Oxidadiones Biologicas Practica 12

OXIDADIONES BIOLOGICAS Experimento 1: ACCION DE LA XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE INTRODUCCION

La mayor parte del oxígeno celular se utiliza para quemar combustibles y generar ATP a partir de ADP y Pi. Un único tipo de complejo enzimático localizado en la membrana mitocondrial interna cataliza esta reacción en la que el ultimo aceptor de electrones. La formación de AT P por fosforilación del ADP ocurre al mismo tiempo que la combustión de las grasas, los carbohidratos e incluso las proteínas. Las células modifican estas reacciones a fin de producir la fosforilación de una gran cantidad de moléculas de ATP por molécula de combustible consumido; cada uno de estos procesos representa la suma de muchas reacciones individuales. Más del 85 % de los fosfatos de alta energía consumidos durante un día por todo el organismo son producidos por fosforilacion oxidativa; esto es, la generación de enlaces pirofosfatos acoplados a la reducción del oxígeno. La oxidación de un sustrato típico por el oxígeno libera suficiente energía libre para producir dos o tres moléculas de ATP por cada átomo de oxigeno consumido. La transferencia de electrones desde el sustrato hacia el oxigeno para reducir éste a agua se descompone entonces en un máximo de tres pasos. Tres complejos enzimáticos de bombeo de protones a través de la m embrana mitocondrial interna para impulsar la for mación de una molecula de ATP a partir de ADP y Pi por cada par de electrones transferidos a través de una serie de intermediarios que constituyen co nstituyen la “cadena respiratoria”. Los tres complejos enzimáticos catalizan las siguientes transferencias sucesivas de electrones a la vez de bombear protones. En las células vivas los electrones que son liberados, no permanecen en el medio, ya que inmediatamente son tomados por otro compuesto, el que al hacerlo se reduce. Estos procesos de oxido- reducción son catalizados por deshidrogenasas mas o menos especificas; algunas utilizan +   como agente oxidante, mientras que otra utilizan directamente la ubiquinona. El consumo de oxigeno puede ser estimado en el respirometro de Warburg. Otra manera de medir el consumo de oxigeno es a través de la determinación (Hb  ) y la desoxigenada muestra una región donde es claramente diferente. El objetivo des presente experimento es verificar la actividad de la xantina deshirogenasa de la leche, utilizando como sustrato artificial al aldehído formico hidratado, analizando el efecto de los inhibidores cianuro y uretano sobre la oxidación del aldehído formico hidratado por la xantina deshidrogenasa de la leche, a través del descolorimiento del azul de metileno.

PROCEDIMIENTO

1.

Establezca el siguiente sistema de tubos de ensayo COMPONENTES SISTEMA DE TUBOS DE ENSAYO I. Leche cruda Leche hervida Uretano Cianuro de sodio  Aldehído formico  Azul metileno

2. 3.

II.

5.0 ml

III.

IV.

5.0 ml

5.0 ml

5.0 ml 0.5 ml 0.8 ml 0.4 ml

0.8 ml 0.4 ml

0.8 ml 0.4 ml

Mezclar y agregar a cada tubo 1 ml de parafina liquida e incubarlos incubarlos a 37 °C Observe el decoloramiento cada cinco minutos.

0.5 ml 0.8 ml 0.4 ml

RESULTADOS

Construya la siguiente tabla para anotar sus observaciones cada cinco minutos expresando el decoloramiento con cruces (de cero a 4). SISTEMAS Sustrato Enzima Decoloración de 0 – 5´ Decoloración de 5 – 10´ Decoloración de 10 – 15´

I.

II.

III.

IV Observación

Experimento 2: OXID ACION DEL SUCCIONATO POR CADA CADENA RESPIRATORIA

El objetivo del presente experimento es evidenciar el funcionamiento de la cadena respiratoria del corazón del mamífero a través de la medida del consumo de oxígeno por la técnica manométrica de Warburg, analizar el efecto de los inhibidores, donantes y aceptores durante la oxidación del succionato por la cadena respiratoria y entender el funcionamiento del citocromo oxidasa de corazón de mamífero. PROCEDIMIENTO

1.

En 8 frascos de Warburg mida lo siguiente: SISTEMA DE FRASQUITOS DE WARBURG COMPONENTES Succionato 0.1 M Cianuro  Azul de metileno Malonato  Ascorbato  Agua destilada Extracto enzimatico

2.

I II

III

IV

V

VI

VII

VIII

Equilibrar los sistemas por a 10 a 15 minutos, permitiendo el libre intercambio gaseoso con el medio ambiente. Cerrar la llave de los manometros y la llave lateral de los frascos de Warburg y realizar las lecturas cada 10 minutos hasta completar 1 hora.

RESULTADOS

1. 2. 3.

Construir una tabla en la que figuren el consumo de oxígeno en microlito/hora para los siete sistemas experimentales. Anotar en la misma tabla el porcentaje (%) de inhibición o estimulo en el consumo de oxigeno con relación al sistema I. Con los valores parciales para el consumo de oxígeno en el sistema I. construya la curva de progreso de la reacción.

Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos:

TB

 =1

 =2

 =3

 =4

 =5

 =6

 =7

0´ 10´ 20´ 30´ 40´ 50´ 60´ TOTAL Oxigeno * (*) Oxigeno consumido/ Hbr CUESTIONARIO

1.

Haga una interpretación adecuada de los resultados obtenidos en el experimento 1, anote sus observaciones y conclusiones: SISTEMA I: _______________________________________________________  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________ SISTEMA II: ______________________________________________________  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________ SISTEMA III: ______________________________________________________  ________________________________________________________ _________________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________ SISTEMA IV: ______________________________________________________  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________

2.

Esquematice el mecanismo de la reacción catalizada por la xantina deshidrogenasa, utilizando como sustrato artificial el aldehído fórmico hidratado.

3.

El cianuro es capaz de inhibir la oxidación del succinato por la cadena respiratoria. ¿Cómo podría superar esta inhibición aun en presencia de cianuro?  ________________________________________________________ _________________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   _____________________________________

4.

De haber añadido uretano al sistema I del experimento 2. ¿cuál habría sido el resultado esperado en cuanto al consumo de oxigeno?  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________

5.

Los potenciales redox de los sistemas oxido- reducción A y B son respectivamente 0.23 y 0.32 voltios. Indique cual es el sistema oxidante y cual es reductor.  ___________________________________________ ______________________________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________

6.

Señale las consecuencias de los siguientes factores para el funcionamiento de la cadena respiratoria y de la fosforilación oxidativa: a) Presencia de cianuro de potasio o cobalto: _________________________________  ________________________________________________________ __________ b) Deficiencia de fosfato inorgánico (Pi): ____________________________________  ________________________________________________________ __________ c)

Deficiencia de ADP: __________________________________________________  ________________________________________________________ __________

d) Presencia de denitrofenol (DNF): _______________________________________  ________________________________________________________ __________ e) Carencia de Pi y/o ADP en presencia de DPN: _____________________________  ________________________________________________________ __________

7.

Calcule el rendimiento de la oxidación biológica de la glucosa y el ácido palmítico:     + 6 → 6     F°= -686 kcal/mol Rendimiento: ______    + 23 →

16   16   F°= -2338 kcal/mol

Rendimiento: _____

8.

Haga una justificación desde el punto de vista termodinamico de los lugares en donde se sintetiza ATP en la cadena respiratoria.  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________ ___________________   ______________________________________________________________ ___________   _____________________________________

9.

¿Qué son desacopladores de la fosforilacion oxidativa? Distinga los tipos de desacopladores y coloque al menos dos ejemplos.  ______________________________________________________________ ___________   _______________________________________________________

10. Nombre al menos cuatro inhibidores de la transferencia de electrones.  ___________________________________________________ ______________________   _______________________________________________________ 11. ¿Con que objeto se usa la capa de parafina liquida en cada tubo?  ______________________________________________________________ __ 12. ¿Cómo actual el azul de metileno?  ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________________________ ___________   ______________________________________________  ALUMNO: _______________________________________ __ CODIGO: __________