P ROYECTO FINAL
MICROSCO MICROSCOPÍ PÍA A HOLOGRÁ HOLOGRÁFICA FICA 11 de diciembre de 2017
Sosa Escalante Amor Enitz Universidad Universidad Nacional Autónoma de México Facultad Facultad de Ciencias Óptica
Sosa Escalante Amor Enitz
Microscopía holográfica
La formación de imágenes sin lentes es un enfoque a la microscopía utilizado cuando se requieren imágenes de alta resolución, usualmente reconstruyendo un objeto por medio de uno o más patrones de difracción, donde la microscopía convencional no es posible o conveniente. Por ejemplo, en experimentos en los cuales se utiliza radiación de longitudes de onda muy cortas (como los rayos ultravioleta o rayos X), donde la obtención de imágenes
de buena calidad es extremadamente compleja. Desde su invención, el microscopio en sus muchas variantes se ha basado principalmente en arreglos de lentes, lo que sujeta a estos sistemas a limitaciones por la apertura numérica (NA) de dichos elntes. El límite clásico de resolución para luz coherente es de 2Nλ A con λ la longitud de onda y la apertura numérica dada por N A = n s i n ( θ), donde n es el índice de
refracción y θ es el ángulo de aceptación máxima del lente. Aunque es posible encontrar microscopios de relativamente bajo aumento (menos de 10x) y apertura numérica de más de 0.5, éstos resultan muy costosos, requieren de corregir
aberraciones con arreglos ópticos y están limitados por la longitud de onda de la luz. Por otro lado, en la microscopía sin lentes las imágenes que se obtiene están libres de aberraciones, debido a que el mecanismo está formado principalmente de un diodo láser y un sensor de imagen. En este tipo de microscopía, los límites de la formación de imágenes están regidos principalmente por la difracción de la luz entre el objeto y el plano de observación
(sensor). [5] La microscopía sin lentes se basa típicamente en difracción. Este fenómeno ocurre cuando se coloca un objeto opaco entre una fuente de luz y una pantalla, donde se observa que la nitidez de sombra proyectada por objeto difiere de lo que predice la óptica geométrica, al observarse franjas oscuras se en la orilla de la sombra. La difracción también ocurre cuando
la luz pasa por una abertura o rendija muy pequeña. La difracción se puede explicar cuantitativamente por la formula de Fresnel-Kirchhoff
alrededor de un punto P sobre una superficie cerrada arbitraria. [1] 1 U (P ) = − 4π
S
i k s
e
/s
∂U ∂n
i ks
− e
/s
∂U ∂n
d S
(1)
Donde U es la amplitud compleja de la onda, k es el número de onda y s es la distancia del punto P a la superficie, donde s y la distancia de la fuente puntual al objeto son
considerablemente mayores que λ. En 1948 Dennis Gabor, un científico Húngaro, sugirió que la difracción clásica de Fresnel de un objeto opaco puede pensarse como un patrón de interferencia entre la luz difractada por el objeto y la luz no desviada que pasa por la parte transparente del campo. Gabor notó que al iluminar la impresión registrada de este patrón con el haz que iluminaba originalmente
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el objeto opaco, se podría recrear la amplitud compleja del campo original en el plano de registro, y que el campo se propagaría como si el objeto siguiera ahí; de esta forma, se podía
formar una imagen del objeto original, a la cual se le llama holograma. En la microscopía holográfica digital (o DHM por sus siglas en inglés), la lente de un microscopio clásico es reemplazado por un algoritmo de computadora que utiliza un holograma
de un objeto grabado digitalmente para calcular y reconstruir la imagen. El mecanismo tiene algunas variantes, pero típicamente consiste en crear un patrón de interferencia (holograma) de un objeto iluminándolo con luz coherente (monocromática), por ejemplo, un láser. El haz es dividido en un haz objeto y un haz de referencia. El primer haz ilumina la muestra para crear un frente de onda característico del objeto, que se colecta con un objetivo de microscopio o lente y se utiliza un divisor de haz para hacer interferir el haz del objeto con el de referencia y así crear el holograma. Usando el holograma grabado, una computadora calcula la imagen del frente de onda utilizando un algoritmo de reconstrucción
numérico que consiste, principalmente, de transformaciones de Fourier simples. [4][6] [7] Normalmente, cuando la intensidad de un campo se registra con un sensor o pantalla, se pierde información de su fase, pero en holografía, el término de interferencia provee un método para registrar la información de fase en función de la posición de las franjas de interferencia en el sensor. Mientras que la información de la amplitud se encuentra en la
envolvente de las franjas. [2] La resolución de estos microscopios está sujeta al límite de difracción, aunque ofrece gran resolución axial (profundidad), registrada de hasta 5 nm. Otro límite que se encuentra es el del tamaño del pixel del sensor, que comercialmente es alrededor de 1 micrómetro o incluso mayor. Se puede desarrollar sistemas de formación de imágenes de súper-resolución de pixel para superar este límite, con lo que la resolución de la imagen está limitada al ruido
de la señal y, por supuesto, al límite de difracción. Con estas técnicas de súper-resolución se han reconstruido imágenes de muestras con un NA equivalente a 0.9 en un campo de visión de 20 mm 2 . Comparado con un microscopio típico de objetivo de 0.9 AN, que tiene un campo de visión de sólo 0.01 m m 2. Incluso se puede obtener un NA mayor a 1.4 si se ilumina la muestra a múltiples ángulos, a lo que se le conoce como apertura sintética. Este ancho de banda espacial que admiten los microscopios holográficos es una característica que permite medir grandes cantidades de objetos sobre un
espacio amplio de visión en muestra de gran volumen. Se pueden generar imágenes de color por medio de iluminaciones simultáneas o secuenciales del objeto a diferentes longitudes de onda y registrar la imagen por un sensor a color, o trabajando en el plano YUV, que separa el componente de luminosidad (Y) de los de
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crominancia (U y V) que representan dos colores distintos. El primer método es realizado a
altas resoluciones y el segundos a bajas resoluciones. [8] La microscopía holográfica tiene caracterizaciones únicas en 3D de muestras de células vivas, ya que las mediciones no afectan a las células; permite contar y visualizar objetos transparentes en varios planos, al mismo tiempo siendo un método eficiente, rápido y simple. Se puede utilizar para evaluar el desgaste de un metal u otro material y evaluar la integridad estructural de un objeto, y ha sido utilizada para diferenciar distintos tipos de
células inmunitarias al etiquetarlas con nano partículas y anticuerpos. Formalmente, la descripción de la holografía puede ser expresada por funciones comple jas representativas de los frentes de onda. Simbolizando el frente de onda del objeto por U o y el frente de onda de referencia como U r , donde ambos definen la amplitud y fase del frentes
del onda resultante que puede ser expresado por la ecuación: (2)
U = U o + U r
La distribución de intensidad en el sensor es obtenida multiplicando U por su conjugado
U* complejo: I = UU ∗ Entonces 2
2
∗
I = |U o | + |U r | + UoUr ∗ +U o U r
(3)
El primer término de la ecuación 3 representa la suma de las intensidades de los frentes de onda de referencia, mientras que los otros dos términos, representan el patrón de
interferencia requerido para formal la imagen del objeto. [4] Si se ilumina el holograma con el frente de onda de referencia original, se obtiene la
distribución de intensidades: I h = U r I 2
2
I h = U r (| U o | + | U r |
) + U o |U r |2 + U o ∗U r 2
(4)
En la ecuación 4, con la cual se pueden reconstruir la imagen, el primer término representa la intensidad combinada de las ondas objeto y la de referencia, mientras que el segundo
representa la reconstrucción del frente de onda del objeto original. Experimentalmente, la calidad del holograma obtenido dependerá de varios factores, como es la resolución del material de registro y la estabilidad tanto mecánica como térmica del sistema. Además, se requiere que los frentes de onda objeto y de referencia mantengan una relación de fase constante, es decir, deben ser coherentes. Es relativamente sencillo lograr coherencia espacial y temporal, aún para una fuente que típicamente se considera
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incoherente, como un LED. La coherencia especial se puede aumentar usando una apertura menor de la fuente o alargando la distancia fuente-objeto. La temporal se puede aumentar
utilizando un filtro paso banda, que limita el rango de frecuencias de la señal. Un inconveniente de la holografía es que la imagen reconstruida tiene una imagen gemela, que surge de la inhabilidad de medir la fase de la luz en el plano del sensor, lo que provoca una pérdida de información de fase. Esto se manifiesta en un patrón que teóricamente podría ser generado por el mismo objeto, posicionado en el lado opuesto del sensor e iluminado en
dirección contraria. Sin embargo, capturando varias imágenes de hologramas a diferentes distancias fuenteobjeto se puede resolver esta ambigüedad de fase y eliminar el efecto de la imagen gemela. Estas técnicas que se conocen como recuperación de fase y se basa en el principio de que amplitud de la luz capturada en cada uno de los diferentes planos de observación debe ser
consistente con la propagación de la luz entre los planos. Actualmente, los métodos de formación de imágenes sin lentes están limitados principalmente por la necesidad de una fuente de luz angosta, estable y en un rango del espectro conocido. Aunque estas limitaciones de ancho de banda recientemente han sido removidas
exitosamente al iluminar la muestra con dos pulsos coherentes retrasados en el tiempo.[5] El futuro de la microscopía holográfica digital sigue creciente en ámbitos académicos e industriales, y comienza a estar disponible comercialmente. El bajo costo y relativa simplicidad de estos sistemas ha incitado a la investigación y desarrollo de microscopios de campo en el espectro visible compactos y portables, con posibles aplicaciones tan importantes como la detección de malaria, otras enfermedades tropicales, y parásitos de agua. Es un campo reciente y en desarrollo, que seguirá creciendo gracias al avance tecnológico tanto en fuentes
de luz como en sistemas de detección.
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Bibliografía [1] Thompson Kingslake, et al., Applied Optics and Optical Engineering, Volume VI, Academic Press Inc., USA, (1980), pp. 357-391 [2] Fowles G. R., Introduction to Modern Optics, 2nd. Edition, Dover (1989). [3] Sirohi Rajpal S., Introduction to Optical Metrology, CRC Press Taylor & Francis Group, London, England, (2016) [4] McLeod E., Ozcan A. (2017). Microscopy without lenses, Physics Today, 70, 9, 50. doi: 10.1063/PT.3.3693 [5] Witte S., Tenner T.V., Noom WE D., Eikema SE K. (2014). Lensless diffractive imaging with ultra-broadband table-top sources: from infrared to extreme-ultraviolet wavelengths,
Nature Magazine, 3, e163. doi:10.1038/lsa.2014.44 [6] Myung K. K. (2010). Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Reviews. 1: 018005. doi:10.1117/6.0000006. [7] Kemper B., Langehanenberg P., von Bally G. (2007). Digital Holographic Microscopy: A New Method for Surface Analysis and Marker? Free Dynamic Life Cell Imaging. Optik &
Photonik (2): 41–44. [8] Escobar Mesa M. (2014). Unimedios, 0. Recuperado en diciembre 2017 de
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