UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS: RNA 16S COMO INDICADOR DE IMPACTO
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FISICAS Y MATEMATICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS: RNA 16S COMO INDICADOR DE IMPACTO
PATRICIA ALEJANDRA CONTRERAS ARANEDA
COMISION EXAMINADORA
CALIFICACIONES
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FISICAS Y MATEMATICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS: RNA 16S COMO INDICADOR DE IMPACTO
PATRICIA ALEJANDRA CONTRERAS ARANEDA
COMISION EXAMINADORA
CALIFICACIONES
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar gracias a Rodri por todo su apoyo, tanto durante la memoria como durante todos estos años, lo logramos!!!. Gracias a mis padres por haberme enseñado a luchar en la vida, y a entender que la educación es la mejor herencia que me pudieron dejar. Gracias por sobre todo a mi mami por haber estado ahí en espíritu apoyándome en estos años de universidad, y durante toda mi vida. A la Tante por su sabiduría y su cariño. Esta memoria se la dedico a todos ustedes. Gracias al profesor Leandro Herrera por su paciencia ante las miles de inquietudes que tuve. A los profesores de la comisión, profesora Blanca Escobar y profesor César Sáez, por su paciencia ante los variados cambios de
INDICE
Agradecimientos ..................................................................................................v Resumen ........................................................................................................... vii CAPITULO 1 . Introducción ................................................................................ 9 1. 1 Propiedades del Suelo Natural............................................................... 11 1. 2 Suelos Contaminados ............................................................................ 14 1.2.1 Gestión ambiental del sitio contaminado .......................................... 19 1. 3 Biodiversidad y su importancia en el suelo............................................. 21 1. 4 El suelo como hábitat microbiano........................................................... 23 1.4.1 Fijación de Nitrógeno........................................................................ 25 1. 5 Suelos contaminados y microorganismos .............................................. 26 1. 6 Objetivos y Alcances .............................................................................. 29 1.6.1 Objetivo General:.............................................................................. 30 1.6.2 Objetivos Específicos:....................................................................... 30 1.6.3 Metodología ...................................................................................... 30 1.6.4 Alcance de la memoria ..................................................................... 31 CAPITULO 2 . Identificación de microorganismos............................................ 32 2. 1 Diversidad Biológica............................................................................... 33 2.1.1 RNA ribosomal.................................................................................. 34 2.1.2 Reacción de la Polimerasa en Cadena............................. 38
RESUMEN
Considerando al suelo como el sustrato sólido de la superficie de la tierra, en que se desarrollan las principales actividades humanas (urbanas, agrícolas, forestales, mineras, etc.), se estudiaron los fundamentos científicos y metodológicos que permitiesen utilizar la biodiversidad como indicador de la calidad de los suelos. El objetivo de esta memoria fue, entonces, estudiar la utilización de la diversidad microbiana, medida con técnicas moleculares (en particular T-RFLP), como indicador biológico de la sustentabilidad e impacto ambiental de las actividades desarrolladas en los suelos. Se observó que en los estudios acerca de la importancia del suelo para el desarrollo de la sociedad, sea este entendido tanto como recurso económico o como fuente de alimento, no se suele enfatizar el rol que juegan los
comercial. Chile, que recientemente se ha convertido en un actor notable de la comunidad internacional, se empieza a preocupar de los suelos, pero aún no se han decretado normativas específicas al respecto. Se concluyó que la posibilidad de evaluar la “salud” de un suelo a través de su riqueza y variedad de microorganismos es factible, pero se constató que las técnicas moleculares están en pleno desarrollo y no es posible aún obtener resultados cuantitativos ni de buena reproducibilidad. Tampoco en el caso que la investigación en biodiversidad de suelos haya llegado a un consenso de métodos cuantitativos prácticos. En este trabajo se propone que se realicen seguimientos anuales del impacto sobre la biodiversidad en cada nuevo proyecto de inversión industrial, llevando hacia el futuro la posibilidad de construir una línea de base de la biodiversidad en el país.
CAPITULO 1 . INTRODUCCIÓN
En el planeta ocurren una serie de flujos tanto energéticos como de materia, igual que en un proceso industrial, donde se distinguen flujos de entrada, de salida, y desechos. La tierra actúa como receptor de todos esos flujos, convirtiéndose en una especie de fuente de materiales y de vertedero, como también de reciclaje; ya que las materias primas provienen de la tierra, los desechos van a ella, y se degradan naturalmente también ahí. Sin embargo estas capacidades del planeta son finitas, y en la actualidad están siendo sobreexplotadas por el ser humano. Entendiendo lo anterior, Naciones Unidas en 1987, y mediante el informe de la Comisión Mundial sobre Medio Ambiente y Desarrollo, el grupo de trabajo, conocido como Comisión Brundtland, publicó el documento llamado Nuestro Futuro Común (Brundtland et al. , 1987). En este documento se advertía que la
de manera que su tasa de vaciado se limite a la tasa de creación de sustitutos renovables. Otros factores, como la tecnología o la escala de la economía, también tienen que armonizarse con el desarrollo sostenible” y que “ las capacidades de regeneración y asimilación deben ser consideradas como capital natural. El no-mantenimiento de estas capacidades debe ser considerado como consumo de capital y, por tanto, como no sostenible “ De esta exposición se deduce la importancia que tiene conservar la tierra, y en particular sus capacidades tanto de “vertedero” como de “reciclaje”, ambas están relacionadas, como se verá mas adelante, con la existencia de microorganismos, en particular en el suelo, lugar donde se realizan muchos de los ciclos biogeoquímicos involucrados en las capacidades del planeta. A continuación se detalla la importancia del suelo y de los microorganismos presentes en él, así como las consecuencias en las comunidades microbianas
1. 1 PROPIEDADES DEL SUELO NATURAL El suelo es un recurso natural definido generalmente como la capa superior de la corteza terrestre, está formado por partículas de minerales, materia orgánica, agua, aire y allí nacen y se desarrollan miles de seres vivos, desde microorganismos hasta plantas y animales superiores [COM 2002]. Los suelos se clasifican en distintos tipos de acuerdo al porcentaje de cada uno de los componentes mencionados. Según el reporte sobre la protección del suelo de la Comisión Europea, se pueden distinguir 320 tipos distintos de suelos en Europa [COM, 2001]. Los suelos se constituyen en capas, llamadas horizontes 1. Cada horizonte difiere en una o más características del superior o del inferior. Usualmente se reconocen cinco tipos de horizontes. Los horizontes se observan en la figura 1,
El suelo cumple un rol muy importante y esencial para el sustento de la vida en este planeta. Según la definición de la Comisión para la Comunidad Europea (2002) entre las propiedades del suelo están: •
Ser fuente de alimentos para la producción de biomasa
•
Ser actuar como medio filtrante y buffer
•
Ser hábitat de miles de organismos
•
Ser el escenario donde ocurren los ciclos biogeoquímicos
•
Ser fuente de materia prima indispensable para el ser humano como los minerales
•
Ser el lugar donde se realizan la mayoría de las actividades humanas como por ejemplo la agricultura y las actividades forestales
Dentro de las propiedades nombradas del suelo, está su capacidad de actuar como tampón y de servir de acopio de materiales, ambas características dependen fuertemente del contenido de materia orgánica presente,
Como se menciona, la materia orgánica 2 es uno de los componentes centrales del suelo y juega un rol muy importante, pues se encarga de mantener las funciones del suelo, en particular la capacidad de resistir a la erosión y de mantener la fertilidad del suelo. Además de asegurar la capacidad tampón mencionada y de adhesión que posee el suelo, primordial para limitar la difusión de contaminantes. El suelo además es un medio rico en vida, con una gran diversidad de microorganismos que viven en él, siendo esto central para todas las funciones naturales que posee. La riqueza en diversidad otorga la estructura y fertilidad del suelo, incluida la producción de alimentos. A pesar de haber sido considerado por muchos años un recurso infinitamente renovable, por su apariencia sana, el suelo superior es netamente un recurso NO RENOVABLE, y actualmente posee altas tasas de degradación y tasas
1. 2 SUELOS CONTAMINADOS Se
entiende
como
suelo
contaminado,
según
muchos
organismos
internacionales 3, aquel que represente una amenaza para la salud humana y el medio ambiente, debido a las sustancias presentes en o bajo el suelo, generalmente debido a un mal uso previo. Además se puede decir que un sitio contaminado según Moraga (2003) es “aquel con presencia de componentes que no son atribuibles a la condición natural del sitio”. En Chile no existe una normativa que indique la definición de suelo contaminado; si bien existe un consenso dentro de las autoridades de su significado, no hay ninguna definición oficial de este concepto. La introducción de contaminantes o material exógeno al suelo puede traducirse en un daño o pérdida de algunas o varias de las funciones antes mencionadas,
La contaminación de suelos donde se desarrollan actividades industriales, agrícolas y humanas en general, se debe principalmente a la inadecuada gestión del mismo, la cual ha llevado a la disposición deliberada o accidental de desechos sobre él, tanto de materia orgánica, solventes o residuos peligrosos, perjudicando a su vez cualquier actividad posterior relacionada con este recurso, traduciéndose finalmente en un problema mundial de contaminación de los suelos. La problemática comenzó a fines del siglo XIX, con la revolución industrial, pues una de las principales fuentes de contaminación fueron las instalaciones industriales tanto en operación como después de su cierre, las que causaron derrames y filtraciones, tanto por accidentes o debido al mal manejo de las operaciones. Se pueden relacionar algunas actividades industriales con los contaminantes
antiguamente se creía que depositar contaminantes o basura en el suelo era la solución para los desechos hoy se sabe que los únicos perjudicados al realizar estas acciones son los propios seres humanos. Los sólidos que se abandonan ambientalmente siguen en reacción, ya sea física, química o biológica, que finalmente lleva a la generación de compuestos en fase acuosa que impactan el suelo donde se han dispuesto. La metodología usada normalmente para detectar suelos contaminados, es mediante análisis químicos. Hoy en día existe la intención, tanto en el medio científico, como en organizaciones internacionales y en los propios gobiernos [Büchs, 2003a] [Duelli et al., 1998] [Büchs , 2003b] de usar indicadores biológicos, en particular para determinar la “salud” del suelo, en términos de fertilidad. Pues aluden a que “riqueza de especies significa calidad de vida”, no solo enfocado en suelos contaminados sino en la “salud” de la tierra en su conjunto. Estos indicadores biológicos pueden ser comunidades biológicas,
Chile, a su vez, comienza a seguir los pasos de la Comunidad Europea; en estos momentos se realiza un estudio en la CONAMA para detectar los posibles sitios contaminados, también llamados “pasivos” ambientales 4, porque se les entiende como una deuda con el país (valor negativo). Sin embargo hasta el momento no se conoce con exactitud la magnitud que puede tener este problema en el país [CONAMA, 2003]. En los estudios de contaminación, no basta con detectar la presencia de contaminantes sino que se han de definir los máximos niveles admisibles y además se han de analizar posibles factores que puedan influir en la respuesta del suelo a los agentes contaminantes entre ellos la biodisponibilidad del contaminante y su carga crítica. La primera variable corresponde a la asimilación del contaminante por los organismos, y en consecuencia la posibilidad de causar algún efecto, negativo o positivo. La carga crítica representa la cantidad máxima de un determinado componente que puede ser
para las nuevas instalaciones de manera de crear el menor impacto tanto en el suelo como en el medio ambiente, para lograr esto se implementa la remediación del suelo, de manera de poder ser reutilizado sin peligro alguno para su posible uso como terreno residencial u otro fin necesario. Si bien esta es una política principalmente Europea, en Chile también ocurre algo similar, aunque en menor medida como es el terreno que poseía la ENAP en Las Salinas donde se debe remediar el sitio para la construcción de viviendas habitacionales. Otro ejemplo es el gobierno ingles en fomentar la reutilización de sitios contaminados que han sido previamente remediados, para que se construyan en estos sitios la mayoría de las nuevas casas y poblaciones, incrementando el reuso a un 80% para fines del 2008 [EA-UK, 2002].
1.2.1 Gestión ambiental del sitio contaminado La gestión de riesgo ambiental se basa en el estudio del riesgo debido a contaminantes, en este caso, presentes en el suelo. El riesgo se define como la probabilidad que una sustancia o situación produzca un efecto adverso para algún elemento sensible, a lo humano o ecológico y/o económico, bajo determinadas condiciones de contacto. Debido a las normativas de la limpieza de sitios contaminados en países desarrollados, se han desarrollado una serie de metodologías, propuestas principalmente por la agencia estadounidense ambiental (EPA), para la correcta caracterización y definición del problema, así como las posibles tecnologías aplicables para su remediación. Según la definición de la EPA un sitio contaminado (brownfield en inglés) “es aquel que es una propiedad cuya
Fase I: incluye una investigación histórica del sitio, que consiste en una recopilación histórica de los antecedentes del sitio, determinando las actividades realizadas en él, así como inspeccionar directamente el lugar. Luego de completar esta fase se puede definir si existen sustancias peligrosas en la propiedad y seguir con la fase II, o bien no es necesario seguir otra acción. Fase II: El propósito de esta fase es descubrir y entender cuales son los contaminantes presentes en el sitio, dónde se encuentran específicamente y en qué niveles. Para esto se tiene una serie de metodologías analíticas, que testean la presencia de químicos, así como la forma como se obtienen las muestras que se desean evaluar. Existen varios métodos para obtener muestras y analizarlas, los cuales se pueden encontrar en la página de la American Society of Testing and Materials (ASTM) (www.astm.org).
1. 3 BIODIVERSIDAD Y SU IMPORTANCIA EN EL SUELO Se entiende por biodiversidad el “conjunto de genes, especies, ecosistemas y paisajes en un espacio determinado y en un momento dado, considerados en sus interacciones jerárquicas sucesivas de genes a especies, ecosistemas y paisajes y viceversa” [Di Castri, 2003]. Según la normativa chilena, en el artículo 2 letra a) de la Ley Base del medio Ambiente se define biodiversidad como “la variabilidad de los organismos vivos, que forman parte de todos los ecosistemas terrestres y acuáticos. Incluye la diversidad dentro de una misma especie, entre especies y entre ecosistemas“ [Ley 19300, 1994]. La biodiversidad es comúnmente conocida en términos de la gran variedad de
sentido, esta percepción corresponde a las funciones tanto “fuente” como “vertedero” y “reciclaje” de Dalí y al grupo de trabajo de la comisión Brundtland (1987). La biodiversidad promueve y da sustento a actividades económicas en términos mundiales se estima que provee bienes y servicios que fluctúan entre US$ 16 y 52 x 1012 anuales, equivalentes a alrededor de 2 veces el producto geográfico bruto de todas las economías del mundo combinadas [Constanza et al., 1997]. El papel fundamental de la biodiversidad es mantener el balance y permitir los procesos funcionales del ecosistema como es el reciclaje. El desbalance que se observa hoy en día en el planeta, se debe principalmente al mal uso que ha dado el hombre a los recursos, principalmente en el tema de la biodiversidad. Encontrándose en la actualidad una gran cantidad de especies en extinción y se estima que si el uso irracional de los recursos prosigue, la tasa de extinción
Debido a lo anterior es que muchos países como también organizaciones ambientales están trabajando en recopilar información sobre la calidad de los suelos relacionado con la biodiversidad presentes en estos. Por ejemplo el Reino Unido cuenta con su Programa para la Biodiversidad en el Suelo (The Soil Biodiversity Programme) donde ya han dispuesto de 5.85 millones de libras (alrededor de 11 millones de dólares), de manera de estudiar la biodiversidad y entender su rol en el suelo.
1. 4 EL SUELO COMO HÁBITAT MICROBIANO Tal como se mencionó en las propiedades del suelo, los microorganismos presentes en él son vitales para su fertilidad y para la degradación de materia orgánica y contaminantes en suelos y sedimentos [Von Beelen et al., 1997]. Estos microorganismos juegan un papel indispensable refiriéndose en particular
El recuento de bacterias siempre suele ser mayor en la rizosfera que en zonas del suelo donde no se encuentran raíces. Esto de debe a que las raíces secretan cantidades considerables de azucares, aminoácidos, hormonas y vitaminas estimulando un crecimiento intenso de bacterias y hongos. Se sabe que tanto la abundancia como la diversidad de microorganismos en el suelo, depende directamente del horizonte del suelo que se esté estudiando. Se estima que en un gramo de suelo en buen estado se puede encontrar hasta 600 millones de bacterias, correspondientes entre 15 mil y 20 mil especies distintas [COM, 2001], aunque según Ogram (1997) por cada gramo de suelo hay alrededor de 4 mil especies de microorganismos. No así en suelos desérticos donde el número de bacterias disminuye hasta 1 millón que se distribuirían entre 5 y 8 mil especies. Como se menciona en la introducción de este trabajo los microorganismos
Tabla 1: Composición de bacterias en el suelo
Especie Arthrobacter
%
5-60
Bacillus
7-67
Pseudomonas
3-15
Agrobacterium
1-20
Alcaligenes
1-20
Flavobacterium
1-20
Corynebacterium
2-12
Micrococcus
2-10
Staphylococcus
<5
Xanthomonas
<5
La disponibilidad de formas fijadoras de nitrógeno es un importante limitante factor tanto para la actividad microbiana en el suelo como para el crecimiento de las plantas superiores, la presencia de estas especies permite el 60% de la fijación de nitrógeno que ocurre en la tierra [Madigan et al, 1999] . Dentro de los principales organismos fijadores de nitrógeno se encuentran bacterias como Azotobacter, Mycobacterium flavum, Azospirillum lipoferum, Methylococcus, Thiobacillus y Rhizobium, entre otras.
1. 5 SUELOS CONTAMINADOS Y MICROORGANISMOS La evaluación del efecto que producen los contaminantes del suelo en los microorganismos naturales presentes en él, ha recibido una atención considerable en los últimos años [Abbondanzi et al., 2003] .
Según estudios de Van Beelen (1997) sobre toxicidad, se sabe que algunos grupos de microorganismos tienen la capacidad de ser más resistentes a contaminantes que otros, por ejemplo las bacterias Gram negativas son más resistentes en comparación a las Gram positivas, en particular ante la presencia de metales. En el mismo trabajo se estudió y concluyó, que la presencia de comunidades resistentes a metales traía consigo serias consecuencias ecológicas, pues estas comunidades presentan bajas tasas de mineralización, su capacidad de biodegradación decrece así como su resistencia al frío. Entre los microorganismos que normalmente se encuentran en un suelo contaminado, con hidrocarburos, está la especie Pseudomonas en particular P. putida. Esta bacteria pertenece a la subclase proteobacteria [Nelson et al.
2002], específicamente según Yu (2000) corresponde a una γ proteobacteria y
Las bacterias del género Sphingomonas también son encontradas comúnmente en suelos con las características mencionadas. Recientemente se ha estudiado la presencia de esta especie en suelos con distintas concentraciones del contaminante donde se encontró que a mayor concentración menor era la diversidad presente de esta especie [Leys et al., 2004]. Así también fue demostrado en el estudio de Duarte (2001) donde se observó que si bien el número de bacterias no variaba con respecto a la presencia de contaminantes, al realizar análisis de las comunidades a través de métodos moleculares, específicamente DGGE ( ver capitulo 3.2 Técnicas de análisis de diversidad microbiana), se observa que a medida que aumenta la concentración de contaminantes en el suelo, el perfil de análisis de la comunidad disminuía. Según Duarte (2001) las “comunidades microbianas tienden a responder ante la presencia de contaminantes del petróleo, cambiando su estructura a una que
1. 6 OBJETIVOS Y ALCANCES En este trabajo se estudiará la posibilidad de determinar en forma cualitativa la presencia de contaminantes en el suelo, que se traduzca en un potencial riesgo. Por ende, determinar si el suelo en estudio se encuentra o no contaminado. En otros términos, se busca determinar la “salud” de suelos en general. En este trabajo se pretende estudiar el comportamiento de ciertas especies microbianas, específicamente bacterias, presentes normalmente en el suelo que sirvan como indicadores de contaminación siendo necesario que estas bacterias sean sensibles ante la presencia de contaminantes, específicamente hidrocarburos, de manera de evaluar la biotoxicidad de estos contaminantes. Así se podrá determinar la presencia o ausencia de contaminantes y proponer un plan de acciones para seguir adelante con la remediación o bien definir que no hay posibilidad de riesgo ambiental debido a estos contaminantes.
1.6.1 Objetivo General: Estudio de métodos de medición de parámetros útiles para la evaluación de impacto ambiental en suelos mediante técnicas de biología molecular 1.6.2 Objetivos Específicos: a) Estudiar suelos contaminados b) Determinar importancia de biodiversidad en suelo c) Definir parámetros a analizar d) Revisar metodologías que permitan analizar la biodiversidad en suelos e) Definir métodos de control y factibilidad técnica f) Establecer metodología para identificar impacto ambiental en suelos
1.6.3 Metodología
1.6.4 Alcance de la memoria Se establecerá una propuesta de norma, basada en una nueva metodología de evaluación preliminar de sitios contaminados, como una alternativa más económica y rápida a los análisis químicos. Aunque esta alternativa solo podría llegar a indicar, por el momento, la presencia de contaminante y la composición biológica del lugar, sin llegar a evaluar las concentraciones a las cuales podría hallarse el contaminante en cuestión. El método se relacionará, si bien no cuantitativamente, con la conservación de la biodiversidad del suelo donde se instale un proyecto. Así también serviría como antecedente de evaluación del impacto de instalaciones industriales sobre el terreno, de manera de poder realizar
CAPITULO 2 . IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Hasta la aparición de técnicas moleculares avanzadas, la forma de identificar microorganismos se basaba en diferencias morfológicas y actividades especificas, como resistencia a antibióticos, las cuales se llevaban a cabo luego de cultivar microorganismos presentes en su hábitat natural, sin embargo se sabe que no es posible cultivar para aislar más del 1% de los microorganismos presentes en el suelo [Ritchie et al., 2000] [Muyzer, G., 1999]. Para estudiar una muestra conteniendo microorganismos sin utilizar métodos de cultivo se recurre a técnicas moleculares. Por ejemplo, para calcular el número total de microorganismos presentes en el medio o para identificar microorganismos se pueden teñir con alguna de las variedades de las distintas tinciones fluorescentes especificas para células vivas, como es el naranja de
2. 1 DIVERSIDAD BIOLÓGICA Debido al crecimiento en el área molecular se utiliza hoy en día tanto para clasificar como para identificar los microorganismos la subunidad ribosomal del ARN (SSU rRNA) [Muyzer, 1999]. En particular, es posible estudiar la biodiversidad utilizando las sondas para esta subunidad. El resultado es una imagen filogenética de las especies presentes en la comunidad. Para resumir los métodos se basan en la extracción total de DNA o RNA de representantes de toda la comunidad y a continuación mediante las sondas especificas de ácidos nucleicos, se obtiene clones de RNA ribosómico. Estos se consiguen por la amplificación de los genes RNA ribosómicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o de manera indirecta , por la producción de DNA complementario (cDNA) del RNA ribosómico, que se lleva a cabo por la transcriptasa reversa.
sección 3.2 se detallan las posibles técnicas para estudiar comunidades microbianas.
2.1.1 RNA ribosomal Hay tres moléculas de RNA ribosómico, que en las procariotas tienen una medida 5 de 5s, 16s y 23s. Las moléculas de rRNA bacteriano de gran tamaño, que son el 16s y el 23s contienen aproximadamente 1500 y 29000 nucleótidos, respectivamente. Dado que el 16s es más manejable que el 23S para la experimentación, se ha utilizado en la filogenia de los procariotas. [Madigan, 2000]. Los genes correspondientes al RNA ribosomal son útiles como marcadores biológicos por las siguientes razones [Microbial Ecology, 1999]
Figura 3: Metodología de secuenciación utilizada en la actualidad para la identificación de cualquier microorganismo. Fuente: Herrera et al., 2000
La manera de estudiar una comunidad microbiana se resume en la figura 4:
Comunidad microbiana Extracción DNA
Extracción RNA
DNA total de la comunidad
RNA total de la comunidad
Multiplicación por
Copia, mediante
2.1.2 Reacción de la Polimerasa en Cadena De manera especifica, la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se está usando para amplificar los genes del rRNA (es decir, el trozo de DNA que codifica para el rRNA 16S) usando los moldes de los partidores obtenidos sintéticamente, complementarios de secuencias conservadas en el RNA. La amplificación mediante la PCR, del DNA que codifica el rRNA requiere de menos material celular que la secuenciación directa del rRNA. El gen del RNA ribosómico6 16s se encuentra entre las posiciones 1671 y 3229 de la cadena H del DNA mitocondrial y posee una longitud de 1559 nucleótidos. El método hace uso de la enzima DNA polimerasa que copia moléculas de DNA [Mandigan et al., 2000],. Se requiere conocer la secuencia de nucleótidos de una región del gen deseado. Esto es necesario porque para que funcione la PCR
es
preciso
disponer
de
oligonucleótidos
iniciadores
cortos,
En la figura 5 se esquematiza el proceso y las etapas que ocurren en un ciclo de PCR, así como el número de copias que se obtiene finalmente. En la figura la enzima polimerasa está indicada como P.
Se usa la Taq polimerasa, DNA polimerasa aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus estable a 95ºC, la que no se ve afectada por el paso de la desnaturalización empleado en el PCR. Su uso también incrementó la especificidad de las reacciones pues el DNA es copiado a 72º, donde raramente ocurren la hibridación inespecífica de los partidores con el DNA La amplificación por medio de PCR presenta la gran ventaja de poder obtener suficiente material genético para poder hacer análisis posteriores. También presenta una serie de desventajas [Microbial Ecology, 1999] como las siguientes: a) Algunos genes de rRNA presentan preferencia de ser amplificados frente a otros, todo dependerá de la calidad del primer utilizado b) La amplificación de mezclas de genomas conlleva a la formación de quimeras [Muyzer G., 1999] debido a la alineación de fragmentos de diferentes genes entre regiones altamente conservadas, creándose
2. 2 TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DIVERSIDAD MICROBIANA En particular se pueden dividir entre aquellas que utilizan amplificación, llamadas métodos indirectos, y las que no las utilizan siendo éstos los métodos directos. Entre los primeros se encuentran diversos métodos de separación la electroforesis en un gel con un gradiente denaturante, DGGE por sus siglas en inglés (Denaturing gradient gel eletroforesis) o por gradiente de temperatura (TGGE), aquellas que utilizan enzimas de restricción como RFLP (restriction fragment length polimorfism) también llamada análisis de fragmentos ribosomales de DNA amplificados ( ARDRA por sus siglas en inglés) o bien TRFLP ( terminal restriction fragment length polimorfism), entre otros. En esta sección se explicará en detalles en que consisten las dos últimas técnicas señaladas.
Uno de los problemas que presenta esta técnica es que los fragmentos observados en el gel de agarosa, es decir el número de bandas en el perfil entregado es mayor al número de fragmentos de DNA amplificados, estimándose un número de miembros de la comunidad mayor al realmente presente en ella.
2.2.2 T-RFLP Esta técnica posee un principio muy similar al descrito anteriormente para RFLP o ARDRA, pero hace uso de fragmentos marcados con fluorescencia que también han sido amplificados por medio de PCR. Estos productos han sido marcados en su terminal durante la amplificación con PCR utilizando un partidor fluorescente. Los genes amplificados son posteriormente separados en un gel de electroforesis, luego visualizados por medio de la excitación del compuesto
Figura 6: Procedimiento del método T-RFLP Fuente: Michigan State University
Figura 7: Perfil fragmentos T-RFLP
Sin embargo no es lo único, estudios recientes han demostrado que la acumulación de productos amplificados por PCR puede llevar a obtener
Al ser secuenciados los fragmentos, pueden posteriormente ser analizados para obtener un árbol filogenético, utilizando alguna base de datos que contenga secuencias de bacterias ya analizadas y comprobadas, como es el caso del Ribosomal Database Project el cual contiene cerca de 16300 SSU de rRNA de procariontes [Maidak et al., 2001].
CAPITULO 3 . BACTERIAS COMO INDICADOR DE IMPACTO
El principal objetivo del presente trabajo es estudiar una forma de evaluar la presencia de contaminantes en el suelo sin utilizar las metodologías comunes basadas en análisis químico de los componentes del suelo, puesto que estos análisis entregan el contenido total de las sustancias y no la biodisponibilidad de éstos
para
los
microorganismos
presentes.
La
importancia
de
la
biodisponibilidad es que puede encontrarse la sustancia absorbida en un grano de tierra o bien en sus poros, sin producir daño alguno a los organismos de ese hábitat en particular, traduciéndose en un menor impacto en el ser humano y la sociedad. Es por eso que se propone la utilización de bacterias como indicadores de presencia de contaminantes, pues éstas demostrarían la biodisponibilidad de la
bastante importante y nada de trivial que “es casi imposible crear reglas básicas para indicadores de biodiversidad debido a la gran diversidad de objetivos que deben cumplir los indicadores”, en particular en este estudio se refieren a insectos y arácnidos como bioindicadores, y no nombran en su estudio la posibilidad de usar microorganismos para tal efecto. A pesar de que los análisis químicos son cada vez más versátiles, no entregan información directa sobre el efecto de los compuestos tóxicos, contaminantes, sobre los microorganismos presentes en el medio. El uso de bioensayos, puede predecir la presencia de compuestos tóxicos, incluso no especificados y el impacto biológico que producen [Abbondanzi et al., 2003] Para esto, primero se debe definir cual sería la metodología a utilizar para evaluar el comportamiento de las bacterias, luego definir que tipos de bacteria utilizar y luego especificar el procedimiento y sus resultados.
3. 1 METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN : En la metodología aquí propuesta, se debe realizar primero una recopilación de antecedentes históricos del sitio de manera de poder determinar el estado actual de su suelo. Luego de esta etapa se podrá concluir si el sitio en cuestión corresponde, según la nomenclatura implementada por Fundación Chile 7 (2004), a uno de los dos siguientes tipos: a) Sitio sin contaminación (SSC): pues puede nunca haber sido utilizado como terreno de industrias o usos agrícolas, pudiéndo ser considerado un suelo sin actividades humanas por consiguiente posee las propiedades propias de su tipo. Es también posible que no exista un registro histórico pero que exista evidencia de contaminación que implicaría incluirlo en la siguiente categoría, aún sin registro histórico.
Es necesario caracterizar el volumen total del sitio a evaluar, pero generalmente no es posible examinar el terreno en su totalidad, siendo necesario tomar muestras lo más representativas del sitio [Norma ISO 10.381, 2002] Para realizar un buen muestreo y obtener de esta manera resultados creíbles se recomienda consultar la Norma ISO 10.381 (2002) que trata tanto del correcto muestreo de suelo como de su almacenamiento y transporte. En esta norma aconseja la metodología de muestreo según el objetivo del estudio, y presenta un diagrama para determinar el tipo de muestro a realizar, en el Apéndice D se esquematiza el objetivo que presenta este trabajo. Es importante considerar que es más confiable, visto desde el punto de vista estadístico, el muestreo al azar en bloques. Varios trabajos de estudios de comunidades bacterianas en suelo indican este patrón de toma de muestra como el utilizado [Rietche et al., 2000] [Duarte et al., 2001] La Figura 8 es un ejemplo de este patrón, donde los círculos representan el lugar donde se debe tomar la muestra.
Si bien ninguna norma o estrategia indica la temperatura a la cual debe ser almacenada la muestra para análisis microbiológicos la parte II de la Norma ISO 10.381 señala que tal temperatura debe ser menor a –25º C para evitar reacciones enzimáticas, oxidación o pérdida de materia orgánica. Por lo mismo muchos trabajos en este ámbito establecen como temperatura de almacenamiento –80º C, como es el caso de Edgcomb (2002) y Kaplan (2004). Estas temperaturas suelen usarse para suelos contaminados, de manera de evitar un cambio importante en la composición de los contaminantes, especialmente en aquellos volátiles. Una temperatura adecuada para almacenar las muestras es de –40º C, así se asegura que el centro dela muestra alcance al menos los -25º C indicados por la norma ISO antes mencionada ( para 100 g de muestra 8). El paso siguiente dependerá del tipo de sitio que se esté analizando. Para el
Para evaluar la riqueza microbiana se propone realizar un análisis por medio del uso de técnicas moleculares, específicamente T-RFLP, de la biodiversidad de bacterias presente. Los protocolos para los análisis se encuentran detallados en el Apéndice A. Para el segundo caso, es decir, cuando el suelo corresponde a un SPC, la metodología difiere de la anterior. Primero se deberá conseguir, en lo posible, una muestra similar de suelo 10 pero con la certeza de que está libre de contaminantes, y comparar los perfiles entregados por el análisis de T-RFLP que se le realizan a ambos suelos, de manera de poder visualizar la calidad del suelo potencialmente contaminado. Así si ambos perfiles son similares y ricos en diversidad y abundancia de especies, se podría concluir que el SPC no representa un riesgo para el medio ambiente, pues la comunidad microbiana ha permanecido inalterable.
crecimiento. Para lograr esta evaluación se inocula la muestra de suelo con la bacteria de las que se disponga previamente partidores específicos, se mantiene la muestra a una temperatura y condiciones típicas del suelo, por ejemplo aproximadamente entre 10 y 15 °C. Y se analizará por medio de un TRFLP con partidores específicamente diseñados para P. putida. Naturalmente como P. putida es una bacteria propia del suelo, es necesario realizar un análisis de restricción la muestra de suelo sin inoculo, para que así sirva como blanco. Una vez inoculada la muestra de suelo con P. putida se deberá realizar un análisis de T-RFLP, al día siguiente de la inoculación y luego de 10 días de crecimiento de las bacterias. Así se obtendrá la tasa de crecimiento de esta especie dadas las condiciones del suelo.
Los perfiles entregados por el análisis mediante T-RFLP pueden ser visualizados como lo muestra la figura 9, donde se comparan los perfiles de dos sitios distintos.
Figura 9: Ejemplo de comparación de perfiles pertenecientes
CAPITULO 4 . DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
4. 1 DISCUSIONES El planeta tierra puede ser considerado como un flujo de energías, donde el suelo participa en el reciclaje de éstas, y se caracteriza por servir como vertedero de desechos tanto naturales como producidos por el hombre. Esta cualidad de servir como “vertedero” y “reciclador” natural se debe principalmente a la capacidad de buffer y almacenamiento que posee este recurso. Sin embargo esta capacidad es limitada al contrario de lo que se creyó en algún momento, está determinada en particular por la acción de miles de los habitantes microbianos presentes en el suelo, principalmente por la función que cumplen éstos como degradadores de compuestos orgánicos y su participación en los ciclos biogeoquímicos, de vital importancia para el correcto funcionamiento del planeta (fijación del nitrógeno, de carbono, producción de
Actualmente los análisis biológicos, se basan principalmente en la técnica de PCR. Como se menciona a lo largo de este trabajo esta técnica posee algunas desventajas que deben ser considerados al momento de realizar los estudios y posterior análisis de los datos. Entre estos problemas se menciona la posibilidad de amplificar ciertos fragmentos frente a otros, la formación de quimeras y que el número de copias de un gen sea mayor en una especie que en otra, produciéndose apreciaciones erradas de las comunidades presentes en la muestra. Esta limitación será prontamente superada porque los métodos están en permanente revisión e innovación. Actualmente se utiliza Real Time PCR, el que se basa en los mismos principios de PCR pero el número de ciclos es menor y se realiza un análisis en tiempo real durante las amplificaciones de los primeros ciclos, consiguiéndose así eliminar los errores antes mencionados y se tiene la posibilidad de evaluar cuantitativamente la cantidad de especies presentes en la muestra.
de reciclar compuestos, permanezca sin ser alterado. En tanto las implicancias políticas se refieren a la responsabilidad tanto del estado como de la comunidad de preocuparse no tanto del aspecto físico del terreno sino también del estado interno del sitio. Además ellas tienen la responsabilidad de legislar sobre las condiciones del suelo actuales y los usos que se le den a este, ya sean industriales, agrícolas o habitacionales. Australia ha estado realizando investigaciones sobre metodologías para medir y cuantificar la biodiversidad de comunidades microbianas tanto en el suelo como en aguas subterráneas de manera de cuantificar el impacto de los sistemas de gestión de suelos, en particular agrarios, en la composición de estos ambientes, para así mantener sus funciones naturales. Se puede esperar que finalmente estas tecnologías servirán como monitoreo ambiental de las industrias y la agricultura desde el punto de vista de la sociedad moderna que busca la regulación ambiental. Este país no solo se preocupa por la biodiversidad
Como una manera de crecer como país en temas ambientales sería adecuado contemplar en la normativa nacional la contaminación del suelo, la necesidad de instaurar estudios de impacto para los nuevos proyectos industriales, así podría incluirse en la gestión ambiental el seguimiento temporal de la calidad del suelo, pudiéndose evitar la contaminación total de éste, puesto que si no se realiza una correcta gestión, finalmente se debería incurrir en altísimos costos para su remediación.
4. 2 CONCLUSIONES El estudio de la biodiversidad del suelo se basa principalmente en concluir el estado de las capacidades naturales del suelo para funcionar como tal, que puede ser basado en las técnicas moleculares reportadas en este estudio, pero aún en términos cualitativos mas que cuantitativos.
Se suele concebir que las técnicas moleculares podrían llegar a caracterizar cuantitativamente la biodiversidad de suelos. Este estudio permitió establecer que dada la complejidad de la constitución de suelos, tal posibilidad está aún lejana. La humanidad deberá primero incrementar su conocimiento y caracterización de suelos, antes de proceder con relaciones cuantitativas. Se concluye que el suelo es un recurso imprescindible para las actividades humanas, y según las normativas vigentes en el país, este recurso debe ser protegido. Una manera de hacerlo es implementando medidas preventivas. Proponiéndose el estudio de los parámetros biológicos como posible indicador de calidad del suelo.
CAPITULO 5 . BIBLIOGRAFIA
ABBONDANZI, F.; CACHADA, A.; TIZIANA, C.; Guerra, R.; RACCAGNI, M.; IACONDINI, A. 2003. Optimisation of a microbial bioassay for contaminated soil monitoring: bacterial inoculum standardisation and comparison with Microtox assay. Chemosphere 53: 889-897 ABED, R., SAFI, NIMER. KÖSTER, J.,DE BEER, D., EL-NAHHAL, Y., RULLKÖTTER, J Y GARCIA-PICHEL, F. 2002. Microbial diversity of heavily polluted microbial mat and its community changes following degradation of petroleum compounds. Appl. Environ. Microbiol. 68 (4):1674-1683. ATLAS, Ronald. Ecología microbiana y microbiología ambiental, Madrid, Addison-Wesley Iberoamericana, 2002. 677p.
BÜCHS, WOLFANG. 2003b. Biodiversity and agri-environmental indicatorsgeneral scopes and skills with special reference to the habitat level. Agric. Ecosyst. Environ. 98:35-78. CASTRO-LOPEZ, J. Uso Agronómico del Catastro de Suelos. [en línea]
[consulta:
25
noviembre 2004] COM (2001). The soil protection communication. Commission of the European Communities, Bruselas, 2001. COM, 2002: Towards a thematic strategy for soil protection. Commission of the European Communities. Bruselas, 2002. CONAMA, 2003. [en línea] Pasivos Ambientales en Chile: Desafíos de gestión e
DALY, HERMAN. [en línea]. Criterios operativos para el desarrollo sostenible [consulta:04 diciembre 2004] DUARTE, G., SOARES, A., SELDIN, L., ARAUJO, W. Y VAN ELSAS, J. (2001) Analysis of bacterial community structure in sulfurous-oil-containing soils and detection of species carrying dibenzothiophene desulfurization (dsz) genes. Appl.Environm.Microbiol. 67(3): 1052-1062. DUELLI, P. Y OBRIST, M. (1998) Biodiversity indicators: the choice of values and measures. Agric. Ecosyst. Environ. 98:87-98. EA-UK, Environmental Agency United Kingdom: “Dealing with contaminated land in England”. England, 2002.
FLYNN, S., LÖFFLER, F. y TIEDJE, J. (2000). Microbial community changes associated with a shift from reductive dechlorination of PCE to reductive dechlorination of cis-DCE and VC. Environ. Sci. Technol.34:1056-1061. FUNDACIÓN CHILE. Área de Medio Ambiente y Metrología Química, Programa de Remediación Ambiental. Gestión de Riesgos Asociados a Sitios Contaminados. Santiago, Chile. 2004. 141p. HAMEL, SEBASTIÁN. Informe jurídico sobre pasivos ambientales. Comisión Nacional del Medio Ambiente. Santiago, Chile. 2000. HERRERA, M., CRUZ, A. y URIBE,A., 2000.[en línea]. La utilización del análisis de la subunidad 16s del rrna para establecer la filogenia entre los organismos procariotes http://www.arareko.net/biology/rRNA_16S.html [consulta:20 octubre 2004]
LUDWIG,J., TONGWAY, D., BASTIN, G. y JAMES, C. (2003). Monitoring ecological indicators of rangeland functional integrity and biodiversity atlocal to regional scales. Australia MADIGAN, Michael, MARTINKO, John y PARKER, Jack. Brock Biología de los microorganismos. 8 ª ed. Madrid, Prentice Hall, 1999. 1064p. MAYDAK, Bonnie et al. 2001. The RDP-II ( Ribosomal Database project). Nucleic Acids Res. 29 (1):173-174 Microbial Ecology, 1999.
Ribosomal RNA as a tool in microbial ecology.
Molecular Microbial Ecology Workshop 1999. Nayagüez. MILLER, D., BRYANT, J., MADSEN, E. Y GHIORSE,W. (1999) Evaluation and optimazation of DNA Extraction and purification procedures for soil and
PAOLETTI, M.G. (1999) using Bioindicators based on biodiversity to assess landscape sustainability. En Büchs, W. (2003) Biodiversity and agrienvironmental indicators-general scopes and skills with special reference to the habitat level. Agric. Ecosyst. Environ. 98:35-78. OGRAM, A. y FENG, X. Methods of soil microbial community análisis. En : HURST, C., KNUDSEN, G. y McINERNEY, M. manual of Environmental Microbiology. Washington DC, ASM Press, 1997. pp 422-430. RITCHIE, N., SCHUTTER, M., DICK, R. y MYROLD, D. 2000. Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl. Environ. Microbiol. 66:1668-1675 ZYNDA, TODD 2000. [en línea] Michigan State University TAB Program
[consulta:
14
WIKIPEDIA,
2004
[en
línea]
Polymerase
chain
reaction
http://en.wikipedia.org/wiki/PCR#Example [consulta: 05 diciembre 2004] YU, Z., STEWART, G. Y MOHN, W. (2000). Apparent contradiction: psychrotolerant bacteria from hydrocarbon-contaminated arctic tundra soils that degrade diterpenoids synthesized by trees. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12): 5148-5154
APÉNDICE A: PROTOCOLOS DE ANÁLISIS
Las muestras de suelo deben ser pasadas a través de un tamiz de 2 mm, así se eliminan raíces y piedras que podrían estar presentes. Generalmente se mezclan todas las muestras de un sector para así homogeneizar el estudio. Los siguientes protocolos 11 sirven para la extracción de DNA del suelo para luego ser analizado en un gel de acrilamida para T-RFLP. El orden de los pasos es: 1. Kit de extracción de DNA 2. Pequeño volumen de los fragmentos amplificados por PCR ( 25 µl) para observar que el procedimiento de PCR funcionó bien. Realizar un gel de agarosa con bromuro de etidio para chequear el procedimiento.
Extracción DNA Usando el kit MoBIO (UltraClean Soil DNA Kit) (protocolo indicado por James Tiedje) Materiales: • • • •
El kit incluye 5 soluciones y todos los filtros y tubos necesarios. Centrífuga Balanza, autoclave Pipetas
Protocolo12 1. Sacar el suelo del refrigerador, a –40ºC 2. Añadir 0,25 g de suelo a 2 ml en la solución (bead solution según indica el fabricante). Vortex por 10 segundos 3. Añadir 60 µl de la solución 1 e invertir el tubo para mezclar. Agitar en Vortex por 10 minutos al máximo con los tubos tapados
mezcla nuevamente a un filtro rotatorio. Centrifugar un minuto y eliminar el flujo ( flow through) 10. Agregar 300
l de la solución 4. centrifugar por 30 segundos.
µ
Eliminar el flujo 11. Centrifugar nuevamente por 1 minuto 12. Agregar 50 µl de la solucion 5 ( 10mM Tris) en el centro de cada filtro. Centrifugar por 30 segundos. Extraer el filtro. 13. El DNA es estable en la solución 5 presente en el tubo. Guardar a –20ºC
Amplificación utilizando PCR
Volumen
Concentración final
2.5 µl
1x
DNTP mix ( 2.5 mM de cada dNTP)
2.0
200 µM
MgCl2 (50 mM)
0.75
1.5 µM
BSA (2500 µg/ml)
3.0
200µg/ml
H2O
14.5
8Fhex (12.5 µM)
0.5
0.25 µM
1392R(12.5 µM)
0.5
0.25 µM
Taq (5U/µl)
0.25
Para 25 µl 10X buffer sin Mg
DNA
1
1. Limpiar prolijamente el lugar donde se realizara el experimento 2. Si fuese necesario, hacer soluciones stock para BSA (concentración final de 2500 µg/ml), mix dNTP 810mM, 2.5 mM cada uno), partidor 8F (Hex) (12.5 µM) y para el primer 1392 R ( 12.5 µM) 3. Encender el termociclador (al menos 30 minutos antes de ser usado). Marcar los tubos de PCR ( pero no en las tapas de los tubos porque desaparecerán luego de realizados los ciclos) 4. Hacer el mix maestro en el lugar limpiado. Mantener todo el material en hielo. 5. Agregar el DNA a los tubos para PCR 6. Agregar los partidores y la taq a la muestra. Vortex. 7. Agregar la mezcla maestra a los tubos que contienen el DNA 8. Si se usa termociclador antiguo se debe agregar aceite mineral 100 para evitar que la solución hierva 9. Hacer funcionar el termociclador
l
µ
Gel de Agarosa Materiales necesarios •
Buffer de corrida TAE
•
Gel de agarosa al 1% con TAE (1X)
•
Tampón de carga
•
DNA ( fragmentos amplificados por PCR)
•
Marcador de DNA
Para hacer el gel de agarosa: 1. Disolver en un frasco de 125 ml, 0,5 g de agarosa en 50 ml 1x de TAE 2. Agitar la solución a baño maría, sin dejar que llegue a hervir 3. Insertar la peineta que servirá de moldes para los carriles de carga, en el molde para el gel. 4. Verter la solución en el molde para el gel, esperar que se solidifique 5. .Llenar la cámara horizontal de electroforesis con buffer TAE de forma que el gel quede cubierto
APENDICE B : GLOSARIO DE ABREVIACIONES
EPA : Environmental Protection Agency (Agencia para la protección ambiental estadounidense) PAH: Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (compuestos aromáticos policíclicos) PCR: Polimerasa Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) RFLP: Restriction Fragment Length Polimorfism (técnica molecular donde se realiza una medición de fragmentos de los polimorfismos presentes en las células por medio de enzimas de restricción) TRFLP: terminal Restriction Fragment Length Polimorfism (técnica molecular similar a la anterior pero el fragmento a analizar está marcado fluorescentemente) DNA: DeoxyriboNucleic Acid ( ácido desoxiribonucléico, polímero de nucleótidos correspondiente al material genético de las células, cuya estructura
APÉNDICE C: ACTIVIDADES Y SUS CONTAMINANTES RELA CIONADOS Ac tivi dad es realizadas en el sitio
Contaminantes típicos
Agricultura
Compuestos orgánicos volátiles, (VOCs), arsénico, cobre, pesticidas, insecticidas.
Reparación automóviles
de Algunos metales, varios compuestos orgánicos, solventes, desechos aceitosos, pintura.
Producción
de Metales pesados, solventes y ácidos
cosméticos Lavasecos y actividades VOCs como cloroformo y tetracloroetano; varios relacionadas solventes Producción de vidrio
Arsénico; plomo
municiones Producción de pinturas
Metales (como cromo, cadmio, plomo, y zinc); VOCs; cloroformo; etil benceno; solventes; pinturas; tintas
Producción pesticidas
de VOCs; arsénico; cobre; pesticidas; insecticidas; herbicidas; fungicidas; xilenos; compuestos orgánicos clorados; solventes
Refinerías de petróleo
Hidrocarburos del petróleo; benceno, tolueno, etilbenceno, xileno (BTEX); , combustibles, aceites y grasas
Producción farmacéutica plomo; varios orgánicos Producción de plásticos
químicos orgánicos; solventes
Polímeros; cadmio; solventes; resinas; aditivos químicos; VOCs
