Métodos basados en la dispersión de la radiación.

Análisis Instrumental, Instrumental, 12/13 - Capítulo II, Métodos de espectroscopia espectroscopia molecular

Capítulo 2.- Métodos de espectroscopia molecular

Olga Domínguez Renedo-M. Asunción Alonso Lomillo

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Tema 6.- Métodos basados en la dispersión de la radiación


Índice 6.1.- Fundamentos del fenómeno de dispersión disper sión de la radiación radia ción....................................... ....................................... 3 6.1.1.- Dispersión por partículas part ículas grandes ................................. ........................................................ .................................... ............. 3 6.1.2.- Dispersión Dispersi ón por partículas pequeñas ............................................. ................................................................... ...................... 5 6.1.2.1.- Dispersión Rayleigh ....................................... ............................................................. ............................................ ...................... 5 6.1.2.2.- Dispersión Raman ................................................. ....................................................................... ..................................... ............... 7 6.1.2.3.- Modelo ondulatorio de la dispersión Raman y Rayleigh ........................... ........................... 9 6.2.- Turbidimetría y nefelometría nefe lometría .......................................................... ................................................................................. ....................... 10 6.2.1.- Introducción ............................................ ................................................................... ............................................. ................................. ........... 11 6.2.2.- Turbidimetría .............................. .................................................... ............................................ ............................................. ......................... .. 11 6.2.3.- Nefelometría ....................................... .............................................................. .............................................. ...................................... ............... 12 6.2.4.- Instrumentación en turbidimetría y nefelometría ..................................... ............................................ ....... 13 6.2.4.1.- Fuentes de radiación ........................................... ................................................................. ...................................... ................ 13 6.2.4.2.- Celdas de muestra muestr a .......................................... ................................................................ .......................................... .................... 13 6.2.4.4.- Detectores .......................................... ................................................................ ............................................ ................................. ........... 13 6.2.4.5.- Instrumentos: turbidímetros y nefelómetros ............................................ ............................................ 14 6.3.- Espectroscopia Raman ....................................................... .............................................................................. .................................... ............. 15 6.3.1.- Introducción ............................................ ................................................................... ............................................. ................................. ........... 15 6.3.2.- Instrumentación en espectroscopia es pectroscopia Raman ................................................. ..................................................... .... 16 6.3.2.1.- Fuentes de radiación ........................................... ................................................................. ...................................... ................ 16 6.3.2.2.- Sistemas de iluminación de la muestra ............................................... .................................................... ..... 17 6.3.2.3.- Espectrómetros Raman........................................... ................................................................. .................................. ............ 20 6.3.3.- Comparación de la espectroscopia Raman con los métodos basados en la absorción molecular en el infrarrojo ............................................ ................................................................... ............................... ........ 22 6.3.4.- Otros tipos ti pos de espectroscopia Raman................. Ra man....................................... ............................................. ....................... 24 6.3.4.1.- Espectroscopia Raman Ra man de resonancia ................................................. ...................................................... ..... 24 6.3.4.2.- Espectroscopia Raman de superficie aumentada ..................................... ..................................... 26 6.3.4.3.- Espectroscopia Raman no lineal ...................................................... .............................................................. ........ 27 6.4.- Referencias ......................................................... ............................................................................... ............................................. .............................. ....... 29

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Análisis Instrumental, 12/13 - Capítulo II, Métodos de espectroscopia molecular

6.1.- Fundamentos del fenómeno de dispersión de la radiación En este tema se tratarán los métodos basados en el fenómeno de interacción de la radiación electromagnética con la materia conocido como dispersión.

Tal y como se vio en el tema anterior, responder a preguntas obvias como ¿por qué el cielo es azul? o ¿por qué se torna rojo al atardecer? han permitido el desarrollo de la ciencia. La respuesta a estas preguntas se encuentra en un fenómeno de interacción de la radiación electromagnética con la materia conocido como dispersión.

La dispersión puede explicarse como un proceso de interacción de la radiación electromagnética con partículas de pequeño tamaño, que da lugar a oscilaciones en las cargas eléctricas de la materia y, los dipolos así inducidos emiten ondas secundarias en todas las direcciones [1].

E=0

h i

Ei  0

Dipolo inducido

La dispersión causada por la materia puede ser de diferente naturaleza según sea el tamaño de las partículas implicadas. En los siguientes apartados se describen los diferentes tipos de dispersión.

6.1.1.- Dispersión por partículas grandes

La dispersión por partículas grandes es conocida como dispersión Tyndall y, toma dicho nombre de su descubridor, el físico irlandés John Tyndall. Este fenómeno de dispersión se presenta cuando el diámetro de las partículas que producen la dispersión


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es igual o mayor que la longitud de onda de la radiación incidente. Se trata de un tipo de dispersión provocada por partículas de dimensiones coloidales y llega a ser tan intensa que el ojo humano puede verla [2, 3]. La medida de la radiación dispersada sirve para determinar el tamaño y la configuración de ciertas moléculas poliméricas y partículas coloidales [2]. John Tyndall (1820 -1893)

En el caso de la dispersión Tyndall, la intensidad de dispersión alrededor de las partículas grandes se distribuye de modo no homogéneo debido a interferencias constructivas y destructivas entre las ondas (Fig. 6.1.).

Radiación dispersada I0 ( )

ID ( )

Radiación incidente Partícula grande

Figura 6.1.- Distribución de intensidades de la dispersión producida por una partícula grande (Dispersión Tyndall)

Por otra parte, la longitud de onda de la radiación dispersada es idéntica a la de la radiación incidente lo que impide su empleo en análisis cualitativo, ya que la radiación dispersada no es característica de una especie en particular [3].

El valor de la intensidad dispersada depende de varios factores entre ellos la longitud de onda de la radiación incidente de modo que, con frecuencia, la intensidad de la radiación dispersada es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda, de dicha radiación incidente [3].

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6.1.2.- Dispersión por partículas pequeñas

La dispersión por partículas pequeñas puede ser de dos tipos: dispersión Rayleigh y dispersión Raman. Ambos fenómenos tienen lugar cuando el diámetro de las partículas causantes de la dispersión es pequeño en comparación con la longitud de onda de la radiación incidente. Los tipos de dispersión tienen lugar cuando existen moléculas en disolución e iones poliatómicos [3].

6.1.2.1.- Dispersión Rayleigh

El fenómeno conocido como dispersión Rayleigh toma también su nombre de su descubridor, el físico británico John Rayleigh. Al igual que en el caso de la dispersión Tyndall la radiación dispersada conserva la longitud de onda de la radiación incidente pero, a diferencia John William Strutt Rayleigh (1842 -1919)

que en la Tyndall, en la dispersión Rayleigh la distribución de intensidades dispersadas es simétrica (Fig. 6.2.) [1].

Radiación dispersada ID I0 ( ) Radiación incidente Partícula de reducidas dimensiones

Figura 6.2.- Distribución de intensidades de la dispersión producida por una partícula pequeña (Dispersión Rayleigh)

La intensidad de la radiación dispersada se relaciona fácilmente con la longitud de onda de la radiación incidente, con las dimensiones de las partículas dispersantes y con la polarizabilidad [1]:


5


I D 

Donde:

8 4 2 4

2

 r

 ( 1  cos 2  )  I 0

[Ecuación 6.1.]

 = polarizabilidad de la partícula  = longitud de onda de la radiación incidente I 0 = Intensidad incidente  = ángulo entre el rayo incidente y el dispersado r = distancia entre el centro de dispersión al detector

Los cambios energéticos que ocurren durante la dispersión Rayleigh pueden verse en la figura 6.3. Normalmente, la partícula (molécula o ion poliatómico) causante de la dispersión se encuentra en el estado energético vibracional más bajo del estado electrónico fundamental. Cuando un fotón interacciona con dicha partícula produce un aumento en la energía de la misma. El aumento de energía es igual a la energía del fotón (h i). La partícula vuelve inmediatamente a un estado de energía inferior, emitiendo la correspondiente cantidad de energía idéntica a la radiación incidente. Podemos ver como en la dispersión Rayleigh la intensidad de la radiación dispersada conserva la frecuencia y por tanto la longitud de onda de la radiación incidente [1-3].

Estado electrónico excitado Estado virtual h i

h i

Radiación incidente

Radiación dispersada Estados vibracionales

Estado electrónico fundamental

Figura 6.3.- Origen de la dispersión Rayleigh

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6.1.2.2.- Dispersión Raman Un tercer tipo de dispersión es la conocida como dispersión Raman. El efecto Raman fue descubierto, en 1928, por el físico indio Chandrasekhara Venkata Raman Chand rasekharVenkata Raman (1888-1970)

lo que supuso la obtención del premio Nobel de física en 1930. Raman observó que cuando un haz de radiación

monocromática incide sobre un conjunto de moléculas, parte de esta radiación es dispersada; la mayor parte de esta radiación dispersada posee la misma frecuencia que la radiación incidente (dispersión Rayleigh) pero una pequeña parte presenta una variación de frecuencia. La diferencia entre estas nuevas frecuencias y la frecuencia de la radiación original es característica de la molécula irradiada y numéricamente igual a algunas frecuencias de vibración y rotación de la molécula [1].

Los cambios energéticos que ocurren durante la dispersión Raman pueden verse en las figuras 6.4 y 6.5. Al igual que en el caso anterior, cuando un fotón interacciona con la partícula dispersante ésta aumenta su energía alcanzando un estado energético virtual. Inmediatamente la partícula puede perder energía pero retornando esta vez a un nivel vibracional superior al fundamental, en este caso la frecuencia de la radiación emitida es diferente a la de la radiación incidente. De hecho, la frecuencia de la radiación dispersada es menor que la del fotón incidente. Este fenómeno de dispersión recibe el nombre de dispersión Raman Stokes (Fig. 6.4.) [1, 2].


h S


Radiación dispersada

h v

Estado electrónico fundamental s

Estados vibracionales

=  i- v

s

<  i

Figura 6.4.- Origen de la dispersión Raman Stokes


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Por otra parte, si la partícula causante de la dispersión se encuentra inicialmente en un nivel vibracional superior al fundamental cuando la partícula pierda energía, después de interaccionar con el fotón incidente, la dispersión puede tener lugar de modo que la partícula regrese a un nivel vibracional inferior al de partida. Nos encontramos ante la denominada dispersión Raman anti-Stokes (Fig. 6.5.). En este caso la radiación dispersada efectivamente tendrá una frecuencia diferente a la incidente siendo de hecho superior.


h as



h v

Estado electrónico fundamental  as


=  i+ v

 as

>  i

Figura 6.5.- Origen de la dispersión Raman anti-Stokes Es mucho más probable que ocurra la dispersión Rayleigh que la dispersión Raman debido a que el fenómeno más probable es la transferencia de energía a moléculas en el estado fundamental y la reemisión al retornar esas moléculas al estado fundamental. Del mismo modo, la emisión Stokes está mucho más favorecida que la anti-Stokes [2].

El cambio en la frecuencia de la radiación emitida mediante dispersión Raman respecto a la de la radiación incidente es importante para el análisis. Debido a que este cambio en la frecuencia se corresponde a la diferencia de energía entre niveles vibracionales de la molécula, la técnica presenta información característica de dicha molécula y puede emplearse en análisis cualitativo. Además, dicha información es comparable pero no idéntica a la subministrada por las técnicas basadas en la absorción en el infrarrojo [3].

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6.1.2.3.- Modelo ondulatorio de la dispersión Raman y Rayleigh

La radiación electromagnética que incide sobre una disolución de un analito presenta un campo eléctrico conocido cuya fuerza varía con la frecuencia de vibración de dicha radiación (i). El campo eléctrico de esta radiación se puede representar entonces mediante la ecuación,

E i  E 0 cos ( 2 i t )

[Ecuación 6.2.]

donde E 0 es la amplitud de la onda.

Cuando este campo eléctrico interacciona con la nube electrónica de un enlace del analito, induce un momento dipolar  en el enlace que viene dado por,

   E i   E i2   E i3  ...

[Ecuación 6.3.]

Debido a que  es normalmente mayor que  que es a su vez mayor que  , etc., solamente el primer sumando de la ecuación puede considerarse importante. Por lo tanto la Ec. 6.3 queda simplificada según,

  E i   E 0 cos ( 2 i t )

[Ecuación 6.4.]

donde  es la polarizabilidad del enlace y es una medida de la deformabilidad del mismo cuando se encuentra en un campo eléctrico. Se genera entonces un dipolo inducido oscilante que emite radiación electromagnética en todas direcciones.

Para que un enlace sea activo en espectroscopia Raman, la polarizabilidad  del enlace ha de variar en función de la distancia entre los núcleos, de acuerdo con la siguiente ecuación,

     r 

   0  ( r  r eq )


[Ecuación 6.5.]

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donde  0 es la polarizabilidad del enlace a una distancia internuclear de equilibrio (r eq) y r es la separación internuclear en un instante dado. Naturalmente la separación internuclear varía con la frecuencia de la vibración (vib), según la siguiente expresión,

r  r eq  r m cos ( 2 vib t )

[Ecuación 6.6.]

donde r m es la separación internuclear máxima en relación con la posición de equilibrio. Sustituyendo la Ec. 6.6 en la Ec. 6.5 se obtiene,

   r m cos ( 2 vib t )  r 

   0  

[Ecuación 6.7.]

Sustituyendo la [Ecuación 6.7.] en la [Ecuación 6.4.], se puede obtener una expresión para el momento dipolar inducido,  . De esta forma,

    cos ( 2 vib t ) cos ( 2 i )  r 

   0 E 0 cos (2 i t )  E 0 r m 

[Ecuación 6.8.]

Operando en esta expresión se obtiene,

   0 E 0 cos ( 2 it ) 

E 0 2

E        cos [ 2 (  i   vib )t ]  0 r m   cos [ 2 (  i   vib )t ] r 2 r      

r m 

[Ecuación 6.9.]

El primer término en esta ecuación representa la dispersión Rayleigh, que tiene lugar a una frecuencia de excitación  i. El segundo y el tercer término de la [Ecuación 6.9.] corresponde a las frecuencias Stokes y anti-Stokes, respectivamente.

6.2.- Turbidimetría y nefelometría Este apartado está dedicado al estudio de dos técnicas basadas en el fenómeno de la dispersión de la radiación electromagnética: turbidimetría y nefelometría.

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6.2.1.- Introducción

La turbidimetría y la nefelometría son técnicas analíticas basadas en la dispersión de la radiación electromagnética por partículas en suspensión en el seno de una disolución. La diferencia entre estas dos técnicas se encuentra en la forma de medir la radiación dispersada (Fig. 6.6.). En la turbidimetría se mide la disminución de la intensidad de la radiación emitida por la fuente al atravesar la disolución de la muestra, mientras que en la nefelometría se mide la radiación dispersada según una dirección que forma un ángulo, generalmente de 90º, con la radiación incidente [1]. Radiación incidente

Radiación transmitida Muestra

I0

Turbidimetría I


ID

I 0 >I

Nefelometría

Figura 6.6.- Turbidimetría y nefelometría

6.2.2.- Turbidimetría

Las medidas turbidimétricas se basan en la medida del decrecimiento de la intensidad de la radiación incidente causada por la dispersión. Esta medida es completamente análoga a las medidas absortivas. Ahora bien la reducción de la intensidad es debida en esta ocasión a la dispersión y no a la absorción de radiación electromagnética [3].

A concentraciones bajas de analito dispersante es posible definir una ecuación similar a la ya explicada ley de Beer (Sección 3.3), que describe la relación entre la intensidad de la radiación incidente ( I 0), la intensidad de la radiación transmitida ( I ) y, por lo tanto no dispersada, y la concentración de las partículas dispersantes (C ): S  log

Ι

Ι 0

 k·b·C


[Ecuación 6.10.]

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donde S hace referencia a la “turbidancia” debida a la dispersión (término análogo a la absorbancia), k es una constante de proporcionalidad, a veces designada como coeficiente de turbicidad y b es el camino óptico. El valor de k depende del tamaño y forma de la partícula, de la longitud de onda y de los índices de refracción de las partículas en suspensión y del medio [1].

Las medidas turbidimétricas son más precisas cuando la relación I/I 0 se aleja del valor 0 o de 1. Debido a que las dispersiones Rayleigh y Raman producen pequeños cambios en la intensidad de la radiación incidente, las medidas turbidimétricas no suelen basarse en este tipo de dispersiones sino en la ya descrita dispersión Tyndall [3].

6.2.3.- Nefelometría

Las medidas nefelométricas son similares a las medidas fluorimétricas ya descritas (Sección 4.3.2). En esta ocasión se mide la radiación dispersada que forma un ángulo de 90º con la radiación incidente [3].

Al igual que en el caso de la fluorescencia, en nefelometría es posible definir una ecuación que relacione la intensidad de la radiación dispersada ( I D), la intensidad de la radiación incidente ( I 0), y la concentración de las partículas causantes de la dispersión [3],

 D  k · 0 ·C

[Ecuación 6.1.]

donde k es una constante del sistema determinada empíricamente. Puede verse que al igual que en el caso de las medidas de fluorescencia, la intensidad medida es proporcional a la intensidad de la radiación incidente y a la concentración de analito. Cuando se trabaja con concentraciones bajas de partículas dispersantes es mejor emplear una elevada intensidad de radiación incidente. En el caso de la nefelometría es posible emplear los tres tipos de dispersión que se han descrito en el tema (Rayleigh, Tyndall y Raman) [3].

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6.2.4.- Instrumentación en turbidimetría y nefelometría

Muchos de los instrumentos empleados en turbidimetría y nefelometría son similares a los vistos para las técnicas espectrofotométricas descritas en temas anteriores. Por lo tanto, los siguientes apartados se centrarán en la descripción de aquellos detalles más característicos o propios de estas técnicas.

6.2.4.1.- Fuentes de radiación

En el caso de los turbidímetros es necesario emplear fuentes monocromáticas y emplear monocromadores que reduzcan al mínimo la absorción. En el caso de los nefelómetros puede emplearse radiación policromática. En ambos casos se debe disponer de una fuente de intensidad elevada y, siempre que sea posible, se debe trabajar a longitudes de onda cortas ya que ello aumenta la eficacia de la dispersión. Normalmente se emplean fuentes que emiten radiación de la zona del visible. Una de las fuentes habituales es la de vapor de mercurio, junto con filtros que permitan aislar una de las líneas. Otra fuente común es la lámpara de wolframio con monocromador o filtros [1].

6.2.4.2.- Celdas de muestra

Generalmente se emplean cubetas cilíndricas, pero es preferible disponer de cubetas con caras planas ya que así se reducen al mínimo las reflexiones y dispersiones múltiples debidas a la cubeta [1].

6.2.4.4.- Detectores

En el caso de la turbidimetría pueden emplearse detectores corrientes, tales como los fototubos de vacío, pero en el caso de la nefelometría deben utilizarse tubos fotomultiplicadores, ya que la intensidad de la radiación dispersada suele ser muy pequeña [1].


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6.2.4.5.- Instrumentos: turbidímetros y nefelómetros

Las medidas turbidimétricas se realizan con un sistema intrumental denominado turbidímetro similar a los espectrofotómetros descritos en temas anteriores (Fig. 6.7.).

Detector Fuente Registro

Muestra Selector de longitud de onda

Figura 6.7.- Esquema de un instrumento empleado para la realización de medidas turbidimétricas

En cuanto a las medidas nefelométricas, en la figura 6.8 se muestra un esquema de un nefelómetro en el que puede verse como, efectivamente, el detector se encuentra en una posición situada formando 90º con la radiación incidente.

Muestra

Fuente

Selector de longitud de onda

Selector de longitud de onda

Detector Registro

Figura 6.8.- Esquema de un instrumento empleado para la realización de medidas nefelométricas

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6.3.- Espectroscopia Raman En los apartados anteriores se han descrito dos técnicas, turbidimetría y nefelometría, empleadas en el análisis cuantitativo. Sin embargo, dichas técnicas no son útiles en análisis cualitativo, ya que el tipo de dispersión en el que se basan (Rayleigh y Tyndall) se caracteriza por la ausencia de variación de longitud de onda entre la radiación dispersada y la radiación incidente. En este apartado se hará referencia a un tipo de técnica basada en la dispersión Raman, útil en análisis cualitativo y cuantitativo, que por lo tanto, permite no solo la cuantificación sino también la identificación de las especies presentes en una muestra.

6.3.1.- Introducción

Los espectros Raman se obtienen al irradiar una muestra con una potente fuente láser de radiación monocromática visible o infrarroja. Durante la irradiación, se registra el espectro de la radiación dispersada un cierto ángulo (por lo general 90 grados) con un espectrómetro adecuado [2].

En la figura 6.9 se representa una parte del espectro Raman, obtenida al irradiar una muestra de tetracloruro de carbono con un intenso haz de un láser de argón de -1

longitud de onda 488 nm (20.492 cm ). La radiación medida es de tres tipos: dispersión Stokes, dispersión anti-Stokes y dispersión Rayleigh. [2].

Como es usual en los espectros Raman, en la abscisa de la figura 6.9 se representa el desplazamiento del número de onda  , que se define como la diferencia, -1

en números de onda (cm ), entre la radiación observada y la de la fuente. En dicha figura puede observarse que existen tres picos Raman a cada lado del pico Rayleigh, y que el modelo de desplazamiento es idéntico en ambos lados. Es decir, las líneas Stokes se encuentran a unos números de onda inferiores al del pico Rayleigh en 218, 314 y 459 cm-1, mientras que los picos anti-Stokes aparecen a números de onda superiores al de la fuente en 218, 314 y 459 cm-1. Es bastante general que las líneas anti-Stokes sean


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apreciablemente menos intensas que las correspondientes líneas Stokes. Por esta razón únicamente se suele utilizar la parte Stokes del espectro [2].

459

d a d i s n e t n I

314 218

-218

-314

-459

0

   fuente   dispersada Figura 6.9.- Espectro Raman del CCl 4 excitado con una radiación láser de 488 nm.

6.3.2.- Instrumentación en espectroscopia Raman

La función primaria de un instrumento Raman es rechazar limpiamente la intensa dispersión Rayleigh y detectar los componentes débiles de frecuencias Raman desplazadas [4].

Los instrumentos empleados en espectroscopia Raman moderna constan de tres componentes: una fuente láser, un sistema de iluminación de la muestra y un espectrómetro adecuado.

6.3.2.1.- Fuentes de radiación

Las fuentes utilizadas en la espectroscopia Raman moderna son casi siempre láseres debido a su alta intensidad, necesaria para producir dispersión Raman lo

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suficientemente intensa como para poderse medir con una relación señal/ruido razonable. En la Tabla 6.1 se enumeran cinco de los láseres más utilizados en espectroscopia Raman [2].

Tabla 6.1.- Algunas fuentes láser comunes en espectroscopia Raman

Tipo de fuente

Longitud de onda, nm

Ion argón

488,0 o 514,5

Ion criptón

530,9 o 647,1

Helio/neón

632,8

Láser de diodos

782 o 830

Nd/YAG

1064

Debido a que la intensidad de la dispersión Raman aumenta con el inverso de la cuarta potencia de la longitud de onda, las fuentes de argón y criptón, que emiten en la región azul y verde del espectro, presentan ventajas sobre las otras fuentes mostradas en la tabla. Sin embargo, las fuentes del infrarrojo cercano presentan dos ventajas importantes sobre los láseres de longitud de onda más corta. La primera es que pueden funcionar a potencias muy superiores, sin producir fotodescomposición de la muestra. La segunda es que no son lo suficientemente energéticas para poblar, en la mayoría de las moléculas, un número significativo de estados electrónicos excitados capaces de producir fluorescencia. Como consecuencia con estos láseres, la fluorescencia es, en general, mucho menos intensa o inexistente [2].

6.3.2.2.- Sistemas de iluminación de la muestr a

La manipulación de las muestras en espectroscopia Raman es más sencilla que en espectroscopia de infrarrojo, debido a que puede emplearse vidrio para las ventanas, lentes y otros componentes ópticos, en lugar de los haluros cristalinos que resultan más frágiles y menos estables a los componentes atmosféricos [2]. Olga Domínguez Renedo-M. Asunción Alonso Lomillo

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En función de la naturaleza de la muestra a analizar se pueden definir diferentes tipos de sistemas de iluminación.

Muestras líquidas

Las muestras líquidas pueden ser analizadas empleando celdas tan pequeñas como un simple capilar de vidrio (Fig. 6.10a.). El empleo de estas reducidas dimensiones es posible debido a que la fuente láser se puede enfocar con facilidad sobre una zona pequeña de la muestra y, a su vez, la radiación emitida enfocarla eficazmente sobre una rendija. Una celda cilíndrica de mayores dimensiones, como la mostrada en la figura 6.10b, puede emplearse para reducir el calentamiento local, particularmente en el caso de especies absorbentes. El rayo láser es focalizado en una zona cerca de la pared de la celda para minimizar la absorción. Además la reducción del calor localizado puede realizarse también rotando la celda [5].

(a)

(b)

Figura 6.10.- Sistemas de iluminación para espectroscopía Raman de muestras líquidas. En (a) capilares, (b) celdas cilíndricas

Muestras gaseosas

El análisis de muestras gaseosas se lleva a cabo normalmente en tubos de vidrio de diámetros comprendidos entre 1 y 2 cm (Fig. 6.11.). Esta cubeta se coloca a menudo entre los espejos de la fuente láser, lo que da lugar a un aumento de la potencia de excitación [5].

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Figura 6.11- Sistema de iluminación para espectroscopía Raman de muestras gaseosas

Muestras sólidas

Los espectros Raman de muestras sólidas se adquieren con frecuencia mediante el llenado de una pequeña cavidad o un capilar con la muestra. En algunos casos es posible emplear perlas de KBr similares a las empleadas en infrarrojo [2, 5].

Muestreo con fibra óptica

Una de las ventajas de la espectroscopia Raman es que se emplea radiación del visible o del infrarrojo cercano que puede ser transmitida a una gran distancia gracias al empleo de fibra óptica. Una fibra óptica puede introducirse en la disolución de la muestra o ser empleada para iluminar sólidos. Una segunda fibra recolecta la dispersión Raman producida y la transporta a la entrada del espectrómetro (Fig. 6.12.).


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Fibra de excitación

Monocromador

Detector

Fibra de emisión

Microscopio

Muestra

Láser

Figura 6.12.- Instrumento Raman con fibra óptica

6.3.2.3.- Espectrómetros Raman

Hasta comienzos de los años ochenta, los espectrómetros Raman tenían diseños semejantes y utilizaban el mismo tipo de componentes que los instrumentos dispersivos ultravioleta-visible clásicos. La mayoría empleaban sistemas de doble red para minimizar la radiación no deseable que llega al detector. Como detectores se utilizaban fotomultiplicadores. Sin embargo, en la actualidad, la mayoría de los espectrómetros Raman que se comercializan son instrumentos de transformada de Fourier con detectores de germanio o instrumentos multicanal con dispositivos de acoplamiento de carga [2].

En la figura 6.13 se muestra un esquema de un instrumento de transformada de Fourier empleado en Raman. Se trata de un sistema que contiene un interferómetro similar al empleado en espectroscopia de infrarrojo. El instrumento cuenta además con filtros para evitar la llegada al detector de radiación no deseada [2].

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Detector 

Espejo fijo Divisor del haz 

Muestra

Espejo móvil Filtro

Láser

Figura 6.13.- Instrumento Raman con transformada de Fourier Otro ejemplo típico de espectrómetro Raman es el mostrado en la figura 6.14. Este dispositivo emplea un detector de acoplamiento de carga. El dispositivo cuenta además con un sistema de muestreo basado en el empleo de fibra óptica [2].

Filtro

Sonda para muestra

Láser



Muestra

Red  Detector 

CCD

Figura 6.14- Instrumento Raman dispersivo con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD)


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6.3.3.- Comparación de la espectroscopia Raman con los métodos basados en la absorción molecular en el infrarrojo

La diferencia de energía observada para un enlace determinado en el experimento Raman debería ser idéntica a la energía de una banda de absorción en el infrarrojo, siempre que los modos de vibración implicados sean activos tanto en la absorción en el infrarrojo como en la dispersión Raman.

Estado virtual h i

h s

h v h v Absorción IR


Dispersión Raman

En efecto, para una especie determinada, el espectro de dispersión Raman y el espectro de absorción en el infrarrojo, con frecuencia, suelen parecerse mucho. Sin embargo, hay suficientes diferencias entre los tipos de grupos funcionales que son activos en el infrarrojo y los que lo son en Raman, como para que ambas técnicas no resulten competitivas sino complementarias. No es sorprendente encontrar diferencias entre un espectro Raman y un infrarrojo si se considera que los mecanismos básicos, aunque depende de los mismos modos vibracionales, surgen de procesos que son mecanísticamente diferentes [2].

Debido a esta diferencia fundamental en el mecanismo, la actividad Raman de un modo vibracional determinado puede diferir marcadamente de su actividad en el infrarrojo. En este sentido, la espectroscopia Raman puede utilizarse para detectar y analizar moléculas inactivas en el infarrojo, como las diatómicas homonucleares como el N2. Tal y como se observa en la figura 6.15, la molécula N 2 es inactiva en el infrarrojo (la vibración no produce un cambio en el momento dipolar de la molécula) pero, es activa en Raman (la vibración produce un cambio de polarizabilidad) [2].

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N

N

N

N

N

N

=0

N

=0

N

=0

N

N

N

N

(a)

(b)

Figura 6.15- Variación (a) del momento dipolar, (b) de la polarizabilidad con el modo de vibración de tensión en la molécula de N 2

Por otra parte, ambas técnicas pueden resultar complementarias en el estudio de determinadas moléculas que presente diferentes modos de vibración, algunos de los cuales pueden ser activos en el infrarrojo pero no en Raman y viceversa, tal y como puede verse en las figuras 6.16 y 6.17 para la molécula de CO 2.

O

C

O

O

C

O

O

C

O

=0

=0

O

C

O

O

C

O

=0

O

C

(a)

O

(b)

Figura 6.16- Variación (a) del momento dipolar, (b) de la polarizabilidad con el modo de vibración de tensión simétrico en la molécula de CO 2

O

C

O

O

O

C

C

O

=0

0

O

≠

O

≠

0

(a)

C

O

O

O

C

C

O

=cte

O

=cte

(b)

Figura 6.17- Variación (a) del momento dipolar, (b) de la polarizabilidad con el modo de vibración de tensión asimétrico en la molécula de CO 2


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En otros casos, los modos de vibración pueden ser activos tanto en Raman como en infrarrojo. Por ejemplo, todos los modos de vibración del dióxido de azufre producen picos Raman y en el infrarrojo. Sin embargo, el tamaño de los picos difiere debido a que la probabilidad de transiciones es distinta para los dos mecanismos. Por ello, en algunas moléculas complicadas, cuya baja simetría no prohíbe la actividad, tanto en infrarrojo como en Raman, algunos modos vibracionales son inherentemente más intensos en el efecto Raman, y más débiles, o nulos, en los espectros de infrarrojo [2, 4].

Para resolver algunos problemas el infrarrojo es una herramienta superior, sin embargo, para otros el Raman proporciona espectros más útiles. Una ventaja importante de los espectros Raman con respecto a los del infrarrojo, se debe al hecho de que el agua no produce interferencias y, por tanto, es posible obtener los espectros Raman de disoluciones acuosas. Además, se pueden utilizar cubetas de cuarzo, lo que evita el inconveniente de tener que trabajar con ventanas de NaCl o de otros materiales inestables en la atmósfera. A pesar de esas ventajas, la espectroscopia Raman no ha sido muy utilizada por los químicos para los estudios estructurales hasta que en los años sesenta se pudo disponer de los láseres, los cuales han permitido obtener los espectros con mayor facilidad. Otro impedimento para la utilización de la espectroscopia Raman ha sido la interferencia de la fluorescencia de la muestra o de sus impurezas. Este problema se ha solucionado en gran medida en la actualidad con el uso de fuentes de láser de infrarrojo [2].

6.3.4.- Otros tipos de espectroscopia Raman

Con el desarrollo de los láseres sintonizables a principios de los setenta se desarrollaron varios métodos nuevos de espectroscopia Raman. A continuación se tratan brevemente algunas de estas técnicas.

6.3.4.1.- Espectroscopia Raman de resonancia

Este tipo de espectroscopia se basa en la utilización de radiación incidente cuya frecuencia es la misma que la necesaria para causar la excitación de especies

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absorbentes a un estado de energía electrónico superior al fundamental. Bajo estas circunstancias, las magnitudes de los picos Raman asociados con las vibraciones más simétricas aumentan considerablemente. Como consecuencia, se han podido obtener espectros Raman de resonancia con concentraciones de analito tan bajas como 10

-8

M.

Estos niveles de sensibilidad contrastan con los estudios Raman normales, los cuales se limitan, de ordinario, a concentraciones mayores de 0.1 M [2].

En la figura 6.18 se muestran los cambios de energía responsables de la dispersión Raman de resonancia. En dicha figura se muestra también la diferencia con la fluorescencia. Puede verse como el electrón una vez promocionado a un estado electrónico excitado sufre una relajación inmediata a un nivel vibracional del estado electrónico fundamental. En este caso el proceso de relajación no está precedido por un relajamiento previo al estado vibracional mínimo del estado excitado, como ocurre en la fluorescencia. Por lo tanto, el proceso de emisión Raman de resonancia es, esencialmente, instantáneo y el espectro resultante consiste en bandas estrechas [4].


Estado electrónico excitado

Estado electrónico fundamental

Estados vibracionales Raman de resonancia

Fluorescencia

Figura 6.18.- Diagrama de energías para la dispersión Raman de resonancia y emisión fluorescente.

La intensidad de las líneas en un experimento Raman de resonancia aumenta rápidamente cuando la longitud de onda de excitación se aproxima a la longitud de onda del pico de absorción electrónica. Así, para conseguir el mayor incremento de señal en


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un intervalo ancho de máximos de absorción, se necesita un láser sintonizable. Con una radiación láser intensa, la descomposición de la muestra se puede convertir en un problema debido a que los picos de absorción electrónica, con frecuencia, se dan en la región ultravioleta. Expresamente, la absorción intensa da lugar a un calentamiento local en la muestra que produce la descomposición del analito. Para evitar este problema, es una práctica normal desplazar la muestra de forma circular por delante del haz enfocado del láser [2].

La principal limitación de la espectroscopia Raman de resonancia radica en la interferencia causada por la fluorescencia del propio analito o de otras especies presentes en la muestra [2].

6.3.4.2.- Espectroscopia Raman de superficie aumentada

La espectroscopia Raman de superficie aumentada (SERS, de Surface Enhanced Raman Spectroscopy) supone la obtención de espectros de la manera usual, de muestras que se absorben sobre la superficie de partículas metálicas coloidales (normalmente plata, oro o cobre) o sobre superficies rugosas de piezas de estos metales. Por razones del todo no comprendidas, las líneas Raman de la molécula adsorbida a menudo se 3

6

incrementan en un factor de 10 a 10 . Cuando el incremento de su superficie se combina con la técnica de resonancia aumentada, tratada en el apartado anterior, el incremento neto de la intensidad de la señal es más o menos el producto de la intensidad producida por ambas técnicas. En consecuencia se han llegado a conseguir límites de detección de 10-9 a 10-12 M [2].

Se han utilizado varias técnicas para la manipulación de la muestra en la espectroscopia de superficie aumentada. En una de las técnicas, partículas de plata u oro coloidal se suspenden en una disolución diluida (normalmente acuosa) de la muestra. A continuación, la disolución se mantiene o se hace fluir a través de un tubo de vidrio estrecho mientras se excita con un haz láser. En otro de los métodos, se deposita una delgada película de partículas metálicas coloidales sobre una placa de vidrio, y se añaden una o dos gotas de disolución de la muestra sobre la película. A continuación se obtiene el espectro Raman de la forma usual. Alternativamente, la muestra se puede

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depositar sobre un electrodo metálico rugoso, que a continuación se retira de la disolución y se expone a la fuente de excitación láser [2].

6.3.4.3.- Espectroscopia Raman no lineal

Las técnicas no lineales presentan ventajas sobre la espectroscopia Raman lineal. Se trata de técnicas con mayor eficiencia y menos susceptibles a la interferencia por la fluorescencia [2].

Entre los métodos no lineales se encuentran: dispersión Raman estimulada, efecto hiper Raman, ganancia Raman estimulada, espectroscopia Raman inversa, espectroscopia Raman Stokes coherente y espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS, de Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy). La más popular de estas técnicas no lineales es sin duda la espectroscopia CARS por ello vamos a describirla con un poco más de detalle.

Espectroscopia CARS

En la figura 6.19 se muestra un diagrama sencillo del sistema instrumental empleado para llevar a cabo un análisis mediante CARS. Puede verse como la técnica requiere del empleo de dos láseres de elevada intensidad. Normalmente se trata de fuentes que emiten radiación de la zona del visible. Los haces de radiación procedentes de ambos láseres son enfocados simultáneamente sobre la muestra. Uno de los láseres emite radiación de frecuencia fija (1) mientras que el otro láser es sintonizable y emite radiación de frecuencia variable (2). En la técnica se registra la frecuencia de la radiación anti-Stokes dispersada (as) a medida que la frecuencia 2 del láser sintonizable es modificada [3].

Los dos rayos láser se combinan en la muestra para formar un rayo coherente de frecuencia 3 ( 3 = 21 - 2). La frecuencia as medida es únicamente intensa cuando la diferencia entre 1 y 2 se corresponde con la diferencia de energía que existe entre el


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nivel vibracional fundamental y el nivel de energía vibracional más elevado del estado electrónico fundamental (Fig. 6.20.).

Detector

Láser 2

Registro I vs ( 1 - 2 )

Frecuencia variable

Espejo

Filtro

2  as

Muestra

Láser 1

Espejo

1

Frecuencia constante

3

Figura 6.19.- Diagrama de un sistema instrumental empleado en espectroscopía antiStokes coherente (CARS)

3

 as 1

1

2 v2 v1 v0 3

=2

1- 2

Figura 6.20.- Diagrama de energías para la espectroscopia anti-Stokes coherente (CARS)

CARS es una técnica adecuada para el análisis de muestras fluorescentes debido a que la radiación dispersada presenta una frecuencia menor que la que la de la

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radiación fluorescente. Otra ventaja de esta técnica es que no es necesario el empleo de un monocromador debido al empleo de láseres de ancho de banda muy estrecho. Además el empleo de estas fuentes aumenta la resolución de la técnica [3].

6.4.- Referencias [1]

E.D. Olsen, Métodos ópticos de análisis. Reverté, 1990, Barcelona.

[2]

D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principios de análisis instrumental . McGraw-Hill, 2000, Madrid.

[3]

R.D. Braun, Introduction to instrumental analysis Pharma Book Syndicate, 2006, Hyderabad.

[4]

H.H. Willard, L.L. Merrit, J.A. Dean, F.A. Settle, Métodos instrumentales de análisis. Grupo Editorial Iberoamericana, 1991, México D.F.

[5]

D.A. Skoog, F.J. Holler, R.C. Stanley, Principles of instrumental analysis Thomson, 2007, Australia.


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Métodos basados en la dispersión de la radiación.

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