METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA
Para la detección de coliformes totales y coliformes fecales (E.coli) es utilizado el método de filtración por membrana, el cual es un método altamente reproducible, puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grande y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones también se encuentra entre los métodos standards.
Fundamento del método filtración por membrana:
La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por un filtro de celulosa de0.45 micras de tamaño de poro, para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo coliformes y las mesófilas. El filtro es colocado en un medio de cultivo específico para lo que se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y microorganismos mesófilos), incubando a 35 grados centígrados más o menos dos grados durante 18 a 20 horas
El número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante mediante la filt fi ltraci ración ón de volúmenes volúmenes específ es pecífic icos os de la la mues muestra tra a través de filt fi ltrr os de membrana. membrana. P or lo g eneral, es tán tán compues tos de és teres de celulosa, típicamente con poros de 0,45 mm de diámetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Después se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. En la práctica, la técnica de filtración de membrana ofrece resultados comparables a los
que
se
obtienen
con
el
método
de
tubos
múltiples.
Una de las ventajas del método de filtración f iltración a través de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rápidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo
en forma normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua, tambien se utiliza en el análisis de leche y otros alimentos líquidos.
Características del filtro de membrana: Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una completa retención de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos filtros estén libres de químicos susceptibles a inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de fi ltración satisfactoria Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana: El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La lectura de resultados se da en un mejor tiempo (24 horas) a comparación del método NMP, además se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios adecuados, el análisis se dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la muestra o haciendo inóculos muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a analizar
https://www.academia.edu/29948088/Filtracion_por_membrana
C. Aparatos y técnicas de filtración
El aparato de filtración consiste de un disco incrustado (portafiltros) sostenido por soporte de goma o caucho y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado o una rampa múltiple de filtración
El disco incrustado o perforado (portafiltros) sostiene el filtro de membrana.
El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtración bien sea único o colector múltiple (rampas de filtración para varias muestras a la vez) conectado
a un sistema de vacío.
Volumen de agua analizada
El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de or ientación: Tipos de agua
Coliformes totales
Potable de consumo público
100 ml
Envasadas
250 ml
Manantiales
15; 60; 100 ml
Lagos, depósitos
4; 15; 60; 100 ml
Acometidas
0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas
0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ríos
0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas
0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar
0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml
Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiendolas al embudo de filtración.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución tamponada estéril y, encima de ella, se vierte la muestraa a filtrar. Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución tamponada estéril.
Toma de muestra La técnica de muestreo depende del lugar donde se realiza dicho muestreo, para conocer los detalles sobre la toma de muestras de aguas para análisisi microbiológicos haga clic sobre esta frase
Material y equipo Membranas filtrantes de 0,45 µm de tamaño de poro Soporte del filtro con embudo Sistema de vacio Pipetas estériles de 10 y 1 mL. Estufa de cultivo Asa de siembra Pinzas estériles
G. Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales: Caldo Endo, MF Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes totales. Este es un medio para el aislamiento selectivo de los coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de microorganismos. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompañantes. Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de
E. coli y
de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico.
Se utiliza este medio para la identificación y recuento de coliformes en agua, leche y otros líquidos mediante filtración sobre membrana y esta incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
2004
".
Medio sólido selectivo, que se prepara en placas para filtración de membrana.
Medio líquido selectivo, que se deposita en placas de cultivo que llevan una almohadilla absorbente (aproximadamente 2 mL por placa) El medio de cultivo debe prepararse según instrucciones del fabricante en el envase, en material de vidrio estéril, sin necesidad de ser autoclavado. Disolver y fundir en horno microondas o en baño María. Hervir 1minuto. El pH final del medio de cultivo debe ser 7,4 ± 0.2. Dejar registro en la ruta de análisis 10.6 Puede almacenarse a 1- 4,4 ºC por un período máximo de 14 días, ya sea en erlenmeyer, frasco Schott o repartido en las placas. 10.7 Dejar registro en la ruta de análisis de la preparación de los medios de cultivo. Preparación de las P lacas de Petri 10.8 Previo a la distribución del medio de cultivo en las placas de Petri estériles, termostatizarlo a 45ºC. Colocar aproximadamente 3 mL de medio por cada placa de 47 mm de diámetro, bajo condiciones de esterilidad. 10.9 Dejar solidificar sobre la mesada de trabajo. 10.10 Almacenar en heladera de material estéril (1- 4,4ºC) hasta su utilización. 10.11 Las placas de Petri antes de usarse deben rotularse en el fondo de las mismas con lápiz graso, indicando número de muestra y dilución efectuada. Preparación de tubos para diluciones 10.12 Estos tubos se preparan en caso de que sea necesario hacer diluciones de la muestra antes de filtrar. 10.13 Colocar 9 ± 0.2 mL de agua peptonada en tubos de ensayo. Tapar con algodón o tapa de rosca. Colocar los tubos en una gradilla o cesto y cubrir con papel aluminio o papel de embalaje. 10.14 Autoclavar por 15 minutos a 121ºC. 10.15 Conservar en heladera de material estéril (1- 4.4ºC) hasta el momento de su uso, como máximo 30 días. 11 ANALISIS DE LA MUESTRA 11.1 El volumen de muestra a ser filtrado se determina de acuerdo a la densidad bacteriana esperada y el origen de la muestra. En caso de ser necesario se preparan diluciones en cascada en los tubos de dilución, adicionando 1mL de muestra o de la dilución previa, a los 9 mL de agua peptonada. Se recomienda filtrar 2 volúmenes diferentes de muestra en múltiplo de 10. Si no se dispone de valores históricos de la muestra es conveniente filtrar tres volúmenes diferentes. 11.2 Conectar el equipo de filtración con embudo estéril. Colocar un filtro de nitrocelulosa estéril con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre el portafiltros poroso del embudo utilizando pinzas humedecidas en alcohol, flambeadas y a temperatura ambiente. 5053UY Coliformes Termotolerantes / Versión 5 / Septiembre 2009 Pág. 7 / 10 5053UY Coliformes Termotolerantes SECCION 5 11.3 Filtrar un volumen aproximado a 10 mL de agua peptonada estéril para humedecer el filtro. 11.4 Homogeneizar la muestra agitándola o usando el vortex (si se hicieron diluciones en tubos), y filtrar el volumen seleccionado. 11.5 Luego enjuagar el embudo filtrando aproximadamente 10
mL de agua peptonada estéril. Retirar el filtro con pinzas estériles y colocarlo en la placa de Petri sobre el medio, con la parte cuadriculada hacia arriba, evitando la formación de burbujas de aire, pasar suavemente la pinza por el borde del filtro para sacar el aire. No tocar con la pinza el área de filtración del filtro ya que se arrastran células bacterianas. Asegurarse de que todo el filtro quede en contacto con el medio de cultivo. Cerrar la placa y colocarla en la mesada para luego ser incubada. 11.6 Luego de filtrar cada muestra descontaminar los embudos humedeciéndolos con alcohol y flambeándolos. Una vez que el alcohol se consume hacer pasar suficiente agua peptonada estéril para lavar el sistema y enfriarlo más rápidamente. 11.7 Si el volumen a filtrar es poco (1 mL) colocar en el embudo aproximadamente 10 mL de agua peptonada estéril y luego la muestra, para lograr una mejor distribución de la misma sobre la membrana al ser filtrada. 11.8 Siempre comenzar la serie de filtración por la dilución mayor para no contaminar el embudo. 11.9 Incubar las placas de Petri en posición invertida, en la estufa de 44.5 ± 0.2ºC durante 24 ± 2 horas. Recuento 11.10 Las colonias típicas de coliformes termotolerantes son de distintas tonalidades de azul. Las colonias grises o crema son consideradas como no coliformes, aunque exiten colonias de E.coli atípicas que se presentan de color crema por lo que se recomienda realiza la verificación a posteriori. 11.11 El recuento de colonias se realiza en las placas que contengan entre 20 y 60 colonias de coliformes típicas y no más de 200 colonias de cualquier tipo. 12 ANÁLISIS DE DATOS 12.1 La ecuación que se emplea es la siguiente: C. Termotolerantes (ufc/100mL) = colonias de coliformes contadas x 100 mL de muestra filtrados Ufc corresponde a Unidades Formadoras de Colonias. 12.2 Si las colonias crecen uniéndose sobre la membrana se informa como crecimiento confluente con o sin presencia de coliformes y se sugiere la realización de otro muestreo del mismo punto. 12.3 Si el número de colonias típicas de coliformes termotolerantes fuera entre 20 y 60 pero la placa posee más de 200 colonias de cualquier tipo, se informa como mayor al recuento realizado y se aconseja la realización de otro muestreo en ese punto. 12.4 Si el número de colonias típicas es mayor a 60, el recuento se realiza siguiendo alguno de los procedimientos que se detallan a continuación y se informa como valor estimado. • Dividir l a placa en 4 cuadrantes, contar en
uno, multiplicar por cuatro.
http://coli.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html file:///C:/Users/BRYAN/Downloads/cioh_bcc3313%20(2).pdf
http://www.dczogbi.com/membranas.html
https://documents.tips/documents/practica5-filtracion-por-membrana.html
