METODE PENGUKURAN DENSITAS DAN AKTIVITAS MIKROBIA
OLEH: RUBIYATNA SAKARONI 176090100111006
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA 2017
METODE PENGUKURAN DENSITAS DAN AKTIVITAS MIKROBIA A. Pengukuran Pertumbuhan Mikrobia 1. Pertumbuhan Mikrobia
Tumbuh dalam pengertian umum diartikan sebagai bertambahnya ukuran, sedangkan
berkembang
diartikan
sebagai
bertambahnya
kuantitas.
Pertumbuhan dapat ditunjukkan dengan adanya pertambahan panjang, luas, volume, berat maupun kandungan tertentu, sedangkan berkembang ditunjukan dengan bertambahnya jumlah individu dan terbentuknya alat reproduksi. Tumbuh merupakan proses dari pendek menjadi panjang, dari sempit menjadi luas, dari kosong menjadi berisi, dari ringan menjadi berat, sedangkan berkembang adalah dari sedikit menjadi banyak (Sri, 2015). Kuantitas atau ukuran pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur, pertama dari segi pertambahan dimensi satu, misalnya : panjang,diameter, jari-jari, dan jumlah sel, Kedua dari segi pertambahan dimensi dua, misalnya :luas, Ketiga dari segi pertambahan dimensi tiga, misalnya : volume, berat segar, berat kering. Selain tiga segi tersebut, pertumbuhan juga dapat diukur dari segi komponen seluler, misalnya : RNA, DNA, dan protein dan dari segi kegiatan metabolisme secara langsung, misalnya : kebutuhan oksigen, karbon dioksida, dan lain-lain (Chandra, 2012). Pertumbuhan mikroorganisme dapat ditinjau dari dua sudut, yaitu : pertumbuhan individu dan pertumbuhan koloni atau pertumbuhan populasi. Pertumbuhan individu diartikan sebagai bertambahnya ukuran tubuh, sedangkan pertumbuhan populasi diartikan sebagai bertambahnya kuantitas individu dalam suatu populasi atau bertambahnya ukuran koloni. Namun demikian pertumbuhan mikroorganisme unisel (bersel tunggal) sulit diukur dari segi pertambahan panjang, luas, volume, maupun berat, karena pertambahannya sangat sedikit dan berlangsung sangat cepat (lebih cepat dari satuan waktu mengukurnya), sehingga untuk mikroorganisme yang demikian
satuan pertumbuhan sama dengan satuan perkembangan. Pertumbuhan bakteri dan mikroorganisme unisel lainnya dapat ditunjukan dengan cara menghitung jumlah sel setiap koloninya maupun mengukur kandungan senyawa tertentu yang dihasilkan (Chandra,2012). 2. Pertumbuhan sel
Pertumbuhan Sel berarti penambahan jumlah sel melalui proses pembelahan sel. Pembelahan sel ini membutuhkan transformasi energi lebih dari 2000 reaksi kimia. Pertumbuhan sel diawali dengan molekul-molekul kecil yang saling berikatan membentuk molekul yang lebih besar atau makromolekul kemudian menjadi struktur sel yang lebih kompleks dan akhirnya menjadi satun sel atau individu baru. Pertumbuhan sel dapat berbentuk linear, Tetra, sarcinae dan Grapelike atau Staphylo (Chahardehi dkk, 2010). Pertumbuhan mikroorganisme dimulai dari awal pertumbuhan sampai dengan berakhirnya aktivitas merupakan proses bertahap yang dapat digambarkan sebagai kurva pertumbuhan. Kurva
pertumbuhan mikroba
terdiri dari 4 fase utama yaitu : lag, eksponensial, stasioner, dan kematian. Kurva pertumbuhan yang lengkap merupakan gambaran pertumbuhan secara bertahap (fase) sejak awal pertumbuhan sampai dengan terhenti mengadakan kegiatan (Sri, 2015). Kurva pertumbuhan mikroba
Menurut Sri (2015), Empat fase kurva pertumbuhan mikroorganisme, yaitu : a. Fase Lag atau Adaptasi Jika mikroba dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula akan mengalami fase adaptasi untuk menyesuaikan dengan kondisi lingkungan di sekitarnya. Lamanya fase adaptasi ini dipengaruhi oleh beberapa factor, diantaranya:
Medium dan lingkungan pertumbuhan jika medium dan lingkungan pertumbuhan sama seperti medium dan lingkungan sebelumnya, mungkin tidak diperlukan waktu adaptasi. Tetapi jika nutrient yang tersedia
dan
kondisi
lingkungan
yang
baru
berbeda
dengan
sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesa enzimenzim.
Jumlah inokulum jumlah awal sel yang semakin tinggi akan mempercepat fase adaptasi. Fase adaptasi mungkin berjalan lambat karena beberapa sebab, misalnya: 1) Kultur dipindahkan dari medium yang kaya nutrien ke medium yang kandungan nutriennya terbatas, 2) Mutan yang baru dipindahkan dari fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti sebelumnya.
b. Fase Log atau Pertumbuhan Eksponensial Pada fase ini mikroba membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva logaritmik. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrient, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini mikroba membutuhkan energi lebih banyak dari pada fase lainnya. Pada fase ini kultur paling sensitif terhadap keadaan lingkungan. terdapat keragaman kecepatan pertumbuhan berbagai mikroorganisme. Akhir fase log, kecepatan
pertumbuhan populasi menurun dikarenakan nutrien di dalam medium sudah berkurang, adanya hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroba. c. Fase Stasioner Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat-zat nutrisi sudah habis. Karena kekurangan zat nutrisi, sel kemungkinan mempunyai komposisi yang berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik. Pada fase ini sel-sel lebih tahan terhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan-bahan kimia. d. Fase Kematian Pada fase ini sebagian populasi mikrobia mulai mengalami kematian karena beberapa sebab yaitu nutrien di dalam medium sudah habis, energi cadangan di dalam sel habis. Kecepatan kematian bergantung pada kondisi nutrien, lingkungan, dan jenis mikroba.
Pada
kenyataannya
bahwa
gambaran
kurva
pertumbuhan
mikroorganisme tidak linear seperti yang dijelaskan di atas jika faktor-faktor lingkungan yang menyertainya tidak memenuhi persyaratan. Beberapa penyimpangan yang sering terjadi, misalnya : fase lag yang terlalu lama karena faktor lingkungan kurang mendukung, tanpa fase lag karena pemindahan ke lingkungan yang identik, fase eksponensial berulang-ulang karena medium kultur kontinyu, dan lain sebagainya.
3. Pengukuran pertumbuhan
Pertumbuhan mikroorganisme dapat diukur berdasarkan konsentrasi sel (jumlah sel per satuan isi kultur) ataupun destilasi sel (berat kering dari sel-sel persatuan isi kultur). Densitas sel adalah kuantitas yang lebih bermakna, sedangkan dalam penelitian mengenai inaktivitas mikroorganisme, kosentrasi sel adalah kuantitas yang bermakna. Perhitungan massa sel secara langsung atau tidak langsung sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti (Kenneth dkk, 2013). Menentukan massa sel mikroba dalam suatu populasi, dilakukan dengan cara menumbuhkannya dalam suspensi homogen pada medium yang sesuai dengan konsentrasi (jumlah sel/ ml) dan densitasnya (mg/ml), dihitung adanya peningkatan seiring dengan waktu (Kenneth dkk, 2013). Pada kultur pertumbuhan mikroba dapat ditentukan laju pertumbuhan dan waktu penuh. Metode penentuan massa sel dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu secara langsung dan tidak langsung. Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara,yaitu : a. Metode Total Count Pada metode ini sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop Jika setetes kultur dimasukkan kedalam wadah (misalnya hemasitometer) yang diketahui volumenya, maka jumlah sel dapat dihitung. Akan tetapi cara tersebut memiliki keterbatasan, yaitu tidak dapat membedakan sel hidup atau mati dan tidak dapat digunakan pada jumlah sel yang sangat sedikit (kurang dari 102sel/ml) (Purwoko, 2007).
Kelemahan lain lagi ialah kadang-kadang cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sehinggga tersebut dengan menambahkan bahan
anti
gumpalan
seperti
asetat dan tween-80 sebanyak
0,1%.
dinatrium
etilanadiamina
Keuntungan
metode
ini
tetra ialah
pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan (Purwoko, 2007). b. Metode Turbidimetrik Bila kita harus memeriksa kosentrasi sel biakan dalam jumlah besar biakan, maka metode cawan bukanlah pilihan yang baik karena memakan waktu. Kuantitas mikroba menunjukkan banyaknya jumlah sel mikroba. Penghitungan jumlah sel bakteri dapat dilakukan dengan metode turbidimetri (uji kekeruhan) menggunakan spectrophotometer. Metode ini merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu larutan. Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri dalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium. Jumlah bakteri dapat dihitung menggunakan spektrofotometer yang prinsip kerjanya adalah membaca tingkat kekeruhan dalam media bakteri. Spektrofotometer dapat menghitung seluruh sel bakteri baik yang hidup maupun yang mati. Jadi semua suspensi yang ada dalam larutan kuvet akan terbaca semua.
Prinsip kerja spektrofotometer adalah cahaya dari sumber radiasi jatuh pada suatu medium homogen, sebagian
dari sinar masuk akan
dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Metode ini memiliki kelemahan tidak dapat membedakan antara sel mati dan sel hidup (Purwoko, 2007). c. Metode Berat Kering Cara yang paling cepat mengukur jumlah sel adalah metode berat kering. Metode tersebut relatif mudah dilakukan, yaitu kultur disaringan atau disentrifugasi, kemudian bagian yang disaring atau yang mengendap hasil sentrifugasi dikeringkan. Pada metode ini juga tidak dapat membedakan sel yang hidup dan mati. Akan tetapi keterbatasan itu tidak mengurangi manfaat metode tersebut dalam hal mengukur efesiensi fermentasi, karena pertumbuhan diukur dengan satuan berat, sehingga dapat diperhitungkan dengan parameter konsumsi substrat dan produksi senyawa yang diinginkan (Purwoko, 2007). d. Metode Elektronic Counter Suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil (orifice) dengan bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur tekanan listrik (ditandai dengan naiknya tekanan) pada saat bakteri melalui orifice. Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungan metode ini adalah hasil bisa diperoleh dengan lebih cepat dan lebih akurat, serta dapat menghitung sel dengan ukuran besar. Kerugiannya metode ini tidak bisa digunakan untuk menghitung bakteri karena adanya gangguan derbit, filamen, dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati (Pratiwi, 2008).
e. Metode Plating Technique
Metode ini merupakan metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan di dasarkan pada asumsi bahwa bakteri hidup akan tumbuh, membelah dan memproduksi satu koloni tunggal. Satuan perhitungan yang dipakai adalah CFU (colony forming unit) dengan cara membuat seri pengenceran sampel dan menumbuhkan sampel pada media padat.
Pengukuran dilakukan pada plat dengan jumlah koloni berkisar 25-250 atau 30-300. Keuntungan metode ini adalah sederhana, mudah dan sensitif karena menggunakan colony counter sebagai alat hitung dapat digunakan untuk menghitung mikroorganisme pada sampel makanan, air ataupun tanah. Kerugiannya adalah harus digunakan media yang sesuai dan perhitungannya yang kurang akurat karena satu koloni tidak selalu berasal dari satu individu sel (Pratiwi, 2008).
Metode pengukuran pertumbuhan mikroorganisme secara tidak langsung dapat dilakukan dengan beberapa metode sebagai berikut : a. Metode Viable Count Kultur diencerkan sampai batas yang di inginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi 1 koloni beberapa saat berikutnya, biasanya 4-12 jam. Akan tetapi cara ini memiliki keterbatasan, yaitu jumlah sel terhitung biasanya
lebih dari sebenarnya (kemungkinan besar 1 koloni dapat berasal dari 2 sel) dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Pada metode tersebut yang perlu diperhatikan adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, pengenceran di anggap gagal. Misalnya cawan yang dapat dihitung jumlah selnya adalah sel yang mempunyai jumlah sel sekitar 2-4 untuk sampel pengenceran (10x
), 20-40 untuk sampel pengenceran (10(x+1)) dan 200-400 untuk sampel
pengenceran (10-(x+2)) (Purwoko, 2007). b. Metode Aktivitas Metabolik Metode ini didasarkan pada asumsi bahwa produk metabolit tertentu, misalnya asam atau CO2, menunjukkan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam media. Misalnya pengukuran produksi asam untuk menentukan jumlah vitamin yang di hasilkan mikroorganisme (Pratiwi, 2008). c. Metode Berat Sel Kering Metode ini umum digunakan untuk mengukur pertumbuhan fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai berat
kotor. Miselium selanjutnya dicuci dan dikeringkan dengan alat
pengering (desikator) dan ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat yang konstan yang dihitung sebagai berat sel kering (Pratiwi, 2008). d. Metode MPN (most probable number ) Metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang diinokulasi dari sampel padat atau cair sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme perkiraan terdekat (Harti, 2015). Sebagai contoh bakteri coliform dalam sumber air merupakan indikasi pencemaran air. Dalam penentuan kualitas air secara mikrobiologi kehadiran bakteri tersebut ditentukan berdasarkan tes tertentu yang umumnya menggunakan tabel atau
yang lebih dikenal dengan nama MPN ( Most Propable Number ). Dasar estimasi
ini
adalah
estimasi
jumlah
paling
memungkinkan
organisme coliform dalam 100cc air (Suriawiria, 2008). Bakteri coliform yang
difermentasi dengan
media
laktosa
akan
menghasilkan gas jika diinkubasi selama lebih dari 48 jam pada suhu 35˚C, itulah dasar dilakukan metode MPN dengan melihat gas yang dihasilkan dalam tabung reaksi yang kemudian disesuaikan dengan tabel MPN (Krisna, 2005). Metode MPN terdiri dari 3 langkah, yaitu : 1. Uji Penduga ( Presumtive test) Sampel air diletakkan dalam tabung steril yang berisi Lactose Broth. Beberapa tabung diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35˚C, kemudian
diperiksa
terbentuknya
gas,
karena
bakteri
akan
memfermentasikan laktosa dan menghasilkan gas. Jika gas tidak terbentuk dalam 24 jam, inkubasi diteruskan hingga 48 jam. Tes penduga dikatakan positif jika pada tabung terdapat gas yang ditandai dengan
terapungnya
tabung
durham.
Uji
ini
mendeteksi
sifat
fermentative coliform dalam sampel dan harus dikonfirmasi dengan tes konfirmatif untuk menyingkirkan keberadaan organisme lain yang memberikan hasil positif pada fermentasi laktosa. 2. Uji Penegas (Confirmed test) Tabung positif yang didapatkan dari uji penduga dilanjutkan dengan uji penegas. Sampel positif yang menunjukkan gas diinokulasi pada media Brilian Green Lactose Broth, kemudian inkubasi pada suhu 37˚C selama 48 jam. Apabila dihasilkan gas, maka uji penegas ini dinyatakan positif (Willey, 2008). 3. Uji Pelengkap (Complete test) Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasikan koloni bakteri pada medium agar dengan cara digoreskan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35˚C. agar yang digunakan adalah endo agar
dan Eosin Metil Blue (EMB). Pembenihan pada media agar ini mengakibatkan media agar menjadi bewarna ungu tua dengan kemilau tembaga metalik dan membentuk koloni dengan pusat gelap (Willey, 2008).
B. Pengukuran Aktivitas Mikrobia
Uji aktivitas mikrobia dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode, yaitu metode difusi, dilusi, dan bioautografi. Metode difusi dan bioautografi merupakan teknik secara kualitatif karena metode ini hanya akan menunjukkan ada atau tidaknya senyawa dengan aktivitas mikrobia. Disis lain, metode dilusi digunakan untuk kuantitatif yang akan menentukan sejauh mana aktivitas mikrobia, khususnya Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) (Jawet dkk, 2007). 1. Metode difusi Metode yang paling luas digunakan adalah uji difusi cakram. Cakram kertas filter yang mengandung sejumah senyawa tertentu ditempatkan di atas medium agar yang telah diinokulasi pada permukaan dengan mikrobia uji. Setelah inkubasi, diameter zona jernih inhibisi disekitar cakram diukur sebagai ukuran kekuatan inhibisi senyawa melawan mikrobia uji tertentu. Biasanya diukur dengan jangka sorong kemudian hasil pengukuran dianalisis dengan uji ANOVA (Jawet dkk, 2007). Metode difusi dibagi menjadi beberapa cara (Ratnasari, 2009), yaitu: a. Metode silinder gelas Metode silinder yaitu meletakkan beberapa silinder yang terbuat dari gelas atau besi tahan karat di atas media agar yang telah diinokulasi dengan bakteri. Tiap silinder ditempatkan sedemikian rupa hingga berdiri di atas media agar, diisi dengan larutan yang akan diuji dan diinkubasi. Setelah diinkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan di sekeliling silinder.
b. Metode kertas cakram disk diffusion Metode cakram kertas yaitu meletakkan cakram kertas yang telah direndam larutan uji di atas media padat yang telah diinokulasi dengan mikrobia. Setelah diinkubasi, pertumbuhan mikrobia diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan disekeliling cakram (Kenneth dkk, 2013). c. Metode cetak lubang (metode sumur) Metode lubang yaitu membuat lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak lubang disesuaikan dengan tujuan pengamatan, kemudian lubang diisi dengan
larutan
yang
akan
diuji.
Setelah
diinkubasi,
pertumbuhan mikrobia diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan disekeliling lubang. 2. Metode dilusi Sejumlah
zat
antimikroba
dimasukan
ke
dalam
medium
bakteriologi padat atau cair. Biasanya digunakan pengenceran dua kali lipat zat antimikroba. Medium akhirnya diinokulasi dengan bakteri yang diuji dan diinkubasi. Tujuan akhir dari metode dilusi adalah untuk mengetahui seberapa banyak jumlah zat antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri yang diuji. Uji keretanan dilusi agak membutuhkan waktu yang banyak, dan kegunaanya terbatas pada keadaan-keadaan tertentu. Uji dilusi kaldu tidak praktis dan kegunaannya sedikit apabila dilusi harus dibuat dalam tabung pengujian, namun adanya serangkaian preparat dilusi kaldu untuk berbagai obat yang berbeda
dalam
lempeng
mikrodilusi
telah
meningkatkan
dan
mempermudah metode (Jawet dkk, 2007). Keuntungan uji dilusi adalah bahwa uji tersebut memungkinkan adanya hasil kuantitatif, yang menunjukan jumlah obat tertentu yang diperlukan untuk menghambat (atau membunuh) mikroorganisme yang diuji (Jawet dkk, 2007).
Metode dilusi dibagi menjadi beberapa cara yaitu, (Ratnasari, 2009). a. Cara penapisan lempeng agar Larutan zat antibakteri dibuat pengenceran kelipatan dan sehingga dilipat berbagai variasi konsentrasi. Hasil pengenceran larutan tersebut dicampur dengan media agar yang telah dicairkan kemudian dijaga pada suhu 45ºC- 50ºC, dengan perbandingan antara larutan zat antibakteri dengan media adalah satu bagian untuk larutan zat antibakteri dan sembilan bagian untuk media. Setelah itu, media campuran tersebut dituang kedalam cawan petri steril dan dibiarkan dingin hingga membeku. Lalu pada tiap cawan petri ditanamkan dengan suspensi bakteri yang mengandung kira-kira 105-106 CFU/ mL, kemudian media cawan petri tersebut dalam posisi terbalik dan diinokulasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Untuk setiap pengenceran digunakan kontrol negatif. Hasil pengamatan konsentrasi hambat minimal (KHM) dibaca sebagai konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme, jika terlihat pertumbuhan bakteri tidak jelas atau kabur maka pertumbuhan bakteri dapat dibiakan. b. Cara pengenceran tabung Larutan zat antibakteri dilarutkan dengan pelarut yang sesuai, kemudian diencerkan dengan medium cair berturut-turut pada tabung yang disusun dalam satu deret hingga konsentrasi terkecil yang dikehendaki. Tiap tabung (yang berisi campuran media dan larutan zat antibakteri dengan berbagai konsentrasi tersebut) ditanami dengan suspensi bakteri yang mengandung kira-kira 105 – 106 sel bakteri CFU/mL. Selanjutnya dibiakan dalam media tabung diinkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. Pertumbuhan bakteri diamati dengan cara melihat kekeruhan didalam tabung tersebut, yang disebabkan oleh
inokulum
bakteri.
Larutan
uji
agen
antimikroba
pada
kadar
terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media baru tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM. c. Turbidimetri Metode turbidimetri ini dilakukan dengan suatu turunan protein yang dimurnikan dan dibiakan dalam satuan tuberkulin. Reaksi pada metode ini adalah mengerasnya jaringan yang dengan mudah dapat dirasakan, dengan garis tengah 10 mm atau lebih yang terjadi dalam waktu 48-72 jam setelah penyuntikan. Uji ini diukur dengan speltrofotometer UV-VIS dengan panjang gelombang 530 mm.
3. Metode bioautograf Menurut
(Akhyar,
2010)
bioautografi
adalah
suatu
metode
pendeteksian untuk mememukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada bioautogafi ini didasarkan atas efek biologi berupa antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti. Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat
DAFTAR PUSTAKA
Ahyar. 2010. Uji daya hambat dan analisis KLT bioautografi ekstrak akar dan buah bakau ( Rhizophora stylosa griff ) terhadap Vibrio Harveyi. Makassar: Universitas Hasanudin. Chahardehi AM., Ibrahim D., Sulaiman SF. 2010. Antioxidant, antimicrobial activity and toxicity test of Pilea microphylla. International Journal of Microbiogy. Doi: 10.1155/2010/826830. Chandra B. 2012. Pengantar Kesehatan Lingkungan. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC, p: 105. Jawetz, Melnick, Adelberg. 2007. Mikrobiologi Kedokteran 23th ed. Jakarta: Salemba Medika. ISBN978-979-448-859-1. Kenneth C., Ofokansi., Anthony AA., Philip FU., and Mercy OO. 2013. Evaluation of the combined antimicrobial activity of the leaf extract Phyllantus muellerianus with ciprofloxacin. Pharmaceutical technology & drug research. Doi: 10.7243/2050-120X-2-16. Pratiwi, ST. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Fakultas Farmasi UGM. Ratnasari. 2009. Uji aktivitas antibakteri ekstrak diklorometan dan etil asetat daun MIMBA ( Azadircanta indica) terhadap bekteri Staphylococcus aureusdan E.coli. Jakarta: Universitas Islam Negeri Syarifhidayatullah. Sri, HA. 2015.. Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta: CV. ANDI OFFSET. Suriawira U (2008). Mikrobiologi Air & Dasar-dasar Pengolahan Buangan Secara Biologis. Bandung : Penerbit Alumni. Willey, joanne M, Linda M. Sherwood, Christopher J (2008). Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology. New York : Mc Graw Hill, pp 272-274.
