METODE KOAGULASI
Point penting:
Kebanyakan prosedur untuk pemeriksaan koagulasi memakai plasma
Pemeriksaan koagulasi pada suhu 37˚C ± 1˚
Nilai normalnya tergantung metodelogi, reagen, instruments dan populasi pasien
Pengambilan, penyimpanan dan transport sampel akan mempengaruhi hasil pemeriksaan
Perbandingan antikoagulan : darah adalah 1:9 dan di campur secara gentle
Sentrifuse secepatnya dalam 10 menit pada 2500 G
Pindahkan PPP (platelet poor plasma) secepatnya pada tabung plastic dan simpan di refrigerator, diperiksa sebelum 4 jam
Bila lebih 4 jam, simpan di freezer pada suhu – 70˚C
Direkomendasikan sesaat sebelum pemeriksaan plasma di cairkan pada water bath 37˚C untuk mencegah terbentuknya kriopresipitat.
Antikoagulan yang digunakan sodium sitrat (3,2 % 0,109 M), yang lain no way
Perbandingan darah:antikoagulan harus 9:1. Pada pasien Polisitemia, dimana Ht > 55% perbandingan ini harus dihitung dengan cara: C = 1,85 x 10-3 x (100 –H) x V dimana C= volume sodium sitrat (ml). H=hematokrit (%) dan V=volume darah (ml)
Sekarang ini pemeriksaan imunologik sudah dipakai untuk pemeriksaan factor koagulasi, inhibitor dan protein yang berhubungan dengan fibrinolisis.
Dahulu pemeriksaan hemostasis prosedurnya berdasarkan terbentuknya bekuan (clot formation), saat ini penggunaan enzim spesifik synthestik subtrat sudah mulai dilakukan pada pemeriksaan hemostasis
TEST FUNGSI TROMBOSIT
Test fungsi trombosit adalah suatu pemeriksaan untuk mengetahui kemampuan trombosit dalam adhesi-agregasi. Saat ini fungsi trombosit dapat diperiksa dengan bleeding time (BT) dan agregasi trombosit, namun pemeriksaan ini memerlukan waktu lama, tidak praktis. BT hasilnya bisa bervariasi antara pemeriksa yang satu dengan yang lainnya sehingga beberapa institusi memakai alat PFA-100® ataupun alat lainnya. Dalam memeriksa fungsi trombosit kita harus mengetahui riwayat perdarahan atau tanda2 klinis yang berhubungan perdarahan.
PFA-100 closure time adalah screening test untuk fungsi trombosit yang dapat mengevaluasi kemampuan dari trombosit bekerja dengan collagen dan ADP atau epineprin dalam kapiler untuk menyebabkan pembekuan darah. Pemeriksaan ini masih merupakan screening dan hasil pemeriksaan positif tidak 100% sensitive menandakan kelainan trombosit.
Peranan trombosit dalam hemostasis primer adalah proses adhesi dan agregasi. Adhesi adalah kemampuan trombosit untuk melekat di permukaan collagen subendotel. Sedangkan agregasi kemampuan trombosit untuk melekat dengan trombosit lainnya. Pada keadaan ini trombosit harus bisa mengeluarkan isi dari organel2 nya seperti α granul dan dense bodies. Secara laboratorium BT adalah pemeriksaan untuk menilai kemampuan adhesi dan agregasi dari trombosit.
BLEEDING TIME
Prinsip
BT adalah waktu yang ditentukan berdasarkan standar dimulai pada saat teririsnya kulit sampai perdarahannya berhenti. Pada pembuluh darah yang terluka, trombosit akan menempel pada kolagen di subendotel dengan bantuan factor von Willebrand (vWF) dan akan membentuk sumbat trombosit (platelet plug). BT menilai kemampuan trombosit dalam menghentikan perdarahan sehingga dapat di prediksi jumlah dan fungsi dari trombiosit. Kontraksi dari kapiler, factor instrinsik dan ekstrinsik tidak berperan dalam BT. BT merupakan pemeriksaan screening untuk mendeteksi kelainan congenital ataupun kelainan yang didapat dari fungsi trombosit dan penyakit dari vWF. Pasien sebelumnya di imformed content
Peralatan
Alat BT steril
Stopwatch
Sphygmomanometer
Alcohol swab
Filter paper disc
Butterfly bandage, covering bandage
Prosedur
Pemeriksaan jumlah trombosit sebelumnya jangan lebih 24 jam
Jumlah trombosit kurang dari 100.000 akan mempengaruhi hasil
Persiapan tangan pasien, 5 cm dibawah antecubital, hindari kulit yang luka, bila banyak bulu cukur dulu.
Pasang tensimeter pada 40 mmHg (20 mmHg pada anak dan bayi)
Bersihkan lengan dengan alcohol dan siapkan alat BT
Secara gentle insisi paralel atau perpendikuler pada antecubital
Pasang stopwatch
Setiap 30 detik luka di tempel dengan kertas saring, jangan mengenai langsung lukanya.
Stop timmer sampai tidak ada warna darah pada kertas saring
Jika perdarahan masih berlanjut setelah 15 menit. Akhiri pemeriksaan dan laporkan hasil BT nya > 15 menit
Bersihkan bekas luka dan pasang butterfly bandage selama 24 jam untuk menghindari scar.
Interpretasi
Nilai normal 2,5 sampai 9,5 menit, nilai ini bervariasi tergantung dalamnya luka. Hasil yang memanjang yang BT dapat disebabkan:
Trombositopenia (< 50.000)
Dysfungsi trombosit bawaan (Bernard Soulier sindr, Glanzman trombasthenia,
Setelah makan aspirin
Setelah makan obat yang dapat menghambat fungsi trombosit, seperti antihistamin
Penyakit von willebrand
Catatan
Pasien harus bebas obat aspirin, minimal satu minggu sebelum pemeriksaan.
CLOSURE TIME - PFA-100 (Siemens)
Prinsip
Citrate whole blood ditambahkan pada cartridge dlm tabung kapiler dengan kolagen/ADP, atau kolagen/epinefrin. Catridge dianalisis oleh PFA-100. Trombosit terpapar oleh pemukaan kolagen dan terjadilah adhesi-agregasi. Waktu yang dibutuhkan trombosit unuk menutup tabung kapiler dicatat sebagai closure time
Method
Tempatkan catridge COL/EPI dan/atau COL/ADP di suhu ruangan
Pipet 0,8 mL cirat-wholeblood ke sample well, masukan ke alat, tekan start. Darah akan teraspirasi melewati kolagen ddan tabung kapiler
Di alat akan muncul hasil dan cetak closure time (detik)
Interpretasi
Pemeriksaan ini efektif untuk menscrening penyakit von Willebrand. Perlu dibedakan dengan obat anti platelet
Closure Time
ADP/Colagen
Epinefrin/Colagen
Normal
vWF disease
Aspirin/drug like effect
Normal
Memanjang
Normal
Normal
Memanjang
Memanjang
AGREGASI TROMBOSIT
Prinsip
Fungsi trombosit dalam hemostasis primer adalah terbentuknya sumbat trombosit di tempat pembuluh darah yang luka. Sumbat ini terbentuk karena proses menempelnya trombosit satu dengan lainnya yangdisebut agregasi. Beberapa substansi yang dapat menginduksi agregasi adalah kolagen, ADP, epineprin, thrombin, serotonin, asam arakhidonat, ristocetyn, bisa ular, komplek antigen-antibodi, dan FDPs. Substansi ini akan menginduksi agregasi trombosit atau menyebabkan trombosit melepaskan ADP endogen, atau kedua2nya. Agregasi trombosit ini merupakan bagian penting untuk menganalisis penderita yang diduga dysfungsi trombosit.
Agregasi trombosit di periksa dengan alat agregometer dengan metode photo-optical dan terhubung dengan alat yang dapat merekamnya. Platelet rich plasma dimasukan di cuvet, tempatkan pada suhu 37˚C pada heating blok di alat. Darah akan tercampur melalui small magnetic bar. Penambahan substansi agregat menyebabkan formasi besar/lebih luas yang terlihat pada transmisi cahaya. Hal ini terjadi karena clearing pada PRP. Perubahan transmisi tsb di convert menjadi signal elektronik. Signal ini yang di analisis.
Beberapa hal yang perluu diperhatikan:
Venipuncture harus bersih, sampel hemolisis tidak dipegunakan karena RBC mengandung ADP yang akan menginduksi trombosit
Plasma puasa lebih diutamakan karena sampel yang lipemik akan berpengaruh densitas optic selama agregasi trombasitl.
Fibrinogen dianjurkan diperiksa
Plasma sample tidak boleh kontak dengan permukaan tabung gelas kecuali yang menandung silicon, karena gelas akan mengaktifkan trombosit dan adhesi
Pemeriksan dilakukan pada suhu 37˚C dengan pH 6,5 sampai 8,5
Sampel selama proses dalam suhu kamar
Pemeriksan agregasi harus diperiksa sebelum 3 jam
Trombositopeni menyebabkan evaluasi dari respon agregasi sulit
Reagen dan alat
Control dan pasien PRP
Agregometer dan cuvet
M agnetik stiring bar
Pipet
Normal saline
Agent agregat
Prosedur
Interpretasi
Agregasi trombosit terdiri dari 2 langkah yaitu primer dan sekunder waves of aggregation. Yang primer agregasi dimulai dari trombosit adhesi dengan trombosit yang lainnya dengan bantuan agen agonis seperti ADP, epinefrin, atau ristocetin. Agregasi sekunder adalah agregasi yang terjadi setelah trombosit-trombosit tersebut distimulasi untuk melepaskan substansi yang berasal dari organelanya. Keduanya ini dipantau kapan agonis menyebabkan agregasi primer dan mulainya agregasi sekunder.
Pada glanzmann's thrombasthenia memperlihatkan agregasi incomplete dengan ADP
Agregasi trombosit diinduksi oleh kolagen diperlihatkan dengan adanya lag periode sebelum agregasi, dengan single wave. Respon agregasi biphasic terlihat pada pemberian ristocetin, namun bisa juga single wave. Biphasic wave juga terjadi pada pemberian epinefrin.
Pada pasien vWF disease, tidak terdapat wave pada pemberian ristocetin. Begitu pula pada penyakit Bernard-Soulier syndrome, platelet storage pool defects dan ITP terjadi abnormal kurva pada pemberian ristocetin
Catatan
Pada evaluyasi pasien dengan kelainan trombosit, agen yang digunakan biasanya ADP dengan berbagai variasi konsentrasi, kolagen, epinefrin,dan ristocetin. Aspirin dan obat anti inflamasi akan menghambat secondary wave dengan cara menghambat reaksi pelepasan dari trombosit. Turun atau tidak adanya wave harus di tanyakan kemungkinan pasien makan obat aspirin, ibuprofen, red wine, dan beberapa jenis herbal.
TEST SKRENING KOAGULASI
ACTIVATED PARTIAL THROMBOPLASTIN TIME
Prinsip
APTT merupaka pemeriksaan skrening untuk mengevaluasi jalur instrinsik dan jalur bersama dari proses koagulasi. Atau untuk mengetahui semua factor koagulasi, kecuali F VII dan XIII. Fibrin akan terbentuk bila jalur instrinsik (F. VIII,IX,XI dan XII) dan jalur bersama (F I,II,V dan X) mempunya konsentrasi dan fungsi yang normal.
Fibrin akan terbentuk optimal bila ditambah activator seperti kaolin, celite, micronized silica dan asam ellagic.
APTT juga digunaka untuk screening inhibitor dari jalur instrinsik seperti lupus antikoagulan serta untuk monitor therapy heparin.
Reagent dan alat
Coagulation analyzer (oto atau semiotomatis)
Comecial activated partial thromboplastin ( activator, pospholipid)
Prosedur
Sample collection
Proses dan store sample sesuai guideline
Rekonstitusi reagen APTT mengikuti petunjuk dari insert kit
Contoh: 50µL reagen APTT ditambah 50µL plasma, inkubasi 3 menit pada suhu 37˚C, kemudian tambah 50 µL CaCl2 catat waktu terbentuknya fibrin (cloting time)
Interpretasi
Setiap laboratorium mempunyai nilai normal bervariasi. Hypofibrinogen (<100 mg/dL) meneybabkan nilai APTT memanjang.
Catatan
APTT dan PT harus di periksa bersama untuk screening koagulopati, untuk mengevaluasi jalur instrinsik, ekstrinsik dan bersama.
One-Stage PROTOMBIN TIME (PT)
Prinsip
PT adalah waktu yang diperlukan untuk membentuk bekuan fibrin ketika plasma ditambahkan thromboplastin-mix calcium. Test ini akan mengevaluasi jalur ektrinsix dari koagulasi yaitu F II, V, VII dan X (fibrinogen). PT sensitive terhadap vit K dependent
Digunakan dalam memonitor therapy anticoagulant oral.
Reagent dan alat
Coagulaton analyzer (semi/otomatis)
Commercial thromboplastin reagent (thromboplastin, fosfolipid, Ca2+)
Prosedur
50 µl plasma di hangatkan dalam 37˚C selama 2 menit
kemudian tambah 100µL
catat waktu terbentuknya pembekuan
interpretasi
nilai normal 10 – 13 detik
PT memanjang pada defisiensi Faktor pembekuan baik yang congenital atau didapat (peny liver, oral antikoagulan the/, atau def vit K)
PT juga memanjang pada pemberian FDPs dan heparin, tergantung dari reagen yang dipakai.
Pasien dengan polisithemia PTnya akan memanjang, hal ini disebabkan karena masalah perbandingan plasma dengan antikoagulan. Pada Polisitemia kadar plasma lebih sedikit, sehingga citrate lebih banyak dan menyebabkan peningkatan pengikatan terhadap kalsium selama pemeriksaan.
PT akan memendek bila plasma disimpan > 4 jam pada suhu 4˚C karena dingin akan mengaktivasi factor VII
THROMBIN TIME
Prinsip
TT adalah waktu yang dibutuhkan untuk thrombin mengubah fibrinogen menjadi bekuan fibrin insoluble. Pembentukan fibrin di picu dengan penambahan thrombin pada sampel yang kemudian akan menjalankan cascade koagulasi.
TT tidak mengevaluasi kelainan di jalur instrinsik atau ekstrinsik.
Test ini untuk melihat kelainan kadar fibrinogen dan adanya dysfibrinogenemia serta keberadaan antithrombin seperti heparin dan direct thrombin inhibitor seperti hirudin dan FDPs. Bovin thrombin banyak dipakai, namun human thrombin juga dapat dipakai pada pasien yang mempunyai anti-bovin thrombin anibodi.
Reagen
Coagulation analyzer
Reagen Bovin atau human thrombin
Plasma control normal dan abnormal
Prosedur
Setelah plasma pasien siap, ikuti insert kit, misalnya: inkubasi 0,05 mL control atau pasien pada suhu 37˚C selama 2 menit. Tambah 0,1 mL reagen thrombin sebelum di hangatkan.
Langkahnya seperti Clotting time
Jika hasil clotting time sangat berlebih dari normal, test harus diulang dengan perbandingan 1:1, bila masih tinggi pakai heparin sebagai inhibitor
Interpretasi
Nilai normal 14 – 18 detik, tergantung reagen dan alat
TT memanjang pada hypofibrinogenemia (<100 mg/dL), dysfibrinogenemia dan pada pemberian antikoagulan seperti heparin dan hirudin
MIXING STUDIES – APTT atau PT 1:1 mix
Prinsip
aPTT dan/atau PT berguna untuk membedakan factor defisiensi dan koagulasi inhibitor, bila plasma pasien di campur dengan pool normal plasma yang mempunyai 100 % factor untuk mengkoreksi hasil yang memanjang yang disebabkan oleh factor difisiensi.
Mixing study ini dapay membantu menentukan langkah selanjutnya untuk mendiagnosis aPTT atau PT yang abnormal.
Reagen dan alat
Reagen aPTT atau PT
CaCl2 (0,02 atau 0,025 M) untuk aPTT mixing study
Pool plasma normal
Prosedur
Sesuai insert kit
Mix plasma pasien dengan pool normal plasma 1:1
Ulangi pemeriksaan aPTT atau PT dengan sampel no2 diatas
Bandingkan hasilnya dengan hasil aPTT/PT pasien
Interpretasi
Jika aPTT/PT terkoreksi dengan plasma normal, maka diindikasikan factor defisiensi
Jika aPTT/PT tiddak terkoreksi diindikasikan inhibitor kuat
Catatan
Antibody yang dapat menghambat factor VIII biasanya ig G, antibody ini merupakan inhibitor lemah namun tergantung pada suhu dan waktu, hal ini biasanya menyebabkan PT memanjang pada awal pemeriksaan.
Bila ada inhibitor factor VIII, bisa untuk melihat aktivitas factor. Karena pada perkembangannya akan terjadi komplikasi pada pasien hemophilia A pada saat pemberian AHF, shg harus di monitor secara periodic.
PEMERIKSAAN FAKTOR KOAGULASI
PEMERIKSAAN ONE – STAGE QUANTITATIF UNTUK FAKTOR II, V, VII, DAN X
Prinsip
Protombin time adalah dasar dari pemeriksaan ini, dengan penambahan factor spesifik – plasma defisiensi pada plasma pasien. Persentase dari aktivitas factor di tentukan dengan menghitung koreksi dari PT ketika cairan spesifik dari plasma pasien di tambahkan dgn factor-defisiensi plasma. Hasilnya di dapat dari aktivitas kurva.
Reagen dan alat
Comersial tromboplastin
Factor spesifik-deff plasma (II,V, VII, dan X)
Imidazole buffer saline
Prosedur
Interpretasi
Nilai normal berkisar 50 - 150%
PEMERIKSAAN ONE STAGE KUANTITATIF UNTUK FAKTOR VIII, IX, XI DAN XII
Prinsip
Pemeriksaan ini berdasarkan pada kemampuan plasma pasien untuk mengkoreksi faktor spesifik- plasma defisiensi dengan tes aPTT. Hasilnya berupa kurva.
Reagen dan alat
Reagen aPTT
Prosedur
Interpretasi
Catatan
PEMERIKSAAN SKRENING FAKTOR XIII
Prinsip
Stabilnya bekuan fibrin tergantung dari plasma factor XIII, dengan mengubah ikatan hydrogen menjadi ikatan kovalen dengan transaminasi. Bila tidak ada factor XIII ikatan hydrogen ini larut pada 5 M urea atau 1 % asam monokloroasetat
Reagen dan alat
5 M urea atau 1 % asam monokloroasetat
0.02 M CaCl2
Salin (0,14 M NaCl)
Plasma pasien
Water bath 37 C
Prosedur
Siapkan 2 bekuan fibrin dengan menambahkan 0,1 ml pasien plasma dan 0,05 ml dari CaCl2 pada setiap tabung reaksi
Inkubasi 37 C
Tabung 1 tambah 1 ml 5 M urea atau 1 % asam monokloroasetat
Tabung 2 tambah 1 ml salin
Tutup tabung, homogenisasi dan inkubasi pada suhu ruangan dan observasi bekuan pada jam 1, 2,4 dan 24
Interpretasi
Setelah 24 jam terlihat bekuan dengan factor XIII lebih kuat.dengan defisiensi factor XIII memperlihatkan pada tabung lebih encer. Bila bekuan nya pecah pada tabung salin dan urea mengindikasikan hiferfibrinolisis.
Catatan
Defisiensi factor XIII tidak terdeteksi dengan pemeriksaan koagulasi lainnya. Harus dengan teknik kromogenik.
INHIBITOR KOAGULASI
Pd pasien hemophilia Faktor inhibitor dalam darah secara langsung akan melawan factor VIII, tapi pada pasien non hemofilia juga bisa bereaksi seperti pada wanita setelah melahirkan atau aborsi, orang tua dan pada kelainan imunologik seperti remathoid arthritis. Begitu pula pada vWF disease.
BETHESDA TITER
Factor VIII inhibitor dapat dihitung
9
