UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS ESCUELA DE QUIMICA QUÍMICA
METABOLISMO FERMENTATIVO, ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES Y DE LA CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES EN LEVADURAS FERMENTATIVE METABOLISM, STUDY OF PROTON PUMP AND ELECTRON TRANSPORT CHAIN IN YEAST
Correa Fuentes Juanita Del Pilar Soracá Pérez Gina Yasmin Fecha de entrega del informe: 06-05-2015 Resumen: En esta práctica de laboratorio, se busca conocer y entender los
mecanismos bioquímicos subyacentes a los procesos microbianos de síntesis, utilizando modelos matemáticos que describen el comportamiento microbiano (fermentación) como: crecimiento, síntesis y cinéticas de inactivación. P alabras labras claves claves : Fermentación, levadura, microorganismos. Abstract: In this lab, we seek to know and understand the underlying biochemical
mechanisms to microbial synthesis processes using mathematical models describing the microbial behavior (fermentation) as: growth, synthesis and inactivation kinetics. Keywords: Fermentation, yeast, microorganisms.
Introducción
La fermentación es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser un proceso de oxidación incompleta, típico de los organismos anaeróbicos, pues se realiza sin la intervención del oxígeno. El proceso de fermentación no solo incluye la desasimilación como la formación de alcohol, etanol-acetona, ácido láctico, etc. Sino también la producción industrial de vinagre, ácido cítrico, enzimas, penicilina, etc. Todos estos productos son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentación.
Antes de la revolución metodológica de la biología molecular, la identificación de microorganismos dependía del análisis morfológico y bioquímico. En la actualidad, estas técnicas se complementan con los avances moleculares y técnicas informáticas para permitir un mayor conocimiento y una mejor identificación y clasificación de los microrganismos, sin embargo: el análisis bioquímico es el único que permite una aproximación al estudio de su metabolismo, información de gran importancia para determinar aplicaciones industriales.
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Durante la fermentación, le energía obtenida procede, igual que en la respiración aerobia, de las reacciones de óxido-reducción habidas durante el catabolismo de la glucosa (glucolisis), pero en la fermentación las coenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxígeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgánico que se reduce y el e producto característico de cada fermentación.
Se puede ver que la fermentación alcohólica es desde el punto de vista energético una reacción exotérmica, se libera una cierta cantidad de energía. Un cálculo realizado sobre la reacción química muestra que el etanol resultante es casi un 51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.
Inóculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las bebidas alcohólicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autóctonas, las cuales están adaptadas a los medios de fermentación de cada área. Aunque se han encontrado muchos géneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomycerevisae es la principal responsable de la fermentación alcohólica, así como de la producción de la mayoría de los compuestos aromáticos. Algunos de los criterios de selección de las cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como producción de etanol, acidez y consumo de azucares.
Resultados y discusión
(Ver Anexo A)
Efecto de la fuente de carbono.
La fermentación alcohólica es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, sirve con cualquier sustancia que tenga la forma empírica de la glucosa, es decir, que sea una Hexosa.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico (2)
La fermentación completa a la glicolisis y hace posible producir ATP continuamente en la ausencia del oxígeno. Por la oxidación del NADH producido en la glicolisis, la fermentación regenera el NAD+, el cual interviene otra vez para producir más ATP.
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Las concentraciones de azúcares afectan a los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.
Los monosacáridos como la dextrosa y la fructosa son moléculas de un solo anillo. Los disacáridos como la sacarosa, la maltosa y la lactosa están formados por dos monosacáridos unidos. Al mezclarse con la levadura, la que produce más fermentación es glucosa (y por consiguiente más dióxido de carbono) seguida por la sacarosa. La fructosa, maltosa y la lactosa producen una reacción muy pequeña.
(Ver anexo B)
Reconocimiento de intermediarios metabólicos.
Reconocimiento del piruvato La aparición de un anillo rosado indicará la presencia de grupos tiólicos.
(Ver anexo C)
Reconocimiento del etanol. La aparición de un anillo rosado indicará la presencia de grupos tiólicos.
Si bien el proceso completo descrito simplificado anteriormente explica los productos resultantes de la fermentación etílica de una hexosa, cabe destacar que el proceso se puede detallar en una glicólisis previa gobernada por un conjunto de enzimas en la que se obtiene
(Ver anexo D) TUBO
1
2
3
4
Anillo Anillo rosado rosado Piruvato (grupos (grupos tiol) tiol) Etanol (-) (+) (-) (-)
Patrón etanol
(+)
Metabolismo del piruvato: El piruvato, producto final de la glucolisis, se metaboliza por diferentes vías para producir etanol, lactato o acetilcoenzima A, en dependencia de las necesidades celulares, del tejido, del organismo, etc. El piruvato se transforma en: etanol + CO2, que son los productos finales de la fermentación alcohólica realizada por algunos µorganismos (levaduras).
La concentración excesiva de hidratos de carbono en forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentración puede frenar el proceso. Las concentraciones límite dependen del tipo de azúcar así como de la levadura responsable de la fermentación.
Reacción global: Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 H+ ------> 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
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Después de unas semana de total reposo, se abrió el bote para verificar si la fermentación se llevó a cabo de una manera correcta, se observó que la fermentación salió bien, debido a que el olor que despedía era a alcohol, podría decirse que a sidra, pero de igual manera al realizar las diferentes se pruebas se observó que: - No hubo desprendimiento de gas. - Al acercar el fosforo al fermentado, se avivo más la llama. - No se formaron los cristales. Lo anterior se puede explicar, debido a que el proceso de fermentación excedió los días óptimos para su estudio.
Fermentación alcohólica. La fermentación alcohólica con la emisión de ciertas cantidades de etanol se produce de forma espontánea en la naturaleza siempre que se encuentre un azúcar y una atmósfera pobre de oxígeno, es por esta razón que ocurre espontáneamente en el interior de algunas frutas que se puede decir sufren un proceso de maduración anaeróbica.
Glicolisis anaerobia.
Volumen CO2 vs Tiempo 25
) 20 n i m15 ( o p 10 m e i t
Se tiene que estar revisando periódicamente, ya que pueden llegar a formarse pequeñas bombas, las cuales se forman debido a que se produce gran cantidad de CO2, el cual pesa más que el aire, y puede llegar a crear bolsas que desplazan el oxígeno de los recipientes donde se produce la fermentación. En caso de que así sea, se es recomendable abrir unos segundos la tapa para que se ventile.
5 0
0
10
20
30
40
volumen CO2 (ml)
Como podemos ver en la gráfica a medida que aumenta el tiempo es mayor el volumen de dióxido de carbono. 4
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La degradación de la glucosa por la vía glucolítica produce piruvato. Éste en (1) condiciones anaeróbicas puede seguir una fermentación y produce: etanol,
lactato,
etc…
y
en
(2)
condiciones aerobias se produciría una oxidación completa, degradándose hasta CO 2 (acetilCoA)(3).
DESCARBOXILACION DEL PIRUVATO
OXIDATIVA
En condiciones aerobias u oxidativas el piruvato se convierte en acetil-CoA + CO 2; el acetil-CoA se incorporará al ciclo del ácido cítrico o a otras vías metabólicas. En eucariotas y procariotas, la glucólisis ocurre en el citosol de la célula.
La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del etanol son complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de los parámetros intervinientes durante el proceso de fermentación. Algunos de ellos se deben tener en cuenta, de los más importantes como son: * Concentración de etanol resultante * Acidez del substrato * Concentración de azúcares * Contacto con el aire * La temperatura * Ritmo de crecimiento de las cepas
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El NaF es un potente inhibidor de la actividad enzimática de la enolasa, el catalizador para el paso 9 de la glucolisis.(4)
La velocidad puede ser medida mediante un electrodo de oxígeno. Gran parte del conocimiento de la función mitocondrial ha resultado de estudios con compuestos tóxicos. Inhibidores específicos se han usado para distinguir el sistema de transporte de electrones del sistema de fosforilación oxidativa, y ha ayudado a definir la secuencia de los transportadores redox en la cadena. Si la cadena se bloquea en un punto, todos los transportadores anteriores quedan más reducidos, y los posteriores más oxidados.(5)
Estudio del bombeo de protones por levaduras, efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes.
Conclusiones
pH vs. Tiempo 7,00 6,50 H6,00 p
5,50 5,00 pH (antes de inhibidor)
0
10
20
30
Tiempo (mins)
Se debe estar seguros que al momento de realizar la fermentación, ésta no se encuentre contaminada, por diversos factores, ya que ese pequeño detalle, puede llegar a arruinar el proceso, ocurriendo una putrefacción en vez de una fermentación. Además de tenerla en continua vigilancia.
En la reacción de fuente de carbono se observó que el carbohidrato que liberó más CO 2 fue la glucosa.
Control
Dinitrofenol
Ferricianuro de K
El uso de inhibidores de la cadena ha permitido trazar el paso de los electrones a través de la cadena y determinar el punto de entrada de diversos sustratos. La velocidad a la cual el oxígeno es consumido por una suspensión de mitocondrias es una medida del funcionamiento de la cadena de transporte de electrones.
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Se observó que bombeo de levaduras, el inhibidores a aumentaba el disminuía.
en el estudio del protones por efecto de los medida que tiempo el pH
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Bibliografía (1)
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ROBERTO MARTINEZ. Quimica un proyecto de ACS. ROBERTO MARTINEZ. Quimica un proyecto de la ACS. Pag 418 ROBERT MORRISON. Quinta edición. Quimica Orgánica. Pag 629
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VOET. 2°a edición. Fundamentos de bioquímica. Pag 313 MATHEWS C. 1992. Bioquímica. Paginas 398-433
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Anexos
Anexo A
Fig1. Proceso de fermentación.
Anexo B
Anexo C
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Anexo D
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