Manual de ABC 1 QFB FES Cuautitlan

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

MANUAL DE LABORATORIO DE ANALISIS BIOQUÍMICO CLINICOS I

AUTORES: Q.F.B. MARTHA PATRICIA PATRICIA CAMPOS PEON Q.F.B. RENE DAMIAN SANTOS M en C GLORIA LETICIA ARELLANO MARTNEZ Q.F.B. MA. DE LOURDES GALVAN GALVAN RUIZ Q.F.B. BEATRIZ LUCIA GONZALEZ GONZALEZ MALDONADO M en C OMAR ASAF RUIZ CAZARES

AGOSTO DE 2008

ÍNDICE Presentación Reglamento de Laboratorio Practica No. 1. Toma de muestra de sangre venosa Practica No. 2. Citometría hemática Practica No. 3. Grupos sanguíneos y pruebas cruzadas Practica No. 4. Pruebas de coagulación Practica No. 5. Química sanguínea I y glucosa posprandial Practica No. 6. Química sanguínea II Practica No. 7. Urianálisis Referencias

Pág

2 3 5 14 25 33 43 51 59 70

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ÍNDICE Presentación Reglamento de Laboratorio Practica No. 1. Toma de muestra de sangre venosa Practica No. 2. Citometría hemática Practica No. 3. Grupos sanguíneos y pruebas cruzadas Practica No. 4. Pruebas de coagulación Practica No. 5. Química sanguínea I y glucosa posprandial Practica No. 6. Química sanguínea II Practica No. 7. Urianálisis Referencias

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2 3 5 14 25 33 43 51 59 70

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PRESENTACION En este manual se presenta la información necesaria para realizar adecuadamente las prácticas de la asignatura de Análisis Bioquímico Clínicos I, además de formar parte del material de consulta para los estudiantes y aplicar a los estudiantes que se encuentren cursando la asignatura de Análisis Bioquímico Clínico I y a los profesores que participen en esta asignatura. El manual fue elaborado por los profesores que participan en la asignatura. El manu manual al cons consta ta de 7 prác práctitica cas, s, que que está están n orga organi niza zada dass en 10 punt puntos os,, que que a continuación se resumen, para mejor comprensión del manual. 1. Marco Marco teórico. teórico. En el se da da un panorama panorama de de la importanc importancia ia del estudi estudio o e incluye incluye una sección denominada información complementaria, que comprende una serie de preguntas o temas que el alumno debe responder previo a la realización de la práctica. 2. Objeti Objetivo vo u objet objetivo ivoss de la prác práctic tica. a. 3. Mater Materia iales les.. Este Este punto punto incluye incluye un listad listado o del materi material al requeri requerido do por equipo equipo de trabajo y por grupo, los reactivos necesarios para la práctica, así como la muestra biológica requerida para la misma. 4. Métod Métodos. os. En este este aparta apartado do se desglo desglosan san las determ determina inacio ciones nes que se reali realizar zarán án durante la sesión experimental. Cada determinación incluye su fundamento, el significado significado clínico y el procedimiento procedimiento a seguir. 5. Disposi Disposición ción de residuos residuos.. Se índica la forma de desecha desecharr los residuos residuos generado generadoss durante la práctica. 6. Diagram Diagrama a de flujo. flujo. Consiste Consiste de una hoja hoja en blanco blanco en la la que el alumno alumno plasma plasmara ra en forma de diagrama la secuencia a seguir en la sesión experimental. experimental. 7. Resu Resultltad ados os.. En algu alguna nass prác práctitica cass este este punt punto o vien viene e desg desglo losa sado do por por cálc cálcul ulos os aritméticos y una tabla de resultados, en la cual se deben incluir el valor de referencia y la interpretación de los resultados. 8. Discusi Discusión. ón. Este apartad apartado o se incluy incluyo o con el fin fin de que que alumno alumno plasme plasme en en el mismo mismo manual su análisis y discusión de resultados, evitando el manejo de otras libretas. 9. Conclus Conclusione iones. s. Tiene Tiene la misma intenció intención n del punto punto 8. 8. 10. Refer Referen encia ciass consul consultad tadas. as. Es un punto punto en el cual cual el alumn alumno o deberá deberá anota anotarr las las referencias que empleo para realizar su discusión y elaborar sus conclusiones. Se ha incluido también en el manual, el reglamento del laboratorio, que se ha ubicado al inicio del manual, con la finalidad de que el alumno lo tenga siempre a la mano y recuerde cuales son los lineamientos que debe seguir en el laboratorio, para un mejor desarrollo de las prácticas.

Los Profesores de la Asignatura

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CODIGO: DOC-CB-FESCREGLAMENTO GENERAL DEX-01-00 PARA LOS LABORATORIOS No de REVISIÓN:

1) Este reglamento aplicará para personal académico, alumnos y laboratoristas. 2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con

manga larga. 3) La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos

a partir de la hora señalada. 4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prácticas. 5) En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de trabajo. 6) Queda prohibido en los laboratorios:

a) Tirar basura fuera del cesto. b) Ingerir alimentos y/o bebidas. c) Fumar. d) Recibir visitas. e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos. f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios. g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental. h) Sentarse sobre las mesas de trabajo. i) Mover el mobiliario de su lugar. j) Utilizar las gavetas para guardar

material que no corresponda a la

asignatura.

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7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado físico representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológico-infecciosas (Art. 3º de la Ley General del Equilibrio y Protección del Ambiente). 8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares, reproductores de sonido o cualquier medio electrónico de entretenimiento. 9) El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente un profesor. 10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deberá programarse con el

responsable del laboratorio en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prácticas. para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CBDEX-01-09/CSH-a) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depósito la credencial vigente de la UNAM. 11) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en las condiciones en que se recibió, de no hacerlo, se hará acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio. 12) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el

laboratorio.

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PRACTICA No. 1 TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA

Patricia Campos P.

1.1 MARCO TEÓRICO

El volumen total de sangre en un adulto es 7 a 8% de su peso corporal; siendo el 55% la porción líquida llamada plasma cuya composición corresponde fundamentalmente 90 % agua y el 10 % diferentes metabolitos. El 45% restante de la sangre se compone de elementos celulares eritroides, plaquetarios y leucocitarios. Para que una muestra tenga significado biológico, debe ser representativa y homogénea, por lo que se debe tener conocimiento sobre:

-

La distribución y concentración de cada metabolito en los diferentes tipos de líquidos orgánicos.

-

Estado biológico del metabolito a estudiar (si está libre o conjugado).

-

La producción, utilización y regulación homeostática.

Debe recordarse que una muestra de sangre nos va a reflejar el perfil biológico del paciente del momento en que se ha efectuado la extracción. Existen diferentes técnicas de extracción de muestra sanguínea -

Punción venosa

-

Punción capilar

-

Punción arterial

Para tomar la decisión de cuándo usar cada una de estas técnicas se debe considerar los siguientes factores: -

Edad del paciente

-

Condiciones del paciente

-

Tipo de pruebas a realizar

La técnica de venopuncion, como esta descrita en la estandarización, contempla desde:

-

Condiciones inherentes del paciente (peso, edad, vena no visible, hospitalizado) Selección del material

-

Posición de la toma

-

Selección del sitio de punción

-

Punción venosa (preferentemente con sistema de punción al vació)

-

Eliminación de punzo cortantes

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Las venas más comúnmente utilizadas son las del área ante cubital (vena basílica, cefálica y cubital media), debido a su accesibilidad, fácil manejo y comodidad para el paciente. La venopunción es la más utilizada en el laboratorio clínico ya que es un método sencillo para la obtención de sangre, esta suele hacerse en la vena media cefálica que corre por el interior del brazo y es visible en el pliegue del codo. En casos en los cuales resulta difícil localizar la vena, puede hacerse resaltar diciendo al paciente que cierre y abra la mano, mediante el masaje o por combinación de ambos procedimientos. Se puede realizar de una manera accesible en la mayoría de los pacientes ambulatorios o de consulta externa y en algunos pacientes hospitalizados. La aplicación del torniquete es recomendada para el caso de venas profundas, poco visibles y poco palpables. Debe sujetarse con medio nudo para que pueda quitarse jalando el extremo libre. Para su colocación, es necesario considerar que se ubique 10 cm. por encima del lugar de punción; si se coloca más alto no hay presión, mientras que si está cerca de la zona de punción hay posibilidad de generar un hematoma; además no debe estar más de un minuto en lugar de punción. Se ha demostrado que la utilización del torniquete durante un tiempo mayor a 1 minuto, provoca aumento de un 15% de desviación en valores de coagulación y de un 10% en el hematocrito . Los anticoagulantes son sustancias que impiden la coagulación sanguínea, ya sea por sustracción del calcio del plasma o por neutralización de la trombina. Cuando la sangre se obtiene agregando algún anticoagulante, se inhibe la cascada de la coagulación obteniendo, después de la centrifugación, elementos formes separados del sobrenadante que se conoce como plasma. En cambio, si se permite que la muestra coagule, se obtendrá coágulo y el sobrenadante se llama suero. La sangre desfibrinada es aquella desprovista de factores de la coagulación.

1.1.1 Información Complementaria -

Indique ejemplos de anticoagulantes, su modo de acción, su concentración y proporción en que se usa para esta función.

-

¿Cual es la diferencia entre suero y plasma? Considere su composición y la metodología para su obtención

-

¿Que es la hemólisis? Mencione algunas recomendaciones para evitarla

-

¿Que se obtiene de la técnica para la sangre desfibrinada después de la centrifugación?

-

Indique como se observa una muestra sanguínea lipémica y cual es la razón

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1.2 OBJETIVOS

-

El alumno adquirirá los conocimientos necesarios a para poder realizar una venopunción

-

El alumno desarrollara la habilidad práctica por medio de la técnica de la venopunción para poder obtener una muestra de sangre venosa con calidad e integridad.

-

El alumno conocerá la importancia e influencia de la buena toma de muestra sanguínea a través de los conocimientos y practica adquiridos para poder llevar a cabo un correcto diagnóstico y una toma de decisiones terapéuticas adecuada.

1.3 MATERIAL

1.3.1 Muestra Biológica Se utilizarán tres muestras de sangre venosa: 3 ml y 10 ml obtenidos con jeringa, 7 ml obtenidos con tubo al vacío. 1.3.2

1 4 4 3 8 1 1

Material por equipo

Gradilla Tapón para tubo de ensaye 13 x 100 Pipetas pasteur Bulbo para pipeta Pasteur Tubo de ensaye 13 x 100 Tapa o base para caja petri Tubo de ensaye 15x150 con tapón de rosca

1.3.3

10 1 1 1 6 1

Perlas de vidrio Propipeta Adaptador para tubos al vacío Piseta con agua destilada Gasas Tubo 12x75 con 1 ml de EDTA 5%

Material por grupo

Aplicador de madera Aguja para tubo al vacío Tubo al vacío con gel separador Torundas de algodón con alcohol al 70 % Gasas Cuadros de papel parafilm Balanza granataria de dos platos Frasco con agua corriente y una jeringa Centrifuga Espectrofotómetro con gradilla y 10 celdas limpias

Contenedor para punzocortantes Vaso de precipitado de 250 mL Gradilla Pisetas con agua destilada Recipiente para desechos (RPBI) Micropipetas 5 a 40 µ l Pipeta graduada de 1 mL (1/100) con propipeta Baño de incubación a 37º C con gradilla y termómetro Brazos artificiales con solución cada uno con jeringa Tubo al vacío con Aguja

1.3.4 Reactivos por grupo EDTA al 5% Alcohol al 70% Agua destilada

Hipoclorito de sodio Benzal

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1.4 METODOS 1.4.1 Técnica de venopunción por vacío Para la extracción de sangre el paciente estará sentado y deberá apoyar bien el brazo en una superficie plana, no debe estar de pie o sentado en bancos altos, pues algunos por el efecto de la punción se desmayan y es necesario considerar este riesgo. La técnica de venopunción que se esquematiza a continuación es la indicada para el sistema al vacío: a) Preparar el material. (Romper el sello de seguridad de la aguja sin quitar el

protector de la misma en presencia del paciente. Colocarlo en el adaptador). b) Localizar la vena con el dedo índice y/o medio, evitar utilizar el pulgar. c) Limpiar la zona con alcohol isopropílico al 70% de manera circular del centro hacia

fuera. Dejar secar al aire. d) Solo si es necesario aplicar un torniquete.

e) Sujetar la parte posterior del brazo del paciente a nivel del codo, jalar ligeramente la piel sobre la vena. f) Punción en ángulo de 45º insertando primero la aguja con el bisel hacia arriba

colocándola paralela al trayecto de la vena y posteriormente insertar el tubo (respetando el orden de la toma). g) Retirar la ligadura en cuanto la sangre empiece a fluir (si es necesario). h) Dejar llenar el tubo hasta el volumen preestablecido (frecuente error preanalítico,

que afecta la relación sangre anticoagulante y por lo tanto la calidad de la muestra). i) Mezclar suavemente los tubos con anticoagulantes o aditivos. j) Insertar el siguiente tubo en el caso de toma múltiple. k) Cuando se finaliza la toma, primero se debe retirar el tubo y posteriormente la

aguja. l) Presione el sitio de la venopunción con una torunda con alcohol y coloque un

apósito adhesivo elástico.

1.4.2 Técnica de venopunción con jeringa. Seguir los pasos a, b, c, d y e del procedimiento 1.4.1 e) Quitar el tapón de plástico de la jeringa cuidando que el bisel de aguja se encuentre

hacia arriba colocarla en ángulo de 45º y paralela al trayecto de la vena.

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f) Perforar la piel a lo largo de la cara lateral de la vena, avanzar la aguja y perforar la

pared de la vena. g) Al subir espontáneamente la sangre (se observa una ligera gota en la cubeta de la

aguja) jalar ligeramente el émbolo con movimiento constante. h) Cuando se tiene suficiente cantidad de sangre, se quita el torniquete, se retira la

aguja rápidamente y se aplica una torunda por último un apósito adhesivo elástico. i) Para el manejo de la muestra obtenida con jeringa se retira la aguja de la jeringa y

la sangre se vacía lentamente por la pared de los diferentes tubos a usar con y/o sin anticoagulante. Mientras se llenan los tubos sucesivamente, invertir con suavidad los tubos con aditivos que ya se han llenado

1.4.3 Obtención de Plasma La sangre obtenida por punción venosa con jeringa (3 ml) se vacía inmediatamente en el tubo con la cantidad adecuada de anticoagulante. Es importante recordar quitar la aguja para vaciar el contenido de la jeringa. Se mezcla por inversión lenta con el anticoagulante, evitando la formación de burbujas y se centrifuga a 2.500 rpm/ 5 - 10 min. El tubo se saca de la centrifuga y se separa cuidadosamente el plasma con una pipeta Pasteur, vaciándolo en otro tubo. El plasma también se puede obtener por el método de tubo al vacío, el cual puede contener dos diferentes anticoagulantes, EDTA al 5 % (tubo de tapón lila) o citrato sódico al 3,8 % (tubo de tapón azul), que se elegirá dependiendo de las determinaciones que se realizarán a la muestra.

1.4.4 Obtención de Suero La muestra de sangre obtenida con tubo al vacío de tapón rojo, se coloca en forma inclinada (mayor superficie de contacto) en el baño de incubación a 37º C durante 10 minutos. El coagulo (observe la retracción si se presenta), se separa ligeramente de las paredes con un aplicador de madera, y se centrifuga a 2.500 rpm/5 - 10 min. El tubo se retira de la centrifuga y se separa el suero con pipeta Pasteur, vaciándolo en otro tubo de ensayo. El suero también puede obtenerse tomando la muestra con jeringa y depositándola en un tubo de ensayo sin anticoagulante.

1.4.5 Obtención de sangre desfibrinada

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La muestra de sangre venosa obtenida con jeringa se vacía en un tubo con tapón de rosca que contenga al menos el mismo número de perlas de vidrio que mililitros de sangre se vaya a desfibrinar. A continuación se aplica un movimiento de inversión suave del tubo constante. Al cabo de 2-3 minutos se observará que el ruido que las perlas hacían al chocar contra las paredes del tubo, deja de oírse, eso se debe a que la fibrina que se va formando en el proceso de la coagulación, se deposita sobre ellas, atrapándolas. A partir de ese momento se prosigue el movimiento rotatorio durante 10 minutos. Posteriormente se separan con mucho cuidado la sangre líquida en un tubo de ensaye que se lleva a centrifugar y las perlas de vidrio en la tapa o base de una caja Petri las cuales se lavan con agua destilada separando la fibrina que se adhirió a ellas. La sangre líquida se centrifuga a 2.500 rpm/5 - 10 min.

1.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS 1.5.1 Eliminación de punzocortantes La eliminación de punzocortantes adecuada es parte importante de la toma de muestra. En este caso la eliminación de aguja de toma múltiple, está de acuerdo a normas nacionales (NOM-087-ECOL-SSA1-2002) y las políticas de buenas prácticas establecidas en cada laboratorio. Los punzocortantes como agujas y lancetas así como tubos rotos contaminados deben depositarse en el contenedor rojo rígido. En los contenedores existen diferentes capacidades, lo cual permite que el laboratorio seleccione el más adecuado a su flujo de trabajo y material utilizado. Se debe tomar en consideración las instrucciones de utilización recomendadas por los fabricantes y cuidar no sobrellenar el contenedor, pues esto puede ser un factor de riesgo para el personal técnico y de intendencia. Con una adecuada eliminación se disminuyen los eventos de punción accidental tanto para el paciente y trabajador de salud, como para el personal de intendencia.

1.5.2 Eliminación de muestras biológicas Los tubos para extracción de sangre contaminados o llenos tienen que recogerse en recipientes apropiados para residuos de material potencialmente infeccioso que en este caso son bolsas rojas. Los tubos de vidrio que contengan las muestras serán colocados en agua con cloro durante 24 h. La eliminación de residuos se hace usualmente en instalaciones incineradoras apropiadas.

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1.6 DIAGRAMA DE FLUJO

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1.7 RESULTADOS 1.7.1 Cálculos

1.7.2 Tabla de Resultados Datos Paciente

Puncionó

Técnica(c/s

Muestra

Observaciones

anticoagulante) obtenida

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1.8 DISCUSIÓN

1.9 CONCLUSIONES

1.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

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PRÁCTICA No. 2 CITOMETRÍA HEMÁTICA 2.1 MARCO TEÓRICO. Aunque existe la tendencia a la automatización en la citometría hemática, la presente práctica está diseñada para introducir al estudiante en los procedimientos de laboratorio manuales que puede ser necesario utilizar cuando existen recuentos que exceden la linealidad de un instrumento o éste presenta un desperfecto. El método de cianometahemoglobina para la determinación de hemoglobina y el microhematocrito que permite medir el volumen de los eritrocitos centrifugados, se usan como parte del control de calidad y como métodos de apoyo de análisis de varios laboratorios. El hemocitómetro permite realizar recuentos de cualquier tipo de célula sanguínea: eritrocito, leucocito o plaqueta que ayudan a detectar anormalidades cuantitativas, que al hacer un frotis sanguíneo, teñirlo con colorante de Wright y observarlo al microscopio permite identificar las alteraciones morfológicas o en el caso de los leucocitos el tipo celular que predomina. Empleando los resultados del recuento eritrocitario, valor de hematocrito y concentración de hemoglobina se calculan los índices eritrocíticos (índices de Wintrobe), que aportan datos importantes sobre el tamaño, la concentración de hemoglobina y el peso de hemoglobina de un eritrocito promedio. Datos que facilitan el diagnóstico y la clasificación de las anemias. El recuento de reticulocitos permite evaluar la actividad eritropoyética de la médula ósea, se hace utilizando tinciones supravitales. La velocidad de sedimentación globular (VSG), mide la sedimentación de los eritrocitos en un periodo de 1 hora, que es dependiente de las sustancias contenidas en el plasma y la capacidad de las células para sedimentar. Se encuentra alterada en procesos inflamatorios y se usa para monitorear el tratamiento de ciertas enfermedades. Los resultados obtenidos con estos procedimientos se usan en el diagnóstico para la identificación de afecciones que incluyen: anemias, leucemias, infecciones, así como, trastornos hereditarios de los leucocitos; y además son útiles para el pronóstico y vigilancia terapéutica de diversos padecimientos.

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2.1.1 Información complementaria. - ¿Cuáles son las instrucciones que se dan a un paciente a quien se le realizará una citometria hemática? - Justificar matemáticamente y señalar c/u de los factores a considerar en la obtención del factor 36,8 utilizado para calcular la concentración de hemoglobina y sus unidades.

2.2OBJETIVOS El alumno aplicará los conocimientos adquiridos en la parte teórica, para realizar una citometria hemática. El alumno interpretará los resultados obtenidos en el laboratorio a fin de establecer la presencia o no de anemia. El alumno aprenderá a identificar la morfología de las diferentes células sanguíneas con fines diagnósticos.

2.3MATERIALES 2.3.1

Muestra biológica.

Sangre venosa completa obtenida por sistema de vacío con EDTA.

2.3.2 Material por equipo Gradilla Tubo de Wintrobe Tubo de ensaye 13 x 100 Hemocitómetro Tubo de ensaye 12 x 75 Adaptador para tubos al vacío Pipeta de Salhi con manguera de Tubos de ensaye 12x75 con 3 ml de SSF, succión 3ml de reactivo de Turck, 3ml de reactivo Contador de Hayem cada uno Pipeta Pasteur con punta larga con bulbo Microscopio

2.3.3 Material Por Grupo Tubo capilar Aguja para tubo al vacío Tubo al vacío de tapón lila Torundas de algodón con alcohol al 70 % Gasas Tubo al vacío con tapón lila Cuadros de papel parafilm Microcentrífuga Lector de hematocrito Espectrofotómetros con vaso de precipitado de 500 ml

Celdas /2 gradillas Pipeta graduada de 5 ml c/propipeta Gradillas de Sedimentaciòn Pisetas de agua destilada Vasos de pp de 250 ml Viales limpios c/2 -3 ml de EDTA al 5% Vortex Recipiente c bolsa roja para desechos Contenedor para punzocortantes Frascos torunderos c/torundas y alcohol

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2.3.4 Reactivos Reactivo de Drabkin (Hemoglobina) Etanol 70% Líquido de Turck Reactivo de Hayem Cloruro de sodio 0,9% (SSF)

Benzal Hipoclorito de sodio Reactivo de Wright Buffer de fosfatos para tinción de Wright Azul de cresilo brillante

2.4 MÉTODOS

2.4.1 Hemoglobina: Método de la cianometahemoglobina Fundamento. Para la determinación de hemoglobina se utiliza el reactivo de Drabkin, el cual contiene un detergente que permite la lisis de los eritrocitos y, por lo tanto la liberación de la hemoglobina. Posteriormente, el ferricianuro de potasio la reduce a metahemoglobina, que se estabiliza por la unión con los iones CN - (cedidos por el KCN) formando cianometahemoglobina que tiene una absorbancia máxima a 540 nm.

Significado clínico. El valor de referencia de la hemoglobina para mujeres es de 12 a 16 g/dl y para hombres de 14 a 18 g/dl. La disminución de hemoglobina indica anemia, que puede deberse a deficiencia en las sustancias que intervienen en su formación, alteraciones en los órganos que la sintetizan y disminución en la producción o destrucción excesiva de los eritrocitos.

Procedimiento. -

Colocar 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo 13x100

-

Llenar la pipeta de Sahli hasta la marca de 20 con ayuda una boquilla.

-

Secar el exceso de sangre con una gasa limpia.

-

Sin dejar caer alguna gota de sangre, depositar la muestra en el tubo con el reactivo de Drabkin, enjuagando la pipeta con un poco del reactivo.

-

Tapar el tubo con papel parafilm. Homogenizar la preparación en un vórtex.

-

Incubar 3 minutos a temperatura ambiente.

-

Leer a 540 nm antes de 5 minutos. Multiplicar la absorbancia obtenida por 36.8 para obtener la concentración de hemoglobina en g/dl.

2.4.2Cuenta de eritrocitos: Método del hemocitómetro Fundamento. El número de células por mm 3 estará determinado por un factor de dilución en la pipeta de Thoma para eritrocitos, por el conteo de las cinco cuadrículas secundarias del hemocitómetro y por el volumen de la cámara. Las células contadas en el objetivo 40X corresponderán a los eritrocitos después de un tratamiento con el diluyente de Hayem, compuesto de bicloruro de mercurio, sulfato de sodio y cloruro de sodio, que permite la lisis de los leucocitos, y conservar a los eritrocitos en un ambiente isotónico.

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Significado clínico. El valor de referencia para hombres es de 4,0 – 6,2 x 10 6 células / mm3, el de mujeres es de 4,0 – 6,2 x 10 6 células / mm3. El aumento de eritrocitos se observa en la hemoconcentración, en afecciones del bazo. Su disminución se manifiesta en las anemias, cuyo origen puede ser la pérdida excesiva de sangre, destrucción acelerada o producción inadecuada de eritrocitos.

Procedimiento. -

Llenar la pipeta de Thoma para eritrocitos (roja) con sangre hasta la marca de 0.5 con ayuda una boquilla.

-


-

Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el líquido diluyente de Hayem hasta la marca de 101 sin pasar de la marca.

-

Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm.

-

Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min.

-

Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitómetro.

-

Contar las células con el objetivo 40X en las cinco cuadrículas secundarias con la ayuda de un contador mecánico.

-

Calcular el número de eritrocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por 10000.

2.4.3 Hematocrito: Método del Microhematocrito Fundamento. El hematocrito expresa en porcentaje (%) el volumen que ocupan los eritrocitos en una muestra sanguínea centrifugada en velocidad y tiempo constante.

Significado clínico. El valor de referencia es de 37 a 47% en mujeres y 42 a 52% en hombres. Su aumento indica policitemia (aumento del número de eritrocitos); su disminución se presenta durante la anemia, hipovolemia y durante el embarazo.

Procedimiento. -

Llenar un capilar de 75 mm hasta ¾ partes por capilaridad con la sangre previamente homogenizada.

-

Sellar el extremo vacío del tubo con un encendedor.

-

Colocar el tubo capilar sellado en la microcentrífuga con la parte sellada hacia el lado opuesto al centro de la centrífuga.

-

- Centrifugar 5 minutos (10.000 rpm) o 10 minutos (5.000).

-

Calcular el microhematocrito con ayuda del lector de microhematocrito o de acuerdo a la siguiente fórmula:

-

Hto= Vol. de eritrocitos (mm) / Vol Total de sangre (mm) x100

-

Reportar en %.

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2.4.4 Índices de Wintrobe: VCM, HCM, CHCM Fundamento. Se trata de indicadores obtenidos mediante cálculos aritméticos, que involucran los valores de hemoglobina, número de eritrocitos/mm 3 y hematocrito, y que permiten la clasificación morfológica de las anemias.

Significado clínico. Los valores de referencia son: -

VCM = 80 – 100 fl; un valor < 80 fl indica anemia microcítica; mientras que por arriba de 100 fl indica anemia macrocítica. Esta relacionada con la anisocitosis.

-

HCM = 26 a 34 pg y CHCM = 32 – 36 g/dl; valores menores al de referencia indican anemia hipocrómica; mientras que valores por arriba del límite de referencia indican anemia hipercrómica.

Procedimiento. Para obtener los índices de Wintrobe es necesario tener los valores de hemoglobina, número de eritrocitos/mm 3 y hematocrito, utilizando las siguientes fórmulas. Volumen Corpuscular Medio (VCM) = Hto / No. eritrocitos X 10 = [fl] (femtolitros) Hemoglobina Corpuscular media (HCM) = Hb / No eritrocitos. X 10 = [pg] (picogramos) Concentración de HCM (CHCM) = Hb / Hto X 100 = [g/dl]

2.4.5 Cuenta de Reticulocitos: Tinción supravital Fundamento. Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de rRNA (ácido ribonucleico ribosomal). Cuando son sometidos a colorantes llamados supravitales, como el azul de cresilo brillante, este precipita sobre los restos de rRNA permitiendo observarlo en forma de “cuentas de rosario”, que los eritrocitos maduros no contienen.

Significado clínico. El valor de referencia es de 5 a 20 reticulocitos/1.000 eritrocitos o 0,5 a 2,0 %. Cuando se presenta la destrucción acelerada de eritrocitos (anemia hemolítica, sangrado excesivo, hemorragia), el número de eritrocitos aumenta.

Procedimiento. -

Colocar en un tubo 12x75, 5 gotas de colorante azul de cresilo brillante

-

Adicionar 5 gotas de sangre homogenizada.

-

Mezclar sin agitar ni generar burbujas.

-

Incubar 15 minutos a temperatura ambiente,

-

Con esta preparación realizar un frotis y dejarlo secar al aire.

-

Observar con el objetivo de 100X, buscando una zona de la extensión donde el número de eritrocitos sea aproximadamente 100, contando el número de reticulocitos presentes.

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-

Repetir el conteo en al menos en tres campos distintos. Expresar el número de reticulocitos observados por cada mil eritrocitos o en tanto por ciento.

2.4.6 Cuenta de leucocitos: Método del hemocitómetro Fundamento. El número de células por mm 3 estará determinado por un factor de dilución en la pipeta para glóbulos blancos, por el conteo de las cuatro cuadrículas primarias del hemocitometro y por el volumen de la cámara. Las células contadas en el objetivo 10X corresponderán a los leucocitos después de un tratamiento con el diluyente de “Turck”, compuesto de ácido acético glacial, que lisa a los eritrocitos, y azul de metileno (colorante de contraste) que permite observar fácilmente a los leucocitos. La fuerte agitación es importante para este cometido.

Significado clínico. El valor de referencia es 5.000 a 10.000 leucocitos/mm 3. Los leucocitos son células de la defensa (inmunidad) que incrementan en procesos inflamatorios o infecciosos. Su disminución se observa durante la inmunosupresión (por el usos de fármacos), inmunodeficiencia (algunos virus pueden ocasionarla) o en la leucopoyesis alterada.

Procedimiento. -

Llenar la pipeta de Thoma para leucocitos (blanca) con sangre hasta la marca de 0.5 con ayuda de una boquilla.

-


-

Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el líquido diluyente de Turck hasta la marca de 11 sin pasar de la marca.

-

Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm.

-

Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min.

-

Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitómetro.

-

Contar las células con el objetivo 10X en las cuatro cuadrículas primarias con la ayuda de un contador mecánico.

-

Calcular el número de leucocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por 50.

2.4.7 Cuenta diferencial de leucocitos: tinción de Wright Fundamento. La extensión de la sangre sobre un portaobjetos (frotis) permite apreciar mejor la morfología de las células sanguíneas. El conteo diferencial es posible gracias a la tinción de Wright, cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes ácidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición al metanol). De esta manera, es posible realizar la cuenta diferencial de las poblaciones

21

leucocitarias, además de observar la morfología y características de tinción de los eritrocitos y plaquetas.

Significado clínico. El valor de referencia relativo y las alteraciones comunes de las células leucocitarias son las siguientes: -

Neutrófilos segmentados = 45 a 60%; la neutrofilia se observa durante procesos inflamatorios agudos e infecciosos; la neutropenia se presenta en la depresión de la médula ósea, inmunodeficiencia o inmunosupresión.

-

Linfocitos = 20 a 40%; la linfocitosis se manifiesta en alteraciones virales y en respuesta a procesos infecciosos; la linfopenia se observa en procesos similares a la neutropenia.

-

Monocitos = 0 a 7%; la monocitosis

-

Neutrófilos en banda = 0 a 5 %; su número se observa incrementado cuando los neutrófilos segmentados disminuyen por reaccionar ante el agente infeccioso.

-

Eosinófilos = 0 a 4%; la eosinofilia se presenta principalmente en respuesta a cuadros alérgicos y durante las parasitosis.

-

Basófilos = 0 a 1%; la basofilia se manifiesta cuando los eosinófilos aumentan, pues se trata de células que controlan la respuesta alérgica.

Como se mencionó, en el frotis sanguíneo también se observan las plaquetas (forma y tamaño) y los eritrocitos, cuyas observaciones deben relacionarse a lo determinado por los índices de Wintrobe, de acuerdo a lo siguiente: −

Anisocitosis: diferentes tamaños del eritrocito; siendo un microcito si su

tamaño es menor 7 µ m; normocito si va de 7 a 8 µ m y macrocito si es mayor a 8 µ m. Esta característica se relaciona con el VCM. −

Anisocromía: diferentes características de tinción; es hipocrómico si se

tiñó débilmente; normocrómico si tiene una coloración normal e hipercrómico si su tinción es intensa. Esta característica se relaciona con el HCM y CHCM. −

Poiquilocitosis: cambios permanentes en la forma del eritrocito. No

mantiene relación con los índices de Wintrobe.

Procedimiento. -

Colocar una gota de sangre perfectamente homogenizada en un portaobjetos.

-

Hacer la extensión de sangre con un movimiento suave y firme con la ayuda de otro portaobjetos.

-

Secar al aire.

-

Cubrir el frotis completamente con colorante de Wright durante 7 minutos (cuidar que no se seque el colorante).

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-

Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos.

-

Decantar y enjuagar con agua destilada.

-

Contar al microscopio en el objetivo de 100X, 100 células leucocitarias con ayuda de un contador mecánico. Al mismo tiempo que se recorre el frotis observar la morfología de eritrocitos y plaquetas.

2.4.8 Velocidad de sedimentación globular: Método de Wintrobe Fundamento. La velocidad de sedimentación globular (VSG) está determinada por la propiedad de sedimentación de las células sanguíneas por influencia de la gravedad y depende de las características del plasma y su relación con las células.

Significado clínico. El valor de referencia para hombres es 0 a 15 mm/h y para mujeres es 0 a 20 mm/h. Si la VSG está aumentada se demuestra la presencia de inflamación o destrucción celular, como en el caso de lupus eritematoso generalizado, artritis reumatoide, infecciones crónicas y agudas, fiebre reumática, hepatitis, infarto al miocardio, embarazo, menstruación.

Procedimiento. -

Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentación cuidando que esté perfectamente bien nivelada.

-

Con la ayuda de la pipeta Pasteur llenar el tubo de Wintrobe hasta la marca de 10 ó 1 con sangre previamente homogenizada.

-

Dejar reposar durante una hora evitando cualquier movimiento.

-

Hacer la lectura de los milímetros (mm) sedimentados en una hora.

2.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Los tubos con sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores dispuestos para cada fin. Las agujas se desecharán en el contenedor rojo de punzocortantes. Los guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminado con sangre se depositarán en la bolsa roja de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI). Los empaques de jeringas, agujas, guantes, algodón e incluso los mismos guantes, se desecharán en el bote de la basura si no están contaminados con muestra biológica.

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2.7.1 Tabla Datos del Paciente Nombre______________________________________ Edad______ Sexo____ Determinación Hemoglobina Hematocrito VSG Eritrocitos HCM VCM CMHC Reticulocitos Leucocitos Neutrófilos segmen. Neutrófilos banda Linfocitos Monocitos Basófilos Eosinófilos

Resultado

Valor de Referencia

Observaciones

en

25

2.8 DISCUSIÓN

2.9 CONCLUSIONES

2.10 REFERENCIAS

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PRÁCTICA No. 3 GRUPOS SANGUÍNEOS Y PRUEBAS CRUZADAS Omar Ruiz C.

3.1 MARCO TEÓRICO Las células sanguíneas contienen moléculas en la superficie de la membrana que difieren de un individuo a otro. Las sustancias que se encuentran en los eritrocitos y que son responsables de la incompatibilidad sanguínea, se han llamado antígenos eritrocitarios y han sido descritos alrededor de 23 grupos diferentes. Estos diversos antígenos forman a los grupos sanguíneos que son biomoléculas presentes al nacimiento, cumplen con las leyes mendelianas y son detectadas porque reaccionan específicamente con un anticuerpo. El sistema ABO fue el primer grupo sanguíneo que se describió, son una secuencia de 5 a 7 carbohidratos y se encuentran en la membrana de los eritrocitos como glicolípidos o en líquidos corporales como glicoproteínas. Lo constituyen los tipos A, B, AB y O. Pero existen variantes como el antígeno Bombay y el antígeno de Lewis. Los carbohidratos del sistema ABO sirven de transportadores de iones para los eritrocitos. El factor Rh (de Macaccus rhessus, primate donde se descubrió al inocular sus eritrocitos en conejos) es una lipoproteína transmembranal cuya sección reaccionante es el antígeno D, aunque existen otros 43 antígenos más que lo componen, la identificación de este antígeno describe un individuo Rh positivo. El Rh está involucrado en la anemia hemolítica del recién nacido. Su papel fisiológico de la lipoproteína es el transporte de iones con gasto de ATP. Los sistemas ABO y Rh son los más estudiados debido a que son los más inmunogénicos, es decir, que provocan una respuesta inmune más severa , tomando gran importancia para el caso de transfusiones. Otros grupos sanguíneos que han tomado importancia en el banco de sangre son el sistema Kell, Duffy, Kidd, Lutheran, MN y Lewis. Los grupos sanguíneos se estudian principalmente en los casos de transfusión o trasplantes, en el estudio de estados hemolíticos inmunológicos; medicina forense, exclusión de paternidad, homicidio, violaciones o en antropología física (origen o migración étnica, mezcla racial). Debido a la presencia de otros grupos sanguíneos, en el banco de sangre se emplean las pruebas cruzadas. Dichas pruebas someten el plasma del receptor con eritrocitos del donador y viceversa. Si existe alguna incompatibilidad sanguínea, será detectada por una reacción antígeno-anticuerpo observándose en forma de aglutinación. La

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reacción de aglutinación es utilizada también en la determinación de los grupos sanguíneos.

3.1.1 Información complementaria -

¿Qué es la eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido?

-

Investiga cuál es la utilidad del suero de Coombs y la albúmina en la práctica.

-

¿Cuál es la secuencia de carbohidratos de los diferentes antígenos del sistema

ABO? -

Describe el proceso de preparación de 2 ml de suspensión de eritrocitos al 5%.

-

Investiga los requisitos que debe cumplir el donante y otros análisis que se

realizan a la unidad de sangre donada.

3.2 OBJETIVOS -

El alumno conocerá la importancia de los grupos sanguíneos en el banco de sangre através del estudio de incompatibilidades.

-

El alumno determinará los grupos sanguíneos ABO y Rh de una muestra de sangre a través de reacciones de aglutinación.

-

El alumno analizará la compatibilidad de dos muestras para una transfusión a través de las pruebas cruzadas.

-

El alumno conocerá la utilidad del suero de Coombs con diferentes pruebas.

3.3 MATERIALES 3.3.1 Muestra biológica Sangre venosa completa obtenida por sistema al vacío con EDTA Suspensión de eritrocitos A al 5% Suspensión de eritrocitos B al 5%

3.3.2 Material por equipo 1 8 2 2 1 1

Placa de porcelana Tubos de ensaye de 12 x 50 Tubos de ensaye de 13 x 75 Pipetas Pasteur Adaptador para sistema la vacío Gradilla

1 1 1 1 2

Bulbo para pipeta Pasteur Pipeta graduada 1/100 de 1 ml Pipeta graduada 1/10 de 5 ml Vaso de precipitados de 100 ml Tapones de goma para tubos de 13 x 75

3.3.3 Material por grupo Aplicadores de madera Agujas 21G x Centrífuga Tubos al vacío con EDTA Lancetas Baño maría a 37°C con 2 gradillas, 1 tubo y un

Balanza de doble plato 1 frascos con agua Vasos de precipitados de 500 ml Contenedor para punzocortantes Contenedores para biológicos infecciosos

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termómetro Algodón

Jeringa

3.3.4 Reactivos Suero hemotipificador Anti-A Suero hemotipificador Anti-B Suero hemotipificador Anti-D Suero de Coombs

Solución salina fisiológica (SSF) Albúmina al 22% Alcohol etílico al 70%

3.4 MÉTODOS 3.4.1 Tipificación Clásica Fundamento. La tipificación clásica utiliza la reacción de aglutinación para observar si existen los antígenos A y/o B en los eritrocitos. Si existe alguno de ellos, reaccionarán específicamente con anticuerpos anti-A o anti-B que harán que aglutinar produciendo una prueba positiva.

Significado clínico. Una aglutinación positiva indica la presencia del antígeno, ya sea “A”, “B”, ambos (“AB”) o no aglutinación (“O”); así mismo, el antígeno indica el grupo sanguíneo a la que pertenece la muestra.

Procedimiento. -

Colocar una gota de suero anti-A en un extremo de la placa.

-

Colocar una gota de suero anti-B en otro extremo de la placa.

-

Agregar una gota de sangre completa próximo a cada gota de suero.

-

Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos

-

Observar si existe o no aglutinación en menos de 2 minutos (se debe observar

3.4.2 Tipificación Inversa Fundamento. Identifica los anticuerpos anti-A o Anti-B

(también llamados

isoaglutininas) presentes en el suero o plasma de la muestra, los cuales reaccionan específicamente con eritrocitos conocidos “A” o “B”.

Significado clínico. La presencia de aglutinación indica la presencia de anticuerpos anti-A (si aglutina el tubo A) o anticuerpos anti-B (si aglutina el tubo B). El grupo sanguíneo será “A” si sólo aglutina en el tubo B; grupo sanguíneo “B” si sólo aglutina en el tubo A; “O” si aglutina en ambos y “AB” si no se encuentra aglutinación en alguno de los tubos.

Procedimiento -

Colocar al tubo A 5 gotas de suspensión de eritrocitos A.

-

Colocar al tubo B 5 gotas de suspensión de eritrocitos B.

-

Agregar 5 gotas de suero o plasma problema a cada tubo.

-

Incubar 15 minutos a 37°C, centrifugar a 2.000 rpm por 1 minuto.

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-

Observar si existe o no aglutinación moviendo un poco el fondo del tubo.

3.4.3 Antígeno D (Rh) Fundamento. El antígeno D da una fuerte reacción de aglutinación con anticuerpos anti-D determinando así el factor Rh como positivo.

Significado clínico. La aglutinación positiva indica una sangre Rh positiva, en el caso contrario se deberá hacer la prueba de Du para asegurar que sea Rh negativa.

Procedimiento. -

Colocar una gota de suero anti-D en un extremo de la placa.

-

Agregar una gota de sangre completa próximo a la gota de suero.

-

Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos.

-

Observar si existe o no aglutinación en menos de 5 minutos.

3.4.4 Detección del factor Du (solo si el Rh es negativo o dudoso) Fundamento. Esta prueba se aplica cuando el Rh es negativo o dudoso en la prueba de Antígeno D. El Rh está compuesto por varios determinantes antígénicos (C, D, E, c, d, e) siendo el D el que da una mejor reacción. Para facilitar la aglutinación se agrega suero de Coombs para detectar estos antígenos ya que reaccionan débilmente.

Significado clínico. Si existe aglutinación en el tubo con anti-D, la sangre es de la variedad Du y es Rh positiva; El tubo con albúmina es el control negativo y no debe existir aglutinación. Si ambos tubos no

presentan aglutinación, la sangre es Rh

negativa.

Procedimiento. -

Colocar a cada tubo 1 gota de suspensión al 5% de eritrocitos problema. A un tubo colocar una gota de suero anti-D y al otro una gota de albúmina

-

Incubar ambos tubos a 37°C durante 15 minutos.

-

Lavar 3 veces con SSF

-

Después de decantar agregar a cada tubo 2 gotas de suero de Coombs

-

Centrifugar a 2.000 rpm 1 minuto y observar si existe aglutinación moviendo el botón.

3.4.5 Pruebas cruzadas Fundamento. Estas pruebas determinan si existe compatibilidad sanguínea entre el donante y el receptor a través de enfrentar sus sueros y eritrocitos en una prueba in vitro. De esta manera se descartan anticuerpos irregulares y de otros grupos

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sanguíneos diferentes al ABO y Rh que pudieran reaccionar al momento de la transfusión.

Significado clínico. Después de agregar el suero de Coombs y no observar aglutinación en ambos tubos hay compatibilidad del 100%. Si sólo existe aglutinación en el tubo de la Prueba Mayor, existe un 75% de incompatibilidad; por otro lado si sólo aglutina el tubo de la Prueba Menor, hay un 25% de incompatibilidad. La aglutinación en ambos tubos indica 100% de incompatibilidad.

Procedimiento 1 (medio salino) -

Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensión de eritrocitos del donador (Prueba Mayor).

-

Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensión de eritrocitos del receptor (Prueba Menor).

-

Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto.

-

Observar si existe aglutinación, de lo contrario incubar 15 min. a 37°C.

-

Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. Observar si hay aglutinación.

-

Si no hay aglutinación o es dudosa, lavar 4 veces con SSF.

-

Decantar, mezclar y agregar 2 gotas de suero de Coombs.

-

Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm, 1 min. Observar aglutinación.

Procedimiento 2 (medio proteico). -

Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensión de eritrocito del donador (Prueba Mayor).

-

Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensión de eritrocitos del receptor (Prueba Menor).

-

Agregar 2 gotas de albúmina y seguir los pasos del 3 al 8 del procedimiento de medio salino. NOTA: los tubos en medio salino y medio proteico pueden realizarse simultáneamente

3.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Los tubos con sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores dispuestos para cada fin. Las agujas y lancetas usadas de desecharán en el contenedor rojo de punzocortantes. Los sobrenadantes resultados de los lavados con SSF se decantarán en un vaso con hipoclorito de sodio. Los Guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminado con sangre se depositarán en la bolsa roja de residuos biopeligrosos.

31

Torundas, servitoallas, guantes, envolturas y demás material no contaminado se desechan en el contenedor de basura municipal


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3.7 RESULTADOS Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____

3.7.1 Tablas Tipificación Clásica y Antígeno D Suero hemotipificador

Anti-A

Anti-B

Anti-D

Aglutinación Antígeno presente (A, B ó ninguno -O-) (+) Aglutinó (-) No aglutinó Tipificación Inversa Suspensión de eritrocitos Aglutinación Isoaglutinina presente (anti-A, anti-B) (+) Aglutinó (-) No aglutinó

Eritrocitos A

Eritrocitos B

Determinación del Factor Du. (Antígeno D negativo o dudoso) Aglutinación Muestra con albúmina Muestra con suero de Coombs (+) Aglutinó (-) No aglutinó Grupo sanguíneo Factor Rh Pruebas Cruzadas Proceso Centrifugación 1000 rpm/ 1 min Medio PM salino Pm Medio PM proteico Pm (+) Aglutinó (-) No aglutinó

Incubación a 37°C y centrifugación

PM. Prueba Mayor

Lavado con SSF y suero de Coombs

Pm. Prueba Menor

Grupo sanguíneo Donador Grupo sanguíneo Receptor % Compatibilidad % Incompatibilidad

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3.8 DISCUSIÓN

3.9 CONCLUSIONES

3.10 REFERENCIAS

34

PRÁCTICA No. 4 PRUEBAS DE COAGULACIÓN Lourdes Galván R.

4.1 MARCO TEÓRICO La hemostasia es el término que se aplica al conjunto de fenómenos que detienen o combaten el sangrado de un vaso sanguíneo lesionado, el cual provoca una serie de modificaciones físicas y bioquímicas de las sustancias participantes hasta llegar a la transformación de la sangre líquida en un trombo o coágulo sólido, que sella con eficacia los vasos rotos. Por lo que las hemorragias son consecuencia de anomalías en la fase vascular, plaquetaria y/o en los factores de la coagulación. El proceso de la coagulación se verifica en tres fases: 1) Aparición de actividad tromboplastínica. La tromboplastina es una sustancia celular que se encuentra en plaquetas y tejidos transformando la: 2) Protrombina en trombina siendo necesaria la presencia de calcio. La protrombina es una proteína que se sintetiza en el hígado y es dependiente de la vitamina K. 3) Transformación de fibrinógeno en fibrina, que mediante la participación de la trombina logra gelificarse produciendo redes que recubre elementos celulares de la sangre y finaliza con la formación de un coágulo. En estas tres fases intervienen 16 factores de la coagulación que se activan en “cascada” formando: la vía intrínseca, la vía extrínseca y la vía común. Siendo de gran utilidad la realización de diversas pruebas en el laboratorio que ayuden a la identificación correcta de la alteración en cualquiera de los tres sistemas antes mencionados. El citrato trisódico al 3,8 % es el anticoagulante recomendado para pruebas de coagulación ya que conserva a los factores que participan en este proceso. La dosificación en que se utiliza es 1 parte de anticoagulante para 9 partes de sangre. El EDTA al 5% sólo se recomienda para realizar conteo plaquetario ya que actúa inhibiendo el proceso de agregación, sin embargo no es útil para pruebas de coagulación ya que inactiva algunos factores lábiles. La dosificación en la que se utiliza es 0,02-0,04 ml de anticoagulante para 1 ml de sangre. En la presente práctica se realizarán pruebas que apoyan a la evaluación de la hemostasia: el tiempo de sangrado valora integralmente a la coagulación, el tiempo de coagulación del plasma y el tiempo de tromboplastina parcial activada evalúan el sistema intrínseco mientras que el tiempo de protrombina lo hace con el sistema extrínseco. También se hará la evaluación cuantitativa de las plaquetas.

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4.1.1 Información complementaria - Esquematiza la cascada de coagulación completa. - Define petequia, hematoma y púrpura. - Señala los cuidados que se deben tener al realizar pruebas de coagulación.

4.2 OBJETIVO El alumno conocerá y seleccionará la muestra útil para realizar cada una de las pruebas de coagulación indicadas para esta práctica y, mediante el conocimiento de los fundamentos de cada método, aplicará la técnica adecuada para obtener resultados confiables que reflejen el estado de salud o enfermedad del paciente respecto a la hemostasia.

4.3 MATERIALES 4. 3.1 Muestras biológicas − − − −

Sangre venosa anticoagulada con EDTA obtenida con jeringa Sangre venosa anticoagulada con citrato trisódico obtenida con jeringa Plasma rico en plaquetas (PRP) obtenido de la muestra citratada Plasma pobre en plaquetas (PPP) obtenido de la muestra citratada

4.3.2 Material por equipo 1 Gradilla 15 Tubos de ensaye (12x75) 6 Tubos de ensaye (13x100) 2 Pipetas Pasteur 2 Pipetas de vidrio de 1 ml (1/10) 1 Pipeta salhi con manguera y boquilla 1 Cámara de Neubauer

1 Caja Petri c/algodón (cámara húmeda) 1 Frasco con 10 ml de SSF (0,9%) 1 Propipeta 1 Tapón de hule para tubo 13x100 1 Contador 1 Cronómetro 1 Microscopio 1 Marcador indeleble

4.3.3 Material por grupo Termómetros Gradillas Tubos de ensaye 15x150 Pipeta graduada de 1 ml (1/100) Pipetas graduadas de 1 ml (1/10) Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas graduadas de 10 ml Propipetas Centrífuga (16 tubos)

Balanza Frascos con agua y una jeringa Torundas Tubos capilares Lancetas Cuadros de parafilm para tubo 12x75 Cuadros de papel seda (5x5cm) Cuadros de papel filtro (2x5cm) Jeringas de 10ml c/aguja (21x32mm) Contenedor para punzocortantes Contenedor para desechos

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4.3.4 Reactivos Solución de EDTA al 5% Citrato trisódico al 3,8 % Cloruro cálcico (0,025M) Oxalato de amonio al 1%

Etanol al 70% Determinaciones de TTPA Determinaciones de TP

4.4 MÉTODOS Recomendaciones -Identificar perfectamente el material y los reactivos a utilizar. -Rotular en forma clara cada uno de los tubos de ensaye y revisar la jeringa a emplear. -Dosificar en un tubo 13x100 la cantidad necesaria de citrato trisódico al 3,8 % para 6ml de sangre.

-Dosificar en un tubo 12x75 la cantidad necesaria de EDTA al 5% para 1ml de sangre. 4.4.1 Extracción de sangre y procedimiento de separación de muestras -Colocar el torniquete poco apretado y mantenerlo el menor tiempo. Al momento de la punción deberá causar el mínimo daño a los tejidos para evitar que la sangre se contamine con tromboplastina tisular.

-Obtener 10 ml de sangre. -Utilizar los primeros 3 ml para la prueba de Tiempo de coagulación (Ver procedimiento) -Vaciar 1ml en el tubo con EDTA tapar y mezclar por inversión. Utilizar esta muestra para el conteo plaquetario. -Vaciar los 6ml restantes en el tubo con citrato trisódico, taparlo y mezclar bien por inversión. Centrifugar a 1.500 rpm/10 min y separar con una pipeta Pasteur 1ml del plasma rico en plaquetas (PRP), vaciarlo en tubo 13x100. El PRP se utiliza para el tiempo de coagulación del plasma. - El resto de la muestra sanguínea se centrifuga a 3.000 rpm/15 min y separar en tubo 13x100 todo el plasma pobre en plaquetas (PPP). Esta muestra se utiliza para tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada.

4.4.2 Conteo plaquetario Fundamento. Se emplea sangre anticoagulada (con EDTA) la cual se diluye en Oxalato de amonio al 1% que lisa el resto de las células sanguíneas para permitir el recuento de plaquetas en el hemocitómetro.

Significado clínico:

(Valor de referencia: 150.000-450.000 plaquetas/mm3)

a) Trombocitopenia, trombopenia o plaquetopenia:

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*Disminución en la concentración de las plaquetas, por debajo de 130.000/mm 3, causas: i) Disminución de la trombopoyesis: pancitopenia, anemia mielocítica ii) Trombopoyesis ineficaz: Trombopenias hereditaria,

Hemoglobinuria paroxistica

nocturna, Déficit de ácido fólico o de vitamina B 12 iii) Aumento de la destrucción de las plaquetas: Púrpura trombcitopénica idiopática, Púrpura

trombótica

trombocitopénica,

Hiperesplenismo,

Sepsis

bacteriana,

Coagulación intravascular diseminada. b) Trombocitosis: *Aumento en la concentración de plaquetas, por encima de 450.000/mm3, causas: i) Primarias: Trombocitemia esencial u otros síndromes mieloproliferativos. ii) Secundarios: esplenectomía, infecciones que cursan con una formación de depósitos purulentos, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, neoplasias malignas.

Procedimiento: -En un tubo (12x75) que contiene 1,98 ml de oxalato de amonio al 1 % frío, agregar 0,02 ml de sangre con pipeta de Sahli. -Tapar el tubo con papel parafilm y mezclar. -Refrigerar 15 min. -Llenar cámara de Neubauer y colocarla dentro de la cámara húmeda durante 5 min. -Limpiar la base de la cámara. -Observar al microscopio (10x), buscar la cuadrícula central. -Cambiar el objetivo a (40x) con baja intensidad de luz contar las plaquetas observadas. NOTA: Las plaquetas se observan en forma ligeramente alargada o circular y presentan

refringencia.

CALCULO = # de plaquetas contadas x FACTOR = # de plaquetas/ mm3

4.4.3 Tiempo de coagulación Fundamento. Es el tiempo que tarda en formarse el coágulo en una muestra de sangre sin anticoagulante, al ponerse en contacto con una superficie de vidrio. Esta prueba permite la detección de trastornos en la vía intrínseca o la vía común de la coagulación.

Significado clínico. Valor de referencia 5 -10 min. Se encuentran tiempos alargados en déficit de factores de la vía intrínseca por ejemplo hemofilia, en casos de afibrinogenemia, en fibrinolisis excesiva y en terapias con

38

heparina. Debido a esto último la prueba se utiliza en el control de tratamientos heparínicos.

Procedimiento -Rotular previamente 3 tubos de ensaye 13x100: del 1 al 3 -Vaciar en cada tubo 1ml de la sangre extraída, comenzando por el tubo 1, momento en el que se activa el cronómetro; cuidar que los tubos tengan el mismo volumen para que la prueba sea válida. -Incubarlos a 37° C en posición vertical. -A los 4 min. sacar el tubo 1 y revisarlo inclinando suavemente, regresarlo a incubar, seguir revisando cada 30seg y conforme transcurre el tiempo disminuirlo a 15seg manteniéndolo el menor tiempo fuera de incubación hasta detectar la coagulación. -Ahora se revisará el tubo 2 de la misma forma y una vez coagulado éste revisar el tubo 3. -Finalmente se reporta el tiempo del tubo 3 que es el menos manipulado.

4.4.4 Tiempo de coagulación de plasma (Test de Howell): Fundamento. Mide el tiempo que tarda en coagularse un plasma rico en plaquetas (PRP) cuando se vuelve a recalcificar.

Significado clínico. Valor de referencia: 90-130segundos. La utilidad e interpretación de la prueba son similares a las del tiempo de coagulación, su única ventaja, es que no se precisa realizarlo inmediatamente después de la extracción de la muestra.

Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,2 ml de PRP incubar a 37 ° C por 3 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Adicionar 0,2 ml de CaCl 2 (0,025M) a 37° C, -Mezclar, cronometrar e incubar, revisar aproximadamente a los 40 seg. Continuar

***

-Fuera del baño inclinar el tubo suavemente y cerca de una fuente de luz.

***

***

-Observar la aparición de los primeros filamentos de fibrina en las paredes del

tubo, esto indica el punto final de la prueba. ***

-Detener el cronómetro y registrar el tiempo.

Reportar el promedio de los 3

resultados.

39

4.4.5 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA). Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP en presencia de un sustituto del f3p que consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenidos a partir de cerebro de conejo y se conoce como cefalina, pero además contiene una sustancia activadora de los factores de contacto que puede ser: caolín, polvo de vidrio, celite o ácido elágico. Esta prueba sirve para explorar la vía intrínseca y la vía común.

Significado clínico. Valores de referencia: 30-42 seg. Tiempos prolongados se presentan ante déficit de factores de la vía intrínseca y para el control de tratamientos con anticoagulantes, en concreto, de las terapias con heparina.

Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,1 ml de PPP e incubar a 37 ° C por 2 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Agregar 0,1ml de reactivo de TTPa, mezclar e incubar 2 min. a 37° C. - Agregar 0,1 ml de CaCl 2 (0,025M) a 37° C, mezclar, cronometrar, incubar y leer aprox. a los 25 seg.

Continuar

***

4.4.6 Tiempo de protrombina (TP) o Tiempo de Quick. Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística obtenida a partir de extracto de cerebro o pulmón de conejo o humano. Esta prueba sirve para explorar a la vía extrínseca y la vía común.

Significado clínico. Valores de referencia: 11-15 seg. Tiempo de protrombina está alargado en pacientes con déficit de factores de la vía extrínseca, en pacientes sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que sufren algunos trastornos hepáticos.

Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,1 ml de PPP e incubar a 37° C por 2 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Agregar 0,2 ml de reactivo de TP mezclar, cronometrar, incubar y leer aprox. a los 8 seg.

Continuar

***

4.4.7 Tiempo de sangrado con la técnica de Duke Fundamento. Es el tiempo que transcurre desde la lesión a un grupo de capilares hasta la formación del trombo blanco plaquetario. Se determina efectuando una

40

pequeña herida estandarizada (3 mm de profundidad) y midiendo el tiempo que tarda en cesar el sangrado.

Significado clínico. Valor de referencia: 1 - 3 min. El tiempo de sangrado está alargado en las púrpuras vasculares , en las trombocitopenias, en las trombopatías congénitas, en la enfermedad de von Willebrand y en los sujetos que han tomado acetilsalicílico.

Procedimiento. - El lóbulo de la oreja debe estar caliente ya sea frotándolo o aplicando compresa de agua caliente. -Limpiar con una torunda con alcohol (70 %). Dejar secar. -Hacer una incisión o herida de aprox. 3 mm de profundidad con una lanceta estéril. -Al aparecer la primera gota de sangre cronometrar, dejarla que caiga sobre el papel filtro o absorberla con éste, “sin tocar la piel” cada 15 ó 30 segundos. -La muestra deja de tomarse cuando cesa la hemorragia. -Detener el cronómetro. Registrar el tiempo.

4.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Las agujas y lancetas se depositarán en contenedor para punzocortantes. Las jeringas con tapón, guantes, torundas y papel filtro con sangre desechar en contenedor para residuos biológicos. Los tubos con muestras biológicas se desechan en contenedores con hipoclorito de sodio al 6 %, que el laboratorista designará para tal fin.

41


42


4.7.2 Tabla de Resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinación

Resultado

Valores de referencia

Interpretación

Tiempo de sangrado Tiempo de coagulación TCP TP TTPa Conteo plaquetario

4.8 DISCUSIÓN

43

4.9 CONCLUSIONES


44

PRÁCTICA No. 5. QUÍMICA SANGUÍNEA I Y GLUCOSA POSPRANDIAL Beatriz González M.

5.1 MARCO TEÓRICO La química sanguínea está compuesta por una serie de pruebas de rutina que ayudan a evaluar el estado general del paciente y permite saber si se requiere alguna determinación más especializada. Para realizar estas pruebas es necesario realizar un ayuno de 8 a 10 horas, con la finalidad de que no afecta a la muestra la presencia de quilomicrones formados después de la comida y que los analitos no se alteren por un ayuno prolongado. Asimismo, las muestras ictéricas y hemolíticas pueden alterar la determinación. En un principio comprendía las determinaciones de glucosa en ayuno, urea, creatinina y ácido úrico. Actualmente, la química sanguínea se realiza en los laboratorios como un perfil de hasta 30 analitos, que pueden incluir lípidos, proteínas, enzimas y electrolitos. La glucosa en ayuno es la prueba principal para el diagnóstico y seguimiento de la diabetes mellitus, aunque debe realizarse en dos ocasiones con 2 semanas de diferencia. De esta manera se ha propuesto la realización de la curva de tolerancia oral a la glucosa, que además permite distinguir entre diabetes e intolerancia a la glucosa; sin embargo, esta prueba requiere un mínimo de 4 tomas de muestra (en ayuno y 1 cada media hora u hora). Existe la alternativa de la glucosa posprandial, que requiere 2 tomas de muestra (en ayuno y dos horas después de la ingesta de alimentos ricos en carbohidratos), teniendo el inconveniente de que el desayuno que toma el paciente no está estandarizado por los laboratorios. Para esta prueba es necesario que el paciente lleve tres días antes una dieta de entre 150 g y 250 g de carbohidratos, por ejemplo, 2 rebanadas de pan tostado con mermelada en el desayuno, comida y cena. La urea es un producto de desecho formado a partir del metabolismo de las proteínas y junto con la creatinina, producto de la degradación de la creatina a partir del metabolismo muscular, permiten la evaluación del f uncionamiento renal. A su vez, el ácido úrico es un producto de desecho del metabolismo de las purinas (adenina y guanina) que se utiliza en el diagnóstico del síndrome gotoso, que consiste en la precipitación de cristales de ácido úrico en las articulaciones, provocando inflamación y dolor.

45

5.1.1 Información complementaria - Explique la utilidad de la ley de Lambert-Beer en la realización de la práctica. - Indique las longitudes de onda que conforman el rango UV-Visible en el espectro electromagnético. - Defina cada uno de los siguientes conceptos: Solución patrón, Solución blanco, Solución control - ¿Qué factores además del ayuno pueden afectar a las determinaciones?

5.2 OBJETIVOS

-

El alumno conocerá la importancia del rango UV-Visible del espectro electromagnético en las determinaciones de Química Clínica.

-

El alumno conocerá el fundamento y la técnica de las determinaciones, a través de la realización de las mismas, para que con base a sus resultados valore el estado clínico del paciente.

5.3 MATERIALES 5.3.1 Muestra biológica Suero obtenido en tubo al vacío de tapón rojo. Plasma obtenido con tubo al vacío de tapón lavanda. Nota: El desayuno que el paciente tomará inmediatamente después de la primera toma de muestra es el siguiente: 250mL de jugo de naranja natural, un plato con cereal azucarado en leche y un plátano, una rebanada de pan tostado con mermelada.

5.3.2 Material por equipo 1 gradilla 1 tapón para tubo de ensaye 13x100 15 tubos 12x75 3 tubo de ensaye 13x100 2 pipetas pasteur con bulbo

1 adaptador para tubos al vacío 1 propipeta 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100) 5 puntas amarillas para micropipeta 1 cronómetro

5.3.3 Material por grupo Tubo al vacío de tapón rojo o dorado Tubo al vacío de tapón lila Aguja verde para tubo al vacío Algodón para torundas Aplicador de madera Papel parafilm Gasas Espectrofotómetro UV-Visible Celdas para espectrofotómetro Vaso de precipitado de 250 ml Agitador vórtex

Recipiente para desecho RPBI Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas graduadas de 1 ml Pisetas con agua destilada Centrífuga Balanza Micropipeta de 5 a 40 ul Micropipeta de 5 a 50 ul Baño de agua Contenedor para punzocortantes Termómetro

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5.3.4 Reactivos Alcohol para las torundas Agua destilada Hipoclorito de sodio

Kit para determinación de: - glucosa - creatinina - urea - ácido úrico

5.4 MÉTODOS 5.4.1 Glucosa: método enzimático colorimétrico Fundamento GOD

D-glucosa + O2 + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol

POD

Ácido glucónico + H 2O2

4-(p-benzoquinona-iminofenazona) + 2H 2O quinonimina roja ( λ = 505 nm)

GOD: glucosa oxidasa; POD Peroxidasa

Significado clínico. El valor de referencia de la glucosa en ayuno es de 60 – 100 mg/dl. La determinación de glucosa apoya al diagnóstico y seguimiento de la diabetes mellitus; puede existir hiperglucemia en alteraciones hipofisiarias (acromegalia, Síndrome de Cushing), tiroideas, traumatismos. La hipoglucemia se presenta en ayunos prolongados, por efecto del tratamiento erróneo de diabetes, posterior a la ingesta prolongada de etanol, cuando hay insulinoma o enfermedades crónicas hepáticas. El valor de referencia de la glucosa posprandial es hasta 140 mg/dl. La realización de glucosa posprandial apoya al diagnóstico de estados prediabéticos y de diabetes mellitus.

Procedimiento La técnica de las determinaciones que se realizarán en la presente y siguiente prácticas son diferentes de acuerdo al fabricante de los reactivos utilizados. Generalmente siguen el siguiente esquema: Blanco Patrón Muestra RT (ml) Patrón (µ l) Muestra (µ l) que indica el uso de soluciones blanco, patrón y muestra, que son tratados bajo las misma condiciones de incubación y lectura de longitud de onda. Para la descripción de

47

las técnicas es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos a utilizar, verificando su vigencia.

5.4.2 Creatinina: método de Jaffé Fundamento Medio alcalino

Creatinina + ácido pícrico

Picrato de creatinina

Significado clínico. El valor de referencia para mujeres es de 0,6 a 1,1 mg/dl y para hombres es de 0,7 a 1,4 mg/dl. La creatinina es el mejor indicador de la función renal. Aumenta en sangre cuando hay alteraciones glomerulares, necrosis o atrofia del músculo esquelético, hipertiroidismo y durante el puerperio.

5.4.3 Urea Fundamento: método colorimétrico

Ureasa

CO2 + 2NH4+

Urea + H2O NH4+ + salicilatos + hipoclorito

indofenol (570 nm)

Fundamento: método de la ureasa-UV

Ureasa

CO2 + 2NH4+

Urea + H2O

GLDH

NH4+ + α -cetoglutarato + NADH (340 nm) + H +

NAD+ + glutamato

GLDH: glutamato deshidrogenasa

Significado clínico. El valor de referencia es de 10 a 45 mg/dl. La hiperuremia (azoemia) puede clasificarse en: -prerrenal: deshidratación; shock; disminución del volumen sanguíneo, fallo cardiaco, catabolismo incrementado de las proteínas (fiebre, estrés y quemaduras) -renal: enfermedad renal crónica, deshidratación, catabolismo incrementado de las proteínas -postrenal: obstrucción del tracto urinario La hipouremia se manifiesta en alteraciones hepáticas, mala nutrición, ingesta alta de líquidos y en el embarazo.

5.4.4 Ácido úrico Fundamento Uricasa

Ácido úrico + O 2 + H2O

Alantoína + H2O2 + CO2 POD

H2O2 + 4-aminoantipirina + DCBS

quinonimina roja ( λ = 505 nm) + H2O

DCBS: dicloro bencensulfónico

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Significado Significado clínico. El valor de referencia es de 2,5 a 7,5 mg/dl. La hiperuricemia primaria se observan cuando hay defectos enzimáticos hereditarios; la hiperuricemia secundaria se presenta en insuficiencia renal; en gota, litiasis renal, insuficiencia renal, síndrome de Lesh Nyhan y preeclamsia. La hipouricemia se manifiesta cuando hay dieta baja en purinas, purinas, tratamien tratamiento to excesivo excesivo con alopurin alopurinol, ol, síndrome síndrome de Fanconi Fanconi (defectos de la resorción tubular), enfermedad hepática.

5.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS - Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes. - Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basura municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. - Los guantes de látex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura municipal. - Los tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin.

49


50


5.7.2 Tabla de Resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinación Resultado Valor de de re referencia Observaciones Glucosa en ayuno Glucosa posprandial Creatinina Urea Ácido úrico

51

5.8 DISCUSIÓN

5.9 CONCLUSIONES

5.10 REFERENCIAS

52

PRÁCTICA No. 6. QUÍMICA SANGUÍNEA II René Damián S.

6.1 MARCO TEÓRICO Como se explicó en la Química Sanguínea I, los perfiles de esta pueden abarcar hasta 30 determinaciones, de las que se realizaron Glucosa, Urea, Creatinina y Ácido Úrico. En la presente práctica se determinarán analitos que están relacionados con el hígado, que se encuentra en el cuadrante superior derecho del organismo, está dividido en dos lóbulos desiguales unidos por el ligamento falciforme y tiene una irrigación de 1500 ml de sangre por minuto. Se estima que lleva a cabo más de 500 actividades diferentes entre las que se encuentran: a) Metabolismo de carbohidratos, lípidos, aminoácidos y proteínas, bilirrubina,

hormonas, vitaminas b) Almacenamiento de glucógeno, lípidos, aminoácidos y proteínas, hierro, cobre,

vitaminas c) Síntesis de proteínas, tales como albúmina, proteínas de f ase aguda, entre otras d) Biotransformación de toxinas, alcohol, fármacos, bilirrubina, esteroides, otras

hormonas e) Hematológica debido a la producción de factores de coagulación y de eritrocitos en

el feto f) Excreción de ácidos biliares, colesterol y bilirrubina a través de la bilis, g) Inmunológica: Fagocitosis (células de Kupffer), secreción de IgA, producción de

factores del complemento, además de formar parte del sistema fagocítico mononuclear. Debido a la diversidad de funciones de este órgano, no hay un analito único que permita evaluar su funcionamiento general. Los analitos que se determinarán durante la práctica pueden alterarse debido a patologías no relacionadas con el hígado, por lo tanto el diagnóstico debe realizarse considerando todos los datos clínicos y de laboratorio. De esta manera observamos que: a) proteínas totales, albúmina, relación A/G, colesterol, triglicéridos y lípidos totales evalúan la capacidad de síntesis y metabolismo hepático; los tres primeros además apoyan a demostrar el estado nutricional del paciente o la posibilidad de que se presente síndrome nefrótico, mientras que los últimos determinan el riesgo aterogénico e hipertensión;

53

b) bilirrubinas directa, indirecta y total son pruebas que valoran la biotransformación y excreción hepática, conjuntamente indican el origen de la ictericia.

6.1.1 Información complementaria - Investigue el metabolismo completo (formación a eliminación) de las bilirrubinas. -¿Cuál es la estabilidad y condiciones de almacenamiento de cada uno de los analitos que se evaluarán? -¿Cuál es el tiempo máximo de ayuno para realizar las determinaciones? ¿Por qué?

6.2 OBJETIVOS

-

El alumno conocerá el fundamento y la técnica de las determinaciones, a través de la realización de las mismas, para que obtenga resultados confiables.

-

El alumno conocerá la importancia clínica de las determinaciones y con base a sus resultados valore el estado clínico del paciente.

6.3 MATERIALES 6.3.1 Muestra biológica Suero obtenido en tubo de tapón rojo o dorado

6.3.2 Material por equipo 1 gradilla 5 tapones para tubo de ensaye 13x100 18 tubos 12x75 5 tubos de ensaye 13x100 1 pipetas pasteur con bulbo 1 adaptador para tubos al vacío

1 propipeta 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100) 5 puntas amarillas para micropipeta 5 puntas azules para micropipeta 1 cronómetro

6.3.3 Material por grupo Tubo al vacío de tapón rojo o dorado Aguja verde para tubo al vacío Algodón para torundas Aplicador de madera Gasas Espectrofotómetro UV-Visible Vaso de precipitado de 250 ml Agitador vórtex Mechero Bunsen Tripie Tela de asbesto Pinzas para tubo de ensaye

Micropipeta de 5 a 40 ul Micropipeta de 5 a 50 ul Baño de agua Termómetro Papel parafilm Centrífuga Recipiente para desechos (RPBI) Contenedor para punzocortantes Pisetas con agua destilada Pipetas graduadas de 1 ml Pipetas graduadas de 2 ml Pipetas graduadas de 5 ml

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6.3.4 Reactivos Kit para determinación de - proteínas totales - albúmina - colesterol - triglicéridos - lípidos totales - bilirrubinas

Alcohol para las torundas Agua destilada Hipoclorito de sodio

6.4 MÉTODOS NOTA: Para conocer el procedimiento para todas las técnicas utilizadas en esta práctica es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos disponibles en el laboratorio. 6.4.1 Proteínas totales: método del Biuret Fundamento Proteínas + Cu2+

Medio alcalino

Complejo azul violeta ( λ = 560 nm)

Significado clínico. El valor de referencia es 6,1 – 7,9 g/dl. La hiperproteinemia puede presentarse durante la deshidratación o diarrea grave. La hipoproteinemia se observa en inanición o mala absorción (desnutrición), hepatopatías, síndrome nefrótico, hemorragias.

6.4.2 Albúmina: método de verde bromocresol Fundamento

Medio alcalino

Albúmina + Verde de bromocresol (VBC)

Complejo albúmina-VBC (λ = 600 nm)

Significado clínico. El valor de referencia es 3,5 – 4,8 g/dl. La albúmina es el principal indicador nutricio-proteico. La hiperalbuminemia se manifiesta durante la deshidratación. La hipoalbuminemia se presenta en alteraciones hepáticas, donde puede apoyar a determinar la gravedad y pronóstico de enfermos crónicos; también se observa en alteraciones renales y gastrointestinales. Con estas determinaciones es posible determinar la cantidad de globulinas, considerando que la suma de estas con la albúmina es igual a las proteínas totales. La relación A/G se define como el cociente de la albúmina entre las globulinas (proteínas totales menos la albúmina).

6.4.3 Colesterol: método enzimático colorimétrico Fundamento

CEH

Ésteres de colesterol + H 2O

Colesterol + ácido graso COx

Colesterol + O 2

Colest-4-en-3-ona + H2O2

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POD

H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol

quinonimina roja ( λ = 505 nm) + 2H2O

CEH: Colesterol éster hidrolasa; COx: Colesterol oxidasa; POD: Peroxidasa

Significado clínico. El valor de referencia es 60 – 200 mg/dl. La determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. La hipercolesterolemia se ha relacionado con la formación de placas ateroscleróticas, con pacientes hipertensos y obesos, en los cuales se incrementa el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. La hipocolesterolemia puede relacionarse con alteraciones en la síntesis de hormonas esteroideas.

6.4.4 Triglicéridos: método enzimático colorimétrico Fundamento

Lipoprotein lipasa

Triglicéridos

glicerol + ácidos grasos GK

Glicerol + ATP

glicerol-1-P + ADP

GPO

Glicerol-1-P + O2

H2O2 + Dihidroxiacetona fosfato POD

2 H2O2 + 4-aminofenazona + clorofenol

quinonimina roja ( λ = 505 nm)

GK: Glicerolcinasa; GPO: glicerol fosfato oxidasa; POD: Peroxidasa

Significado clínico. El valor de referencia es 50 – 150 mg/dl. La hipertrigliceridemia es un factor riesgo en enfermedades ateroscleróticas. Su medición es importante en el diagnóstico y manejo de hiperlipidemias, que pueden ser de origen genético o estar relacionadas con nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endocrinas.

6.4.5 Lípidos totales: método de ácido fosfórico vainillina Fundamento Lípidos + H2SO4

∆

Cetonas + ácido fosfórico-vainillina

Cetonas complejo rosa ( λ = 505 nm)

Significado clínico. El valor de referencia es 450 – 850 mg/dl. El interés en su estudio se debe a su conexión entre hiperlipemia y aterosclerosis, diabetes y enfermedad cardiaca.

6.4.6 Bilirrubinas: método de Van den Bergh Fundamento Bilirrubina directa + ácido sulfanílico diazotado Bilirrubina total + desarrollador + ácido sulfanílico diazotado

azobilirrubina azobilirrubina (λ = 530 nm)

56

Significado clínico. Los valores de referencia son: Bilirrubina directa hasta 0,2 mg/dl, Bilirrubina indirecta hasta 0,8 mg/dl, Bilirrubina total hasta 1,0 mg/dl. La determinación de bilirrubinas apoya a la evaluación y clasificación de la ictericia (hiperbilirrubinemia):

Ictericia

Defecto fisiológico

Ejemplos de etiología

Prehepática

Producción excesiva de bilirrubina

Ictericia hemolítica

no conjugada Hepática no Transporte defectuoso de la bilirrubina

Síndrome de Gilbert

conjugada

Deficiencia de la glururoniltransferasa

Síndrome de Crigler-Najjar

Hepática

Hepatocelular: lesión del parénquima

Hepatitis vírica o tóxica;

conjugada:

cirrosis Hepatocanalicular:

Posthepática

parecida

a

obstructiva Obstrucción mecánica del árbol biliar

biliar primaria; la Cirrosis hepatitis Carcinoma del páncreas o

conjugada:

del colédoco; coledocolitiasis

6.5 DISPOSICIÓN DE RESIDUOS - Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes. - Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basura municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. - Los guantes de látex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura municipal. - Los tubos con coágulos de sangre y muestras biológicas deben depositarse en el recipiente con cloro que dispondrá el laboratorista para tal fin.

57


58


6.7.2 Tabla de resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinación Proteínas totales Albúmina Relación A/G Colesterol Triglicéridos Lípidos totales Bilirrubina directa Bilirrubina

Resultado Valor de referencia Observaciones

indirecta Bilirrubina total

59

6.8 DISCUSIÓN

6.9 CONCLUSIONES


60

PRACTICA No. 7 URIANÁLISIS Leticia Arellano M.

7.1 MARCO TEÓRICO La orina es un filtrado del plasma sanguíneo que prácticamente no contiene proteínas. La formación de orina comprende los complejos procesos de filtración de la sangre, reabsorción de sustancias esenciales incluyendo el agua y secreción tubular de ciertas sustancias. Después de la formación en el riñón, la orina pasa por el uréter hacia la vejiga en donde es almacenada temporalmente antes de ser excretada a través de la uretra. En promedio un adulto joven elimina entre 800 a 1.500 mL en 24 horas. Algunos padecimientos renales o extra-renales modifican las características físicas y químicas de la orina, lo que constituye un indicador importante del estado de salud. El análisis de rutina de la orina conocido también como urianálisis o examen general de orina, incluye una serie de pruebas de detección que permiten descubrir algunos de los padecimientos arriba mencionados. La calidad del urianálisis comienza con una adecuada recolección de la muestra de orina, la cual debe realizarse (previa asepsia de genitales) en un recipiente limpio y seco de preferencia desechable. Para realizar el urianálisis se pueden utilizar muestras emitidas a cualquier hora del día, sin embargo la muestra más recomendada es la primera orina de la mañana, porque es más concentrada y es más probable que revele anormalidades. Como la orina contiene sustancias orgánicas e inorgánicas que favorecen la reproducción bacteriana, se recomienda realizar el urianálisis en orina fresca, de ser posible dentro de los 30 minutos después de colectada.

7.1.1 Información complementaria -

¿Qué indicaciones se le deben de dar a un al paciente que se le realizará un urianálisis?

-

¿Cuál es la composición de la orina?

-

¿Qué son y en donde se forman los cilindros?

61

-

¿Qué significa: anuria, poliuria, oliguria, hematuria y cetonuria?

7.2. OBJETIVO El alumno interpretará los resultados emitidos de un urianálisis, relacionando la importancia de la adecuada recolección de la muestra de orina, el conocimiento del fundamento de las determinaciones realizadas y la identificación al microscopio de las estructuras presentes en la orina centrifugada, a f in de descartar alguna enfermedad.

7.3 MATERIALES 7.3.1 Muestra biológica 50 mL de orina recién emitida 7.3.2 Material por equipo de trabajo 3 Tubos de ensaye 13x100 mm 1 Gradilla para tubos de ensaye 1 Pipeta Pasteur

1 Bomba de succión para pipeta Pasteur 1 Microscopio óptico compuesto

7.3.3 Material por grupo Centrífuga con capacidad para tubos de ensaye Portaobjetos 13x100 mm y 2000-3000 rpm. Cubreobjetos Balanza granataria Papel seda para limpiar lentes Piseta con agua destilada del microscopio 7.3.4 Reactivos Tira reactiva para análisis de orina. 7.4 METODOS

-

Homogenizar y permitir que la muestra de orina a este a temperatura ambiente antes de realizar el estudio.

-

Rotular dos tubos 13x100 mm (tubo 1 y tubo 2). Trasvasar aproximadamente 6 mL de orina a cada tubo.

7.4.1. Análisis físico de la orina

Fundamento La determinación se basa en la observación macroscópica de la muestra de orina a fin de detectar alguna alteración en su aspecto o color.

Significado Clínico En la mayoría de los casos es escasa la información que aporta está determinación, debido a que la orina normal habitualmente es clara y presenta una amplia gama de colores, debida a la presencia de pigmentos urocrómicos (urobilina y uroeritrina). Sin embargo existen muchos factores patológicos y no patológicos que pueden alterar el color y aspecto normal de la orina.

62

La orina es muy pálida o incolora entre otras cosas debido a un elevado consumo de líquidos o a estados patológicos como la diabetes mellitus. La causa más común del color rojo de la orina es la presencia de eritrocitos (hematuria), aunque también puede deberse a la presencia de hemoglobina libre o mioglobina. La orina de color castaño a negro puede deberse a la excreción de ácido homogenístico, característico de la alcaptonuria. Los pacientes que tienen ictericia obstructiva excretan pigmentos biliares como la bilirrubina, y la orina es de color castaño-amarillento a verde-amarillento. En cuanto a la turbidez de la orina, puede ser debida a la presencia de cristales, leucocitos, células epiteliales, bacterias, moco o grasa.

Procedimiento

-

Se puede emplear cualquiera de los dos tubos. Observar el aspecto (presencia o no de turbidez) y color de la orina. Anotar resultados.

7.4.2 Análisis químico de la orina El análisis químico de la orina empleando tiras reactivas es un método sensible y rápido que ayuda a identificar alteraciones en la composición de la orina. La tira reactiva es una banda de plástico con pequeños cuadros de papel impregnados con los reactivos necesarios para identificar diferentes analitos en una misma tira.

Fundamento -

pH. Utiliza dos indicadores, rojo de metilo y azul de bromotimol que cubren la escala de pH que va del 5 al 9.

-

Glucosa. Se basa en la determinación enzimática con glucosa oxidasa, que sigue las mismas reacciones que el método enzimático colorimétrico para glucosa, empleado en la química sanguínea 1.

-

Proteínas. Se basa en el cambio de color (de amarillo a azul), del indicador azul de tetrabromofenol en presencia de proteínas.

-

Sangre oculta. Se basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina que cataliza la oxidación del indicador tetrametilbencidina por la acción de peróxido de hidrógeno.

-

Cetona. La tira reactiva contiene nitroprusiato de sodio que en medio alcalino forma un complejo color castaño con el ácido diacético.

-

Nitritos. El nitrito en presencia de una sulfanilamida genera un sal de diazonio que al reaccionar con una tetrahidrobenzoquinolina produce un colorante azoico de color rojo.

63

-

Gravedad específica. Se basa en el cambio de pKa de algunos polielectrólitos, con lo que se mide la concentración iónica de la orina, lo cual esta relacionado con el peso específico.

-

Bilirrubina. Se basa en la reacción de acoplamiento de la bilirrubina con una sal de diazonio.

-

Urobilinógeno. Se basa en la reacción que se lleva a cabo entre el urobilinógeno y el dimetilaminibenzaldehido, generando un complejo color amarillo castaño.

-

Leucocitos. La prueba detecta la presencia estearasa leucocitria, esta enzima hidroliza el éster del ácido indoxilocarbónico que a su vez, reacciona con el indicador bromosulfoftaleína produciendo un color morado.

Significado Clínico -

pH. El pH de la orina es ligeramente ácido alrededor de 6. No existiendo un intervalo normal, ya que puede cambiar de ácida a básica, por factores tales como la dieta.

-

Glucosa. La presencia de cantidades significativas de glucosa en la orina se llama glucosuria. La principal causa de glucosuria es un elevado nivel de glucosa en sangre, ya que por lo general la glucosa aparece en la orina cuando el nivel de glucosa en sangre supera los 160-180 mg/dL, cifra que se conoce como el umbral renal de la glucosa.

-

Proteínas. En condiciones normales existe una mínima cantidad de proteínas de bajo peso molecular en la orina (< 20 mg/dL). La presencia de una concentración elevada de proteínas en la orina puede constituir un índice de enfermedad renal.

-

Sangre oculta. Se denomina así porque es sangre que no se aprecia a simple vista (microhematuria) y el color de la muestra no resulta afectado. Puede presentarse hematuria en enfermedades renales o lesiones del tractor urinario inferior.

-

Cetona. Los cuerpos cetónicos se forman durante el catabolismo de los ácidos grasos. Cuando la capacidad de los tejidos para utilizar los cuerpos cetónicos es superada, el exceso se excreta en la orina. Lo anterior sucede en casos de ingesta baja de hidratos de carbono, enfermedades como la diabetes mellitus y en la eclampsia entre otros.

-

Nitritos. La determinación de nitritos por tira reactiva es un método rápido e indirecto para el diagnóstico de bacteriuria e identifica la presencia de bacterias que reducen el nitrato de la orina a nitrito (Ej. E. coli, Citrobacter, Klebsiella).

-

Gravedad específica. Constituye un índice del material disuelto en la orina. El intervalo normal varía de 1.003 – 1.035. Algunas de las causas que producen

64

aumento del peso específico son las siguientes: deshidratación, proteinuria, glucosuria y eclampsia. -

Bilirrubina. Normalmente en la orina no existen cantidades detectables de bilirrubina. La presencia de bilirrubina en orina se debe a la presencia de ictericia por aumento de bilirrubina conjugada.

-

Urobilinógeno. A diferencia de la bilirrubina, existen una pequeña cantidad de urobilinógeno en la orina (1 unidad Erlich / 100 mL de orina) y su elevación puede indicar daño hepático.

-

Leucocitos. En condiciones normales los leucocitos no son detectables por tira reactiva. La tira reactiva dará positiva, solo si existe una cantidad abundante de leucocitos, lo cual se puede deber a la presencia de procesos infecciosos o inflamatorios del tracto urinario.

Procedimiento

-

Emplear el tubo No. 1 y una tira reactiva para urianalisis.

-

Sumergir la parte reactiva de la tira en el tubo y retirar inmediatamente, teniendo cuidado de retirar el exceso de orina sobre papel absorbente.

-

Leer los resultados para cada parámetro en el tiempo indicado en la etiqueta del frasco y comparando los resultados con la escala de colores indicada en la etiqueta. El tiempo de lectura no debe exceder de dos minutos.

-

Debido a que se trata de una determinación semicuantitativa, los resultados se reportan como negativo (-)

o positivo (+) y en caso de ser positivo puede

reportarse con +, ++, +++ o ++++, en función de la intensidad del color generado.

-

Anotar resultados.

Nota: Las tira reactiva debe mantenerse en el envase original con el desecante y

extraerla hasta el momento de emplearla cuidando de no tocar las bandas reactivas con los dedos y tapar el frasco inmediatamente después de extraer la tira. 7.4.3

Análisis del sedimento de la orina

El examen del sedimento urinario es una herramienta diagnóstica valiosa para la detección y evaluación de trastornos renales y del tracto urinario. El valor de esta prueba depende de una muestra adecuada y del conocimiento de la persona que realiza el estudio.

Significado Clínico En condiciones normales la orina es transparente prácticamente no contiene partículas en suspensión. Sin embargo en algunos casos patológicos y no patológicos, se

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pueden encontrar estructuras tan diversas como células, cilindros, cristales y cuerpos extraños generados por algún medicamento. Células. Eritrocitos: Se pueden encontrar de 2-3 por campo y en gran número indican sangrado de vías urinarias. Leucocitos. Es normal encontrar de 1-2 por campo, pero se incrementan en casos como infección o inflamación de vías urinarias. Células Epiteliales. Provienen de las vías urinarias y pueden ser: -

Células epiteliales pavimentosas, son células grandes de núcleo pequeño y provienen de vías urinarias bajas o epitelio vaginal.

-

Células epiteliales piriformes,

más pequeñas que las pavimentosos, con un

apéndice en forma de cola y provienen de vías urinarias altas. Cilindros. Los cilindros son precipitados de proteína que pueden o no agrupar células o algún otro material y se forman en los túbulos contorneados, razón por la que adquieren su nombre y forma. En función de la composición del cilindro, se pueden encontrar cilindros hialinos, cilindros eritrocitarios, cilindros leucocitarios, cilindros granulosos, cilindros de células epiteliales y cilindros cilindros grasos. Cristales. Por lo general no se encuentran cristales en la orina recién emitid, pero aparecen dejándola reposar un tiempo. La presencia de abundantes cristales en la orina resulta importante en el caso de sospecha de cálculos renales o trastornos s. Entre los cristales más importantes se encuentran los de tirosina, leucina o sulfamida. Como la formación de cristales depende del pH de la orina, en general se clasifican como: cristales de orina ácida y cristales de orina básica. Cristales de orina ácida: Cristales de ácido úrico. Se presentan en casos como la gota, enfermedades febriles o nefritis. Cristales de oxalato de calcio. Pueden aparecer después de la ingesta de alimentos ricos en oxalatos y en diabetes mellitus o en alguna enfermedad renal crónica. Cristales de uratos de sodio. Carecen de significado clínico. Cristales de cistina. Aparece en pacientes que presentan cistinuria sistémica. Cristales de orina alcalina:

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Cristales de fosfato triple. Se llegan a encontrar en orinas normales, pero también pueden aparecer en algunos procesos patológicos como cistitis crónica o cálculos renales. Cristales de fosfato amorfo. Carecen de significado clónico. Cristales de fosfato de calcio. Pueden estar presentes en caso de cálculos renales.

Procedimiento -

Tapar el tubo No. 2 con papel parafilm y centrifugar a 2500 rpm durante 5

minutos. -

Después de centrifugar, decantar el sobrenadante, dejando aproximadamente

0.5 mL del mismo para resuspender el sedimento. -

Con ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota de sedimento resuspendido

y cubrirla con un cubreobjetos. -

Enfocar en el microscopio primero con el objetivo de 4x y después con el de

10x (seco débil) para enfocar la imagen.

-

Cambar al objetivo de 40x y revisar 15 campos.

-

Reportar tipo y número de estructuras encontradas por campo. En el caso de

que las estructuras sean muy abundantes. Se reportará escasos, moderados o abundantes. -

Anotar resultados.

Nota: Traer para el día se la práctica un atlas de sedimento urinario o laminillas de color para ayudar a identificar las estructuras encontradas.

7.5 DISPOSICION DE RESIDUOS -

La muestra de orina será desechada en el inodoro, teniendo cuidado de bajar la palanca después de desecharla.

-

La tira reactiva empleada en el análisis químico deberá tirarse en el contenedor con bolsa roja de riesgo biológico.

-

El contenedor para la recolección de la muestra de orina deberá sumergirse durante 15 minutos en un recipiente con una solución de hipoclorito de sodio y posteriormente desecharse en el bote de la basura.

-

Los guantes desechables así como el papel secante empleado para retirar el exceso de orina, deberán colocarse en el bote de la basura del laboratorio.

67

7.6

DIAGRAMA DE FLUJO

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7.7 RESULTADOS Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Análisis Físico Determinación Color Aspecto

Resultado

Valor de Referencia

Observaciones

Resultado

Valor de Referencia

Observaciones

Valor de Referencia

Observaciones

Análisis Químico Determinación Glucosa Proteínas Sangre Cetona Bilirrubina Gravedad específica pH Urobilinógeno Nitrito Leucocitos

Análisis de sedimento Resultado Eritrocitos Leucocitos Otras estructuras

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7.8 DISCUSIÓN

7.9 CONCLUSIONES


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Manual de ABC 1 QFB FES Cuautitlan

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