MANFAAT TES DENGUE STICK IgM DAN IgG PADA DEMAM BERDARAH DENGUE Aryati1,2, Yolanda Probohoesodo2 1
Tropical Disease Center, Universitas Airlangga 2 Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga
ABSTRAK Diagnosis laboratorik untuk infeksi virus dengue berperan penting dalam dalam pengelolaan kasus dan pemberantasan penyakit dengue. Sayangnya, diagnosis pasti dengan cara isolasi virus maupun deteksi RNA virus dengan cara Polymerase Chain Reaction meme memerl rluk ukan an tekn teknol olog ogii yang yang rumi rumitt dan dan lama lama wakt waktu u peng penger erja jaan anny nya. a. Pengembangan uji untuk deteksi IgM dan IgG anti-dengue sebagai penentu fase akut, baik primer maupun sekunder merupakan jawabannya. Dalam makalah ini kami bahas mengenai Dengue Stick, yang dikenal juga sebagai Dengue sebagai Dengue Blot atau Dot imunoasai. Dengan prinsip metode ELISA, baik ELISA tak langsung atau Captured ELISA, Captured ELISA, namun menggunakan fase padat kertas nitroselulose yang high capacity, capacity, uji ini cukup andal (sensitif (sensitifitas itas dan spesifisi spesifisitas tas cukup tinggi), tinggi), praktik praktik dan dapat dilakukan dilakukan pada serum tunggal untuk menentukan infeksi primer atau sekunder. PENDAHULUAN Terdapat empat serotipe virus dengue yaitu D1, D2, D3 dan D4, dimana infeksi dari salah salah satu satu seroti serotipe pe dengue dengue menimb menimbulka ulkan n imunit imunitas as seumur seumur hidup, hidup, namun namun tidak tidak ada imunitas silang protektif terhadap infeksi serotipe lain. Pada anak, infeksi virus dengue sering sering bersifat bersifat subklinis subklinis atau dapat menyebabkan menyebabkan penyakit penyakit demam yang self-limi self-limited, ted, namun namun apabil apabilaa suatu suatu saat saat penderi penderita ta terkena terkena infeks infeksii virus virus dengue dengue beriku berikutny tnyaa dengan dengan serotipe yang berbeda, penyakit ini akan lebih berat, menjadi demam berdarah dengue atau dengue syok sindrom. Pemeriksaan Pemeriksaan serologis serologis untuk mendeteksi antibodi terhadap terhadap infeksi infeksi virus dengue makin berkembang saat ini, hal tersebut disebabkan karena rumit dan lamanya waktu yang yang dipe diperl rluk ukan an untu untuk k isol isolas asii viru viruss yang yang meru merupa paka kan n diag diagno nosi siss past pasti, i, deng dengan an menggunakan kultur sel. Disamping isolasi virus dengan kultru sel, teknik Polymerase Chain Reaction untuk deteksi antigen dengue juga berkembang pesat, namun kedua uji ini membutuhkan peralatan ayng mahal dan kurang cocok untuk negara berkembang. Pem Pemeri eriksaa ksaan n ser serolog ologiis yang yang bany banyak ak digu diguna naka kan n adal adalan an beru berupa pa uji uji HI (hemagglutination inhibition test = test = uji hambatan hemaglutinasi) yang merupakan standar WHO, kemudian Dengue Blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue, Dengue, uji Captured ELISA untuk Dengue baik IgM Captured – Captured – ELISA maupun IgG Captured – – ELISA dan tes tes ICT ( Immuno-chromatography Immuno-chromatography Test ), ) , seda sedangk ngkan an uji uji fiks fiksas asii komp komple leme men n dan uji uji netralisasi sudah lama ditinggalkan karena rumit dan tidak praktis. Uji HI yang merupakan uji serologis yang dianjurkan menurut standar WHO, dapat mendeteksi antibodi anti dengue, baik IgM maupun IgG dalam serum, dimana infeksi virus dengue akut ditandai dengan terdapatnya peningkatan titer empat kali atau lebih antara antara sepasa sepasang ng sera sera yaitu yaitu serum serum akut dan serum serum konvale konvalesen sen.. AkhirAkhir-akhi akhirr ini IgM
maupun IgG anti-dengue telah dapat dideteksi dengan menggunakan pemeriksaan Dengue Blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue. Uji ini merupakan salah satu tes pilihan untuk diagnosis infeksi dengue akut, baik primer ataupun sekunder, dengan melihat terdeteksinya kadar IgM anti-dengue pada serum tunggal. Sedangkan dengan terdeteksinya IgG anti-dengue dapat dipakai untuk melihat apakah infeksi tersebut primer atau sekunder, tergantung dari standarisasi masing-masing reagen yang telah ditetapkan setara berapa kadar HI-nya. IMUNOPATOGENESIS Virus dengue merupakan virus RNA untai tunggal, genus Flavivirus, terdiri dari 4 serotipe yaitu D1, D2, D3 dan D4. Struktur antigen dari keempat serotipe ini sangat mirip satu dengan yang lain, namun antibodi terhadap masing-masing serotipe tidak dapat memberikan perlindungan silang. Struktur genome virus dengue adalah 5’-C-preM-(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3 NS4a-NS4b-NS5-3’. Virion matur terdiri dari protein struktural dan protein nonstruktural. Protein struktural terdiri dari nukleokapsid atau protein inti dan protein yang berhubungan dengan membran atau protein envelop, sedangkan protein non-struktural terdiri dari NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5. Di dalam tubuh manusia, virus berkembang biak dalam sistem retikuloendotelial, dengan target utama virus dengue adalah monosit atau makrofag walaupun sel-sel yang lain seperti sel Kupffer dari hepar juga dapat terkena. Viremia timbul pada saat menjelang tampak gejala klinik hingga 5-7 hari setelahnya. Virus bersirkulasi dalam darah perifer di dalam sel monosit, sel limfosit B dan sel limfosit T. Sebagi reaksi terhadap infeksi virus, tubuh akan membuat antibodi anti-dengue, baik berupa antibodi netralisasi, antibodi hambatan hemaglutinasi dan antibodi pengikat komplemen. Diduga bahwa kebocoran vaskuler pada DBD disebabkan oleh pelepasan sitokin (IL-1β dan TNF-α) serta PAI oleh monosit dan pelepasan IL-2, IL-1β serta TNF-α oleh limfosit T yang terinfeksi oleh infeksi virus tersebut. Infeksi primer ditandai dengan timbulnya antibodi IgM terhadap dengue sekitar tiga sampai lima hari setelah timbulnya demam, meningkat tajam dalam satu sampai tiga minggu serta dapat dideteksi sampai tiga bulan. Antibodi IgG terhadap dengue diproduksi sekitar dua minggu sesudah infeksi. Titer IgG ini meningkat amat cepat, alu menurun secara lambat dalam waktu yang lama dan biasanya bertahan seumur hidup. Pada infeksi sekunder terjadi reaksi anamnestik dari pembentukan antibodi, khususnya dari kelas IgG dimana pada hari kedua saja, IgG ini sudah dapat meningkat tajam. Pada berbagai penelitian di daerah dimana dengue primer dan sekunder terjadi keduanya, didapatkan suatu angka signifikan yang menyatakan bahwa pada pasien dengan infeksi sekunder dengue, antibodi IgM tidak terdeteksi dalam waktu lima hari sejak infeksi timbul, bahkan pada beberpa kasus tidak menunjukkan suatu respon hiongg hari ke 20. PEMERIKSAAN LABORATORIUM Dengue Blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue Uji serologis HI merupakan standard WHO untuk diagnosis infeksi virus dengue. Antibodi HI bertahan di dalam tubuh sampai bertahun-tahun, disamping itu dapat dibedakan antibodi terhadap serotipe tertentu, sehingga uji ini baik untuk studi seroepidemiologi. Sayangnya uji ini membutuhkan sepasang serum (paired sera), yang
diambil pada fase akut (hari ketiga – ketujuh) dan pada fase konvalese (hari kesepuluh – keempatbelas). Diagnosis ditegakkan bila terdapat kenaikan titer konvalesen (hari kesepuluh – keempatbelas). Diagnosis ditegakkan bila terdapat kenaikan titer konvalesen 4x lipat atau lebih titer serum akut. Uji serologis lain yang mengandalkan adanya antibodi IgM maupun IgG spesifik terhadap dengue serta cukup praktis karena tidak perlu paired sera antara lain Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue, uji Captured-ELISA dan tes ICT ( Immunochromatography Test ) . Uji serologis yang terdahulu seperti uji fiksasi komplemen dan uji netralisasi tidak lagi digunakan karena kurang sensitif, tidak praktis, mahal, perlu waktu lama serta teknik yang sukar. Uji Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue merupakan teknik yang baru dikembangkan dan merupakan uji serologis dengue yang banyak dipakai saat ini. Uji ini dipakai untuk mendeteksi adanya antibodi yang reaktif terhadap virus dengue serotipe 1, 2, 3 dan 4 dalam plasma atau serum penderita yang dicurigai menderita demam dengue/DBD. Prinsip dasar uji Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue adalah uji ELISA, baik uji ELISA tak langsung (indirect ELISA) atau menggunakan Captured ELISA. Yang membedakan uji Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue dibandingkan dengan ELISA yaitu pada fase padatnya, menggunakan kertas nitroselulose yang bersifat high capacity. Pada uji Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue dapat menggunakan metode ELISA tak langsung yaitu antigen virus dilekatkan langsung pada fase padat, dimana setelah diberikan blokade untuk menutup celah-celah diantara antigen pada kertas nitroselulose, langsung diberikan serum penderita. Bila didalam serum penderita terdapat antibodi anti-dengue dapat berupa IgG anti-dengue atau IgM anti-dengue, yang dikerjakan secara terpisah yaitu IgG indirect ELISA saja atau IgM indirect ELISA, maka antibodi tersebut akan berikatan dengan antigen yang terikat pada kertas nitroselulose. Setelah tahap inkubasi dan pencucian, ikatan antigen-antibodi ini dapat dilacak dengan menggunakan konjugat yaitu antibodi yang berlabel enzim AP (alkalinefosfatase), HRP (horseradish peroxidase) maupun colloidal gold yang akan memberikan dot berwarna biru keunguan setelah ditambah substrat berkromogen. Selain dengan metode ELISA tak langsung, uji ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode Captured ELISA, misalnya pada IgM Captured ELISA dimana antihuman IgM dilekatkan pada fase padat kertas nitroselulose. Antihuman IgM ini akan menangkap IgM didalam serum penderita. Tahap berikutnya diberikan antigen dengue, selanjutnya diberikan pelacak seperti yang terdapat pada metode ELISA tak langsung diatas dan akan memberikan hasil dot berwarna biru keunguan yang menunjukkan hasil positif. Uji Dengue blot / Dengue Stick / Dot imunoasai Dengue yang saat ini banyak digunakan di Indonesia adalah Dengue blot / Dengue Stick IgG, dengan metode ELISA tak langsung. Pada penelitian yang dilakukan oleh Pokja DBD LPUI, 1995, dengan membandingkan Dengue Stick IgG buatan dalam negeri (PT. Kalbe Farma) dan Dengue blot IgG, didapatkan hasil pada infeksi primer, dengan menggunakan serum akut saja kedua uji ini menunjukkan hasil negatif sebesar 82,8% dan 93,2%, yang seharusnya
kedua uji ini harus 100% negatif, karena infeksi primer serum akut belum mempunyai IgG. Baru pada serum konvalesen, didapatkan hasil 72,4% positif untuk Dengue blot IgG dan 68,9% positif untuk Dengue Stick IgG. Pada infeksi sekunder, dengan serum akut didapatkan hasil positif 66,6% untuk Dengue blot IgG dan 64,4% untuk Dengue stick IgG. Sedangkan pada serum konvalesen hasil positif didapatkan naik menjadi 100% untuk Dengue blot IgG dan 97,8% Dengue stick IgG. Disini tampak banwa Dengue blot IgG maupun Dengue stick IgG mempunyai sensitivitas yang sama, dimana dengan memeriksa serum konvalesen sensitivitas keduanya dapat ditingkatkan baik untuk infeksi primer maupun sekunder. Senada dengan pendapat Yatim, 1996, uji Dengue stick IgG sensitivitasnya tinggi untuk infeksi dengue sekunder dengan serum akut, sedangkan infeksi primer sensitivitasnya rendah pada serum akut. Waktu pengerjaan Dengue stick IgG adalah 2,5 jam, dengan biaya yang relatif tidak mahal karena memakai bahan lokal. Sedangkan untuk Dengue stick IgM memakai metode IgM Captured ELISA, dengan waktu pengerjaan 5,5 jam pada suhu 37 0C dan 23 jam pada suhu ruang, dengan biaya yang lebih mahal karena masih memakai reagen impor. Saat ini juga sudah dikembangkan uji dot imunoasai (Agus Sjahrurachman, 2000) untuk deteksi IgM anti-dengue, dengan metode IgM Capture ELISA dengan nama BDIA ( Biotinylated Dengue Immunoassay) menggunakan antigen biotinylated-dengue virus dan pelacak HRP-labelled Streptavidin dan substrat 5-chloronaphtol yang memberikan hasil dot berwarna ungu pada serum positif, dengan cut off value absorbans lebih besar atau sama dengan 0,11. Sensitivitas lebih tinggi untuk infeksi dengue sekunder, tetapi rendah pada infeksi primer, juga pada serum konvalesen lebih tinggi kadarnya dibandingkan serum akut. Yang mengejutkan adalah adalah juga ditemukan IgM anti-dengue dengan kadar rendah pada kelompok non-dengue, dimana kemungkinan penderita ini pernah terpapar virus dengue dan masih dalam fase konvalesen. Waktu pengerjaan 4,5 jam. Dot imunoasai ini belum dipasarkan secara luas. Pada penelitian Wu SL, 2000, diteliti sensitivitas IgM dipstick ELISA dengan metode ELISA indirek, menggunakan antigen Dengue2, dengan waktu pengerjaan 75 menit dibandingkan dengan Immunochromatographic card assay, dengan antigen tetravalent (campuran D1, D2, D3, D4) untuk deteksi IgM dan IgG anti-dengue. Hasil IgM dipstick ELISA bila positif juga berupa dot berwarna biru keunguan. Kedua tes memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang bagus yaitu > 90% untuk deteksi IgM antidengue. DAFTAR PUSTAKA 1. Agus Sjahrurachman (1994). Flavivirus dalam Mikrobiologi Kedokteran. Edisi revisi. Binarupa Aksara, Jakarta, 354-373. 2. Agus Sjahrurachman, Betty Ernawati, Fera Ibrahim et al (2000). Semiquantitative dot immunoassay for detection of IgM anti-dengue antibodies in human sera. Med. Journal of Indonesia 9(1), 9-12. 3. Agus Sjahrurachman, Betty Ernawati, Fera Ibrahim et al (2000). Comparison of two dot immunoassay for diagnosis of dengue infection. Med. Journal of Indonesia 9(4), 248-252.
4. Cardosa MJ et al (1991). Dot enzyme immunoassay : An alternative diagnostic aid for dengue fever and dengue haemorrhagic fever. Bulletin of the WHO 69, 741-745. 5. Devine P et al (1997). Dengue Fever Testing. Today’s Life Science, 26-30. 6. Kurane I, Ennis F (1992). Immunity and immunopathology in dengue virus infections. Seminar in Immunology 4, 121-127. 7. Lam SK, Devi, Pang T (1987). Detection of specific IgM in Dengue infection. Southeast Asian Journal Tropical Medicine Public Health 18 (4), 532-538. 8. Pokja DBD LPUI (1994). Laporan hasil uji coba dengue stick IgG. 9. Rothman AL et al (1997). Viral pathogenesis of dengue infection. In: Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever. Eds : DJ Gubler and G Kuno. CAB International, 245-271. 10. Tatalaksana Demam Dengue/DBD. Penyunting : Sri Rezeki et al. Edisi 1 tahun 1999. DepKes RI DirJen Pemberantasan Penyakit Menular & Penyehatan Lingkungan Pemukiman. 11. WHO (1997). Dengue Haemorrhagic Fever : Diagnosis, treatment, prevention and control. 2nd edition. Geneva, 1-84. 12. Wu SL, Paxton H, Hanson B et al (2000). Comparison of Two Rapid Diagnostic Assays for Detection of Immunoglobulin M Antibodies to Dengue Virus. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 7(1), 106-110. 13. Yatim (1996). Hasil Uji Coba Dengue stick IgG. Cermin Dunia Kedokteran 107, 26-27.
