OLEH
:
PUJI ANDINI XI ANALIS KESEHATAN
SMK KESDAM VI/DIPONEGORO 2014
1
Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari Botani Rusia, yang menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari dua kata yaitu chromos yang berarti warna dan graphos yang berarti menulis. Meskipun kromatografi
diturunkan dari kata warna dan tulis, warna senyawa-senyawa tersebut jelas hanya kebetulan saja terjadi dalam proses pemisahan ini. Tswett sendiri mengantisipasi penearapan pada beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera ditanggapi dan diperluas, beberap bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi tetap tersembunyi sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotenatumbuhan dilaporkan oleh ahli sains organik terkemuka yaitu Kuhn. Penelitian ini menarik lebih banyak perhatian dan kromatografi adsorsi menjad meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil alam. Dalam analisa kimia suatu bahan sering dihadapkan pada pekerjan-pekerjaan seperti menghilangkan konstituen pengganggu atau mengisolasi atau memekatkan konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukan identifikasi maupun pengukuran jumlahnya. Kromatografi merupakan salah satu cara pemisahan yang dewasa ini telah banyak digunakan secara rutin yang dapat dilaksanakan dengan waktu yang sangat simgkat dengan peralatan yang relatif sederhana dan murah. Walaupun cara kromatografi merupakan cara pemisahan, namun banyak diantara cara ini yang digunakan untuk analisa secara kuantitatif. Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan yang sangat sensitif. Selain dapat memisahkan campuran zat warna, teknik juga dapat menunjukkan residu nikotin dalam darah dari orang yang duduk dekat seorang perokok ketika naik bus kota. Selain itu kromatografi juga dapat memisahkan campuran kompleks, seperti minyak bumi yang merupakan campuran dari puluhan bahkan ratusan senyawa yang terkandung didalamnya, dan masih banyak lagi keunggulan dari pemisahan dengan teknik kromatografi lainnya.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Kromatografi merupakan metode fisika untuk pemisahan dimana komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara dua fase, salah satunya merupakan lapisan stationer dengan permukaan yang luas dan fase yang lain berupa zat cair (fluid) yang mengalir lambat (perkolasi) menembus atau sepanjang lapisan stationer tersebut.
2
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama.Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponenkomponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.Kita akan melihat alasannya pada halaman selanjutnya. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan-perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang akan dipisahkan (Mulja, 1995). Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :
Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk
bahan padat
Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.
Kromatografi jenis ini memakai fase diam cair dan fasa gerak cair . Pemisahan komponenkomponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekulmolekul yang dipisahkan. Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Bisa menggunakan: air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Berdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka kromatografi dibedakan menjadi 4
(Mulja, 1995), yaitu : a) Kromatografi dengan asas adsorpsi.
Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau gas. Pemisahan komponen-komponennya akan sangat bergantung pada perbedaan polaritas molekul-molekul yang akan dipisahkan. b) Kromatografi dengan asas partisi. 3
Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponenkomponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekulmolekul yang dipisahkan.
Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponenkomponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekulmolekul yang dipisahkan. c) Kromatografi dengan asas filtrasi.
Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi terhadap komponen yang mempunyai massa molekul relatif (Mr) yang tinggi dan fasa padat tersebut dimiliki oleh gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya adalah cairan. Kromatografi dengan dasar filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk (struktur dan ukuran molekul). d) Kromatografi dengan asas suhu kritik.
Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa mobil dipakai CO2 dalam keadaan superkritik.Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi keseimbangan yang baik antara fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penjerap atau fase diam harus berupa serbuk halus. Sedangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Persyaratan tersebut menghasilkan teknik high pressure liquid chromatography , yang selanjutnya lebih dikenal sebagai high performance liquid chromatography (HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter et al ., 1991).Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel dibawah ini.
Tabel Klasifikasi kromatografi Kriteria Fasa mobil Mekanisme
Nama Kromatografi cair, kromatografi gas Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi Kromatografi pertukaran ion kromatografi gel
Fasa
Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,
stationer
kromatografi kertas
Ada beberapa cara dalam mengelompokkan teknik kromatografi. Kebanyakan berdasarkan pada jenis fase yang digunakan (fase gerak dan fase diam) misalnya kromatografi gas dan kromatografi cairan. Cara pengelompokkan lainnya berdasarkan teknik yang digunakan. 4
Disini metode kromatografi sebagian dikelompokkan berdasarkan macam fase yang digunakan dan sebagian lainnya berdasarkan pada mekanisme pada distribusi fase.
1. Kromatografi cairan-padat atau kromatografi serapan.
Disini metode kromatografi sebagian dikelompokkan berdasarkan macam fase yang digunakan dan sebagian lainnya berdasarkan pada mekanisme pada distribusi fase.
1. Kromatografi cairan-padat atau kromatografi serapan.
Ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Kuhn dan Lederer pada tahun 1931, telah digunakan secara luas untuk analisis organik dan biokimia. Pada umumnya sebagian isi kolom adalah silika gel atau alumina yang mempunyai angka banding luas permukaan terhadap volume sangat besar. Sayangnya hanya ada beberapa bahan penyerap, maka pemilihannya sangat terbatas. Keterbatasan yang lebih nyata pada kenyataan bahwa koefisien distribusi untuk serapan kerap kali tergantung pada kadar total. Hal ini akan menyebabkan pemisahan tidak sempurna. Contoh : - Kromatografi orisinil Tswett dengan larutan eter petroleum dan kolom CaCO 3. - Kromatografi pertukaran ion. 2. Kromatografi cairan-cairan atau kromatografi partisi.
Dikenalkan ole Martin dan Synge pada tahun1941, dan kemudian mendapatkan hadiah Nobel untuk hal itu. Fase diam terdiri dari lapisan tipis, cairan yang melapisi permukaan dari padatan inert yan berpori-pori. Ada banyak jenis kombinasi cairan yang dapat digunakan sehingga metode ini sangat berguna. Lebih lanjut koefisien distribusi sistem ini lebih tidak bergantung pada kadar, memberikan pemisahan lebih tajam Contoh : - Kromatografi partisi pada kolom gel silika - Kromatografi kertas 3. Kromatografi gas-padat
Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik tidak berkembang karena keterbatasannya sama seperti halnya kromatografi cairan-padat, tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fase padat baru memperluas panggunaan teknik ini. 4. Kromatografi gas-cairan
Merupakan metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik lebih menyebabkan revousi dalam kimia organik, sejak dikenalkan pertama kali oleh James dan Marthin pada tahun 1052. hambatan yang paling utama ialah bahan cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa liter pada suhu kolom, sistem ini sangat baik 5
sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan dalam kromatografi karena daat memisahkan dengan cepat dan peka. 5. Kromatografi penukar ion
sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan dalam kromatografi karena daat memisahkan dengan cepat dan peka. 5. Kromatografi penukar ion
Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya sistem ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemu resin sintetik dengan sifat penukaran ion sebelum perang dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah dan asam amino. 6. Penyaringan gel
Penyaringan gel merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekulmolekul berdasarkan ukurannya. Molekul-molekul dengan berat molekul antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan bentuk serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer. 7. Elektroforesis
Elektoforesis merupakan kromatografi yang diberi medan lstrik disisinya dan tegak lurus aliran fase gerak. Senyawa bermuatan positif akanmenuju ke katoda dan anion menuju ke anoda,sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan. 8. Kromatografi kertas
Pada kromatografi kertas senyawa-senyawa yang dapat dipisahkan dapat diambil dari kertas dengan jalan memotong noda (spot) yang kemudian melarutkan secara terpisah. Setetes dari larutan cupikan yan gmengandung sejumlah komponen yang dipisahkan dengan cara diteteskan pada daerah yang diberi tanda diatas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang dibuat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang telah berisi pelarut sebagai fase gerak dimana ujung yang dengan dengan cuplikan tercelup (noda harus tidak tercelup, sedikit diatas permukaan pelarut). Pelarut bergerak melalui serta-serta dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen-kpmponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawasenyawa tidak berwarna maka harus dideteksi dengan metode kimia atau fisika. Cara yang biasa adalah menggunsksn suatu pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Sering juga menggunakan cara deteksi dengan sinar ultra violet atau teknik radiokimia.
6
Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini.
a. Kromatografi partisi
Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini.
a. Kromatografi partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbs.Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik (Gambar 12.3). Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil). b.
Kromatografi kertas
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asamasam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena
7
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut. c. Kromatografi gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair). Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini. Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.
Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan sedemikian rupa dengan memanipulasi sifat-sifat fisik umum dar suat senyawa atau molekul yaitu :
Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan)
Kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk bahan padat (absorbsi)
Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas)
8
Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa pelarutan, absorbsi atau penguapan.
Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa pelarutan, absorbsi atau penguapan. Untuk menerangkan suatu proses pemisahan diambil suatu contoh yang berada dala situasi statik (diam). Jika suatu senyawa ditaruh dalam corong pemisah yang berisi dua macam pelarut yang sukar bercampur (misalnya air dan eter) , maka senyawa tersebut akan terdistribusi (partisi) diantara kedua pelarut tersebut. Dalam hal ini sifat kelarutan sangat berperan dalam proses pemisahan. Bila suatu senyawa dimasukkan kedalam cairan yang berisi serbuk absorben (misalnya arang), maka senyawa tersebut akan terdistribusi diantara cairan dan absorben. Maka dalm hal ini sifat kelarutan dan absorbsi berperan dalam proses pemisahan tersebut. Demikian pula bila suatu senyawa yang mudah menguap (volatil) dilarutkan dalam cairan yang non volatil yang biasanya berwujud suatu lapisan film, maka senyawa tersebut akan terdistribusi diantara lapisan film cairan dan gas yang kontak dengan lapisan film tersebut. Dalm hal ini sifat kelarutan dan volatilitas berperan dalam proses pemisahan tersebut.
alat-alat
:
Bahan
Ø Gelas kimia 100 mL
Ø Aseton
Ø Gunting
Ø Tinta Biru
Ø Penggaris
Ø Alkohol
:
Ø Tinta Merah Ø Ekstrak Pandan Ø Sari bunga rosela Ø Akuades Ø Kertas saring
9
10
