LAPORAN RESMI PRAKTIKUM FITOKIMIA ISOLASI KAFEIN DARI DAUN TEH HIJAU (C amelli a sine si nensi nsis s) DENGAN METODE REFLUKS DAN IDENTIFIKASI DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
Disusun Oleh : Nama
: Cicillia Dian
16.0564
Riska Putri S
16.0558
Hari/Tanggal
: Kamis, 4 Mei 2018
Dosen Pembimbing
: Margareta Retno P, M.Sc., Apt
LABORATORIUM FITOKIMIA LANJUTAN AKADEMI FARMASI THERESIANA SEMARANG 2018
LAPORAN RESMI PRAKTIKUM FITOKIMIA ISOLASI KAFEIN DARI DAUN TEH HIJAU (Camelli a sinensis) DENGAN METODE REFLUKS DAN IDENTIFIKASI DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip dan mengisolasi senyawa kafein dari daun teh hijau (Camellia sinensis) dengan metode refluks. 2. Mahasiswa mampu melakukan evaluasi kafein dari teh hijau (Camellia sinensis) dengan uji organoleptis meliputi bentuk, warna, rasa dan menghitung rendemen hasil senyawa kafein dari ekstraksi teh hija u 3. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi kafein dari teh hijau (Camellia sinensis) dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan menghitung nilai retardasi solut (Rf)
II.
PRINSIP
a. Ekstraksi Prinsip kerja refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik. b. Pemisahan Prinsip pemisahan corong pisah yaitu memisahkan senyawa tertentu dalam sampel berdasarkan kelarutan dalam pelarut tertentu yang memiliki perbedaan bobot jenis. c. Mikrosublimasi Pemisahan zat dari simplisia nabati yang dilakukan pada zat-zat yang mudah menguap. Penguapan zat-zat hingga menguap lalu dikristalkan dalam permukaan yang diinginkan sehingga zat-zat yang dapat menyublim akan membentuk kristal.
d. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip absorbsi dan partisi, yaitu ditentukan oleh fase diam (adsorbsi) dan fase gerak (eluen). Komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap absorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya.
III.
TINJAUAN PUSTAKA Teh digunakan sebagai obat luar untuk beberapa penyakit, seperti penyembuhan luka atau mencegah penyakit kulit dan penyakit kaki karena kutu air (Dewi, 2008). Kandungan dalam teh beraneka ragam antara lain kafein,
teofilin, vitamin K, vitamin C, vitamin A, vitamin B (B1, B2, B6), K, Na, Mn, Cu, F, flavonoid, dan tannin. Kadar kafein dalam daun teh sekitar 2% (Nersyanti, 2006). Kafein adalah sejenis senyawa alkaloid yang termasuk golongan metilxantine (1,3,7-trimethylxantine). Kristal kafein dalam air berupa jarum-jarum bercahaya. Bila tidak mengandung air, kafein meleleh pada suhu 234°C – 239°C dan menyublim pada suhu yang lebih rendah. Kafein mudah larut dalam air panas dan kloroform, tetapi sedikit larut dalam air dingin dan alkohol (Abraham, 2010). Kafein dapat di isolasi dengan metoda refluks. Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur dan titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga proses ekstraksi sempurna (Voight,1971). Untuk tujuan ini, pelarut yang sesuai adalah kloroform, diklorometana, etil asetat, karbondioksida super kritik, dan lain-lain. Diklorometana digunakan untuk dekafeinasi bagian yang besar dari teh konvensional. Pelarut ini juga relatif tidak toksik dan sering digantikan dengan kloroform. Etil asetat juga menarik kafein dari daun teh secara efektif, juga dapat mengekstrak komponen kimia lain dengan baik.
Studi pada teh hijau dengan dekafeinasi menggunakan etil asetat telah menunjukkan potensi di atas 30% dari epigalokatekin galat (dianggap sebagai komponen yang sangat bermanfaat dalam teh hijau) dan lainnya bermanfaat sebagai komponen yang bersifat antioksidan yang diekstrak bersama kafein (Atomssa dan Gholap, 2011). Kafein merupakan alkaloid yang banyak ditemukan pada daun teh, biji kopi dan biji coklat. Kebanyakan alkaloid yang telah diisolasi berupa padatan kristal dengan titik lebur tertentu atau mempunyai kisaran dekomposisi. Sedikit alkaloid berbentuk amorf dan beberapa seperti nikotin dan koiini berupa cairan. Kebanyakan alkaloid tidak berwarna, tetapi beberapa senyawa yang kompleks,spesies aromatis, berwarna contoh berberin berwarna kuning dan betanin merah (Pranata,1997) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masingmasing komponen di antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi di antara dua fasa yang tidak bercampur (partisi). (Tim Dosen Kimia Organik, 2012). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada dasarnya sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya. Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahnya, yakni diguankannya lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastik sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam (Soebagio, 2000).
IV.
ALAT DAN BAHAN
ALAT
BAHAN
Labu alas bulat leher satu
Teh hijau (Camellia sinensis)
Pendingin bola
Baku sekunder kafein
Corong pisah
Aquadest
Klem dan statif
Kloroform
Batu didih
Larutan Pb Asetat
Gelas ukur
Etil Asetat
Cawan penguap
Metanol
Batang pengaduk
Vaselin
Beaker glass
Iodium kalium iodida-asam klorida
Lampu spiritus
Plat KLT
Pipet
Kertas saring
Bejana KLT
Kapas
Silica Gel GF 254
Kain katun
Neraca analitik Erlenmeyer Lampu UV 254 nm Corong kaca Kaca arloji
V.
CARA KERJA
1.
Proses Isolasi senyawa kafein dari daun teh Dirangkai rangkaian alat refluks terlebih dahulu
Ditimbang 40 g daun teh hijau
Dimasukkan ke dalam labu alas bulat 250 ml
Ditambahkan aquadest 200 ml dan batu didih
Dilakukan refluks selama 25 menit diatas lampu siritus
Disaring cairan teh tersebut (dalam keadaan panas) dengan menggunakan kain katun
Dituangkan filtrat kedalam bekerglass dan diberi larutan Pb Asetat tetes demi tetes ± 25 ml sampai filtrat tidak terbentuk endapan
Disaring campuran tersebut dengan corong betingkat yang telah diberi kertas saring diatasnya, hingga benar-benar jernih
Diimasukan filtrat hasil penyaringan ke dalam corong pisah
Ditambahkan dengan kloroform 25 ml
Digojog sampai terjadi pemisahan
Ditampung lapisan bawah
Dilakukan ekstraksi sekali lagi
(hasil ekstraksi kafein )
dengan menggunakan corong
lapisan I
pisah
Ditambahkan kloroform 20 ml lapisan II
Disatukan lapisan I dan II, pelarut kloroform dipisahkan dengan cara destil asi sederhana hingga pada labu alas bulat larutan terse but tinggal lebih kurang 5 ml
Sisa hasil destilasi dituang ke dalam cawan peguap, kemudian dengan api kecil dipanaskan hingga hampir kering
2.
Pemurnian kafein dengan cara mikrosublimasi Dimasukan kafein dengan pengotor (kafein yang belum jernih) ke dalam cawan penguap
Ditutup dengan kertas saring yang dilubangi
Diatas kertas saring diletakkan corong kaca yang pada bagian lubangnya ditutup dengan kapas basah Panaskan dengan nyala api kecil
Dibuka corong tersebut
Diamati apakah kristal kafein sudah terbentuk
Dihitung rendemen kafein dengan rumus R=
x 100%
3.
Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Disiapkan lempeng KLT, dipanaskan dalam oven selama 5 menit dengan suhu 105°C
Disiapkan eluen dalam bejana KLT, dilakukan penjenuhan
Disiapkan fase diam
Ditotolkan sampel pada lempeng KLT
Dimasukkan ke dalam bejana KLT yang sudah jenuh
Diamat kenaikan bercak, setelah proses berakhir, dikeringkan, kemudin diamati di bawah sinar UV 254 nm
Disemprotkan penampang bercak (Iodium kalium iodida-asam klorida)
Dipanaskan dalam oven selama 5 menit dan amati warna noda pada lempeng KLT
Hitung Rf bandingkan dengan baku primer 4.
Pengamatan Organoleptis Diamati bentuk dan warna kafein
Dicium bau dari kafein
Diambil sedikit sampel kafein dan dicicipi rasanya
VI.
GAMBAR RANGKAIAN ALAT
VII. HASIL EVALUASI
1. Organoleptis a. Bentuk : Serbuk kristal b. Warna : Putih c. Bau
: khas teh hijau
d. Rasa
: pahit
2. Rendemen No.
Keterangan
Jumlah
1.
Berat teh hijau
40 g (A)
2.
Berat vial kosong
12,2643 g
Perhitungan
R = x 100%
3
Berat vial kosong + kristal
12,2784 g
kafein 4
Berat kafein
0,0141 g (B)
3. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Eluen ( untuk 10 ml) Etil asetat : methanol : air ( 100:13,5:10) Etil asetat
= 100/123,5 x 10 ml
= 8,1 ml
Metanol
= 13,5/123,5 x 10 ml
= 1,1 ml
Aquadest
= 10/123,5 x 10 ml
= 0,8 ml
Baku pembanding = baku kafein
R=
0,0141 40
x100%
R = 0,0353 % b/b
No
Keterangan
Panjang Noda
1
Kafein
5,2 cm
Warna Noda Pada Sinar UV 254 nm Sebelum Sesudah disemprot
disemprot
penampang
penampang
bercak
bercak
Ungu
Ungu
Perhitungan
Rf =
5,2 8
= 0,65 cm
HRf = 0,65 x 100 = 65
2
Baku
5 cm
Ungu
Pembanding
Ungu
5
Rf = = 0,63 cm 8
HRf = 0,63 x 100 = 63
4. Uji mikroskopik
VII.
PEMBAHASAN
Isolasi senyawa kafein dari daun teh hijau ini dilakukan dengan metode reflux, yaitu metode ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu sehingga terjadi ekstraksi kontinu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik. Metode refluks ini digunakan untuk mengisolasi kafein dari daun teh karena sifat kafein tahan terhadap adanya pemanasan (titik didih kafein 234°C) serta tekstur bahan yang kasar. Prosedur kerja dengan menyiapkan alat reflux, masukan daun teh hijau kering dan tambahkan air sebanyak 200 ml. Air dipilih sebagai pelarut dalam proses isolasi kafein karena melihat sifat kafein yang larut dalam air panas. Proses refluks ini dilakukan selama 25 menit dihitung sejak tetesan pertama proses kondensasi, adanya pendidihan untuk membuka pori-pori pada daun teh sehingga kafein yang ada dalam daun teh dapat ditarik keluar dan dapat larut dalam air panas tersebut. Setelah proses refluks berakhir dilakukan proses penyaringan yang akan memisahkan sari teh dengan ampasnya. Proses penyaringan ini dilakukan dalam keadaan panas karena si fat kafein yang larut dalam air panas karena apabila penyaringan dilakukan pada keadaan dingin maka kafein akan mengendap sehingga dapat tertinggal pada kain katun. Kain katun dipilih sebagai penyaring, karena pori-pori kain katun kecil sehingga akan memaksimalkan penyaringan tersebut. Hasil filtrat yang didapat kemudian diendapkan dengan menambahkan Pb Asetat yng berfungsi untuk mengendapkan senyawa kotoran atau senyawa lain yang ada pada the contohnya tannin dan zat pengotor lainnya. Pemberian Pb Asetat perlu diperhatiksn sebaiknya dilakukan tetes demi tetes agar memudahkan dalam mengamati apakah masih terbentuk endapan atau tidak. Selanjutnya campuran tersebut disaring menggunakan corong kaca bertingkat yang telah dilapisi kertas saring sebagai pengganti corong buchner, filtrat
yang didapatkan harus jernih dan tidak terbentuk endapan. Setelah mendapatkan filtrat yang jernih dimasukan kedalam corong pisah dan tambahkan kloroform sebanyak 25 ml pertama dan 20 ml pada penambahan kedua dengan tujuan mengikat kafein dari larutan agar kafein benar-benar terpisah dari zat-zat lain dalam larutan. Kafein terikat dengan kloroform yang mana kloroform adalah zat non polar yang dapat terikat oleh zat non polar yaitu kafein sendiri. Penambahan kloroform akan menyebabkan terbentuknya dua lapisan pada corong pisah yang diakibatkan karena kloroform berat jenisnya lebih besar daripada air sehingga lapisan atas merupakan fase air, sedangkan lapisan bawah merupakan fase kloroform yang bercampur dengan kafein. Digunakan kloroform karena kelarutan kafein yang lebih mudah larut dalam kloroform dibandingkan dengan air serta sifat kloroform yang lebih mudah menguap sehingga dalam proses penguapan selanjutnya untuk memperoleh ekstrak kental kafein, kloroform dapat mudah diuapkan guna proses mikrosublimasi selanjutnya. Prinsip mikrosublimasi adalah perubahan wujud zat dari padat ke gas atau dari gas ke padat. Mikrosublimasi dilakukan dengan tujuan agar didapatkan kafein dalam bentuk murni. Kafein yang terkandung dalam ekstrak kental tersebut akan menguap yang membasahi kertas saring dengan adanya pemanasan dan berubah menjadi uap yang akan menembus celahcelah yang ada pada kertas saring, kemudia uap tersebut akan berubah menjadi bentuk padatan kristal dengan adanya pendingin oleh kapas basah yang ada pada corong kaca. Kristal yang di dapat tersebut akan menempel pada kertas saring. Proses mikrosublimasi ini menghasilkan kristal kafein yang berbentuk kristal jarum, bau khas teh, dan berwarna putih. Kristal kafein yang didapatkan selanjutnya diidentifikasi menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Pada proses KLT digunakan dua jenis fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 nm. Sedangkan fase
gerak adalah media angkut yang terdiri dari suatu atau beberapa pelarut, bergerak di dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak yang digunakan (Etil Asetat : Metanol : Aquadest = 100 : 13,5 : 10). Langkah pertama yang dilakukan yaitu penjenuhan eluen dengan cara mencelupkan ujung kertas saring
dalam chamber dan ditutup. Tujuan
penjenuhan ini adalah untuk mempercepat proses eluasi. Tujuan penutupan chamber
adalah
untuk
meyakinkan
bahwa
kondisi
dalam
chamber
terjenuhkan oleh uap pelarut. Langkah kedua diaktifkan lempeng KLT dalam oven selama 5-10 menit pada suhu 105 oC. Tujuan pengaktifan lempeng KLT untuk menghilangkan tapak-tapak air yang terserap pada lempeng KLT tersebut yang dapat mengganggu proses migrasi dari sampel dan baku pembanding dengan eluen serta fase diam. Lalu dilakukan penotolan dengan ekstrak kafein yang didapat dan baku pembanding kafein pada lempeng KLT. Hasil penotolan dilihat dibawah sinar UV 254 nm terlihat warna ungu. Fraksi yang telah ditotolkan tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen. Eluen digunakan sebagai pelarut untuk mendeteksi noda karena ketika senyawa organik diserap oleh eluen pada lempeng KLT, proses penyerapan berhenti dimana semakin kuat senyawa diserap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan. Setelah terlihat kenaikan bercak lempeng KLT dikeringkan lalu diamati dibawah sinar UV 254 nm dan ditandai noda yang timbul pada lempeng KLT sesuai bentuk yang diamati agar mempermudah perhitungan Rf dan HRf. Noda yang timbul berwarna ungu, s etelah ditandai noda yang nampak dilakukan penyemprotan penampang bercak iodide kalium iodide-asam klorida dilanjutkan dengan pengeringan pada oven dengan suhu 1050 C selama 5-10 menit untuk mengintensifkan warna pada lempeng KLT dan noda yang terbentuk berwarna ungu sama dengan baku pembanding yang menandakan ekstraksi senyawa kafein berjalan sesuai prosedur. Dari hasil perhitungan menghasilkan nilai RF 0,65 dan nilai HRf nya 65. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti
mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Nilai Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan
adalah
mengurangi
kepolaran
eluen,
dan
sebaliknya
(Gandjar,2007). Serbuk hasil isolasi kafein tersebut akan berbentuk Kristal jarum kecil-kecil berwarna transparan memanjang apabila diamati secara mikroskopik perbesaran 100x.
VIII.
KESIMPULAN
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip dan mengisolasi senyawa kafein dari daun teh hijau (Camellia sinensis)
dengan metode refluks yaitu
metode ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu sehingga terjadi ekstraksi kontinu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik. Metode refluks ini digunakan untuk mengisolasi kafein dari daun teh karena sifat kafein tahan terhadap adanya pemanasan serta te kstur bahan yang kasar. 2. Mahasiswa mampu melakukan evaluasi kafein dari teh hijau (Camellia sinensis) dengan uji organoleptis yaitu berbentuk serbuk kristal , warna putih, bau khas teh, rasa pahit dan rendemen yang dihasilkan 0,0353% b/b 3. Mahasiswa mampu melakukan identifikasi kafein dari teh hijau (Camellia sinensis) dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan prinsip memisahkan
komponen-komponen
sampel
berdasarkan
perbedaan
kepolaran. Dihasilkan noda warna ungu baik dari hasil senyawa kafein yang diekstrak maupun baku pembanding kafein pada lempeng KLT. Serta retardasi solut (Rf) hasil senyawa kafein 0,65 dan baku pembanding kafein 0,63
IX.
DAFTAR PUSTAKA
Abraham.
2010.
Penuntun
Praktikum
Kimia
Organik
II .
LaboratoriumPengembangan Unit Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan. Universitas Haluoleo : Kendari Atomssa T., A.V. Gholap. 2011. “ Characterization of Caffeine and Determination
of
Caffeine
in
Tea
Leaves Using
UV-Visible
Spectrometer”. African Journal of Pure and Applied Chemistry. Vol. V(1). Dewi, Mainora Rahayu. 2008. “ Penentuan Kandungan Kafein Pada Daun Teh (Camelia sinensis)”. Tesis. Program Pascasarjana Universitas Andalas Nersyanti, Fenri. 2006. “S pektrofotometri Dervatif Ultraviolet Untuk Penentuan Kadar Kafein Dalam Minuman Suplemen Dan Ekstrak Teh”. Skripsi.
Departemen
Kimia,
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bogor. Bogor. Pranata, F. Sinung. 1997. “Isolasi Alkaloid dari Bahan Alam (Alkaloid Insulation of Natural Materials)”. Biota. Vol. II(2). Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Negeri Malang. Tim Dosen Kimia Organik. 2012. Penuntun Kimia Organik I. Laboratorium FMIPA UNM. Makassar Voight. 1971. Buku Pembelajran Teknologi Farmasi Edisi 5. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press
Semarang, 4 Mei 2018 Mengetahui,
Praktikan
Dosen Pengampu
Margareta Retno Priamsari, M.Sc., Apt
(Cicilia Dian)
Praktikan
(Riska Putri)
LAMPIRAN
Reagen yang digunakkan saat KLT
Eluan yang diperlukan = Etil Asetat : Metanol : Aquadest (100 : 13,5 : 10) Eluen yang digunakan = 10 ml Etil Asetat
=
Metanol
=
Aquadest
=
100
x 10 ml = 8,1 ml
123,5 13,5
x 10 ml = 1,1 ml
123,5 10 123,5
x 10 ml = 0,8 ml
Kelompok beasr = Etil asetat: 8,1 ml x 6 = 48,6 ml Metanol : 1,1 ml x 6 = 6,6 ml Air 0,8 ml x 6 = 4,8 ml
Pembuatan Pb Asetat 20% 25 ml x 6 kelompok = 150 ml Overmatt 10% x 150 ml = 15 ml Total 150 ml + 15 ml = 165 ml Pb asetat serbuk = 20% x 165 = 33 g Air = 165 – 33 g = 132 ml
Kloroform 45 ml x 6 kelompok = 270 ml Overmatt 10% x 270 ml = 27 ml 270 + 27 ml = 297 ml ~ 300 ml
