LAPORAN RESMI PRAKTIKUM KIMIA PRODUK ALAM IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Disusun oleh:
Golongan IV Kelas B Kelompok A 1. Ziana Walidah 2. Nida Al Husna 3. Rusyda Dyah
13/348742/FA/09660 13/348742/FA/09660 13/348838/FA/09661 13/348838/FA/09661 13/348874/FA/09662 13/348874/FA/09662
Dosen Jaga
: Dr. rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt
Asisten Jaga
: Fairuz Sakina Mufida Annisafia Rizky Damaskha Dewi Rahmawati
Tanggal Praktikum
: Selasa, 10 Maret 2015
LABORATORIUM KIMIA PRODUK ALAM FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2015
IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
I.
Tujuan 1. Mahasiswa mampu memisahkan senyawa-senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak tumbuhan yang akan dianalisis. 2. Mahasiswa mampu mengidentifikasi golongan senyawa metabolit sekunder yang ada pada ekstrak tumbuhan dengan menggunakan KLT. 3. Mahasiswa mampu memahami prinsip pemisahan dan identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dengan metode KLT.
II. Alat dan Bahan A. Alat 1.
Pipa Kapiler
2.
Kertas saring
3.
Penggaris
4.
Lampu UV 254 dan 366
5.
Kompor
6.
Bejana KLT + tutup
7.
Penyemprot
B. Bahan 1.
Silika gel F254
2.
Toluen:etil asetat (93:7)
3.
Heksana:etiil asetat (4:1)
4.
Minyak kayu putih
5.
Oregano
6.
Ekstrak mint
7.
Pacing
8.
Stigmasterol
9.
Pembanding Thymol dan Menthol
10. Anisaldehid-asam sulfat
III. Cara Kerja Batas elusi ditandai 5 cm dari tempat penotolan dengan menggunakan pensil secara perlahan
Larutan uji dan pembanding ditotolkan pada lempeng silika gel F 254 dengan diberi jarak pada masing-masing sampel
Lempeng dimasukkan dalam bejana KLT yang sudah dijenuhkan dengan diberi fase gerak (toluen-etil asetat untuk tymol, menthol dan sineol, heksana:etil asetat untuk steroid)
Senyawa dibiarkan terelusi hingga batas tanda
Diamati dan didokumentasikan pada kondisi sinar tampak, sinar UV 254 dan UV 366
Disemprot dengan menggunakan anisaldehid-asam sulfat, kemudian dipanaskan
Diamati dan didokumentasikan pada kondisi sinar tampak, sinar UV 254 dan UV 366
IV. Data dan Hasil Praktikum A. MONOTERPEN Keterangan: P = Pembanding S1 = Oregano S2 = Daun Mint S3 = Minyak kayu putih
- Dokumentasi 1. Sebelum disemprot a. Tampak
’
b. UV 254 (tidak ada foto)
c. UV 366 (tidak ada foto)
2. Sesudah disemprot a. Tampak
b. UV 366
-
Data Rf SEBELUM DISEMPROT
NO
TAMPAK
UV 254
SESUDAH DISEMPROT UV 366
TAMPAK
P
S1
S2
S3
P
S1
S2
S3
P
S1
S2
S3
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,46 0,02 0,11
2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,28
0,4
4
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,54
0,5
-
-
5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,65 0,61
-
-
-
Perhitungan Rf
Rf =
1. Tampak a. Pembanding P.1 → Rf = P.2 → Rf =
= 0,46
= 0,63
b. Sampel 1 (Oregano) S1.1 → Rf = S1.2 → Rf = S1.3 → Rf =
= 0,02
= 0,11
= 0,28
P
S1
S2
UV 366 S3
P
S1
0,4
-
0,02 0,5
-
0,63 0,11 0,27 0,54
-
0,54
-
-
-
-
0,71
S2
S3
S1.4 → Rf = S1.5 → Rf =
= 0,54
= 0,65
c. Sampel 2 (Mint) S2.1 → Rf = S2.2 → Rf = S2.3 → Rf = S2.4 → Rf = S2.5 → Rf =
= 0,11
= 0,27
= 0,4
= 0,5
= 0,61
d. Sampel 4 (minyak kayu putih) S3.1 → Rf = S3.2 → Rf = S3.3 → Rf =
= 0,4
= 0,54
= 0,71
2. UV 366 a. Sampel 1 (Oregano) S1.1 → Rf = S1.2 → Rf = S2.1 → Rf =
B. STEROID Keterangan : P = Stigmasterol S = Pacing
= 0,02
= 0,11
= 0,28
- Dokumentasi 1. Sebelum disemprot a. Tampak
b. UV 254
c. UV 366
2. Sesudah disemprot a. Tampak
b. UV 366
-
Data Rf SEBELUM DISEMPROT
NO
TAMPAK
UV 254
SESUDAH DISEMPROT UV 366
TAMPAK
UV 366
P
S
P
S
P
S
P
S
P
S
1
-
-
-
-
-
-
0,58
0,48
-
-
2
-
-
-
-
-
-
0,58
-
-
3
-
-
-
-
-
-
0,68
-
-
4
-
-
-
-
-
-
0,74
-
-
5
-
-
-
-
-
-
0,76
-
-
-
Perhitungan Rf
Rf =
Hanya terlihat pada sinar tampak a. Pembanding P.1 → Rf =
= 0,58
b. Sampel S.1 → Rf = S.2 → Rf = S.3 → Rf = S.4 → Rf = S.5 → Rf =
= 0,48
= 0,58
= 0,68
= 0,74
= 0,76
V. Pembahasan Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa terpenoid atau building block isoprene dari jalur asetat-mevalonat dalam ekstrak tumbuhan yang dianalisis dan diidentifikasi menggunakan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Senyawa yang akan diuji adalah senyawa Thymol, Mentol, Sineol, dan Steroid. Dimana bahan-bahan tersebut dianalisis dari beberapa tumbuhan yang telah diekstraksi yaitu: oregano (Origanum vulgare L.) yang dianalisis kandungan Thymol, daun mint ( Mentha piperita) yang dianalisis kandungan Mentol, minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron) yang dianalisis kandungan sineol, dan Rhizoma pacing (Costus Specious) yang dianalisis kandungan steroidnya. Berikut ini adalah klasifikasi dari tumbuhan yang digunakan dalam percobaan ini : 1. Costus speciosus (Rhizoma pacing)
-
Kingdom: Plantae
-
Subkingdom : Tracheobionta
-
Superdivisi : Spermatophyta
-
Divisi: Magnoliophyta
-
Kelas : Liliopsida
-
Subkelas: Zingiberidae
-
Orde: Zingiberales
-
Famili: Costaceae
-
Genus: Costus L.
-
Spesies : Costus speciosus
2. Melaleuca leucadendron (Kayu putih)
-
Kingdom: Plantae
-
Subkingdom : Tracheobionta
-
Superdivisi : Spermatophyta
-
Divisi: Magnoliophyta
-
Kelas : Magnoliopsida
-
Subkelas: Rosidae
-
Orde: Myrtales
-
Famili: Myrtaceae
-
Genus: Melaleuca L.
-
Spesies : Melaleuca leucadendron
3. Origanum vulgare L. (Oregano)
-
Kingdom: Plantae
-
Subkingdom : Tracheobionta
-
Superdivisi : Spermatophyta
-
Divisi: Magnoliophyta
-
Kelas : Magnoliopsida
-
Subkelas: Asteridae
-
Orde: Lamiales
-
Famili: Lamiaceae ⁄ Labiatae
-
Genus: Origanum L.
-
Spesies : Origanum vulgare L.
4. Mentha piperita (Daun mint)
-
Kingdom: Plantae
-
Subkingdom : Tracheobionta
-
Superdivisi : Spermatophyta
-
Divisi: Magnoliophyta
-
Kelas : Magnoliopsida
-
Subkelas: Asteridae
-
Orde: Lamiales
-
Famili: Lamiaceae ⁄ Labiatae
-
Genus: Mentha L.
-
Spesies : Mentha piperita L.
(Wijayakusuma, 1994)
Praktikum kali ini menggunakan teknik KLT, dimana metode ini digunakan untuk memisahkan senyawa berdasarkan kepolarannya. semakin polar senyawa yang diidentifikasi, maka akan semakin suka dengan fase diamnya (like dissolve like) dan tidak akan bergerak jauh. Sedangkan untuk senyawa yang non polar akan lebih menyukai dengan fase geraknya yang sama sama non polar sehingga akan memiliki jarak gerak yang lebih jauh dibandingkan dengan senyawa yang polar. Pada praktikum ini, fase diam yang digunakan bersifat polar (silika gel F254) dan fase geraknya bersifat non polar. Senyawa yang dipisahkan adalah senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan. Pada teknik KLT terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan. Diantanya adalah fase gerak, fase diam dan senyawa pembanding. Untuk senyawa thymol, mentol dan sineol fase gerak yang digunakan sama yaitu toluene-etil asetat (93:7 v/v) sedangkan steroid, fase gerak yang digunakan adalah n-heksanaetil asetat (4:1 v/v) Pada praktikum ini. Tumbuhan yang disediakan sudah dalam keadaan ekstrak sehingga tidak perlu lagi melakukan ekstraksi atau pembuatan larutan. Selain itu Plat KLT dan bejana KLT pun sudah dijenuhikan dengan fase gerak. Langkah awal yang dilakukan adalah menotolkan sampel pada plat KLT. Terdapat dua plat KLT, plat KLT pertama digunakan untuk mengidentifikasi metabolit sekunder yang terkandung dalam rhizoma pacing dengan pembanding stigmasterol, dan plat KLT kedua untuk mengidentifikasi adanya metabolit sekunder yang terkandung pada minyak kayu putih, daun mint, oregano dengan pembanding yaitu campuran menthol dan thymol. Tanda yang digunakan untuk penotolan adalah titik. Dimana masing-masing titik pada plat ditotol dengan ukuran yang sesuai, tidak terlalu besar ataupun keci. Totolan yang terlalu besar dapat mengakibatkan pelebaran hasil yang ditakutkan dapat mengganggu senyawa lain, sedangkan totolan yang terlalu kecil dikhawatirkan tidak terlihat ketika telah dilakukan KLT. Baik titik untuk pembanding maupun untuk sampel, masing-masing penotolan harus menunggu sampai penotolan sebelumnya kering terlebih dahulu agar totolan yang dihasilkan tidak melebar. Lalu plat KLT yang telah ditotol dengan fase gerak tersebut dimasukkan kedalam bejana yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Plat KLT dimasukkan ke bejana dengan hati-hati agar fase gerak tidak menyentuh totolan. Selain itu saat memasukkan plat KLT juga harus cepat agar kejenuhan fase gerak dalam bejana tidak berubah. Penempatan palt ke dalam bejana pun harus lurus, jangan sampai nantinya hasil yang didapat akan memperlihatkan fase gerak yang bergerak tidak lurus. Hal tersebut akan mempersulit dalam penentuan batas elusi
danperhitungan Rf nantinya. Kemudian ditunggu hingga fase gerak mencapai batas elusi yaitu 5cm dari totolan. Setelah mencapai batas elusi, plat KLT diambil dan ditunggu hingga kering. Selanjutnya hasil KLT yang didapatkan nantinya akan diuji dalam beberapa uji yang harus dilakukan secara berurutan. Yaitu uji deteksi sinar tampak, UV 254, UV 366, deteksi UV 254 dan 366 setelah penyemprotan asam sulfat pekat dan pemanasan pada suhu 110 0. Senyawa pembanding yang digunakan adalah senyawa yang diperkirakan ada di dalam ekstrak tumbuhan yang akan diidentifikasi. Sehingga nantinya apabila antara senyawa pembanding dengan senyawa yang diidentifikasi memiliki nilai Rf yang sama, keduanya merupakan suatu senyawa yang sama pula. Sebagai larutan penbanding. Untuk senyawa Thymol, Mentol, Sineol menggunakan senyawa pembanding yang sama yaitu campuran Thymol dan mentol, Untuk sineol bahan pembanding yang digunakan pun campuran dari thymol dan menthol dengan pertimbangan, urutan RF dari ketiga senyawa tersebut dari nilai yang terendah yaitu mentol, sineol, dan timol sehingga KLT dapat dilakukan kepada bahan bahan yang akan diperiksa secara bersama-sama. Sedangkan steroid menggunakan senyawa pembanding yaitu stigmasterol. Untuk uji senyawa thymol, bahan yang digunakan adalah oregano. Dimana oregano diungkapkan oleh literature mengandung senyawa yang termasuk dalam phenol terpen monohydric phenol, yaitu carvacrol (Kar, 2007) yang merupakan transformasi dari thymol Berikut adalah struktur kimia dari thymol dan carvacrol yang terkandung dalam oregano:
(Kar, 2007) Dari struktur diatas, dapat dilihat bahwa keduanya memiliki struktur pokok yang sama. Sehingga dapat dikatakan bahwa oregano diduga mengandung thymol. Setelah dilakukan uji KLT. Didapatkan hasil dimana RF untuk thymol adalah 0,63 sedangkan dari oregano terdapat bercak dengan nilai RF sebesar 0,65. Hal ini memperkuat dugaan bahwa oregano mengandung thymol. Dengan warna yang sama yaitu kuning kecoklatan. Hasil ini didapatkan pada sinar tampak, setelah melakukan penyemprotan dengan H2SO4 dan pemanasan dengan suhu 110 0C, pemanasan harusnya menggunakan oven, sehingga suhu tetap terjaga dengan baik. Namun, pada praktikum ini, pemanasan dilakukan dengan menggunakan kompor dan terdapat kesalahan dalam pemanasan, dimana kemungkinan terjadi pemanasan yang melebihi dari suhu seharusnya
sehingga terdapat beberapa bagian kertas KLT yang terbakar dan tidak dapat diamati kembali pada UV 366 setelah dilakukan penyemprotan. Pada uji senyawa menthol, bahan yang digunakan adalah daun mint. Dimana daun mint diungkapkan oleh literature mengandung menthol sebesar 50-60% (Kar, 2007) Berikut adalah struktur kimia dari methol:
(Kar, 2007) Setelah dilakukan uji KLT. Didapatkan hasil dimana RF untuk menthol
adalah 0,46
sedangkan dari daun mint terdapat bercak dengan nilai RF sebesar 0,5. Nilai RF yang didapat cukup dekat dan keduanya memiliki warna yang sama yaitu coklat kemerahan. Sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa daun mint diduga mengandung menthol. Hasil ini didapatkan pada sinar tampak, setelah melakukan penyemprotan dengan H 2SO4 dan pemanasan dengan suhu 1100C, pemanasan harusnya menggunakan oven, sehingga suhu tetap terjaga dengan baik. Namun, pada praktikum ini, pemanasan dilakukan dengan menggunakan kompor dan terdapat kesalahan dalam pemanasan, dimana kemungkinan terjadi pemanasan yang melebihi dari suhu seharusnya sehingga terdapat beberapa bagian kertas KLT yang terbakar dan tidak dapat diamati kembali pada UV 366 setelah dilakukan penyemprotan. Pada uji senyawa sineol, bahan yang digunakan adalah minyak kayu putih. Dimana minyak kayu putih diungkapkan oleh literature mengandung sineol sebesar 50-60% (Tirtajaya, et al. 2004) Berikut adalah struktur kimia dari methol:
(Kar, 2007)
Setelah dilakukan uji KLT. Didapatkan hasil dimana RF untuk menthol adalah 0,46 dan thymol adalah 0,63. Sedangkan minyak kayu putih terdapat bercak dengan nilai RF sebesar 0,58. Nilai RF yang didapat berada diantara thymol dan methol. Hal ini, masuk sesuai dengan teori dimana sineol memiliki RF diantara thymol dan menthol dengan penampakan warna yaitu ungu muda. Sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa minyak kayu putih diduga mengandung sineol. Hasil ini didapatkan pada sinar tampak, setelah melakukan penyemprotan dengan H2SO4 dan pemanasan dengan suhu 1100C, pemanasan harusnya menggunakan oven, sehingga suhu tetap terjaga dengan baik. Namun, pada praktikum ini, pemanasan dilakukan dengan menggunakan kompor dan terdapat kesalahan dalam pemanasan, dimana kemungkinan terjadi pemanasan yang melebihi dari suhu seharusnya sehingga terdapat beberapa bagian kertas KLT yang terbakar dan tidak dapat diamati kembali pada UV 366 setelah dilakukan penyemprotan. Pada uji senyawa steroid, bahan yang digunakan adalah rhizome pacing. Dimana pacing diungkapkan oleh literature mengandung diosgenin yang merupakan steroid saponin (Singh dan Thakur,1982). Pada KLT ini senyawa pembanding yang digunakan adalah stigmasterol Berikut adalah struktur kimia dari stigmasterol:
(Kar, 2007) Setelah dilakukan uji KLT. Didapatkan hasil dimana RF untuk stigmasteroid adalah 0,58, sedangkan dari pacing terdapat bercak dengan nilai RF sebesar 0,58. Nilai RF yang didapat tepat sama dan keduanya memiliki warna yang sama yaitu ungu. Sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa pacing diduga mengandung steroid. Hasil ini didapatkan pada sinar tampak, setelah melakukan penyemprotan dengan H2SO4 dan pemanasan dengan suhu 110 0C, pemanasan harusnya menggunakan oven, sehingga suhu tetap terjaga dengan baik. Namun, pada praktikum ini, pemanasan dilakukan dengan menggunakan kompor dan terdapat kesalahan dalam pemanasan, dimana kemungkinan terjadi pemanasan yang melebihi dari suhu seharusnya
sehingga terdapat beberapa bagian kertas KLT yang terbakar dan tidak dapat diamati kembali pada UV 366 setelah dilakukan penyemprotan. Semua bercak yang didapatkan pada percobaan kali ini terelusi dengan bagus (tidak ada yang gagal) sehingga Rf yang dihasilkan cukup baik. Namun, terdapat beberapa titik yang kurang jelas bahkan tidak tampak pada UV 366 setelah penyemprotan. Hal ini dikarenakan terlalu panasnya perlakuan setelah penyemprotan.
VI. Kesimpulan 1. Oregano kemungkinan mengandung tymol karena Rf mendekati yaiu 065 dari pembanding 0,63. Warna bercak yang dihasilkan adalah sama. 2. Mint kemungkinan mengandung mentol karena Rf mendekati yaitu 0,5 dari pembanding 0,46. Warna bercak yang dihasilkan adalah sama. 3. Minyak Kayu Putih kemungkinan mengandung sineol karena Rf mendekati yaitu 0,54 dengan menggunakan pembanding Tymol dan Mentol. 4. Identifikasi senyawa kandungan ekstak tumbuhan dapat menggunakan metode K LT menggunakan pembanding yang sama ataupun yang mewakili.
VII. Daftar Pustaka Kar, Ashutosh, 2007, Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology, Edisi 2, New Age International (P) Limited Publishers, New Delhi Singh, Sheo B., dan Thakur, Raghunath S., 1982, “Saponins From the Seeds of Costus speciosus”, J. Nat. Prod 45 (6): 667 – 671
Tirtajaya, Imelda., Djohan Sofia, Lidia Ratnawati, Hioe Fei Lien., Oktober 2004, “ Jurnal llmu dan Teknologi Pangan”, Vol. 2, No. 2:59-65 Wijayakusuma, H.M Hembing; Setiawan Dalimartha, dkk , 1994, Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia, Pustaka Kartini, Jakarta
