PREPARAT PREPARAT IRISAN UNTUK UNT UK HEWAN (METODE PARAFIN)
Oleh :
Oleh : Nama NIM R&m'&nan Kel&m*&+
: Dyna Ratnasari Plashintania : !"#!$%#$ : I :%
,APORAN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK MIKROTEKNIK
KEMENTERIAN RISET- TEKNO,O.I- DAN PENDIDIKAN TIN..I UNIERSITAS "ENDERA, SOEDIRMAN FAKU,TAS IO,O.I PURWOKERTO %#!/
I0
PENDAHU,UAN
!0! ,atar ela+an
Ginjal adalah organ yang mengatur komposisi kimia dari lingkungan dalam, melalui proses majemuk yang melibatkan filtrasi, absorbsi aktif, absorbsi pasif, dan sekresi. Selain itu ginjal juga mengatur tekanan darah dan volume darah dalam tubuh. Ginjal terletak pada dinding posterior abdomen terutama didaerah lumbal, disebelah kanan dan kiri tulang belakang dibungkus lapisan lemak, dibelakang peritorium (Price & Wilson, !!"#. Ginjal diperdarahi oleh arteri renalis yang dipercabangkan dari aorta abdominalis. $ena renalis bermuara ke vena kavea inferior. %ari setiap ginjal, suatu pembuluh yang dinamakan ureter membaa kemih ke dalam kandung kemih. 'andungan kemih berfungsi sebagai tempat penyimpanan kemih yang dikosongkan secara berskala melalui uretra. 'emih dibentuk dari darah melalui proses filtrasi yang diikuti penyerapan kembali secara selektif (Green, ))! # *da tiga tahap pembentukan urin yaitu + # Proses filtrasi merupakan proses yang terjadi dalam glomerulus, terjadi karena permukaan aferent lebih besar dari permukaan eferent maka terjadi penyerapan darah, sedangkan sebagian tersaring adalah bagian cairan darah kecuali protein, cairan yang tersaring ditampung oleh simpauni baman yang terdiri dari glukosa, air, sodium, klorida, sulfat, bikarbonat diteruskan ke tubulus seminiferos. # Proses reabsorpsi + terjadi penyerapan kembali sebagian dari glukosa, sodium, kloroda dan fospat dan beberpa ion bikarbonat. Prose ini terjadi secara pasif yang dikenal obligator reapsorbsi terjadi pada tubulus atas. # proses sekresi + sisanya penyerapan kembali yang terjadi pada tubulus dan diteruskan ke piala ginjal selanjutnya diteruskan keluar (Syaifuddin, !!-#. Glomerulus adalah suatu organ epiteliovaskuler yang dirancang untuk filtrasi ultra dari plasma. 'apiler glomerulus dilapisi oleh lapisan endotelium, berlubang poripori dengan diameter karang lebih )) nm dan terletak pada membran basalis (Silvia et al , )#. Glomerulus pada setiap nefron menyaring darah dan membiarkan unsurunsur darah dengan berat molekul kurang dari pembuluh, tetapi menahan setiap molekul kapiler darah (Green, ))!#.
/0.))) masuk kedalam
dan partikel yang lebih besar dalam
Sebagian besar dari air yang disaring pada glomerulus (0)0"1# tidak harus diserap kembali dalam tubuh proksimal. 2erbagai jumlah dari sisanya diserap kembali dalam tubuh distal dan saluran pengumpul sesuai dengan keperluan air dalam tubuh. Penyerapan kembali air dan dengan demikian mengurangi volume urin yang terbentuk. 'arena tindakanya ini maka hormon itu dinamakan hormon anti diurectik (*%3#. *%3 ialah suatu nonpeptida yaitu suatu polipeptida dengan ! asam amino, jika darah mulai menjadi terlalu cair (misalnya setelah banyak minum air# maka sekresi *%3 terhalang ('imball, !!)#.
!0% T121an
4ujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara pembuatan sediaan organ ginjal ayam dengan metode parafin dan untuk mengamati struktur mikroskopis organ ginjal ayam.
II0 MATERI DAN METODE
%0! Materi
*latalat yang digunakan diantaranya yaitu alat bedah, botol sampel, beaker glass, oven inkubator dengan thermostat, hot plate, cetakan dari kertas karton, blok kayu sebagai holder, mikrotom putar, kuas dan mangkuk air hangat, alumunium foil, object glass, cover glass, staining jar, mikroskop, kamera, pensil dan label. 2ahanbahan yang digunakan diantaranya yaitu organ ginjal ayam ( Gallus gallus#, Neutral Buffered Formalin (526#, alkohol -)1, 0)1, !)1, ))1, akuades, 7ylol, gelatin 1, pearna haemato7ylin dan eosin 1 serta entelan ne. A0 Met&3e
8etode yang dialakukan dalam praktikum ini adalah+ A0 Penam'ilan Sam*el . *yam disembelih dengan menggunakan pisau. . *yam dibedah menggunakan alat bedah yang telah disediakan. . *ngkat organ ginjal kemudian dibersihkan dari darah dan difiksasi dengan
larutan 526 di dalam botol sampel selama minimal 9 jam. $olume fiksatif minimal ) kali volume sampel jaringan. 0 Pemr&sesan Oran 1nt1+ Em'e33in %ehidrasi. Sampel direndam dalam larutan alkohol bertingkat mulai dari -)1, 0)1
!)1 dan akhohol absolut dua kali masingmasing selama 9" menit. Penjernihan : clearing . Sampel direndam dalam campuran alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#,
;ylol < dan ;ylol << masingmasing selama 9" menit.
dalam
campuran
7ylol+parafin
(+#,
7ylol+parafin
(+#,
7ylol+parafin (+# masingmasing selama 9" menit. Parafin murni < dan parafin murni << masingmasing selama /) menit. 9 Embedding. %isiapkan cetakan dari kertas karton kurang berukuran 7 cm. Paraffin cair dituangkan ke dalam cetakan sekitar 9:" tinggi cetakan. >aringan ditanam dalam paraffin dan posisinya diatur sesuai dengan orientasi pengirisan jaringan yang diinginkan, kemudian holder dari blok kayu yang telah diberi label ditetakkan. Paraffin dibiarkan membeku pada temperatur ruang.
40 Penirisan sam*el 8ikrotom disambungkan dengan power supply, switch tombol mikrotom ke
posisi on. Posisi hendle pemutar kromotom diubah ke posisi tak terkunci dan diputar
untuk memastikan baha mikrotom dalam keadaan baik dan operasional. Posisi hendle pemutar kromotom dikembalikan ke posisi terkunci, ketebalan
9
irisan diatur deengan memutar tombol pengatur ukuran irisan. Sudut kemiringan (elevasi# pemegang pisau diatur dan dilakukan uji coba
"
dengan blok kosong. 'uas dan pinset disispkan untuk pemotongan dan pita paraffin dipindahkan
/
ke air hangat untuk mengembangkan jaringan. Sebelum diiris paraffin di sekeliling sampel dapat dikurangi melalui
trimming . - older dipasang pada pemegang holder. 0 Posisi blok disesuaikan dengan pisau mikrotom dengan memajukan atau memundurkan pemegang sampel. ! 2lok diiris dengan kecepatan dan kekuatan putaran yang konstan. ) Pita berisi beberapa irisan sampel dipindahkan ke mangkuk berisi air hangat dengan kuas kecil dan pinset. aringan yang akan diarnai disiapkan. %eparafinasi. >aringan dicelupkan ke dalam 7ylol < dan 7ylol << selama menit.
?ehidrasi. >aringan dimasukkan ke dalam alkohol absolut <, absolut <<, alkohol !)1, 0)1, -)1 dan akuades masing masing ) celupan. >aringan dicelupkan ke dalam larutan haemato7ylin selama " menit, kemudian dicuci dengan air
9 "
kran selama menit. %irendam dalam eosin selama menit %ehidrasi. >aringan dicelupkan ke dalam larutan alkohol -)1, !)1, alkohol absolut <
dan alkohol absolut << masingmasing ) celupan. / !learing . >aringan dijernihkan dalam larutan 7ylol dan 7ylol << selama menit. - "ounting. >aringan ditetesi dengan tetes mounting agent (entelan new# dan ditutup dengan gelas penutup. 0. %iamati dibaah mikroskop.
III0 $0! Hasil
HASI, DAN PEMAHASAN
.am'ar $0!0 hasil em'e33in &ran in2al ayam
$0% Pem'ahasan
8etode parafin adalah suatu cara pembuatan sediaan histologi, baik hean atau tumbuhan dengan menggunakan parafin. 8etode ini sekarang banyak digunakan karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik dengan menggunakan metode ini. 8etode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan yang tipis (5urliani, ))-#. 'elebihan metode ini ialah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metode beku atau metode seloidin. 4ebal irisan ratarata dengan metode beku yaitu diatas ) mikron, akan tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai ratarata / mikron. Selain itu, irisanirisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. 'elemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah
patah. >aringanjaringan
yang
besar
tidak
dapat
dikerjakaan, bila
menggunakan metode ini. Sebagian besar en@im yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini (Suntoro, !0#. Arutan cara kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin secara umum yaitu fiksasi, pencucuian (washing # , dehidrasi, penjernihan (clearing #, infiltrasi parafin, penanaman (embedding # , pengirisan ( section#, penempelan (afi#ing #, deparafinisasi, pearnaan ( staining #, penutupan (mounting #, dan labelling . Embedding menggunakan parafin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi. 8edium embedding merupakan media yang memudahkan untuk merubah dari bentuk cair ke bentuk padat ('urniaati, )9#. Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin yang pertama adalah organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi dengan 526 selama 9 jam. 6iksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa, sehingga perubahan bentuk atau struktur sel atau jaringan yang mungkin terjadi hanya sedikit. Selain itu, fiksasi berguna untuk meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terarnai dengan baik. 4ahap selanjutnya adalah dehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi bertingkat. Prinsip dari dehidrasi adalah karena jaringan hidup mengandung 0"1 air, sedangkan air tidak dapat bercampur dengan media parafin, sehingga dibutuhkan tahapan dehidrasi jaringan untuk menarik molekul air yang ada di dalam jaringan, dengan demikian, jaringan akan lebih teraetkan dan ruang antarsel dalam jaringan dapat diisi dengan media lain sesuai keperluan sediaan mikroskopis (Suntoro, !0#.
Proses yang dilakukan setingkat demi setingkat, karena untuk menjaga tidak terjadi perubahan yang tibatiba terhadap sel jaringan, hingga perubahan struktur selsel yang sekecil mungkin (Schichnes et al., ))"#. Presentase alkohol yang digunakan dalam praktikum adalah alkohol -)1, alkohol 0)1, alkohol !/1, alkohol absolut ())1# <, dan alkohol absolut <<. Brgan selanjutnya di clearing dengan larutan campuran 7ylol dan alkohol dengan perbandingan tertentu yaitu +, +, + dan 7ylol murni. 4ujuannya adalah untuk membersihkan sisasisa alkohol dari organ dan membantu proses penyerapan parafin. 4ahapan berikutnya yaitu infiltrasi atau perendaman dalam parafin, dilakukan di dalam inkubator agar saat organ dimasukkan dalam parafin, maka parafin tersebut tidak mudah membeku. 4ahapan perendaman dalam parafin diulangi sebanyak kali dengan tujuan agar parafin meresap sempurna dan pada saat pemotongan akan didapat hasil yang baik. Selain itu tahapan perendaman dalam parafin
yang
sempurna
juga
turut
mempengaruhi
struktur
organ
yang
digunakan.4ahapan selanjutnya adalah penanaman atau embedding organ ke dalam blok parafin. Penanaman dilakukan pada hari yang sama setelah dilakukan tahap infiltrasi. Brgan yang sudah berada dalam blok parafin akan dipotong dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan hasil " mikron. 4ahapan pemotongan memerlukan kesabaran dan ketelitian. *da beberapa jenis mikrotom yang dapat digunakan sebagai alat pemotong sediaan antara lain hand microtom, rocking microtom, rotary microtom, free$ing microtom, dan sliding microtom. 2eberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain pita tidak terbentuk sempurna. 3al ini kemungkinan karena pisau yang tumpul. Pita melengkung atau bengkok, hal ini kemungkinan karena tepi pisaunya yang tidak rata. Sayatan tertekan, mengkerut, atau berdempet, hal ini kemungkinan karena sudut pisau yang terlalu kecil dan mata pisau yang terlapis dengan sisa parafin. Sayatan remuk dan cenderung lepas dari parafin, hal ini kemungkinan karena proses dehidrasi dan clearing yang tidak sempurna (>unCuera et al., !!0#. Pita hasil pemotongan kemudian dilekatkan pada object glass, kemudian dilakukan tahap deparafinisasi dengan 7ylol. 6ungsinya adalah untuk menghilangkan parafin pada jaringan. 4ahapan selanjutnya adalah pearnaan dengan pearna 3emato7ilinDosin. Pearnaan dilakukan untuk memudahkan pengamatan dan menemukan bagianbagian dari organ yang ingin diamati atau dikaji (Schichnes et al., ))"#. 4ahapan berikutnya adalah pencucian dengan akuades agar sisasisa
arna yang menempel tidak sempurna bisa hilang. 'emudian perendaman dalam alkohol bertingkat. 3al ini bertujuan untuk mengurangi kemungkinan lunturnya arna, untuk menghilangkan kandungan air yang mungkin saja masih tersisa setelah proses pencucian dan mencegah hal lainnya yang tidak diinginkan ('hasim, ))#. Earutan yang dipakai dalam praktikum metode parafin yaitu 526, sebagai larutan fiksatif. Brgan ginjal ayam difiksasi dalam larutan 526 selama 9 jam, kemudian dilanjutkan dengan tahap dehidrasi dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat mulai dari -)1, 0)1, !/1 dan 7))1 masingmasing selama 9" menit, dilanjutkan dengan tahap clearing dengan menggunakan larutan campuran alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#, alkohol+7ylol (+#, dua kali 7ylol murni masingmasing selama ) menit. Setelah tahap clearing yaitu tahap infiltrasi dengan larutan campuran 7ylol+paraffin (+#, 7ylol+paraffin (+#, 7ylol+paraffin (+# masing selama ) menit, kemudian dua kali dalam paraffin murni masingmasing selama jam (%ellman dan 2ron, !!#. 8enurut 8untiha ())#, jaringan direndam dalam larutan 526 )1, yang berfungsi sebagai bahan pengaet agar terhindar dari pencernaan jaringan oleh en@imen@im (otolisis# atau bakteri dan untuk melindungi struktur fisik sel. 2ahan pengaet yang rutin digunakan adalah larutan Neutral Buffered Formalin (526# )1 dengan p3 berkisar antara /," F -,". p3 ideal adalah -,). *gar fiksasi jaringan dengan larutan tersebut berlangsung sempurna, maka perbandingan antara organ dan larutan yaitu +), sedangkan lamanya fiksasi minimal 9 jam. 4ahap pearnaan jaringan hean dalam praktikum menggunakan pearna haemato7ylineosin yang diaali dengan tahap deparafinisasi menggunakan larutan 7ylol dua kali masingmasing selama menit. Earutan yang digunakan dalam rehidrasi yaitu alkohol 7))1, !/1, 0)1, -)1, akuades masingmasing ) celupan selama ) detik, kemudian direndam dengan larutan haemato7ylin " menit. Earutan untuk dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai dari -)1, !)1 dan 7))1 masingmasing selama ) celupan ) detik, kemudian tahap clearing menggunakan larutan 7ylol dua kali masingmasing selama menit. 4eknik pearnaan terbaru yang digunakan untuk mengevaluasi jaringan secara histologis yaitu 8assons trichrome dan hemato7ylin eosin protokol. 4eknik tersebut lebih efektif dalam mengidentifikasi sel dan struktur jaringan daripada teknik yang telah berkembang sebelumnya (2et@ et al., )#.
8enurut 'urniaati ()9#, pemrosesan dan pearnaan jaringan diaali dengan fiksasi kemudian diikuti dengan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat sebelum dilakukan embedding dalam parafin. >aringan dipotong sebesar " Hm selanjutnya diproses dengan pearnaan umum haemato7ylin eosin (3D#. Pearnaan umum 3D dilakukan untuk mengetahui morfologi umum jaringan ginjal. 3asil penelitiannya menunjukan baha morfologi umum pada jaringan ginjal tikus kelompok kontrol negatif yang diarnai dengan 3D menunjukkan inti sel tubuli renalis mengambil arna basofilik, sedangkan bagian sitoplasmanya mengambil arna asidofilik. 2erdasarkan hasil praktikum, preparat histologi ginjal ayam tampak jelas, namun yang terlihat hanya bagian sel asinus yang berfungsi untuk menghasilkan en@im pencernaan.
I0 KESIMPU,AN DAN SARAN 60! Kesim*1lan
2erdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan baha+ . Prosedur kerja pembuatan preparat organ ginjal ayam dengan metode parafin yaitu fiksasi, pencucuian (washing #, dehidrasi, penjernihan (clearing #, infiltrasi parafin, penanaman (embedding #, pengirisan ( sectioning #, penempelan (afi#ing #, deparafinisasi, pearnaan ( staining #, penutupan (mounting #, dan labelling. . Preparat organ ginjal ayam yang dihasilkan dengan metode parafin dan pearnaan hematoksilineosin menjadikan struktur organ ginjal ayam terarnai merah dan yang terlihat adalah bagian sel asinus.
60% Saran
Sebaiknya dalam melaksanakan praktikum, alatalatnya ditambah supaya lebih efektif dalam pelaksanaannya.
DAFTAR REFERENSI
2et@, %. 3., Dpperson, ?. 4. 2rian, 8. 3., and ?oy %. 2. ). * ne trichrome techniCue for P88* embedded percutaneous implants for the study and characteri@ation of epithelial integration. %ournal of istotechnology. " (9# + /9-). %ellman 3. % and 2ron D. !!. Buku &eks istologi 'eteriner (( dan ((( . Penerbit Aniversitas akarta. Ganong W.6. !!". Buku )jar Fisiologi *edokteran (?evie of 8edical Physiology. Ddisi 9. *lih 2ahasa + *drianto P. DG=. >akarta. Green, >. 3. ))!. +engantar Fisiologi &ubuh "anusia. %i terjemahkan oleh %r. 3. 8. %jauhari Widjadjakusuma. Penerbit 2inarupa *ksara+ 4angerang. 3offbrand, *.$. !!/. Essential aemotology. 2lackell Scientific Publications. Penerbit 2uku 'edokteran DG=, >akarta. >unCuera E.=, =arneiro >, dan ?obert B.'. !!0. istologi asar. Dd ke0. Penerbit 2uku 'edokteran 3ean. >akarta. 'hasim, S.8. )). *nimal "icrotechni-ue +rinciples and +ractice. =apital Publishing =ompany, 5e %elhi. 'imball. !!). Biologi. Drlangga+ >akarta 'urniaan, W. )). +embuatan /ediaan (risan %aringan ewan engan "etode +arafin. Aniversitas Eambung 8angkurat, 2anjarbaru. 'urniaati, 8., =hanif 8., and *ulanniam *. )9. 4he Dffect of >uice 8angosteen ?ind (Garcinia "angostana 0.# to 2lood Sugar Eevels and 3istological of Pancreatic ?ats With 4he aringan 3ean dengan Pearnaan 3ematoksilin dan Dosin (3&D#. &emu &eknis Fungsional Non +eneliti, 2ogor. 5urliani, *. ))-. +etunjuk +raktikum &eknik 0aboratorium. %epartemen Pendidikan 5asional Aniversitas Eambung 8angkurat. ?oss, 8.3., E.> ?omell and G.< 'aye. !!". istology. * 4e7t and *tlas 4hird Ddition. Williams and Wilkins. * Waerly =ompany, AS*. Price, S. * and E. 8 Wilson, !!". +atofisiologi konsep klinis edisi 2. *lih bahasa peter anugerah. >akarta+ DG
Schichnes %., >.*. 5emson, and S.D. ?u@in. ))". 8icroave Protocol 4echniCues for Plant and *nimal Paraffin 8icrotechniCues. &he 3niversity of !alifornia at Berkeley, !N1 Biological (maging Facility. ")". Suntoro, S.3. !0. "etode +ewarnaan. 2hatara 'arya *ksara, >akarta. Weather, P.?., 3.G. 2urkitt, and $.G %aniels. !-!. 6unctional 3istology. Eong Group Eimited, Eondon.
