Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Farmacia y Bioquímica E. A. P. Farmacia y Bioquímica 5to año - Noveno Semestre e!artamento Acad"mico de Farmacolo#ía$ Bromatolo#ía y %o&icolo#ía '(tedra de %o&icolo#ía y )uímica *e#al
Práctica N°8: Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos +N%E,AN%ES
Práctica 8
Benito Navarro, Aldo !"#$###!% &o'a ()ima*++ro, -ri !"#$##.!% /+aman Fiestas, (+san Andrea !"#$##.0% 1ac)aca 2ictorio, 1erritt Br'an !"#$##3!% 4odr5g+e6 7ervantes, ilian ##.88$"9%
P/FES/ E *A P0'%+'A P0'%+'A 1g ;os< Al=onso A>esteg+5a ?F ;os< la)+illa ?+ea
FE'1A E *A P0'%+'A 0#@#0@!9 !# am0:## >m INTRODUCCIÓN
Práctica N° 8
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos En consonancia con el desarrollo industrial y técnico crece el número de estas sustancias químicas. Incluye este grupo los derivados de la destilación del petróleo y mucos idrocar!uros saturados" no saturados y aromáticos# alcool metílico y etílico" éter" $ormol" idrato de cloral y acetona# aminas aromáticas constituyentes de las anilinas# derivados clorados de los idrocar!uros aromáticos utili%ados como insecticidas y com!inaciones orgánicas del $ós$oro# salicilatos" aspirina y $enacetina" tam!ién derivados de idrocar!uros aromáticos# disolventes de grasas" como el sul$uro y tetracloruro de car!ono# cloro$ormo y los cloruros y !romuros de metilo# !ar!itúricos# alcaloides o!tenidos de plantas como mor&na" codeína" cocaína" atropina"
papaverina"
curare" estricnina" nicotina"
quinina"
aconitina" ergotamina" etc. 'oy en día las drogas de a!uso an pasado a ser de un pro!lema glo!al que a$ecta a mucos países" o!ligando a las naciones a intensi&car sus es$uer%os por el control y regulación de algunas drogas" es por ello que como $uturos investigadores en el presente in$orme vamos a identi&car los principales meta!olitos producto de la !iotrans$ormación de sustancias tó(icas presentes en los )uidos y te*idos corporal. Para la identi&cación de estas sustancias previamente es necesario reali%ar una e(tracción en un disolvente orgánico ya sea en medio ácido o alcalino de modo que nos permita e(traer la mayor cantidad y pure%a de estos tó(icos. +entro de estos compuestos vamos a poder encontrar sustancias como las !en%odiacepinas" car!amacepina" $enotia%inas" an$etaminas" antidepresivos tricíclicos" alcaloides" plaguicidas organo$os$orados" !ar!itúricos" salicilatos y otros analgésicos antipiréticos que ayan sido empleados como sustancias de a!uso por el paciente. +entro
de
estos
compuestos
se
encuentran,
-en%odiacepinas"
car!amacepina" $enotia%inas" !utiro$enonas" canna!inoles" an$etaminas" antidepresivos tricíclicos" cocaína" estricnina" opiáceos" otros alcaloides y los principales meta!olitos de todos ellos. Plaguicidas organo$os$orados" plaguicidas
organoclorados
y
piretriodes.
umarinas"
plaguicidas
car!ámicos" glutetimida" idantoinas" mepro!amato" !ar!itúricos" salicilatos y otros analgésicos antipiréticos y los principales meta!olitos de todos ellos.
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Práctica N° 8
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos
MARCO TEÓRICO 0a investigación to(icológica es el con*unto de procesos analíticos que tiene por o!*eto el aislamiento" identi&cación y determinación cuantitativa de los tó(icos" tanto en el vivo como en el cadáver" con el &n de permitir el diagnóstico de la into(icación. 123 4odos los $ármacos entran en esta categoría" así como las drogas de a!uso" los plaguicidas y una gran cantidad de sustancias utili%adas en síntesis químicas y en industria alimentaria. +e las into(icaciones con $ármacos" la que involucran a los psico$ármacos son las más $recuentes" aunque tam!ién son $recuentes las into(icaciones con aspirina y paracetamol. 0a mayoría de las veces" la investigación de la presencia de estos compuestos en casos de sospeca de into(icación" requiere de la aplicación de dos tipos de métodos, a3 5étodos de aislamiento que separan al compuesto del resto de los componentes de la muestra. !3 5étodos de identi&cación 1y" en algunos casos" de cuanti&cación3. +esde el punto de vista analítico" los tó(icos se dividen en,
4ó(icos volátiles 4ó(icos gaseosos 4ó(icos orgánicos &*os o e(traí!les 4ó(icos inorgánicos o minerales
Analtica de los tóxicos no !olátiles o Tóxicos Orgánicos Fijos 1/3 -a*o la denominación de 4ó(icos 6rgánicos 7i*os 14673 o no volátiles se incluye una gran variedad de sustancias orgánicas" de interés to(icológico" que no pueden aislarse por destilación de las matrices que los contienen" sino que de!e recurrirse a la acción de disolventes orgánicos 1en medio ácido o alcalino3 para su separación y posterior identi&cación. 0a mayoría de estos tó(icos su$ren de pro$undos cam!ios meta!ólicos en el organismo y" en consecuencia" pueden aparecer en los )uidos o te*idos en su $orma UNMSM / FFYB / CÁTEDRA DE TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos original o como productos de !iotrans$ormación 1meta!olitos3" li!res o con*ugados con di$erentes compuestos 1ácido glucurónico" sul$atos" aminoácidos" etc.3. 0as propiedades &sicoquímicas del to(ico y sus meta!olitos pueden ser muy distintas" a veces incluso entre los meta!olitos de un mismo compuesto. Ello determina una e(creción característica según los casos y la conveniencia de reali%ar la investigación en una u otra matri% 1orina" sangre" !ilis" etc.3 7recuentemente la especie que será anali%ada está presente en un te*ido o un )uido !iológico" unido a proteínas u otros constituyentes celulares. En este caso" puede ser necesario separar el to(ico 1el compuesto madre de sus meta!olitos3 del resto del componente de la matri%" de modo de o!tenerlo en cantidad y pure%a su&cientes para permitir su identi&cación y cuanti&cación. 9olo recientemente an surgido métodos disponi!les que permiten la medida directa de algunos analitos sin la separación previa de su matri%. El analista to(icológico a e(perimentado un crecimiento paulatino en el número de técnicas a su disposición. En la actualidad la clásica metodología convencional a sido reempla%ada por la introducción de método instrumentales más so&sticados" de gran sensi!ilidad y precisión" pero cuyo costo elevado limita su disponi!ilidad en la mayoría de los la!oratorios de nuestro medio. 0os 467 tienen en común el uso de metodología similares para su aislamiento" caracteri%ación y cuanti&cación.
INMUNOEN"A#O"$
E(isten
en
el
comercio
numerosos
tipos
de
inmunoensayos con aplicaciones en 4o(icología. En su mayoría están dise:ados para el análisis de muestras líquidas" como orina" agua y suero de!ido a que estas matrices presentan poca cantidad de inter$erencias. Estas muestras se emplean en $orma directa" evitando por lo tanto el paso previo de e(tracción aislamiento de los analitos y logrando una reducción importantísima en el tiempo de o!tención de los resultados 12; minutos < 2 ora3. 0os inmunoensayos se !asan en la reacción especi&ca que se produce cuando un antígeno se en$renta con un anticuerpo. 0a técnica tradicional consiste en me%clar un volumen de muestra conteniendo la droga a ensayar" con una cantidad &*a de un anticuerpo especí&co 1monoclonal o policlonal3" y una cantidad &*a de la misma droga marcada sintéticamente con un radioisótopo" una en%ima activa o una sustancia )uorescente. +e este modo se esta!lece una competencia entre la droga UNMSM / FFYB / CÁTEDRA DE TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL
=
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos marcada 1+roga>3 y la presente en la muestra 1+roga3 por los sitios de unión del anticuerpo. En $orma simple se esquemati%a esta competencia,
Droga% & Droga & Antic'er(o ))))))))))))))))* Droga%)Antic'er(o & Droga)Antic'er(o 0a pro!a!ilidad de que una molécula marcada o sin marcar se una al anticuerpo depende de su concentración. 9e requieren instrumentos capaces de evaluar el punto &nal de la reacción y comparar la respuesta del test contra estándares conocidos. +e acuerdo al tipo de marca es el método analítico de medida empleado. En algunos casos no puede di$erenciarse :a se:al producida por la droga marcada unida al anticuerpo y la droga marcada li!re" siendo necesario separarlas antes de e$ectuar la medida. Estos ensayos se conocen como eterogéneos" e involucran principalmente a los radioinmunoensayos. uando esta separación no es necesaria" porque la se:al producida por la droga marcada se di$erencia si está li!re o unida" el ensayo se llama eterogéneo.
T+CNICA" CROMATO,RAF-A"$ 0a !úsqueda de 467 mediante técnicas cromatogra$ías" como 40 1romatogra$ía en capa &na3" 'P40" 'P0" ?" etc. 9e caracteri%a porque antes de aplicarles es necesario separar las drogas de la matri% en la que se encuentran inmersas mediante alguna técnica de e(tracción. En la práctica esto se logra siguiendo una serie de pasos" como los que se descri!en a continuación. Preparación de la muestra: es un paso crucial en los análisis. Involucra la
omogeni%ación de la muestra" a*ustes de p'" pesa*e" procedimientos de idrólisis 1ácida" !ásica o en%imática3" precipitación" centri$ugación" etc. +e modo tal que se $acilite el aislamiento de la sustancia de interés. Aislamiento del analito: se puede llevar a ca!o mediante e(tracción líquido@
liquido 1en tu!os" en ampollas de decantación o en columnas de tierra de diatomeas3 o e(tracción en $ase sólida 1columnas de 9PE3 de acuerdo a las disponi!ilidades del la!oratorio. En este paso se mueve el analito de su matri% original para o!tenerlo en la mayor concentración posi!le" esta!ili%arlo 1ya que en su matri% original puede degradarse química o en%imáticamente3 y eliminar inter$erencias. Concentración del extracto: el o!*etivo de este paso es colocar el analito en
el menor volumen posi!le para aumentar la sensi!ilidad del análisis. 9e UNMSM / FFYB / CÁTEDRA DE TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL
A
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos de!en usar condiciones controladas" idealmente una temperatura menor de =;B y corriente de nitrógeno. +urante las operaciones antes mencionadas se de!e tener sumo cuidado para evitar pérdidas por volatili%ación" o(idación o a!sorción en los precipitados" ya que $recuentemente los productos a identi&car están presentes en cantidades menores del gC ml. 0as pérdidas por volatili%ación de sustancias !ásicas como an$etaminas pueden prevenirse cuidando la temperatura y sali&cando el e(tracto con ácido clorídrico al 2 D en metanol. Identifcación del analito: e(isten di$erentes niveles de comple*idad
dependiendo de las técnicas que se utilicen para su identi&cación. sí e(iste un nivel primario que utili%a técnicas como romatogra$ía en apa +elgada 1403" Espectro$otometría FG" además de reacciones de coloración para la orientación" etc. Fn nivel secundario involucra técnicas tales como la romatogra$ía de ?ases 1?3 y la 0íquida de lta Hesolución 1'P03 tanto para 9creening como para la determinación de una droga en particular y un nivel terciario que utili%a la Espectrometría de 5asas acoplada a un a romatogra$ía separativa como la de ?ases o 0íquida de lta Hesolución 1?C59 o 'P0C593. Cuantifcación del analito: una ve% identi&cado el analito la cuanti&cación
del mismo se puede reali%ar por una técnica directa" !ien a*ustada y utili%ando patrones de re$erencia puros para análisis. Esta técnica directa generalmente es una técnica cromatográ&ca gas@líquido o líquido@líquido y la espectrometría acoplada a estas dos anteriores. ada uno de estos pasos merece un capítulo aparte dentro de la 4o(icología. Por ende" sólo se pretende citar sus características principales aciendo incapié en los detalles técnicos más relevantes. 13
O./ETI0O"
9eparar los di$erentes compuestos orgánicos que se encuentren en la muestra pro!lema utili%ando el método de urry.
MATERIA1E" # REACTI0O" •
HE4IG69 loro$ormo 'idró(ido de monio cido lorídrico concentrado
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J
Práctica N° 8
Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos •
'idró(ido de 9odio /"A D Na'6 AD
54EHI0E9 Pera de +ecantación /A; m0 Pro!etas graduadas A; m0 Papel indicador p' -eaKer de 2;; m0 Pipetas graduadas A < 2; m0 Em!udo de Gidrio Pipetas pasteur
METODO1O,-A FUNDAMENTO 1=3 omo norma general" los tó(icos se e(traen con disolventes orgánicos. Entre los más $recuentes para una e(tracción general se encuentran, éter etílico" cloro$ormo" diclorometano" etc. En este proceso es $undamental el p' del medio en el que se reali%a la e(tracción" ya que el $undamento de la e(tracción liquido@liquido consiste en la di$erente solu!ilidad que cada sustancia tiene en agua yCo disolventes orgánicos en $unción del grado de disociación que su$re en $unción del p' del medio 1sin olvidar el e$ecto de la mayor o menor liposolu!ilidad de acuerdo al coe&ciente de partición3. 0os tó(icos en medio acuoso 1como es el caso de las muestras !iológicas3 se comportan como ácidos" !ases o sustancias neutras. El equili!rio $undamental de que acemos uso en la e(tracción con disolventes es el siguiente,
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L
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos 0as $ormas no ioni%adas son más solu!les en disolventes orgánicos. Por tanto" en cada caso tendremos que utili%ar el p' idóneo para que el tó(ico que !uscamos se encuentre mayoritariamente en $orma no ioni%ada.
En el
caso de los tó(icos ácidos" si consideramos un medio ácido" implica una elevada concentración de 'M" por lo que según el principio de 0e atelier" la reacción se despla%aría para compensar dico aumento acia la i%quierda" es decir" acia la $ormación de '" aumentando así la cantidad de ácido que está en $orma no ioni%ada. 0a $orma no ioni%ada es más solu!le en disolventes orgánicos que la ioni%ada. Por lo que concluimos que los ácidos se e(traen con disolventes orgánicos en medio ácido.
En el caso de los tó(icos !ásicos" si consideramos un medio alcalino" implica una elevada concentración de 6'@" por lo que según el principio de 0e atelier" la reacción se despla%aría acia la i%quierda para compensar ese aumento" es decir" acia la $ormación de -6' aumentando así la cantidad de !ase que está en $orma no ioni%ada. 0a $orma no ioni%ada es más solu!le en disolvente orgánico que la ioni%ada. Por lo que concluimos que las !ases se e(traen con disolvente orgánicos en medio alcalino.
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos
M+TODO DE CURR# A m0 ; 2;; g 1contenido, gástrico" J m0 de 4unsgtato de sodio al 2;D m0 de ácido sul$úrico /C N Am0 de agua destilada 2m0 de idró(ido de sodio al 2;D
-5 por 2A minutos
7iltrar en caliente 9ol.
E(traer con 2C gitar por minutos @rgano, 7os$orados lorados ar!ámicos @9alicilatos @-ar!itúricos 79E F69 @-en%odiacepinas @umarinas @9ul$as gregar N'=6' 2;D asta Evaporar a @+igitálicos sequedad @5ariuana 2; gts @4ó(icos, loro$ormo UNMSM / FFYB / CÁTEDRA DE TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL @cidos, 7uertes" +é!iles @4ó(icos neutros
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos
E(traer con 2C vol.Oter romatogra$í a
Hesiduo acuoso
9915e6', cetona3
79E E4OHE Evaporar a sequedad 2; gts loro$ormo
M+TODO DE
@lcaloides @ -en%odiacepina s
Evaporar a sequedad 2; gts loro$ormo CURR#
4o(. c. 7uertes 1473 4o(. c. +é!iles
4o(. lcalinos 143
Fase ac'osa M A; m0 Na'6 A D
M N'= p' "A M E(traer A; m0 l' gitar @AQ M A; m0 M agitar Q
M gts 'l p'
Eva orar
47
4+
M A m0 Na6' /"AD
4+
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2 ;
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Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos
H= 4
7enotia%ínicos -en%odiacepina
-i!liogra$ía
Eva orar
M m0 'l p' Eva or
H2 47 9alicilato
Eva orar H/ 4+
H 4N
2.7ernánde% H. 5arca 4o(icológica de Frgencia. 2st ed. 5endo%a , 0a!oratorio de 4o(icología del uerpo 5édico 7orense @ Poder Rudicial de 5endo%a# /;;L. /.amp!ell S. Penotia%ine +erivatives in Frine, 7alse Negative Hesults Tit te 7orrest olor 4est 17PN3" and a 5etod $or 4eir Elimination. lin em. 2JA 6ct# 2212;3, p. 2=@. .5isiuK U" Su%micKa 0" 5ielec S" Pu%anoTsKa@4arasieTic% '. E(amination o$ iron 1III3 and e(acyano$errate 1III3 ions as reagents$or te spectropotometric determination o$ proma%ine and pera%ine. cta Pol Parm. /;;2 Nov@+ec# A81J3, p. =/2@A. =.4rinder P. Hapid determination o$ salicylate in !iological )uids. -iocem R. 2A= Run# AL1/3, p. ;2@;.
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