Lab. Vegetal Rosas y Piñas

L A T E G E V A I G O L O N C ELKIN DAVID CAICEDO CAMACHO E T O I B 1610627

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DIEGO ARMANDO VIVIESCAS LOPEZ

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CULTIVO DE YEMAS Y MERISTEMOS, VIA ORGANOGENESIS DIRECTA. ESTABLECIMIENTO ESTABLECIMIENTO DE ROSAS Y PIÑAS PIÑ AS

OBJETIVOS

Dominar la etapa (I) o fase de establecimiento de rosas y piñas, vía organogénesis directa, mediante el cultivo de yemas y meristemos. Continuar adquiriendo abilidades en el traba!o de cultivo de te!idos, especialmente en siembra de material vegetal. RESUMEN

"n esta pr#ctica se establecieron cultivos de organogénesis directa, en el cual se escogieron las yemas y meristemos no desarrollados de los tallos de la rosa y el meristemo de la piña, y primordios foliares de piña luego de eso se sometieron a un proceso de desinfecci$n con tres soluciones, ipoclorito de sodio, alcool al %&' y soluci$n !abonosa, este ciclo de desinfecci$n se llevo a cabo en diferentes #reas de laboratorio desde #rea no estéril asta c#mara de flu!o laminar, ya desinfectados los eplantes, se realio la siembra en c#mara de flu!o laminar.

INTRODUCCION

*a organogénesis es un evento morfogenético que se caracteria por su desarrollo unipolar, en otras palabras, es la formaci$n de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, la organogénesis directa es la formaci$n directa de $rganos sobre la superficie del eplante cultivados intactos. "ste no requiere de la formaci$n de callos. "l establecimiento de los te!idos vegetales en las condiciones + in vitro vitro+ es una etapa decisiva, para obtener cultivos eitosos, es necesario seleccionar adecuadamente el eplante, el método de desinfecci$n, el medio de cultivo y mantener una asepsia total durante todo el proceso de etracci$n y siembra del eplante seleccionado así mismo

28 DE M MARZO DEL 2014

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deber#n seleccionarse adecuadamente las condiciones ambientales para el crecimiento de los mismos. "l traba!o en el cuarto de siembra deber# realiarse de forma r#pida y precisa. "n el momento de la siembra en los medios de cultivo se debe tener etremo cuidado y mantener las m#imas normas de asepsia que minimicen el riesgo de contaminaci$n por manipulaci$n.

MARCO TEORICO

*a organogénesis directa es la formaci$n de $rganos directamente del eplante si la necesidad de pasar por una fase de formaci$n de callos. *a organogénesis a sido la base fundamental de la multiplicaci$n vegetativa y dentro de ella pueden diferenciarse dos vías- la formaci$n de las yemas ailares y la formaci$n de yemas adventicias. •

ormaci$n de yemas ailares

"sta técnica se basa en la formaci$n de brotes a partir de las yemas que se encuentran en las ailas de las o!as o primordios de o!as, los cuales son divididos y subcultivados repetidamente. (/u y 0ang 1234). "ste método, a pesar de no ser el m#s r#pido, a sido el m#s utiliado para la propagaci$n comercial debido en primer lugar a la facilidad con que se a establecido en la mayoría de las especies y en el segundo lugar a la estabilidad genética de las plantes regeneradas siendo el sistema de regeneraci$n en el cual se reportan los menores índices de variaci$n genética. 5us desventa!as es que sus coeficientes de multiplicaci$n en comparaci$n con otros sistemas de regeneraci$n es muy ba!o, y escasa automatiaci$n del procesos productivo. •

ormaci$n de yemas adventicias

"s la formaci$n de 6ovo de yemas a partir de meristemos preeistentes o te!ido no meristematico, las cuales se originan de una o de un pequeño grupo de células, cuando se cultivan los eplantes en medios con concentraciones elevadas de citoquininas. Con esta técnica es posible producir un mayor n7mero de platas por unidad de tiempo en comparaci$n con el método de yemas ailares y a la ve presenta mayores


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posibilidades de mecaniaci$n8automatiaci$n, eistiendo ya varios e!emplos de bioreactores para su producci$n.

MATERIALES "sta pr#ctica fue realiada en el laboratorio de 9iotecnología vegetal de la :niversidad rancisco de ;aula 5antander sede Campos "líseos en donde se tuvo como ob!etivo, lograr el establecimiento de rosa y piña a partir del cultivo in vitro de yemas y meristemos, respectivamente. Materiales      

gua destilada estéril rascos de vidrio

Reacti!s  

>lcool %&' /ipoclorito de sodio 4'

E"#i$!s 

C#mara de flu!o laminar oriontal


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METODOLOGIA

%ASE PREPARATIVA

1. 5e escoger#n las yemas de rosa y se separan los segmentos con yemas ailares, con la ayuda de ti!eras o escalpelo. 5umergir en soluci$n antioidante. 1a. 5e limpian y reba!an los cogollos de piña con la ayuda de escalpelo y cucillo de cocina. ?. a. b. c.

5e preparan las soluciones desinfectantes- (c@u en un frasco de vidrio) 5oluci$n !abonosa >lcool al %&' /ipoclorito de sodio al 4'

4. 5e realio el proceso de desinfecci$n;ara las yemas de rosas•

5e sometieron a A min en una soluci$n !abonosa, seguido de 4 en!uagues con agua destilada estéril luego de ello, las yemas se llevaron al #rea estéril donde se sumergi$ durante A min en la soluci$n de alcool al %&', seguido de en!uague 4 veces con agua destilada estéril, y por 7ltimo se sumergi$ en ipoclorito de sodio al 4' durante 3 min. "sto se llevo a la cabina de flu!o laminar donde se en!uago 4 veces nuevamente las yemas para su debida desinfecci$n. •

;ara las yemas de piña-

5e sometieron a A min en soluci$n !abonosa, y se en!uagaron 4 veces con agua destilada estéril. 5e llevaron al #rea estéril y se sumergi$ en soluci$n de alcool al %&' durante A min, se en!uago con agua destilada estéril 4 veces. 5eguidamente se sumergi$ en soluci$n de ipoclorito de sodio al %& ' durante B min, por 7ltimo se pasaron a la cabina de flu!o laminar y se en!uago 4 veces con agua destilada estéril.


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%ASE DE ESTABLECIMIENTO

:na ve terminado la fase de desinfecci$n de los eplantes se procedi$ a entrar al #rea donde se encuentra la cabina de flu!o laminar, antes de entrar allí fue necesario lavar de nuevo las manos y los antebraos y utiliar una bata que previamente fue esteriliada.
*uego de aber realiado la siembra de cada yema en los respectivos medios, cierre los frascos, salga de la cabina. 5elle con envoplast y rotule cada frasco ubique en el cuarto de crecimiento con las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo del eplante.

"*I6 *>5 <5 =" *>5 DI >*"E>6DF> ;6G> D" 655


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CUESTIONARIO

&. Cu#les son las condiciones ambientales que deben ser reguladas para el crecimiento de los eplantes sembradosH Detalle en qué condiciones quedaron creciendo los eplantes que usted sembr$.

="DI D" C:* menudo se denomina =edio 9asal y puede ser suplementado con alg7n regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias. *os nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta- sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo.
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J "l valor del p/ del medio puede afectar al p/ del citoplasma y como consecuencia a la actividad de mucos enimas. *> <"=;"F><:F> *a temperatura a la que est# epuesto el eplante cultivado in vitro afecta a la mayoría de procesos fisiol$gicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar. "n general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que se produce el crecimiento $ptimo. "ste intervalo puede variar en funci$n del genotipo, del $rgano del que se a obtenido el eplante, de la época del año, de la edad de la planta madre, del fotoperíodo, etc. :na complicaci$n adicional se produce por el eco de que puede eistir interacci$n entre la temperatura $ptima de crecimiento y otros factores como la lu, la composici$n del medio. Determinar la temperatura $ptima de crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un proceso muy laborioso que, adem#s, eige gran cantidad de c#maras de cultivo reguladas de forma diferente. >fortunadamente, y para la mayoría de situaciones, se pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubaci$n que oscilan entre los ?& y ?3&C. *> *:K *a lu, definida como una forma de energía radiante que se nos manifiesta mediante la visi$n es, en realidad, parte de un fen$meno físico m#s amplio- la energía radiante (radiaci$n), que puede ser descrito seg7n dos modelos diferentes- el modelo ondulatorio (radiaci$n electromagnética) y el modelo corpuscular. Como quiera que s$lo una parte de la energía radiante (la lu y algunas de las radiaciones infrarro!as y ultravioletas pr$imas) tiene influencia conocida sobre el desarrollo de las plantas, a veces, se usa el término lu para referirse a ese con!unto de radiaciones cuando en realidad se refiere al con!unto de radiaciones electromagnéticas con efectos fisiol$gicos. *a lu es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos aut$trofos, en ello radica la importancia de controlar el factor lu en los cultivos in vitro. Del proceso de desinfecci$n depende el éito de la producci$n de callos. 5ueles suceder que con las altas técnicas de asepsia, se logra retirar de los cortes la capa de contaminaci$n que presenta el material vegetal luego el interior que queda esta libre de pat$genos, que brind#ndoles las condiciones adecuadas dan origen a una pl#ntula.

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"s importante eliminar cualquier pat$geno presente en el eplante porque el crecimiento de bacterias y ongos, disminuye el crecimiento de te!idos vegetales o pueden producir toinas que afecten el desarrollo normal. Debemos tener en cuenta los tiempos en los que los eplantes deben permanecer en cada soluci$n desinfectante pues si los eplantes permanecen m#s tiempo del establecido en las soluciones desinfectantes, podría causar a los eplantes la muerte de los meristemos. '. LMué tipo de crecimiento debe esperarse de acuerdo al eplante usado y a la composici$n del medio de cultivoH (señale la composici$n del medio utiliado).que factores podrían afectar ese crecimientoH "plique su respuesta.

De acuerdo al eplante se debe esperar la formaci$n de tallos. *os factores que afectan el crecimiento sonJ Contaminaci$n del medio J Contaminaci$n end$gena Contaminaci$n e$gena J "l tamaño del eplante J "l origen del eplante. J =al mane!o del protocolo de desinfecci$n. =al mane!o de la cabina de flu!o laminar a la ora de la siembra.

(. proponga y elabore un esquema o diagrama con todo el proceso de micropropagacion de rosas, a partir de yemas ailares. "specifique, por separado, medios de cultivo, métodos de desinfecci$n, condiciones ambientales de crecimiento y otros factores que considere de interés particular, en cada fase de la propagaci$n masiva

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1. >5" &- ;F";>F>CIN6 D" *> ;*>6<> D6D" 5" F">*IK>F> *> =:"5 "s de gran importancia mantener a las plantas madre en un período de tiempo, en un invernadero, en condiciones $ptimas. 5e toman las partes m#s !$venes de la planta los cuales van acer utiliados como eplantes. 5e separan las yemas ailares y se sumergen en soluci$n antioidante.

?.

>5" I- "5<>9*"CI=I"6< D"* C:*
Después de la desinfecci$n de las yemas, se lavan con agua y !ab$n , se sumergen en una soluci$n de ipoclorito de sodio, a una concentraci$n final del 1', ba!o la acci$n de una bomba de vacío por 1A min, se llevan a la c#mara de flu!o laminar donde se lavan tres veces con agua destilada estéril. "l material así preparado se corta en segmentos de 1 cm aproimadamente, los cuales se sumergieron r#pidamente en una soluci$n de alcool al %&' y luego se sembraron en el medio de cultivo.

4.

>5" II- =:*CIN6 D" *5 9F<"5

(=edio de cultivo);ara la determinaci$n del medio nutritivo adecuado en el establecimiento del cultivo se realian pruebas usando las sales =:F>5/IG" y 5G (=5), suplementadas con tiamina &,O mg@l, mioinositol 1&& mg@l, sacarosa (4& g@l). >sí mismo se puede probar diferentes combinaciones de sustancias de crecimiento (benciladenina 9>, #cido naftalenoacético >6>, #cido ?,O diclorofenoiacético ?,O8D). ;ara el desarrollo de los brotes se emple$ el medio =5 suplementado con combinaciones de 9> y >6>.

O.

>5" III- "*"CCIN6 D" :6 ="DI D" "6F>IK>=I"6<

"n la etapa de enraiamiento se utiliaron medios libres de sustancias de crecimiento con sacarosa ?& y 4& g@l. ;ara el crecimiento de los brotes, los cultivos se llevaron a

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medio fresco y la incubaci$n fue realiada ba!o lu continua (A&&& lu) a temperatura controlada de ?% P 1QC.

A.

>5" I- >C*I=><>CIN6 D" *5 "R;*>6<"5 "6F>IK>D5

*a aclimataci$n en condiciones de vivero se realia utiliando como sustrato una mecla de suelo y turba en una proporci$n 1-1 y abonada con un fertiliante comercial para buscar una buena adaptaci$n a campo.

DISCUSIONES

"n ésta pr#ctica se pudo aplicar el conocimiento adquirido en una pr#ctica anterior, donde se obtuvieron los meristemos de rosa y piña para esta pr#ctica, los meristemos ya se traían epuestos desde casa ocasionando así un primer punto para la contaminaci$n- ya que el meristemo era epuesto al medio ambiente. 5iendo los brotes, el resultado a obtener de este cultivo, se presume que entre los componentes del medio se allara alguna auina y citocinina, en mayor concentraci$n esta 7ltima pues por ser el eplante un meristemo, ya tiene una carga previa de la primera. "n algunos frascos de rosa se dio gran crecimiento, mientras que en los meristemos de piña no se observo crecimiento solo muca contaminaci$n y fenoliacion esto puede atribuirse a cortes mal realiados.

CONCLUSIONES

Del presente informe se puede concluir que la piña es una especie relativamente de difícil obtenci$n de brotes y muy f#cil contaminaci$n esto es debido a la ineperiencia del uso del laboratorio como tal, y a mucos errores cometidos durante sus procesos de siembra. =ientras que la de rosa se puede concluir que es una especie m#s f#cil de obtener pero de igual facilidad de contaminaci$n esto se debe a lo anterior mencionado con la piña.

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BIBLIOGRA%IA

>C:*<>D D" CI"6CI>5 "R>C<>5, 6><:F>*"5 S >GFI="65:F> ttp-@@ea.unne.edu.ar@[email protected]@>uinasgiberelinasycitocininas.pdf

ANE)OS

E)PLANTES PRIMERA SEMANA %!t!

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E)PLANTES SEGUNDA SEMANA %!t!

E)PLANTES TERCERA SEMANA %!t!

E)PLANTES CUARTA SEMANA %!t!

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