UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGIA INFORME DE LABORATORIO N 0 7 SEMESTRE: I-2009 FECHA DE ENTREGA: 19 /06/09 DOCENTE: FLORES RIOS ABRAHAM AUXILIAR: SERRANO GARCIA ROSA ESTUDIANTE: AYALA CANO ALEXANDRA TÍTULO DE LA PRÁCTICA: INVESTIGACION SALMONELLA 1
OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL y Conocer la técnica más común en alimentos para le detección de salmonella. OBJETIVOS ESPECIFICOS y Observar cuales son las características que presentan los medios selectivos: XLD, VBA y HE, tras su inoculación con Salmonella. Determinar por métodos confirmativos la presencia de Salmonella en caso de presentarse crecimiento de colonias típicas en los distintos medios, mediante la serie bioquímica (en TSI, LIA, MIO y CS), y la prueba del reactivo de Kovacs. Conocer las reacciones características que presenta la Salmonella en TSI, LIA, MIO y CS, para su posterior comparación con la serie bioquímica correspondiente a la colonia sospechosa de la muestra a ser analizada. Determinar si la colonia sospechosa de Salmonella es indol + o -. 2 INTRODUCCION En esta práctica se busco realizar el aislamiento e identificación de las bacterias del género Salmonella utilizando, varias etapas: Preenriquecimiento en medio liquido no selectivo. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas. La finalidad de cada etapa fue la de: Preenriquecimiento en medio liquido no selectivo. En la etapa de preenriquecimiento no selectivo se logra la revivificación de las Salmonella lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo. El medio de elección fue el agua de peptona tamponada que, al mantener un pH constante, favorece el desarrollo de las Salmonella. Por otra otra parte, la peptona peptona y los fosfatos revitaliz revitalizan an al germen. germen. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos. En la etapa de enriquecimiento selectivo, se estimula y favorece el crecimiento de las Salmonella y se restringe la proliferación de la flora competitiva: Los caldos seleccionados son: En el medio selectivo caldo tetraionato-bilis-verde brillante (Müller Kauffmann), el tetraionato inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias intestinales. La bilis, por su parte, estimula el crecimiento de las Salmonellas e inhibe el de la flora competitiva. El verde brillante impide el desarrollo de la flora grampositiva y el carbonato cálcico actúa de tampón para mantener el pH. La recuperación óptima de las Salmonellas se obtiene entre los 42-43 rC. En el medio selectivo RVS, el verde malaquita inhibe el crecimiento de la flora competitiva, pero no el de las Salmonella. Los fosfatos monopotasicos y dipotasicos mantienen inalterable el valor del pH durante el almacenamiento del medio. La concentración de cloruro magnésico es óptima para lograr un buen enriquecimiento del caldo y favorecer el desarrollo de las Salmonellas.. La recuperación óptima de Salmonellas d e las Salmonellas en el medio Rappaport-Vassiliadis se obtiene a 42 rC. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos. En esta etapa se restringe, aun más, el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de las Salmonella Salmonella.. Por otra parte, la composición de los distintos medios permite el crecimiento de colonias con aspecto característico en cada uno de ellos: VBA es un excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella Salmonella;; pero no puede usarse para aislar S. Typhi. Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso. El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S . Typhi y Shigella Shigella.. Las colonias típicas de Salmonella son incoloras y el medio que las rodea es de color fuxia. fuxia. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar XLD son rojas con centros negros debido a un cambio de pH por fermentación de la xilosa y descarboxilacion de la lisina. Los centros negros se deben a la producción de SH 2. A veces no se forman centros negros o, por el contrario, las colonias son negras casi por completo. Las colonias de Salmonella crecidas sobre agar HE son verde azuladas, con centro negro o sin él. En este medio, las sales biliares inhiben el crecimiento de la flora competitiva. En la fórmula del medio hay dos indicadores: azul de bromotimol y fuchina -
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acida que, según actúen, sirven para diferenciar las colonias l actosa-posit ivas y lactosa-negativas. La combinación del tiosulfato sódico con el citrato de hierro hace que se manifieste un color negro en las colonias productoras de SH 2. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas. Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre TSI: Alcalina (rojo) en la superficie inclinada. Acida (amarillo) en el fondo. Con o sin producción de SH 2 (ennegrecimiento o no del medio). Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre LIA: Alcalina (rojo) en el fondo del tubo. Producción de SH2 (ennegrecimiento del medio). Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre MIO: Puede presentarse: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. Las Salmonella dan la siguiente reacción sobre CS: Pueden presentarse: Resultado Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. Resultado Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. 3 FUNDAMENTO TEORICO Salmonella es un género bacteriano, perteneciente a la familia E nterobacteriaceae integrado por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, habitualmente móviles mediante flagelos peritricos, aunque existen mutantes inmóviles. El serotipo pollurumgallinarum es siempre inmóvil. Gramnegativos, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas. No fermentan la lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo-oxidasa negativos. Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas defini das. Prevención y control de la Salmonella. Se puede afirmar que todos los productos crudos de origen animal y el ambiente en que se preparan, pueden estar contaminados con Salmonella. De aquí que los alimentos que con mas frecuencia dan lugar a casos de salmonelosis son: carnes y productos cárnicos, algunos productos de charcutería, carnes de aves y subproductos, huevos y ovoproductos, leche y productos derivados de la leche. Puesto que a veces un bajo número de salmonella (por ejemplo inferior a 100 germenes por gramo) puede ser causa de enfermedad, lo más importante es asegurar su ausencia en los alimentos listos para el consumo. El mayor control se requiere en los siguientes pasos: Etapa del sacrificio de los animales que proporcionan alimentos de consumo humano. Prevención para evitar que contaminen los productos terminados. Almacenamiento de los alimentos a baja o altas temperaturas, según los casos. Los animales cuyas carnes se destinan al consumo humano, sobre todo terneros, cerdos y aves considerados sanos, son portadores de Salmonella en una tasa que oscila entre el 20-30 %. Este microorganismo se aloja en el contenido intestinal y ganglios mesentéricos de los animales de abasto. Su presencia en los alimentos de origen animal se debe a: La existencia de portadores sanos en rebaños y gallineros. La infección de animal a animal es posible cuando existe un contacto muy directo y poca higiene. La ruta fecal oral se produce a través de heces, alimentos o agua contaminados. La utilización de piensos contaminados con Salmonella. Estos productos son una fuente de infección muy importante, permaneciendo en ellos muchos serovares de Salmonella, principalmente los que tienen como fuente proteínas animales. La contaminación ambiental con Salmonella en mataderos y aguas residuales. La maquinaria, el ambiente y las aguas residuales de los mataderos son proclives a la presencia de este microorganismo. La contaminación a través de roedores e insectos. La contaminación a partir del hombre. Se produce principalmente como consecuencia de la falta de higiene de los operarios y/o sus malas manipulaciones. La transmisión de salmonella se realiza, en este caso, a través de manos, ropa y calzados contaminados. Las operaciones de preparaci ón de canales conducen a problemas de contaminación cruzada. Los métodos de control de Salmonella, bien sea en la industria, en el comercio, en la restauración o en el hogar, son numerosos y se basan, esencialmente, en: Prevenir la entrada del germen a través de materiales crudos contaminados. Aplicar una temperatura suficiente durante un tiempo determinado para destruir al germen. Prevenir la contaminación post-procesado mediante: Higiene escrupulosa del personal, lo que debe conllevar una información adecuada de los motivos de esta exigencia. Higiene en la manipulación de los alimentos terminados para lo cual los manipuladores deben recibir enseñanzas especiales de acuerdo con la higiene, desinfección de utensilios, separando los que han servido para la preparación de los productos crudos de los alimentos tratados por el calor o cocinados. Con ello se evita la contaminación cruzada. -
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Separación bien delimitada entre zonas para la manipulación de productos crudos y alimentos terminados, para evitar la contaminación cruzada. Inhibición del crecimiento de Salmonella en el alimento durante su conservación, utilizando distintos procedimientos, según el producto: Almacenamiento por refrigeración a temperatura inferior a 7 rC para productos crudos o terminados. Almacenamiento por calentamiento a temperatura no inferior a 60 rC hasta su consumo en alimentos cocinados y calientes. Respetar la cadena del frio. En general todo se reduce a educar la conciencia colectiva respecto a la higiene; de un modo especial en la etapa final de la preparación de los alimentos. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 4 .
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MATERIALES Pipetas Matraz erlenmeyer 500 ml Caja petri Proveta Mechero Tijera Tubos de ensayo con tapón Gradilla Aza
5 METODOLOGIA Muestra, hamburguesa de pollo cruda
REACTIVOS Hamburguesa de pollo cruda Peptona Caldo Rappaport Caldo Tetrationato Agar VBA Agar HE Agar XLD CS MIO TSI LIA Reactivo de Kovacs Alcohol 70% Detergente liquido al 15 % Desinfectante
EQUIPOS Balanza Agitador vortex Incubadora con termostato Autoclave
1º DIA: PRE-ENRIQUECIMIENTO
Pesar 25 gr de hamburguesa de pollo homogenizado
Transferirlos a 225 ml Agua peptona tamponada -1 (Dilución 10 ) Mezclar.
Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas 2º DIA: ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO
Tomar 1 ml de la dilución hecha el día anterior del (caldo de PRE-enriquecimiento dilución Inocular con pipeta estéril en
Inocular con pipeta estéril en
10 ml de caldo tetraionato-bilis-verde brillante (Müller Kauffmann)
10 ml de caldo caldo Rappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS)
Mezclar
Incubar a 42ºC por 18-24 hor as En baño serológico
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HE Solo se observo el crecimiento del cultivo tomado del caldo rappapor t. Las colonias eran ro jas y el medio que las rodeaba tendía a verde.
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Se observo el crecimiento del cultivo tomado del caldo rappapor t y del caldo tetrationato. Las colonias eran amar illas y el medio que las rodeaba tendía a ro o.
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Las pruebas bioquímicas f ueron reali adas para otra muestra dado que no crecieron colonias típicas en los distintos medios utili ados. Es impor t ante no flamear ni recargar el asa, para la siembra en LIA. Esto con el ob jeto de obtener un me jor resultado a que si se hiciese lo contrar io el exceso de S impedir ía que se observe las demás caracter ísticas como ser la alcalinidad del medio. Se observo que el caldo tetrationato a comparaci n del caldo rappapor t tiene una mayor selectividad, dado que no se observo crecimiento de los cultivos tomados del caldo tetrationato en E y VBA. SI
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Las colonias observadas en los distintos medios no presentaban las caracter ísticas típicas de una colonia de Salmonella, por lo tanto se puede concluir que la muestra a ser anali ada: hamburguesa de pollo cruda, no presentaba Salmonella. De la ser ie bioquímica para la otra muestra utili ada no podemos concluir concretamente que no se trata de Salmonella ya que según la bibliografía consultada los cultivos que muestren reacci n caracter ística de Salmonella en SI, se correspondan o no con la reacci n de dichos cultivos en agar LIA deben ser seleccionadospara la confirmaci n serol gica. Es impor t ante no flamear ni recargar el asa, para la siembra en LIA. Esto con el ob jeto de obtener un me jor resultado ya que si se hiciese lo contrar io el exceso de S impedir ía que se observe las demás caracter ísticas como ser la alcalinidad del medio. En base al parámetro Salmonella, como indicador de inocuidad, se puede establecer que el alimento es inocuo. 9 I I I Ingenier ía, autocontrol y auditor i a de la higiene en la industr ia alimentar ia Jorge Puig-Durán resco icrobiología y Parasitología dica de A. Pumarola, Agustin Pumarola Busquets edios de cultivo y pruebas bioquímicas.pdf i i l gí lim i por ar ía del osar io Pascual Anderson, Vicente alderón y Pascual 0 ES I I . En un analisis microbiologico se requiere confirmar la presencia deS l ll , indique lo siguiente: etodos confirmativos que nos indiquen su presencia.
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¿Cuál el fundamento de los diferentes medios empleados en la práctica indicando cuales son los inhibidores y como es el desarrollo típico de la Salmonella en cada uno de ellos? diferencian rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso. El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S . Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus VBA: medio inhibidor se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de Excelente medio de gran selectividad para el sodio. La selectividad del medio permite usar aislamiento de Salmonella; pero no puede usarse inóculos densos. para aislar S. Typhi. Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se HE:
medio inhibidor El medio de cultivo contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de la flora acompañante, y 2 sistemas indicadores: (i) azul de bromotimol y fucsina ácida como indicadores de la fermentación de carbohidratos, y (ii) el citrato de hierro como un indicador de la formación de SH 2 a partir del tiosulfato. El desarrollo de Shigella spp. es adecuado debido a que la inhibición de estos microorganismos por las sales biliares está disminuida por la adición de cantidades relativamente elevadas de peptona y carbohidratos. El medio de cultivo, permite una buena diferenciación de las colonias e inhibe el
desarrollo de algunos coliformes y otras bacterias no fermentadoras de lactosa, facilitando así la identificación de Salmonella y Shigella a partir de la muestra.
Salmonella: Verde-azuladas, con o sin centro negro
Medio inhibidor
LIA: En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24hs de incubación se observa el pico de col or violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
MIO: Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de laenzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo. CS: En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. Elmedio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. Para la Salmonella el medio puede como no virar a azul. TSI: En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es 3+ la fuente de iones Fe , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Tetrationato El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante. Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada.
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¿Por qué es importante detectar la presencia de Salmonella spp. en los alimentos? Porque la Salmonella spp. puede causar infecciones sist émicas como Fiebre Tifoidea y Paratifoidea o Salmonelosis, enfermedad zoonótica que se manifiesta por una enterocolitis aguda. El mecanismo de transmisión es vía oral. Salmonella es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en intoxicaciones alimentarias a nivel mundial. ¿Indique las características generales o reacciones de Salmonella? Salmonella es un género de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula ni esporas. Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H 2 S). Fermentan glucosa por poseer u na enzima especializ ada, pero no lactosa, y no pr oducen ureasa.
¿Qué condiciones promueven el crecimiento de Salmonella en alimentos y que puede hacerse para retardar su crecimiento? La contaminación cruzada, la cocción insuficiente y los procedimientos de refrigeración inadecuados promueven el crecimiento de la Salmonella durante la elaboración y manipulación. Existen unos métodos destinados a evitar la proliferación de este género en los alimentos, por ejemplo, destruir la bacteria en los alimentos mediante la cocción, evitar la contaminación cruzada durante la manipul ación de los mismos y almacenar los alimentos a bajas o altas temperaturas para evitar su crecimiento. Mencione que enfermedades son causadas por la ingestion de alimentos contaminados con Salmonella. Existen dos tipos de enfermedades causadas por Salmonella: (a) Las fiebres entréticas. La fiebre causada por S. Typhi se conoce como fiebre tifoidea, y las causadas por S. Paratyohi A, S. Schottmuelleri y S. Hirschfeldi se denominan fiebres paratíficas y, (b) Las enterocolitis, también conocidas vulgarmente como salmonelosis causadas por la mayoría de los restantes serotipos de Salmonella. Algunos serotipos de este numeroso grupo, por ejemplo S. Cholerasuis, también pueden causar cuadros de fiebre entréticas sin causar enterocolitis. Cuáles son las características bioquímicas que permiten diferenciar entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella spp., Salmonella subesp. entérica (I) Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Salmonella subesp. entérica IIIa y IIIb, Edwarsiella tarda, Escherichia coli SH2 , S. Cholerasuis y S. Typhisuis.
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¿En qué consiste la serotipific acion de Salmonella spp?
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De acuerdo a la normativa boliviana vigente ¿Cuál es el límite máximo permisible para hongos y levaduras, coliformes totales y fecales, S.Aureus y Salmonella, en la carne molida, hamburguesa de carne cruda congelada, hamburguesa de pollo cruda, apanado crudo, salchipapa, chorizo parrillero y quesillo?Dar el numero de norma (en caso de no contar con ellos, especifique según su criterio) coliformes coliformes Nro. de Hon os y S.Aureus Salmonella Levaduras totales fecales Norma Carne molida Hambur uesa de carne cruda con elada Hambur uesa de pollo cruda Apanado crudo Salchipapa Chorizo parrillero Quesillo 10. Detalle en forma esquemática el método del recuento en placa para el análisis de Salmonella. (junto con su prueba confirmativa).
