MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI PROTEIN REKOMBINAN
Disusun Oleh :
Kelompok 2 A &%(A m1* Lis,-oini &&( As-*3 F*hu77*m*n &2( M*is* &.( R*,ih D** S-*+ill*h &/( M( Ak1* Sophi*n &4(E )in* O;,*)i*ni
&&&.&%2%%%%&& &&&.&&%(2%S%i%l) %i.*/n*A+hi,-* 2( Pi%%25 +i* A0*li* Nis1*h &&&.&%2%% im &&&.&. %(2%P %%% %.oBi,,*30* &&&.&%/2( %%N%u%2u2l Fi,i* P*kp*h*n &&&.&4( %2%Fi, %%%* 24h,unnis*h
&&&.&%2%%%%/. &&&.&%2%%%%%2 &&&.&%2%%%%'. &&&.&%2%%%%2/ && &.&%2%%%%&/
&'(! mmumN*+* &5( Ti<*h-uni &8(" ishilp- Dim*li* &( Pu,i A=ni K e*,i)i,* I
&&&.&% '2 ( %% H%e%s/,i/Sulis,ioini 52 ( %% N%*%62m'*h Mum,*7*h &&&.&% &&&.&8%(2%H %%*%k/*%As9*+* ( %% B%*%+2.i-*,un Ni9m*h &&&.&%2
&&&.&%2%%%%%/ &&&.&%2%%%%5. &&&.&%2%%%%5/ &&&.&%2%%%%54
PROGRAM ST!DI FARMASI FAK!LTAS KEDOKTERAN DAN ILM! KESEHATAN !NI"ERSITAS ISLAM NEGERI S#ARIF HIDA#AT!LLAH $AKARTA DESEMBER 2%&'
PROTEIN REKOMBINAN
Protein adalah molekul makro yang mempunyai berat molekul antara lima ribu hingga beberapa juta. Protein terdiri atas rantai-rantai asam amino, yang terikat satu sama lain dalam ikatan peptide Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai asam-asam amino. Dalam molekul protein, asam-asam amino saling dirangkaikan melalui reaksi gugusan karboksil asam amino yang satu dengan gugusan amino dari asam amino yang lain, sehingga terjadi ikatan yang disebut ikatan peptida. Ribosom berfungsi sebagai tempat sintesis protein dan merupakan contoh organel yang tidak bermembran. Organel ini terutama disusun oleh asam ribonukleat, dan terdapat bebas dalam sitoplasma maupun melekat pada retikulum endoplasma. Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Protein rekombinan merupakan protein yang diperoleh dari hasil teknologi DN rekombinan. Pembentukan protein rekombinan dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai !ector. Melalui teknologi DN rekombinan dapat dilakukan pemindahan gen pengode en"im#protein dari satu organism ke organisme lain. $ehingga bila en"im#protein tersebut diidentifikasi sebagai kandidat en"im untuk digunakan dalam industri, gen pengode en"im#protein tersebut dapat dikloning dalam suatu mikroorganisme inang yang cocok, dan diproduksi dalam skala industri.
TEKNIK PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN A. Isolasi Dna Genom, Rna Total Dan Poly(A) Rna 1) Isolasi DNA enom total. DNA genom berupa untai ganda dan dapat diisolasi dari sel jenis apapun, termasuk bakteri, ragi, tanaman dan binatang. Hasil isolasi DNA yang diinginkan adalah DNA seutuh mungkin, tidak rusak dan memiliki berat molekul tinggi. Sayangnya proses purifkasi DNA sendiri cenderung memutus rantai DNA sehingga menurunkan berat molekulnya, namun tindakan yang hati-hati dapat mengurangi hal ini. Protokol isolasi DNA berariasi, tapi sebagai langkah a!al semua melibatkan proses lisis sel dan nukleus "jika sel memiliki inti#. Suspensi sel-yang-mengandung-DNA diinkubasi dengan deterjen dan atau en$im yang ber%ungsi untuk melisis sel&inti. 'angkah berikutnya biasanya adalah mendisosiasi DNA dari protein "misalnya histon# menggunakan en$im yang dapat mendegradasi protein "proteinase (#. 'angkah ini sekaligus juga untuk menginaktiasi en$im seluler yang dapat mendegradasi DNA "nuklease#. Protein yang terdegradasi sebagian, dihilangkan dari larutan dengan cara ekstraksi %enol&kloro%orm, presipitasi dengan garam, atau dengan mele!atkan larutan melalui kolom yang akan menahan DNA. DNA dipresipitasi dengan etanol. Dengan cara ini biasanya DNA dengan )* tinggi "misalnya DNA genom manusia# akan membentuk threads
(rantai) dan dapat ditarik dari larutan menggunakan batang gelas. DNA kemudian dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam air dengan bu+er tertentu "ris-Hl atau ris-DA# dan akan stabil selama beberapa tahun.
!) Isolasi RNA sel"le# total. )eberapa jenis /NA dapat ditemukan dalam sel, termasuk
messenger /NA "m/NA#, ribosomal /NA "r/NA#, transfer /NA "t/NA# dan lain-lain. (ebanyakan studi "Northern blot, /-P/# cukup menggunakan hasil isolasi /NA seluler total. )erbeda dengan DNA, /NA berupa untai tunggal dan relati% tidak stabil. Pada proses isolasi dan penyimpanan /NA harus sangat diperhatikan agar /NA tidak
terdegradasi oleh en$im /NAse yang banyak ditemukan di lingkungan. Selama isolasi /NA, sel atau jaringan dihomogenisasikan dalam larutan yang mengandung senya!a yang dapat menghambat kerja /NAse, misalnya guanidium isotiosianat. )eberapa metode yang berbeda dapat digunakan untuk langkah berikutnya yaitu pemisahan /NA dari DNA genom. Pada tahap akhir prosedur, seperti juga pada isolasi DNA, /NA yang dipurifkasi dipresipitasi dengan etanol. 'arutan /NA dalam air harus disimpan dalam keadaan beku. 3) Isolasi mRNA. 0ntuk beberapa aplikasi, total /NA seluler tidak cukup baik digunakan. Dari total /NA sebagian besar berupa r/NA, sedangkan m/NA hanya 1- 23. 0ntuk membuat library gen yang diekspresi atau untuk mendeteki m/NA yang sangat jarang&sedikit jumlahnya pada Northern blot, mengisolasi m/NA merupakan langkah a!al terpenting. Hampir semua m/NA mengandung adenilat "poly-adenilated/polyA RNA#, sehingga si%at ini dapat digunakan untuk menangkap dan mengisolasi m/NA. otal /NA seluler dile!atkan melalui kolom atau resin polydeoxythymine "kolom oligod, polyd# yang terikat pada %ase padat. /NA yang tidak terikat akan hilang tercuci, sedangkan poly"A# /NA dapat dielusi pada tahap berikutnya. B. K$ONING DNA Pada metode isolasi DNA di atas, genom sel adalah sumber DNA, oleh karena itu semua sekuens DNA yang diperoleh akan sama jumlahnya seperti yang terdapat dalam sel. ergantung pada ukuran genom organisme, suatu gen tunggal tertentu hanya merupakan bagian yang sangat kecil dari DNA total dalam sel. Sebagai contoh, rata-rata satu gen tunggal dalam manusia "4155.555 pb# hanya merupakan 5.5523 dari genom total. 6adi, gen tunggal terlalu kecil untuk dapat digunakan dalam studi yang mendetil "misalnya sekuensing DNA#. Problem ini dapat dipecahkan dengan kloning DNA, yang memungkinkan untuk membuat satu DNA tertentu dalam jumlah
besar dan murni. Semua metode (loning DNA melibatkan ligasi suatu urutan&sekuens tertentu "misalnya gen manusia# ke dalam ektor kloning. 7ektor kloning adalah urutan DNA yang terdapat di dalam satu sel "dalam hal ini biasanya bakteri E. coli# tapi bukan merupakan bagian dari genom sel. Pemba!a cloning "dan DNA yang diklon di dalamnya# akan diperbanyak dalam sel hospes, menghasilkan sejumlah besar DNA dengan urutan spesifk yang kemudian dapat diisolasi untuk studi selanjutnya.
Plasmi% E. &oli. (loning ke dalam plasmid E. coli masih merupakan metode terpenting untuk membuat DNA dalam jumlah besar dan murni. Plasmid adalah DNA untai ganda sirkuler yang kecil "8555-9555 pb# yang dapat memperbanyak diri "replikasi# di dalam sel bakteri ":ambar 1-9#. Plasmid memiliki srcin of replication sendiri dan mampu memperbanyak diri "propagasi# dengan bantuan mesinmesin seluler endogen. Plasmid kloning mengandung marka seleksi "selectable marker#, biasanya berupa gen yang memba!a resistensi terhadap antibiotika. E. coli yang mengandung plasmid yang dapatdiseleksi-dengan antibiotika ini akan mampu tumbuh dalam media yang mengandung antimikroba tertentu. )anyak plasmid yang memiliki gen β-lactamase, dapat tumbuh dalam ampisilin. Plasmid dapat dibedakan bedasarkan jumlah-salinan "copy number#; tinggi dan rendah. DNA plasmid murni dapat dipisahkan dari DNA genom
E. coli, karena plasmid DNA jauh lebih kecil ukurannya dibanding DNA genom E. coli "genom E. coli 4 1<15= pb#. Sel E. coli yang mengandung plamid ditumbuhkan dalam sejumlah besar media cair yang mengandung antibiotika tertentu. Sel kemudian dibuat pelet dengan cara sentri%ugasi dan lisis menggunakan alkali atau deterjen. Semua metode pembuatan plasmid menggunakan dasar seleksi ukuran untuk memisahkan antara DNA plasmid sirkuler yang kecil dengan DNA genom yang berat molekulnya ")*# tinggi dan /NA. )eberapa mg DNA plasmid murni dapat diperoleh dari 1 '
kultur sel E. coli yang mengandung plasmid dengan jumlah salinan tinggi. Plasmid E. coli modern telah direkayasa sehingga memiliki beberapa situs restriksi "polylinker sites#. )erikut adalah prosedur untuk kloning satu gen tertentu ":ambar 1-9#; DNA plasmid a!al dipotong dengan en$im restriksi, sehingga DNA sirkuler terbuka dan menjadi linier. DNA untai ganda linier lain, yang diinginkan, dibuat sehingga ujung-ujungnya sesuai untuk diligasikan ke dalam celah sehingga plasmid sirkuler terbentuk kembali. Plasmid yang telah diligasi ini dimasukkan melalui proses trans%ormasi ke dalamE. coli. >ang sensiti% terhadap antibiotik marka yang terkandung dalam plasmid. rans%ormasi bakteri dapat tercapai dengan memanaskan campuran DNA dan bakteri pada ?8° selama 1 menit "heat shock# atau dengan memberikan aliran listrik "electroporation#, sehingga DNA plasmid dapat melalui dinding bakteri masuk ke dalam sel bakteri. Setelah trans%ormasi, bakteri ditumbuhkan pada pelat agar yang mengandung antibiotik. Pada kondisi ini hanya sel yang memiliki plasmid sirkuler yang dapat tumbuh dan membentuk koloni. iap koloni bakteri ini disebut klon, karena setiap sel dalam koloni identik secara genetik. iap klon dapat diperbanyak dalam media cair untuk membuat DNA plasmid dalam jmlah besar. (arena sel bakteri tidak mati dan dapat terus menerus membelah tanpa batas, klon yang mengandung plasmid ini merupakan sumber DNA yang permanen. Sel dapat disimpan beku selamanya, dan klon dapat diposkan dan dipakai bersama dengan laboratorium yang lain. Plasmid modern dengan jumlah salinan tinggi berukuran 42 kb dapat menerima DNA sisipan sampai 19 kb. Namun, kebanyakan DNA yang diklon ke dalam plasmid berukuran @15 kb, ukuran yang lebih besar biasanya tidak stabil. Sehingga hanya DNA dengan ukuran relati% kecil yang dapat diklon ke dalam ector plasmid. leh karena itu, dikembangkan ektor cloning yang dapat memba!a DNA dengan ukuran besar, antara lain ektor kloning %aga "phage#,
kosmid, bacterial articial chromosomes (!A") dan yeast
articialchromosomes (#A"). $i'#a#y. 7ektor kloning di atas dapat digunakan untuk memperbanyak DNA tertentu dalam jumlah besar dan murni. etapi bagaimana gen DNA tersebut dapat ditemukan pertama kaliB Proses isolasi suatu gen tertentu dari campuran DNA yang kompleks dapat dijelaskan secara singkat sebagai berikut. (ebanyakan strategi isolasi gen secara traditional melibatkan pembuatan library DNA atau /NA. *ateri a!al library adalah campuran DNA kompleks yang diketahui mengandung urutan DNA yang diinginkan. Sebagai contoh, materi a!al untuk mengisolasi gen manusia tentunya adalah DNA genom yang diisolasi dari sel manusia. DNA ini kemudian dipotong-potong menjadi beberapa %ragmen dengan ukuran tertentu secara mekanis atau didigesti menggunakan en$im restriksi endonuklease. 0kuran %ragmen tergantung pada ector kloning yang digunakan. 0ntuk library phage, ukuran %ragmen rata-rata 4C-89 kb. ampuran %ragmen DNA ini diligasikan ke dalam ektor kloning dan reaksi ligase digunakan untuk mentrans%ormasi bakteri
E. coli. Si%at biologi ektor kloning menjamin bah!a setiap indiidu bakteri hanya mengandung satu sisipan " insert#. Dengan demikian, prosedur ini membagi campuran a!al DNA yang kompleks menjadi jutaan klon tunggal, tiap klon hanya mengandung satu jenis DNA, satu library. $ibrary dapat dibuat dari bermacam-macam sumber DNA untai ganda Gam'a# 1 Subkloning pada bakteri. 7ektor cloning p01 digunakan untuk memperbanyak cDNA. Plasmid memiliki srcin of replication bakteri "/E#, gen resisten untuk seleksi dalam media antibiotik "Amp#, dan gen yang dapat digunakan untuk mendeteksi penyisipan cDNA "lacF#. Setelah plasmid dibuka dan cDNA disisipkan dengan bantuan en$im restriksi dan ligasi, konstruksi DNA ini dimasukkan ke dalam bakteri E. coli dengan cara syok panas " heat shock# atau elektroporasi. Setelah trans%ormasi, bakteri ditanam pada media yang mengandung antibiotik, hanya bakteri yang telah memiliki plasmid yang
mengandung gen resistensi antibitika yang dapat tumbuh. )akteri ditumbuhkan dalam media yang juga mengandung Ggal, substrat untuk β galaktosidase, klon yang mengandung sisipan "insert# pada gen lacF "insert akan merusak reading %rame#, tidak akan sanggup lagi memetabolisme G-gal dan akan nampak sebagai koloni putih pada pelat agar. Sedangkan koloni yang terligasi dan memiliki gen lacF yang %ungsional akan memetabolisme G-gal sehingga akan nampak sebagai koloni ber!arna biru.
0ntuk mengidentifkasi bagian yang menyandi protein pada suatu gen, diperlukan library dari sekuens DNA yang terekspresi.
$ibrary ini dikenal sebagai c%NA library dan sebagai materi a!al digunakan m/NA ":ambar 1-=#. 0ntuk mengisolasi gen yang menyandi en$im metabolisme di hati, maka digunakan m/NA yang dipurifkasi dari homogenat hati. *ateri ini akan mengandung semua m/NA yang ada dalam hati. )eberapa m/NA berjumlah sangat banyak, jika m/NA in menyandi protein yang jumlahnya banyak dalam hati, sedangkan beberapa transkrip lain berjumlah sedikit. / kemudian digunakan untuk menyalin campuran m/NA ini menjadi rst-strand c%NA. cDNA ini kemudian dikonersi menjadi dsDNA dan diligasikan ke dalam ektor cloning menghasilkan c%NA
library. Patut diingat bah!a cDNA library bersi%at khas untuk tiap jaringan "tissue-specic#, karena setiap jaringan mengekspresikan sekelompok gen yang berbeda. cDNA library juga bersi%at spesifk untuk tiap tahap perkembangan organisme. Gam'a# 1* Pembuatan cDNA library. m/NA diisolasi dan diterjemahkan balik dengan /. 0ntai /NA didigesti habis, DNA untai tunggal " single stranded %NA/ss%NA# yang tersisa kemudian ditambah primer oligod dan DNA polimerase. Primer akan menempel pada ujung&ekor poli"A# cDNA dan kemudian diperpanjang
"ekstensi# oleh DNA polimerase. cDNA untai ganda diligasikan ke lengan λ phage yang selanjutnya diin%eksikan ke bakteri. ilter li%t dilakukan pada bakteri yang telah dilisis kemudian dihibridisasi menggunakan probe yang sesuai. Setelah autoradiograf, plak yang sesuai diisolasi, phage dipurifkasi dan dikarakterisasi.
6ika library sudah diperoleh, tahap berikutnya adalah bagaimana menemukan satu klon spesifk yang mengandung gen tertentu di antara jutaan klon. Hal ini dapat tercapai dengan cara menapis "screening# library. )akteri yang mengandung library ini disebar pada pelatagar dengan densitas yang cukup rendah sehingga memungkinkan untuk mengambil satu klon tunggal. Sebagai contoh, suatu phage library yang dibuat dari DNA genom manusia, ditanam dengan kerapatan 95.555 plak per pelat. Pada densitas ini, 85 pelat berarti mengandung 1.555.555 klon. Sebagian dari koloni&plak pada pelat ditrans%er, sebagai salinan persis, ke flter nitroselulosa atau nilon menggunakan prosedur<er liftI "diangkat dengan flter#. ilter ini kemudian diproses suapaya mengikat secara koalen DNA atau protein yang diekspresikan oleh plak&koloni yang ditrans%er. ilter kemudian diinkubasi dengan probe DNA yang dilabel radioakti% atau antibodi spesifk, yang akan menempel pada flter pada posisi klon yang mengandung DNA atau protein yang dicari. (lon yang sesuai tersebut kemudian diambil dari pelat agar aslinya berdasarkan posisi pada flter yang telah ditandai. DNA dalam klon kemudian dapat diamplifkasi "diperbanyak# dan diisolasi seperti yang telah diterangkan sebelumnya, yaitu dengan cara subkloning ke dalam ektor plasmid.
+. Pe#'anyaan (Am-liasi) Dna Se&a# a Kimia
Selain dengan cara perbanyakan menggunakan ector kloning dalam sel hidup, DNA untai ganda dapat diperoleh dalam jumlah besar dan murni secara kimia dengan cara polymerase chain reaction "P/#. Sejumlah kecil DNA untai tunggal dapat disintesis dari nukleotida tunggal dengan bantuan oligonukleotida.
Olion"leoti%a. Salah satu a!al kemajuan yang memba!a kita pada teknik P/ yang sekarang banyak digunakan adalah kemampuan untuk mensintesis secara kimia sepotong kecil DNA dengan urutan basa tertentu "oligonukleotida#. Proses ini dimulai dengan menempelkan basa 9J yang paling ujung dari suatu urutan DNA ke polimer padat pendukung. Setiap basa baru sesuai dengan urutan yang diinginkan ditambahkan pada gugus 2J H basa yang telah ditempelkan pada polimer pendukung, satu demi satu sampai seluruh urutan DNA tersintesis. Pada tiap siklus sintesis hanya satu basa yang ditambahkan, yang sekaligus merupakan langkah untuk mengontrol urutan basa oligonukleotida. ligonukleotida konensional mengandung satu dari empat basa DNA pada satu posisi. Namun, bisa saja prosedur diatur agar dapat digunakan nukleotida yang lain "misalnya inosin#, nukleotida yang dimodifkasi "ditandai dengan 'uorescent atau digoksigenin#, atau lebih dari satu macam basa pada satu posisi "degenerate
oligonukleotides#. Polymerase Chain Reaction (P+R). Dari suatu campuran DNA yang kompleks, P/ memungkinkan peneliti untuk membuat sejumlah besar DNA dengan urutan basa tertentu dalam !aktu yang singkat dan tanpa kloning. Prosedur ini menggunakan DNA polimerase yang tahan panas "thermostable# dan dua primer oligonukleotida sintetik ":ambar 1-K#. 0rutan DNA gen yang akan diamplifkasi "diperbanyak# harus diketahui sebagian, agar primer yang
membatasi ujung DNA target dapat disintesis. Prosedur P/ dapat terdiri dari 2 tahap; "1# denaturasi DNA untai ganda, "8# menempelkan primer ke DNA "annealing#, dan "2# memperpanjang primer "extension#. Selama denaturasi, pemanasan "?-C°# digunakan untuk memisahkan kedua untai DNA target menjadi untai tunggal. 0ntai tunggal ini kemudian siap dihibridisasikan dengan oligonukleotida yang sesuai pada proses annealing jika temperatur diturunkan sampai di ba!ah titik leleh hibrid oligonukleotida-DNA "biasanya sekitar 95-=C°#. Setelah primer menempel, DNA polimerase "aL polimerase dari bakterihermophilus auaticus# dapat menyalin urutan DNA untai tunggal pada K8°, jika tersedia deoksinukleotida tri%os%at "dNP#. Setiap untai DNA target yang telah ada sejak a!al akan disalin dan jumlah DNA akan menjadi dua kali lipat pada akhir tiap siklus. 6adi, setelah 89-25 siklus, urutan DNA yang diinginkan dapat diperbanyak sampai jutaan kali lipat. DNA sejumlah ini memungkinkan untuk dilihat "isualisasi# langsung sebagai pita "band# pada gel agarose, dan lebih dari cukup untuk melakukan cloning atau sekuensing DNA. Perubahan temperatur berturutturut yang diperlukan untuk melakukan P/ ini dilakukan pada mesin thermocycler. Satu P/ biasanya selesai dalam !aktu 1-2 jam, dan oleh karena itu merupakan metode tercepat untuk membuat DNA tertentu untuk studi lebih lanjut. (eterbatasan P/ antara lain adalah misinkorporasi "salah menambahkan# nukleotida oleh en$im aL polimerase "a error# dan ketidakmampuan untuk mengamplifkasi %ragmen DNA yang besar "aL generasi baru mampu mengamplifkasi 485 kb#. *odifkasia dengan tingkat fdelitas tinggi akan mengurangi kesalahan P/ dan meningkatkan kemampuan amplifkasi. Aplikasi P/ bermacam-macam, antara lain; "1# untuk mengamplifkasi DNA pada daerah tertentu sebagai strategi rekayasa genetik yang tidak tergantung pada en$im restriksi, "8# memperbanyak DNA genom untuk keperluan diagnostik, "2# memperbanyak DNA untuk sekuensing, "?# untuk
memnyisipkan&membuat mutasi "site directed mutagenesis#, "9# dikombinasi dengan /, untuk mengkuantifkasi jumlah m/NA a!al "/-P/#.
Gam'a# 1/ /eaksi P/. etakan DNA, primer A dan ), dan DNA polimerase "a# dikombinasi dalam reaksi siklus berulang mengikuti temperatur denaturasiannealing-ekstensi, yang mengamplifkasi DNA pada daerah yang dibatasi oleh pasangan primer A dan ). Site-directed mutagenesis. P/ telah sangat memudahkan site-directed mutagenesis "!alaupun ada juga prosedur lain untuk membuat mutasi&mutagenesis#. *ite-
directed mutations "mutasi yang dibuat pada tempat yang ditentukan# mempunyai banyak aplikasi, termasuk untuk studi struktur-%ungsi reseptor, transcription factors, en$im, dan %aktor transkripsi lainnya. *ite-directed mutations juga dapat dilakukan terhadap elemen regulasi suatu gen untuk mengubah tempat pengikatan transcription factor dan menguji pengaruhnya terhadap %ungsi promotor. *ite-directed mutations juga membantu rekayasa genetik karena memungkinkan untuk menciptakan situs restriksi baru.
*utagenesis biasanya berupa substitusi satu nukleotida, !alaupun bisa juga dilakukan untuk mengubah beberapa pasang basa sekaligus "termasuk delesi anatu insersi kecil#. Protokol yang banyak digunakan adalah membuat mutasi dengan cara perpanjangan yang kemudian saling menumpuk "o+erlap extension
mutagenesis# ":ambar 1- C#. Pada prosedur ini, mutagenesis dilakukan dengan membuat primer oligonukleotida yang komplemen terhadap DNA normal kecuali pada posisi basa mutan, yang biasanya diposisikan di dekat ujung 9J oligonukleotida untuk menjamin priming. Dengan P/, primer mutan diinkorporasikan ke dalam DNA yang baru disintesis. Selanjutnya, DNA hasil P/ "yang sekarang mengandung mutasi# digunakan untuk memulai P/ kedua bersama-sama dengan primer oligonukleotida yang baru. Setelah beberapa siklus P/ akan diperoleh cetakan mutan yang panjang yang dapat diperbanyak dengan P/ tradisinal. )eberapa ariasi strategi ini dibicarakan pada pustaka yang tercantum. Gam'a# 10 *ite-
directed mutagenesis. Primer mutan "tanda bintang# dan primer 2J normal digunakan untuk mengamplifkasi cDNA. Hasil reaksi digunakan untuk mengamplifkasi cetakan bersam-sama dengan primer 9J normal. /eaksi ini akan menghasilkan cDNA termutasi yang dapat diamplifkasi dengan primer norma
D. An*lisis DNA +*n RNA Pemis*h*n men==un*k*n =el >=el sep**,ion?(
Pemisahan DN dan RN berdasarkan ukuran dengan elektroforesis pada berbagai sistem gel merupakan teknik dasar yang penting dalam biologi molekuler. Pada p% netral, DN dan RN bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. &ika migrasi dilakukan pada matriks polimer 'gel(, fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang besar ')ambar *-+(. Dengan demikian, migrasi elektroforetik melalui gel akan memisahkan campuran fragmen DN sehin gga Nampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya. anyak matriks gel yang dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling banyak digunakan adalah gel agarose dan poliakrilamid. )el agarose sesuai untuk pemisahan fragmen DN yang berukuran .*-+ kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen Dna berukuran .+-+ kb. Denaturan seperti urea dapat ditambahkan pada gel poliakrilamid untuk dapat memisahkan fragmen DN sampai pada tingkat resolusi * pb 'misalnya untu/ sekuensing DN(. $alah satu jenis elektroforesis gel agarose adalah pulsed field gel electrophoresis 'P0)1( yang digunakan untuk memisahkan fragmen DN yang sangat besar 'lebih dari * kb(. 2ntuk melihat fragmen DN setelah dipisahkan dengan elektroforesis gel digunakan teknik lain. &ika fragmen DN cukup banyak, gel dapat langsung di3arnai 'staining( selama atau setelah elektroforesis sehingga DN dapat langsung dilihat. 1thidium bromide mengikat DN dan akan berfluoresensi#berpendar merah diba3ah sinar 24. &ika jumlah DN terlalu sedikit untuk di!isualisasi langsung, radioaktif digunakan untuk mendeteksi 'lihat hibridisasi(. Hi1i+is*si *s*m nukle*,(
%ibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. 5eknik ini digunakan untuk $outhern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. 5ujuan metode ini adalah untuk melihat '!isulisasi( sekuens asam nukleat tertentu 'DN atau RN( dalam lingkungan#latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. 5eknik ini memanfaatkan sifat DN yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan saling mengikat 'hibridisasi( dengan tingkat spesifisitas yang tinggi. $ebaliknya, sekuens asam nukleat yang nonkomplemen tidak berikatan secara spesifik, mismatch nukleotida menurunkan temperatur #titik leleh. 2ntuk mendeteksi DN atau RN tertentu dalam suatu campuran yang kompleks, isi campuran harus diimobilisasi pada membran dan diubah menjadi bentuk untai tunggal 'lihat $outhern dan Northern blotting(. 6arutan hibridisasi yang mengandung probe untai tunggal yang dilabel radioaktif ditambahkan agar terjadi hibridisasi pada kondisi tertentu. 5emperatur dan konsentrasi garam pada larutan hibridisasi menentukan kespesifikan pengikatan. Pada temperatur tinggi dan konsentrasi garam rendah, probe hanya
akan mengikat sekuens target yang benar-benar cocok. $etelah hibridisasi, kelebihan probe yang tidak terikat dicuci, sinyal radioaktif akan terdeteksi pada lokasi di mana sekuens target terletak. $inyal radioaktif di!isualisasi dengan mengeksposkan pada fim 7-ray menghasilkan titik atau pita hitam pada tempat radioaktif. Sou,hen 1lo,,in=(
/etika DN genom didigesti dengan endonuklease restriksi dan dipisahkan dengan elektroforesis gel, fragmen indi!idual tidak akan dapat dilihat, bahkan jika digunakan DN dalam jumlah besar. /arena kompleksnya DN genom, digesti dengan en"im restriksi yang di!isualisasi dengan ethidium bromide akan menghasilkan pola 8smear9 yang tercipta dari ribuan fragmen DN. 2ntuk mendeteksi fragmen tertentu pada 8smear9 tersebut digunakan teknik hibridisasi dengan probe radioaktif yang la"im dikenal sebagai $outhern blotting 'diambil dari nama penemunya 1d $outhern( ')ambar *-:(. $outhern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DN yang telah didigesti dengan en"im pemotong. DN kemudian didenaturasi 'dipisahkan menjadi + untai tunggal( dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DN akan terikat pada secara ko!alen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel. 0ragmen DN spesi fik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.
No,hen 1lo,,in=(
Pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RN menggunakan prosedur Northern blotting '5abel *-+(. eberapa hal yang membedakan dengan $outhern blotting adalah; '*( RN jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DN, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam bufer yang mengandung "at kimia yang bersifat melindungi 'biasanya formaldehid(, '+( RN sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, '<( RN biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memelukan digesti en"im untuk memperoleh pola pita. /edua prosedur sangat mirip karena setelah elektroforesis RN juga ditransfer ke membran melalui difusi kapilaritas. iasanya sinar 24 digunakan untuk mengikat 'crosslink( RN pada membran sehingga tidak bergerak 'imobilisasi(.
Sekuensin= DNA
Penentuan urutan nukleotida merupakan analisis DN yang paling detil. da beberapa teknik untuk sekuensing DN, tetapi metode penghentian rantai dengan dideoksi 'dideo=y chain termination( yang dikembangkan oleh $anger adalah metode yang paling banyak digunakan ')ambar *-*(. DN mula-mula harus didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. $atu primer oligonukleotida yang dilabel radioaktif kemudian ditambahkan ke dalam reaksi dan akan menempel pada sekuens pasangannya pada DN target. DN polimerase digunakan untuk menyalin DN untai tunggal. dN5P dalam jumlah banyak 'sampai jenuh( hanya akan menghasilkan produk ekstensi dengan ujung terlabel radioaktif, tapi tidak menghasilkan informasi urutan basa. Penambahan sedikit ddN5P ke dalam
campuran
dN5P
akan
dapat
memberikan
informasi
urutan
basa
DN.
Dideoksinukleotida akan terinkorporasi pada ujung <9 untai DN yang baru disintesis. DN polymerase tidak dapat menambahkan basa baru pada ddN5P. Dengan demikian, inkorporasi ddN5P mengakibatkan penghentian sintesis rantai DN. Penambahan dN5P dan ddN5P dengan rasio yang tepat memungkinkan untuk menghentikan sintesis rantai DN pada tiap posisi nukleotida. $ebagai contoh, jika ektensi primer dilakukan menggunakan d5P, d55P, d)5P dann dd>5P, polymerase akan mensintesis untai DN baru sampai dia harus menggunakan dd>5P 'misalnya ketika basa komplemennya )(. dd>5P akan terinkorporasi, dan pada titik ini DN polimerase tidak akan dapat melanjutkan kstensi. Dengan demikian, panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktif menentukan osisi ) pertama yang disalin. 2ntuk menentukan posisi ) yang lain, bukan hanya ) yang pertama, reaksi sekuensing yang sebenarnya dilakukan dengan menggunakan campuran d>5P dan dd>5P dengan perbandingan ?+;*. Pada kondisi ini kemungkinan terjadi penghentian rantai DN adalah ?*;+ yang terjadi ketika terdapat ) pada DN yang disekuensing. kan diperoleh produk ekstensi dengan berbagai panjang, yang dapat di!isualisasi setelahelktroforesis pada gel poliakrilamid. erdasarkan pada panjang produk, maka tiap fragmen akan menentukan posisi satu ). 2ntuk menentukan posisi keempat basa, empat reaksi sekuensing dilakukan untuk tiap sampel. Pada tiap reaksi dicampurkan dN5P dan ddN5P yang sesuai dikombinasi dengan < dN5P lainnya dalam konsentrasi jenuh. /eempat reaksi kemudian dielektroforesis bersebelahan pada gel 'poliakrilamiddenaturasi( sekuensing sehingga hasil sekuens DN dapat langsung dibaca. $ecara teoritis sekuensing DN namp aknya cukup rumit, tapi sebenarnya pada kenyataannya relatif sangat mudah. 5eknologi modern telah memungkinkan untuk melakukan otomasisasi sekuensing DN. 2ntk skala besar, robot dapat digunakan
untuk menyiapkan reaksi sekuensing. @ang lebih penting adalah peralatan yang ada saat ini telah memungkinkan kita untuk dapat membaca hasil sekuensing secara langsung dan sekaligus dapat menyimpan data ke dalam datab ase komputer. $elain mengurangi kerja manusia, otomasisasi demikian juga mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam pembacaan dan pemulisan urutan DN secara manual. /ebanyakan mesin sekuensing sekarang menggunakan fluorescent 'cat yang berfluoresensi( sebagai pengganti radioaktif. >at ini dapatdiinkorporasikan ke dalam primer sekuensing atau ke dalam nukleotida. $eperti pada sekuensing manual, elektroforesis gel 'atau elektroforesis kapiler( digunakanuntuk memisahkan fragmen DN berdasrkan ukurannya.%anya saja pada sekuensing otomatis deteksi fragmenDN yang berfluoresensi dilakukan dengan bantuan sinarlaser dan sinyal diproses oleh komputer. Metode sekuensing otomatis lainnya sedang dikembangkan, termasuk penggunaan chips DN. Pada strategi ini sejumlah besar nukleotida yang diatur dan dilekatkan pada chips DN. %ibridisasi fragmen DN pada chips memungkinkan detesi sekuens yang o!erlap yang dapat diubah menjadi sekuens DN yang terhubung 'nyambung(. 5eknologi ini terutama akan sangat berguna untuk mendeteksi polimorfisme dan mutasi,karena sekuens yang telah diketahui dapat dilekatkan pada chips dengan !ariasi tertentu pada tiap nukleotida Ekspesi Rekom1in*n Po,ein
/emampuan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam jumlah besar adalah salah satu manfaat yang dapat diperoleh dari kloning cDN. anyak sekali kegunaan praktis dari protein rekombinan '5abel *-A(. $alah satunya adalah sebagai sumber reagen 'misalnya en"im restriksi( yang tidak akan habis dan merupakan sumber yang tidak ternilai untuk hormon dangro3th factors 'misalnya insulin manusia dan eritropoietin( yang sulit diperoleh dari sumber alaminya. /etersediaan protein rekombinan dalam jumlah besar juga sangat membantu dalam studi biofisik dan analisis struktur dan fungsi protein. T*nsl*si in )i,o >in )i,o ,*nsl*,ion? po,ein
rekombinan da banyak metode dan hospes 'pejamu( untuk mengekspresikan protein rekombinan, dan hanya beberapa akan dibahas berikut ini. >ara yang paling sederhana untuk mengekspresikan protein rekombinan adalah dengan in !itro translation menggunak an lisat retikulosit 'reticulocyte lysates(. Dengan cara ini, mRN 'biasanya ditranskripsikan secara in !itro dari cDN yang diklon dalam plasmid( diterjemahkan 'translasi( menggunakan ribosom
yang ada dalam lisat retikulosit. Balaupun proteinnya tidak berjumlah banyak, protein tersebut dapat dilabel dengan asam amino radioaktif 'misalnya <$-metionin(. Protein yang ditranslasikan secara in !itro dapat digunakan sebagai substrat untuk en"im-en"im, reaksi katalisis, imunopresipitasi, uji interaksi DN-protein, dan lain-lain. Ekspesi po,ein ekom1in*n +*l*m E( ;oli
1. coli adalah salah satu hospes pertama yang digunakan dan akan tetap menjadi sumber yang penting untuk mengekspresikan protein rekombinan. 1. coli paling baik digunakan untuk ekspresi protein intraseluler yang relati!e kecil dan tidak memerlukan modifikasi pascatranslasi 'posttraslational modification( yang terlalu banyak untuk dapat berfungsi. Protein diekspresikan dengan bantuan !ektor plasmid untuk ekspresi, yang banyak diantaranya dapat diinduksi dengan pemberian reagen seperti CP5) 'yang akan melepas represi promotor( untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi sebelum kemudian dipurifikasi. Melekatkan protein tertentu pada molekul lain misalnya galaktosidase kadangkadang dapat lebih menstabilkan protein, yang jika tidak dilekatkan mungkin akan terdegradasi dalam 1. coli. %al umum lain yang juga dapat dilakukan adalh dengan menambahkan label#marka 'tag( yang telah dipurifikasi kepada protein yang diekspresikan untuk memudahkan menemukan #mengisolasi protein setelah diekspresik an. Marka yang banyak digunakan adalah glutation-$transferase ')$5( yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation atau marka histidin untuk isolasi menggunakan kolom nikel. $alah satu keuntungan sistem ekspresi pada 1. coli adalah mudah untuk melakukan manipulasi DN rekombinan 'mirip seperti kloning plasmid( dan proses seleksi dan ekspresi yang cepat. . /erugiannya adalah ketidakmampuan untuk melakukan prosesing kompleks seperti glikosilasi, dan bah3a beberapa protein bersifat labil 'atau toksik( pada hospes. $elain itu, protein yang besar biasanya tidak diproduksi atau tidak terlipat 'folding( dengan efisien. . Ekspesi po,ein ekom1in*n +en=*n 1*n,u*n 1*;ulo)ius 1kspresi yang dibantu oleh baculo!irus dalam sel serangga adalah satu cara lain yang umum digunakan untuk ekspresi protein rekombinan. Dengan cara mentransfer plasmid yang mengandung cDN yang dikehendaki, terjadi rekombinasi dengan DN baculo!irus dalam sel $f: sehingga sekuens DN yang menyandi protein mantel !irus 'coat protein( utama, polyhedrin, diganti dengan protein yang dikehendaki. Dengan cara ini akan dihasilkan ekspresi protein rekombinan dalam jumlah tinggi. $el $f: dapat melakukan glikosilasi '3alaupun secara struktural berbeda dengan sel mamalia(, dan dapat mengekspresikan lebih
dari satu proteinbersama-sama sekaligus 'misalnya imunoglubulin(. Protein rekombinan biasanya akan terlokalisasi seperti pada sel normal 'misalnya reseptor pada membran, ranscription factors pada nukleus(, 3alaupun tingkat ekspresi yang tinggi akhirnya dapat mengganggu pola ini. 5ingkat ekspresi yang tinggi akan memudahkan purifikasi, kecuali jika terjadi agregasi. Namun, untuk melakukan seleksi dan rekombinasi sejumlah besar protein mutan pada sistem ini masih agak sulit. 1kspresi pada galur sel mamalia. anyak protein memerlukan ekspresi memggunakan sistem sel mamalia. Balaupun sistem ini sangat jarang dapat menproduksi protein seefisien 1. coli atau aculo!irus, salah satu kelebihannya adalah mampu memproses polipeptida kompleks menggunakan mesin intraseluler yang sesuai. $elain segi prosesing peptida, folding, atau glikosilasi yang dapat dilakukan dengan tepat, untuk mengekspresi protein tertentu seringkali diperlukan kondisi yang hanya dapat dicapai dengan menggunakan sel homolog atau jaringan khusus 'tissue specific(. $ebagai contoh, untuk mempelajari beberapa reseptor atau transcription factors maka perlu dilakukan ekspresi protein tersebut pada sel yang mengandung cofaktor atau target yang sesuai. 2ntuk mammalian cell lines, ekspresi cDN biasanya diatur dengan promotor yang kuat dari suatu !irus. $ebagai alternatif, telah dikembangkan !ektor ekspresis yang dapat diinduksi yang memungkinkan untuk melakukan seleksi klonal yang kemudian diikuti dengan induksi promotor dengan cara menambahkan 'atau menghilang( reagen tertentu 'misalnya tetrasiklin( yang dapat memodulasi akti!itas promotor. Protein yang mengandung leader seEuence dapat disekresikan ke dalam media. %al ini mengakibatkan pengenceran konsentrasi protein, namun kontaminan media ekstraseluler akan jauh lebih sedikit daripada intraseluler sehingga isolasi dan purifikasi protein yang bersangkutan akan lebih mudah. Ekspesi men==un*k*n )ek,o *+eno)ius
anyak !irus digunakan untuk ekspresi pada sel mamalia, memanfaatkan sifat tropisme alami !irus dan kemampuan !irus untuk menginduksi perubahan mesin sintesis intraseluler sehingga menghasilkan tingkat ekspresi yang tinggi. 4ektor adeno!irus sangat menarik karena telah menginfeksi berbagai macam sel mamalia dan karena genom adeno!irus telah dapat diubah menghasilkan !irus yang tidak mapu-replikasi dan dapat memba3a sekuens manusia. deno!irus telah bnayak digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan pada sel dan jaringan yang sulit ditransfek. Penggunaan adeno!irus sebagai !ektor untuk terapi gen juga menjadikan sistem ini sangat menarik untuk ekspresi gen. Dengan menghilangkan gen-gen kunci adeno!irus, !irus yang dusah dimodifikasi ini dapat berfungsi sebagai pemba3a gen mamalia. Memasukkan !ektor !irus yang mengandung
gen yang dikehendaki ke dalam sel +:< yang mengekspresikan 1*a memungkinkan untuk mengemas dan memanen !irus serta !irus tidak ber-replikasi pada sel lain. 4ektor adeno!irus telah digunakan untuk mengekspresikan gennormal pada organ yang defektif 'misalnya ekspresi >05R pada penderita cystic fibrosis(, untuk mengekspresikan gen yang toksik pada tumor 'misalnya timidin kinase pada tumor otak(, dan untuk mentarget gen cell-cycle arrest pada sel !askuler yang sedang berproliferasi. /eterbatasan adeno!irus antara lain ketidakmampuannya untuk menerima DN asing F* kb,jangka 3aktu ekspresinya relatif pendek in !i!o 'beberapa minggu sampai bulan(,toksik terhadap sel, dan menginduksi respon imun. eberapa sistem pemba3a !irus lain sedang dikembangkan termasuk denoassociated !irus, %erpes dan retro!irus 'yang berintegrasi ke dalam genom hospes(. 4aksin !irus juga digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam cell lines, misalnya sel %e6a, sebagai mekanisme yang efisien untuk ekspresi gen pada galur sel mamalia.
Sis,em l*in un,uk ekspesi po,ein ekom1in*n
anyak sistem lain yang digunakan tapi tidak akan dibahas di sini, antara lain produksi dalam susu binatang, Drosophila, ragi dan tanaman
SKEMA
Sistem Es-#esi P#otein (emampuan untuk mengekspresikan proteinrekombinan dalam jumlah besar adalah salah satu man%aat yang dapat diperoleh dari kloning cDNA. )anyak sekali kegunaan praktis dari protein rekombinan. Salah satunya adalah sebagai sumber reagen "misalnya en$im restriksi# yang tidak akan habis dan merupakan sumber yang tidak ternilai untuk hormon dan gro!th %actors "misalnya insulin manusia dan eritropoietin# yang sulit diperoleh dari sumber alaminya. (etersediaan protein rekombinan dalam jumlah besar juga sangat membantu dalam studi biofsik dan analisis struktur dan %ungsi protein.
Translasi in vitro (in vitro translation) protein rekombinan Ada banyak metode dan hospes
"pejamu#
mengekspresikan rekombinan,
dan
untuk protein hanya
beberapa akan dibahas berikut ini. ara yang paling sederhana mengekspresikan
untuk protein
rekombinan adalah dengan in
+itro translationmenggunakan
lisat
retikulosit
"reticulocyte
lysates#.
Dengan cara ini, m/NA "biasanya ditranskripsikan secara in itro dari cDNA yang diklon dalam plasmid# diterjemahkan "translasi# menggunakan ribosom yang ada dalam lisat retikulosit. Malaupun proteinnya tidak berjumlah banyak, protein tersebut dapat dilabel dengan asam amino radioakti% "misalnya 29S-metionin#. Protein yang ditranslasikan secara in itro dapat digunakan sebagai substrat untuk en$im-en$im, reaksi katalisis, imunopresipitasi, uji interaksi DNA-protein, dan lain-lain. kspresi protein rekombinan dalam . Coli . coli adalah salah satu hospes pertama yang digunakan dan akan tetap menjadi sumber yang penting untuk mengekspresikan protein rekombinan. . coli paling baik
digunakan
ekspresi intraseluler kecil
untuk protein
yang
dan
memerlukan
relati% tidak
modifkasi
pascatranslasi "posttraslational
modication# yang terlalu banyak
untuk
dapat
ber%ungsi.
Protein
diekspresikan
dengan
bantuan
plasmid
ektor
untuk ekspresi, yang banyak diantaranya dapat diinduksi dengan pemberian reagen seperti EP: "yang akan melepas represi promotor# untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi sebelum kemudian dipurifkasi. *elekatkan protein tertentu pada molekul lain misalnya galaktosidase kadang-kadang dapat lebih menstabilkan protein, yang jika tidak dilekatkan mungkin akan terdegradasi dalam . coli. Hal
umum
lain
yang
juga
dapat
dilakukan
adalah
dengan
menambahkan label&marka "tag# yang telah dipurifkasi kepada protein yang diekspresikan untuk memudahkanmenemukan&mengisolasi protein
setelah diekspresikan.*arka yang banyak digunakan adalah glutationStrans%erase ":S# yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation atau marka histidin untuk isolasi menggunakan kolom nikel. Salah satu keuntungan sistem ekspresi pada . coli adalah mudah untuk melakukan manipulasi DNA rekombinan "mirip sepertikloning plasmid# dan proses seleksi dan ekspresi yang cepat. (erugiannya adalah ketidakmampuan untuk melakukan prosesing kompleks seperti glikosilasi, dan bah!a beberapa protein bersi%at labil "atau toksik# pada hospes. Selain itu, protein yang besar biasanya tidak diproduksi atau tidak terlipat "%olding# dengan efsien. kspresi protein rekombinan dengan bantuan Saccharomyces cerivisiae
Sistem genetik yang sangat berkembang, penggunaannya mudah, berkurangnya !aktu dan biaya membuat *. "ere+isiae menjadi organisme yang menarik untuk diekspresikan dan memproduksi protein rekombinan. /agi mampu memba!a plasmid yang dirancang khusus dan kemampuan ini ber%ungsi dalam sistem ekspresi protein rekombinan. Plasmid terdiri dari situs restriksi yang dapat digunakan untuk memasukkan urutan gen yang diinginkan. rans%ormasi dari ragi dengan plasmid menghasilkan protein yang diinginkan dan dapat
ditingkatkan.
kspresi protein rekombinan dengan bantuan b aculovirus kspresi yang dibantu oleh baculoirusdalam sel serangga adalah satu cara lain yang umumdigunakan untuk ekspresi protein rekombinan. Dengancara
mentrans%er
plasmid
yang
mengandung
cDNA
yangdikehendaki, terjadi rekombinasi dengan DNA baculoirusdalam sel S% sehingga sekuens DNA yang menyandiprotein mantel irus "coat protein# utama, polyhedrin,diganti dengan protein yang dikehendaki. Dengan caraini akan dihasilkan ekspresi protein rekombinan dalamjumlah tinggi. Sel S% dapat melakukan glikosilasi"!alaupun secara struktural berbeda dengan sel mamalia#,dan dapat mengekspresikan lebih dari satu
proteinbersama-sama
sekaligus
"misalnya
imunoglubulin#.Protein
rekombinan biasanya akan terlokalisasi sepertipada sel normal "misalnya reseptor pada membran,transcription %actors pada nukleus#, !alaupun tingkatekspresi yang tinggi akhirnya dapat mengganggu pola ini.ingkat ekspresi yang tinggi akan memudahkan purifkasi,kecuali jika terjadi agregasi. Namun, untuk melakukanseleksi dan rekombinasi sejumlah besar protein mutanpada sistem ini masih agak sulit. kspresi pada galur sel mamalia )anyak protein memerlukan ekspresi memggunakan sistem sel mamalia. Malaupun sistem ini sangat jarang dapat menproduksi protein seefsien
.
coli
)aculoirus, kelebihannya
atau
salah
satu
adalah
mampu
memproses
polipeptida
kompleks menggunakan mesin intraseluler yang sesuai. Selain segi prosesing peptida, %olding, atau
glikosilasi
yang
dapat
dilakukan dengan tepat, untuk mengekspresi protein tertentu seringkali
diperlukan
kondisi
yang
hanya
dapat
dicapai
dengan
menggunakan sel homolog atau jaringan khusus "tissue specifc#. Sebagai contoh, untuk mempelajari beberapa reseptor atau transcription %actors maka
perlu
dilakukan
ekspresi
protein
tersebut
pada
sel
yang
mengandung co%aktor atau target yang sesuai. 0ntuk mammalian cell lines, ekspresi cDNA biasanya diatur dengan promotor
yang
kuat
dari
suatu
irus.
Sebagai
alternati%,
telah
dikembangkan ektor ekspresis yang dapat diinduksi yang memungkinkan untuk melakukan seleksi klonal yang kemudian diikuti dengan induksi promotor dengan cara menambahkan "atau menghilang# reagen tertentu "misalnya tetrasiklin# yang dapat memodulasi aktiitas promotor. Protein yang mengandung leader seLuence dapat disekresikan ke dalam media.
Hal
ini
mengakibatkan
kontaminan
media
pengenceran
ekstraseluler
akan
konsentrasi
protein,
jauh
sedikit
lebih
namun daripada
intraseluler sehingga isolasi dan purifkasi protein yang bersangkutan akan lebih mudah. kspresi menggunakan vektor adenovirus )anyak irus digunakan untuk ekspresi pada sel mamalia, meman%aatkan si%at tropisme alami irus dan kemampuan irus untuk menginduksi perubahan
mesin sintesis intraseluler sehingga menghasilkan
tingkat
ekspresi y ang t inggi. 7 ektor a denoirus s angat
menarik
karena t elah m engin%eksi b erbagai m acam s el mamalia
dan
adenoirus menghasilkan
karena
telah
irus
dapat
yang
tidak
genom diubah mapu-
replikasi dan dapat memba!a sekuens manusia.
Adenoirus
telah
banyak
digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan pada sel dan jaringan yang sulit ditrans%er. Penggunaan adenoirus sebagai ektor untuk terapi gen juga menjadikan sistem ini sangat menarik untuk ekspresi gen. Dengan menghilangkan gen-gen kunci adenoirus, irus yang susah dimodifkasi ini dapat ber%ungsi sebagai pemba!a gen mamalia. *emasukkan ektor irus yang mengandung gen yang dikehendaki ke dalam sel 82 yang mengekspresikan 1a memungkinkan untuk mengemas dan memanen irus serta irus tidak ber-replikasi pada sel lain. 7ektor adenoirus telah digunakan untuk mengekspresikan gen normal pada organ yang de%ekti% "misalnya
ekspresi
/
pada
penderita
cystic
fbrosis#,
untuk
mengekspresikan gen yang toksik pada tumor "misalnya timidin kinase pada tumor otak#, dan untuk mentarget gen cell-cycle arrest pada sel askuler yang sedang berproli%erasi. (eterbatasan adenoirus antara lain ketidakmampuannya untuk menerima DNA asing O15 kb, jangka !aktu ekspresinya relati% pendek in io "beberapa minggu sampai bulan#, toksik terhadap sel, dan menginduksi respon imun. )eberapa sistem pemba!a
irus lain sedang dikembangkan termasuk Adenoassociated irus, Herpes dan retroirus "yang berintegrasi ke dalam genom hospes#. 7aksin irus juga digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam cell lines, misalnya sel He'a, sebagai mekanisme yang efsien untuk ekspresi gen pada galur sel mamalia. Sistem lain untuk ekspresi protein rekombinan )anyak sistem lain yang digunakan tapi tidak akan dibahas di sini, antara lain produksi dalam susu binatang, Drosophila, ragi dan tanaman. PI$IAN OST UNTUK AMP$I2IKASI PROTEIN Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk %ag, bakteri, ragi, tumbuhan, jamur berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan he!an transgenik. Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifk dan aplikasi untuk protein
rekombinan.
Pemilihan
host
tidak
hanya
mempengaruhi
amplifkasi dan isolasi dari protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka untuk memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk serta integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh, system ekspresi bakteri tidak cocok jika modifkasi pascatranslasi diperlukan untuk menghasilkan produk rekombinan yang dapat ber%ungsi penuh. 'okasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat
mensekresikan
protein
ke
dalam
media
pertumbuhan,
mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma. KE$EBIAN DAN KEKURANGAN PROTEIN REKOMBINAN (elebihan )idang kesehatan 1. Produksi insulin
8. Penggunaan insulin untuk pasien diabetes dalam memproduksi insulin
sangatlah
banyak
sehingga
untuk
mendapatkannya
dibutuhkan inulin dari pankreas sapi atau babi yang cukup banyak pula. etapi dengan teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan para ilmu!an untuk mengembangkan insulin manusia sintetis. 2. *utasi *enggantikan gen yang rusak dengan gen yang sehat dilakukan dengan cara kloning untuk memperbanyak salinan. :en rusak oleh pasien disisipkan gen sehat untuk memulai %ungsi gen yang baru sehingga pasien dapat normal ?. (anker (anker adalah penyakit yang berb ahaya
dapat menyebabkan
kematian pada penderitanya, meskipun telah dilakukan kemoterapi tidak
menutup kemungkinan untuk pasien menderita kanker
tersebut kembali. De!asa ini, Para ilmu!an mencoba menganalisis dan mencari solusi pengobatan dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk mencegah pertumbuhan sel yang tidak terkontrol. 9. 7aksin DNA rekombinan juga telah mengembangkan aksin untuk penyakit seperti herpes, inuen$a, hepatitis dan penyakit menular lainnya. Enter%eron obat, yang digunakan untuk mengobati lim%oma dan leukemia myelogenous, juga merupakan hasil dari teknologi DNA rekombinan. 7aksin disisipkan pada produk tanaman seperti pada tanaman tomat atau kentang sehingga dalam proses pengirim an dan penyimpanan, dibandingkan dengan aksin injeksi. )idang pertanian 1. (euntungan kepada petani yaitu dengan menekan pengeluaran biaya
untuk
pembelian
pestisida.
Selain
itu,
P/:
juga
mengurangi hilangnya pasar akibat penolakan konsumen atas komoditas yang tercemar oleh pestisida, serta dapat menekan rusaknya
lingkungan
akibat
penggunaan
pestisida
yang
berlebihan dalam pengendalian hama dan penyakit. Hasil penelitian menunjukkan bah!a penanaman ).t. corn dapat
secara nyata menekan aplikasi pestisida dan mengurangi hilangnya biaya pengendalian P 8. oleran terhadap jenis herbisida. DNA rekombinan memberikan keuntungan biaya dalam mengatasi gulma karena petani tidak memerlukan penggunaan herbisida dalam jumlah besar dengan berbagai
jenis
herbisida.anaman
hasil
rekayasa
genetika
tersebut resisten terhadap jenis herbisida,contohnya
strain
kedele hasil rekayasa genetika *osanto yang tidak memiliki e%ek negati% apabila diaplikasikan herbisida jenis /oundup. 2. ahan terhadap serangan penyakit tanaman. )eberapa cenda!an, irus, dan bakteri banyak menimbulkan kerugian. Para pakar ftopatologi telah banyak menemukan beberapa arietas tanaman hasil rekayasa genetika yang tahan terhadap seranagan penyakit. ?. pengembangan padi yang berisi tingkat peningkatan besi dan itamin, untuk digunakan di negara-negara Asia di mana kekurangan gi$i kronis adalah masalah. *enurut situs tersebut, daerah
baru
dalam
pengembangan
meliputi
pisang
yang
memproduksi aksin untuk mencegah penyakit menular dan ternak yang tahan terhadap boine spongi%orm encephalopathy "penyakit sapi gila# 9. *eningkatkan efsiensi %otosintesis, sehingga hasil panen dengan mengkonersi tanaman 2 dan ? oleh rekombinasi genetik Ke#"ian )ahaya lingkungan )ahaya lingkungan yang mungkin diakibatkan oleh penggunaan produk rekayasa genetika antara lain ; 1. (ekha!atiran etis eknologi ini juga menimbulkan kekha!atiran etis, terutama ketika gen manusia dimasukkan ke dalam organisme bukan manusia yang kemudian menjadi sebagian manusia. Di ina, DNA manusia sedang ditempatkan
dalam
tomat
dan
paprika
untuk
mempercepat
pertumbuhan mereka. imbul pertanyaan; Apakah makan tomat yang mengandung DNA manusia membuat Anda kanibalB.
8. (ematian organisme bukan target. Hasil penelitian laboratorium menunjukkan bah!a arietas jagung ).t. telah menyebabkan kematian yang tinggi pada &monarc butter'y caterpillarsI meskipun serangga ini tidak menyerang tanaman jagung. Hal ini karena pollen jagung
).t
terba!a
oleh
angin
ke
tanaman milk,eed yang
merupakan inang &monarc butter'y caterpillarsI. 2. Penurunan e%ektiftas dari pestisida. Penggunaan
tumbuhan yang
tahan terhadap hama secara terus menerus dapat menstimulir munculnya gen-gen baru hama yang tahan&resisten terhadap beberapa jenis pestisida. ?. rans%er gen kepada spesies yang tidak menjadi target. (asus munculnya I super,eedsI yang sangat resisten terhadap herbisida akibat penggunaan rekayasa genetika " soybean roundup #. Hal ini terjadi karena adanya trans%er gen dari tumbuhan ke gulma. :angguan kesehatan :angguan kesehatan yang mungkin diakibatkan oleh penggunaan produk rekayasa genetika anatara lain; 1. penggunaan DNA rekombinan dalam produk makanan mengkha!atirkan %ek jangka panjang pada kesehatan manusia masih belum diketahui dan dipastikan keamanannya. *enurut pro%esor
Enggris
*ae
Man-Ho,
DNA
rekombinan
dapat
membahayakan karena memasukkan gen asing ke dalam genom. hal ini dapat menimbulkan e%ek berbahaya dan %atal, termasuk kanker. 8. gangguan kesehatan bagi manusia, adalah Alergi. )eberapa produk makanan yang berasal dari hasil DNA rekombinan
menimbulkan
dampak alergi terhadap manusia. Entoduksi gen tertentu seperti gen kacang-kacangan ke dalam tanaman kedelai dapat menimbulkan reaksi allergi yang berpengaruh terhadap ketahanan tubuh. 2. Pengaruh lain yang belum diketahui. Pengaruh hasil rekombinan
DNA
terhadap kesehatan masih terus diteliti, akan tetapi
berdasarkan penomena yang telah terjadi seperti kasus cross polinasi dan kasus alergisitas, para ahli berpendapat kemungkinan reaksi buruk yang lain dapat terjadi.
Pertimbangan ekonomi Penggunaan dinilai tidak ekonomis dan merugikan petani, karena untuk menghasilkan membutuhkan biaya yang tinggi dan selanjutnya biasanya dipatenkan oleh penciptanya. )iaya penelitian dan hak paten Produk hasil DNA rekombinan akan dibebankan kepada pengguna "petani# melalui penjualan yang mahal. Selain itu, Produk hasil DNA rekombinan pada umumnya tidak menghasilkan keturunan dan digunakan hanya satu kali tanam. (ondisi ini tentunya menimbulkan ketergantungan yang tinggi petani terhadap benih oleh perusahaan penghasil .
PERBEDAAN BIOTEKNO$OGI KON3ENSIONA$ DAN MODERN *enurut the 0nited Nation onention on )iological Diersity, terminologi
bioteknologi
meman%aatkan turunannya
sistem
guna
diartikan biologi,
sebagai
teknologi
organisme-organisme
menyempurnakan
produk
atau
aplikati% hidup proses
yang atau untuk
kepentingan spesifk. Ada 8 jenis bioteknologi, yakni "sederhana# dan bioteknologi modern.
bioteknologi
)ioteknologi konensional menerapkan
konensional
biologi, biokimia, atau
rekayasa masih dalam tingkat yang terbatas. )ioteknologi konensional menggunakan jasad hidup secara utuh. )ioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-1. Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan aksin, antibiotik, dan insulin !alaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses %ermentasi yang tidak sempurna. )ioteknologi modern telah menggunakan teknik rekayasa tingkat tinggi dan terarah sehingga hasilnya dapat dikendalikan dengan baik. eknik yang sering digunakan adalah dengan melakukan manipulasi genetik pada suatu jasad hidup secara terarah sehingga diperoleh hasil sesuai dengan yang diinginkan. Pada masa ini, bioteknologi berkembang
sangat pesat, terutama di negara negara maju. (emajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. eknologi ini memungkinkan untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun AEDS. Dari hasil penelitian, ilmu!an memperkirakan lebih dari ?555 masalah kesehatan disebabkan atau ada keterkaitannya dengan gen manusia. Sebagian penyakit disebabkan oleh kelainan gen, yang lain bisa merupakan kombinasi kelainan genetik dan %aktor pola hidup&lingkungan. eknik yang digunakan dalam bioteknologi modern adalah teknik manipulasi bahan genetik "DNA# secara in itro, yaitu proses biologi yang berlangsung di luar sel atau organisme,
misalnya
dalam
tabung
percobaan.
leh
karena
itu,
bioteknologi modern juga dikenal dengan rekayasa genetika, yaitu proses yang ditujukan untuk menghasilkan organism transgenik. rganisme transgenik adalah organisme yang urutan in%ormasi genetik dalam kromosomnya telah diubah sehingga mempunyai si%at menguntungkan yang dikehendaki. )eberapa prinsip dasar dalam rekayasa genetika, yaitu DNA rekombinan, %usi protoplasma, dan kultur jaringan. Pe#'e%aan Biotenoloi Kon4ensional %an Biotenoloi Mo%e#n 1. )ioteknologi (onensional - 'angsung men ggunakan makhluk hid up dan belum mengetahui -
penggunaan en$im anpa didasari prinsip ilmiah )erdasarkan keterampilan yang di!ariskan turun temurun idak sepenuhnya diproduksi secara masal )ioteknologi yang menggunakan mikroorganisme untuk
memproduksi alkohol, asam asetat, tempe, tahu, oncom, dll 8. )ioteknologi *odern -
*emakai makhluk hidup dan komponennya secara langsung *enggunakan prinsip-prinsip ilmiah Hasil pengkajian berbagi disiplin ilmu yg mendalam Diproduksi secara masal *engupayakan membuat produk dengan e%ekti% dan efsien Didasarkan pada manipulasi atau teknik DNA disamping menggunakan dasar mikrobiologi dan biokimia
-
idak hanya digunakan pada industri makanan namun juga telah
-
meliputi banyak bidang, seperti teknik genetik. Dengan beragamnya penelitian dan perkembangan keilmuan serta teknologi, keuntungan yang lebih besarpun didapatkan.
ontoh 1. 7aksin ontoh; 7aksin Hepatitis ) dan malaria. Secara konensional pelemahan kuman dilakukan dengan pemanasan atau pemberian bahan kimia. Dengan bioteknologi dilakukan %usi atau transplantasi gen.
8. Hormon ontoh; Hormon Ensulin. Penderita penyakit Diabetes mellitus kekurangan hormon insulin sehingga kadar gula dalam darahnya sangat tinggi. Dengan adanya bioteknologi, saat ini hormon insulin telah dapat dihasilkan secara buatan "transgenik# dengan bantuan bakteri Escherichia coli. Pembuatan insulin dilakukan dengan menyisipkan gen insulin ke dalam bakteri. Pada sel bakteri . coli, dimasukkan DNA sel manusia yang mengandung gen insulin sehingga bakteri . coli dapat menghasilkan insulin. (arena bakteri dapat berkembang biak dengan cepat maka hormon insulin pun dapat dihasilkan dalam jumlah yang banyak. (ini, insulin mudah didapatkan oleh penderita diabetes mellitus dalam bentuk cair.
+onto5 P#o%" 2a#masi Be#'asis Biotenoloi 1. P#o%"si "man Tiss"e Plasminoen A&ti4ato# (tPa) -a%a tanaman Cucumis sativus *erupakan salah satu dari empat jenis aktiator plasminogen "urokinase, streptokinase, tPa, dan DSPAQ1#. Diproduksi di dinding hati dan pada pembulu darah. *erupakan en$im dengan berat molekul K8kD dan tersusun dari 98K asam amino. *erupakan en$im yang terlibat dalam proses pemecahan gumpalan darah dengan mengkatalisis
konersi
plasminogen
menjadi
plasmin
.
Hasil
rekombinannya banyak digunakan untuk pengobatan penyakit jantung dan oklusi pembulu darah otak . Pa masih sangat dibutuhkan untuk pengobatan penyakit jantung . (arena onset kerja tPa yang cepat dalam pengobatan. Hal itulah yang mendasari berkembangnya teknologi rekombinan untuk menghasilkan tPa dalam skala lebih besar. Pada a!alnya tPa berasal dari ekstraksi Human )o!es *elanoma
ells
.
Selanjutnya
dikembangkan
dengan
teknik
rekombinan pada Aspergilus nidulans *el mamalia *el insekta *. "ere+isiae dan E. coli. Dengan adanya teknologi molekuler %arming dikembangkan lah rekombinan protein oada tanaman mentimun. *olekuler arming adalah suatu proses penggunaan tanaman dan he!an yang direkayasan secara genetis sebagai suatu materi baru dan termodifkasi (Da4ies an% +5am'e#s, !666) Alasan dipilih teknik rekombinan dengan bantuan tanaman karena tanaman dapat memproduksi protein tanpa mengubah struktur asli tanaman. DNA yang mengandung tPa ditrans%er kedalam nukleus tanaman dengan bantuan Agrobacterium (euntungan lain menggunakan tanaman adalah ; • anaman dapat memproduksi protein kompleks yang tidak •
dapat diproduksi oleh yeast atau bakteri anaman dapat memproduksi protein dalam jumlah banyak
•
pada jaringannya anaman dapat tumbuh pada skala pertanian yang cukup besar hanya
dengan
Dibandingkan
air, dengan
mineral
dan
kultiasi
sel
cahaya
matahari.
mamalia
yang
membutuhkan proses yang lebih sulit dan mahal (No##is, !66)
Meto%oloi Penelitian Plasmi% %an Bate#i Dalam penelitian ini, cDNA dari gen tPA manusia ":ene )ank 6umlah aksesi E515?K# dengan Sac E dan )am HE situs restriksi di kloning
ke
dalam
ekspresi
tanaman
ektor
p)E181
yang
mengandung kembang kol mosaik irus promotor a*7 29S dan urutan terminator transkripsi "NS#, dan gen -glucuronidase. 0rutan (o$ak dan sinyal (D' melekat pada amino dan karboksi terminal gen PA masing-masing. tPA diamplifkasi dengan primer yang
mengandung
G)A
E
dan
Hinc
E
situs
-
restriksi
gagtctagataaacatggatgcaatgaagagaaccc-0, termasuk urutan (o$ak sebelum kodon mulai menjadi primer "A#, dan atagtcaactcatagctcatctttcggtcgcatgttg-0, termasuk urutan (D' sebelum
menghentikan
kodon
sebagai
primer
terbalik
"/A#.
(emudian dimasukkan ke dalam tanaman ektor biner p)E181 "diambil dari NE:)# di ba!ah kendali kembang kol irus mosaik promotor
29S
dan
NS
terminator.
)agian
tengah
gen
ini
diamplifkasi dengan dua primer "); 9J-ttgatgcgaaactgaggctg-2J dan /); 9J-cttctcagatttcgtgstacc-2J# dan konstruk akhir disebut sebagai p)EtPA. 1,K-kb polymerase chain reaction "P/# produk dimasukkan ke dalam dua a*729S dan NS terminator "dari gen nptEE# dan hilir dari ektor p)E181 dengan situs restriksi G)A E dan )am HE "selama subcloning dari p/8.1 di p)E181#. (emudian diisi ulang dengan DNA ? ligase. T#ans7o#masi mentim"n
Dalam percobaan ini, eksplan kotiledon tanaman mentimun "s%ahan arietas lokal# yang digunakan. )iji mentimun didesin%eksi. Setelah = hari, kotiledon diisolasi dari batang dengan melengkung dan dibagi menjadi 9<9-mm. 0ntuk memerifkasi regenerasi yang tepat, eksplan kotiledon tanaman mentimun ditempatkan pada media *S dengan hormon na%talen asetat "NAA# dan konsentrasi yang berbeda hormon purin amino ben$il ")AP#. 6uga, di tes lain, yang berbeda konsentrasi antibiotik kanamisin digunakan untuk menghilangkan sel non-transgenik. Dimurnikan dari scherichia coli, plasmid
p)E181
"mengandung
gen
tPA#
dipindahkan
ke
Agrobacterium ')A??5?. rans%ormasi gen tPA ke dalam eksplan kotiledon dari tanaman mentimun dilakukan melalui Agrobacterium dan metode manual.
Analisis P+R %an RTP+R (arena
tanaman
resisten
terhadap
antibiotik
kanamisin
mungkin tidak benar untuk tanaman reansgenik-untuk contoh, selsel tumbuhan hanya menerima ektor "tanpa tPA gen# reaksi P/ digunakan untuk mengkonfrmasikan keberadaan gen. kstraksi DNA dari daun mentimun muda segar diregenerasi pada medium selekti% yang dilakukan melalui *etode A). (eberadaan gen tPA diselidiki dalam sel tumbuhan mentimun yang diregenerasi pada media selekti% dengan reaksi P/ dan tPA gen spesifk primer. 0rutan dari primer adalah sebagai berikut; -tPA; 9J:A:A:AAAAAA::A:AA:AA:A:A::: 2J /-tPA; 9JAA:AAAA:A:::A:: 2J (ondisi yang diperlukan untuk proli%erasi DNA dari gen tPA termasuk denaturasi a!al 1C5s&95, 29 siklus denaturasi =5s&95, annealing 25s&=55, dan elongasi 185s&K8 5. Produk P/ diperiksa pada 13 gel agarose dan :elred. Daun muda mentimun transgenik dan larutan /NG-Plus "Synagene, Enc# digunakan untuk ekstraksi /NA. Pembangunan cDNA dilakukan menggunakan kit ekstraksi
cDNA "ermentase o#. /eerse-transkripsi "/# -/ reaksi dan primer spesifk "dirancang dari gen tengah# yang digunakan untuk ekspresi gen tPA di sel tumbuhan mentimun transgenik. 0rutan primer adalah sebagai berikut; -tPA; 9J::::AAAAAA:A:AAA 2J /-tPA; 9J:AAA::AA:A:::: 2J (ondisi untuk amplifkasi cDNA gen tPA termasuk primer dengan denaturasi 1C5s&95, 29 siklus tiga langkah denaturasi =5s&95, annealing ?9s&=55, dan elongasi ?5s&K85. Dot Blot En8yme Im"noassay Produksi dari protein rekombinan tPA pada sel timbuhan ketimun transgenik telah diinestigasi melalui teknik dot blot dan menggunakan antibodi yang spesifk. 0ntuk menggunakan teknik ini untuk mendeteksi produksi protein rekombinan tPA pada ekstrak tumbuhan transgenik. Pertama, 85 ng protein absolut tPA "kontrol positi%# dan protein terekstrasi dari daun transgenik dan tumbuhan non-transgenik "sebagai kontrol# yang ditempatkan pada kertas selulosa. )agian dari kertas lainnya diblock dengan serum albumin babi. (emudian kertasnya dicuci dengan bu+er P)S- dan telah ditambahkan antibodi primer "?55 mikrogram&m'#. Setelah dicuci, antibodi
secondary
prroksidase-linked
telah
diakui.
Dengan
menambahkan substrat en$om yang mengandung larutan noda DA) dengan H88, perubahan !arna diamato hanya pada ekstrak tumbuhan yang mengandung protein tPA. Analisa SDSPAGE 0ntuk mendeteksi massa molekul dari protein rekombinan tPA "terhadap protein lain yang diproduksi pada tumbuhan ketimun transgenik yang dibandingkan dengan tumbuhan non-transgenik#, dilakukan elektro%oresis gel poliakrilamid "PA:#. *etode simpel ini mempunyai
pemecahan
yang
tepat
untuk
identifkasi
dan
kemurnian protein secara spesifk. Pada penelitian ini, metode sodium dedocyl sul%at "SDS# PA: dengan sedikit modifkasi yang digunakan untuk elektro%oresis protein. :el terdiri dari dua bagian ; pemisahan gel dengan konsentrasi 18,9 3 dan pengahambatan gel dengan konsentrasi ?3. 0ntuk menyiapkan gel ini, dibutuhkan akrilamid, bisakrilamid, SDS, tris dan *D yang telah digunakan. Di akhir proses elektro%oresis, pe!arnaan dan pemutihangel telah terdeteksi pada scanner. En8yme% $ine% Im"noso#'ent Assay 'ESA telah digunakan untuk penetuan secara kuantitas dari protein rekombinan tPA relati% terhadap protein terlarut pada tanaman
ketimun
transgenik.
ujuannya,
setelah
penentuan
densitas dari protein yang telah diekstrak pada tanaman transgenik maupun daun non transgenik dengan spektro%otometer, 95 ng setiap sampel ditempatkan pada piring dengan 9 kali pengulangan. Dan
juga,
untuk
prosedur
kura
standar,
digunakan
enam
konsentrasi protein tPA yang berbeda. Setelah semua tahap percobaan selesai dilakukan, termasuk penambahan protein non rele
asil %an Pem'a5asan T#ans7o#masi +"&"m'e# :en tPA dikloning ke dalam ektor p)E181 ba!ah promotor a*729S, (o$ak urutan, dan sinyal (D'. (loning gen tPA
dikonfrmasi oleh koloni P/, en$im pencernaan, dan seLuencing. *aka struktur dihasilkan ditrans%ormasikan ke sel inang bakteri ". coli galur DH9a#. p)E181-tPA membentuk in%ormasi ditunjukkan pada :ambar 1
Studi mengenai regenerasi sel tumbuhan mentimun dilakukan dalam konsentrasi NAA dan )AP yang berbeda. *enurut Abuka$emy et al. "8511# regenerasi terbaik tercapai pada media *S dengan hormon NAA "5,1 mg&'# dan )AP "2 mg&' #. Setelah mempersiapkan eksplan kotiledon, inokulasi yang dilakukan oleh Agrobacterium yang mengandung struktur p)E181-tPA. (onsentrasi terbaik dari antibiotik kanamisin untuk eliminasi sel non-transgenik , yaitu ?5mg&'. Pemilihan tanaman transgenik
dilakukan melalui regenerasi pada media selekti% yang mengandung antibiotik kanamisin. Dalam hal ini, eksplan yang tidak menerima konstruksi, tidak mampu regenerasi pada media selekti%. Analisis Mole"le# %a#i Reene#asi Tanaman +"&"m'e# /eaksi P/ dengan primer gen spesifk dilakukan pada DNA yang diekstraksi dari tanaman mentimun. )eberapa band yang diamati pada 1K55 bp tanaman transgenik. (ehadiran single band di sekitar 1K55 bp di setiap tanaman regenerasi dengan ketiadaan pada
tanaman
kontrol
adalah
alasan
trans%ormasi ke tanaman mentimun.
kuat
untuk
tPA
gen
/ P/ dilakukan pada produksi cDNA. /-P/ dengan primer spesifk dari tengah gen menunjukkan beberapa band di sekitar 955 bp. idak adanya band-band ini pada tanaman non-transgenik adalah
alasan
untuk
ekspresi
gen tPA dalam
tanaman
transgenik.
Dalam penelitian ini, telah di jelaskan bah!a pada a!alnya, kloning gen tPA ke ektor p)E181 dikonfrmasi dengan reaksi ; •
P/ kloning
•
n$im pencernaan
•
SeLuencing Setelah ditrans%ormasi pada sel nukleus tanaman mentimun
dengan bantuan Agrobacterium dan regenerasi pada medium yang
selekti%, keberadaan dan ekspresi gen tPA dikonfrmasi dengan tes menggunakan P/ dan /-P/. Akhirnya, produksi tPA protein dan nilai relati% terhadap nilai total protein terlarut ditentukan oleh tiga percobaan, yaitu ; •
Dot )lot
•
SDS Page
•
'ESA
Dot Blot Dot blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifkasi protein. Protein sampel tidak dipisahkan melalui elektro%oresis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Prinsip nya adalah
penempelan
protein atau asam nukleat secara langsung pada membran. Sampel yang terlarut ditarik melalui membran baik menggunakan akum, maupun absorpsi dan intrusi, sehingga protein berikatan dengan membran sedangkan komponen lainnya dapat mele!ati membran Dalam percobaan ini, ada atau tidaknya protein tPA diantara semua protein yang diekstraksi pada daun tanaman transgenik diselidiki dengan antibodi spesifk. Setelah menambahkan substrat ikatan en$im antibodi sekunder, termasuk larutan pe!arna DAB, !O! ,
dan PBS. Amati perbedaan !arna ; Est#a yan menan%"n -#otein tPA R dari tidak ber!arna hingga coklat
Tanaman nont#anseni Ridak ada perubahan yang terlihat. Dari hasil yang diperoleh diketahui bah!a ariasi dalam intensitas !arna pada sampel kontrol positi% "T protein tPA murni# mungkin karena perbedaan konsentrasi yang tidak diinginkan. Perbedaan antara tanaman non-transgenik
"!t# karena adanya
kotoran dalam ekstrak protein. SDSPAGE Seluruh
protein
yang
telah
ditrans%ormasikan
kemudian
diekstrak dari daun tanaman timun transgenic dan daun tanaman timun non-transgenik. Pengujian dengan SDS-PA: ini digunakan untuk mendeteksi berat molekul dari protein rekombinan tpa . Selain itu SDS U PA: ini juga tepat digunakan untuk identifkasi dan pemurnian protein spesifk. Pada 6urnal ini SDS U PA: digunakan untuk penentuan Lualitas protein. Pada hasil SDS-PA:, terlihat pita-pita dengan Mt sebagai sampel control yaitu tanaman timun non-transgenik, ' sebagai marker molekul protein, sampel 1- 2 adalah sampel tanaman timun transgenic.
Pada satu dari tiga tanaman timun transgenic dibandingkan dengan tanaman timun non transgenic "kontrol#. Pita tambahan terlihat pada area =5-=KkDa ")erat protein tPA # dimana pita ini tidak terlihat pada tanaman control.
E$ISA (n!yme "inked #mmunosorbent $ssay ) Pengujian
lisa
digunakan
untuk
menentukan
jumlah
Luantitas protein rekombinan tPA dalam sejumlah protein terlarut dalam tanaman timun transgenik. Setelah dilakukan seluruh langkah, absorbansi dari tanaman timun
transgenic
dan
nontransgenik
gelombang ?95nm. Hasil dari elisa
diukur
pada
panjang
menunjukan bah!a
laju
absorbansi tanaman timun transgenic dua kali lebih banyak dari non transgenic. Protein tPA murni sebagai control diukur pada panjang gelombang ?95nm dan dibuat kura standardnya. Dari kura standard tersebut rata rata absorbansi dari masing masing tanaman dengan 2 replikasi ditempatkan di persamaan standard sehingga diperoleh hasil.
:ambar b menunjukan grafk jumlah tPA yang dihasilkan. (emudian jumlah protein rekombinan tPA yang dihasilkan dibandingkan dengan
total
transgenic
protein
untuk
pada
dihitung.
masing
masing
Hasilnya,
laju
tanaman produksi
timun protein
rekombinan tPA pada tanaman timun transgenic paling kecil 5.C3 Pada
tahap
cloning
a!al,
gen
ditrans%ormasi
oleh
Agrobacterium dan mendapatkan Protein rekombinan Human issue Plasminogen di dalam sel tanaman timun. (loning DNA tPA dilakukan ke ector p)E181 dikonfrm dengan P/ cloning reactor
En1yme digestion dan SeLuencing. Setelah itu ditrans%ormasikan ke medium
yang
selekti%,
keberadaan
dan
ekspresi
gen
tPA
dikonfrmasi dengan P/ dan /-P/. erakhir yaitu produksi protein rekombinan tPA dan perhitungan jumlah relatie dan jumlah total protein terlarut dengan 2 eksperimen yaitu Dot- blot, SDS-PA: dan 'ESA.
Sistem produksi protein rekombinan %armasi menggunakan sistem mikroba, serangga dan kultur sel mamalia, dan he!an transgenik memiliki kelemahan dalam hal biaya produksi, keamanan produk, dan integritas menyebabkan produksi protein pada tanaman meningkat. bat protein tPA lebih disukai dibandingkan dengan obat lain yang serupa. Maktu paruh plasma berkurang pada /eteplase, Saruplase, 'anutplase dan dosis lebih rendah daripada /eteplase dan
'antuplase.
Spesifsitas
tPA
jauh
lebih
besar
daripada
streptokinase. Namun, perkiraan biaya setiap perlakuan lebih besar dibanding streptokinase. Dalam penelitian ini, ditemukan bah!a dengan banyaknya produksi tanaman mentimun menyebabkan pengobatan penyakit menjadi lebih mudah. Nilai protein rekombinan dalam tanaman transgenik dilaporkan antara 5,5583 dan K3 dari total protein larut tergantung pada %aktor ekspresi gen spesifk dan tanaman yang digunakan untuk trans%ormasi. Namun, dalam penelitian ini, tingkat ekspresi protein tPA relati% terhadap total protein yang terlarut dalam tanaman mentimun transgenik, yaitu 5,C-13. Adanya tiga %aktor regulasi ekspresi yaitu "a*7 29S, (o$ak, NS# dan (D' menyebabkan
peningkatan
ekspresi
gen
tPA
pada
tanaman
mentimun. *enurut penelitian lain, ekspresi gabungan ini digunakan untuk produksi H:*-S di tanaman tomat dan menyebabkan produksi protein reko mbinan 6,6!9 dari total protein yang larut. Alasan untuk peningkatan produksi tanaman mentimun mungkin adalah kombinasi gen dengan sinyal (D'. Sehingga, sangat
meningkatan akumulasi protein rekombinan dalam tanaman. ara ealuasi, %aktor, dan metode
lain untuk meningkatkan efsiensi
trans%er gen untuk produksi protein tPA pada mentimun dan tanaman lainnya dianjurkan.
A'st#a elah dirancang dan diimplementasikan sebuah sistem ekspresi yang berdasar pada promotor arabinosa dalam E. coli untuk produksi dan pemurnian rekombinan hormon pertumbuhan manusia "rh:H#. Studi
shake 'ask menunjukkan jumlah rh:H yang terekspresi di dalam ector p)AD8? "p)AD8?*# cukup besar dibandingkan dengan ektor p)AD8? asli. Sementara, tingkat rh:H hanya mencapai K9 mg l-1 dengan p)AD8? di dalam bioreaktor, dan mencapai 4 1C=5 mg l-1 dengan ektor p)AD8?* di ba!ah kondisi yang sama sebagaimana dinilai oleh densitometri protein yang diselesaikan dengan natrium dodesil sul%at-SDS-PA: "SDS-PA:#. Protein rh:H berhasil dimurnikan dari badan inklusi setelah denaturasi urea oleh dua langkah kromatograf pertukaran ion sederhana dengan pemulihan keseluruhan sebesar ?53 dari 4 K95 mg l
-1
h:H yang
dimurnikan yang merupakan hasil tertinggi yang dilaporkan dari rh:H yang dimurnikan selama ini. )akteri murni deriate rh:H dikarakterisasi dengan N-terminal seuence, studi spektrum D, analisis sidik jari massa dan analisis Agilent 8155 bioanaly$er. )ioaktiitas dari rh:H yang dimurnikan adalah sebanding dengan h:H yang tersedia secara komersial "Somatotropin#. Pen%a5"l"an Hormon pertumbuhan manusia "h:H# adalah hormon protein heterogen yang terdiri dari beberapa iso%orm dan gen :H cluster pada kromosom 1KL yang berisi 8 gen :H ":H1 atau :H-N dan :H8 atau :H-7# selain
itu
8
sampai
2
gen
yang
mengkode
terkait
chorionic
somatomammotropin ")aumann, 855#. Hormon pertumbuhan manusia 1 "h:H1# merupakan peptida kecil, satu-rantai dari 11 residu, diproduksi dan disekresikan oleh kelenjar hipofsis anterior. Protein ini bertanggung ja!ab untuk e%ek dalam metabolisme protein, karbohidrat dan lipid serta pertumbuhan dan kekebalan "6orgensen, 1CK# dan digunakan dalam pengobatan d!arfsme hypopituitary "Hindmarsh dan )rook, 1K#. )erbagai sistem ekspresi
yang telah dicoba untuk ekspresi h:H termasuk )acillus subtilis "ranchi et al., 11#, sel mamalia seperti H "Dallia et al. 8552#, sistem baculoirus ":eng et al., 8558# dan ragi seperti 2ichia pastoris "Ascacio*artine$ dan )arrera-Saldana, 855?T. Deshpande et al, 855#. *eskipun keberhasilan
masing-masing
sendiri,
sistem
penggunaan
E.
memiliki coli
kelebihan
untuk
produksi
dan rh:H
didokumentasikan dalam beberapa laporan dengan tingkat keberhasilan yang lebih tinggi. Selama gen tersebut tidak terglikosilasi, maka diekspresikan dalam E. coli ":oeddel et al., 1K#. Aspek yang menarik dari sistem E. coli sehubungan dengan h:H adalah bah!a rh:H telah diuji untuk ekspresi dalam ruang periplasmic E. coli "hang et al, 1CKT. :horpade dan :arg, 12# dan di sitoplasma sebagai badan inklusi "*ukhija et al, 19T Schoner et al, 18#. Sistem promotor induksi kuat "misalnya lac, K, trpA, tac, lambda p' dan
lainnya#
yang
menguntungkan
biasa
selama
digunakan memproduksi
dalam protein
E.
coli
rekombinan
rekombinan
pada
kepadatan sel yang tinggi dalam %ermentasi %ed-batch. Dari jumlah tersebut, promotor arabinose adalah sistem yang terpelajari dengan baik karena menggunakan biaya rendah, memiliki peraturan ketat dan menghasilkan ekspresi tingkat tinggi dari gen pada induksi ")anerjee et al., 855#. (arena sistem ara dapat diinduksi oleh arabinosa dan ditekan oleh kedua represi katabolit dengan keberadaan glukosa atau dengan mengikat kompetiti% dari anti-inducer fucose, plasmid ini memiliki tingkat latar belakang yang sangat rendah dalam berekspresi. Selain itu, ekspresi gen dapat diakti%kan dan dinonakti%kan cepat dengan mengubah gula di dalam medium "Siegele dan Hu, 1K#. ujuan peneliti adalah untuk mengembangkan hasil yang tinggi dari rh:H1 "selanjutnya disebut sebagai rh:H# dikloning dalam sistem E. coli (18 diba!ah promotor arabinosa. Hal ini terutama dipilih karen a E. coli (18 memiliki tingkat biosa%ety organisme leel E, ia merupakan strain recA minus, mampu mempertahankan jumlah tinggi salinan plasmid dan bebas dari bakterio%ag terintegrasi endogen. Peneliti juga mencoba bekerja pada
protokol pemurnian sederhana untuk pemurnian bacteria deriat dari rh:H sehingga protokol bersi%at scalable dan hemat biaya. 6urnal ini juga %okus pada karakterisasi seperti persiapan rh:H yang dimurnikan. Meto%e Penelitian Ba5an %an meto%e Gal"# (st#ain) 'ate#i, -lasmi%, %an on%isi -e#t"m'"5an . coli galur DH9 α digunakan untuk studi trans%ormasi, propagasi dan ekspresi. (edua plasmid p)AD8? "dari Dr. >asuda, Enstitute o% :enetics, 6epang# dan modifed ektor p)AD8?, p)AD8?* ")anerjee et al., 855# dengan Shine-Dalgarno "SD# seLuence teroptimalisasi dan Kg15 enhancer digunakan untuk studi kloning dan ekspresi. n$im restriksi dibeli dari )angalore :enei, )angalore Endia sementara 'arabinosa diperoleh dari Hi *edia, *umbai, Endia. Antibodi poliklonal anti-h:H adalah dari Abe
Klonin %an es-#esi 5G -a%a 4eto# -BAD!: %an -BAD!:M :en h:H diamplifkasi P/ menggunakan gen h:H sintetis sebagai template untuk menghasilkan produk P/ dari 9C9 bp. Pemendekan co/E & HindEEE produk P/ diligasi ke ektor p)AD8? selama 1= jam pada suhu kamar. Selain itu, aliLuot lain dari produk P/ dipendekkan dengan NdeE & HindEEE dan diikat ke ektor p)AD8?* ")anerjee et al. 855# di tempat yang sama. Setelah trans%ormasi sel DH9 α baik dengan ligasi yang bercampur dengan bebas, rekombinan dipilih oleh koloni P/ yang menggunakan primer spesifk gen h:H. plasmid rekombinan yang memba!a gen h:H yang dikonfrmasi lebih lanjut dengan analisis restriksi dan sekuensing DNA. Sel . coli DH9 α yang mengandung baik p)AD8?-
h:H atau rekombinan p)AD8?*-h:H ditumbuhkan dalam ') dengan ampisilin 155 mg ml-1 dan diinduksi dengan 12 m* arabinosa selama ? jam pada suhu 2Ko. Pada akhir induksi, sel-sel yang diinduksi dipanen dan dipisahkan antara %raksi yang larut dan %raksi yang tidak larut. (edua %raksi dianalisis pada 18,93 SDS-PA: dan diisualisasikan dengan oomassie )lue Staining. Penent"an 5asil 5G men"naan %ensitomet#i Scanning densitometri telah dilaporkan sebagai metode yang dapat diandalkan untuk kuantisasi pita protein pada gel poliakrilamida oomassie blue-stained "7incent et al., 1K#. leh karena itu, protokol Dallia et al. "8552# diikuti untuk parameter ini. Pita protein h:H pada gel poliakrilamida oomassie blue-stained dikuantitati% menggunakan sistem )io
/ad
Emager
")io-/ad,
0SA#.
Hasil
h:H
ditentukan
dengan
membandingkan angka pita monomer rh:H dengan jumlah standar )SA run di gel yang sama.
St"%i 'io#eato# )ibit Enokulum disiapkan dengan menginokulasi . coli DH9 α cells yang memba!a plasmid p)AD8 ?-h:H atau p)AD8?*-h:H, pada media ') dan ditumbuhkan selama 1= jam pada suhu 2K W dengan agitasi pada 855 rpm. ermentasi dilakukan dalam 9' bioreaktor "Sartorius, 6erman# untuk mencapai ekspresi rh:H tingkat tinggi. ermentasi dilakukan dalam medium 8,9 ' dalam modus batch. *edium terdiri dari ekstrak ragi "2,=3#, tryptone "1,C3#, "NH?# 8S? "5,123#, NaH8P? "5,23#, Na8HP? "5,?3#, (l "5,5=K3#, *gS? "5,593#, gliserol "1,93# dan ampisilin "155 mg ml1#. *edium %ermentasi diinokulasi dengan oernight seed cultur pada 153 & . Aerasi disimpan pada 1 m "olume udara & olume %ermentasi menengah & menit# dan suhu dipertahankan pada 2K W dengan PED
kontroler pada instrumen. Sementara agitasi ditetapkan antara 255-C55 rpm,
tingkat
oksigen
terlarut
dipertahankan
pada
253
dengan
penambahan otomatis oksigen murni ke udara, yang dikendalikan oleh pengontrol aliran massa pada instrumen. ermentasi dilakukan pada pH K,55 yang dikendalikan dengan penambahan otomatis baik 253 H2P2 atau 183 NH?H dan %oaming dikendalikan dengan penambahan 5,593 anti%oam 0S 1915 "Do! orning, 0SA#. (ultur yang tumbuh diinduksi pada D=55 dari 15 sampai 19 dengan penambahan 12 m* ' arabinosa. )iomassa dicapai pada akhir lima jam pasca induksi diukur dengan memperkirakan berat sel basah "MM# per liter dari medium %ermentasi. untuk memperkirakan MM, 15 ml kaldu %ermentasi diambil di pre!einged tabung centri%uge "# pada triplicates dan diputar pada K555 g selama 15 menit. Supernatan dibuang dan tube di lap kering dan bobot masing-masing tabung ditimbang "#. Perbedaan antara dan merupakan MM. 0ntuk isolasi h:H dari broth %ermentasi, broth yang sudah dipanen disentri%ugasi "(ubota, 6epang# pada C555 rpm selama 15 menit dan pelet sel yang diinduksi 4 1?5 g sel basah disangga pada 15 m* ris bu+er pH C,5 dan olume suspensi sel dibuat untuk 1 '. Proses pengacauan sel dilakukan pada 55-1555 bar pada homogeni$er tekanan tinggi " Niro Soai, Etalia#. Proses pengacauan sel dilakukan selama tiga bagian. 'isat sel yang diperoleh disentri%ugasi pada 15.555 rpm selama 19 menit untuk memisahkan %raksi larut dan tidak larut. Setiap %raksi dianalisis pada SDS-PA: diikuti dengan metode pe!arnaan oomassie /895. otal protein diperkirakan dengan metode )A "hermo Scientifc, 0SA# sedangkan scanning densitometer dilakukan untuk memperkirakan jumlah h:H yang dicapai bersama dengan perhitungan persentase kemurnian dari incluion bodies. P"#iasi %an Analisis %a#i #5G m"#ni Sejak klon Pbad8?*-h:H terekspresi dalam jumlah signifkan dari h:H,
klon
ini
digunakan
untuk
mempurifkasi
rH:H.
Sebelum
proses,setiap gram dari berat basah dari badan inklusi dicuci dengan ?5 olume dari !ash bu+er 1 "95 m* ris.l, pH C, 13 riton G 155 and 85 m* DA#, !ash bu+er 8 "95 m* ris.l, pH C, 8* urea and 85 m* D#
and !ash bu+er 2 "*illi X !ater#. )adan inklusi "C,9 gram berat basah# diperoleh dari 1 liter %ermentasi broth&air daging yang dilarutkan di dalam 2?5 m' dari C * urea, pH 18,9 selama 25 menit pada suhu ruang. )adan inklusi yang terlarut kemudian melipat kembali dalam olume 15 dari 95 *m ris.l, pH C,C dengan metode dilusi cepat. Protein yang terlipat kembali "2?55 ml# bu+er nya ditukarkan dengan 85 *m Natrium asetat pH ?,9 mengandung 8,93 sukrosa, 5,8 !een C5 dan 5,9 *m DA "bu+er seimbang#. Setelah bu+er bertukar, protein diperjelas dengan sentri%ugasi pada 12555 rpm untuk 19 menit dan supernatant yang dihasilkan "?5C5 ml# diisi pada kolom penukar anion "X Sepharose , : Healthcare, S!eden# pada laju alir C ml&menit. (olom dicuci dengan bu+er seimbang sampai DD 8C5 dicapai nol dan elusi dari
protein-protein terikat diteruskan dengan menggunakan
gradient linear dari larutan Nal "5.5-1.5 *# pada bu+er yang sama di dalam sistem purifkasi protein e
mendeterminasi
keaslian.
Spektroskopu
sirkular
dikrois
"D#
dari
persiapan rhH: murni "5,9 mg&m'# diambil dalam 6asco 6-K19 merekam spektropolarimeter menggunakan sel Luart$ silinder. Data ditampilkan sebagai eliptisitas molar "mdeg# ersus panjang gelombang "nm# dan elemen structural sekunder dideterminasi dengan menggunakan
tool
k8D
online
" http;&&!!!.emblheidelberg.
de&4andrade&k8d# pada EES, )angalore, Endia. rh:H murni juga dianalisi pada bioanali$er Agilent 8515 ;Enstrumen elektrophoresis kapiler generasi baru
dengan
mikrouida
berbasis
plat%orm
yang
tersedia
secara
komersial. (arna massa konstan untuk merubah rasio dan menghadirkan matri< polimer pengayakan pada chip dari bioanali$er. *olekul-molekul dipisahkan berdasarkan ukuran. Sampel disiapkan mengikuti protocol manu%acturer dan kit protein C5 yang digunakan untuk analisis protein, berkisar antara 9 dan C5 kDa. Data ditampilkan pada elektrogram dengan memplotkan unit intensitas uoresen "0# ersus retensi !aktu dalam detik. rh:H diturunkan dari bakteri dan rh:H secara komersial tersedia dibandingkan dengan instrument sebagai protokol per manu%acturer. Ati4itas Bioloi %a#i #5G Aktiitas h:H ditentukan dengan mengukur pengikatan dari h:H ke reseptor h:H pada assay in itro dilaporkan oleh Schellenberger et al "855#. Secara singkat, reseptor h:H ter%usi ke sistem c manusia "Sister / VD,0SA# dilapiskan 89 ng per sumur ke dalam plate sumur Nunc = pada triplikat. Sumur diblok&dihambat dengan 23 )SA diikuti dengan inkubasi selama 1 jam dengan bermacam-macam konsentrasi h:H. Setelah pencucian secara e
ASI$ Pemili5an -BAD!:5G %an -BAD !:M 5G #eom'inan Hasil dari P/ p)AD8?-h:H dan p)AD 8?*-h:H menghasilkan ukuran yang sama dengan primer spesifk gen h:H dimana hasil P/ menunjukan bah!a gen h:H telah disisipkan kedalam ektor. Pada
proses
ekspresi
menunjukan
bah!a p)AD 8?*-h:H "'ine 8# terlihat tingkat pita yang terbentuk lebih tinggi dari primer "*#, sedangkan p)AD8?-h:H terihat tidak adanya perubahan signifkan "line 1#.
pD+AM-h)%
Es-#esi #5G %aam Bio#eato#
Pada proses %ermentasi p)AD8?h:H
dan
p)AD
8?*-h:H
dengan
keadaan lingkungan yang sama, terlihat pola pertumbuhan yang sama tetapi tingkat
ekspresi
rh:H
pada
p)AD8?*h:H hampir 89< lebih tinggi
dibandingkan dengan p)AD8?-h:H "gambar 2#. Dan nilai D rH: pada p)AD8?-h:H hanya K9 mg&m' dan pada p)AD8?*h:H sebanyak 1.C=8 mg&*l dengan kondisi yang sama "tabel 1# ketika diukur dengan densitometer, hasil penelitian menunjukan badan inklusi pada p)AD8?h:H hanya 1,C3 sedangkan pada p)AD8?*-h:H sebanyak 93 dari total protein.
P"#iasi %a#i 'ate#i 5 *enggunakan
pertukaran
ion
X
USepharose
yang
akan
menghilangkan sebagian besar kotoran hingga mendapatkan ==3 h:h murni dan karena adanya muatan negati% pada proses ini juga menghapus kontaminan dari DNA host. 0ntuk mendapatkan tingkat kemurnian yang lebih tinggi, protein yang telah mengandung h:h dimasukan kedam kolom "SP sepharose # dan protein yang terikat, dielusi menggunakan Nal 5,? * "1-? *# dan didapat hasi dengan tingkat kemurnian 93 yang dinilai menggunakan pe!arnaan perak dengan perolehan kembali ?53
Ka#ate#isasi #5G m"#ni
Pada proses karakterisitik rh:H menggunakan SLuencing N-terminal terlihat urutan menjadi *P EP dimana urutan ini cocok dengan Nterminal pada gro!th hormon manusia. Selain itu, karakterisasi protein juga dilakukan menggunakan analisa maskot yang dilihat dari massa peptida yang diperoleh dari *A'DE& dan menunjukan adanya C=3 karakterisitik peptida untuk somatotropin manusia. Dan pada alpha heliks menunjukan nilai D C93 dengan minimum 85 nm dari rh:h murni. Dengan menggunakan )ioanai$er Agilent 8155 dengan
!aktu
retensi
yang
sama
dengan
somatotropin
menggunakan secara komersia menghasikan puncak tunggal.
dengan
:ambar =; elektro%oregram dari rh:H komersial dan rh:H dimurnikan sebagai
diisualisasikan
dalam
Agilent
8155
)ioanaly$er.
:el
elektro%oresis protein indiidu adalah dilakukan secara independen dan profl puncak itu tumpang tindih untuk analisis. Puncak 1 adalah rh:H komersial "somatotropin# ,Puncak 8 puncak rh:H. Puncak 2 merupakan puncak dari albumin boine serum ")SA# digunakan sebagai stabili$er di somatotropin dipasaran. Data ";i 'ioati4itas 5G.
Hitam ; Hgh komersial Putih ; hasil Hgh yang telah dimurnikan
Nilai mean Z S*. 0ntuk kontrol, protein non-spesifk seperti bakteri menghasilakn PH "O 3 murni# dan pada peneitian ini aktiitas biologi dari rh:H yang telah dimurnikan memiliki aktiitas yang lebih besar dibanding somatotropin yang tersedia secara komersial. Pengujian ini dilakukan khusus untuk Hgh sejak protein rekombinan seperti hormon paratiroud dan PH tidak menunjukanmengikat reseptor Hgh dengan kondisi yang sama. Pem'a5asan "man G#o
P"#iasi 5G elah
banyak
dilaporkan
mengenai
teknik
prufkasi
h:H,
kebanyakan dari para peneliti tersebut menggunakan teknik purifkasi konensional seperti ; presipitasi amonium sul%at, kromatograf fltrasi gel,
dan kromatograf pengganti ion. Sebagian besar melaporkan lebih dari 9 tahapan purifkasi yang menghasilkan jumlah h:H yang kurang baik dan dengan biaya yang mahal. Akan tetapi, afnitas dari kromatograf terhadap purifkasi protein ini dianggap sebagai alternati% yang baik. Peneliti ini menggunakan strain .coli (18 untuk ekspresi, promoter "lamba p'# membutuhkan penaklukan dari sel-sel bakteri hingga suhu ?85 untuk induksi. Hal ini tidak memungkinkan untuk memproduksi dalam skala besar dan karena hal itu penggunaan strain .coli (18 dalam penelitian dengan arabinose ini merupakan alternati% yang baik. Sebagian besar ekspresi rh:H yang diketahui sebagai protein periplasma, degradasi rh:H yang terekspresi tidak dapat dihindari akibat adanya beberapa en$im protease yang terdapat di area periplasma. Hal ini yang menjadi tantangan dalam proses hilir selanjutnya. )eberapa peneliti yang melakukan percobaan purifkasi rh:H dengan berbagai metode purifkasi kebanyakan menghasilkan rendemen yang masih sangat sedikit "sekitar 1 3 ; yang dilakukan Niimi dkk, 1CK#. Penulis ini menggunakan metode purifkasi rh:H yang menggunakan sistem promoter arabinose dengan inklusi bakteri mencapai K95 mg l
-1
yang merupakan hasil tertinggi hingga saat ini.
Bent" 5G )entuk olligomerik :H memiliki bioaktiitas yang lebih kecil dibanding bentuk monomeriknya. Data yang ditampilkan dalam jurnal ini mengenai ; pengamatan bentuk tunggal dari monomer rh:H tanpa dimer yang menunjukkan potensi sistem ekspresi untuk skala besar produksi rh:H. Data ini juga menunjukkan bentuk peak tunggal pada Agilent 8155 bioanaly$er dengan !aktu retensi yang sesuai dengan :H komersial yang mengindikasikan bah!a kegunaan alat ini untuk menilai kemurnian dari proses preparasi rekombinan protein
Perbedaan kecil dari perpanjangan asam amino ditemukan dapat menyebabkan perubahan dalam laju ekspresi rh:H. Dan hal ini dicapai dengan adanya 85 gen berbeda dari h:H dengan urutan *et-G<<-:lu-:luh:H, dimana G<< menandakan 85 asam amino berbeda yang membuat peneliti harus melakukan upaya lanjutan untuk meningkatkan jumlah ekspresi h:H menggunakan teknik yang berbeda. Kesim-"lan Penelitian ini telah menunjukkan perbandingan karaktersitik biokimia dari rh:H yang berasal dari bakteri dengan standar rh:H dengan menguji urutan
N-terminal,
*A'DE-&,
D
spectra
dan
Agilent
8155
bioanaly$er. Pengamatan dari rh:H yang telah dimurnikan yang diperoleh dari penelitian ini menunjukkan bioaktiitas yang sama yang dibandingkan dengan rh:H komersial. Proses yang dilakukan dalam penelitian ini sangat sederhana dan dengan biaya minimal untuk produksi skala industri "besar#
DAFTAR P!STAKA
• •
http;##repository.usu.ac.id#bitstream#*+hapterJ+CC.pdf https;##333.researchgate.net#publication#+I+*+*<KProduksiKproteinKrekombinanK
•
dalamKsistemKekspresiKPichiaKpastoris /ayser, O., dan Muller, R.%. '+A(. Pharmaceutical iotechnologyL Drug Disco!ery
•
and >linical pplications. Billey-4>%; )erman nonim, 5he Recombinant Protein %andbook, Protein mplific ation and $imple
•
Purification, 1dition , mersham Pharmacia iotech, http;##333.biotecharticles.com#)enetics-rticle#d!antages-of-Recombinant-DN-
•
<*.html https;##333.Euora.com#Bhat-are-the-ad!antages-and-disad!antages-of-recombinant-
•
DN http;##333.biology.lifeeasy.org#*+I#recombinant-dna-disad!antages
• •
http;##333.bphn.go.id#data#documents#pkjK+*+K-KA.pdf Mshaneh sgari et al.,+*A. Production Of %uman 5issue Plasminogen cti!ator
•
'tPa( in Cucumis sativus.http;##333.tandfoline.com#Coi#Cpbb+ http;##333.sigmaaldrich.com#technical-documents#articles#biology#protein-
• •
e=pression-systems.htmldiakses pada Minggu, *I Desember +*G h,,p:@@po;u1e(s-sme(;o(6p@en=@p@esilk0omou,line@ h,,ps:@@000(u3(e+u(*u@peC@;on,en,@po,einepession%
• •
h,,p:@@000(*ms1io(;om@1*;ulo)iuspo,einepessionse)i;es(*sp Marks, . Da3n. +. iokimia /edokteran Dasar; $ebuah Pendekatan /linis.
•
&akarta; 1)> )rompe, Marcus et.al. *::I. Teknik Rekombinan DNA dan Genetik. Principles of Molecular Medicine
