Dr. Heni Rachmawati
School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung
LATAR BELAKANG Biologically active peptides and proteins are beco becom min an inc ncrreasi easinn l im orta rtant cla class of drugs. Their use for human and animal treatment is problematic, however, because some of these drugs are generally ineffective when taken orally
1
STUDI PREFORMULASI Formulasi protein/peptida sangat berbeda dengan formulasi , , , , degradasinya tidak satu tahap, hasil degradasi tidak bisa dideteksi dengan hanya 1 metode analisis Saat pengembangan formulasi harus diperhatikan: Struktur protein Fakt Faktor or-f -fak akto torr an mem mem en aruh aruhii stab stabililit itas as kimi kimiaa dan dan fisika Teknik yang digunakan untuk stabilisasi protein
Studi preformulasi: Mempelajari data fisikokimia protein dan eksipiennya Evaluasi kelarutan Evaluasi stabilitasnya Mempelajari metode analisisnya Pemahaman data kelarutan, stabilitas, dan titik isoelektrik akan menentukan pH yang paling sesuai pada saat pengembangan formulasi
2
PROTEIN
Senyawa organik makromolekul (BM 5500 – 220.000 dalton atau 50 – 2000 asam amino)
Tersusun dari asam amino-asam amino (BUILDING BLOCK)
Ikatan yang menghubungkan asam amino satu dengan lainnya adalah ikatan peptida, amin
3
ASAM AMINO ESENSIAL
4
BIOSINTESIS PROTEIN Sintesis protein dikode oleh gen tertentu (genetic code) Setiap protein mempunyai sekuen (urutan) asam amino yang unik yang diturunkan dari sekuen nukleotida pengkode protein (genetic code) Kode gen merupakan rangkaian terdiri dari 3 nukleotida disebut kodon. Setiap kodon akan mengkode 1 asam amino
STRUKTUR PROTEIN Primer: sekuen dari rantai asam-asam amino Sekunder: Jika sekuen asam amino u ung an o e a an
rogen
Tersier Jika terjadi interaksi antara alfa heliks dan beta sheet.Struktur distabilisasi oleh ik hidrogen, jembatan garam, disulfida, dan inti hidrofobik Kuarterner Protein yang terdiri dari lebih dari 1 molekul protein: dimer, trimer, oligomer, baik homomer atau heteromer.
5
IKATAN KIMIA DALAM PROTEIN UNTUK STABILISASI PROTEIN
FUNGSI PROTEIN (protein endogen = dihasilkan oleh tubuh) Metabolisme Metabolisme:: enzim hormon hormon Imunologi: antibodi, sitokin Pertumbuhan: hormon, faktor pertumbuhan Transport dan penyimpanan: hemoglobin Dan lain-lain
Potensial sebagai obat
6
Karakteri Karakteristik stik khusus sen awa rotein rotein 1. Merupakan Merupakan senyawa senyawa makromol makromolekul ekul yang sangat sangat kompleks 2. Aktivitas biologinya biologinya sangat sangat dipengaruhi oleh struktur dan konformasinya (primer, sekunder, tersier tersier dan kuarter kuarterner ner 3. Sangat poten (dosis terapi sangat kecil) 4. Sangat tidak tidak stabil oleh berbagai berbagai faktor
SIFAT PRODUKSI PROTEIN ENDOGEN Beberapa protein endogen diproduksi secara secara konstitutif konstitutif di roduksi roduksi ada kondisi kondisi normal): hormon, enzim, albumin Beberapa protein endogen diproduksi secara induktif (diproduksi hanya kalau ada stimulus): antibodi, sitokin, faktor pertumbuhan, enzim dan induktif: albumin, hormon, enzim
7
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN ENDOGEN SEBAGAI OBAT
Jumlah protein yang diproduksi tidak mencukupi untuk terapi Produksi rotein terinhibisi/menurun ada kondisi tertentu
PERLU ASUPAN/TAMBAHAN PROTEIN DARI LUAR TUBUH (PROTEIN EKSOGEN)
PROTEIN EKSOGEN HARUS DIISOLASI
KENDALA PENGGUNAAN PROTEIN EKSOGEN SEBAGAI OBAT
Keterbatasan donor atau tidak memungkinkan secara etik Reaksi penolakan jika digunakan donor dari spesies yang berbeda
PROTEIN REKOMBINAN
8
ORGANISME UNTUK REKOMBINASI PROTEIN TERAPI BAKTERI RAGI (YEAST) TANAMAN MAMALIA
TERGLIKOSILASI mengan ung gugus gu a
TIDAK TERGLIKOSILASI a mengan ung gugus gu a
AKTIVITAS? STABILITAS?
9
DEGRADASI (PENGURAIAN PROTEIN) KIMIA FISIKA BIOLOGI
10
PROSES DEGRADASI PROTEIN DAPAT TERJADI SELAMA: PENYIAPAN BAHAN BAKU PROTEIN PEMURNIAN REKOMBINAN PENYIMPANAN PENANGANAN LANJUT PENGGUNAAN
DEGRADASI PROTEIN DAPAT MENYEBABKAN PROTEIN KEHILANGAN AKTIFITASNYA
11
FAKTOR KIMIA PENYEBAB DEGRADASI PROTEIN
Reaksi kimia dapat merusak protein sehingga aktivitas biologinya hilang Sumber emicu reaksi kimia Air Keasaman/kebasaan (pH) Bahan tambahan yang digunakan dalam formulasi Pelarut pembantu suhu senyawa garam ion-ion logam mekanik (pengocokan) konsentrasi protein
12
Protein Protein disusun disusun oleh rantai rantai oli etida etida membentuk membentuk struktur 3 dimensi yang unik Struktur protein distabilisasi oleh kombinasi interaksi elektrostatik dan hidrofobik, dengan fleksibilitas molekul pada struktur bagian dalam yang tinggi Dalam larutan, struktur molekul dapat terganggu jika kondisi lingkungan berubah termasuk perubahan dalam ukuran molekulnya . Stabilitas protein dalam larutan
Reaksi kimia pemicu instabilitas protein
Deamidasi
Isomerisasi Deglikosilasi Oksidasi Reaksi Maillard
13
Contoh reaksi degradasi protein Degradasi Pemotongan (cleavage) eam as Deamidasi Deamidasi Deamidase Oksidasi Suksinimidasi
protein bFGF bFGF insulin RNase A rhPTH bFGF
kondisi sangat asam ne ra – asa netral – basa pH < 5 pH tinggi pH 10 pH 4 - 5
(DENATURASI)
pada struktur molekul tertingginya, yaitu struktur tersier) Denaturasi juga sering terjadi karena perubahan pada struktur sekundernya.
14
Agregasi dan presipitasi AGREGASI
Bentuk non-native self association dari suatu protein yang masih berada dalam dalam larutan dan secara visibel visibel tidak dapat terlihat dengan mata telanjang Proses utama dari instabilitas fisika. Pada kondisi tertentu, struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein dapat berubah, menyebabkan agregasi
Aktivitas
Kelarutan
Imunogenesitas berubah
PRESIPITASI
Suatu proses makroskopik yang menghasilkan perubahan yang visibel (peningkatan viskositas atau atau kekeruhan pada larutan) Reaksi polimerisasi (kovalen) dan agregasi (nonkovalen) berperan terhadap pembentukan presipitat yang tidak larut Faktor fisik penyebab penyebab agregasi dan presipitasi presipitasi
Suhu (peningkatan atau penurunan)
mekanik (Vorteks) pH Penambahan pelarut organik, surfaktan
15
Perubahan suhu menyebabkan hilangnya struktur Ikatan hidrogen menjadi lemah Interaksi hidrofobik menjadi kuat Gaya nonkovalen terganggu Protei Proteinn men men adi adi lebih lebih fleksi fleksibel bel men ebabka ebabkann unfolding parsial Frekuensi kolisi (tumbukan) meningkat menghasilkan agregat
16
pH dari larutan protein merupakan faktor paling penting dalam menentukan struktur protein. terjadinya interaksi elektrostatik yang dipicu oleh peningkatan muatan positif dari protein. pH tinggi menurunkan stabilitas melalui tolak-menolak muatan negatif dari protein. Kebanyakan protein menunjukkan stabilitas maksimum pada atau mendekati titik isoelektrik, di mana muatan netto protein adalah netral Banyak protein membentuk struktut unfolded pada pH asam (2-3)
Reversibilitas agregat protein Reversibel
dapat dilarutkan kembali dalam zat ered ereduk uksi si// ende endena natu turr
Tidak reversibel
tidak dapat dilarutkan kembali dalam zat pereduksi/pendenatur
Dalam farmasi jika unfoleded protein tidak dapat kembali ke keadaan natifnya melalui refolding mis dengan penurunan suhu, maka denaturasinya disebut irreversible
Karakteristik fisika agregat yang reversibel dan tidak reversibel adalah sama Struktur agregat reversibel: secara energi lebih stabil, susunannya lebih teratur, serta lebih longgar
17
EKSIPIEN PADA FORMULASI PROTEIN 1. SISTEM DAPAR Da ar an bisa bisa di un unak akan an un untu tukk fo form rmul ulas asii rote rotein in:: Fosfat (pH 6,2-8,2) Asetat Asetat (pH 3,8 – 5,8) Sitrat Sitrat (pH 2,1 – 6,2; pK 3,15 3,15 dan 6,4) 6,4) Suksinat Suksinat (pH 3,2 – 6,6; pK 4,2 4,2 dan 5,6) 5,6) Histidin (pK 1,8;6 dan 9) Glisin (pK 2,35 dan 9,8) Arginin (pK 2,18 dan 9,1) Trietanolamin (pH 7-9) Tris-hidroksimetilaminometan Tris-hidroksimetilaminometan (pK 8,1) Maleat
Fungsi dapar dalam formulasi: Menjaga stabilitas sediaan dan bioaktivitas protein Mempengaruhi kelarutan protein, selain kekuatan ion
Muatan protein ~ titik isoelektrik 0 pada pH di titik isoelektriknya + - Pada pH di atas atas titik isoelektriknya Pendaparan sangat dekat dengan titik isoelektrik tidak disarankan
18
2. KELARUTAN PROTEIN Kelarutan protein: sangat larut, agak larut, tidak larut bergantung pada urutan asam amino dan konformasinya e aru an asam am no er an ng er er a engan ukuran dan bagian nonpolarnya Kelarutan protein ditentukan oleh kemampuan gugus polar berinteraksi dengan air Kelarutan protein umumnya minimum pada titik isoelektriknya karena muatannya 0 sehingga interaksi
Dipengaruhi: pH Jenis eksipien yang digunakan Suhu
3. PENGAWETAN SEDIAAN Sediaan mengandung protein rentan terkontaminasi m ro a, se ngga pengawe merupa an omponen penting terutama untuk multiple dose Pemilihan pengawet merupakan faktor kritik karena dapat mempengaruhi stabilitas fisik sediaan (presipitasi atau turbiditi larutan) Contoh: NaHSO3 sebagai pengawet sediaan injeksi menyebabkan degradasi insulin insulin pada pH 4-7
19
JENIS EKSIPIEN 1.Albumin (human serum albumin, HSA) Protein (BM 66,4 kDa) berperan dalam ikatan dengan berbagai macam senyawa Karena kelarutan dan stabilitasnya luar biasa, albumin banyak digunakan sebagai eksipien (stabiliser dan mencegah adsorpsi peptida atau protein lain pada berbagai permukaan) Albumin mencegah adsorpsi protein lain pada permukaan karena kompetisi adsorpsi dengan protein lain di mana albumin lebih cenderung teradsorpsi (preferentially adsorption)
Kekurangan albumin sebagai eksipien:
Mengganggu analisa protein lain dengan pengembangan rekombinan HSA)
20
2. Asam amino Fungsi: Menghambat agregasi Menstabilkan protein terhadap denaturasi karena panas Meningkatkan kelarutan protein Asam amino yang sudah digunakan untuk formulasi protein: glisin, arginin, alanin
3. Karbohidrat Senyawa gula berfungsi menstabilkan protein terhadap situasi stres: panas, liofilisasi Stabilisasi protein oleh gula adalah dari efeknya terhadap struktur air Melindungi agregasi protein yang dipicu oleh lembap Contoh: sukrosa, maltosa, laktosa, trehalosa - Sukr Sukros osa, a, Dapat meningkatkan tegangan permukaan air Zat yang paling efektif melindungi hemoglobin dari oksidasi spontan menjadi methemoglobin selama proses liofilisasi dan penyimpanan
21
4. Zat pengkhelat Beberapa anion dan kation dapat berikatan dengan protein dan menurunkan kelarutannya Fungsi zat pengkhelat: Menghilangkan ion-ion tersebut dan mempertahankan kelarutan protein Menghambat reaksi oksidasi gugus sulfidril dari protein yang dipicu oleh logam en ng ng a an s a as er a a agregas yang dipicu oleh pana Contoh pengkhelat: EDTA
5. Siklodekstrin Siklodekstrin adalah senyawa karbohidrat tapi mempunyai mekanisme stabilisasi yang lebih unik dibandingkan karbohidrat lain Fungsi: Meningkatkan kelarutan protein Menstabilkan protein (mencegah agregasi) Pembawa dalam sistem penghantaran protein
22
Struktur siklodekstrin
Struktur ring siklodekstrin menjadikannya mempunyai kemampuan membentuk kompleks inklusi karena sifat hidrofobik dari bagian
Ukuran kantung sekitar 5-10 Å Siklodekstrin yang paling banyak dipakai adalah β siklodekstrin (walaupun kelarutan dalam air sangat rendah)
dengan siklodekstrin
23
6. Alkohol polihidrat Contoh: gliserol, eritritol, arabitol, xylitol, sorbitol, manitol Fun Fun si: si: stab stabiilisa lisasi si rote rotein in men mence ah a re asi 7. Polietilen glikol Fungsi: Mengurangi adsorpsi protein pada permukaan en ng a an s a as ro e n s ma Meningkatkan kelarutan protein
Melalui ikatan kovalen
8. Senyawa Garam Berfungsi meningkatkan kelarutan protein ada kekuat kekuatan an ion rendah rendah saltin saltin in akan akan tetapi jika konsentrasi garam terlalu tinggi, maka terjadi kompetisi antara ion dan protein untuk molekul air menghasilkan penurunan kelarutan protein (salting out)
Konsentrasi garam harus diperhatikan
24
9. Surfaktan Surfaktan berfungsi meningkatkan stabilitas protein pada kondisi optimal alin ban ak di unakan dalam Surfaktan an formulasi protein adalah tween 80 Pada pemakaian tween 80 perlu diperhatikan cemaran peroksida karena peroksida dapat mempercepat degradasi protein Mekanisme stabilisasi protein oleh surfaktan
permukaan
+ surfaktan, tidak terjadi agregasi Tanpa surfaktan dimerisasi agregasi
25
Pan sa asar rotein rotein rekombinan rekombinan berkembang pesat tuntutan keberhasilan formulasi sediaan protein Pertimbangan preformulasi dan penapisan bentuk molekul yang “formulable” Teknik yang mengindikasikan stabilitas (memonitor pembentukan atau peningkatan cemaran Eksipien penstabil dan peranannya dalam mencapai waktu simpan yang sesuai
Modifikasi struktur Substitusi asam amino meningkatkan termostabilitas Glikosilasi (menambahkan gugus gula) meningkatkan ara teristi arma o ineti , resistensi proteo iti , sta i itas termal Pembentukan ikatan disulfida: perlindungan protein terhadap denaturasi Pegilasi (+ PEG) dapat meningkatkan kelarutan, menurunkan imunogenisitas, meningkatkan t1/2 dan menurunkan toksisitas
26
27
Penambahan eksipien
Cryoprotectants : mencegah pembentukan kristal es saat menyimpan protein pada suhu -20C Contoh krioprotektan: senyawa gula (non-reducing sugar), poliol,
Inhibitor protease untuk mencegah degradasi proteolitik
Antimikroba (natrium azide, NaN3) pada konsentrasi akhir 0.02-0.05% (w/v) atau timerosal pada konsentrasi akhir 0.01% mencegah oksidasi yang dikatalisis oleh logam
-
Zat pereduksi (DTT, ditiotritiol dan merkaptoetanol, 2-ME) pada konsentrasi akhir 1-5 mM untuk mempertahankan protein dalam keadaan tereduksi dengan mencegah oksidasi sistein, Cys.
Polimer seperti serum albumin, siklodekstrin: mencegah adsorpsi permukaan protein
Asam-asam amino, seperti histidin dan metionin: antioksidan
28
Formulasi sediaan protein rekombinan
Sediaan padat
Sediaan cair
Mengontrol ukuran partikel dan distribusi ukuran partikel dalam sediaan cair protein merupakan hal yang sangat sulit.
Formulasi dalam sediaan kering (lebih diminati) Spray-drying
Teknologi cair superkritik
Freeze drying/ liofilisasi
Protein yang stabil selama proses dan penyimpanan
29
Proses Spry freeze drying/liofilisasi untuk formulasi sediaan protein serbuk Atomisasi larutan protein + pembawa ke dalam nitrogen cair
dispersi kasar
Pemindahan dispersi padat ke precooled freeze dryer Pengeringan menggunakan program standar freeze drying
reconsitutable
Liofilisat protein Kadar air < 3%
Stabilitas protein tetap terjamin: Struktur Aktivitas
30
Faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam proses liofilisasi protein
. 2.Konsentrasi protein 3.Konsentrasi bulking agent
Liofilisasi versus stabilitas protein : aktivitas Contoh formulasi tripsinogen dengan liofilisasi Pengaruh konsentrasi terhadap aktivitas produk akhir
31
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
Pengaruh konsentrasi lioprotektan
32
Pengaruh konsentrasi protein
AAPS PharmsciT PharmsciTech ech 2005
Liofilisasi versus stabilitas protein : agregasi
J.Pharm.Sci., 2001, 90
33
Pengaruh jenis dan konsentrasi lioprotektan
J.Pharm.Sci., 2001, 90
Pengaruh konsentrasi protein
34
Liofilisasi versus rekonstitusi Pengaruh konsentrasi protein terhadapa struktur liofilisat Konsentrasi protein
Pengaruh konsentrasi protein terhadap waktu rekonstitusi
10 min setelah rekonstitusi
35
Freeze dryer
Sistem penghantaran Merupakan bagian integral dari pengembangan produk farmasi terutama untuk biomolekul. hi dup suatu Berperan tidak hanya dalam pengaturan siklus hidup molekul tapi juga pada aspek farmakologinya Salah satu tantangan dalam terapi menggunakan protein adalah aga aga mana mana s s em peng an aran aran yang ang epa Nyaman bagi pengguna Efektif Efisien
36
RUTE INJEKSI Sistem penghantaran pertama dan yang masih dipertahankan sampai sekarang untuk protein dan e tida
Ketidaknyamanan penggunaan Merupakan rute invasif am nan yang ngg a an s er as se aan Biaya dan keterbatasan penggunaan LIMITATION
Alternatif sistem penghantaran protein terapetik 1. Penghantar Penghantaran an protein protein melalui paru-paru paru-paru (pulmonary (pulmonary delivery): untuk insulin 2. Pen hantar hantaran an melalu melaluii oral oral :terut :terutama ama unt untuk uk en obatan obatan jangka panjang: MOST TARGET TARGET Penggunaan carrier untuk menghindari degradasi GI Strategi pengembangan untuk meningkatkan absorpsi 3. Penghantar Penghantaran an melalui melalui nasal Merupakan pengembangan terkini penghantaran rote rotein in mel melal alui ui abs absor or si tra trans nsmu muko kosa sa san san at efe efekt ktif if dan tidak iritan
Peluang pasar untuk sediaan protein terapetik
37
38
39
TUJUAN FORMULASI PROTEIN Secara umum sama dengan tujuan formulasi senyawa obat: . Mening at an penerimaan epa a pasien 2. Meningkatkan stabilitas dan efikasi 3. Memudahkan Memudahkan penggun penggunaan aan 4. Meningkatk Meningkatkan an performan performan
40
