Toksisitas Subkronik Dekokta Daun Pulutan (UrenalobataL.) Pada Fase Juve Juvenile ile Ikan Zebra (Danio rer rerio) [Studi pada Nilai LC50 dan Perubahan Kecepatan Berenang] Muhammad Rubangi*, Marindra Firmansyah **, Yudi Purnomo ** * Ma Mahas hasiswa FakultasKedokter teran Universitas IslamMala alang **Staff Pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang Email:
[email protected] Email:
[email protected] ABSTRAK
lobata (DUL) berpotensi sebagai obat perlu dilakukan uji toksisitas untuk menjamin Pendahuluan: Dekokta daun Urena lobata keamanannya. Keamanan penggunaan herbal pada fase juvenile juvenile perlu dievaluasi untuk memastikan dampaknya terhadap pertumbuhan dan perkembangan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui toksisitas subkronik daun pulutan berdasarkan n ilai Lethal Concentration 50 (LC (LC 50 ) dan kecepatan berenang ikan zebra fase juvenile fase juvenile.. 50 ) dan Metode: Penelitian bersifat eksperimental laboratorium dengan desain control group post test only menggunakan ikan zebra fase juvenile. juvenile. Perhitungan nilai LC 50 menggunakan dosis 500, 1.000, 4.000, 8.000, dan 10.000 mg/L, dengan ulangan sebanyak 3 kali kemudian persentase kematian masing-masing dosis pada hari ke 28 dianalisis menggunakan regresi linier d an probit. Efek DUL terhadap kecepatan berenang digunakan dosis terapi (500 mg/L), ½ MATC (600 mg/L), MATC (1.200 mg/L), dan LC 50 (6.200 mg/L) pengamatan menggunakan software tracker kemudian kemudian dianalisis menggunakan One Way ANOVA dilanjutkan Pos Hoc LSD test dengan dengan nilai signifikan p<0,05. Hasil: Nilai LC50 subkronik DUL ikan zebra fase fase juvenile juvenile sekitar 6.200 mg/L yang termasuk kategori toksisitas ringan. Pemberian DUL dosis ½ MATC dan MATC meningkatkan kecepatan berenang ikan zebra fase juvenile berturut-turut juvenile berturut-turut sekitar 3 kali lipat dan 2 kali lipat dibandingkan kelompok kontrol (p<0,05) sedangkan dosis terapi dan LC 50 tidak signifikan meningkatkan kecepatan berenang (p>0,05). Kesimpulan: Nilai LC 50 subkronik DUL termasuk kategori toksisitas ringan dan pemberian DUL dosis ½ MATC dan MATC meningakatkan kecepatan berenang ikan zebra fase juvenile fase juvenile.. Kata Kunci: ikan zebra fase juvenile, fase juvenile, kecepatan kecepatan berenang, LC 50, subkronik, Urena subkronik, Urena lobata. lobata.
Subchronic Toxicity of Ceasarweed Leaf Decoction (Ur ena lobata lobata L.) In the Juvenile Phase of Zebra Fish (D anio reri reri o) [Study on LC50 Value and Swimming Speed Changes] Muhammad Rubangi *, Marindra Firmansyah **, Yudi Purnomo ** * Medical Faculty Student of Islamic University of Malang ** Medical Faculty Lecturer of I slamic University of Malang Faculty of Medicine, Islamic University of Malang Email:
[email protected] ABSTRACT
lobata Leaf decoction (ULD) has potential as drug, but needs to be tested for its toxicity. The safety of the Introduction: Urena lobata Leaf herbal use in the juvenile phase needs to be evaluated to ensure its impact on growth and development. The aim of this research is to know the subchronic toxicity of caesarweed leaf based on Lethal Concentration 50 (LC 50) value and juvenile zebra fish swimming speed. Methods: this was Laboratory experimental research with post test only control group design using zebra fish on juvenile phase. Doses of 500, 1.000, 4.000, 8.000, and 10.000 mg/L with 3 times repetition and 28 days exposure were used to determine LC 50 value. Doses of therapy (500 mg/L), ½ MATC (600 mg/L), MATC (1.200 mg/L), and LC 50 (6.200 mg/L) with tracker software observation were used to determine swimming speed. The LC 50 data was analyzed using linear regression and probit, and the swimming speed data was analyzed using One Way ANOVA followed by P os Hoc LSD (p <0.05). Results: Subcrhonic ULD LC50 value in juvenile zebra fish phase is about 6.200 mg/L and belong to mild toxicity. Doses of ½ MATC and MATC increase the rate of juvenile zebrafish fish swimming speed respectively by 3 times and twice higher than control group (p <0.05). LC50 dose did not significantly increase swimming speed (p> 0,05). Conclusions: Subchronic ULD LC 50 value include in mild toxicity and ULD doses of ½ MATC and MATC increase juvenile zebra fish swimming speeds. Keywords: juvenile zebra fish phase, swimming speed, LC 50, subchronic, Urena lobata. lobata.
PENDAHULUAN Pulutan (Urena Lobata) merupakan salah satu herbal yang memiliki potensi sebagai obat. Secara empirik ekstrak dari daun dan akar Urena lobata digunakan oleh masyarakat untuk mengobati beberapa penyakit seperti batuk, malaria, luka, dan rematik 1. Penelitian secara in vitro dan in vivo membuktikan bahwa ekstrak daun pulutan ( Urena lobata) memiliki efek antidiabetes melalui mekanisme menghambat enzim DPP-IV (dipeptidyl peptidase IV ) sehingga menurunkan kadar glukosa darah2,3. Salah satu senyawa kimia pada ekstrak Urena lobata yaitu alkaloid dan tanin yang bersifat sitotoksik sehingga dapat menghambat pertumbuhan serta merusak sel kanker maupun sel normal 4,5. Uji preklinik ekstrak metanol daun Urena lobata menunjukkan efek sedatif ansiolitik yang ditandai dengan penurunan aktivitas motorik dan peningkatan waktu tidur tikus yang diinduksi thiopental 6. Keamanan penggunaan Urena Lobata untuk pengobatan perlu diperhatikan. Penggunaan herbal Urena lobata selama 18 hari menimbulkan nekrosis sel tubulus kontortus proksimal ginjal mencit 7. Penelitian uji toksisitas pada tikus yang di papar ekstrak air Urena lobata selama 28 hari tidak terjadi perubahan berat badan dan hati, namun terjadi perubahan secara signifikan pada profil histologis dan biokimia hati yang ditandai dengan perdarahan ringan sampai berat dan infiltrasi sel mononuklear seiring dengan bertambahnya kadar AST (aspartat transaminase), ALT (alanin transaminase) dan ALP (alkaline phosphatase) pada serum 8. Studi toksisitas menggunakan kelinci normal selama 24 minggu menunjukkan bahwa ekstrak akar Urena lobata memiliki efek menurunkan kadar glukosa darah yang signifikan. Sedangkan pada fungsi hati, terjadi penurunan fungsi pada 10 minggu pertama akan tetapi kembali ke fungsi normal pada perlakuan minggu berikutnya9. Uji toksisitas Urena Lobata perlu di lakukan untuk menjamin keamanannya. Uji toksisitas merupakan prasyarat formal keamanan kandidat obat untuk pemakaian pada manusia 10. Uji toksisitas yang di lakukan antara lain uji toksisitas umum dan khusus. Lethal Concentration 50 (LC50) merupakan parameter uji toksisitas umum yang menjadi prioritas utama untuk menilai keamanan herbal. Nilai LC 50 menunjukkan derajat toksisitas dan dosis yang mampu menimbulkan kematian 50% organisme uji. Selain toksisitas akut, uji toksisitas subkronik dan kronik juga perlu dilakukan untuk evaluasi keamanan penggunaan herbal jangka panjang. Peningkatan dosis dan lama paparan herbal dapat meningkatkan toksisitas yang ditandai dengan gangguan struktur dan fungsi organ.
Ikan zebra dapat di gunakan sebagai hewan coba dalam uji toksisitas herbal. Penggunaan ikan zebra sebagai hewan uji memiliki beberapa keuntungan antara lain sensitif terhadap racun dari polusi lingkungan, embrio yang transparan sehingga mudah melakukan pengamatan secara langsung pada organ-organ dalam. Selain itu, ikan zebra juga mudah di pelihara, berukuran kecil, jumlah telur yang banyak dan perkembangannya yang cepat 11. Terdapat 70% gen pengkode protein pada manusia juga di temukan pada ikan zebra sehingga memungkinkan penyakit yang terkait dengan gen pada manusia juga bisa terjadi pada ikan zebra12. Masa juvenile ikan zebra merupakan fase usia tumbuh kembang ikan zebra yang pesat pada rentang usia 4 minggu sampai 12 minggu pasca-fertilisasi13. Keamanan penggunaan herbal perlu di evaluasi pada kelompok usia tumbuh kembang untuk memastikan dampaknya terhadap gangguan pertumbuhan dan perkembangan. Efek toksisitas herbal dapat mengganggu fungsi organ salah satunya adalah sistem saraf pusat. Gangguan sistem saraf pusat khususnya aspek motorik dapat dievaluasi dengan mengamati kecepatan 14 berenangnya . Hingga saat ini penelitian tentang derajat toksisitas dan efek toksisitas dekokta Urena lobata pada sistem saraf pusat fase juvenile belum pernah dilakukan. Berdasarkan uraian tersebut, maka perlu dilakukan pengujian toksisitas dekokta daun pulutan (Urena lobata) dengan menentukan nilai LC50 dan menilai kecepatan berenang fase juvenile ikan zebra ( Danio rerio).
METODE PENELITIAN Penelitian ini menggunakan metode observasi dan eksperimental laboratorik secara in vivo menggunakan desain penelitian control group post test only dengan tujuan mengetahui efek toksik dekokta daun pulutan (Urena lobata) terhadap Danio rerio fase juvenile. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang pada bulan maret 2017 – juni 2017 dan telah mendapat surat laik etik dari Komisi Etik Kesehatan Penelitian Universitas Brawijaya No. 656-KEP-UB dan disetujui pada tanggal 13 Desember 2016. Hewan coba yang akan diberi perlakuan adalah Danio rerio fase juvenile dengan usia 1-2 bulan yang didapatkan dari petani ikan Desa Pelem Kecamatan Campur Darat Kabupaten Tulungagung dan telah disertifikasi di Fakultas Pertanian Peternakan Universitas Muhammadiyah Malang dengan nomor 01/Analisa/Lab.Perikanan/FPPUMM/I/2017 . Ikan zebra Fase Juvenile diadaptasikan dan dipelihara selama tujuh hari didalam aquarium
berukuran 60 x 30 x 35 cm yang dilengkapi dengan filter, aerator set, termeometer dan heater sebelum dilakukan perlakuan. Air yang digunakan selama pemeliharaan adalah air hasil penyaringan dengan purified water yang dijaga pada suhu 25-28 oC. Siklus hidup ikan zebra diatur dalam 14 jam terang dan 10 jam gelap. Ikan zebra diberi makan satu kali sehari dengan tetramin..
Pembuatan Dekokta Daun pulutan ( Urena lobata L.) Simplisia daun pulutan (Urena lobata L.) diperoleh dari UPT Balai Materia Medika, Kota Batu, Jawa Timur dan telah dideterminasi dengan nomor surat 074 / 306 / 101.8 / 2016. Simplisia daun Urena lobata L. ditimbang sebanyak 80 gram kemudian dimasukkan ke dalam panci dekok berisi 1 liter air yang sudah dipanaskan pada suhu 90 0C selama 30 menit sambil sesekali diaduk. Setelah dingin dekokta diperas dan disaring menggunakan kasa lalu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer menggunakan corong.
HASIL PENELITIAN Nilai Lethal Concentration (LC50) Dekokta Daun Urena lobata L. pada Ikan Zebra Fase J uvenile Nilai LC50 dekokta daun Urena lobata L. (DUL) dapat dilihat pada Tabel 1. Dan gambar 1. dibawah ini:
Tabel 1. Rerata Persentase Kematian Ikan Zebra
Kelompok K1 (500 mg/L) K2 (1000 mg/L) K3 (4000 mg/L) K4 (8000 mg/L) K5 (10.000 mg/L)
% Kematian ( rerata ± SD )
00.00 ± 00.00 20.00 ± 00.00 30.00 ± 00.00 53.33 ± 00.57 90.00 ± 01.00
LC50 100 y = 0.0079x + 1.6249 R² = 0.922
80
Perhitungan Nilai Lethal Concentration (LC50) Penelitian ini menggunakan 150 ekor ikan zebra fase juvenile yang terbagi dalam 5 kelompok dengan dosis 500, 1000, 4.000, 8.000, dan 10.000 mg/L. Perlakuan dilakukan dengan 3 kali ulangan, masingmasing ulangan terdiri dari 10 ikan. Penggantian herbal dilakukan 24 jam sekali selama 28 hari. Setiap kensentrasi dihitung persen kematian ikan dan nilai LC50 ditentukan dengan metode analisis regresi linier.
n 3 3 3 3 3
60 40 20 0 0
5000
10000
15000
Gambar 1. Grafik Regresi Linier LC 50 Tabel 2. Nilai LC 50 berdasarkan analisis probit
Pengukuran Kecepatan Berenang Penelitian ini menggunakan 30 ekor ikan zebra fase juvenile yang terbagi menjadi 5 kelompok yaitu: kelompok kontrol, terapi, ½ MATC, MATC, dan LC50. Dosis MATC ( Maximum Allowable Toxicant Concentration) ditentukan berdasarkan nilai NOEC ( No-Observed Effect Concentration) dan LOEC ( Lowest-Observed Effect Concentration) menggunakan rumus: √ ()(). Ikan zebra dipapar selama 30 menit kemudian dilakukan perekaman selama 1 menit dan hasil video dianalisis menggunakan software tracker dengan satuan kecepatan cm/s13,14. Analisis Data Perubahan kecepatan berenang dianalisis menggunakan One Way ANOVA untuk menguji hipotesis dilanjutkan Post Hoc LSD Test untuk menentukan perbedaan antar kelompok perlakuan. Hasil dinyatakan berbeda signifikan bila p<0,05.
Berdasarkan rumus pada hasil analisis regresi linier dan probit menunjukkan dekokta daun Urena lobata L. memiliki nilai LC50 berturut-turut sebesar 6.123,43 mg/L dan 6.296,74 mg/L. Nilai tersebut tidak jauh berbeda dan termasuk dalam kategori toksisitas ringan15.
Efek Dekokta Daun Urena lobata L. terhadap Perubahan Kecepatan Berenang Ikan Zebra Fase
juvenile Efek dekota daun Urena lobata L. terhadap perubahan kecepatan berenang ikan zebra dapat dilihat pada Tabel 3. dan Gambar 2. dibawah ini: `Tabel 2. Rerata Hasil Pengukuran Kecepatan Berenang Ikan Zebra Kelompok
Kecepatan Berenang (cm/s) 1.15 ± 0,33 a
n
KN (Kontrol Negatif)
6
P1 (Terapi) 500 mg/L
6
1,31 ± 0,43 a
P2 (1/2 MATC) 600 mg/L
6
2.88 ± 0.55 b
P3 ( MATC) 1.200 mg/L
6
2.01 ± 0.80 b
P2 (LC50) 6.200 mg/L
6
1.24 ± 0.35 a
Keterangan: a,b,c : notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan kecepatan berenang yang bermakna (p<0,05).
Kecepatan berenang b
4.00
b
3.00 2.00
a
a
kontrol
terapi
a
1.00 0.00 0.5 matc
matc
lc50
Gambar 2. Histogram Rerata Kecepatan Berenang Ikan Zebra Fase juvenile Berdasarkan Tabel 3. dan Gambar 2 pemberian dekokta daun Urena lobata L. dosis ½ MATC dan MATC meningkatkan secara signifikan kecepatan berenang ikan zebra fase juvenile berturut-turut sekitar 3 kali lipat dan 2 kali lipat dibandingkan dengan kontrol (p<0,05) sedangkan dosis terapi dan LC50 meningkatkan tidak signifikan kecepatan berenang (p>0,05). Pemberian dekokta Urena lobata L. dosis ½ MATC dan MATC tidak berbeda signifikan dalam meningkatkan kecepatan berenang (p>0,05).
PEMBAHASAN Nilai Lethal Concentration (LC50) Dekokta Daun Urena lobata L. pada Ikan Zebra Fase juvenile Nilai LC50 subkronik dekokta daun Urena lobata L. pada ikan zebra fase juvenile adalah 6.200 mg/L yang termasuk dalam kategori toksisitas ringan 15.
Efek toksik ini dikendalikan oleh komponen dan komposisi zat aktif dalam daun Urena lobata L seperti alkaloid, saponin dan tanin. Beberapa jenis alkaloid dalam Urena lobata L. diduga bekerja sebagai anti-mitosis dengan mengikat tubulin dan memblokade polimerasi protein ke dalam mikrotubulus sehingga terjadi penghancuran mikrotubulus. Hal ini menimbulkan gangguan fungsi mikrotubulus dan gangguan enzim telomerase yang dapat menghambat pembelahan dan perkembangan sel16. Alkaloid dapat merubah materi genetik seperti DNA sehingga menghasilkan protein unfungsional yang menimbulkan kerusakan serta kematian sel. 17. Gangguan dan kerusakan sel atau jaringan menginduksi kematian organisme. Saponin memiliki aktivitas menurunkan tegangan permukaan vaskuler sehingga mengakibatkan 17 hipovolemia . Kondisi hipovolemia menurunkan jumlah oksigen yang diangkut ke sel dan jaringan sehingga terjadi hipoksia seluler. Saponin juga dapat melisiskan sel darah merah sehingga menurunkan jumlah ikatan oksigen-hemoglobin dalam darah, keadaan ini menimbulkan hipoksia sel. Hipoksia sel dapat mengganggu respirasi oksidatif dan menurunkan produksi ATP sehingga memicu kematian. Deplesi ATP dapat meningkatkan pembentukan ROS ( Reactive Oxygen Species) yang akan menyebabkan kerusakan dan kematian sel. Kematian sel yang kompleks menimbulkan kematian organisme18. Tanin merupakan merupakan senyawa metabolit sekunder golongan polifenol . Tanin menghambat kerja enzim dan mengganggu metabolisme pencernaan sehingga organisme mengalami kekurangan nutrisi dan menimbulkan kematian. Tanin diduga dapat merusak membran ikan fase juvenile sehingga cepat mengalami paralisis dan kematian19. Pada umumnya kandungan metabolit sekunder dalam herbal berkadar rendah sehingga kurang menimbulkan efek toksik. Beberapa senyawa metabolit sekunder dalam Urena lobata L memiliki konsentrasi yang kecil sehingga efek farmakologi dan toksisitasnya rendah. Metabolit sekunder dalam herbal pada umumnya bersifat toksik dan diproduksi untuk perlindungan terhadap kondisi yang tidak menguntungkan, tetapi dalam jumlah kecil memiliki senyawa ini memiliki efek terapi 21. Interaksi beberapa zat aktif dalam daun Urena lobata L. diduga bersifat antagonis sehingga dapat menurunkan potensi toksisitas dari herbal tersebut. Selain interaksi yang bersifat antagonis dapat pula terjadi interaksi sinergistik sehingga dapat memperkuat aktifitas biologis dari senyawa yang melakukan interaksi 22.
Lama paparan mempengaruhi derajat toksisitas suatu herbal. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Firdausi (2017), pada paparan akut Urena lobata L. memiliki nilai LC50 8.900 mg/L. Derajat toksisitas akut lebih rendah dibandingkan dengan paparan subkronik. Fase juvenile merupakan fase dimana terjadi pertumbuhan dan perkembangan organisme yang pesat. Pada fase ini organisme sensitif terhadap senyawa xenobiotik seperti obat, herbal, polutan dan bahan kimia asing. Hal ini terjadi karena perkembangan fungsi organ ekskresi dan metabolisme yang belum matur sehingga meningkatkan resiko toksisitas suatu senyawa xenobiotik. Enzim yang berfungsi untuk proses metabolisme belum diproduksi optimal baik dari segi jenis dan jumlah sehingga beresiko tinggi menimbulkan efek toksik 23. Efek Dekokta Daun Urena lobata L. terhadap Kecepatan Berenang Ikan Zebra Fase juvenile DUL pada dosis ½ MATC dan MATC dapat meningkatkan kecepatan berenang ikan zebra fase juvenile. Hal ini diduga berhubungan dengan komponen zat aktif dan konsentrasinya dalam DUL yaitu senyawa flavonoid dan alkaloid. Flavonoid merupakan senyawa yang bekerja pada susunan saraf pusat dengan cara menghambat aktivitas asetilkolinesterase. Enzim ini berperan mendegradasi asetilkolin menjadi kolin dan asetat sehingga jumlah asetilkolin akan menurun 23. Setelah asetilkolin digunakan selanjutnya dilakukan proses degradasi oleh enzim asetilkolinesterase untuk proses repolarisasi sel otot skelet sehingga terjadi proses relaksasi. Inhibisi enzim asetilkolinesterase mengganggu proses degradasi asetilkolin sehingga proses relaksasi terhambat. Kondisi ini meningkatkan kontraksi otot-otot extremitas sehingga terjadi peningkatan kecepatan berenang pada i kan zebra fase juvenile23,24. Beberapa alkaloid dalam herbal memiliki efek stimulasi pada SSP. Alkaloid terikat sebagai agonis pada reseptor kolinergik yaitu asetilkolin nikotinik (nAChR) yang terletak pada otak, ganglia otonom dan neuromuscular junction. Setelah terjadi ikatan alkaloid dengan reseptor nAChR maka influk ion Ca kedalam sel meningkat sehingga kadar Ca intrasel meningkat. Kondisi ini akan meningkatkan kontraksi sel otot sehingga meningkatkan kecepatan berenang26. Pemberian DUL dosis ½ MATC dan MATC meningkatkan kecepatan berenang lebih kuat dibandingkan dosis LC 50 Hal ini diduga karena adanya mekanisme down regulation dan desensitisasi. Mekanisme down regulation yaitu penurunan jumlah reseptor akibat peningkatan dosis
zat aktif sehingga efek biologisnya menurun. Sedangkan desensitisasi merupakan penurunan kepekaan reseptor akibat stimulasi zat aktif dosis tinggi dan jangka lama sehingga aktivitasnya menurun. Kemungkinan lainnya zat aktif bekerja lebih dari satu reseptor sehingga peningkatan dosis tidak di iringi aktivitas biologisnya 24,25.
KESIMPULAN 1. Dosis LC50 paparan subkronik dekokta daun Urena lobata L. pada ikan zebra fase juvenile adalah 6.200 mg/L yang termasuk kategori toksisitas ringan. 2. Pemberian dekokta daun Urena lobata L. pada dosis terapi (500 mg/L) ½ MATC (600 mg/L) MATC (1.200 mg/L) dan LC50 (6.200 mg/L) meningkatkan kecepatan berenang pada ikan zebra fase juvenile.
SARAN Perlu dilakukan penelitian mengenai efek dekokta daun Urena lobata L. terhadap perubahan anatomi dan histologi serta kadar neurotransmiter sebagai penanda kerusakan sel otak yang lebih spesifik.
UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada IOM (Ikatan Orang Tua Mahasiswa) yang telah memberi bantuan dana dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA 1. Mathappan, Rinku., and Umachigi, Sanjay P. Morpho Anatomical Studies Of Leaves Of Urena lobata Linn. International Journal Of Pharmaceutical Innovations. 2013. Volume 3, Issue 1. 2. Purnomo, Y., Soeatmaji, D.W., Sumitro, S.B., Widodo, M.A. Incretin Effect of Urena lobata Leaves Extract on Stucture and Function of Rats Islet β-cells. Journal of Traditional and Complementary Medicine xxx. 2016. 1-6. 3. Onoagbe IO, Negbenebor EO, Ogbeide VO, Dawha IH, Attah V, Lau Hu and Omonkhua AA. A study of the antidiabetic effects of Urena lobata and Sphenostylis stenocarpa in streptozotocin-induced diabetic rats. Eur. J. Sci. Res. 2010; 43: 6-14.. 4. Mshelia, I.Y., Dalori, B.M., Hamman, L.L. dan Garba, S.H. Effect of the Aqueous Root Extract of Urena lobata (Linn) on the Liver of Albino Rat. Research Journal of Applied Sciences, Engineering and Technology. 2013. 5(1): 01-06.
5. Purwanto, Naton., Rismawati, Endah dan Sadiyah, Esti. R. Uji sitotoksik ekstrak biji salak (Salacca Zalacca (Gaert) Voss) dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (Bslt). Prosiding penelitian spesia Unisba 2015. ISSN 2460-6472. 6. Emran, T.B. dan Rahman, M.A. Sedative, anxiolytic and analgesic effects of Urena sinuata L. leaf extract in animal models. International Food Research Journal. 2014. 21(5): 2069-2075. 7. Maisaroh, Siti., Handayani, Nursasi dan Gofur, Abdul. Pengaruh Rebusan Simplisia Daun Pulutan (Urena Lobata L.) Terhadap Nekrosis Sel Tubulus Kontortus Proksimal Ginjal Mencit ( Mus Musculus) Galur Balb C. 2016. Malang: Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang. 8. Mshelia IY, Dalori BM, Hamman LL, and Garba SH. 2013. Effect of the aqueous root extract of Urena lobata (Linn) on the Liver of Albino Rat. Res. J. Appl. Sci. Engine. Technol. 2013; 5(1): 01-06. 9. Omonkhua, Akhere. A, Lyere O. Onoagbe. 2011. Evaluation of the long-term effects of Urena lobata root extracts on blood glucose and hepatic function of normal rabbits. Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences. 2011. Vol. 3(8) pp. 204-213. 10. Depkes RI. Menteri Kesehatan Republik Indonesia Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 761/Menkes/Sk/Ix/1992 Tentang Pedoman Fitofarmaka Menteri Kesehatan Republik Indonesia. 1992. Jakarta. 11. Uwe Strählea, Stefan Scholz b, Robert Geisler a , Petra Greiner c , Henner Hollert d , Sepand Rastegar a ,Axel Schumacher a, Ingrid Selderslaghs e, Carsten Weiss a, Hilda Witters e, Thomas Braunbeckf. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments — A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations Reproductive Toxicology 33 (2012) 128 – 132. 12. Howe, Kerstin. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Letter Research. 2013 : 498| Nature| Vol 496. 13. Parichy, D.M., Elizondo, M.R., Mills, M.G., Gordon, T.N., and Engeszer, R.E. 2009. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 2009: 238(12):2975-3015. 14. Bencan Z, Sledge D, et al. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a
zebrafish model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 2009;94(1):75 – 80. 15. Dekant, W., Vamvakas,., Ullmann’s Industrial Toxicology. 2005. Weinheim; Wiley-VCH 16. Meles, D.K., Wurlina, I.D.P.A. Adnyana., S. Zakaria., D.M.S. Putra., N. Suasanti. Efek Antimitogenik Fraksi Alkaloid Achyranthes aspera Linn. terhadap Induksi Apoptosis pada Mencit yang Terinfeksi Mycobacterium tuberculosis. ACTA VETERINARIA INDONESIANA ISSN 2337-3202, E-ISSN 23374373. 2015. Vol. 3, No. 1: 8-15. 17. Nurqolbiah, E., Indri, K., Siti, N.N. Uji Toksisitas Fraksi Air Impatiens balsamina Pada Tikus Betina Galur Sprague Dawley. Pharm Sci Res ISSN 2407-2354. 2014. Vol. 1 No. 1. 18. Mitchell, R.N. & Cotran, R.S. Jejas, Adaptasi, dan Kematian Sel. Dalam Kumar, V., Cotran, R.S., Robbins, S.L. (eds). Buku Ajar Patologi Robbins Volume 1. Edisi VII. Jakarta: EGC.3:726. 2007. 19. ngajow, mercy., Abidjulu, Jemmy dan Kamu, WS. Pengaruh Antibakteri Ekstrak Kulit Bawang Matoa ( Pometia pinnata) terhadap Bakteri Staphylococcus aureus secara In vitro. Jurnal MIPA UNSRAT Online. 2013. 2(2) 128-132. 20. Noriko, N. Potensi Daun Teh (Camellia sinensis) dan Daun Anting anting Acalypha indica L. dalam Menghambat Pertumbuhan Salmonella typhi. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains Dan Teknologi. 2013. Vol . 2, No. 2. 21. Purnomo, Y., J.W. Soeatmadji, S.B. Sumitro, M.A. Widodo. Anti-diabetic Potential of Urena lobata Leaf Extract Through Inhibition of Dipeptidyl Peptidase IV Activity. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2015. 5 (8). 645-649. 22. Goodman & Gilman. The Pharmacological Basis of Terapeutics 10 th ed. London. 2004. 23. Singgleman, Corinna., Holtzman, Nathalia G growth and maturation in the Zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. PMC. 2014. Aug 1 1; 11(4): 396-406. 24. Jung, Mankil., Park, Moonsoo. Acetylcholinesterase Inhibiton by Flavonoids from Agrimonia pilosa. Molecules.2007.12, 21302139 25. Ganong, WF. Review of medical phisiology 22 th edition. 2008. .Jakarta: EGC. 26. Setiawati, Agustina. Suatu Kajian Molekuler Ketergantungan nikotin. Jurnal farmasi sains dan komunitas. 2013. Hlm. 118-127.
