Isolasi total genom

BAB I ISOLASI TOTAL GENOM 1.1 Latar Belakang  Deoxyribonucleic acid atau acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004). DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur  perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan  berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas  berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010). Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi p ada akhir-akhir ini sangat maju, terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman  –   padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA. 1.2 Isolasi DNA Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)  biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal yang memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak  boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler terutama dalam analisis DNA. Mengeluarkan DNA dari dalam sel memiliki teknik yang berbeda-beda sesuai dengan jenis sel dan struktur dari sel. 1

Untuk isolasi DNA bakteri, enzim lysozyme digunakan untuk mencerna peptidoglikan. Untuk isolasi DNA tumbuhan, dinding sel dihancurkan dengan blender dan dilanjutkan dengan enzim yang akan memotong polimer dinding sel menjadi monomer. Sedangkan untuk isolasi DNA hewan, enzim digunakan untuk mendegradasi jaringan penghubung dan pemisahan komponen intraseluler dilakukan ketika komponen intraseluler keluar dari dalam sel (Clark & Pazdernik, 2009). 1.3 Prinsip Kerja Isolasi DNA Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi DNA hewan pada dasarnya memiliki prinsip yang sama. Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan  pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan  bahan yang digunakan. Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar dari isolasi total DNA dari jaringan adalah memecah dan mengeksraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA dan substansi dasar lainnya. (Faatih, M., 2009). Pada dasarnya, metode isolasi DNA terdiri dari tahapan penghancuran (lisis) sel, ekstraksi DNA dan presipitasi DNA (Dolphin, 2008). Isolasi asam nukleat bertujuan mendapatkan asam n ukleat yang diinginkan secara murni. Menurut Sumner (2003), tahap isolasi DNA antara lain yaitu dengan memecahkan dinding sel untuk mengeluarkan isi sel, melisiskan membran sel agar DNA larut dalam buffer, melindungi DNA dari nuklease endogenus, meminimalisir pemotongan DNA, dan meminimalisir degradasi DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, membran sel harus dihancurkan. 1.4 Tahapan Isolasi DNA Tahapan isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai tahapan yang akan dijelaskan sebagai  berikut. 1. 4. 1 Lisis Pada tahapan ini terjadi perusakan dinding sel dan membran seluler (membran plasma dan nukleus). Proses ini dapat dilakukan secara mekanik, kimiawi maupun enzimatis, namun pada umumnya proses ini dilakukan secara mekanik karena lebih mudah dan praktis. Dinding sel (terbuat dari selulosa) dirusak dengan kekuatan mekanik, contohnya menggerus daun dengan mortar dan  pestle. Selanjutnya, ditambahkan detergen untuk menghancurkan membran sel. Detergen mampu merusak membran karena bersifat amphipatic (memiliki bagin hidrofilik dan hidrofobik), sehingga molekul detergen dapat memisahkan membran. Akhir dari lisis yaitu bagian sel tanaman tersebar di dalam larutan.

1. 4. 2 Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari komponen seluler lainnya. Prinsip ekstraksi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi adalah teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Proses ekstraksi DNA pada umumnya menggunakan senyawa kimia tertentu, misalnya fenol atau kloroform. Fenol atau 2

kloroform digunakan untuk menghilangkan protein dari DNA. Fenol akan mendenaturasi protein dan melarutkan protein yang terdenaturasi. Kloroform juga merupakan protein denaturan. Selain dengan menggunakan fenol atau kloroform, ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan cara  penambahan garam. Garam akan mengganggu ikatan hidrogen antara air dan molekul DNA. Berikut ini adalah gambaran skematis dari proses ekstraksi DNA.

Gambar 1. Proses ekstraksi DNA. Setelah didapatkan larutan DNA, akan dilakukan p roses presipitasi. DNA dipresipitasi dari  protein dengan menggunakan isopropanol atau etanol. Dengan adanya kation, etanol akan menginduksi perubahan struktur molekul DNA yang menyebabkan molekul DNA terpresipitasi dari larutan. Setelah itu, akan dihasilkan pelet DNA dari sentrifugasi dan supernatan dibuang. Proses presipitasi DNA dapat dilihat pada gambar berikut ini.

Larutan DNA ditambahkan isopropanol

Gambar 2. Proses presipitasi DNA

3

1.4.3 Pencucian dan Resuspensi DNA yang terpresipitasi mengandung garam asetat. DNA tersebut “dicuci” dengan larutan etanol 70% untuk menghilangkan garam dan impurities lain yang larut air, tanpa meresuspensi DNA. DNA yang bersih diresuspensi dalam buffer untuk meyakinkan stabilitas dan penyimpanan  jangka panjang. Buffer yang umum digunakan untuk resuspensi yaitu 1xTE. 1.5 Visualisasi DNA Visualisasi DNA dapat menggunakan beberapa Metode, salah satunya yaitu dengan metode elektroforesis. Metode elektroforesis sendiri terbagi menjadi dua, yaitu matriks gel dan  Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE). 1.5.1 Matriks Gel a. Gel Agarose Prinsip kerja gel agarose yaitu Pemisahan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dalam medan listrik dan juga berat molekulnya. Biomolekul dipisahkan dengan mengaliri listrik pada gel untuk menggerakkan molekul yang bermuatan melalui matriks agarose.(Sambrook,2001)  b. SDS-PAGE Merupakan teknik yang biasa digunakan dalam biokimia,forensic,genetic, biologi molecular dan bioteknologi untuk memisahkan makromolekul biologis, biasanya berupa protein atau asam nukleat, prinsip kerja teknik ini juga sama seperti gel agarose, yaitu memisahkan molekul  berdasarkan tingkat migrasi dalam medan listrik. (Arianna,2011) 1.5.2 Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) Prinsip kerjanya adalah mengalirkan tegangan listrik melalui gel dari 3 arah yang berbeda secara bergantian, memisahkan molekul DNA yang jauh lebih besar daripada elektroforesis konvensional dan memisahkan kromosom, PFGE biasanya digunakan untuk genetic fingerprinting. 1.6 Keuntungan Isolasi DNA Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pen genalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu korban kecelakaan, atau korban perang, penentuan anggota keluarga, dan identifikasi hewan.

4

BAB II EKSTRAKSI PROTEIN 2.1 Latar Belakang 2.1.1 Protein Protein merupakan molekul yang esensial dalam penyusunan struktur maupun proses fungsional tubuh pada seluruh makhluk hidup. Protein terdiri atas rantai asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida sehingga membentuk beragam struktur yang kompleks. Reaksi hidrolisis protein bertujuan untuk mengubah protein menjadi bentuk yang lebih sederhana, yaitu asam amino dan peptida melalui pemutusan ikatan peptida, sehingga dapat lebih mudah untuk dimanfaatkan oleh tubuh. Hidrolisis protein dapat dilakukan den gan beberapa metode, yaitu hidrolisis asam, basa dan enzimatis. Setiap protein akan menghasilkan campuran atau proporsi asam amino yang khas setelah reaksi hidrolisis. Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang  berarti “yang paling utama”) adalah senyawa oorganik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptide. Molekul protein mengandung karbon, hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fisfor. Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polnukleutida, yang merupakan penyusun utama mahluk hidup. Selain itu, protein merupakan slaah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Protein terlibat dalam system kekebalan (imun) sebagai antibody, system kendali dalam bentuk hormone, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai slaah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut. Protein murni tidak berwarna dan tidak berbau. Jika protein tersebut dipanaskan, warnanya  berubah menjadi coklat dan baunya seperti bau bulu atau bau rambut terbakar. Keratin misalnya, yaitu protein yang monomernya banyak mengandung asam amino sistein. Jika keratin dibakar, timbul bau yang tidak enak. Protein alam yang murni juga tidak memiliki rasa, tetapi hasil hidrolisis protein, yaitu proteosa, pepton, dan peptida, mempunyai rasa pahit (Sumardjo, 2008). Pada umumnya, protein terdapat dalam bentuk amorf dan hanya sedikit sekali yang terdapat dalam  bentuk Kristal. Protein nabati umumnya lebih mudah membentuk Kristal dibandingkan dengan  protein hewani. Protein hewani seperti hemoglobin mudah membentuk suatu Kristal, sedangkan albumin sukar. Beberapa protein enzim, seperti tripsin, pepsin, urease, dan katalase juga dapat membentuk Kristal (Sumardjo, 2008). Viskositas larutan protein dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi protein. Pada konsentrasi yang sama, larutan protein fibrosa mempunyai viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan protein globular. Jadi, juga pada konsentrasi yang sama, larutan protein bermolekul besar mempunyai viskositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan larutan protein bermolekul kecil. Viskositas protein paling rendah yaitu pada titik isoelektriknya (Sumardjo, 2008). Kelarutan protein dalam pelbagai pelarut (air, alcohol, dan garam encer)  berlainan. Protein yang kaya akan radikal-radikal nonpolar bebas lebih mudah larut dalam campuran alcohol-air dari pada dalam air. Protein yang miskin akan radikal-radikal polar bebas cenderung untuk mengendap dengan penambahan sedikit alcohol atau aseton. Protein tidak larut dalam air, tetapi kaya akan radikal-radikal yang bermuatan, dan mudah larut dalam garam-garam netral (Sumardjo, 2008). Tinggi rendahnya suhu dapat memengaruhi kelarutan protein dalam 5

larutan garam. Dalam larutan garamfosfat misalnya karboksi hemoglobin kuda pada suhu 0oC mempunyai kelarutan sepuluh kali lebih besar dari pada suhu 25oC. Protein yang terdapat pada  biji-biji tanaman lebih mudah larut dalam larutan garam pada suhu tinggi dibandingkan dengan suhu rendah. Namun, kenaikan suhu tidak banyak memengaruhi kelarutan albumin telur dalam larutan garam (Sumardjo, 2008). 2.1.2 Ektraksi Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran.Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran, kita harus melakukan pemisahan. Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu komponen dari suatu campuran berdasarkan proses distribusi terhadap dua macam pelarut yang tidak saling bercampur. Ekstraksi pelarut menawarkan banyak kemungkinan yang menarik untuk pemisahan analitis. Bahkan di mana tujuan primernya bukanlah analitis namun preparatif, ekstrasi pelarut dapat merupakan suatu langkah penting dalam urutan yang menuju ke suatu produk murninya dalam laboratorium organik, anorganik atau biokimia. Meskipun kadang-kadang digunakan peralatan yang rumit, namun seringkali hanya diperlukan sebuah corong pisah. Seringkali suatu permisahan ekstrasi pelarut dapat diselesaikan dalam beberapa menit. Ekstraksi merupakan proses pemisahan,  penarikan atau pengeluaran suatu komponen cairan/campuran dari campurannya. Biasanya menggunakan pelarut yang sesuai dengan kompnen yang diinginkan.Cairan dipisahkan dan kemudian diuapkan sampai pada kepekatan tertentu. Ekstraksi memanfaatkan pembagian suatu zat terlarut antar dua pelarut yang tidak saling tercampur untuk mengambil zat terlarut tersebut dari satu pelarut ke pelarut lain (Oxtoby, 2001). Ekstraksi memegang peranan penting baik di laboratorium maupun industry. Di laboratorium, ekstraksi seringkali dilakukan untuk menghilangkan atau memisahkan zat terlarut dalam larutan dengan pelaurt air yang diekstraksi dengan pelarut lain seperti eter, kloroform, karbondisulfida atau benzene (Mulyani, 2005). 2.2. Ekstraksi Protein Albumin merupakan fraksi protein, sehingga proses pemisahannya dapat dilakukan menggunakan prinsip-psinsip pemisahan protein. Pemisahan protein acap kali dilakukan dengan menggunakan berbagai pelarut, elektrolit atau keduanya, untuk mengeluarkan fraksi protein yang  berbeda menurut karakteristiknya (Murray et al ., 1999). Pemisahan protein dari berbagai campuran yang terdiri dari berbagai macam sifat asam-basa, ukuran dan bentuk protein dapat dilakukan dengan cara elektrofesa, kromatografi, pengendapan, dan perbedaan kelarutan. Pemisahan proteinacap kali dilakukan dengan berbagai pelarut, elektrolit ataupun keduanya, untuk mengeluarkan fraksi protein yang berbeda menurut karakteristiknya (Wirahadikusumah, 1981). 2.3 Prinsip dan Metode Ekstraksi Protein Prinsip dari masing-masing metode pemisahan fraksi protein tersebut adalah sebagai  berikut: 2.3.1 Elektroforesa Elektroforesa merupakan teknik pemisahan senyawa yang tergantung dari pergerakan molekul bermuatan. Jika suatu larutan campuran protein diletakkan di antara kedua elektroda, molekul yang bermuatan akan berpindah ke salah satu electrode den gan kecepatan tergantung pada muatan bersihnya, dan tergantung pada medium penyangga yang digunakan (Montgomeryet al ., 1983). Kecepatan gerak albumin dalam elektroforesa adalah 6,0 dalam buffer berkekuatan ion 0,1  pH 8,6 (Pesce and Lawrence, 1987) 6

2.3.2 Kromatografi Kromatografi meliputi cara pemisahan bahan terlarut dengan memanfaatkan perbedaan kecepatan geraknya melalui medium berpori (Sudarmadji, 1996). Metode ini didasarkan pada  perbedaan kelarutan dan sifat asam basa pada masing-masing fraksi protein. Ada tiga teknik kromatografi yang biasanya dipergunakan untuk pemisahan protein yaitu kromatografi partisi dan kromatografi penukar ion, dan kromatografi lapis tipis (WIrahadikusumah, 1981). 2.3.3 Pengendapan protein dengan penambahan garam Pengendapan protein dengan cara penambahan garam didasarkan pada pengaruh yang  berbeda daripada penambahan garam tersebut pada kelarutan protein globuler (Wirahadikusumah, 1981). Lebih lanjut Hena wijaya (1987) menjelaskan bahwa pada umunya dengan meningkatnya kekuatan ion, kelarutan protein semakin besar, tetapi setelah mencapai titik tertentu kekuatannya  justru akan semakin menurun. Pada kekuatan ion rendah gugus protein yang terionisasi dikelilingi oleh ion lawan sehingga terjadinya interaksi antar protein, dan akibatnya kelarutan protein akan menurun. Jenis garam netal yang biasa digunakan untuk pengendapan protein adalah magnesium klorida, magnesium sulfat, natrium sulfat, dan ammonium sulfat. 2.3.4 Pengendapan pada titik isoelektik Titik isoelektrik adalah pH pada saat protein memiliki kelarutan terendah dan mudah membentuk agregat dan mudah diendapkan (Sudarmadji, 1996). Berbagai protein globular mempunyai daya kelarutan yang berbeda di dalam air. Variable yang mempengaruhi kelarutan ini dalah pH, kekuatan ion, sifat dielektrik pelarut dan temperature. Setiap protein mempunyai pH isoelektrik, dimana pada pH isoelekrik tersebut molekul protein mempunyai daya kelarutan yang minimum. Perubahan pH akan mengubah ionisasi gugus fungsional protein, yang berarti pula mengubah muatan protein. Protein akan mengendap pada titik isoelektiknya, yaitu titik yang menunjukkan muatan total protein sama dengan nol (0), sehingga interaksi antar protein menjadi maksimum. 2.3.5 Pengedapan protein dengan pemanasan Temperature dalam batas-batas tertentu dapat menaikkan kelarutan protein. Pada umunya kelarutan protein naik pada suhu lebih tinggi (0-40°C). pada suhu di atas 40°C kebanyakan protein mulai tidak mantap dan mulai terjadi denaturasi (Wirahadikusumah, 1981). Suwandi dkk. (1989) menjelaskan bahwa denaturasi dapat didefinisikan sebagai perubahan struktur sekunder, tersier, dan kuartener dari molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan peptide. Peristiwa denaturasi biasanya diikuti dengan koagulasi (pen ggumpalan). De Man (1989) menjelaskan bahwa rentang suhu denaturasi dan koagulasi sebagian besar protein sekitas 55 sampai 75°C. suhu koagulasi albumin telur 56°C, albumin serum sapi 67°C, dan albumin susu dapi 72°C. 2.3.6 Western Blot Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan ditransfer ke nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target (Mahmood, 2012).

7

BAB III STUDI KASUS 3.1 Studi Kasus 1

3.1.1 Pendahuluan Penelitian ini berfokus pada pembandingan metode untuk ekstraksi protein dari spesies aphid Schizaphis graminum, sehingga dapat menemukan solusi untuk menghambat pertumbuhan aphid tersebut secara molekuler. Aphid merupakan serangga pemakan daun yang banyak memberikan permasalahan agrikulur secara global. Selain menyebabkan kerusakan tanaman melalui proses pemakanan, aphid juga menjadi vector untuk banyak virus yang menginfeksi tanaman agrikultur. Perkembangan proteomic untuk mengetahui mekanisme molekuler dari transmisi virus menjanjikan suatu cara terbaru untuk memanagemen penyakit melalui perusakan  protein fungsional dan interaksi antara virus dan aphid. Selain mengembangkan proteomic untuk mengetahui struktur molekuler dari aphid, dilakukan juga pengujian terhadap metode ekstraksi  protein yang sesuai untuk mengekstraksi protein dari aphid tersebut. Beberapa kandungan dari aphid menyebabkan beragam permasalahan dalam pengamatan protein. Kandungan chitin dan actin yang sulit dilarutkan, dapat mengganggu proses gel electrophoresis  dengan menyebabkan adanya kenampakan noda pada hasil pengamatan. Untuk menghadapi tantangan ini, peneliti ingin menguji dan membandingkan tiga metode ekstraksi protein yaitu: metode TCA-acetone, metode ekstraksi fenol, dan metode ekstraksi multidetergen. Untuk menentukan metode yang sesuai untuk mengekstraksi protein aphid.

8

3.1.2 Bahan dan Metode Aphid dikumpulkan, ditimbang dan dibekukan pada suhu –  80°C dalam 50 mL BD-Falcon tube. Sebelum dilakukan ekstraksi, 3 gram aphid dihaluskan pada morta dan pestle. Kemudian dimasukkan pada 50 mL BD-Falcon tube yang mengandung larutan ekstraksi. Selanjutnya dilakukan ekstraksi menggunakan masing-masing metode ekstraksi yang telah ditentukan sebelumnya yaitu metode TCA-acetone, metode fenol dan metode multidetergen. Perbandingan  perlakuan dari ketiga metode dapat dilihat pada Gambar 1 atau Tabel 1 di bawah ini.

Gambar 1. Perbandingan perlakuan dari ketiga metode ekstraksi setelah dilakukan penghalusan dari aphid yang telah didinginkan.  No 1

2

3

4

5

Metode TCA-acetone Tambahkan serbuk dari  penghalusan aphid pada larutan TCA-acetone dan dicampur Presipitasi semalam pada suhu -20oC

Metode Fenol Tambahkan serbuk dari  penghalusan aphid pada larutan buffer ekstraksi dan dicampur Ekstrak protein dalam  phenol

Metode Multidetergen Tambahkan serbuk dari  penghalusan aphid pada 7M urea dan detergen dan kemudian dicampur Disentrifuge dan dikumpulkan protein dalam supernatant Cuci butiran protein Presipitasi protein dalam Presipitasi semalam dengan acetone ammonium asetat dan dengan TCA-acetone methanol semlam pada  pada suhu 20oC suhu -20oC Keringkan butiran dan Cuci butiran protein Cuci butiran protein  o simpan pada suhu -80 C dengan methanol dengan acetone kemudian acetone Keringkan butiran protein Keringkan butiran dan dan simpan pada suhu - simpan pada suhu -80oC 80oC

9

Tabel 1. Perbandingan antara metode ekstraksi TCA-aseton, fenol dan multideterjen. Protein dari setiap jenis metode ekstraksi dilarutkan dalam larutan Proteins from each rehydration buffer   (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS) dan dikuantifikasi menggunakan and microplate Quick Start Bradford assay menggunakan BSA untuk menghasilkan kurva standard. Protein (10 g) dipanaskan dalam 20  l SDS dan dimasukkan ke dalam precast 10-lane, 10 – 20% PAGE gels dengan dimensi 8 cm x 8 cm dan ketebalan 1 mm. Gels dialiri arus listrik 125 V secara konstan selama 2 jam pada suhu ruang dalam SureLock XCell mini-cell , difiksasi dalam 40% methanol; 10% asam asetat selama 30 menit, dan diwarnai semalaman dengan Colloidal blue. 3.1.3 Hasil Butiran dari setiap jenis ekstraksi memiliki karakteristik yang unik. Butiran hasil ekstrasksi melalui metode fenol berwarna putih dan flaky saat mongering. Ketika dicekam dalam urea rehydration buffer, butiran berwarna merah muda dan terlarut seluruhnya. Butiran dari metode TCA-acetone dan multidetergen berwarna coklat muda dan abu-abu ketika kering dan berwarna coklat gelap dan transparan saat dicekam dengan rehydration buffer. Secara kualitatif metode ekstraksi fenol memberikan hasil yang lebih jelas dan bagus. Gel SDS-PAGE 1-D digunakan untuk memeriksa kisaran protein MW dan untuk menilai adanya zat yang mengganggu pada ekstrak genotipe aphid SC. Semua metode ekstraksi mengungkapkan bahwa protein yang diamati memiliki kisaran MW Lebih dari 6,5 kDa sampai 200 kDa. Profil pita gel 1 dimensi yang memberikan hasil yang jelas dan dapat diproduksi kemba li adalah hasil dari metode ekstraksi TCA-aseton dan ekstraksi fenol. Sebaliknya, ekstraksi multi deterjen gagal menunjukkan profil 1-D yang jelas dan d apat diproduksi kembali; banyak pita besar yang muncul dan terdapat pita yang muncul pada salah satu hasil tetapi tidak muncul pada hasil  pengulangan, seperti yang dapat dilihat pada Gambar 2. Berdasarkan hasil ini, menyarankan agar metode ekstraksi multi-deterjen perlu disempurnakan lebih lanjut untuk ekstraksi protein aphid. Ada juga perbedaan yang jelas dalam pola pita protein antara ekstraksi multi-deterjen dan ekstraksi TCA-aseton dan fenol, juga sedikit perbedaan antara metode ekstraksi TCA-acetone dan ek straksi fenol (Gambar 2).

10

Gambar 2. Perbandingan hasil uji 1-D gel elektroforesis antara metode ekstraksi TCA-aseton, metode fenol dan metode multidetergen. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa metode ekstraksi TCA-aseton mengekstrak lebih banyak protein yang terlibat dalam struktur sel, kontraksi otot, kompleks protein, dan  pelipatan protein, dibandingkan dengan metode lainnya (Tabel 2). Metode fenol mengekstrak lebih  banyak protein yang terlibat dalam protein fosforilasi tetapi lebih sedikit protein yang terlibat dalam motilitas sel. Hasil pengukuran jumlah protein yang diperoleh masing-masing jenis ekstraksi dengan metode Bradford, menghasilkan perbedaan hasil yang cukup mencolok Metode ekstraksi TCAacetone menghasilkan hasil protein 2-3 kali lipat lebih banyak dari metode yang lain, yaitu 20,4 mg / g dibandingkan dengan metode ekstraksi fenol 7,3 mg / g atau multi deterjen 4,79 mg / g.

Tabel 2. Hasil identifikasi protein dari ketiga metode ekstraksi menggunakan software PANTHER. Hal ini bisa dijelaskan oleh fakta bahwa fenol d an metode ekstraksi multi-deterjen memiliki langkah-langkah sentrififikasi sebelum presipitasi itu akan menghilangkan ba gian bagian kaya protein (misalnya,Exoskeleton dan nukleus) yang ditemukan dalam pelet TCAaseton yang kemudian dilarutkan dalam 8 M urea rehydration buffer. Pada kutu daun, kandungan lipid sel somatik bisa berkisar antara 58% sampai 76%; karena itu, sebagai alternatif, ada kemungkinan bahwa peningkatan kinerja TCA-acetone dalam mengekstrak protein aphid,  berkorelasi dengan kemampuannya untuk melarutkan protein membran. Berdasarkan hasil penelitian di atas, peneliti menyarankan untuk menggunakan metode ekstraksi TCA-aseton karena secara kuantitatif menghasilkan protein yang lebih banyak dibandingkan dengan metode ekstraksi fenol dan metode ekstraksi multi deterjen, secara teknis 11

merupakan ekstraksi paling sederhana untuk dilakukan, hemat biaya, dan sangat dapat diproduksi kembali. 3.1.4 Kesimpulan Metode ekstraksi TCA-acetone menghasilkan hasil protein 2-3 kali lipat lebih banyak dari metode yang lain, yaitu 20,4 mg / g dibandingkan dengan metode ekstraksi fenol 7,3 mg / g atau multi deterjen 4,79 mg / g. Metode ekstraksi TCA-aseton sesuai digunakan untuk mengekstraksi  protein aphid, namun peneliti juga merekomendasikan agar dilakukan kombinasi dalam proses ekstrasi protein agar dapat menghasilkan hasil yang lebih baik lagi. 3. 2 Studi Kasus 2

12

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B. 1994. Moleculer Biology of the Cell, 3th ed . New York: Garland Publisher, Inc. Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA: Thomson Brooks. Clark, D.P. & N.J. Pazdernik. 2009. Biotechnology Applying the Genetic Revolution.Academic Press. New York Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools an d Techiques in  Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA. Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill Companies, Inc. Mahmood, T., Ping-Chang, Y. 2012. "Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting".  J. Med Sci. 4 (9): 429 – 434. Mawardi, A., Simonapendi, M. L. 2016. Uji Efektivitas Metode Isolasi DNA Genom Kopi Arabika (Coffea arabica L.) Asal Kabupaten Jayawijaya. Jurnal Biologi Papua  8(1): 7 –  12. Mulyani, S. 2005. Kimia Fisika II. Malang: UM Press. Murray, R.K., Granner, D. K., Mayes, P.A., Rodwell, V. W. 1999. Biokimia Harper. Edisi ke-24. Jakarta: Penerbit EGC. Montgomery, R., R.L. Dryer, T.W. Conway and A.A. Spector. 1983.  Biokimia. Jilid 1. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Oxtoby, D. 2001. Kimia Modern Edisi Ke Empat Jilid I. Jakarta: Erlangga. Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schwartz DC, Cantor CR .1984. "Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis". Cell . 37 (1): 67 – 75. Sumardjo, D. 2008. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan  Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Surzycky, R. 2000. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Inc., Belmont Wirahadikusumah, M. 1981. Biokimia : Proteine, Enzima & Asam Nukleat . ITB. Bandung. Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular . Jakarta : Erlangga

13