ISOLASI ATAU PEMBIAKAN VIRUS Disusun Oleh :
Makdalena Lawing Marzela Riyaya Safitri Meiliana Suryandari Suryandari Meliana Indrawati Merlin Herofianti
Pendahuluan Virus adalah parasit obligat intrasel, virus tidak dapat berkembang biak di dalam medium mati. Oleh karena itu cara pembiakannya lebih sulit daripada pembiakan bakteria.
Tiga Metode mengembangbiakan virus 1.
Inokulasi pada hewan percobaan
2.
Inokulasi pada telur berembrio
3.
Kultur jaringan (in vitro) dan telur bertunas (in vivo).
1. Hewan percobaan •
•
•
Dahulu sebagai satu2nya ara untuk pembiakan virus Banyak perbedaan kepekaan hewan percobaan terhadap infeksi dengan virus sehingga timbul reaksi berbeda baik bagi yg spesiesnya tidak sejenis maupun spesiesnya sejenis. Masih digunakan untuk mempelajari sifat2 onkogenik virus, patogenesis penyakit virus. Reaksi imun trhdp virus, pengaruh lingkungan terhadap infeksi virus dan isolasi primer trhdp beberapa jenis virus, misalnya: virus coxsackie A.
•
•
Metode tergantung pada jenis virus yg akan dicoba dan lokasi anatomi dari sel yang dituju dalam percobaan. Ex: virus berselubung segera menjadi tidak aktif jika berada pada ph asam shg tdk mungkin di biakkan dg cara inokulasi melalui alat pencernaan. Cara yg sering dilakukan melalui jalan intravena, intraserebral, intraperitonal, intranasal, intratrakeal, intradermal, dan subkutan sesudah terjadi replikasi virus, jaringan yang terinfeksi diambil. Dihancurkan Dihomogenkan dlm larutan pengawet disimpan dlm keadaan beku digunakan sbg virus yang infektif.
1. 2. 3. 4. 5.
Kelemahan Biaya mahal Butuh pemeliharaan Dipengaruhi oleh sistem imun Variasi individu Sulit memilih hewan yang cocok
2. Telur berembrio (Metode Kultivasi) •
•
•
•
Telur berembrio yang dapat digunakan untuk pembiakan virus adalah telur bebek dan telur ayam (lebih sering). Tempat inokulasi dan umur embrio tergantung virus yang dibiakkan. Telur yang akan digunakan untuk percobaan tidak boleh dicuci, karena pada bagian luar telur ada semacam zat seperti lilin yang berfungsi melindungi telur agar kuman tidak dapat masuk ke dalam telur. Sebelum digunakan telur dimasukkan ke dalam alat pengeram atau incubator, letak telur tiap hari harus diubah supaya tidak terjadi perlekatan selaput-selaput bagian dalam telur dengan embrionya ( supaya embrio tersebut tetep ditengah-tengah ).
Lanjutan
….
Macam- macam inokulasi telur berembrio 1.
Yolk sac (kuning telur)
2.
Allantoic sac
3.
Chorio Allantoic Membrane (CAM)
4.
Amniotic cavity
5.
Intravenous
Anatomi telur Ayam dengan embrio
a. b. c. d. e.
Kulit telur Membran kulit Embrio h. yolk sac Membran korioalantois Rongga Udara
f. Allantoic sac g. Amniotic sac i. albumin
Beberapa kemugkinan bila virus ditanam atau disuntikan pada telur berembrio
1.
Embrio ayam akan mati
Misalnya : Virus Javanes B Encephalitis yang disuntikan secara intra yolk sac. 2.
Tumbuh pocks atau plaques. –
–
Pock adalah bintik-bintik putih berbentuk bundar dan menonjol pada permukaan CAM. Plaques adalah bintik-bintik putih tapi tidak menonjol dari permukaan CAM
Lanjutan
….
Virus-virus yang dapat membetuk pock adalah : •
Virus Variola
•
Virus Vaccinia
•
Virus Cowpox
•
Virus Foo Pox
•
Virus B Encephalitis
Virus yang dapat membetuk Plaques adalah virus Herves Simplex
Lanjutan
…..
3. Pembentukan antigen
Antigen yang terbentuk ada dua macam, yaitu antigen hemaglutinin dan antigen ikatan komplemen. Misalnya : Virus yang membentuk antigen tersebut adalah virus Influenza dan virus mumps. 4. Daya infeksi virus terhadap hewan atau manusia berubah menjadi virulen atau kurang virulen.
Keunggulan inokulasi pada telur berembrio : 1.
Isolasi dan kultivasi banyak unggas dan sedikit virus-virus mamalia
2.
Telur berembrio merupakan tempat yang cocok untuk pertumbuhan virus
3.
Jaringan dan cairan luas dan steril
4.
Biaya murah
5.
Membutuhkan sedikit tenaga
6.
Mudah didapatkan
7.
Bebas dari bakteri dan banyak virus-virus laten (tersembunyi)
8.
Bebas dari faktor pertahanan yang spesifik dan non spesifik
9.
Sensitif terhadap virus yang tidak menimbulkan infeksi pada burung dewasa
3. Kultur jaringan/ tissue Cultures •
•
Teknik kultur sel telah menggantikan sebagian besar peranan binatang percobaan dan telur berembrio yang mahal dan sulit penanganannya. Dengan kultur jaringan ini selain pembiakan virus juga dapat dilakukan berbagai macam tindakan, misalnya penemuan berbagai virus baru, penelitian sifat virus dalam jangka panjang misalnya virus polio dan juga usaha untuk menemukan vaksin terhadap penyakit virus. Terdapat tiga dasar jenis kultur sel hewani yaitu: a. kultur primer dan kultur sekunder b. diploid cell strains c. continous cell lines.
Kultur primer berasal langsung dari jaringan hewan atau telur berembrio dan merupakan sel-sel satu lapis (monolayer). Sedangkan kultur sekunder merupakan subkultur dari kultur primer jaringan normal. Sesudah melalui 30 sampai 50 subkultur atau bila dilakukan subkultur ulangan, sel-sel mengalami degenerasi atau mati. Kadangkadang sel mengalami perubahan sehingga mampu hidup sesudah melewati subkultur lebih dari 50 kali atau lebih. Sel-sel ini umumnya telah mengalami perubahan morfologi meskipun jumlah kromosom tidak berubah dan disebut sebagai diploid cell strains . Selama mengadakan kultur dari cell strains dapat terjadi continuous cell lines yang berubah sifat-sifat khasnya, tumbuh dengan cepat, membentuk beberapa lapis sel dan juga berubah jumlah kromosomnya. Continuous cell lines ini juga dapat terbentuk dari kultur primer dari jaringan maglina secara langsung atau tumbuh dari kultur primer yang diinfeksi dengan virus onkogenik.
Komponen kultur jaringan :
1.
Sel / jaringan
2.
Serum
3.
Sistem buffer (penyangga) PH
4.
Antibiotik
5.
Anti jamur
Kultur Sel 1.
Primer a. Beraneka ragam banyak tipe sel –
b. Closest to animal c. Technical hassle 2.
Diploid cell strain a. Relatively homogeneous sedikit tipe sel –
b. Further from animal c. Technically less hassle 3.
Continous cell line a. Immortal b. Most homogeneous c. Genetically weird furthest from animal –
d. Hassle free e. Suspension on monolayer
Ada 3 jenis kultur jaringan 1.
Kultur Jaringan Primer (Primary cell culture) - kultur jaringan hamster - kultur jaringan ginjal kera
2.
Kultur jaringan semi lestari (Semi continuous cell culture) tissue culture of human embryonal lung
3.
Kultur jaringan lestari (Continuous Cell Culture) Contoh : sel hela, berasal dari kanker servix LLC-MK 2, berasal dari ginjal kera rhesus BHK-21, berasal dari ginjal bayi hamster
No
Virus
Kultur Jaringan
1.
Herpes Simplex
Vero Hep-2, human diploid (HEK, HEL) human amnion
2.
VZV
Human diploid (HEK, HEL)
3.
CMV
Human diploid fibroblast
4.
Adenovirus
Hep-2, HEK
5.
Poliovirus
MK, BGM, LLC-MK2, Human Diploid, Vero HEP-2, Rhadomyosarcoma
6.
Coxsackie-B
MK, BGM, LLC-MK2, Vero-hep2
7.
ECHO
MK, BGM, LLC-MK2, Human Diploid, Rd
8.
Influenza-A
MK, LLC-MK2, MDCK
9.
Influenza-B
MK, LLC-MK2, MDCK
10
Para-Influenza
MK, LLC-MK2
11.
Mumps
MK, LLC-MK2, HEK, Vero
12.
RSV
Hep-2, Vero
13.
Rhinovirus
Human diploid (HEK,HEM)
14.
Measless
MK, HEK
15.
Rubella
Vero, RK-13
Teknik kultur jaringan pada epitel dari usus embrio ayam
Kultur berbagai sel (perbesaran 100x)
A
B
C
D A. B. C. D.
Sel endotel porcine aorta. Sel fibroblas chick embryo. Jaringan tiroid Sel otot jantung mouse embryo.
TERIMAKASIH