JURNAL PRAKTIKUM BIOKIMIA
ISOLASI DNA
Disusun oleh:
Martin Susanto (080100383)
KELOMPOK A-4 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2008
TUJUAN Praktikum isolasi DNA ini bertujuan agar mahasiswa memahami proses pekerjaan untuk memperoleh DNA dari sel-sel leukosit seperti yang umum dilakukan di laboratorium Biologi molekuler dan juga agar lebih memahami perkuliahan mengenai genetika molekuler.
TEORI DNA dapat diisolasi dari sel-sel darah, jaringan biopsi dan juga dari amnion. Beberapa metode untuk mengisolasi DNA suda sangat umum digunakan di laboratorium. Jika digunakan darah sebagai sampel, pada prinsipnya DNA diisolasi dari sel-sel leukosit dengan cara memisahkan terlebih dahulu sel-sel darah merah, kemudian sel-sel darah putih diLysis untuk memperoleh DNAnya dan DNA tersebut dipisahkan dari protein-protein seluler lainnya sehingga akan diperoleh DNA murni. Kemudian DNA murni penting diupayakan sebab untuk proses selanjutnya bila digunakan DNA murni akan didapatkan hasil yang lebih baik. Dna tidak hanya ada di inti sel tetapi juga dijumpai di matriks mitokondria. DNA yang diperoleh biasanya akan diproses atau digunakan lebih lanjut sebagai bahan untuk proses pemeriksaan atau proses berikut: Polymerase Chain Reaction (PCR) Shouthern Blot Dipotong oleh enzim DNA retriksi tertentu Sequence Analysis Dan lainnya.
PRINSIP Praktikum isolasi DNA menggunakan prinsip pemisahan antar larutan dan koagulan atau endapan. Langkah awal yaitu dengan menambahkan zat koagulan dan zat pemecah inti sel. Dalm proses ini bagian terpenting adalah proses sentrifugasi yaitu dengan alat khusus yang memakai prinsip sentrifugal dan keseimbangan sehingga menjadikan larutan dan endapan menjadi terpisah secara nyata dan akhirnya hingga kita mendapatkan DNA yang terisolasi sesuai dengan tujuan praktikum ini.
TINJAUAN PUSTAKA DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat de ngan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven & Johnson 2002: 94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building (building block ) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--178). Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupa n. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)
DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah Allium (Allium cepa) cepa) dan pada pisang ( Musa Musa sp.) (Kimball 2005: 8; Kent & Carr 2001: 317). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:
1. Isolasi jaringan
2. Dinding dan membran sel dilisiskan
3. Diekstraksi dalam larutan
4. Dipurifikasi
5. Dipresipitasi
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation (rotation per minute) minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3; LPCH 2005: 2). Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ek strak nukleus sel darah putih. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3; LPCH 2005: 2). Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid ) yang akan membentuk kompleks (chelate (chelate)) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium (Sodium Dodecyl Sulfate) Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur (Rybicki & Purves 20 05: 1; Harley 2005: 410). Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005: 409--410; Lewiston 2002: 1--2).
Isolasi DNA genom buah pisang memiliki prinsip yang sama dengan isolasi DNA sel darah putih. Langkah pertama adalah dengan memasukkan buah pisang ke dalam blender dan blender selama 5 menit. Hasil blender kemudian ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 dan garam lalu diaduk selama 15 menit. Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Campuran tersebut kemudian disaring dengan corong dan ditambahkan isopropanol yang berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan (desalted (desalted ) sebab isopropanol tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan negatif (-). Kemudian tabung dibolak-balik untuk mendapatkan DNA. Akan tetapi, setelah diberikan Tris-EDTA, yang didapat oleh praktikan hanyalah pengotor yang tidak larut di dalamnya. Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti dalam mengerjakan proses isolasi tersebut (Harley (Harley 2005: 410).
ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan: Alat sentrifugasi (sentrifuge) Vortex Mikropipet Tabung Efppendorf Bahan yang digunakan: Sampel darah Zat anti koagulan (heparin/citrat/EDTA) Cell Lysis Solution Protein Precipitation Solution Nuklei Lysis Solution Isopropanol Etanol 70%
PROSEDUR PERCOBAAN 1. Supernatant dibuang lalu tambah etanol Isi 1,5 ml EDTA ke dalam tabung mikrocentifuge dan masukkan 1 µL darh , kocok agar bercampur, 2. Ke dalam tabung kedua masukkan CLS, tambah 300 µL darah dari tabung 1 ke CLS 500 µL lalu bolak-balik hingga bercampur. Tunggu hingga 10 menit dengan terus membolak-balik hingga 2 atau 3 kali, 3. Tabung 2 disentrifugasi 1300 rpm selama 20 deetik kemudian buang larutan hingga tersisa pellet putih, kemudian divortex selama 10-15 detik agar pellet tersuspensi kembali. 4. Sebanyak 300 µL Nuclear Lysis dimasukkan ke suspensi, larutan dibuat bercampur dengan dipipetkan 5-6 kali lalu ditambahkan 100 µL PPS dan divortex kuat selama 10-20 detik hingga terlihat gumpalan kecokelatan. 5. Supernatant dipindahkan ke dalam tabung yang masih bersih dan ditambahkan 300 µL isopropanol dan dicampur hingga terlihat benang-benang putih DNA. 6. Lalu tabung tersebut disentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit, lalu DNA akan terlihat sebagai pellet putih. 7. dan sentrifugasi kembali separti langkah di atas. 8. Buang etanol, tetapi jangan sampai DNA ikut terbuang lalu letakkan di atas tissue selama 10-15 menit dalam keadaan terbalik, 9. Terakhir tambahkan DNA Dehidration Solution dan dehidrasi dengan membiarkannya selama 1 malam.
PERLAKUAN MEnambah zat anti koagulan ke dalam darah Menambah Cell Lysis Solution Tabung dimasukkan ke sentrifuge
PENGAMATAN Darah tetap menjadi cair dan tidak beku
Sel-sel darah pecah membagi-bagi Endapan terpisah dengan larutan sehingga sel darah putih dapat terlihat dalam bentuk pellet putih Pellet putih divortex Campuran tersuspensi Suspensi darah putih ditambah Nuclei Lysis Inti yang berupa gumpalan protein dipecah Larutan divortex kembali Muncul bintil-bintil cokelat pada kantung yang merupakan gumpalan protein Sentrifugasi Supernatan dan gumpalan protein terpisah Supernatant ditambah isopropanol Terlihat benang-benang yang merupakan benang-benang DNA isopropanol Disentrifugasi 13000 rpm selama 1 menit Terlihat pellet putih yang merupakan DNA dan terlihat supernatant yang bening Supernatant dibuang dan DNA diberi Dna yang ada pada dinding tabung ethanol berkumpul di dasar tabung setelah dicuci Ethanol dibuang dan DNA diletakkan Tabung dengan segera mongering karena terbalik di atas tisu alcohol cepat menguap dan meninggalkan DNA yang melekat di dasar tabung DNA tersebut ditambahkan DNA Agar DNA dapat lebih cepat awet untuk Dehidration Solution disimpan.
KESIMPULAN DNA terdapat pada sel yang berinti dan juga terdapat pada matrioks mitokondria. Dalam darah manusia sel darah merah tidak mengandung DNA karena tidak memiliki inti sel atau nucleus, sebaliknya sel darah putih memiliki DNA karena mempun yai inti. Pada percobaan di atas darah seharusnya akan segera membeku, tetapi setelah ditambahkan zat anti koagulan, darah tidak membeku karena zat tersebut berfungsi menghambata pembekuan darah. Diperlukan beberapa reagansa seperti yang telah dijelaskan di atas yang berfungsi sebagai pemecah sel dan inti, enggumpal, pencuci dan juga pengering. Centrifuge diprlkukan untuk memisahkan endapan dan larutan, sedangkan alat vortex digunakan untuk menggetarkan tabung mikropipet secara tepat agar endapan atau butir butir DNA tersuspensi.
REFERENSI
http://www.alzheimers.org/unraveling/09.htm http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch123/Atom%20Structure/separati on_methods.htm Harley, J.T. 2005. Regulatory exercises in microbiology. microbiology. 6th ed. McGraw-Hill Company, Boston: xiv + 466 hlm. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/primer_pic.shtml Kent, G.C. & R.K. Carr. 2001. Comparative anatomy of the vertebrates. 9th ed. The McGraw-Hill Companies, New York: xvii + 523 hlm. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/B/Blood.html, November 2005, pk.21.30.
23
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm. Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm. http://abacus.bates.edu/~ganderso/biology/resources/centrifugation.html http://www.lpch.org/DiseaseHealthInfo/HealthLibrary/hematology/bloodoview.htm l Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill Companies, Inc., New York: xxiv + 1238 hlm.
