Informe Preliminar

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Facultad de Ciencias Químicas Escuela de Bioquímica y Farmacia Microbiología de los Alimentos

“ANÁLISIS DE RIESGOS DE RIESGOS E IDENTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE DE PATÓGENOS PATÓGENOS POR CONTAMINACION MICROBIANA CONTAMINACION MICROBIANA EN LA EN LA ELABORACIÓN DE ELABORACIÓN DE CHORIZO CHORIZO AHUMADO”

INTEGRANTES:

Bohórquez Paúl Bustos María Fernanda Ibarra Danilo Parra Mercedes Serrano Juan Serrano Juan Sebastián Vaca Rodrigo Velasco Alexandra Velasco Alexandra

mo

7 Alimentos

2009‐2010 1

1. PROBLEMA : Muchas de las pequeñas empresas productoras de carnicos y sus derivados, en sus procesos de elaboración, no siempre pueden realizar controles biológicos de la calidad entre estos Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). Al no cumplir con sistemas de aseguramiento de la calidad, no se garantiza un producto inocuo, que brinde la seguridad alimentaria que requiere el consumidor, debido a que es mucho más probable que exista contaminación microbiana que afecte a la población que muestre mayor vulnerabilidad de adquirir una enfermedad, ya sea esta causada por una infección o intoxicación alimentaria. Uno de los principales derivados de productos cárnicos es el chorizo ahumado, al ser este un producto de consumo masivo, la frecuencia con la que pueden presentarse dichos casos de contaminación aumenta, por lo que se realizará una investigación, en la industria San José en la cual se elabora chorizo ambateño, con el fin de prevenir la expedición de lotes con productos que presente un alto riesgo microbiológico.

2. ANTECEDENTES: •

Ubicación: La empresa se encuentra ubicada en la provincia de Cotopaxi, en una zona rural cercana a Salcedo no tiene una buenas carreteras lo cual el ingreso y salida de la misma es de gran dificultad.

•

Transporte: La materia prima es transportada hacia las instalaciones en camionetas a temperatura ambiente, tanto para la adquisición de la materia prima como para la entrega del producto, no cuenta con sistema de frío

•

ubicado en una zona rural rural no cuentan con con agua potable ni alcantarillado, alcantarillado, el Agua: Por estar ubicado suministro de agua utilizada en este proceso es agua de pozo entubada y es manipulada sin previo tratamiento.

•

Infraestructura: El lugar donde se elabora el producto es un cobertizo el cual no presentan áreas de procesamiento adecuadas ni definidas sin control de insectos y roedores, su techo es translucido, no cuentan con instalaciones eléctricas apropiadas y sistemas de evacuado ni de tratamiento de aguas residuales y la clara ausencia de cuartos fríos para el almacenamiento de materia prima y productos elaborados. elaborados.

•

Asesoramiento: No poseen normas para la elaboración es un proceso artesanal en el cual nadie los asesora y no hay la mejora continua.

•

Proveedores: No cuentan con proveedores seleccionados ya que compran en supermercados la materia prima que necesitan.

La empresa San José, ubicado en el Cantón Salcedo comunidad de Panzaleo en la Parroquia Antonio José Holguin creado hace catorce años atrás se encarga de una amplia elaboración de toda clase de embutidos, su mayor producción es la elaboración de chorizo ambateño como chorizo ahumado. Antes clausurado por dos ocasiones por el Ministerio de Salud por no cumplir con las normas de elaboración, elaboración, por lo cual se han visto obligados ha cambiar su infraestructura y su modo operario. Por el momento tienen una producción de 180 libras por día, trabajando 3 días a la semana contando para esta producción con dos personas. 2

3. JUSTIFICACIÓN: La empresa destina sus productos para consumo masivo en las ciudades de Ambato, Salcedo, Pillaro de acuerdo con la población actual y según la INEC este producto es consumido en su mayoría por adultos y adolescentes pero los más vulnerables son los adultos mayores, mujeres embarazadas y niños causada por la salmonelosis y listeriosis. Una empresa de elaboración de embutidos debe tener ambientes de baja temperatura para asi evitar la contaminación con microorganismos, además los espacios de trabajo deben estar debidamente señalados, al igual que utensilios higiénicos y contar personal capacitado para la manipulación de materia prima y maquinaria. Es importante para esta empresa hacer un seguimiento continuo de sus procesos de elaboración para de este modo evitar la clausura nuevamente. nuevamente.

4. OBJETIVOS: 4.1 Objetivo general •

Realizar el análisis de riesgos e identificar los microorganismos patógenos en la elaboración de CHORIZO AHUMADO

4.2 Objetivo específico • •

•

• •

Levantar el proceso teórico y real de la elaboración del chorizo ahumado. Determinar los factores ecológicos de las diferentes bacterias que colonicen en el proceso de elaboración del chorizo ahumado. Realizar un listado de los microorganismos microorgani smos patógenos que estén presentes en cada etapa de elaboración del chorizo ahumado. Identificar las fuentes de contaminación endógena endógena y exógena en todo el proceso de elaboración. Determinar los los métodos de análisis para para la identificación identificación en el laboratorio laboratorio de las las bacterias patógenas persistentes persistentes en el proceso.

5. HIPOTESIS: •

Hipótesis Nula, Ho: Determinar que las siguientes bacterias están presentes en los l os puntos críticos detectados Recepción de materia prima Staphylococcus aureus Bacillus cereus E. coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia entrolitica Clostridium perfringes (esporas) Mezclado Staphylococcus aureus Bacillus cereus E. coli Listeria Monocytogenes 3

Yersinia entrolitica Clostridium perfringes (esporas) Ahumado Bacillus cereus (esporas) Clostridium perfringes (esporas) Almacenamiento Bacillus cereus E. coli Salmonella Clostridium perfringes (esporas) •

Hipótesis alterna, Ha: Durante la observación del proceso de elaboración de chorizo natural por la carencia de aplicación de sistemas de aseguramiento y control alimentario, alimentario, se espera encontrar en orden de severidad los siguientes microorganismos Recepción de materia prima Staphylococcus aureus Bacillus cereus E. coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia entrolitica Clostridium perfringes (esporas) Mezclado Staphylococcus aureus Bacillus cereus E. coli Listeria Monocytogenes Yersinia entrolitica Clostridium perfringes (esporas) Ahumado Bacillus cereus (esporas) Clostridium perfringes (esporas) Almacenamiento Bacillus cereus (esporas) E. coli Salmonella Clostridium perfringes (esporas)

6. MARCO TEORICO Chorizo: Es un embutido curado (bien al aire, bien ahumado), elaborado principalmente a base de carne de cerdo picada y adobado con especias, siendo la más característica el pimentón, que es el elemento más distintivo del chorizo frente a otras salchichas, y también el que le da su color característico rojo. La piel de este tipo de salchicha suele ser intestino delgado de cerdo, aunque también se utiliza el intestino grueso. A continuación algunas propiedades del chorizo. 4

Elementos principales Energía humedad fibra dietetica hidratos de carbono proteínas lípidos totales

En 100g 1844 kJ 31.90g 0.00g 0.00g 24.00g 38.30g

Acidos grasos

Minerales Calcio Fósforo Hierro Magnesio Sodio Potasio Zinc

42.00mg 177.00mg 3.40mg 20.00mg 1078.00mg 160.00mg 1.60mg

Saturados

14.38g

Vitaminas

Monoinsaturdos Monoinsaturdos Poliinsaturados Poliinsaturados Colesterol

18.40g 3.50g 110.00mg

Vitamina A Ac. Ascorbico Timina Riboflavina Niacina Piridoxina Ac. Fólico

… 0.00mg 0.00mg 0.59mg 0.26mg 4.60mg 0.07mg 3.00mg

Cobalamina

1.00mg

Propiedades del Chorizo aw pH

0.98 5.04

6.1- CONTROL DE CALIDAD: El chorizo elaborado correctamente debe tener las características:  Consistencia Firme y compacta al tacto.  Forma circular cilíndrica más o menos regular.  Aspecto ligeramente rugoso en el exterior  La tripa debe estar bien adherida a la masa interior.

6.2.- Descripción del proceso de elaboración del Chorizo Ahumado Recepción de la materia prima.- Se procede a pesar las carnes y los respectivos condimentos. Fraccionado de carnes.- Se retira de la carne partes cartilaginosas y huesos Molido.- Se introduce la carne por medio de discos que poseen orificios de 5mm, después de este proceso se golpea la masa obtenido contra una superficie lisa.

Mezclado.- Se coloca la sal curante, los condimentos, hielo y especias para reforzar y mejorar el sabor del chorizo para evitar la agregación de cantidades excesivas y la monotonía de un solo sabor, conviene emplear mezclar preparar de varios condimentos.

Embutido.- Es importante que la pasta no este a mas de 4-5C antes de embutir pues en caso contrario se presentan pringosidades durante la operación del rellenado. Se puede utilizar tanto tripas artificiales como naturales en este proceso, es necesario realizar el embutido hasta lograr un largo de 5-10 cm y proceder al atado del mismo

Ahumado.- Se traslada los embutidos a una cámara de ahumado la temperatura de la cámara de ahumado no supere los 60 C

Secado al ambiente.- Es necesario realizar un enfriamiento posterior al ambiente para su posterior refrigeración

Almacenado.- La temperatura del almacenado no debe superar a 5C 5

Comercialización.- Esta debe mantener la cadena de frio, tanto en el transporte como en el expendio.

6.3- Bacterias más frecuentes frecuentes en el Chorizo Chorizo 

Escherichia coli .- (Infectante). Productora de citotoxinas e invasora del tracto gastrointestinal por contaminación fecal. Se encuentra en el grupo de la Enterobacterias Gram(-) y es anaerobia facultativa. Puede ser endógena o exógena.



Staphylococcus Aureus.- (Intoxicante). Productora de enterotoxinas, resistente a altas presiones y temperaturas, desecación y radiación. Se encuentra presente en animales sanos (piel y mucosa) y enfermos (ubre). Pertenece a la familia Estafiloccocácea, Estafiloccocácea, es Gram(+) y anaerobia facultativa. facultativa.



Bacillus Cereus.- e l género Bacillus estácompuesto por bacilos grampositivos y formadores de endosporas aerobios. Consta de dos especies patógenas: B. anthracis (agente causal del carbunco) y Bacillus cereus, que es la especie de interés en los alimentos. B. cereus se encuentra presente en agua, suelo y polvo, sus esporas son resistentes al calor y la mayoría de su cepas son apatógenas.



Salmonella.- (Infectante). Se encuentra presente en el agua y alimentos contaminados. El origen de la contaminación puede ser endógena por zoonosis o exógena por el procesado de los alimentos. Es una bacteria Gram(-) y anaerobia facultativa. facultativa. No produce toxina.



Listeria Monocytogenes.- (Infectante). Se encuentra presente en superficies y alimentos contaminados, en los cuales su desarrollo se produce por la refrigeración. Produce una endo y enterotoxina.



Yersinia enterolitca.- (Infectante). Las Yersinias son bacilos del tipo gramnegativos aerobios y anaerobios facultativos fac ultativos;; son mótiles a 22°C, 22°C, pero no a 37°C, 37°C, por flagelos flage los anfitricos, anfitri cos, o peritricos, peritr icos, forman pilis, y fimbrias. No forman cápsulas de gran espesor ni esporas. Los roedores son el principal reservorio natural. Puede encontrarse en animales de sangre caliente domésticos y silvestres, los cerdos son importantes reservorios de los serotipos patógenos para el hombre.



Clostridium.- (Intoxicante) es un género de bacterias anaerobias, bacilos grampositivas, parásitas y saprófitas algunas de ellas, que esporulan, están ámpliamente distribuidas en el ambiente, habitando el tracto gastrointestinal tanto de humanos como animales.

6

6.3.- Flujo-grama Flujo-grama de la Elaboración del Chorizo humado (teórico)

7

6.3.1 Flujo-grama de la elaboración del chorizo ahumado (Real)

Recepción de la materia prima Almacenamiento congelador. T >10ºC

10cm a 15cm

Fraccionado de las carnes

T>20ºC

Carne de res, grasa de

Molido

cerdo y grasa de pollo

T>20ºC

Especias, colorante

Mezclado

Hielo y preservantes. preservantes.

T>10ºC

Embutido

Tripa natural ( lavada con

T>20ºC

vinagre)

Piola.

Atado

Ahumador +aserrín

Ahumado T=40ºC T=40ºC 20 min.

Secado T>20ºC

Almacenado

Fundas de polietileno

T>20ºC

Transporte Tem Tem erat eratur ura a ambi ambien ente te

8

En base a la comparación con el diagrama de flujo teórico se realizó una tabla de comparaciones en los cuales los puntos de de riesgo van a ser los mismos a continuación se explica:

Tabla de comparación del proceso de la elaboración del chorizo ahumado tanto teórico como real.

ELABORACION TEORICA

ELABORACION REAL

Rango de Todo el proceso se lleva a cabo No hay un control de temperatura temperatura en menor en el proceso La planta a 5ºC Recepción MP Pesaje y limpieza de la carne Pesaje y almacenamiento. almacenamiento. De carne ,grasa de cerdo y grasa de pollo Fraccionado Fraccionad o De carne y grasa de 5 a 10 cm. mayor de 10cm Selección de carne sacar tendones No selección de carne adición de cartílagos y Molido cartílagos ,etc. tendones Control de temperatura menor a 5ºC No control de temperatura adición de especias Mezclado adición de especias sal curante ,hielo sal curante hielo sin procedimiento de calculo (calculo) previo Embutido en tripa natural sal curante Embutido Embutido entripa natural lavado con vinagre. ,salado y lavado Manipulación del producto con las Atado mas exigentes exigentes normas para tener un un Manipulación del producto sin ninguna norma. producto inocuo No control de la temperatura y tiempo en que el Ahumado Temperatura de 30min -50ºC operario cree que en que el producto esta listo. No hay un control de plagas especialmente En un lugar libre de plagas como moscos ya que que estos están están sobre el producto y Secado moscos roedores y animales ,se realiza el secado secado con las puertas puertas abiertas abiertas domésticos. de la planta Temperatura menor a 5ºC en cuartos El producto esta sobre una mesa y es fríos y en envases adecuados Almacenado manipulado en donde se pesa y se lo coloca ,controlados y específicos para el en fundas para su respectivo almacenamiento producto Con temperatura controlada en Es transportado transportado en la parte trasera de una una Transporte vehículos adecuados para su camioneta en temperatura ambiente. posterior entrega

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7. ANALISIS DE RIESGO

Análisis de riesgos en el Proceso de Elaboración del Chorizo Ahumado Paso del proceso

Recepción de carnes crudas pesaje y limpieza

Fraccionado de Carnes y Grasa

Riesgo a la Inocuidad del alimento

Fundamento

Medidas a aplicarse para prevenir, eliminar o reducir el riesgo a un nivel aceptable.

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Clostridium P.

Los patogenos descritos podrían estar en en el producto crudo entrante (contaminacion endógena y exógena)

Certificación de los proveedores que declara que el producto ha cumplido con las normas de calidad correspondientes a los distintos patógenos

Físicos: materias extrañas

Materias extrañas pueden adherirse durante el transporte que proporciona el proovedor

Certificación de los proveedores que declara el adecuado transporte de la materia prima.

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Clostridium P.

Portadores sanos y enfermos que manipulan alimentos, falta de higiene del personal, refrigeración insuficiente (exógeno)

Contratar personal con los respectivos certifiados medicos, ademas deben complir con las normas de higiene impuestas por la empresa, utilizar procedimientos de enfriamiento apropiados



Químicos: ninguno

Químicos: ninguno Físicos: ninguno

Molido

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Clostridium P. Químicos: ninguno Físicos: ninguno

10

Mezcla

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica



Químicos: Nitritos

Dosis inadecuada

Realizar una adecuada dosificación







Biológicos: Patógenos sobrevivientes Bacillus Cereus (esporas) Clostridium P. (esporas)

El tratamiento térmico durante el ahumado disminuye la carga de patogenos debido a que la mayoria son mesófilos

Usar tiempos y temperaturas adecuadas para ahumar

Químicos: compuestos fenólicos

Tiempos de exposición prolongados

Controlar adecuadamente los tiempos de exposición

Físicos: ninguno

Embutido

Biológicos: Patógenos Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Clostridium P. Químicos: ninguno Físicos: ninguno

Atado

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Químicos: ninguno Físicos: ninguno

Secado

Biológicos: Patógenos Staphylococcus Aureus Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Listeria Monocytogenes Yersinia Enterolítica Químicos: ninguno Físicos: ninguno

Ahumado

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Físicos: ninguno

Secado


Biológicos: Patógenos Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Clostridium P.



Almacenamiento

Biológicos: Patógenos Bacillus Cereus Escherichia Coli Salmonella Clostridium P.

Refrigeración insuficiente

Utilizar procedimientos de enfriamiento apropiados


8. MARCO METODOLOGICO: 8.1.- GENERAL • •

Se utilizó el de análisis de riesgos, para identificar las causas de contaminación, en cada punto de control de la elaboración del producto. Para la identificación y asilamiento asilamiento de los patógenos se utilizaron utilizaron las normas de la ISO, BAM, FDA Y AOAC adjuntadas en los documentos anexos.

8.2.- ESPECÍFICO •

E. coli: Procedimiento a seguir: Método oficial de la ISO 7251 confirmación de E.coli Este procedimiento se aplica para realizar el método de ensayo cualitativo PETRIFILM E. coli/coliformes coli/coliformes contaje contaje en en placa placa para para la confirmación de E. coli . Se utiliza para cualificar coliformes y E. coli, teniendo como ventaja la cuantificación.

•

Bacillus Cereus: Procedimiento Procedimiento a seguir: método oficial de la ISO 7932:2004. Este procedimiento se confirma en β hemolisis en Agar Sangre de Cordero. Además de pruebas bioquímicas para confirmar presencia.

•

Listeria monocytogenes: El procedimiento a seguir: Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes de detección ISO 11290-1:1997. Se observaron diferencias diferencias con el aislamiento a partir partir de los medios de Oxford y Palcam, Estos medios suprimen mejor en este alimento la flora competitiva Confirmación Confirmación del género: Catalasa, Gram, movilidad. Confirmación de la especie: hemólisis, fermentación de ramnosa y xilosa.

•

Salmonella.- Procedimiento: ISO 6579 Directiva general concerniente a los métodos de investigación de Salmonella, este es muy parecido al método establecido por la BAM, estos métodos los comprobamos por resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados. 12

•

Clostridium perfinges.- Procedimiento a seguir : método oficial de la ISO 7937:2004 con el cual se utiliza para análisis TSC. Podemos comprobar su presencia o ausencia por tres métodos bioquímicos de comprobación establecidos establecidos por esta técnica.

•

Staphylococcus Aureus.- Procedimiento a seguir: método oficial ISO 6888. Método mediante enumeración de colonias, en base al cálculo del número de estefilococos coagulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias características y no características obtenidas en las placas escogidas a los órdenes de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa. coagulasa.

La selección de las técnicas se dieron en base a selectividad, disponibilidad, comprobación de bacterias detectadas y costos de los medios empleados en la técnica, existe gran parecidos entre las mismas como son: BAM, ISO, y AOAC, en la mayoría de casos empleamos las normas ISO puesto que en su mayoría son normas que acoge la INEN y esta es el organismo que nos rige en nuestro país.

9. MUESTREO En alimentos esta destinado al análisis microbiológico, este consiste en separar un número determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc. Con el fin de obtener resultados analíticos fiables.

9.1-Muestreo único: Consideraremos Considerarem os un muestreo único, aunque existe una gran probabilidad de falsos negativos. Es conveniente analizar un número de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeño. Usaremos este tipo de muestreo para determinar la ausencia o presencia de los patógenos en tres puntos del proceso, los cuales hemos considerado críticos (recepción de materia prima, mezclado, ahumado). Para el análisis colectaremos un 10% de la muestra debido a que la producción es pequeña (en cada punto de muestreo), de esta muestra haremos tres siembras. 9.2.- Muestreo por atibutos: Usaremos un plan plan de muestreo por atibutos que es es aplicable a datos cualitativos cualitativos y cuantitativos, cuantitativos, esto debido a que tenemos escasa información sobre el modo en que el alimento se ha procesado, además de no disponer de registros anteriores. Usaremos un plan de muestreo por atributos a dos y tres clases, para el análisis cuantitativo definiremos un valor límite que defina si un valor es no satisfactorio, en nuestro proyecto usaremos el caso 7 y el caso 10 en los puntos críticos de control según se indica en la siguiente tabla sugerida por la ICMSF:

Nivel de peligro para la salud Con peligro para la salud Moderado, directo, diseminación limitada

Bacillus cereus , Clostridium perfringens A, Staphylococcus

Condiciones en las cuales el producto sera manipulado y consumido luego del muestreo Sin cambio El peligro se Reducción del peligro en el peligro incrementa

caso 7 3 clases n=5;c=2


caso 9 3 clases n = 10 ; c = 1


caso 11 2 clases n = 10 ; c = 0

caso 12 2 clases n = 20 ; c = 0

aureus . Moderado, directo, diseminación potencial

Escherichia coli patógena, otras serovariedades de Salmonella

Listeria monocytogenes monocytogenes . 13

Severo, directo

caso 13 2 clases n = 15 ; c = 0

caso 7 2 clases n = 30 ; c = 0

caso 15 2 clases n = 60 ; c = 0

10.- FACTIBILIDAD: Bacteria

Método utilizado

Medio

Disponibilidad en el laboratorio

Por que del método

Salmonella

ISO 6579

Agua de peptona tamponada Agar XLD

Si Si

Este es muy parecido al método establecido por la BAM, estos métodos los comprobamos por resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.

Escherichia Coli

ISO 7251

Petrifilm

Si

Bacillus Cereus

ISO 7932:2004.

Agar manitol yema de huevo polomixina Agar Sangre de Cordero

Si

Si (comprar en distribuidoras distribuidoras $1.8 caja)

Este procedimiento procedimiento se aplica para realizar el método de ensayo cualitativo PETRIFILM E. coli/coliformes coli/coliformes contaje en placa para la confirmación confirmación de E. coli . Se utiliza para cualificar coliformes y E. coli, teniendo como ventaja la cuantificación. Este procedimiento procedimiento se confirma en β hemolisis en Agar Sangre de Cordero. Además de pruebas bioquímicas para confirmar presencia.

11.- CRONOGRAMA Días Lunes Martes

Miercoles

Actividad Preparación y esterilización de material Preparación de medios Siembra de muestras preenriquecimiento de Bacillus Cereus en Agar Manitol Yema de Huevo Polomixina MYPA Incubación de muestras preenriquecimiento Salmonella en agua de peptona tamponad a Siembra de muestras de identificación E. Coli en Petrifilm 14

Temperatura

Tiempo

30ºC

24h

35ºC

24h

37ºC

48h

Jueves

Viernes Sabado

Siembra de muestras enriquecimiento de Bacillus Cereus en Agar Sangre de Cordero + hemólisis Incubación de muestras enriquecimiento de Salmonella en Caldo tetrationato Siembra en agar XLD para Salmonella Identificación de Bacillus Cereus Pruebas bioquímicas para identificación identificación de Salmonella

30ºC

24h

35ºC

24h

35ºC

24h

12.- BIBLIOGRAFIA http://www.lezgon.com/pdf/IB0000 http://www.lezgo n.com/pdf/IB00000016/24%20 0016/24%2028%20Line 28%20Linea%20de%2 a%20de%20llenado.pdf 0llenado.pdf 2. 3. 4. 5.

http://www.colombiaaprende.edu.co/html/mediateca/1607/articles‐83403_archivo.pdf PASCUAL, María del Rosario. “Microbiológica Alimentaría”. Ed. Díaz de Santos. Segunda Edición. Madrid‐ España.2000. Pág.171‐193, 281‐291. DESROSIER, N. “Elementos de Tecnología de los Alimentos”. Compañía editorial Continental S.A. Primera edición. Decima Tercera reimpresión. Mexico‐Mexico D.F. 1995. Pág. 99‐101, 198, 447‐449 MOSSEL. “Microbiología de los Alimentos”. Págs. 330 – 330 – 336, 430 – 430 – 436.

15

ANEXOS Descripción detallada de los procedimientos:

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus. Método mediante enumeración de colonias

Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido, preparando dos series de placas, con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias características obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa. coagulasa. NF V 08-057-1 Método de rutina para la enumeración de estafilococos cuagulasa positivos mediante recuento de colonias a 37ºC. Técnica de confirmación de las colonias. Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido selectivo, repartido en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. Incubación de las placas a 37º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de estefilococos coagulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias características y/o no características obtenidas en las placas escogidas a los órdenes de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.

BACILLUS CEREUS

16

SALMONELLA ISO 6579 Directiva general concerniente a los métodos de investigación de Salmonella. Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agua de peptona tamponada e incubación a 37º C (35º C) durante 16 – 20 horas. Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembre en verde malaquita con cloruro de m,agnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 24 horas y 24 horas suplementarias. Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se siembran dos medios sólidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a elección. Ambos se incuban a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas. Confirmación: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.

V 08-052 Método de rutina para la investigación de Salmonella Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: - Preenriquecimiento Preenriqueci miento en medio no selectivo: selectivo : Siembra de la muestra en agua de peptona tamponada e incubación a 37º C durante 16 – 20 horas Enriquecimiento Enriquecimi ento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento preenriquecim iento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 18 – 24 horas. - Aislamiento e identificación: identificación: A partir de los cultivos cultivos anteriores anteriores se siembra en en un medio sólido sólido selectivo selectivo a elección. Se incuba a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas y se examinan las características de las colonias. - Confirmación: Confirmación: Resiembra Resiembra de las presuntas presuntas colonias colonias de Salmonella y confirmación confirmación en los medios medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados. apropiados.

E. Coli ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica del NMP Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de doble concentración con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. A continuación se siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. Después y en las mismas condiciones se siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35 – 37º C según acuerdo durante 24 – 48 horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra desprendimiento de gas se inocula un tubo con medio selectivo líquido EC. La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares a 45º C. Se hacen las lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del número de tubos positivos en medio selectivo EC se siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubación a 45º C, 24 – 48 horas y se examina la producción de indol. A partir de los tubos positivos a la producción de gas en medio selectivo y a la producción de indol en agua de triptona, se calcula el número más probable de E. coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo.

17

18

Listeria monocytogenes

19

Cl. Perfringes tipo A

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METODOS ALTERNATIVOS SEGÚN LA BAM PARA IDENTIFICACION DE SALMONELLA, E.COLI Y STAPHILOCOCUS AUREUS Recuento e Identificación de E. Coli Preparación de la muestra

10 g ó ml de muestra + 90 ml de H2O de peptona

Diluciones

0,1 ml de muestra + 9.9 ml de H2O de peptona

Selectividad

Sembrar por vertido 1 ml de cada dilución en VRB Incubar a 44ºC por 24 horas

Pruebas bioquímicas

IMVIC

Recuento e Identificación de Stapjilococcus Aureus Preparación de la muestra

10 g ó ml de muestra + 90 ml de H2O de peptona

Dilución

0.1

ml de muestra + 9,9 ml de H2O de peptona

Selectividad

Sembrar 1 ml de cada dilución en Agar Baird Parker por extensión

Incubar a 37 ºC por 48

Confirmación de S. Aureus

Of ‐ Coagulasa

Catalasa

Tinción Gram.

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Identificación de Salmonella

Preenriquecimiento

25 g ó ml de muestra + 225ml de

Incubar de 16‐20 horas a 37ºC

Enriquecimiento

10 g ó ml de muestra + 100 ml de

‐ Incubar a 37ºC de 24‐48 Horas Selectividad

Salmonella‐Shigella

Verde Brillar

McConkey

McConkey

Aislamiento

Pruebas Bioquímicas

TSI

SIM

Urea

22

Informe Preliminar

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