INFORME ESPECTROFOTOMETRÍA
PARTE PARTE I. Curvas de Absorbancia Tras exponer las tres sustancias a todo el espectro de luz visible, estos fueron los datos obtenidos:
Azul de Bromoenol
Tabla !. Datos de absorbancia de longitudes de onda entre 400 y 700 nm para el Azul de Bromofenol
"r#ica !. !urva de absorbancia vs longitud de onda para el Azul de Bromofenol
Naran$a de Me%ilo
Tabla &. Datos de absorbancia de longitudes de onda entre 400 y 700 nm para el "aran#a de $etilo
"r#ica &. !urva de absorbancia vs longitud de onda para el "aran#a de $etilo
Soluci'n de Naran$a de Me%ilo ( Azul de Bromoenol
Tabla ). Datos de absorbancia de longitudes de onda entre 400 y 700 nm para la mezcla de "aran#a de $etilo y Azul de Bromofenol
"r#ica ). !urva de absorbancia vs longitud de onda para la mezcla de "aran#a de $etilo y Azul de Bromofenol
Toda sustancia %ue absorbe luz visible aparece coloreada cuando trasmite o refle#a la luz &la luz blanca contiene todos los colores del espectro visible'la sustancia absorbe ciertas longitudes de onda de la luz blanca, y nuestros o#os detectan las longitudes de onda %ue no se absorben (l color observado se llama el complementario del color absorbido (l azul de bromofenol absorbe la longitud de onda naran#a &)*0+)0 nm' y aparece azul a la vista
(l naran#a de metilo absorbe la longitud de onda azul &4-0+470 nm' y aparece naran#a a la vista
Tabla *. !olores de .uz /isible
Analizando los datos obtenidos a partir de la mezcla de colorantes se observa un fenmeno muy interesante, observamos %ue la gr1fica de absorbancia contra longitud de onda es en realidad una superposicin de las respectivas gr1ficas del azul de bromofenol y el naran#a de metilo !omo mencionamos anteriormente, el azul de bromofenol absorbe luz naran#a, por lo %ue se ve azul, mientras %ue el naran#a absorbe luz azul, por lo %ue se ve naran#a, al mezclarlos, ser2a lgico %ue de alg3n modo se complementaran5 absorbiendo de esta manera un amplio rango de luz visible, explicando as2 el color marrn oscuro, observado durante la pr1ctica
PARTE II. +emos%raci'n de la ,e( de Beer Tras completar el proceso anterior, 6emos procedido a preparar ) soluciones de cada colorante siguiendo el siguiente protocolo:
Tabla -. rotocolo de preparacin de !antidad de !olorante y !antidad de Agua
!alculando la concentracin molar de estas soluciones obtenemos %ue:
A/, +E BROMOFENO, Tubo No.! !8/89!/ C 2=
0,01∗0,005
C 2=
0,005 0,01 g
C 2=
Tubo No.& !8/89!/
L
C 2=
669,96 g −5
0,006 g
∗1 mol C 2=
669,96 g
L
∗1 mol
669,96 g −
C 2= 8,95 x 10
Tubo No.!8/89!/ 0,01∗0,001 C 2=
0,005
C 2=
L
0,005
C 2=1,19 x 10
Tubo No.* !8/89!/ 0,01∗0,002 C 2=
L
0,005
−5
C 2=1,49 x 10
0,004 g
0,01∗0,004
0,008 g
∗1 mol
Tubo No.) !8/89!/ 0,01 ∗0,003 C 2=
0,005
0,002 g
∗1 mol C 2=
669,96 g −6
L
∗1 mol
669,96 g −6
C 2=5,97 x 10
C 2=2,98 x 10
ANARAN0A+O +E METI,O Tubo No.! Tubo No.& !8/89!/ !8/89!/ 0,01 ∗0,005 0,01 C 2 C 2= =
0,005
0,01 g
C 2=
L
−
C 2=3,05 x 10
5
Tubo No.* !8/89!/ C 2=
0,01∗0,002 0,005
0,005
0,008 g
1m
∗
327 , 34 g
0,004
∗
C 2=
L
Tubo No.) !8/89!/ 0,01 ∗0,003 C 2= 0,005
0,006 g
∗1
327 , 34 g
C 2=2,44 x 10
5
−
Tubo No.!8/89!/ 0,01 ∗0,001 C 2= 0,005
C 2=
L
∗1
327 , 34 g −5
C 2=1,83 x 10
6
0,004 g
C 2=
L
0,002 g
1
∗
327 , 34 g −5
C 2=1,22 x 10
L
C 2=
∗1
327 , 34 g −6
C 2= 6,10 x 10
Azul de Bromofenol
Tubo No. 8
1,49∗10
1,19∗10
;
8,95∗10
4
5,97∗10
)
2,98∗10
Anaran#ado de $etilo
−5
3,05∗10
−
−5
2,44∗10
−
6
1,83∗10
−
6
1,22∗10
−6
6,10∗ 10
5
−5 −5 −5
−6
Tabla 1 !oncentraciones de Amaran#ado de $etilo y Azul de Bromofenol para cada tubo
osteriormente, 6emos sometido las soluciones de cada colorante a una luz cuya longitud de onda fuese la m1s propensa a ser absorbida por el colorante &4-0 nm para el naran#a de metilo y )*0 nm para el azul de bromofenol' y 6emos medido la absorbancia resultante con la ayuda del espectrofotmetro, estos fueron los datos obtenidos:
Azul de bromoenol Concen%raci'n absorbancia moles2, 0,0000149 0,0000119 0,00000895 0,00000597 0,00000298
0,950 0,778 0,549 0,392 0,192
Tabla 3. /alores de concentracin de Azul de Bromofenol de acuerdo a la Absorbancia
"r#ica *. !urva de Absorbancia vs !oncentracin para el Azul de Bromofenol
"r#ica -. !urva de Absorbancia vs !oncentracin para el Azul de Bromofenol con la regresin lineal de m2nimos cuadrados realizada en (xcel y la e cuacin de la recta
Naran$ado de me%ilo Concen%raci'n moles2,
Absorbancia
0,0000305 0,0000244 0,0000183 0,0000122 0,0000061
0,764 0,617 0,469 0,309 0,16
Tabla 4. /alores de concentracin de Anaran#ado de $etilo de acuerdo a la Absorbancia
"r#ica 1. !urva de Absorbancia vs !oncentracin para el Anaran#ado de $etilo
"r#ica 3. !urva de Absorbancia vs !oncentracin para el Azul de Bromofenol con la regresin lineal de m2nimos cuadrados realizada en (xcel y la e cuacin de la recta
Ambas curvas presentan un comportamiento exponencial caracter2stico de la .ey de Beer
ambas con concentraciones desconocidas, para determinar su concentracin tan solo es necesario tomar como referencia una solucin para cada color de las utilizadas en el punto anterior y as2 poder determinar la absorbancia espec2fica >ecordemos %ue la ley de Beer+.ambert establece %ue: E= kCl
Donde E es extincin o absorbancia, k es la absorbancia espec2fica, C es la concentracin del colorante, y l es la longitud del medio %ue la luz debe atravesar De manera %ue: E C = Kl
>eemplazando los valores conocidos, obtenemos %ue:
C =
C =
0,238
( 63983 )× 1
0,213
( 25255 )× 1
= 0,00000372 M ( parael azul debromofenol )
= 0,00000843 M ( parael anaranjado demetilo )
De esta manera se obtuvieron las concentraciones para las soluciones incgnitas de azul de bromofenol y anaran#ado de metilo
,ABORATORIO CROMATO"RAFIA +E CAPA FINA
PARTE I. SO,/BI,I+A+ +E ,A ",ICINA (n este experimento, se agregaron cristales de glicina a diferentes compuestos A continuacin se describen las observaciones realizadas:
Solven%e /%ilizado ?!l 0,8$
Observaciones .os cristales de glicina en contacto con
el 1cido clor62drico se disuelven completamente dando como resultado una solucin .os cristales de glicina no se disuelven formando una segunda fase, pues los cristales se depositan en el fondo del tubo de ensayo y se forma una frase sobrenadante A simple vista los cristales de glicina no producen ninguna reaccin, pero observando detenidamente, se aprecia %ue los gr1nulos de glicina se 6acen m1s pe%ue@os y m1s finos, y por consiguiente se forma una segunda fase .os cristales de glicina en contacto con el agua se disuelven pero no totalmente, aproximadamente un ) %uedando unos pocos gr1nulos en el tubo de ensayo
(tanol
!loroformo
Agua destilada Tabla 5. bservaciones para cada solvente utilizado
A partir de estos resultados podemos ordenar los solventes utilizados de mayor a menor capacidad de diluir los cristales de glicina de la siguiente manera:
!. &. ). *.
Ccido clor62drico Agua destilada !loroformo (tanol
(sto nos permite afirmar %ue los cristales de glicina se comportan de manera diferente al 6acer contacto con determinados solventes
PARTE II. REACCI6N CON ,A NIN7I+RINA. (stos fueron los resultados observados:
Amino#cido u%ilizado licina
87 a8ro9imado -
Tirosina
-
rolina
-
Coloraci'n Ad:uirida /ioleta Encoloro, con precipitado blanco Amarillo
Tabla !;. Coloraci'n Ad:uirida ( 87 a8ro9imado 8ara cada Amino#cido u%ilizado
racias a los datos obtenidos se puede decir %ue los amino1cidos %ue reaccionaron con la nin6idrina fueron la glicina y la prolina .a nin6idrina descarboxila por oxidacin los a +aa a ! y un alde62do, form1ndose un comple#o de color azul+p3rpura &l : )70 nm' .os aa no a , prolina e 6idroxiprolina, producen un color amarillo con nin6idrina
PARTE III. PR/EBA +E NITROPR/SIATO. Al momento de realizar este procedimiento, la ciste2na produ#o una coloracin ro#iza mientras %ue los dem1s amino1cidos presentaron una coloracin naran#a p1lida (stos resultados se pueden explicar gracias a la presencia o ausencia del grupo tiol en los amino1cidos utilizados, un tiol es un compuesto %ue contiene el grupo funcional formado por un 1tomo de azufre y un 1tomo de 6idrgeno &+
PARTE I<. CROMATO"RAFÍA +E CAPA FINA. Tras colocar la placa de s2lica gel en la fase mvil y de#arse en reposo por varias 6oras, observamos %ue la fase mvil se desplaz verticalmente a trav=s de la placa de s2lica gel &debido al proceso de capilaridad, el mismo %ue usan las plantas para transportar agua' Despu=s de 6aberse secado el eluente de la placa, se roci con nin6idrina y se calent, al 6acer esto se formaron manc6as de colores en la placa correspondientes a los diferentes amino1cidos %ue fueron arrastrados por el eluente, esta ad%uisicin de color se explica mediante la siguiente reaccin %u2mica !omo se observa en la siguiente fotograf2a, los amino1cidos aparecen como manc6as p3rpura sobre un fondo ligeramente amarillento
Fi=ura !. Fotograf2a de placa para cromotograf2a de capa fina usada en el laboratorio
A continuacin se expone de manera organizada los datos cuantitativos obtenidos a partir de la cromatograf2a:
Tabla !! . Datos cuantitativos de acuerdo a la cromatograf2a
* Xaa: distancia recorrida por el aminoácido Xsolvente: distancia recorrida por el solvente
(n la solucin denominada $EG5 se encuentran tres diferentes amino1cidos correspondientes a la prolina, la metionina y la fenilalaninaH esto lo pudimos comprobar comparando los tres diferentes recorridos con los dem1s amino1cidos y observando %ue realizaban recorridos de longitudes similares a los de otros amino1cidos, as2 es como constatamos %ue el amino1cido 85 se desplazaba igual distancia %ue la prolina, lo %ue significaba %ue las7u dos eran las mismas sustancias, lo mismo pas con el amino1cido 5 %ue se desplazaba igual distancia %ue la metionina y el amino1cido ;5 se desplazaba la misma distancia %ue la fenilalanina Amino1cido 8: prolina Amino1cido : metionina Amino1cido ;: fenilalanina (n lo %ue respecta a los amino1cidos puros, su comportamiento lo podemos explicar a partir de las caracter2sticas de su radical, pues como vemos en la tabla de resultados, los amino1cidos con radicales sin cargas se movieron m1s a trav=s de la placa de s2lica gel, esto es debido a %ue la fase mvil era de car1cter apolar, por lo %ue estos amino1cidos eran arrastrados por esta en su paso a trav=s de la placaH por otro lado, los amino1cidos %ue menor desplazamiento mostraron eran predominantemente polares, por lo %ue no eran f1cilmente disueltos por la fase mvil y como consecuencia de ello su desplazamiento fue menor
INFORME REACCIONES "ENERA,ES +E ,AS PROTEINAS ara la realizacin de todos los experimentos %ue se expondr1n posteriormente, se 6an utilizado ; prote2nas &alb3mina, case2na y gelatina', las cuales 6an sido sometidas a diferentes agentes externos para observar como var2an algunas de sus propiedades y determinar de esta manera una o varias de sus caracter2sticas A continuacin se describen los resultados obtenidos en cada experimento
PARTE I >PR/EBA +E BI/RET? (n este experimento, se 6an utilizado m. de cada prote2na, a las %ue se le 6an a@adido ) gotas del sulfato de cobre y seguidamente m. de "a? Tras mezclarse correctamente se observaron estos resultados: A,B@MINA CASEÍNA "E,ATINA 8 Despu=s de a@adir ) gotas de !. Despu=s de a@adir ) gotas !. Despu=s de a@adir ) gotas sulfato de cobre 80 gI. a la de sulfato de cobre 80 gI. de sulfato de cobre 80 gI. prote2na alb3mina, ad%uiere una a la prote2na case2na, se a la prote2na gelatina, no coloracin azul muy puede observar una se observa ning3n tipo de desvanecida siendo seme#ante coloracin violeta clara coloracin, la sustancia al color blanco y se mantuvo &. .uego de agregar los ml sigue siendo transparente con espuma antes y despu=s de de "a? 80$ y mezclar &. .uego de agregar los ml la agitacin vigorosamente se observa de "a? 80$ y mezclar .uego de agregarle los ml de una coloracin violeta clara vigorosamente se observa "a? 80$ y mezclar , pero m1s oscura %ue la una coloracin violeta vigorosamente se detecta un alb3mina oscuro color violeta no muy intenso ).
esultados de prueba de Biuret para Albumina, !aseina y elatina
.as pruebas de biuret con la albumina, la case2na y la gelatina arro#aron resultados positivos .as tres prote2nas mencionadas antes son prote2nas globulares debido a %ue se encuentran enrollados adoptando forma esf=rica por sus uniones pept2dicas reaccionan con los iones c3pricos &!uso4' del reactivo en el medio alcalino proporcionado por el 6idrxido de sodio &"a?' consiguiendo %ue su disposicin espacial sea diferente y consiga un color violeta .a intensidad del color es proporciona la concentracin de prote2nas Al comparar los resultados se observa %ue las prote2nas ad%uirieron diferentes intensidades de violeta, de m1s oscuro a m1s claro: gelatina, case2na y alb3mina (sto se debe a %ue la prueba de Biuret reacciona con compuestos %ue tienen m1s de enlaces pept2dicos, lo %ue significa %ue las prote2nas alb3mina, case2na y gelatina cumplen con esta caracter2stica, de#ando en claro %ue la gelatina tiene m1s enlaces pept2dicos %ue las otras dos debido a %ue su coloracin fue de un violeta m1s oscuro, seguido por la case2na y con menos enlaces pept2dicos la alb3mina
.as cadenas de prote2nas %ue 6ay en la albumina se encuentran enrolladas adoptando una forma esf=rica
PARTE II >+ESNAT/RA,IACI6N +E PROTEÍNAS POR CA,OR 87? (stos fueron los resultados obtenidos:
Tras el cambio de 87 Tras el calen%amien%o Tras la neu%ralizaci'n
Albmina 7Cl NaO7 .a solucin se torn "o se observaron levemente blancuzca cambios .a solucin se torn
A=ua "o se observaron cambios .a solucin se torn blancuzca pero menos %ue la solucin 1cida y menos %ue la solucin b1sica (l p? fue de * "o se observaron cambios adicionales
Tabla !) . >esultados de Desnaturalizacin de prote2nas por calor y p? para Albumina
7Cl
"ela%ina NaO7
A=ua
Tras el cambio de 87 Tras el calen%amien%o Tras la neu%ralizaci'n
"o se observaron cambios "o se observaron cambios "o se observaron cambios "o se observaron cambios "o se observaron cambios "o se observaron cambios (l p? fue de 8 (l p? fue de 84 (l p? fue de ) "o se observaron cambios "o se observaron cambios "o se observaron cambios
Tabla !* . >esultados de Desnaturalizacin de prote2nas por calor y p? para elatina
7Cl Tras el cambio de 87 Tras el calen%amien% o Tras la neu%ralizaci' n
.a solucin se torn blanca y empez a precipitarse "o se observaron cambios adicionales (l p? fue de ; .a precipitacin finaliz y se formaron dos fases muy evidentes
Casena NaO7
A=ua
"o se observaron "o se observaron cambios cambios "o se observaron "o se observaron cambios cambios (l p? fue de 8; (l p? fue de * .a solucin se torn .a solucin blancuzca blancuzca
se
torn
Tabla !- . >esultados de Desnaturalizacin de prote2nas por calor y p? para !aseina
ara empezar, debemos resaltar el 6ec6o de %ue una de las prote2nas, la gelatina, no mostr signos de reaccin alguno, en el caso de la gelatina esto se explica por%ue la gelatina se obtiene mediante la desnaturalizacin del col1geno presente en el te#ido conectivo de diferentes animales &piel, cart2lago, ligamentos, tendones, etc' a trav=s de diferentes procesos como el calentamiento o la exposicin a p? extremos &el mecanismo m1s com3n en la industria', por ende, la prote2na %ue 6emos utilizado en el experimento ya se encontraba desnaturalizada, es decir, 6ab2a perdido su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, y como es lgico, una “redesnaturalización” no era posible
precipitado los dem1s tubos al tener p? ale#ados del punto isoel=ctrico tan solo mostraban los efectos del calentamiento .a case2na, por otro lado, es una prote2na muy com3n en la lec6e bovina, y al contrario de la alb3mina, no se desnaturaliza por el calor, sino por cambios en su p?, esto tambi=n lo podemos observar en la cotidianidad, pues observamos %ue al 6ervir lec6e, ning3n cambio se observa, mientras %ue si le agregamos suficiente #ugo de limn como para acercar su p? a su punto isoel=ctrico &4,-', esta se precipita muy claramenteH en nuestro experimento obtuvimos resultados muy similares, la solucin de case2na a la %ue se le agreg ?!l &con un p? de aprox ;' se precipit formando dos fases muy bien definidas &una blanca y una transparente', mientras %ue las dem1s no mostraron cambios ni al modificar su p? ni al calentarse
PARTE III >PRECIPITACI6N POR META,ES PESA+OS? ara la realizacin de este experimento se 6an a@adido a 4 tubos de ensayo m. de cada prote2na, posteriormente se le a@adi sulfato de cobre a cada tubo y por 3ltimo se satur cada solucin con el metal (stos fueron los resultados observados durante esta pr1ctica:
Albumina
Casena .a solucin se torna celeste lec6oso un poco oscuro y no 6ay presencia de precipitado, al a@adirle el exceso de sulfato de cobre se vuelve azul cielo con muc6o precipitado, el precipitado se va al fondo del tubo de ensayo formando dos fases
"ela%ina .a solucin se torna transparente sin presencia de precipitado, al a@adir el sulfato de cobre la solucin se vuelve m1s azul sin precipitado "o se present desnaturalizacin
Tabla !1 . >esultados de Desnaturalizacin de prote2nas por calor y p? para !aseina
!uando una rote2na tiene su estructura J"ormalJ u riginal, se le llama nativa Todos sus enlaces Entermoleculares, est1n intactos &uentes de ?idrgeno,
puentes disulfuro, etc' !uando alg3n factor, rompe estos enlaces, y la rote2na pierde su estructura !uaternaria, a eso se le llama Desnaturalizacin
(n el caso de las sales de metales pesados, su adicin a soluciones de prote2nas d=bilmente alcalinas, produce la precipitacin de la prote2na, debido a %ue las prote2nas en forma aninica se neutralizan por los iones de los metales pesados y precipitan
PARTE I< >PRECIPITACI6N POR REACTI
evidenci1ndose as2 la afinidad %u2mica del 1cido p2crico con el "a? y la disociacin de las prote2nas y el p=ptido A continuacin se exponen m1s detalladamente los resultados obtenidos en el experimento: ALBUMINA
CASEINA
GELATINA
ÁCIDO PÍRICO CONCENTR ADO (5 gotas)
Se observa turbidez y precipitado. Al aitar se !a"tie"e la turbidez y el precipitado.
Se observa trasl#cido y "o $ay precipitado. Al aitar !a"tie"e de esta !a"era.
ÁCIDO PÍRICO CONCENTR ADO (5 gotas)
Se observa !%s turbidez y !%s precipitado. Al aitar se !a"tie"e de esta !a"era.
HIDRÓXIDO DE SODIO
'o" u"a ota de (a)* se trata de re"aturalizar, pero para &ue se re"aturalice se "ecesit+ aitar el tubo de e"sayo. ued+ trasl#cido au"&ue se observa" u"as pe&ue-as partculas.
Se observa turbidez y precipitado. Al aitar se vuelve trasl#cido y "o se ve precipitado. Se observa turbidez y precipitado. Al aitar se !a"tie"e la turbidez y el precipitado. 'o" u"a ota de (a)* se re"aturaliza parcial !e"te y co" aitarla u" poco se re"aturaliza por co!pleto.
Se observa alo de turbidez y precipitado. Al aitar &ueda e" u"a turbidez i"ter!edia. Al e"trar e" co"tacto la ota de (a)* se re"aturaliza de i"!ediato y se vuelve co!pleta!e"te trasl#cido.
Tabla !3 . >esultados de precipitacin de prote2nas por reactivos 1cidos para la Albumina, !aseina y elatina
CONC,/SIONES .a absorbancia es la capacidad %ue tienen algunos compuestos para absorber la radiacin electromagn=tica, se pudo observar en la pr1ctica cmo, dependiendo de la concentracin y la longitud de onda del rayo de luz aplicado, puede alcanzar un punto m1ximo de absorcin (n la pr1ctica donde se realiz la espectrofotometr2a se calcul las longitudes de onda de tres sustancias las cuales permitieron %ue a diferentes concentraciones se pudiera calcular la absorbancia de las mismas y as2 determinar su concentracin de manera num=rica mediante la ley beer+lambert, con esto se pudo concluir %ue a mayor concentracin, mayor ser1 la absorbancia Detectando las propiedades de algunos amino1cidos, tales como solubilidad y capacidad para reaccionar al ser expuestos a un reactivo espec2fico, se puede entender la gran importancia de su estudio para comprender el papel %ue tienen en las reacciones %u2micas, en la produccin de soluciones y para formar diferentes prote2nas As2, .as propiedades cualitativas y cuantitativas de los amino1cidos muestran la capacidad %ue tienen de participar en una amplia variedad de reacciones %u2micas, tales como: esterificacin, 6alogenacin, reduccin, al%uilacin, acilacin, acetilacin, entre otrasH por lo tanto es posible clasificarlos de acuerdo a las diferencias y seme#anzas en cuanto a las propiedades f2sicas identificadas Edentificamos una prote2na como una cadena de amino1cidos cuya secuencia es espec2fica %ue comienza a plegarse sobre s2 misma utilizando de otros elementos como colaboradores para adoptar la conformacin espacial necesaria para realizar correctamente su funcin biolgica Adem1s identificamos %ue la p=rdida de esta conformacin espacial 6ace %ue la prote2na no pueda cumplir con su funcin biolgica y se conoce como desnaturalizacin, y %ue existe la forma de renaturalizar estas prote2nas
/eere"cias Aminoácidos. s... )bte"ido de $ttpace!ucsc.aleo".co!articulosio&ui!icaa!i"oacidos.$t! *arris, . '. s... Análisis Químico Cuantitativo.
La Cromatografía en Capa Fina . s... )bte"ido de $ttpdepa.&ui!.u"a!.!protei"asestructura'$r'.$t!l Pruebas Cualitativas para Aminoácidos y Proteínas . s... )bte"ido de $ttpbio:i!i:2011.blospot.co!201109ob;etivos
