Preinforme de Bioprocesos 2da Unidad B2

Grupo B2: Preinforme de Bioprocesos 2da Unidad – Cultivo Celular por lote alimentado con aireación de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 Curso: Bioprocesos Docente:

Augusto Castillo Calderón Integrantes:    

Diestra Galarreta Alex Escudero Jaramillo Fred Guzman Serrano Wilmer Jara Paz Ángel

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS

CULTIVO CELULAR POR LOTE ALIMENTADO CON AIREACIÓN DE SACCHAROMYCES SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATCC 4126 I. OBJETIVOS 1.1.



Generales:

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA) con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126.

1.2.

Específicos:



Diseñar un medio de cultivo



Realizar la activación celular y desarrollo del inoculo.



Identificar y describir las partes, accesorios y geometría, conocimiento de la operación del fermentador, esterilización, carga y descarga y toma de muestras.



Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automático, así como la calibración de los sensores.

 Puesta en marcha el CLA. En el cultivo por lote determinar μ Max y ⁄ . 

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y oxigeno disuelto a través del tiempo total de fermentación en el birreactor.



Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitado.



Determinar ⁄ y  del CLA.

DESARROLLO DEL DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR CELULAR POR LOTE

2


II.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

2.1.

Diseño del Medio de Cultivo

Para diseñar un medio de cultivo es necesario conocer la composición elemental del M.O. Diseño de los medios de Mantención, Activación y Cultivo para Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126. µm = 0.37 h-1 en sacarosa a 35°C.

MEDIO

SÓLIDO DE MANTENCIÓN

NUTRIENTE Extracto de levadura

3

Peptona

5

Extracto de Malta Agar

35°C y 150 rpm

20 10

Sacarosa

15

Extracto de levadura

3

Extracto de Malta

PRE-FERMENTACIÓN

3

Glucosa

ACTIVACIÓN T° 35°C, 200 rpm

CONCENTRACIÓN (G/L)

Solucion de Sales

5 5ml/L

Sacarosa

15

Extracto de Levadura

1.8

Sulfato de Amonio (NH4)2SO4

0.23077

Fosfato de Potasio KH2PO4

0.0036

Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4.7H2O

0.5173

Solución de Sales

10ml/L

Tampón Citrato pH 4.2

100ml/L

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE

3


FERMENTACIÓN en CLA Para 2 litros

Sacarosa

0.32


1.8


0.467


0.037


0.022

Solución de Sales

10ml/L pH 4.2

Composición de Solución de Sales 100 veces concentrado, utilizadas en los medios de cultivo en g/L: 1,12 CaCl2.2H2O; 0,11 ZnSO4.7H2O; 0.06 FeSO4.7H2O; 0.05 CuSO4.5H2O; 0.01 CoCl2.6H2O; 0.0005 MoO3; 0.027 MnCl2.6H2O y 0.28 NaCl. 

-

Determinación de la concentración de biomasa para el medio de activación: El medio de activación contiene 15ml de medio, de lo cual tendríamos que sacar 15ml según X0: 15 v/v para inocular en el medio de fermentación que es de 100 ml.

15 ml

100 ml

15 ml

Fuente C

Nutriente C12H22O11

% célula 45

Ahora podemos hallar ∆X: ⁄ =

%nutriente 42.1

Yx/s 0.56

∆ ∆

∆ = 10 ∗ 0.56 = . /


So(g/L) 10

Sò(g/L) 10

4

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS 

Determinación de la concentración de biomasa inicial para el medio de fermentación:

10 ml

100 ml

X’=5.6g/L

X0= ? 100 ml

20 ml

1 ∗ 1 = 2 ∗ 2 5.6 ∗ 10 =  ∗ 100  = .  /



Calculando la concentración de nutrientes para el medio de Pre-fermentación

Xo: 20 v/v So: 5.36g/L, µm = 0.37 h-1, Metabolismo aerobio: 0.5-0.6, trabajando con 0.6

Elemento Nutriente %celula %nutriente C_Limit C12H22O11 45 42.1 N (NH4)2SO4 9 10.6 P KH2PO4 2 29.8 K KH2PO4 0.5 37.5 S MgSO4.7H2O 0.25 12.99 Mg MgSO4.7H2O 0.4 9.74 Aminoácidos Extracto de -----Levaduras

Yx/s So(g/L) Sò(g/L) 0.56 3.2 3.2 1.17 1.5385 2.3077 14.9 0.1208 0.1812 75 0.024 0.036 51.96 0.0346 0.0519 24.35 0.0739 0.1108 ----1.8

Sacarosa C12H22O11, PM: 342 Sulfato de Magnesio Heptahidratado MgSO4.7H2O, PM: 246.3 Fosfato de Potasio KH2PO4, PM: 144 Sulfato de Amonio (NH4)2SO4, PM: 132 Yx/s = (Xf-Xo)/(So-Sf) DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE

So(gr) 0.32 0.23077 0.01812 0.0036 0.00519 0.01108 0.18

5

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS Ya que se empleara 3.2g/l de sustrato inicial de sacarosa, y teniendo en cuenta que es una fermentación aerobia se lograra producir 1.8 g/L de células lo cual nos daría una variación de biomasa igual a: Xf-Xo= 1.8 g/L Teniendo en cuenta siempre elegir entre 2 nutrientes iguales los valores más altos para sustrato inicial. Hallando el X f , sabiendo que ∆X=1.8 g/L: Se trabajara con un Xf aproximado de 1.8 g/L El tiempo que se estima para el CL es de 7 horas. 

Calculando la concentración de nutrientes para el medio de Fermentación CLA

Si se consideran las mismas características del medio de pre-fermentación para la etapa inicial del CLA, la cual consiste en 1 Litro de medio en Lote, se tendrá las siguientes características: luego se utilizara un litro más en el flujo para agregar al cultivo por lote alimentado así es que los gramos de medio a utilizar serán: Ya que al final del cultivo por lote alimentado se obtendrá una concentración de células de 3.64g/L, al inicio de la primera etapa en el cultivo por lote alimentado se agregaran las sales necesarias para que se pueda obtener 3.64g/l pero el sustrato limitante (fuente de carbono) se mantendrá para 1.8 g/L de célula, ya que al inicio de la segunda etapa se necesitará sales para obtener 3.64 g/L de célula. Por tanto en el cultivo por lote se agregara en exceso las sales y aminoácidos necesarios para obtener 3.64 g/L. Elemento Nutriente %celula %nutriente C_Limit C12H22O11 45 42.1 N (NH4)2SO4 9 10.6 P KH2PO4 2 29.8 K KH2PO4 0.5 37.5 S MgSO4.7H2O 0.25 12.99 Mg MgSO4.7H2O 0.4 9.74 Aminoácidos Extracto de -----Levaduras

Yx/s So(g/L) Sò(g/L) 0.56 3.2 3.2 1.17 3.11 4.67 14.9 0.24 0.37 75 0.05 0.07 51.96 0.07 0.11 24.35 0.15 0.22 ----1.8


So(gr) 0.32 0.467 0.037 0.007 0.011 0.022 0.18

6

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS -

Primera etapa del cultivo por lote alimentado:

Se tiene 1 litro de medio con una S 0 inicial de 1.8g/l de sacarosa. Entonces de los cálculos anteriores se obtiene una concentración inicial de: 1 ∗  1 = 2 ∗ 2 1.8 ∗ 100 = 2 ∗ 1000 ´0 = 0.18

 

         

Viendo que esta concentración es supuestamente la ideal tendremos una concentración menor a esta, sería mucho mejor extraer el inoculo en su fase exponencial pero ya que no se va a poder por lo motivos antes descritos, sacaremos el inóculo a una concentración de 0.9 gr/l, para un litro de Bach que contiene 15 gr/l de sustrato se obtendrá una diferencial de concentración de 8.4 gr/l de célula, entonces se espera de 3 – 4 horas para obtener un crecimiento exponencial y aquí daremos inicio al cultivo por lote alimentado .

-Segunda etapa de cultivo por lote alimentado: Para la alimentación del lote alimentado (S F), donde tendrá un X 0 de 1.8 g/L y se desea obtener un concentración de células final de 3.64 g/L, lo cual se determino mediante la siguiente ecuación:   =    

Donde  = 3ℎ y  = 1.5, porque es en la etapa de transición. Reemplazando los datos obtenemos:  1.5 = 1.8 ∗ 1 .∗  = . /

Después de la etapa de transición se asume que la concentración es constante (crecimiento limitado), entonces el X f =3.64g/L. Elemento C_Limit

Nutriente C12H22O11

%celula 45

%nutriente 42.1

Yx/s 0.56


Sf(g/L) 6.5

So(gr) 0.65

7


-

Calculamos el flujo para un tiempo de 6 horas y un incremento de volumen de 1L:  = /  = 1000 /360  = 2.8/

 = . /

-

Para graficar la curva del crecimiento se tomaran 6 puntos en un tiempo de 3.5 horas .Cada punto cada punto en un lapso de 35 minutos.

-

Hallando la concentración de sustrato limitante en la alimentación:

   =  ⁄  +   ⁄ +  

Donde:  = 0.37ℎ−,  = 1 ,  = 1.8/,  = 3ℎ ,  = 0.17/ℎ,  = 0, ⁄ = 0.56

Por lo tanto:  = . / DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTE

8

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS -

Hallando el sustrato final (S): =

 ⁄   ⁄ (   1) + (  ⁄ +   )

Reemplazando obtenemos:  = 0.0453/

RESUMIENDO: X=3.64g/L

F= 0.17L/h Condiciones finales

SF= 12.82g/L

S=0.0453g/L V=2L

V V0

X0=1.8g/L Condiciones iniciales

S0=0 V0=1L t=6 h

-

La velocidad de aireación (Q):

vvm=Q/volumen del liquido de fermentador vvm= 0.5 – 2 a nivel de laboratorio Volumen del liquido de fermentación = 2 litros

Q=1.5*2 =3litros /min


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS 2.2.

Preparación del Medio de cultivo

a) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN SOLIDO Adicionar los componentes previamente pesados según la Tabla 02 a una fiola de 50ml

Aforar con agua destilada

Llevar a calentar en agua hasta 2 minutos en ebullición

Partir de la aparición de la 1° burbuja en el agua.

mL de esta solución en 6 tubos con tapa

En caliente e inmediatamente taparlos

Colocar los tubos en un vaso de precipitado y Esterilizar hasta 121°C durante 15minutos

Ajustar las tapas de los tubos Luego de la olla a presión

Dejar los tubos a temperatura ambiente en posición inclinada para que se solidifique


Aflojar un poco las tapas de los tubos dentro de la olla a presión para facilitar el intercambio de gases.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS b) PREPARACÍON DEL MEDIO DE ACTIVACION

Pesar los componentes para el medio de activación de 25 mL según la TABLA N°02

Preparar por separado el Extracto de Levadura en un tubo de ensayo - enrazar hasta 5mL con agua destilada

Preparar las Sales en otro tubo de ensayo - enrazar hasta 8 mL con agua destilada

Preparar la Glucosa en un matraz de 125 mL - con 12 mL de agua destilada -

Esterilizar a 30°C durante 15 minutos

Proceder a enfriar y no mezclar los nutrientes hasta el dia de la activación

Tapar bien para proceder a la siembra del inoculo


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS c) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE PRE-FERMENTACIÓN

Pesar los componentes para el medio de Fermentación de 100 ml según la TABLA N° 02

Preparar por separado el Extracto de Levadura en un tubo de ensayo - enrazar hasta 10ml con agua

Preparar las Sales en otro tubo de ensayo enrazar hasta 10ml con agua destilada

Preparar la Sacarosa en un matraz de 100 ml - con 55 ml de agua destilada+10ml de tampón+15ml de inoculo

Agregar en el matraz de 100ml el preparado de extracto de le Levadura y Sacarosa


Proceder a enfriar y no mezclar los nutrientes hasta el dia de la ermentación

Tapar bien y esperar para proceder a la siembra del inoculo ara la ermentación


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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS d) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

Pesar los componentes para el medio de Fermentación de 2 litros según la TABLA N° 02

Preparar por separado el Extracto de Levadura en un tubo de ensayo - enrazar hasta 10ml con agua

Preparar las Sales en otro tubo de ensayo enrazar hasta 10ml con agua destilada

Preparar la Sacarosa en un matraz de 100 ml - con 55 ml de agua destilada+10ml de tampón+15ml de inoculo

Agregar en el matraz de 100ml el preparado de extracto de le Levadura y Sacarosa


Proceder a enfriar y no mezclar los nutrientes hasta el dia de la ermentación

Tapar bien y esperar para proceder a la siembra del inoculo ara la ermentación


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PROGRAMA DE MUESTREO

Vista de la hoja de muestreo

Cultivo por lote alimentado aireado Grupo:……………………………………………………………………………………..

Día de la experiencia:………………………………………… Microrganismo:…………………………………………… Fuente carbono………………………………….. pH:…………………………………………..T° C:…………………………………Nrpm :…………………….........

N°

Hora

Tiempo

Absorbancia Oxigeno disuelto %

Nombre del oxigeno


Observaciones

14


15

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

a) PARA EL MEDIO DE MANTENCIÓN Esterilizamos la zona de trabajo y los instrumentos, trabajando siempre junto al mechero.

Extraer la cepa de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126 con una asa de Siembra expandiendo bien sobre la superficie del agar

Siempre flameando, proceder a inocular en el medio de agar solido y dejar en la incubadora a 35°C

Luego de haberse infestado el medio de agar solido proceder a refrigerar para su posterior uso agregar 7 mL de esta solución en 6 tubos con tapa

b) PARA EL MEDIO DE ACTIVACIÓN Activar las células (Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126) de agar en incubadora a 35°C durante 2 horas

Inocular las Células Activas del medio de Mantencion, tomando una a 2 asadas de una de las cepas

Llevar al Shaker a 35°C y 200rpm durante horas


Observando la muestra para que se propague bien (2 a 5h) Tomar el tiempo a partir de la aparición de la 1° burbuja en el agua.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS c) PARA MEDIO DE PRE-FERMENTACIÓN

Activar las células (Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126) de agar en incubadora a 35°C durante 2 horas

Inocular las Células Activas del caldo de activación y sembrar en el medio de fermentación

Llevar al Shaker a 35°C durante 10 horas

d) PARA MEDIO DE PRE-FERMENTACIÓN

Una ves terminado el tiempo de pre-fermentación, se procede a agitar bien

Luego se procede a inocular en el medio de fermentación

Observar el comportamiento las 3 primeras horas del CLA, luego de este tiempo se procede a alimentar el lote


16


METODOS ANALITICOS

2.5.1. Determinación de Azucares Reductores DNS La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

REACTIVOS

CONCENTRACIÓN

PARA 100 mL

10 g/l

1g

200 mL/l

20 mL

300 g/l

30 g

ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) NaOH 2N Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

Cálculo de la cantidad de NaOH Concentrado a utilizar: Datos: V= 20 mL= 0.020 lt, N = 2 N, PM (NaOH) = 40 =

   ×

Entonces:    =  ×  ×     = 0.02 × 40 × 2    = . 

Cantidad de NaOH Concentrado que se necesita para preparar 20ml de NaOH a 2N


17


Determinación de Azucares reductores:

Rotular tubos de ensayo con tapa según el número de muestras Evaluadas durante la Cinética de Crecimiento más un tubo para el BLANCO

Luego añadir a cada tubo 1 mL de la muestra y al tubo para el Blanco añadir 1 mL de agua destilada

Agregar 1 mL del reactivo de DNS a cada tubo

Colocar todos los tubos en agua hirviendo durante 5 minutos

Enfriar en agua helada y luego adicionar 10ml de agua destilada a cada tubo

AGITAR todas las muestras y colocarlas en una rejilla.

Leer la ABSORBANCIA a 540 nm en el ESPECTROFOTOMETRO


18


19

2.5.2. Determinación de la concentración celular por D.O.

Preparar 8 tubos de ensayo sin tapa y gruesos

Adicionar caldo de células + agua destilada especificado en la Tabla 03

Tener como base 5 ml de dilución (caldo de células +

Leer la Absorbancia en el Espectrofotómetro, anotar las lecturas

Llevar a la Centrifuga a 1200 rpm por 20 minutos

Sacar el tubo y realizar un primer lavado con agua destilada y botar el sobrenadante

reviamente esados .

Luego volvemos a colocar el mismo tubo con 5mL de agua destilada a la

centri u a durante 20 min.

Realizar un segundo lavado, volver a centrifugar y botar el sobrenadante

Luego del segundo lavado, echar agua destilada a las células, llevar el tuvo al a itador de tubos echar las células a los ca achitos

Cuando ya tenemos todos los capachitos listos con las células, los

colocamos en la estufa a 80 °C por 24 horas

Cuando ya han secado, los pesamos y obtenemos el peso seco de las células por diferencia de peso. Anotamos en la Tabla 03


a ua destilada

Realizar los siguientes pasos para los 8 tubos


III. MATERIALES , INSTRUMENTOS Y REACTIVOS Material Biológico: 

Cepa de Saccharomyces Cerevisiae ATCC 4126.

Medio de Cultivo: 

Agar



Peptona






Agua destilada.



Xilosa

Reactivos: 

K 2HPO4



DNS (ACIDO



DINITROSALICILICO)

NH4Cl



MgSO4.7H2O



KCl


20


Instrumentos: 

Balanza analítica:



El espectrofotómetro



La autoclave



La centrifuga



El shaker



La incubadora



Horno de esterilización (la estufa)



Agitador



Asa bacteriológica.



Mechero bunsen.



Tubos de ensayo con tapa para medio de cultivo.



matraz 125 ml , 250 ml y 1 litro



Papel para hacer los capachos de muestra.



Espátula.



Micro pipeta.



Matraz de 200ml.



Picetas.



Pipetas de 1 ml y 10ml



Gradillas



Papel aluminio ,algodón y gasa (para los tapones de los matraces)



Alcohol



Fosforo


21

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA LABORATORIO DE BIOPROCESOS IV.

CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES Y TAREAS

ACTIVIDADES 

 

      

FECHA

Recolección de información.

12/11/12 28/11/12

Resembrado Celular Obtención de la Curva de Calibrado para Azucares Reductores: MÉTODO DEL DNS  Hidrólisis Acida de la Sacarosa.  Preparar una Solución de NaOH 2 N.  Obtención de Azucares Reductores: Método del DNS para la Sacarosa Hidrolizada.

07/11/12

Obtención de la Curva de Calibrado para Biomasa Activación celular. Esterilizar pipetas por 2 horas a 140°C. Acopio y Codificación de Viales para recibir muestras. Acondicionar canastillas en el SHAKER. Pesar capachos para curva de biomasa rápida. Inicio de la cinética de medio de activación

14/11/12



 

   

Inicio de la cinética de medio de activación Preparación y Esterilización del Medio de Activación para el inóculo. Preparación y Esterilización del Medio de Pre- Fermentación Resembrado en el medio de Pre -ermentación INICIO DE CINETICA LOTE ALIMENTADO TOMA DE MUESTRAS

20/11/12

21/11/12

Discusión y conclusión de la experiencia:  Determinación de Azúcares Reductores.  Determinación de Alcoholes.

28 /11/12



Presentación del informe final.

29/11/12



Sustentación del informe.

29/11/12




22


V.



REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProca riontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9cnica%20as%C3%A9ptica.pdf



http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf .



http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml



QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica.



http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-deCultivo

VI.

ANEXOS

Para diseñar un medio de cultivo es necesario conocer la composición elemental del M.O

Elemento Carbono Nitrógeno Magnesio Azufre Potasio Fosforo

% De composición elemental 45 9 0.4 0.25 0.5 2

Tabla 01: Lane, M. y Morrisey, J. 2010


23


Tabla 02: Requerimiento de nutrientes para la preparación del Medio de Mantención Activación, Pre-Fermentación y Fermentación

MEDIO

NUTRIENTE Extracto de levadura Peptona

SÓLIDO DE MANTENCIÓN

Extracto de Malta

3

Glucosa

10

ACTIVACIÓN Extracto de Malta

35°C y 150 rpm

5

20

Extracto de levadura

PRE-FERMENTACIÓN

3

Agar

Sacarosa

T° 35°C, 200 rpm

CONCENTRACIÓN (G/L)

Solucion de Sales

15 3 5 5ml/L

Sacarosa

15


1.8


0.23077


0.0036


0.5173

Solución de Sales

10ml/L

Tampón Citrato pH 4.2

100ml/L


24


FERMENTACIÓN en CLA Para 2 litros

Sacarosa

0.32


1.8


0.467


0.037


0.022

Solución de Sales

10ml/L pH 4.2

TABLA 03:

Nº Capacho

Caldo m.o (ml)

Agua (ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 REFEREN CIAL

5,0 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,0 0,5 0,0

0,0 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 4,0 4,5 5,0

ABS (640nm)

Peso (gr)

Peso (gr)

Capacho

Capacho + células


Peso seco células (gr)

X (gr/l)

25

Preinforme de Bioprocesos 2da Unidad B2

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