UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
ESCUELA DE POST GRADO GRADO ESPECIALIDA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS : OBTENCIÓN DE AISLADO PROTEICO DE SOYA SOYA
TEMA CURSO
:
:
PROFESOR ALUMNOS
TECNOLOGÍA AVANZADA DE ALIMENTOS.
:
msc Ing. Edu!d" m"!#$s s"!%n".
n &.' Esc#n($ &!"n. )ARINA M.' AGUADO *umn%. C+SAR' *UAMANÍ SALAZAR.
NOVIEMBRE del 2010
I.- INTRODUCC I NTRODUCCION ION
Desde el punto de vista biológico, las proteínas animales son las mejores, pero son escasas y de costo elevado. Por eso muchas investigaciones tratan de aprovechar al
máximo las proteínas vegetales. Las proteínas vegetales, generalmente son deficientes en uno o varios aminoácidos esenciales, pero esta deficiencia puede ser evitada con el mejoramiento gentico de las plantas, la posibilidad de combinar diferentes proteínas vegetales o su enri!uecimiento mediante agregados de productos proteicos poco explotados hasta la fecha, o bien, incorporando aminoácidos sintticos como la lisina y metionina "#errer et al., $%&&' citado por (uerrero $%)%*. +stas proteínas vegetales se pueden obtener en la forma de concentrados proteicos o aislados, los cuales pueden estar dirigidos ya sea a aumentar el nivel de proteínas en productos alimenticios básicos o como reemplao total o parcial de las proteínas animales como ingredientes en alimentos " -odrígue, $%)$' citado por (uerrero $%)%*. Las proteínas vegetales tienen muchas características físicas deseables, tales como capacidad de retención de agua, de grasa, emulsificante, espesante y propiedades de formación de espuma, de película y de masa. /demás estos aislados y concentrados proteicos contienen solamente pe!ue0as cantidades de carbohidratos, grasas y cenias "1ressani, $%2)' citado por (uerrero $%)%*. Las fuentes usuales de aislado proteico de origen vegetal son las oleaginosas, las cuales tienen un alto contenido proteico "/nson, $%23' citado por (uerrero $%)%*. 4in embargo en trminos de economía, sostenibilidad y nutrición' la soya es la fuente más efica, !ue combina un excelente valor nutritivo con una amplia gama de propiedades funcionales. La proteína de soya posee una elevada biodisponibilidad y suministra un rango amplio y completo de aminoácidos esenciales, incluyendo la lisina !ue con mucha frecuencia es el aminoácido limitante "5oogen6amp, 3778*. La semilla o grano comprende tres partes principales, la envoltura, los cotiledones y el hipocotilo, cuyas proporciones respectivas y composiciones medias, se indican en el cuadro$. La composición de los granos de soya, por selección gentica se logró obtener variedades más o menos ricas en proteínas "97 : 98;* y lipidos"$)<37;*. "=heftel et al.$%)%*. Cuadro 1. Composición físico química del grano de Soa.
;
=omposición "; P>P seco*
ponderal en Proteínas la semilla "? x 2,38* (rano entero =otiledones
$77 %7
97 9A
Lípidos
(l@cidos
=enias
"incluye 37 3A
fibras* A8 3%
9,% 8,7
+nvoltura ) 5ipocotilo 3 #uente =heftel et al. "$%)%*.
),) 9$
$ $$
)2 9A
9,A 9,9
Cuadro !. /minoácidos en proteínas comerciales de soya"gramos de aminoácidos por
$77 g de proteína* 4oja /minoácidos
5arina desgrasada 9.2A &.& 2.3 $.A $.3 8.A 9.3 $.9 9.%
Bsoleucina Leucina Lisina Cetionina =isitina #enilalanina reonina riptófano Ealina #uente Adaptado de Badui (2006)
/islados 9.) &.) 2.7 $.7 $.7 8.8 A.& $.A 9.)
4on tres los tipos de productos, seg@n su contenido proteico, !ue se pueden obtener a partir de la soya. +stos son harina o grits de soya, concentrado proteico de soya y aislado proteico de soya "=anales, $%)3*. =uando las escamas, hojuelas o láminas de soya son molidas para reducir su tama0o, el producto resultante se denomina harina de soya, siendo sus partículas lo suficientemente finas como para pasar por un tami malla $77 "u.s.*' o bien son grits, cuando el grosor de las partículas es mayor. La harina de soya tiene un contenido proteico mínimo de 87; de proteína en b.s. "=anales, $%)3*. Los concentrados de proteína de soya son proteínas derivadas de las láminas desgrasadas de soya, obtenidas por extracción con ácido diluido "p5 9.8* se eliminan los a@cares solubles, nitrógeno proteico y otros componentes de bajo peso molecular y una pe!ue0a cantidad de proteína. Los concentrados proteicos de soya deben contener mínimo &7; de proteína en b.s. "Folf, $%2$' citado por =anales, $%)3*. +s aislado proteico de soya es definido como la mejor fracción proteica obtenida del frijol de soya de alta calidad. La materia usada para la producción de aislado proteico de soya son las hojuelas de soya desgrasada o harina, la cual tiene una proteína de alta dispersibilidad. +n el proceso de extracción se humedecen las hojuelas de soya con una
cantidad apropiada de agua, controlando la temperatura, p5, tiempo y además la relación sólido lí!uido para obtener resultados máximos "Ceyer, $%2&' citado por =anales, $%)3*. Los aislados proteicos de soya deben contener
mínimo %7; de proteína en b.s.
"=anales, $%)3*. Cuadro "# Composición típica de un Aislado de proteína de soya. Harina COMPONENTE
Sin desgrasar
Desgrasada
Aislado
roteinas &rasas Humedad ira cruda
!".# 2".0 #.0 2."
#$.0 ".0 #.0 2.%
%0 0.0 !.' 0.2
Ceni*a
#.2
6.0
$.+
,S-
+#.0
,S-/ ,ndice de soluilidad del nitrógeno uente/ Adaptado de Badui (2006)
$ro%eina
Las proteinas de la soya son una mecla heterognea de globulinas "27 a &8;* del total y de albuminas, con pesos moleculares muy variados, solubles en disoluciones salinas y en agua, y precipitan en su punto isolelctrico, en el intervalo de 9.3 a 9.) "1adui ,3772*. La solubilidad de las proteínas de la soya en agua es fuertemente afectada por el p5, como se muestra en la #igura $. =asi el )8; del nitrógeno es soluble a p5 3 ó & " y a p5 $$ puede solubiliarse hasta un %8;*. Gn perfil de solubilidad parecido se observasi se utilia una torta desengrasada de soya. Las globulinas, principales constituyentes proteicos, son insolubles en una ona de p5 "A.& : 8.3* situada en torno de su punto isoelctrico "p5 9.3 : 9.2*, pero pueden solubiliarse progresivamente a esos mismos p5 por aumento de la fuera iónica "con ?a=l, por ejemplo* "=heftel et al. $%)%*.
&igura 1. +xtracción de la proteína a diferente svalores de p5.
#uente 1adui "$%%7* La baja solubilidad a p5 9.3 : 9.2 se utilia para preparar los aislados proteicos de soya por Hprecipitación isoelctricaI "=heftel et, al. $%)%*. Despues de la disolución en agua o a un p5 ligeramente alcalino, las proteínas de soya pueden separarse en varias fracciones por cromatrografía permeable de gel, electroforesis, ultracentrífuga, etc. =uando se utilian esta ultima tecnica se separarn cuatro fracciones cuyos coeficentes de sedimentación 4 37, J "unidades 4vedberg, a 37K=, en el agua son respectivamentes iguales a 34, &4, $$4 y $84. Las globulinas $$4 y &4 representan por si solas más del &7; del las proteinas del grano de soya. La relación globulina $$4>globulina &4 esta comprendida entre 7.8 a A, seg@n la variedad de soya. "=heftel et, al. $%)%*. /sí la globulina $$4 o glicinina de alto peso molecular y !ue de amnera indicidual es el polipptido más abundanteen la soiya,puesto !ue representa el A$; del total
esta
constituida de $3 subunidades, 2 de carácter acido y 2 de carácter alcalino. Los pesos moleculares de las subunidades son de A&377 y 33A77 para las ácidas y las básicas "=heftel et, al. $%)%* " 1adui 3772*.
La fracción 34 esta compuesta por polímeros de peso molecular bajo ")777<3$877*, solubles en su punto isoelctrico y contiene los inhibidores de tripsina de 1oJman<1ir6 y de unit " 1adui 3772*. La fracción &4 esta basicamente integrada por cuatro proteínas , dos de las cuales son enimas "M
Cuchos de los usos de los productos de la soya están basados en las propiedades funcionales de las proteínas de la soya. +stas características incluyen la propiedad de estas proteínas para espesar "viscosidad*, emulsificar, formar geles, espumas, absorber agua y>o grasa y crear estructuras texturiadas parecidas a la carne "=anales, $%)3*.
Gno de los mtodos para determinar proteínas es el Ctodo de 1iuret, !ue se basa en la formación de un complejo coloreado entre el =u 3N y los grupos ?5 de los enlaces peptídicos en medio básico. $=u 3N se acompleja con 9 ?5. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas "enlaces peptídicos* y la reacción es bastante específica, de manera !ue pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados "por ejemplo en suero* "#ernánde' 377)*. +n el presente trabajo se realio lo obtención del aislado proteico a partir de una fuente vegetal, se determinó la capacidad de retención de agua de un aislado proteico de soya y la cuantificación de proteínas por el mtodo de 1iuret' con la finalidad de evaluar sus
propiedades funcionales importante para la aplicación tecnológica en la industria alimentaria.
II. O'()TI*OS
Obtener aislado proteico a partir de una fuente vegetal.
=uantificación de proteínas por el mtodo de 1iuret.
III.- +,T)RI,)S +)TODOS
".1. +a%eriales/ equipos e ins%rumen%os
".1.1. +a%eriales
/gua destilada
5arina de soya
".1.!. Reac%i0os
4olución de hidróxido de sodio $ ?
4olución de ácido clorhídrico $ ?
-eactivo de 1iuret
-eactivo blanco de 1iuret
".1.". +a%eriales equipos
1ea6er de $ litro
ubos de centrifuga
Placas petri
+mbudo de vidrio
Papel filtro
Catra 877ml
=entrífuga
+stufa
Potenciómetro
/gitador magntico
ubos
ubos de centrifuga
Cicropipeta
Pipeta de 8 ml
1aguetas
=entrifuga
Potenciómetro
Easos de precipitado
".!. +e%odología eperimen%al
,. )%racción de $ro%eínas
4e mecló 87 g de harina de soya con &87ml de agua "$$8* y homogeniar.
4e ajustó lentamente el p5 hasta % con hidróxido de sodio $?, con agitación continua durante 97 minutos.
4e centrifugó a A777 rpm durante $8 minutos. 4eparar +l sobrenadante del residuo por filtración "si fuera necesario*.
4e ajustó el p5 del sobrenadante a 9,8 con ácido clorhídrico $ ?, con agitación continua por $8 minutos.
4e centrifugó a A777rpm durante $8 min. Luego se separó el sobrenadante y el precipitado. 4e transfirió el precipitado a una placa petri previamente pesada. 4e colocó la placa en una estufa "emperatura 87 Q= tiempo 39hr.' hasta peso constante*.
#inalmente, se guardó el aislado proteico para los análisis de proteína correspondientes.
+n la #igura 3 se aprecia el flujo de operaciones !ue se siguió en laboratorio para realiar la extracción del aislado proteico de soya. &igura !. #lujo de Operaciones para la obtención del /islado Proteico
de 4oya
5arina de soya
5idratación
/gitación " p5 %*
=entrifu ar
#iltrar
/gitación " p5 9.8*
=entrifu ar 4ecado
87g.harina de soya N &87ml /gua destilada "$$8* 5omogeniar.
/justar con ?aO5<$? P5 % /gitación x 97 min.
A777rpm x $8 min.
Precipitado
/justar con 5=l<$? P5 9.8 /gitación x $8 min.
A777rpm x $8 min.
87Q= iempo 39 hors.
/islado
'. De%erminación de pro%eína por el m2%odo de 'IUR)T
$ROC)DI+I)NTO
$. 4e pipeteó 8 ml del reactivo de 1iuret en una serie HpruebaI de tubos de ensayo y 8 ml del blanco de 1iuret en una serie H1lancoI. 3. 4e pipeteó $77ul de espcimen "proteína extraída o proteína estándar* en cada tubo de la serie. 4e mecló bien con vortex o por inversión repetida despus de cubrir los tubos con parafilm. 4e preparó un blanco de muestra, mediante la adición de $77ul de agua a 8ml del reactivo de 1iuret.
A. 4e incubó los tubos a temperatura ambiente por A7 minutos o a A&Q= por $7 minutos. 9. 4e fijó la absorbancia en cero a 897nm con el blanco del reactivo de 1iuret. 4e leyeron las absorbancias de la serie HblancoI, luego se leyeron las absorbancias del blanco de muestra y la serie HpruebaI. 8. =alcular de la siguiente manera a. 4ustraer tanto los blancos de reactivo y el blanco de muestra de las absorvancias "/* obtenidas para la serie HpruebaI. Aneta
A prueba
Ablancoreactivo
Ablancomuestra
+l blanco de muestra con el reactivo de 1iuret deberá leer 7.7%8 : 7.$78 para un tubo de $ cm paso de lu para el reactivo descrito. 2. 4e reemplaó la absorvancia neta en la ecuación obtenida de la curva estándar de alb@mina.
I*.- R)SUT,DOS DISCUSION)S
+l mtodo de extracción realiado en el laboratorio, corresponde a una extracción negativa' ya !ue se eliminó todo lo !ue no se necesitaba y al final fue !uedando sólo la proteína. +n la etapa de hidratación y agitación, se realió la extracción de la proteína utiliando un p5 extremo de %' ya !ue a este p5 se solubilia la proteína. 4eg@n /nson "$%23*, citado por (uerrero "$%)%*' uno de los mtodos más utiliados consiste en aislar la proteína por tratamiento de la materia a p5 alcalino, seguido por una precipitación en su punto isoelctrico. /simismo, 1orgeois y Le -oux "$%)2*, mencionan !ue la solubilidad de la
proteína varía con el p5, temperatura, fuera iónica y la constante dielctrica del solvente' incrementándose sta al aumentar la fuera iónica, hasta llegar a un valor óptimo. Luego de la solubiliación de la proteína, existió una etapa de centrifugación' ya !ue seg@n Filc6e "$%&%*, citado por (uerrero "$%)%*' la centrifugación ayuda a separar a la proteína de la fracción insoluble compuesta por polisacáridos y fibra cruda. +n la segunda etapa de agitación, donde se ajustó el p5 a 9.8, se hio precipitar a la proteína !ue se encontraba soluble en el primer sobrenadante' con el fin de obtener a la proteína pura y eliminar otras sustancias indeseables. 4eg@n Food
et al.
"$%&9*, citado
por (uerrero "$%)%*' menciona !ue las proteínas pueden ser precipitadas selectivamente manipulando el p5, la fuera iónica y la constante dielctrica del solvente. Los mtodos preferidos son la precipitación en el p5 isoelctrico, puesto !ue implican menor riesgo de desnaturaliación proteica. 4mith y =ircle "$%&)*, citados por -odrígue "$%)$*' a su ve citado por (uerrero "$%)%*' encontraron una solubilidad mínima de la proteína de soya a p5 9.3, correspondiendo al punto isoelctrico de la mayoría de proteínas. La precipitación isoelctrica es por lo tanto @til para concentrar globulinas y para separarlas de los constituyentes menores como a@cares y sales, !ue son extraídas de la harina junto con las proteínas.
&igura "# +tapas de extracción de aislado proteico de soya.
"a*
"b*
"c*
"a* +xtracción de proteina de soya a p5 alcalino, "b* Proteina de soya centrifugada, luego de precipitación en el punto isoelctrico, "c* /islado proteico de soya, antes del secado.
/ continuación, en el =uadro 9, se observa el rendimiento en peso del aislado proteico de soya, respecto a la materia prima inicial.
Cuadro 3# -endimiento en peso del aislado proteico de soya.
$eso Inicia4gr5
$eso final4gr5
soya repet 1
50
18.86
soya repet 2
50
16.9404
A&.&3 AA.))
Promedio
35.80
Rendimien%o
Rd%o. 465
=omo se observa en el =uadro 9, el rendimiento en peso, respecto a la cantidad inicial de harina' fue de A8.)7;. +ste resultado es un poco bajo comparado con el hallado por -obles y Cora "s.a.*, !uienes obtuvieron rendimientos de 8).A3; "para la harina desgrasada con hexano* y &7.)A; "para la harina desgrasada con etanol*' utiliando el mismo mtodo de extracción !ue el realiado en práctica. +ntonces, se puede suponer !ue un desgrasado previo de la muestra mejora el rendimiento de extracción, raón por la cual nosotros obtuvimos un rendimiento menor' ya !ue no desgrasamos la harina de soya. / continuación se presenta la curva estándar preparada con concentraciones conocidas de alb@mina los cuales fueron comparados con la muestra inicial para determinar en ella la concentración de proteína total. 4e utilió alb@mina por!ue es la !ue más se asemeja a la globulina , !ue es la proteina encontrada en el aislado proteico de soya " Ceyer, $%22' citado por =anales, $%)3*.
&igura !# =urva +stándar de /lb@mina.
Para determinar el contenido de proteina de la harina de soya, se extrajo una muestra de la proteina !ue se solubilió a p5 % y sta se sometió a la prueba de 1iuret. +ste mtodo utilia el reactivo de 1iuret, el cual detecta la presencia de proteínas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida "Fi6ipedia, 37$7*. /l realiar el análisis por el mtodo de 1iuret, se apreció un cambio de color de aul a un color violeta
La sensibilidad del mtodo de 1iuret es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados "#ernánde y (alván, 377)*, es por ello !ue este mtodo es muy @til para determinar proteina en aislados proteicos. De la prueba de 1iuret se obtuvo el siguiente cuadro, con los resultados de la absorbancia neta
Cuadro "# /bsorbancia neta de la muestra por el mtodo de 1iuret. Muestra
Blanco reacvo
Pruea
Blanco muestra
asorancia neta
soya Repeto 1
0.163
0.964
0.65
0.151
soya Repeto 2
0.151
0.895
0.643
0.101
!s. Promedio
0.126
La absorbancia promedio obtenida para la muestra de soya fue de 7.$32. +sta absorvancia se reemplaó en la ecuación correspondiente de la curva estándar de la alb@mina, obteniendose un resultado de !7.8"" g de al9:mina; li%ro de solución. Luego, como no se sabe la concentración de proteína de la harina de soya utiliada' se asumió !ue sta tenía una concentración de 87; de proteina, es decir 38g de proteina. +ntonces se realió los siguientes cálculos < 4e multiplicó el resultado obtenido en 1iuret con la cantidad de agua !ue se utilió para hidratar los 87 g de harina de soya.
2#.+$$
g 1
0.'# 1
"%.$'# g de proteina
< Luego el resultado anterior se expresó como rendimiento en peso de proteina extraido, respecto a la cantidad de proteina en la materia prima. 4endimiento de roteina e3traida ()
"%.$'# 2#
"00
''.#
+ntonces se obtuvo !ue de un total de 38 g de proteina !ue contenia la harina de soya inicial, se logró aislar $%.A&8 g de proteina, o en otras palabras el rendimiento proteico de la extracción fue de &&.8 ;. .
CONCUSION)S R)CO+)ND,CION)S
< +l rendimiento en peso de la proteina extraida, respecto a la cantidad de materia prima inicial, fue de A8.)A; .
< Gsando el mtodo de 1iuret, el rendimiento en peso de la proteina, respecto a la cantidad de proteina contenida en la harina de soya "considerando !ue sta tenía 87; de proteina*, fue de &&.8;. < 4e recomienda realiar un desgrasado previo de la materia prima, para obtener mejores rendimientos. < 4e recomienda realiar el análisis del contenido proteico del aislado obtenido, para poder conocer el porcentaje de proteina !ue ste posee y el cual debería ser de un mínimo de %7;.
,.
'I'IO
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#uente (enta y /lvare "3772*.
