UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INFORME # TÍTULO:
INTEGRANTES: 20131213
Ferrer Chávez, Ana
20121256
Jara Blas, Lucero Pastrana Casas, Daniel
20131240
Rojas Guerra, Gonzalo
20140328
Velásquez Quispe, Laura
MESA: NÚMERO 4
2016
1. INTRODUCCIÓN
.
2. MARCO TEORICO Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, éste debe reunir una serie de condiciones tales como: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Clasificación de medios de cultivo: Según su estado físico: o Líquidos Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. Sólidos Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo. 100 °C, lo que permite su uso para la inmensa mayor ía de los microorganismos, que son mesófilos.
Según la naturaleza de sus constituyentes: Medios naturales, complejos o indefinidos Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes d el medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Este tipo de medio es el ideal para cuando simplemente se pretende obtener un buen crecimiento microbiológico, ya que su confección es fácil y rápida (Basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave). Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras. Medios sintéticos Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales. Medios “mezcla” de los anteriores
Denominado medio semisintético, llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad se conoce, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinida.
Según sus propósitos de uso: Medios de enriquecimiento Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de microorganismo en relación con el número de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inóculo. Un medio de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química del medio usado, sino que en un medio dado puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación, etc. Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos. Medios selectivos Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el aislamiento de patógenos entéricos. Medios diferenciales No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero sí contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.
Medios selectivos diferenciales A veces se combinan en un mismo medio las características de ser selectivo y diferencial. Por ejemplo, el agar Mac Conkey, este medio contiene sales biliares y cristal violeta, que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas. Pero como también contiene lactosa y un indicador de pH permite distinguir entre las bacterias fermentadoras de lactosa y las que no lo son. CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza.
EXTRACTOS . Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de malta.
PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales.
FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia es necesario añadir a los medios de cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por tanto debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano, y adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que también aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Un ejemplo podría ser la catalasa presente en las células sanguíneas destruye el peróxido de hidrógeno que algunas bacterias que no poseen este enzima acumulan como producto del metabolismo del oxígeno.
SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener el pH dentro del rango optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al medio de cultivo. Debido a que la mayoría de as bacterias son neutrófilas, se suelen emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò bipotásicos u otras sustancias como las peptonas para prevenir la desviación del pH.
INDICADORES DE PH. Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores acido-base que nos lo indiquen.
AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo de crear en los medios de cultivo condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos ò anaerobios se añaden estos agentes reductores siendo, los mas empleados la cisteina y el tioglicolato entre otros.
AGENTES SELECTIVOS. La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, azida sodica, telurito potasico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados microorganismos. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados; normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso rehidratar. En estos casos la preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en el autoclave y enfriados a temperatura ambiente ó a 40-50ºC si se trata de medios con agar. Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes adecuados (tubos, matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de distribuir en tubos ó en matraces será necesario fundir el agar en baño Maria u horno microondas, una vez fundido y homogenizado,
se distribuye en caliente a los tubos ó matraces (no en placas Petri) se tapa y se esteriliza en el autoclave.
3.
PROCEDIMIENTO 3.1. Materiales:
Agua destilada
Algodón, gaza
Erlenmeyers
Espátulas
Balanza
Marcador de vidrio
3.2. MÉTODOS A) CALDO NUTRITIVO (extracto de carne, 0.3% y peptona, 0.5%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado suficiente para preparar 100ml de caldo nutritivo. Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250ml limpio y seco, agregue cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta. Mezcle la preparacion con movimientos giratorios hasta la completa disolucion. Elabore tampones de algodón para 15 tubos. Distribuya el medio liquido con una pipeta graduada a razon de 5ml en cada tubo. Coloque en los tubos los tapones de algodón evitando que queden flojos o muy compactos. Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel, identifiquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de la persona responsable de la elaboración. Esterilice los tubos con medio en autoclave a 121ºC (15lb de presión) durante 15 minutos.
B) AGAR NUTRITIVO (extracto de carne, 0.3%; peptona, 0.5%; agar, 1.5%)
1.
2. 3. 4. 5. 6.
Prepare 200ml de caldo nutritivo. (Repita los pasos 1, 2 y 3 del rocedimiento anterior con la correcion en el peso para la nueva cantidad solicitada y en el erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendrá el medio). Agregue 3g de agar y lleve a licuar en baño de agua en ebullicion hasta que el medio luzca transparente a la luz. Elabore tapones de algodón para 16 tubos. Una vez licuado en el medio, dejalo enfriar ligeramente y distribuyalo en los tubos con una pipeta graduada. Prepare 6 tubos con 12ml y 10 tubos con 7ml. Repita los pasos 6, 7 y 8 de proceso anterior. El medio restante debe ser acondicionado para su esterilizacion junto a lo anterior.
C) AGAR MAC CONKEY (peptona, 1.7%; proteosa-pentona, 0.3%; lactosa, 1%; sales biliares, 0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%; rojo neutro, 0.003%; cristal violeta, 0.0001%) D) AGAR MANITOL SALADO (extracto de carme, 0.1%; proteosa-peptona, 1.0%; NaCl, 7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%; rojo fenol, 0.0025%) 1.
2. 3.
4.
Pese cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100ml de cada uno. Observando la formulacion de cada medio comprobara que los pesos a realizar son distintos. Coloque el polvo de cada medio en erlenmeyers de 250ml y llevelos a licuar en baños de agua caliente hasta la completa disolucion del agar. Elabore tampones de algodón para cada erlenmeyer. Luego de colocarlos cubra los recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio, fecha de elaboracion y el nombre de la persona responsable de su preparacion. Esterilice en autoclave.
E) AGAR ALMIDON (peptona, 1%; K2HPO4, 0.5%; almidon, 0.3%; agar, 1.5%) 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Pese cuidadosamente el almidon necesaria para preparar 100ml de medio. Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250ml con un volumen pequeño del agua destilada que ha metido en la probeta. Caliente el recipiente con el almidon agitando constanteente hasta su disolución. Pese el resto de los ingredientes y agreguelos con la cantidad de agua destilada restante. Licue el medio al baño de agua caliente hasta la completa disolucion del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH. Coloque en el erlenmeyer un tapon de algodón a la medida, cubra con papel, identifique el material y esterilice en autoclave.
F) AGAR GELATINA ( peptona, 0.1%; extracto de levadura, 0.3%; gelatina, 0.4%; agar, 1.5%) 1. 2. 3. 4.
Pese cuidadosamente el almidon necesaria para preparar 100ml de medio. Coloque los ingredientes en un erlenmeyer de 250ml y agregue agua destilada medida en probeta. Lleve el recipiente a licuar en baño de agua en ebullicion hasta la completa disolucion del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0. Acondicione su medio para esterilizacion como en los procedimientos anteriores.
4. DISCUCIONES En la práctica se prepararon diversos medios de cultivo, como el Caldo Nutritivo, Agar nutritivo, Agar Mac Conkey, Agar Manitol Salado, Agar Almidón y Agar Gelatina. Se preparó toda esta diversidad de medios de cultivo pues cada uno al diferir en sus componentes también se diferenciaba en aplicación. Cada medio de cultivo presentaba ingredientes requeridos por un microorganismo para que produzcan más como él. Según Sagardoy & Tandolesi (2004), el Agar Nutritivo y el Caldo Nutritivo son usados para multiplicar gérmenes poco exigentes, especialmente en la investigación bacteriológica de aguas potables, aguas de uso industrial, aguas residuales, alimentos y productos estimulantes entre otros. Estos dos m edios de cultivo tienen otras aplicaciones, tales com o: uso en cultivo y conservación de cepas, determ inación de sensibilidad y resistencia a antibióticos, comprobación de la esterilidad entre otros. Así mismo, Negroni (2009) afirma que casi todas las bacterias heterótrofas crecen mejor en medios de cultivo complejos en los que es difícil conocer la cantidad exacta de cada compuesto químico. De esta manera, estos medios de cultivos particulares responden a necesidades nutricionales particulares. Nuestro grupo fue en encargado de preparar el Agar Manitol Salado el cual presento coloración roja en el medio de cultivo preparado. En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o purpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.
CONCLUSIONES:
5. CUESTIONARIOS 5.1. ¿Cuáles son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?
Los medios complejos fueron los primeros utilizados, y los más empleados. Se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no está exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados por ser de menor costo que los medios definidos.
5.2. ¿Por qué no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo y sí lo es en el agar de almidón? Esto se debe a que el caldo nutritivo es un medio común que permite el crecimiento indiscriminado de todo tipo de microorganismos. Por otro lado, el agar almidón es un medio especial; éste medio se utiliza para identificar los organismos que degradan el almidón. El almidón solo puede ser utilizado por los microorganismos que secreten las enzimas extracelulares necesarias, como la amilasa, para hidrolizarlos y dichas enzimas trabajan a un pH óptimo alrededor de 7- 7.2, siendo necesario así ajustar el pH del medio para que puedan actuar.
5.3. Determine la naturaleza química y la función nutritiva de cada uno de los ingredientes que contienen los medios que ha utilizado -Extracto de carne: Constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales inorgánicas y otros nutrientes muy variados. -Peptonas: Son proteínas degradadas, ricas en nitrógeno y carbono, de fácil disposición. -Cloruro sódico: Proporciona equilibrio osmótico. -Tampones estabilizantes de pH: Contrarrestan las variaciones de pH por la acumulación de los productos resultantes del metabolismo bacteriano. -Agentes solidificantes: Los contienen los medios sólidos y semisólidos. El agar es el más común, la gelatina y la albúmina se usan escasamente. -Agentes reductores: Promueven la anaerobiosis. Entre los más empleados están: tioglicolato sódico, cisteína, ácido ascórbico. -Azúcares: Se adicionan con fines de nutritivos o para investigar la actividad metabólica. -Extracto de levadura: Es la parte soluble en agua de la autolisis de levadura, que es cuidadosamente controlada para preservar la forma natural del complejo B.
Estimulador del crecimiento de bacterias, es utilizado en la preparación de medios de cultivo microbiológicos.
Describa el autoclave y su forma de uso El aparato de laboratorio diseñado para utilizar el vapor de agua saturado bajo presión regulada, se llama autoclave, Es esencialmente, una cámara equipada con dispositivos que permiten que ésta se llene de vapor y a su vez mantienen la temperatura y la presión necesarias por el tiempo requerido. En el autoclave, lo que mata a los microorganismos no es la presión, sino la humedad combinada con la alta temperatura del vapor. Cuando se opera el autoclave, es absolutamente necesario que el aire este dentro de la cámara salga y sea totalmente reemplazado por vapor. Si quedara aire en la cámara, la temperatura que se alcanzaría a una presión dada es menor. Es un quipo esencial en el laboratorio de microbiología. Medios de cultivo, soluciones, cultivos que se descartan y el material contaminado se esterilizan de rutina en éste aparato. (Pelczar, Reid & Chan, 1986)
5.4. ¿Qué otros métodos de esterilización se emplean para medios de cultivo? ¿Qué ventajas otorgan? La esterilización de los medios es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos, cuidando que en los recipientes no vuelva a entrar ningún otro. En esta forma, sólo se cultivarán los organismos deseados. La esterilización es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida.
5.5. -Esterilización por radiación (ultravioleta): Las radiaciones electromagnéticas ionizantes son una forma de esterilización física muy efectiva pero su manejo se ve restringido por la necesidad de disponer de instalaciones especiales para la emisión radioactiva. D urante las prácticas se manejará material adquirido de casas comerciales esterilizado mediante radiación γ, una radiación muy penetrante y útil para la esterilización de material termolábil como el plástico. La luz ultravioleta (UV) tiene efecto biocida debido a que provoca la formación de dímeros de timina en el DNA. Esta radiación tiene muy baja capacidad de penetración por lo que su uso se ve restringido al tratamiento de superficies o a la esterilización del aire en "salas limpias" como los quirófanos o las instalaciones como las unidades de cultivo celular.
5.6. -Esterilización por estufa: Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados de par bimetálico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatación. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la resistencia calefactora. Ventajas: No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
5.7. -Esterilización por tyndalización: Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones. Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56° u 80° para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas. Ventajas: Rápido calentamiento y penetración, destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo, no deja residuos tóxicos, hay un bajo deterioro del material expuesto, económico.
6. BIBLIOGRAFIA
KONEMAN, E. et al. Diagnostico Microbiológico. Sexta Edición. Editorial Médica Panamericana. 2008. Argentina. Páginas 861 y 862. -MADIGAN, M. MARTINKO, J. DUNLAP & P. CLARK, D. (2009) Brock Biología de los microorganismos. Madrid, España: Editorial Pearson Prentice Hall. Duodécima edición. -NEGRONI, M. Microbiología Estomatológica. Fundamentos y guía de práctica. Segunda edición. Editorial Médica Panamericana. 2009. Argentina. Página 51. -PELCZAR, J.; REID, R. & CHAN, E. (1986). Microbiology. 5ta Edition. New York, McGraw Hill, 952 pp. -SAGARDOY, M. & TANDOLESI, M. Biología del Suelo. Editorial de la Universidad Nacional del Sur. 2004. Argentina. Páginas 38 y 39. -STRYER, L; BERG, J.; TYMOCZKO, L. (2008). Bioquímica. Sexta Edición. Editorial Reverte. España.
