INGENIERÍA DE PROCESOS AGROINDUSTRIALES II Práctica Nº8:
OBTENCION Y EVALUACION DE
GELATINA A PARTIR DE HUESOS, PIEL Y PATAS DE ANIMALES Profesor:
Ing. Cesar Moreno Rojo
Paredes Nureña Adderly Alumnos:
Zavaleta Hernandez Luis Andrea Avilés Murillo
Grupo:
“A” (miércoles 08-12 a.m.)
Nuevo Chimbote febrero del 2010
PRACTICA Nº 8 OBTENCIÓN Y EVALUACION DE GELATINA A PARTIR DE HUESOS, PIEL Y PATAS DE ANIMALES
I.
INTRODUCCION: La Gelatina es una mezcla coloide (sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza y casi insípida que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua. En el animal, la gelatina no existe como componente, se obtiene, como ya se dijo, por hidrólisis parcial irreversible del colágeno, su precursor insoluble. En el colágeno, la unidad básica está formada por tres cadenas de polipéptidos, enrolladas en forma de hélice y estabilizadas por uniones intramoleculares. Esto hace que el colágeno exhiba propiedades mecánicas únicas y forme la estructura del tejido conectivo de la piel, los tendones, los cartílagos y los huesos de los animales. La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: se derrite con el agua caliente y se solidifica nuevamente y se hincha con el agua fría. Pocos alimentos reúnen tantas propiedades positivas como la gelatina. Sirve de fuente proteínica de primera, no dispone de potencial alérgeno, es libre de colesterol, azúcar y grasa, se digiere sin problemas y no contiene aditivos. Con la gelatina se puede crear platos bajos en calorías que, a pesar del bajo contenido en grasas, no pierden en sabor y garantizan un plus de proteína Tradicionalmente relegada a la repostería, la gelatina es algo más que un postre fácil de hacer. No sólo es un ingrediente muy atractivo a la hora de cocinar platos elaborados y deliciosos, tanto dulces como salados, sino que tiene un alto valor nutritivo. De hecho, la gelatina es proteína en estado puro.
II.
OBJETIVOS: • Obtener gelatina a partir de patitas de res, de pollo y cuy tierno. • Determinar los parámetros más importantes del proceso de obtención. • Realizar un balance de materia para el proceso. • Evaluar físico química y sensorialmente el producto final. III.
FUNDAMENTO TEORICO: GELATINA La gelatina, es una sustancia orgánica nitrogenada por hidrólisis parcial del colágeno contenido en la piel, tejidos conjuntivos o huesos de los animales. La gelatina es un material proteico dotado de propiedades gelificantes y espesantes únicos, a diferencia de los espesantes de origen vegetal, la gelatina es la única proteína natural de importancia comercial, capaz de producir geles termoreversibles en agua a temperatura cercanas a la temperatura corporal. Esta ventajosa capacidad de re-derretimiento a temperatura corporal, que no puede ser producida por otros materiales o sistemas, es la que imparte a los geles de gelatina su inigualable textura superior y su inconfundible palatabilidad y sensación bucal. Según la materia prima empleada y el método de extracción, las gelatinas varían en composición molecular y propiedades físicas. Por consiguiente, difieren de un fabricante a otro y no se pueden comparar fácilmente para aplicaciones específicas sin un adecuado conocimiento científico. En general, la propiedad más importante de una gelatina desde el punto de vista comercial es su fuerza gelificante (medida en unidades Bloom). Otras propiedades fisicoquímicas tales como viscosidad, color y claridad, así como también su pureza química y bacteriológica y los procesos de producción utilizados, contribuyen al valor global del producto. Rodríguez, G. Muñoz, J. La gelatina se forma mediante la hidrólisis del colágeno y se prepara a partir de materiales ricos en esta sustancia tales como la piel de cerdo, piel de ganado vacuno o huesos. La carne de animales jóvenes en la que el colágeno todavía no ha experimentado un entrecruzamiento intenso produce gelatina con facilidad mediante el proceso de cocinado ordinario.Ranken, M (1993)
COLAGENO El colágeno, es una fracción principal del tejido conectivo, viene a ser una proteína de estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, se encuentra en los tejidos de todos los organismos multicelulares, desde los más primitivos hasta el hombre. El colágeno representa aproximadamente el 30% del conjunto proteico en los mamíferos, siendo la característica de esta proteína el predominio de cuatro aminoácidos en su composición: glicina, alanita, prolina e hidroxiprolina, representando éste último el 14% en peso total de aminoácidos componentes del colágeno, además la suma de estos 4 aminoácidos representa casi el 75% de los aminoácidos totales del colágeno. La obtención de la gelatina de diversas calidades se ve influenciada por la complejidad del colágeno (influenciada a su vez por el tipo de tejido, edad y especie animal), así como de los diferentes procesos químicos disponibles para la ruptura de las estructuras y enlaces del polímero. Tabla 1: Contenido de colágeno en diferentes tejidos
Tejido Tendones Piel Cartílago Huesos
Contenido – base Peso seco% 90 90 40 20
Inicialmente el colágeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la acción de tratamientos ácidos o básicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolágeno (unidad monomérica básica) y posteriormente la desorganización de las tres constitutivas de las hélices mediante los siguientes mecanismos:
•
Apertura en tres cadenas alfa desorganizadas e independientes (peso molecular de 80 000 a 125 000), siendo la gelatina con esta composición la de más alta calidad técnica.
•
Apertura en dos moléculas, una de ellas alfa desorganizada y la otra molécula doble beta (unión de 2 alfas mediante enlaces) de peso molecular de 160 000 a 250 000.
•
La no apertura y desorganización de la espiral nos da una molécula gama de 240 000 a 375 000 dáltons. (tres cadenas alfa unidas covalentemente (tres cadenas alfas unidades
Las tres cadenas alfa unidas entre sí forman una hélice triple y compacta denominada tropocolágeno, en donde la localización de sus componentes prolina e hidroxiprolina les proporciona esta configuración helicoidal. . Rodríguez, G. Muñoz, J. OBTENCION DE GELATINA Para obtener gelatina, es necesario transformar el colágeno hasta obtener un producto de la mejor calidad comercial posible, en este caso el colágeno se puede disponer de las siguientes materias primas: •
Piel fresca de cerdo
•
Huesos
•
Pieles de ternero, bovinos, búfalos, etc.
•
Cartílagos Existen cuatro métodos utilizados para obtener la gelatina, siendo las más utilizadas en la actualidad el método ácido y el método básico:
Extracción ácida.- es el método más rápido, se aplica a materia
prima con poco grado de entrecruzamiento, por ello se utiliza más en las pieles de cerdo, obteniéndose una gelatina denominada A.
Extracción alcalina.- es el método más lento y se utiliza
frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 20ºC, éste método se aplica de preferencia a materiales con alto
grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bovinos y búfalos. En este proceso, el colágeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin acción química complementaria puede completar la transformación hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B.
Extracción enzimática.- se han realizado investigaciones sobre
este método, para ello se ha empleado la enzima pronasa en presencia de cloruro de calcio, el tiempo necesario es inclusive menor al método ácido.
Extracción microbiana.- se han tratado pieles con mycoderma y
torulopsis y se ha obtenido gelatina en 21 días. Esta técnica y la enzimática son relativamente nuevas. Para obtener la gelatina se requieren tres etapas bien diferenciadas:
Preparación de la materia prima
La materia prima, al margen de su procedencia, debe primero seleccionarse, clasificarse, cortarse en tamaños uniformes y purificarse (lavado, desgrasado, eliminación de pelo, etc.), luego mediante los tratamientos ácidos, básicos o biotecnológicos, se incrementa la blandura y el volumen de la materia prima, además a nivel de estructuras moleculares, se produce una ruptura parcial de uniones peptídicas y una disociación parcial de los enlaces covalentes existentes entre las cadenas.
Extracción
Durante la extracción de la gelatina, mediante tratamientos con agua a temperaturas altas (promedio de 80ºC), se acentúa la ruptura de estos enlaces incluido los puentes hidrógeno, separándose en cadenas individuales, permitiendo mayor conversión de colágeno a gelatina. Un pretratamiento alcalino de la materia prima, produce una gelatina con punto iso-eléctrico más bajo, aproximadamente 5, en tanto que un pretratamiento ácido, limitado casi exclusivamente a material de piel de cerdo, produce una gelatina con un punto iso-eléctrico entre 7 y 9.
Purificación y secado
La suspensión de gelatina obtenida después de la extracción se clarifica mediante centrifugado y filtración, además mediante la desionización se purifica la gelatina aún más eliminando sales inorgánicas. Mediante la evaporación se concentra la suspensión de gelatina en preparación para el secado. Una filtración secundaria “pule” la suspensión y resulta en una gelatina de mayor brillo, luego a fin de asegurar el grado máximo de pureza se pasteuriza y se enfría rápidamente y se extruda el gel resultante en forma de fideos, los que se distribuyen en bandejas o fajas transportadoras, para su traslado hasta los túneles de secado hasta reducir la humedad del producto entre 10 y 12%. Posteriormente estos “fideos se trituran y el polvo resultante se tamiza a través de mallas ajustadas a distintas especificaciones y se envasa. Rodríguez, G. Muñoz, J. COLÁGENO HIDROLIZADO El colágeno hidrolizado es una proteína de bajo peso molecular (es decir escaso poder gelificante) para su uso especial en aplicaciones alimenticias y no alimenticias en las cuales se requiere propiedades espesantes y texturizantes de la gelatina sin sus efectos gelificantes. Esta característica abre nuevas perspectivas para su aplicación en industrias que anteriormente no podían utilizar las propiedades fisicoquímicas de la gelatina debido a su poder gelificante. El peso molecular promedio del colágeno hidrolizado se ubica dentro de la escala de
4 000 a 20 000, siendo el valor calórico de 4 cal/gramo. El
colágeno hidrolizado es un producto adecuado para incrementar el contenido proteico de los alimentos debido a su elevado contenido de proteínas. Rodríguez, G. Muñoz, J.
RENDIMIENTO El siguiente cuadro, se muestra el rendimiento de gelatina en base a pieles de diferentes animales: Tabla Nº2: Rendimiento de gelatina
Materia Prima Piel de ternero (seco) Piel de búfalo (seco) Tendón de ternero Piel de cerdo (congelado) Hueso de ternero (seco)
Rendimiento (%) 35 – 52 15 – 50 50 – 70 18 – 22 14 – 18
VALOR BIOLÓGICO DE LA GELATINA El colágeno, es una proteína muy resistente a la acción hidrolítica de los enzimas digestivos; mientras que la gelatina es de fácil digestión pero su valor biológico es muy bajo, debido a su deficiencia de los aminoácidos esenciales lisina y triptófano. FUERZA DE GEL DE LA GELATINA La fuerza del gel se expresa mediante los grados BLOOM, en el mercado existen gelatinas que van desde 50 a 320 grados Bloom, la técnica toma las siguientes condiciones: Se aplica a aquellas preparaciones gelificadas a 10ºC y maduradas durante 16 a 18 horas, y corresponden a peso en gramos, necesarios para obtener un hundimiento de 4 mm. El gel de un pistón cilíndrico de 12,7 mm de diámetro geométricamente definido. USOS DE LA GELATINA Su uso en la Agroindustria es variada debido a sus propiedades fisicoquímicas y sensoriales, entre estos tenemos:
Postres de gelatina en agua Industria Láctea (espumante, flan de leche, en quesos mejora el rendimiento, en yogurt ayuda a estabilizar la viscosidad, en helados, en mantequilla, etc.) Postres espumosos (estabilización de crema chantilly) Pastelería, mejora el espumado Industria Cárnica, absorbe y estabiliza los líquidos presentes en los jamones, salchichas, etc.
Encapsulantes de sabores y aromas durante su secado, mediante la formación de un matriz. Clarificantes de vino y jugo de fruta, mediante la formación de flóculos con los taninos, los que al precipitar, clarifican estos líquidos. Confitería, en la elaboración de malvaviscos y caramelos suaves, marshmellows, etc. Rodríguez, G. Muñoz, J. METODOS USADOS EN LA OBTENCION DE GELATINA Existen cuatro métodos utilizados para obtener gelatina, siendo las más utilizadas en la actualidad el método ácido y el método básico: Extracción ácida.- es el método más rápido, se aplica a materia prima con poco grado de entrecruzamiento, por ello se utiliza más en las pieles de cerdo, obteniéndose una gelatina denominada A. Extracción enzimática.- Se han realizado investigaciones sobre éste método, para ello se ha empleado la enzima pronasa en presencia de cloruro de calcio, el tiempo necesario es inclusive menor al método ácido. Extracción microbiana.- Se han tratado pieles con mycoderma y torulopsis y se ha obtenido gelatina en 21 días. Ésta técnica y la enzimática son relativamente nuevas. Extracción alcalina.- es el método más lento y se utiliza frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 200C, éste método se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bobinos y búfalos. En este proceso, el colágeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin acción química complementaria puede completar la transformación hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. DIAGRAMA DE FLUJO PARA OBTENCION DE GELATINA TIPO A
DIAGRAMA DE FLUJO PARA OBTENCION DE VITAMINA TIPO B
Como forma de presentación encontramos gelatina en láminas, en forma de gránulos más o menos pulverulentos. Las características comerciales de una determinada gelatina, por ejemplo de tipo A (cerdo), se miden según la dureza de sus geles (grados Bloom) y el tamaño de la partícula o polvo (Mesh o Malla). A mayor grado Bloom, más fuerza de gel (suele oscilar entre 80-100 a 200-220ºBloom) y, en cuanto al tamaño de partícula, a mayor número de Mesh, más fino es el polvo.
Una gelatina muy castigada por el tratamiento de extracción y que al final no tenga fuerza para gelificar (0ºBloom) se llama hidrolizado de gelatina y sólo tiene interés en cosmética (cremas de belleza) y farmacia (productos que mejoran el cartílago de las articulaciones, que endurecen las uñas...) o como aporte proteico en alimentos (especialmente en productos cárnicos). Finalmente existe una gelatina que actúa en frío, sin necesidad de calentar como las otras. Se denomina “Gelatina Instant” y se utiliza en postres para preparar en frío (preparar, montar, refrigerar, dejar reposar y comer). Esta gelatina se obtiene por un proceso especial de secado. APLICACIONES La gelatina se utiliza en pastelería por su capacidad de formar geles. Para ello hay que trabajarla de la siguiente manera: Dejarla hidratar un tiempo en agua fría. El tiempo dependerá del grosor de la partícula. En el agua fría veremos que los gránulos, o la lámina de gelatina, se hinchan y se vuelven más flexibles y pegajosos, pero no se solubilizan. Si no se remoja la lámina o no se hidrata bien el producto en polvo, es muy probable que, al final, queden gránulos de gelatina sin disolver. Seguidamente hay que calentar el agua para lograr la completa solubilización de la gelatina. Cuando está perfectamente solubilizada, la gelatina no se ve en el agua y tampoco aporta viscosidad a la misma. Se puede solubilizar a partir de los 45-50 ºC. Mientras más caliente esté el agua, antes se solubiliza, pero un exceso de calentamiento (autoclave, olla a presión) puede hacer que se hidrolice y pierda fuerza de gel. También el medio ácido (zumos de frutas, ácido cítrico o tartárico...) aceleran la hidrólisis de la gelatina y forman geles menos duros si el calentamiento en medio ácido se mantiene un tiempo prolongado. Tras el calentamiento se puede dejar atemperar y no gelificará hasta alcanzar los
35-
40ºC. Se puede mezclar con otros ingredientes, montarla en forma de espuma, etc. Colocarla en el molde adecuado y dejarla en el refrigerador, preferiblemente 24 horas, para que alcance toda su fuerza. Las aplicaciones más habituales de la gelatina para pastelería son: - Estabilización de espumas (en sifón), mousses, babaroises, etc.
- Gelificación de cremas o líquidos para postres o interiores de tartas, gelatinas de frutas, hierbas, etc. - Glaseados y gelatinas para recubrimiento de tartas - Gominolas, marsmalow, caramelos (en algunos casos). La gelatina tiene un amplio uso en la industria alimenticia, principalmente como emulsificante en la repostería y heladería; se usa también en la industria farmacéutica como cubierta de las cápsulas, y en la fotografía como base para la emulsión de cristales de haluros de plata (la parte sensible a la luz) de las películas y papeles fotográficos. IV.
MATERIALES Y METODOS: 4.1
MATERIALES: •
Balanza analítica
•
Materiales de vidrio diversos: pipetas, probetas, vasos de precipitados.
4.2
•
Olla grande
•
Estufa
•
pH-metro
•
Termómetro
•
Molino de martillos
•
Materia prima: huesos, patitas de res y carcasa de cuy tierno.
•
Reactivos: HCl diluido, NaOH 0.05 N
METODOS DE ANALISIS Y CONTROL: •
Determinar el pH de remojo y temperatura de extracción.
•
Determinar los sólidos totales en la etapa de concentración
•
Determinar humedad del producto final y grado de gelificacion
•
Realizar un análisis sensorial al producto final, preparando una gelatina.
V.
PROCEDIMIENTO: 5.1 Diagrama de Flujo para la obtención de gelatina a partir de patitas pollo. Materia Prima
Lavado
Restos de grasa
Tamaño: 40 – 50 mm Água caliente Tº = 80ºC t = 50 min
Cortado
Desengrasado
Remojo en medio acido
Neutralización
pH 1,8 t = 24 h NaOH 0.05 N
Extracción, T060-800C x 2 a 4 h. pH neutro
Filtración Concentración a vacío, 500C hasta 20% sólidos. Secado, 500C Triturado y envasado Almacenado
5.2 Descripción de los análisis a realizar
• Determinación de pH: Preparar una solución acuosa al 1% y medir pH • Determinación de la viscosidad: Se pesa 7,5 g de gelatina en 105 ml de agua Se vierte sobre el recipiente del viscosímetro Brookfield Se usa la aguja N”1 y la T” debe estar en 40”C Se mide la viscosidad a 20, 50 y 100 RPM Los resultados se expresan en centipoise (cp) • Determinación de color, olor y turbidez: Estos análisis se evaluaran con una escala hedónica de 5 puntos que cada grupo elaborara para su gelatina obtenida • Determinación de Grados Bloom: Se determinara en forma cualitativa a través de un cuadro elaborado para tal caso. VI.
RESULTADOS : 6.1.Determinación de Grados Bloom: Gelatina: 102 gr
1500ml
10 gr
X X = 147.06 ml
Colapiz :
ml
102 gr
1500ml
7.5 gr
X X = 110.3 ml ml
Tipos de gelatina
Grados bloom
características
1
200 – 230
Tiene una buena solidez de los geles formados
2
120 -150
Los geles formados tiene una solides no muy consistente
3
50 – 80
Los geles formados no tienen poca solides
Los geles formados por la gelatina comercial y por el colapiz tuvieron una buena consistencia esto se debió ya que son gelatinas comerciales por lo cual estuvieron en el tipo de gelatina 1 con 200 – 230 grados bloom. 6.2.Determinación de pH:
•
Gelatina:
7.5
Colapiz:
7.2
Determinación de color, olor y turbidez:
Gelatina sabor a fresa: al ser una gelatina comercial la que se
aplico para
el
experimento el laboratorio el color fue un rojo
característico el olor a fresa como es la característica de dicho producto.
Para el colapiz no tenia olor y era de un color tranparente ya que
fue comercial también el colapiz es un tipo de gelatina sin olor ni sabor que se utiliza para aumentar los grados bloom de la gelatina comercial y así esta pueda gelatinizar más rápido. VII.
DISCUSION:
Según Ranken, M (1993). La gelatina se forma mediante la hidrólisis del colágeno y se prepara a partir de materiales ricos en esta sustancia tales como la piel de cerdo, piel de ganado vacuno o huesos. La carne de animales jóvenes en la que el colágeno todavía no ha experimentado un entrecruzamiento intenso produce gelatina con facilidad mediante el proceso de cocinado ordinario. En la práctica realizada se trabajo con gelatina comercial (gelatina y colapiz)
Según Rodríguez, G. Inicialmente el colágeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la acción de tratamientos ácidos o básicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolágeno (unidad monomérica básica) y posteriormente la desorganización de las tres constitutivas de las hélices. A través de varias semanas de un tratamiento alcalino, se obtiene una cuidadosa transformación de la estructura del colágeno.. Según Rodríguez, G. Los huesos desengrasados usados para la extracción de gelatina se reducen de tamaño de hasta 5-10 mm. En el proceso de extracción, la materia prima neutralizada y desmineralizada, se somete a la extracción en caliente, siendo muy importante la influencia de la temperatura y el tiempo de extracción en la calidad de la gelatina; en la práctica realizada se utilizo una temperatura de 60-80ºC por 2-4 horas. VIII. CONCLUSIONES: •
Se utilizo gelatina comercial ( colapiz y gelatina)
•
Los grados Bloom se miden según la dureza de sus geles . A mayor grado Bloom, más fuerza de gel (suele oscilar entre 80-100 a 200-220ºBloom)
•
Un criterio importante para determinar la calidad de la gelatina son los grados Bloom que generalmente está entre 50 y 300. Con este valor se determina la estabilidad y el poder de gelificación de la gelatina. Cuanto más alto sea el valor Bloom tanto más alta es la intensidad de gelificación
•
Hay varios tipos de gelatina según la especie animal, el origen del colágeno, el proceso de obtención y la forma de secado. Las más frecuentes son: Gelatina de cerdo: también llamada gelatina A ya que se obtiene con un tratamiento ácido. Es la más utilizada en alimentación en los países no árabes. Gelatina de vacuno: llamada gelatina B ya que las pieles y huesos de vacuno se deben alcalinizar para obtener la gelatina.
•
La gelatina obtenida está catalogada como gelatina Tipo A.
•
El componente principal de la gelatina es la proteína colágeno.
•
Para la gelatina comercial se prepara 102gr en una dilución de 1.5 litros igualmente para el colapiz ya que es una gelatina sin sabor.
•
El colapis es un tipo de gelatina que no tiene sabor ni olor y es utilizado para aumentar los grados bloom de la gelatina comercial.
•
IX.
El ph de la gelatina comercial fue de 7.5 y del colapis fue de 7.2
BIBLIOGRAFIA: 1.
Rodríguez, G. Muñoz, J. Procesos Agroindustriales II. Universidad Nacional del Santa.
2.
Ranken, M (1993). Manual de la Industria de los alimentos, segunda edición, Editorial Acribia S.A Zaragoza.España
3.
http://www.gelita.com/DGFspanish/gelatine/gelatine_herstellung.html
4.
http://www.aulachocovic.es/docs/articles/Gelatina.pdf
5.
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ljaime/subprodu ctos.pdf
6.
http://translate.google.com.pe/translate? hl=es&sl=it&u=http://it.wikipedia.org/wiki/Grado_Bloom&ei=WOBiS4fjFcid lAeg22wAw&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=1&ved=0CAkQ7gEwAA&pr ev=/search%3Fq%3Dgrados%2Bbloom%2Bwiki%26hl%3Des%26sa%3DG
7.
http://jacintoluque.blogcindario.com/2008/07/00020produccion-de-gelatina.html
8.
http://www.aulachocovic.es/docs/articles/Gelatina.pdf
9.
http://www.gelatinascordoba.com.ar/productos.htm
CUESTIONARIO 1)
¿Por qué la gelatina se obtiene por hidrólisis parcial del colágeno?
El colágeno es una proteína fibrosa que contribuye muy significativamente a las singulares funciones desempeñadas por los tejidos conectivos de la piel, los tendones, los cartílagos, los huesos etc. La unidad estructural del colágeno es el tropocolágeno, una proteína en forma de varilla, formada por tres cadenas polipeptídicas superenrrolladas en una triple hélice y estabilizadas por uniones intramoleculares. Estos enlaces influyen en las propiedades moleculares de la gelatina resultante. Inicialmente el colágeno es insoluble en agua, debido a su estructura fibrosa, organizada y casi cristalina, pero bajo la acción de tratamientos ácidos o básicos moderados, esta estructura organizada se desorganiza, provocando el paso de fibras a fibrillas, luego a tropocolágeno (unidad monomérica básica) y posteriormente la desorganización de las tres cadenas constitutivas de alfa hélices ; las tres cadenas alfa unidas entre sí forman una hélice triple y compacta denominada tropocolágeno, en donde la localización de sus componentes prolina e hidroxiprolina les proporciona esta configuración helicoidal. La obtención de gelatina
de diversas calidades se ve influenciada por la
complejidad del colágeno, así como de los diferentes procesos químicos disponibles para la ruptura de las estructuras y enlaces del polímero. El producto hidrolizado depende de los enlaces cruzados que queden entre las cadenas peptídicas y de los grupos reactivos terminales aminos y carboxilos libres que se formen. Dado que las tres cadenas no son idénticas, después de la degradación resultan tres tipos básicos de nuevas cadenas: • Las cadenas alfa, compuestas de una sola cadena peptídica. • Las cadenas beta, formadas por dos cadenas peptídicas conectadas. • Las cadenas gamma, con tres cadenas peptídicas interconectadas Según esto, una muestra de gelatina tiene varios pesos moleculares. La distribución de pesos moleculares de la gelatina determina características como la dispersabilidad en agua, la viscosidad, la adherencia y la resistencia de los geles.
Cuando la concentración relativa de moléculas de bajo peso molecular aumenta, se reduce la viscosidad y la resistencia de los geles. 2)
¿Por qué la extracción de gelatina a partir de la piel y huesos de pescado es por extracción básica? Es el método más lento y se utiliza frecuentemente tiempos que van de tres a cinco meses a temperaturas menores a 20ºC, éste método se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento tales como las pieles de bovinos y búfalos. En este proceso, el colágeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin acción química complementaria puede completar la transformación hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. Este método se aplica de preferencia a materiales con alto grado de entrecruzamiento. En este proceso, el colágeno es desorganizado en su estructura fibrilar y solo el calentamiento en medio acuoso sin acción química complementaria puede completar la transformación hasta gelatina. La gelatina obtenida por este proceso se denomina gelatina B. El grado de entrecruzamiento se define como la concentración de puntos de unión efectivos en la red polimérica.
3)
¿Cómo precipitaría usted las proteínas que acompañan al colágeno después del remojo de las patitas de res en medio acido? El procedimiento de la obtención del producto se caracteriza por someter las pieles y/o tejido conectivo a una serie de lavados, seguido de un tratamiento con álcali diluido para obtener una completa limpieza del producto y preparación para la presolubilización. Su duración e intensidad dependerá del estado de la materia prima. Posteriormente, tras un lavado para neutralizar se somete a un tratamiento con ácido diluido. Las propiedades que infiere el ácido seleccionado predisponen para obtener unas propiedades finales del producto elevadas. La concentración
del acido(s) y el tiempo de permanecia en él dependerá del estado de la materia prima, grado de entrecruzamiento del colágeno, etc. Una vez pregelatinizada la proteína se lava abundantemente y se procede a la extracción de la gelatina en un baño de agua. Según la temperatura y tiempo aplicado se obtendrán unas características y rendimiento determinado. Las proteínas pueden precipitarse del colágeno de distintos métodos entre ellos tenemos: Métodos de rotura celular y extracción de proteínas Métodos cromatográficos Métodos electroforéticos 1. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas.
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están: "
Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos
animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura. "
Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización
(hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).
"
Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un
cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 C).
Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídico) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible, además en ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas. Esta preparación se somete a centrifugación
(10.000 - 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos. Para purificar una proteína es imprescindible tener un método para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este método sea específico y fácil de llevar a cabo. En este sentido es mucho más cómodo trabajar con enzimas, pues se detectarían mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar proteínas no enzimáticas, se requieren métodos de selección más específicos. 2. Métodos cromatográficos para separación de proteínas Las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. Uno de los métodos más habitualmente utilizados para la separación de proteínas es la cromatografía en columna, aunque también existe la cromatografía en papel y en placa. La columna está rellena con un material sólido con las características químicas adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a través de la columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria. Generalmente estas cromatografías se realizan de una forma semiautomática, la fase móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristáltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. Después hay que localizar en que tubo o tubos está la proteína que se pretende purificar. Existen distintos tipos de cromatografías en tres ellos: o La filtración o exclusión molecular o El cromatografía de intercambio iónico o La cromatografía hidrofóbica
o La cromatografía de afinidad a. Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular. La fase estacionaria esta constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa en el tamaño de las partículas. Las proteínas más grandes que no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz de filtración son eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas y siguen un camino más tortuoso y más largo. El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a proteínas por debajo de un determinado peso molecular.
b.
Cromatografía de intercambio iónico. En ella, la columna está rellena con un
soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados
por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fase móvil. Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.
c. Cromatografía hidrofóbica. Se trata de un método similar al anterior con la única diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los resto de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil. d.
Cromatografía de afinidad.
Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertas moléculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína buscada se unirá al ligando inmovilizado mientras que las demás saldrán de la columna con el tampón. En este caso también se utiliza el incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas.
Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatográficos tales como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presión (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificación y utilizan fases estacionarias con mayor poder de retención, lo que se incrementa los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.
3. Métodos electroforéticos Para comprobar si la proteína de interés se ha separado del resto, es decir si la proteína está pura, se requieren las técnicas electroforéticas. La electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en función de la concentración de acrilamida. Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migración de las proteínas es un campo eléctrico, y el gel actúa como filtro molecular, ralentizando la migración de las proteínas en función de su relación carga/masa. A diferencia de lo que ocurría en la cromatografía de filtración, en las electroforesis las proteínas mayores son retardadas y se mueven más lentamente a través del gel, ay que las va frenando el tamaño del poro y las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente. En la figura vemos un típico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocación de un peine de electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formación de unos pocillos, donde se colocarán posteriormente y una vez retirado el peine, las muestras, que se desplazarán por calles paralelas al aplicar el campo eléctrico.
Las muestras de proteína se disuelven en una pequeña cantidad de una solución tampón, que contiene glicerol, que hace que la muestra se sitúe en el fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeño peso molecular que nos indica migración del frente. El tampón de electroforesis cierra el circuito entre el cátodo (+) y el ánodo (-). El sistema se conecta a una fuente de alimentación y las proteínas migran hacia el polo positivo, situado en la base del gel. Después el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de Coomassie), que tiñe por completo el gel. A continuación se destiñe con una disolución de etanol/acético y el gel queda transparente y las bandas de proteínas quedan teñidas de color azul.
Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las proteínas se separan en función de su carga/masa; y en condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente, el SDS (dodecil sulfato sódico). El SDS es un detergente aniónico, que se une a todas las proteínas en la misma proporción formando una especie de micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrínseca de las proteínas, con lo que éstas se separan solo en función de su masa e independientemente de su carga. El único inconveniente de esta técnica es que el SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas multiméricas se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS además de permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptídicas, nos indican las distintas subunidades que posee la proteína. Generalmente la proteína interés se analizan incluyendo calles con marcadores moleculares, que son proteínas de peso molecular conocido que nos permiten determinar el peso molecular de la cadena polipeptídica, como se muestra en la siguiente figura. En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en la calle 2 se encuentra la proteína sujeta a estudio, de tal manera que se puede hacer una relación lineal entre el Log del peso molecular de las proteínas y la distancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente). La
siguiente
figura
nuestra
la
diferencia
entre
la
electroforesis
nativa
(NATIVAPAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia en la figura una banda en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la proteína tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en una banda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo peso molecular. De la figura se deduce que, la proteína está pura (pues solo aparece un banda) y que además posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa ) cada una.
4)
¿Por qué la extracción de gelatina a partir de los huesos de vacuno involucra una desmineralización? ¿por que se realiza en medio acido? La desmineralización del hueso a través del tratamiento intermedio con ácido clorhídrico diluido, en procesos de corriente inversa a bajas temperaturas por varios días, remueve el fosfato contenido en el hueso. Este procedimiento es conocido como “maceración”, el hueso calibrado desmineralizado se denomina “oseína”. Al final los ácidos excedentes son retirados a través de un lavado intensivo. Los huesos se tratan con una solución ácida para extraer los minerales (fosfato de calcio) sin afectar los contenidos orgánicos. Después de un lavado, este producto llamado “oseína”, se vuelve flexible. Los fosfatos se separan por precipitación con cal.
La oseína y las pieles se procesan con ácidos para su hidrólisis a temperatura ambiente por un tiempo relativamente corto. Por otra parte, los cueros y la oseína se ponen en contacto con una solución de cal durante 5 a 10 semanas a temperatura ambiente. Luego se ajusta al pH requerido para la extracción de gelatina propiamente dicha. 5)
¿Qué es el grado Bloom en gelatinas y cual es la metodología para medirlo? Un criterio importante para determinar la calidad de la gelatina es el llamado valor Bloom que generalmente está entre 50 y 300. Con este valor se determina la estabilidad y el poder de gelificación de la gelatina. Cuanto más alto sea el valor Bloom tanto más alta es la intensidad de gelificación. Índice de Bloom o Resistencia de Gel. El Bloom es la medida de fuerza necesaria para formar una depresión de 4 mm por medio de un émbolo de 12.7 mm de diámetro en una solución al 6.66% de gelatina mantenido a 10°C x 18. La técnica es la siguiente: Se aplica a aquellas preparaciones gelificadas a 10ºC y maduradas durante 16 a 18 horas, y corresponden al peso en gramos, necesarios para obtener un hundimiento de 4 mm. En el gel de un pistón cilíndrico de 12.7 mm. De diámetro geométricamente definido.
