OBJETIVO GENERAL -
Estudiar la reacción de la transaminación.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Estudiar el proceso de la transaminación en presencia de un extracto enzimático de origen animal.
- Separar e identificar aminoácidos y cetoácidos obtenidos como productos en la reacción de transaminación.
RESULTADOS En esta experiencia se realiza un estudio sobre hígados de rata, los que se someten a distintos procesos y reactivos para poder producir distintas reacciones de transaminación en sustratos. Los ensayos efectuados son esquematizados a continuación. 1. Composición de los ensayos.
Tubo/Composición
A
B
C
D
E
F
G
H
Patrón Ala
Patrón Glu
Pα-
Ppyr
CG
Arsenito de Na 0,1 M (mL)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Buffer Fosfato 0.05 M (ml)
1,0
1,5
1,5
1,0
1,0
1,5
1,5
1,0
1,5
1,5
1,5
1,5
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1,0
1,0
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Glutamato 0,1 M (mL)
0,5
0,5
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0.5
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1,0
Alanina 0,1 M (mL) ---
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0,5
0,5
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0,5
1,0
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Piruvato 0,1 M (mL) 0,5
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0,5
0,5
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α-Cetoglutarato
0,1M (mL)
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0,5
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0,5
0,5
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Extracto Crudo (mL)
---0,5
Extracto Hervido (mL)
0,5
0,5
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0,5
0,5
0,5
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0.5
*Tabla 1, organización de cada ensayo.
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0,5
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2. Tablas de resultados de distancias recorridas y Rf: Luego de revelar las cromatoplacas, se mide la distancia recorrida tanto del eluyente como de cada muestra en análisis, obteniéndose los siguientes resultados:
a. Cromatografía de aminoácidos Distancia recorrida por eluyente Placa 1: 6,2 cm
Placa 1:
Tubo A
Número de manchas
Distancia Recorrida por analito (cm)
Distancia Recorrida por eluyente (cm)
Rf
2
1,2 (1° mancha) 0,8 (2° mancha) 0,8 0 0,9 1,6 0,7
6,2
0,194 (1° mancha) 0,129 (2° mancha) 0,129 0 0.145 0,258 0,113
Tubo B 1 6,2 Tubo C 0 6.2 Tubo D 1 6.2 Patrón Alanina 1 6,2 Patrón Glutamato 1 6,2 *Tabla 2, Cantidad de manchas y distancias recorridas del eluyente y de los ensayos realizados desde el tubo A al D y los patrones alanina y glutamato.
*Imagen 1, cromatografía aminoácidos placa 1.
Distancia recorrida por eluyente Placa 2: 4,4 cm, (datos obtenidos desde otro grupo de laboratorio).
Placa 2:
Tubo E Tubo F Tubo G Tubo H
Número de manchas
Distancia Recorrida por analito (cm)
Distancia Recorrida por eluyente (cm)
Rf
1 1 1 1
1,40 1,30 0 1,25
4,4 4,4 0
0,318 0,295 0 0,284
4,4
Tubo Patrón Ala 1 1,30 4,4 0,295 Tubo Patrón Glu 1 0,50 4,4 0,114 *Tabla 2, Cantidad de manchas y distancias recorridas del eluyente y de los ensayos realizados desde el tubo A al D y los patrones alanina y glutamato.
b. Cromatografía de cetoácidos. Siguiendo los pasos para la cromatografía de los cetoácidos, es decir, se realiza la
comparación de los tubos del A – H, sembrando las soluciones patrón de α-cetoglutarato y piruvato.
Distancia recorrida por eluyente Placa 1: 4,2 (a las soluciones patrón, no se les adicionó la hidracina, por lo que no se muestran como mancha amarilla, debido a esto se debió conseguir Rf con un grupo de laboratorio de otra sección, para así poder comparar las manchas de las muestras y sus respectivos Rf dependiendo de la m agnitud de éste.) Número de manchas
Distancia Recorrida por analito (cm)
Distancia Recorrida por eluyente (cm)
Rf
Tubo A
2
4,2
Tubo B Tubo C
0 2
Tubo D
2
3,0 (1° mancha) 2,1 (2° mancha) 0 3,1 (1° mancha) 2,3 (2° mancha) 3,2 (1° mancha) 2,4 (2° mancha)
0,714 (1° mancha) 0,500 (2° mancha) 0 0,738 (1° mancha) 0,548 (2° mancha) 0,762 (1° mancha) 0,571 (2° mancha) 0,317 0,512
0 4,2 4,2
Patrón Pα-CG Patrón Ppyr *Tabla 3, cromatografías cetoácidos para tubos del A al D
*Imagen 2, cromatografía aminoácidos placa 1, en cetoácidos.
Distancia recorrida por eluyente Placa 2: 4,7 (datos conseguidos con otro grupo, se establece solo una mancha según información otorgada por ell os.) Número de manchas
Distancia Recorrida por analito (cm)
Distancia Recorrida por eluyente (cm)
Rf
Tubo E 1 2,00 4,7 0,426 Tubo F 0 0,00 0 0 1 2,30 4,7 0,489 Tubo G Tubo H 1 2,35 4,7 0,500 Patrón Pα-CG 1 0,385 Patrón Ppyr 1 0,578 *Tabla 4, datos obtenidos de cromatografía de cetoácidos para los tubos del E al H.
3. Calculo de Rf: Se calcula el Rf con las distancias medidas de cada mancha (se define como distancia de mancha al centro de ésta).
Como ejemplo de obtención del Rf se realiza con las muestras patrón de Alanina y Glutamato.
Patrón Alanina
Patrón Glutamato
Se calcula el resto de los Rf para cada muestra de la misma manera.
DISCUSIÓN Se realiza el análisis entre reactantes y productos obtenidos en la cromatografía en capa fina (sílica) con eluyentes que se encuentran en proporciones definidas, así se puede observar claramente la separación de las manchas, luego se utiliza un revelador (ninhidrina) el cual reacciona con los grupos aminos oxidándolos para luego producir una condensación otorgando el producto morado de Ruhemannn. Para el caso de los cetoácidos se utiliza la hidrazina, la que actúa de forma rápida con los cetoácidos formando una hidrazona que se puede re conocer por su color amarillo. Cabe mencionar que se realiza un error en la detección por cromatografía de los cetoácidos, ya que a las soluciones patrón no se le adiciona la hidrazina, no pudiendo ver la corrida de los cetoácidos. En la reacción de transaminación el grupo alfa-amino de un aminoácido es transferido al átomo de carbono alfa de un cetoácido, dando lugar al correspondiente -cetoácido análogo al aminoácido y el aminoácido análogo al cetoácido correspondiente. Estos productos fueron los medidos en la cromatografía, con la finalidad de saber si la reacción de transaminación fue realizada (efectiva) o no. La reacción se puede escribir de la siguiente manera: Glutamato + Piruvato
Alanina + α-cetoglutarato ↔ Transaminasa
Para lograr la identificación de los aminoácidos L-Glutamato y L-Alanina, en cada tubo por preparado, se comparan los Rf calculados con los patrones, es decir, si ocurre que el tubo preparado otorga una mancha con un Rf similar o igual a un Rf de un patrón, entonces este corresponderá a dicho patrón y podrá ser identificado. Se resume de acuerdo a lo obtenido en la siguiente tabla el práctico:
Tipo de extracto Contenido Inicial Contenido final
A
B
C
D
E
F
G
H
Crudo
Crudo
Crudo
Hervido
Crudo
Crudo
Crudo
hervido
Glutamato Piruvato
Glutamato
Piruvato
Glutamato Piruvato
Alanina α-CG
Alanina
α-CG
Alanina α-CG
Alanina Glutamato α-CG piruvato
Glutamato
α-CG Piruvato
Glutamato α-CG piruvato
Alanina
Alanina
Glutamato
*Tabla 5, resumen de lo obtenido y podido estudiar. (no es posible determinar el contenido final de los tubos completamente por la no completa información otorgada por el o tro grupo).
Para el Tubo A, con la enzima activa (extracto crudo) se logra determinar que exist e la reacción esperada porque las manchas obtenidas poseen un Rf similar a la de los patrones, en ambas cromatografías (aminoácidos y cetoácidos), por lo tanto se dice que fue efectiva la reacción por parte de glutamato- alanina y de piruvato a alfacetoglutarato. Para el Tubo B, se establece que no ocurrió la reacción enzimática porque el mismo glutamato queda en la corrida, sin aparición de alanina, también no se obtienen cetoácidos. Para el Tubo C, es efectiva la reacción, logrando pasar de piruvato a alfacetoglutarato. No se obtiene aminoácidos concordando con lo previsto, ya que no sembraron. Para el Tubo D, se posee la enzima desnaturalizada (extracto hervido) y además los reactantes, pero no ocurre reacción, por esto solo se obtiene una mancha similar al Rf del glutamato. Para el Tubo E, se encuentra la enzima activa, por lo que se espera reacción, pero no ocurre obteniendo una mancha con Rf similar al de la alanina. Pudo deberse a una f alla en el proceso como poco tiempo de incubación. Para el Tubo F, solo se obtiene alanina. Para el Tubo G, no se obtiene resultado respecto a aminoácidos. Para el Tubo H, aunque se utilizó el extracto calentado, se produce reacción obteniendo una mancha con un Rf similar al del glutamato. Pudo deberse a que el crudo no fue correctamente hervido hasta la desnaturalización completa de la enzima. En los tubos D y H, la enzima se utiliza extracto hervido (para la desnaturalización de la enzima), en el tubo D se obtiene lo esperado “No reacciona”, por tanto solo se obtiene lo adicionado en el tubo en cambio el H se produce reacción, pudo deberse a la no utilización correcta del crudo hervido. Para los tubos del E al H no se puede establecer resultados finales con respecto a l os cetoácidos, ya que falta información (número de manchas, Rf de muestras patrón)
CONCLUSIÓN -
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Se logra entender la reacción de transaminación, utilizando un extracto enzimático de hígado de rata, para un completo estudio se evalúa en distintos medios, como temperatura desnaturalizando a la enzima. Se identifican los aminoácidos esperados L-Alanina y L- Glutamato, utilizando la técnica de separación “Cromatografía en capa fina”, comparando Rf de soluciones patrón con los Rf de las manchas de las muestras sembradas. Si no se establece un buen medio, como por ejemplo la total de los reactivos, la reacción no se puede llevar a cabo obteniendo solo el sustrato inicial.
BIBLIOGRAFÍA
1. Jesús V. Jorrín Novo, Mª Nieves Abril Díaz, José A. Bárcena Ruiz , “Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina”, Depto. De Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Córdoba. 2. Lehninger, principios de bioquímica / / David L. Nelson, Michael M. Cox; coordinador de la traducción Claudi M. Cuchillo. 2006
