Universidad Nacional Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Celular BIO 035
Informe de laboratorio N°5 Organización subcélular
Alumnos:
Stephanie fuentes Valdivia Pedro Hernández Ahumada Hugo Bustamante Reyes
Sección:
12
Profesores:
Juan Morgado Jorge Bobadilla
Introducción
Fraccionamiento subcélular
Las células pueden ser de dos tipos. Procariontes como eucariontes estos últimos poseen un núcleo que contiene la mayoría del ADN envuelto en una membrana quedando separado del citoplasma que contiene organelos como: Las mitocondrias: contienen su propio ADN sintetizan proteínas son de un tamaño similar a las bacterias y son las responsables de la respiración celular y producción de energía. Cloroplastos: se encuentra solo en los organismos capaces de realizar fotosíntesis. Están compuestos por una envoltura, estroma y tilacoides. Retículo endoplásmatico: son sacos tubos y capas de membrana que se extienden a través del citoplasma se encuentra a continuación de la membrana nuclear sus funciones son la síntesis de lípidos (retículo endoplasmatico liso) y La síntesis de proteínas (retículo endoplasmatico rugoso) Aparato de golgi: está constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoproteícas. Su función principal es la modificación destinación y empaquetamiento de macromoléculas de secreción o que están destinadas a otros organelos. Los lisosomas: son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas requeridas para la digestión de moléculas al interior de la célula. Ribosomas: Son grandes complejos de RNA y proteínas se encargan de llevar a cabo el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Cuando se requiere el estudio de los componentes específicos de las células se recurre a la técnica de fraccionamiento subcélular la que consiste en un conjunto de procedimientos para llevar a cabo fracciones puras o especializadas en algunos de los componentes de la célula. También este consta de pasos a seguir la primera es la ruptura de la células o homogenizado por algunos de los factores que lo hace posible como shock osmótico, sonicación (por aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular) o moliendo las células con homogenizadores mecánicos. Y segunda es el procedimiento de fraccionamiento de los componentes de las células por centrifugado después de ello se obtiene un precipitado o pellet que según a la velocidad y tiempo que este se mantenga en la centrifugadora y cuantas veces la muestra a sido centrifugado es posible determinar el contenido de su pellet, también obteniendo una parte semilíquida llamada sobrenadante contiene partes de los organelos sin centrifugado. Generalmente las muestras centrifugadas se procede a una evaluación a través de marcadores moleculares estos consisten en identificar y rectificar la distribución y locación de los componentes celulares por lo que se pueden mencionar como por ejemplos: el ADN es la molécula marcadora para identificar núcleos para la clara observación de esta se utilizan colorantes básicos como azul de tripán, azul B y azul toluidina. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la decoloración del azul de metileno.
Objetivo El objetivo de este Laboratorio consiste en que el estudiante reconozca los diferentes componentes de la célula a través del fraccionamiento subcélular (Fracción nuclear, fracción Microsomal y Fracción mitocondrial), conocer los distintos procesos para poder llegar a una determinada fracción celular. Además de evaluar con marcadores moleculares los componentes de la células a través del reconocimiento de las mitocondrias para determinar las diferencias con los demás organelos.
Materiales y método. Actividad N°1
Para este experimento será entregado una muestra homogenizada de hígado de ratón. Llevar la muestra de 5ml a un tubo Falcon manteniendo el tubo en hielo hasta antes de ser puesto en la centrifuga (EBA 20) tener en consideración que en la centrifuga tienen que estar balanceado el peso de las muestras. Centrifugar la muestra a 2500 RPM durante 10 minutos. Luego sacar la muestra en la cual se puede apreciar un pellet y sobrenadante. Retirar el sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo Falcon. Mantener el pellet y sobrenadante obtenido en hielo. Centrifugar el sobrenadante esta vez a 6000 RPM durante 20 minutos nuevamente se obtendrá un pellet y sobrenadante el cual hay que retirar y depositar en un nuevo tubo Falcon con lo cual tendremos 3 muestras la primera con fracción nuclear, la segunda con fracción mitocondrial y la tercera con fracción microsomal Con el primer pellet obtenido (fracción nuclear) se debe colocar una gota sobre un portaobjeto luego colocar un cubreobjetos formando un ángulo para evitar burbujas que interfieran en la observación colocar la muestra en la platina del microscopio óptico y usar el objetivo de 40X de aumento para realizar las observaciones de la muestra del pellet con fracción nuclear. Luego agregar a la muestra azul de tripán y vuelva a realizar las observaciones. Informar que es lo que se observa. Preparar 4 tubos de ensayo rotulados y a cada tubo agregue la solución que corresponda: 1°tubo blanco agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno y 2mL de agua destilada 2°tubo fracción nuclear agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1mL de fracción nuclear. 3°tubo fracción mitocondrial agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1mL de fracción mitocondrial. 4°tubo fracción microsomal agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1ml de fracción microsomal.
Agitar cada uno de los tubo y agregar 1mL de vaselina para evitar contacto de la muestra con oxigeno y luego llevar las muestras a un baño termo regulado a 37°C y observar los cambios de las muestras.
Actividad 2
Observación del corte hígado de un ratón utilizando el objetivo de inmersión (100X) Se entregara una muestra de hígado de ratón en un porta objeto la cual se deberá poner sobre la platina y comenzar a observar en el microscopio óptico con el objetivo de 4X luego mover el revólver aumentando a los objetivos de 10X, 40X hasta llegar al objetivo de inmersión (100X) el cual requiere una gota de aceite inmersión. Para enfocar la muestra utilizar el tornillo micrométrico realizar las observaciones. Finalmente limpiar el objetivo de 100X en el cual se utilizo aceite de inmersión con un trozo de papel absorbente y xilol. Dejar el objetivo puesto en el de menor aumento para próximos experimentos.
Resultados Actividad 1
Al observar la muestra del primer pellet obtenido se puede apreciar una muestra liquida que contiene organelos grandes y parte del sobrenadante que no se logro extraer. Es una muestra uniforme por lo cual no se logra diferenciar exactamente los componentes de la muestra. Fracción Nuclear Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tipo de muestra: Temporal. Descripción: fracción nuclear obtenida con el primer centrifugado al cual corresponde a pellet y parte del sobrenadante que no se logro retirar, esta es una mezcla uniforme en la cual no se logra diferenciar los organelos que componen la muestra
Luego al observar la muestra añadiendo azul de tripán el cual tiene como objetivo unirse al ADN para lograr marcar los núcleos. Con esto ahora se puede diferenciar un sector de color azul el cual podemos concluir que es el ADN que está contenido en los núcleos de las células y que fueron marcados por el azul de tripán agregado a la muestra
Fracción Nuclear Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tinción: Azul de tripán Tipo de muestra: Temporal. Descripción: fracción nuclear obtenida con el primer centrifugado al cual corresponde a pellet y parte del sobrenadante que no se logro retirar, en esta mezcla gracias a la tinción con azul de tripán se logra apreciar un sector de color azul el cual podemos deducir que corresponde al ADN que se encuentra en el interior del núcleo y que es marcado por el azul de tripán. Marcadores moleculares
Las siguientes muestras fueron expuestas a un baño termo regulado a 37°C. Esta temperatura se debe a que las muestras se encontraban a menos de 4°C y se requiere que reacciones a la temperatura corporal que tiene el ratón al que se extrajo el hígado con el que se preparo la muestra. N°
Tubo
Succin ato 0,1M
Azul de metile no
Agua destila da
1
Blanco
1 ml
1 ml
2 ml
2
Fracción nuclear
1 ml
1 ml
1 ml
3
Fracción mitocondr ial
1 ml
1 ml
1 ml
4
Fracción microsom al
1 ml
1 ml
1 ml
Fracci Fracción ón mitocond nuclea rial r
Fracción microso mal
1 ml 1 ml
1 ml
En la muestra blanco no se vio ninguna alteración de color, no se presento precipitado por lo cual las demás muestras son comparadas con esta.
En la muestra nuclear se puede observar un precipitado con trozos de hígado que no fueron completamente fraccionados, un sector de color azul el cual corresponde a núcleos y restos de células y un sector más claro que sería el sobrante con el agua destilada que se le agrego a la muestra de fracción nuclear. En el tubo de fracción mitocondrial se pudo apreciar un leve precipitado de color azul el cual correspondería a las mitocondrias presentes en la muestra de pellet. En el tubo microsomal se pudo ser un cambio de color sin precipitado y una densidad mayor con partículas en suspensión. Actividad N°2 Muestra de hígado de ratón vista con distintos aumentos de microscopio óptico. En las cuales se pueden apreciar ramas de arterias hepáticas, conducto biliar, rama de la vena porta, hepatocito, espacio de Disse, celula endotelial, celula de Kupffer, hematíe y sinusoide.
Aumento objetivo: 4X Aumento oculares: 10X Aumento total: 40X Tipo de muestra: Permanente
Aumento objetivo: 10X Aumento oculares: 10X Aumento total: 100X Tipo de muestra: Permanente
Aumento objetivo: 40X Aumento oculares: 10X Aumento total: 400X Tipo de muestra: Permanente
Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tipo de muestra: Permanente
Discusión Actividad N°1
En general, el proceso de fraccionamiento subcélular se tiene como resultado que en el primer centrifugado a una velocidad baja y en pocos minutos se obtiene en un tubo Falcon (tubos exclusivo para centrifuga) un pellet o sedimentado en el fondo de este enriquecido en organelos grandes, es decir, núcleos y también un sobrenadante (liquido suspendido). Posterior a este, el sobrenadante anterior se extrae del tubo Falcon y se procede a otro centrifugado de mayor velocidad y tiempo que el anterior en este se obtiene un pellet de fracción mitocondrial (mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas y lisosomas) y su respectivo sobrenadante utilizado en otro centrifugado con un aumento en velocidad y tiempo que el anterior obteniendo como resultado una fracción microsomal (membrana plasmática, fragmentos del retículo endoplásmatico) y su sobrenadante es utilizado para el ultimo centrifugado a velocidad alta y bastante tiempo con un pellet enriquecido en ribosomas siendo su sobrenadante el citosol de las células. Hay que tener en cuenta que todo el proceso se mantiene a una temperatura baja para que se mantengan inactivas proteínas que hacen degradar los componentes de las células como fosfolipasas y proteasas Muestra de fracción nuclear al microscopio
En la muestra de fracción nuclear al microscopio sin colorante de azul de tripán solo se podía ver una imagen uniforme en la cual no se lograban diferenciar organelos que se encuentra en la muestra preparada, esto cambia al momento de agregar el azul de tripán el cual es marcador de ADN con lo cual se hace visible la presencia de núcleos que contienen ADN en su interior con la presencia de sectores de color azul los cuales logran diferenciar núcleos de los demás organelos de la muestras Evaluación del fraccionamiento subcélular mediante marcadores moleculares
Tubo blanco: este tubo no presento ningún cambio ya que no tenia presencia de ningún tipo de fraccionamiento celular Tubo fraccionamiento nuclear: su precipitado contenía restos de núcleos cito esqueleto y restos de células. y el sobrenadante (restos de organelos) correspondiente con restos de agua destilada Tubo fraccionamiento mitocondrial: su precipitado contiene lisosomas, peroxisomas y mitocondrias ya teñidas con la mezcla de azul de metileno, Succinato y agua destilada.
Tubo fraccionamiento microsomal: este tubo no presento precipitado solo presento microsomas y pequeñas vesículas en suspensión
Actividad N°2 Muestra de Hígado al microscopio
En la observación con el objetivo de 4X se puede apreciar solamente la mana de la vena porta y sinosoides. Al aumentar al objetivo a 10x se logra observar los hepatocitos que limitan los espacios ocupados por los capilares sinosoides. Luego en el siguiente objetivo, se logra distinguir con más exactitud las fibras reticulares formando una red soporte para los hepatocitos. Y girando al objetivo 100X y utilizando una gota de aceite de inmersión se pudo distinguir completamente la estructura del hígado de ratón con todas sus partes incluso hasta la más pequeñas como las células de kupffer, el espacio de Disse, las células endoteliales y los hematíes que son los componentes mas pequeños del hígado.
Otros métodos de separación de células.
Sedimentación y centrifugado
Centrifugación diferencial practica utilizada solo cuando existen diferencias de tamaño con respecto a los componentes que se están utilizando por lo menos 10 veces mayor. Algunas de estas son centrifugación a través de un medio de densidad constante. Esta se dispone a varios medios de densidades aptas para tipo celulares concretos, también la centrifugación zonal esta se utiliza para componentes celulares que son de similar densidad por ello se utilizan gradientes de densidad para un componente en especial. Además está la centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación utilizado para separar células con densidades igual que se realizan sobre un gradiente de densidad y a un tiempo mayor para alcanzar el equilibrio de sedimentación. Elutriación centrifuga
Otro método es el elutriación centrifuga consiste en separación de células a través de sus velocidades de sedimentación en estas las células están sometidas a dos fuerzas que son la fuerza centrifuga y la fuerza de arrastre producido por el flujo continuo en sentido contrario al medio Separación por afinidad con partículas magnéticas
Consiste en un tipo de separación a través de unas micro esferas magnéticas (oxido de hierro) las cuales están recubiertas de un polímero plástico que permite la absorción de distintas moléculas. Frecuentemente se crean anticuerpos magnéticas con los cuales se hacen mas específicos la separación de ciertas moléculas
Bibliografía Universidad Nacional Andrés Bello. Guía de laboratorio N°5: organización subcélular. Curso BIO035 Biología general 2009. José Luque, Ángel Herráez, Biología Molecular e Ingeniería Genética, 2000, Elsevier, 2000, Barcelona, pág. 122-133. Luiz C. Junqueira, Jorge Carneiro, Histología básica (2005), El sevier, 6 ª Edición, Barcelona, España, pág. 326, 328
