P5. FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS POR PRECIPITACION SALINA
INTRODUCCION
Las moléculas de proteínas pueden reaccionar reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteína-proteína, proteína-agua, proteína-agua, proteína-ión. proteína-ión. La solubilidad de una proteína depende del balance relativo entre las interacciones proteína-disolvente, lo cual tiende a mantenerla en solución y de las interacciones proteína-proteína, las cuales hacen que la proteína se agregue y precipite. La fuerza iónica de las soluciones es de particular importancia para especificar cual de estos tipos de interacciones interacciones predomina. Las proteínas son solubles en un medio acuoso debido a que sus aminoácidos que contienen grupos hidrofílicos, expuestos sobre a superficie de la proteína, interactúan con las moléculas de agua del medio, formando una capa de solvatación. Cualquier compuesto que interfiera con estas interacciones entre los grupos laterales de los aminoácidos hidrofílicos de la proteína y las moléculas de agua, reducirá la solubilidad de la proteína. A medida que las interacciones de la proteína con el agua decrece, las interacciones interacciones entre proteína-proteína se vuelven v uelven mas importantes, y la proteína se agrega, y precipita de la solución. Si la interacción proteína-proteína proteína-proteína es grande y la l a interacción proteína-agua es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - agua es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína-agua disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solv atación). atación). Un variado número de métodos bioquímicos pueden ser utilizados para reducir las interacciones interacciones hidrofílicas y propiciar la precipitación selectiva de p roteínas, roteínas, tales c omo: Fraccionamiento Fraccionamiento de proteínas por precipitación con sales. Precipitación selectiva con un solvente orgánico que reduce el agua de hidratación y también reduce la constante dialéctica de la solución. El fraccionamiento con etanol es comúnmente utilizado para separar fracciones de proteínas del plasma sanguíneo. sanguíneo. Precipitación selectiva utilizando polímeros no-iónicos como el polietilenglicol, el cual opera reduciendo la disponibilidad de las moléculas de agua, así como interactuando con algunas proteínas proteínas de la mezcla.
En el fraccionamiento por salado, grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-agua porque le quita la capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína proteína-proteína y se producirá la p recipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteína, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las proteínas. Si este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (alrededor de 4ºC), las proteínas precipitan sin que se desnaturalicen. Luego, las proteínas precipitadas pueden separarse mediante centrifugación y posteriormente pueden pueden ser re-disueltas en una solución buffer y dializada por varias días para eliminar el sulfato de am onio. El método de precipitación con sulfato de amonio es uno de los más utilizados para preparar fracciones crudas de inmunoglobulinas a partir del suero. La concentración de sulfato de amonio a la cual los anticuerpos precipitan varía entre las especies, pero suele rondar el 50% de saturación.
Las proteínas del suero se dividen en 2 grandes grupos: albumina y globulinas (alfa, beta y gamma). Ejemplos de globulinas son el fibrinógeno, los anticuerpos, y las proteínas transportadoras de metales como la transferrina. Todas tienen en común el grado de hidratación, por lo que precipitan cuando la concentración de sal esta en torno al 50%. En la actualidad la precipitación de proteínas con s ulfato de amonio se usa como un primer paso dentro de los protocolos de separación de proteínas de materiales biológicos.
PROCEDIMIENTO
La albumina puede ser separada de las globulinas ya que la albumina precipita solamente si la solución esta saturada al 100% con sulfato de amonio, mientras que las globulinas lo hacen a un 50% de saturación. 1. Añadir 500 µL de plasma. 2. Añadir 500 µL de solución saturada de sulfato de amonio. El sulfato de amonio debe ser añadido lentamente para asegurar que la concentración local en el sitio donde cae la gota no exceda la concentración de la sal deseada, evitando así la precipitación instantánea de la albúmina junto con la fracción de globulinas precipitada. Agite continuamente la solución evitando la formación de burbujas y espuma. 3. Mantenga la muestra precipitada durante 30 minutos a 4 C. 4. Resuspenda la fracción de globulinas precipitada agitando moderadamente durante 5 minutos. 5. Centrifugue la mezcla a 10.000 g durante 15 minutos a 4C. 6. Traspase cuidadosamente el sobrenadante que contiene la fracción de albúmina a otro eppendorf y resuspenda la fracción de globulinas precipitada en un volumen de PBS igual al de la muestra original (0,5 ml). 7. Mida absorbancia a 280 nm de cada una de las dos fracciones obtenidas y realice electroforesis en acetato de celulosa. 8. Compare los resultados obtenidos con los del suero sin fraccionar.
PREPARACION DE DISOLUCIONES Disolucion saturada de sulfato de amonio
1. Diluya 500g de sulfato de amonio (grado para análisis) en 500 ml. de agua destilada. 2. Caliente la mezcla a 50C con agitación continua, hasta que la sal se disuelva completamente y filtre rápidamente mientras la solución está aún caliente. Deje enfriar la solución durante varias horas o durante la noche a temperatura ambiente mientras el sobrenadante se satura. En este proceso se formaran cristales y estarán presentes en el envase mientras esté saturada la solución. El contenido de sulfato de amonio en la solución saturada depende de la temperatura (d=1.2450 a 25 C). 3. El pH de esta solución es aproximadamente 5 y debe ser ajustado a pH 7.2 añadiendo amonio para evitar la adición de iones extraños. Buffer PBS
Dissolve the following in 800ml distilled H 2O: 8g of NaCl, 0.2g of KCl, 1.44g of Na2HPO4 y 0.24g of KH2PO4. Adjust pH to 7.4 with HCl. Adjust volume to 1L with additional distilled H2O. Sterilize by autoclaving.
