Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Genética Molecular y Microbiologa Biologa de Microorganismos B!"#$#%&'
Informe N°2 Identicación, genética molecular bacteriana y morfología de hongos
(ombre) Diana Fuentes Castillo Profesores : Dras* Beatri+ Die+ y Carolina ,errano -efe de .yudantes) Daniela /ui+ .yudante) .yudante) Gabriela Gabriela Góme+ Góme+ 0illo Fecha de entrega) $ de (oviembre de '1#2
Introducción
0a microbiologa es la ciencia 3ue estudia a los organismos microscópicos y a los virus4 de manera de entender su funcionamiento y aplicar esto en beneficio de la humanidad 5#6* Para generar este conocimiento4 se re3uiere de instancias e7perimentales4 las 3ue permitir8n obtener información sobre el aspecto a anali+ar* %n las actividades pr8cticas reali+adas4 se traba9ó con bacterias4 virus y hongos* 0as bacterias son organismos unicelulares4 sin organelos4 de # a $ um de longitud en general 5'6* %n vista de la variedad de especies4 para su identificación4 es necesario el uso de pruebas en medios diferenciales4 3ue estar8n dirigidas por un an8lisis macroscópico y microscópico previo* 0a certe+a sobre la identidad de la bacteria se puede lograr a través de una batera de pruebas bio3umicas o mediante sistemas de identificación estandari+ados4 como .P! #1,4 3ue tiene un enfo3ue m8s amplio4 pero permite una identificación m8s r8pida 5:6* 0a batera bio3umica empleada consiste en #1 medios de cultivo4 3ue en presencia de la bacteria a identificar permitir8 detectar una reacción bio3umica determinada* %l sistema .P! #1, consta de ## pruebas bio3umicas con sustratos deshidratados* Por otro lado4 para sobrevivir las bacterias poseen : métodos de transferencia de genes) transformación4 en donde .D( libre es tomado por la célula; con9ugación4 en donde la transferencia de .D( re3uiere de interacción mediante pili4 y transducción4 en donde la transferencia de .D( es mediada por un virus 526* 0a transducción puede ser generali+ada4 en donde el virión solo posee .D( del huésped4 y especiali+ada4 en donde una porción especfica del .D( del huésped se integra en el genoma viral4 llegando incluso a eliminar parte de este 5$6* .dem8s4 se ha descubierto otra fuente de variabilidad genética4 los transposones4 3ue son segmentos de .D( 3ue se pueden mover de un lado al otro 5<6* Para verificar el proceso de con9ugación4 se emplearon medios con =anamicina4 antibiótico cuyo ob9etivo son bacterias Gram 5&6 5>6 y ampicilina4 de amplio espectro 5?6* Para verificar el proceso de transducción generali+ada4 se utili+ó el fago P''4 ya 3ue este proceso es tpico de él 5@6* .dem8s4 se utili+ó el medio agar verde para apreciar el metabolismo bacteriano en presencia de los fagos P'' y A$4 ltico y lisogénico respectivamente4 debido a 3ue este medio asla a Salmonella spp * e inhibe el crecimiento de fermentadores de lactosa4 como E. coli 5#16* 0os hongos son organismos eucariontes 3ue pueden ser unicelulares 5levadura6 o multicelulares 5micelio64 los 3ue a su ve+ pueden ser septados4 de células uninucleadas o coenocticos4 de células multinucleadas 5##6* 0os hongos utili+ados fueron Cryptococcus, Rhodotorula, Mucor, Penicillium notatum y Aspergillus niger * Cryptococcus es una levadura4 pudiendo formar blastoconidias 5#'6* Rhodotorula es una levadura del tipo basidiomiceto 5#:6* Mucor 4 es un hongo
dimórfico 3ue en ausencia de o7geno se comporta como levadura 5#26* Penicillium notatum es un hongo filamentoso septado4 9unto con Aspergillus niger * 0os traba9os pr8cticos se han reali+ado con el ob9etivo de) #* !dentificar una bacteria Gram 5&6 mediante el uso de batera bio3umica convencional y el sistema de identificación estandari+ado .P! #1,* '* erificar los mecanismos de con9ugación4 transducción generali+ada y transposición en Salmonella typhimurium mediante an8lisis macroscópico de placas de cultivo* 3. Conocer y caracteri+ar la morfologa macroscópica y microscópica de colonias de hongos unicelulares y pluricelulares*
Materiales y métodos Lista de materiales:
&Bacteria problema en medio l3uido &.sa de platino convencional &.sa de platino adaptada para simular asa en punta &Mechero Bunsen &Batera de medios de cultivo ,emitendidos o ,! o 0!. endidos o .gar corriente o .gar manitol o .gar citrato 03uidos o Caldo corriente o Caldo urea o Caldo sorbitol o Caldo glucosado o Caldo oges&Pros=auer ,emisólidos o M!" •
•
•
•
&Galera .P! #1, &Cultivos de cepas Salmonella entérica serovar yphimurium &0isados de fago transductor P'' de cepas #21'?Cherry y M,#1<: &Placas con medio .gar 0uria4 .gar 0uria Eanamicina&.mpicilina4 agar 0uria .mpicilina4 agar MacCon=ey =anamicina* &Cepa E. coli CC#111 y Salmonella 'C &Micropipetas &Puntas de micropipetas &Placas preparadas con placas de lisis del fago P'' y A$ &Placas de agar verde &.gar blando &Muestra con concentración desconocida de fagos &Microscopio "lympus C'# &.ceite de inmersión &%stufa &.gar sabouraud &Cultivos de levaduras 5 Cryptococcus, Rhodotorula, Candida albicans 6
&Cultivos de hongos filamentosos 5 Aspergillus niger, Mucor, Penicillium notatum 6 &Batera para tinciones Cristal violeta 0ugol ,olución de alcohol&acetona ,afranina al # .+ul de lactofenol inta china • • • • • •
&Portaob9etos &Cubreob9etos
Procedimientos: Trabajo práctico N°3 !ne"o# %l procedimiento se reali+ó de acuerdo a lo estipulado en la gua de traba9o 5#$64 con la e7cepción de 3ue para sembrar los medios semitendidos y semisólidos no se utili+ó un asa en punta* Trabajo práctico N°$ %l procedimiento se reali+ó de acuerdo a lo estipulado en la gua de traba9o 5#<64 con la e7cepción de 3ue la incubación a temperaturas m8s alta 3ue la ambiental se empleó una estufa4 en ve+ de un baHo termorregulado4 y adem8s de usó puntas de micropipeta en ve+ de mondadientes Trabajo práctico N°% %l procedimiento se reali+ó de acuerdo a lo estipulado en la gua de traba9o 5#>64 con la e7cepción de 3ue se dispuso de un cultivo adicional) Candida albicans.
&esultados Identi'icación de bacteria (ram )# ,e reali+ó una batera bio3umica convencional4 en donde se emplearon #1 medios de cultivo4 los 3ue permiten determinar la actividad metabólica de la muestra problema* 0os resultados para cada prueba se presentan en la abla !* %stos resultados se contrastan con la actividad metabólica previamente identificada de las bacterias de la familia %nterobacteriaceae 5#?6* Complementario a esto4 se reali+ó el sistema de identificación estandari+ado4 .P! #1,4 3ue permite obtener la identidad de la bacteria de manera m8s r8pida4 mediante an8lisis computacional* 0os resultados para cada prueba se presentan en la abla !!* .l obtener la identidad mediante la batera bio3umica4 se obtuvo 3ue hubo una compatibilidad de #' aspectos4 de un total de #2* Mediante .P! #1,4 la compatibilidad 3ue mostró el softIare fue de $>4'* 0a compatibilidad porcentual de cada método se muestra en la abla !!!* Tabla I. Batera bio3umica convencional
Tabla II. .P! #1,
Prueba bio3umica
/esultad o Caldo glucosado . .gar manitol &J Citrato & Urea K Caldo corriente &J /eac oges&Pros=auer & /esul /o9o de metilo ción K tado .gar corriente "(P & K G ,! K G0U K 0!. & ./. & M!" & 0DC&; negativo* K ,imbologa) K; positivo* .; 8cido* ,imbologa) K; positivo* &; negativo* A', & "DC & ,!; triple sugar iron* 0!.; 0ysine !ron .gar* 0as muestras fueron observadas directamente* M!"; Motilidad&!ndol&"rnitina* C! & A ',; 8cido sulfLrico* J; no coincidió con lo A', & esperado 0as muestras fueron observadas U/F & directamente* & 0os resultados 3ueD. no coincidieron con lo esperado se marcaron con un asterisco* !(D K ("' & "7id & Tabla III. Porcenta9e de compatibilidad con fenotipo de E. coli asa Método de identificación Compatibilidad con fenotipo de E. coli Batera Bio3umica ?$4> .P! #1, $>4' %l porcenta9e compatibilidad de la batera bio3umica corresponde a la ra+ón entre pruebas compatibles y pruebas totales4 multiplicado por #11* %l porcenta9e de .P! #1, fue entregado por un softIare computacional*
(enética microbiana
"bservación de placas de lisis .l e7aminar las muestras preparadas de placas de lisis de distintos fagos4 fue posible identificar las caractersticas presentadas en la abla !* Tabla I*. Placas de lisis de fagos A$ y P''
Fago A$ P''
Placas de lisis # :
Colonias , (o
,imbologa) Para cuantificar las placas de lisis4 se usó una escala 3ue va de 1 a :4 en donde 1 es nada y : es lo m87imo observado 0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Metabolismo bacteriano .l sembrar los fagos A$ y P''4 provenientes de sus respectivas placas de lisis4 en placas de agar verde4 se obtuvieron los resultados de la abla * 0as placas de agar verde permiten el aislamiento de Salmonella spp. Tabla *. Caractersticas de cultivos de fagos en agar verde
Fago A$ P''
Caractersticas Predominio de colonias negras4 con presencia de algunas colonias blancas Colonias negras
0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Concentración de fagos .l sembrar el fago de concentración desconocida 9unto con la bacteria Salmonella typhimurium en agar corriente no hubo placas de lisis* 0a concentración de fagos est8 dada por PFU 5unidades formadoras de placas6 5#@6 Movili+ación de plasmidios por con9ugación .l sembrar cepas de E. coli y Salmonella tanto 9untas como separadas4 en medio 0B Eanamicina&.mpicilina4 se obtuvieron los resultados presentes en la tabla !* %ste medio inhibe el crecimiento de un amplio rango de bacterias4 entre ellas E. coli y Salmonella. Tabla *I. Placas de lisis de fagos P''
ipo de siembra ig +ag
Césped
Bacteria sembrada E. coli Salmonella typhimurium E. coli + Salmonella t yphimurium E. coli + Salmonella typhimurium
0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Crecimiento (o , , ,
ransducción de pl8smidos .l agregar el fago P''Cherry 9unto a Salmonella N en una placa 0B .mpicilina4 medio antibacteriano de amplio espectro4 se obtuvo los resultados de la tabla !!* Tabla *II.
ipo de siembra ig+ag Césped
/esultados Colonias de color rosado Colonias de color rosado
0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Mutagénesis usando fagos con transposón .l sembrar el fago P''#1<: 9unto con Salmonella N en medio MacCon=ey&Eanamicina4 inhibiendo el crecimiento de bacterias Gram 5K6 y Gram 5&6 respectivamente4 se obtuvo los resultados de la abla !!!* Tabla *III.
ipo de siembra ig +ag Césped
Color agar /o9o oscuro Café
Cantidad de colonias # :
,imbologa) Para cuantificar las cantidad de colonias4 se usó una escala 3ue va de 1 a :4 en donde 1 es nada y : es lo m87imo observado 0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Mor'olo+,a de le-aduras
%n cuanto a la morfologa de levaduras4 se reali+ó un e7amen macroscópico de : cultivos4 cuyas caractersticas se presentan en la abla !* Tabla I. Caractersticas macroscópicas de levaduras
%specie
Forma
Color
,uperficie
Borde %levación
Brillo
Rhodotorula
Colonias circulares
,almón
0isa
0iso
,
,
Cryptococcus Colonias circulares
Crema
0isa
0iso
,
Poco
Colonias circulares
Blanco
0isa
0iso
,
(o
Candida albicans
0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Por otro lado4 para reali+ar el e7amen microscópico4 se empleó tinción Gram4 e7amen al fresco4 y e7amen al fresco de c8psula* 0a tinción Gram permite mayor claridad en el e7amen de las levaduras* 0os resultados de la tinción Gram se presentan en la abla 4 los de e7amen al fresco en la abla !4 y los de e7amen al fresco de c8psula en la abla !!* Tabla . inción Gram
%specie Cryptococcus Rhodotorula Candida albicans
.finidad tintorial ,afranina Cristal violeta Cristal violeta
Forma /edonda "voide "voide
0as muestras fueron observadas mediante microscopa de lu+4 con un aumento de 217*
Tabla I. %7amen al fresco
%specie Cryptococcus
Caractersticas Células de forma redonda
0as muestras fueron observadas mediante microscopa de lu+4 con un aumento de 217* Tabla II. %7amen al fresco de c8psula
%specie Cryptococcus
Caractersticas %sporas a+ules oscuras4 en distintos planos
0as muestras fueron observadas mediante microscopa de lu+4 con un aumento de #117*
Mor'olo+,a de /on+os 'ilamentosos
Para determinar la morfologa de los hongos filamentosos4 se reali+ó un e7amen macroscópico4 cuyos resultados se presentan la abla !!!* Tabla III. Caractersticas macroscópicas de hongos filamentosos
%specie
Color ansverso
Color reverso
(egro
Blan3uecino Pulverulenta
Penicillium notatum
erde
.marillo
.terciopelada 5ansverso corrugado6
Mucor
Blanco
Crema
.lgodonosa
Aspergillus niger
,uperficie
0as muestras fueron observadas directamente4 sin aumento*
Para poder tener una apro7imación a la identidad del hongo mediante las estructuras 3ue contienen las esporas4 se reali+ó un e7amen microscópico4 cuyos resultados se presentan en la abla !* Tabla I*. %7amen al fresco de hongo filamentoso
%specie Penicillium notatum
Caractersticas Presencia de conidias4 conidióforos y fi8lides
0as muestras fueron observadas mediante microscopa de lu+4 con un aumento de #117*
0iscusión
0os resultados obtenidos en cuanto a la identificación de bacterias Gram 5&64 dan cuenta de una mayor precisión en la obtención de la identidad por parte de la batera bio3umica 5abla !!!64 en comparación con el sistema .P! #1,4 lo 3ue era de esperar4 ya 3ue .P! #1, tiene un enfo3ue m8s amplio 5:64 lo 3ue implica 3ue al identificar una mayor cantidad de bacterias4 e7iste una mayor probabilidad de 3ue se usen pruebas 3ue no sean tan atingentes a enterobacterias4 lo 3ue llevara a 3ue puedan haber errores en alguna prueba 3ue no sean tan importantes4 pero 3ue disminuyan de igual manera la compatibilidad* .dem8s4 al emplear el método .P! #1,4 se ha reportado error de identificación en ' de '? cepas de E. coli probadas 5'16* %n cuanto a los dos resultados divergentes 3ue hubo en el método de batera bio3umica 5abla !64 3ue correspondieron a agar manitol y caldo corriente con reactivo de Eovacs4 lo 3ue se puede deber a una mala e9ecución de las pruebas* %n la sección de genética microbiana4 con respecto a la observación de placas de lisis 5abla !64 se tiene 3ue los resultados coinciden con lo esperado4 ya 3ue en la muestra de placas de lisis de A$4 fago lisogénico4 se encuentran colonias y una ba9a cantidad de placas de lisis4 lo 3ue implicara 3ue la muerte bacteriana no es responsabilidad directa del virus4 ya 3ue hay colonias4 mientras 3ue en la muestra de P''4 fago ltico 5'#64 no se encuentran colonias y hay abundantes placas de lisis4 lo 3ue permite inferir 3ue el virus est8 destruyendo las bacterias* %n la sección de metabolismo bacteriano 5abla 64 se tiene 3ue e7iste una predominancia de colonias oscuras4 3ue son signo de 3ue hubo lisis4 ya 3ue ésta acidifica el medio4 provocando la oscuridad de las colonias 5''6* ,in embargo4 hubo una pe3ueHa cantidad de colonias claras4 en la placa con el fago A$4 lo 3ue implica 3ue no e7iste lisis en esas colonias* .un3ue se esperara 3ue en la placa del fago A$ hubiese habido predominancia de colonias claras4 esto se puede e7plicar por el tiempo 3ue pasó4 en el 3ue pudo haber ocurrido una lisis celular 3ue no fue causada por los fagos* Con respecto a la determinación de la concentración de fagos4 esta no se pudo determinar4 ya 3ue no se formaron placas de lisis4 lo 3ue se puede deber a 3ue la concentración del fago haya sido muy ba9a4 a 3ue haya habido muerte de la bacteria debido a 3ue no se disminuyó lo suficiente la temperatura del agar blando4 o a un error en las diluciones* %n cuanto a la movili+ación de pl8smidos por con9ugación 5abla !64 se obtuvo crecimiento cuando se sembraron ambas bacterias 9untas4 lo 3ue es de esperar en el caso de 3ue e7ista con9ugación4 ya 3ue ambas bacterias se transferir8n los genes de resistencia 3ue necesitan recprocamente* ,in embargo4 hubo crecimiento de Salmonella typhimurium sola4 lo 3ue se podra deber a 3ue
esa cepa se haya contaminado con una bacteria 3ue tuviera resistencia4 y por con9ugación4 esta bacteria le hubiese transferido genes de resistencia* %n cuanto a la transducción de pl8smidos 5abla !!64 se apreció tinción rosa en las colonias4 lo 3ue es signo de 3ue hubo transducción del fago P''Cherry* %n la sección de mutagénesis 5abla !!!6 se notó crecimiento bacteriano4 lo 3ue sugiere 3ue hubo una gran tasa de transposición de genes4 3ue eventualmente otorgaron a Salmonella typhimurium resistencia a =anamicina* .dem8s4 el menor crecimiento al sembrar en +ig+ag4 se puede deber a 3ue en ese método4 las concentraciones son muy ba9as4 disminuyendo la cantidad4 y por tanto4 actividad de los fagos 5':6* Por Lltimo4 con respecto a la morfologa de hongos4 todos los resultados coincidieron con lo esperado4 y la e7istencia de conidióforos4 conidias y fi8lides confirmaron 3ue el hongo 3ue se e7aminó al fresco fue Penicillium 5abla !6* ,in embargo4 se notó un marcado aumento en la claridad de la tinción Gram en levaduras4 lo 3ue se debe a su alto contenido de glicoprotenas4 en comparación con hongos filamentosos 5'26*
1onclusión
%n función de los resultados obtenidos4 se puede afirmar 3ue la identificación de una bacteria se puede reali+ar tanto por medio de la batera bio3umica convencional4 como de sistemas estandari+ados como .P! #1,4 pero dentro de estos dos4 es m8s precisa la batera bio3umica4 con el costo de reali+ar un proceso m8s engorroso en comparación con .P! #1,* .dem8s4 se puede concluir 3ue en Salmonella typhimurium4 ba9o las condiciones adecuadas4 pueden ocurrir los procesos de variabilidad genómica de con9ugación4 transducción generali+ada y transposición de genes* %n cuanto a la morfologa de los hongos4 se tiene 3ue un e7amen macroscópico permite distinguir levaduras de hongos filamentosos4 mientras 3ue el e7amen microscópico permite identificar la especie fLngica* . modo de resumen4 a partir de las e7periencias reali+adas se pudo verificar la utilidad e importancia de los procedimientos pr8cticos reali+ados en microbiologa4 teniendo como e9emplo de esto a la identificación de bacterias u hongos4 en cuanto al diagnóstico de una enfermedad4 o a la variabilidad del genoma bacteriano4 a fin de entender la progresión de enfermedades infecciosas4 en donde estos mecanismos incrementan la resistencia del microorganismo*
2iblio+ra',a
#* OBiology of Microorganisms* Madigan4 M*4 Martin=o4 -*M4 ,tahl4 D*. y Clar=4 D*P4 #: a edición4 Mc GraI&Aill4 '1#'4 p8g '* '* /eferencia #4 p8g* :'&:: :* OMicrobiology 0aboratory heory and .pplication4 Brief %ditionQ 0aboffe4 M*-4 Pierce4 B*%4 ' a edición4 Morton Publishing4 '1#'4 p8g 2>$* 2* /eferencia #4 p8g* '>: $* /eferencia #4 p8g* '>> <* /eferencia #4 p8g* '?< >* /eferencia #4 p8g* >>' ?* /eferencia #4 p8g* >># @* O!ntroducción a la microbiologa* ortora G* -4 Fun=e4 B* /4 Case4 C* 04 @ a edición4 %ditorial Médica Panamericana4 '11>4 p8g '2$ #1* OMicrobiology for the .nalytical Chemist* Dart4 /*E4 # a edición4 /oyal ,ociety of Chemistry4 #@@<4 p8g* @$ ##* OMicrobiology) an introduction* ortora G* -4 Fun=e4 B* /4 Case4 C* 04 ## a edición4 Pearson4 '1#:4 p8g 2 #'*/eferencia ?4 p8g* ::$ #:*O/hodotorula infection* . systematic revieI of #'? cases from literature4 uon4 F* F y cols* /ev !beroam Micol4 '11?4 p8g* #:< #2* OMucor dimorphism4 "rloIs=i M4 Microbiol /ev4 #@@# #$* OGua de traba9os pr8cticos) Biologa de los microorganismos 5B!"#$#%6* ,egundo semestre '1#24 p8g* <: #<*/eferencia #'4 p8g* 1 #>*/eferencia #'4 p8g* >2&>$ #?*/eferencia #'4 p8g* <2 #@*/eferencia :4 p8g* :>> '1*O.P! ,ystem) a Multitube Micromethod for !dentification of %nterobacteriaceae4 ,mith4 P*B y cols* .pplied microbiology4 #@>'4 p8g* 2$# '#*Ohe Bacteriophages4 Calendar4 /4 ' a edición4 "7ford University Press4 '11<4 p8g* 2$> ''*OCuring bacterial cells of lysogenic viruses by using ucb indicator plates4 Bochner4 B*/4 Biotechni3ues4 #@?2 ':* O0ytic GroIth of Phage P'' in ,almonella yphi ersus ,almonella yphimurium4 Aund4 .*/4 # a edición4 University of !llinois at Urbana& Champaign4 #@@<4 p* #<* '2* O0a pared celular de los hongos4 y el mecanismo de acción de la anidulafungina4 Pontón4 -4 /ev* !beroam Micol '11?4 volumen '$4 p8g* >@*
