Pontificia Universidad Católica de Chile Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Genética Molecular y Microbiología Biología de Microorganismos BIO 151E sc2
Informe n°2: Prácticas sobre métodos de identificación bioquímica, genética molecular bacteriana, levaduras y hongos filamentosos
Nombre alumno: Profesores: Dras. Jefe de ayudantes: Ayudante: Ayudante: Fecha de entrega:
Felipe Del Valle Batalla. Beatriz Díez y Carolina Serrano. Daniela Ruiz. Isidora Suazo. Suazo. 5 de Noviembre de 2014.
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Introducción y objetivos La identificación de bacterias Gram negativas en el laboratorio de microbiología puede realizarse con tests adecuados para estos propósitos como son los de la batería de identific ación bioquímica convencional o la prueba API 10S (1). Ambos tests se basan en reacciones químicas que entregan como resultado cambios en el medio donde son realizadas las mediciones. Los cambios apreciables pueden ser tales como producción de algún color específico, presencia de burbujas, turbidez del medio y otros parámetros que varían con respecto a la condición inicial debido al microorganismo (M.O.) que se esté sometiendo a la prueba (2). La batería bioquímica convencional consiste en 11 diferentes pruebas organizadas en tubos de ensayo con medios sólidos y líquidos (3). Según distintos aspectos se revelan cualidades intrínsecas del microorganismo o la muestra a analizar, que en este caso se trató de una muestra problema de carácter Gram negativo proporcionada por los ayudantes. El sistema de identificación API 10S que se emplea para enterobacterias y otros M.O. del tipo Gram negativos consiste en 11 pruebas (1) dispuestas en microtubos que de manera análoga a la batería bioquímica convencional muestran cambios luego de que son agregadas las muestras. No solo los M.O. del tipo Gram negativos son de interés en las prácticas de laborato rio realizadas, sino que también las partículas virales y su relación con distintas especies de M.O. son motivo de análisis en cuanto a los procesos relacionados con la genética molecular bacteriana. Los procesos de transferencia genética (4) entre dos M.O. tienen como propósito el beneficio para uno de los individuos tales como factores de resistencia a antibióticos o virulencia, que sirven para adaptaciones a nuevos ambientes. Dentro de las maneras en las que puede transferirse información genética entre dos bacterias están los procesos de conjugación, transformación y transducción (5). Otro proceso importante es el de la transposición genómica (6). La conjugación consiste en la transferencia de algún elemento móvil genético desde una bacteria hacia otra mediante un mecanismo de contacto directo entre estas dos. La conjugación es un proceso que requiere de una célula dadora que tiene un tipo especial de plásmido conjugativo y una célula que no lo posee (7). Este contacto directo se efectúa mediante el oganelo de la bacteria dadora que recibe el nombre de Pili sexual que al hacer contacto con la bacteria receptora se retrae permitiendo la formación de un puente entre ambas y resultando esto en una transferencia del plásmido conjugativo (7). La transducción (8) ocurre mediante la intermisión de un fago que se encarga normalmente de escindir el DNA de la bacteria donante y que luego almacena en su propia estruct ura de la cabeza. Este fago puede ser residente de la bacteria hasta en un ciclo llamado lítico y salir de ella mediante la lisis en el ciclo lisogénico e infectar otra bacteria a la cual podrá donar la sección de DNA bacteriano que obtuvo desde la bacteria donante. La transformación es un proceso en el cual la bacteria, resumidamente, adquiere el material genético desde el exterior celular mediante su incorporación por poros especializados presentes en ella. El proceso de transformación fue evidenciado y caracterizado por Griffith en S. pneumoniae en 1928 (9). La transposición es el movimiento de ciertos elementos del genoma a otras secciones de éste mediante la asistencia de transposones.
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El estudio de los organismos pertenecientes al reino Fungi también es parte de las prácticas del laboratorio de microbiología, por lo que es importante poder notar las diferencias morfológicas generales y microscópicas que existen entre distintos tipos de microorganismos de este reino. En particular la subdivisión más importante se establece entre los hongos filamentosos y las levaduras (10). Los primeros presentan ramificaciones y estas pueden ser del tipo septado o sifonado si es que tienen subdivisiones internas o no (11). Estas ramificaciones dan origen a las estructuras de reproducción del hongo en cuestión y por lo general las colonias se presentan visualmente como algodonosas. Las levaduras son más similares en su forma de colonia a la de las bacterias, y su tipo de reproducción es asexual por yemación (12). Algunos integrantes del reino Fungi son patógenos u oportunistas, mientras que otros pueden ser contaminantes ambientales. La importancia de algunos hongos es notable, como el caso del filamentoso Penicillium notatum (P. notatum) de donde se obtiene la penicilina, o la levadura Sacharomiyces cerevisiae (S. cerevisiae) que es usado como cepa cervecera y panadera (13). Los objetivos propuestos para los prácticos realizados son: 1.- Reconocer e identificar una muestra problema entregada con el método de la batería bioquímica convencional y el test API 10S 2.- Lograr evidenciar satisfactoriamente alguno de los tipos de adquisición de material genético en bacterias. 3.- Describir y discriminar tipos de hongos filamentosos y levaduras a partir de observaciones macroscópicas y microscópicas.
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Materiales y métodos Los materiales y métodos a continuación se detallan de acuerdo al práctico que correspondan de manera correlativa.
Práctico (anexo) 3: “Identificación mediante batería bioquímica convencional y sistema API 10S” Materiales y reactivos: - Mechero bunsen. - Puntas de plástico. - Asas de platino. - Pipetas Pasteur. - Muestra problema n° 8. - Gotario. - Batería bioquímica de identificación convencional. - Test API 10S. - Indicador azul de bromotimol. - Reactivo de Kovacs. - Indicador Alfa Naftol. - Reactivo TDA. - Suero fisiológico. - Reactivo de James, NIT 1 y NIT 2. - KOH al 40%. - Aceite de parafina. - Reactivo oxidable.
Métodos: 1) Se realizó la inoculación de la muestra problema n° 8 a la batería bioquímica convencional siguiendo las instrucciones como aparecen en la guía de trabajos prácticos (14). Se puso especial cuidado en la siembra de medios semitendido realizándola en profundidad y luego zigzagueando la superficie. Se dejó incubar y en el siguiente práctico (n°4) se añadieron los reactivos e indicadores correspondientes, finalmente se anotaron los resultados de las reacciones de acuerdo a la tabla disponible en la guía de trabajos prácticos (15). 2) Se llenaron los microtubos de la prueba API 10S con la suspensión bacteriana correspondiente a la muestra problema n° 8, posteriormente se incubó. En el siguiente práctico (n°4) se siguieron las instrucciones de la guía de trabajos prácticos (14) al momento de agregar reactivos e indicadores correspondientes. Finalmente se anotaron los resultados de las reacciones de acuerdo a las descripciones de las disponibles en la guía de trabajos prácticos (14) y todo el test API 10S fue interpretado por un software computacional que determinó el M.O. que se encontraba en la muestra problema n° 8.
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Práctico 4: “Genética molecular bacteriana” Materiales y reactivos: - Mechero bunsen. - Cultivo de cepa de Salmonella entérica (WT) (S. entérica WT). - Lisados de fago transductor P22 de cepas 14028/Cherry y MST1063 - Placas con agar Luria (LB), Luria Kanamicina-Ampicilina, Luria ampicilina. - Placa de agar McConkey Kanamicina. - Cepa E. coli CC1000 y Salmonella 2C - Puntas de plástico. - Placas verdes. - Agar blando LB. - Rastrillo de siembra. - Tubos eppendorff. - Estufa. - Placas con lisados de fago P22 y H5.
Métodos: 1) Se observó las placas de lisis proporcionadas y se anotó las diferencias que se apreciaban entre ellas a escala macroscópica. 2) Se utilizó una punta plástica para sembrar los fagos P22 y H5 en placas verdes según la guía de procedimientos de laboratorio (16). Se enviaron a incubar y en el siguiente práctico (n°5) se anotaron las diferencias observables. 3) Se siguieron las indicaciones según la guía de laboratorio (16) para realizar la mezcla de fago con la S. entérica WT . Se envió a incubar el tubo eppendorff y luego se realizó una siembra en agar LB utilizando el rastrillo de siembra. En el posterior práctico (n°5) se observó la lisis en las placas. 4) Siguiendo los pasos de la guía de trabajos prácticos (17), se realizó la movilización de plasmidios por conjugación. Hubo un cambio con respecto a la guía y es que se agregó toda la muestra de E. coli. En el práctico siguiente (17) se observó lo ocurrido y se describió. 5) Se siguieron las instrucciones de la guía (17) para la práctica sobre transducción de plásmidos y los resultados fueron descritos y anotados en el práctico siguiente (n°5). 6) Siguiendo las instrucciones de la guía de laboratorio (17) se realizó la siembra con fagos y S. entérica WT y en el práctico n°5 se analizaron los resultados de este procedimiento, describiendo sus características.
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Práctico 5: “Levaduras y hongos filamentosos” Materiales y reactivos: - Mechero bunsen - Asa de platino. - Set regular para tinción Gram. - Microscopio. - Portaobjetos y cubreobjetos. - Aceite de inmersión. - Azul de lactofenol. - Pinzas. - Tinta china. - Cultivos de Rhodotorula, Cryptococcus neoformans, Aspergillus niger, Mucor, Candida albicans (C. albicans) y P. notatum.
Métodos: 1) Se realizaron observaciones macroscópicas de los cultivos disponibles (Hongos filamentosos y levaduras) y luego se anotaron según la clasificación disponible en la guía de trabajos prácticos (18). 2) Se efectuó una tinción de Gram según los pasos de la guía de trabajos prácticos (19) sobre un frotis de C. albicans. Se observó y describió su morfología microscópica según la clasificación de la guía (18). Luego, con la misma levadura se realizó un examen al fresco como se indica en la guía (19) y se anotaron las características microscópicas observables. El último procedimiento para las levaduras se trató del examen al fresco de cápsula que se realizó con Cryptococcus siguiendo los pasos de la guía de trabajos prácticos, anotando luego la morfología microscópica apreciable. 3) Para los hongos filamentosos y su descripción microscópica se hizo un examen al fresco como se detalla en la guía de trabajos prácticos (18) y posteriormente se anotaron las características más notables haciendo énfasis en aquellas que tenían que ver con las estructuras que contienen las esporas.
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Resultados Los resultados para el práctico anexo 3 de análisis mediante la batería bioquímica convencional se encuentran resumidos en la siguiente tabla. Tabla 1: Resultados para batería bioquímica convencional para M.O. aplicado a la muestra problema 8 .
Medio
Resultado
Observación Hay gas atrapado en la campana.
Caldo glucosado en campana
+
Agar manitol Agar citrato Caldo urea
+ +
Cultivo de color amarillento. No se aprecia crecimiento. Coloración fucsia del medio.
Caldo corriente
-
Posterior a la adición del reactivo de Kovacs se aprecia que no hay reacción y se mantiene un color amarilloanaranjado.
Caldo Voges-Proskauer Tubo 1
-
Luego de agregar los reactivos, el color permanece café bastante oscuro.
Caldo Voges-Proskauer Tubo 2
-
Al agregar gota de reactivo, comienza a aparecer un color anaranjado.
Agar corriente
-
Agar TSI Agar LIA - Desaminación de la Lisina
+ -
La cepa no presenta ningún tipo de pigmentación. El tubo es completamente amarillo. No se produjo reacción.
Agar LIA - Descarboxilación de la Lisina
+
Se presenta un color morado intenso en tendido y profundidad.
Agar MIO
-
Producción de H 2S
-
No se observa motilidad de la bacteria alrededor de la picadura. No se aprecia reacción.
Observaciones macroscópicas de resultados para la batería bioquímica (+: positivo, - : negativo).
En la siguiente tabla se detallan los 3 M.O. más relacionados a los resultados de batería de pruebas bioquímicas del práctico anexo 3. Tabla 2: Identidad entre M.O. posibles y mu estra problema n°8.
Máximo Puntaje Porcentaje de M.O. puntaje (PM) obtenido (PO) identidad K. pneumoniae 13 10 76,90% Citrobacter freundii 13 9 69,23% Enterobacter aerogenes 13 8 61,53%
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Para la tabla anterior ( Tabla 2) se asignó 1 punto por coincidencia con la guía y 0 si no había relación. El porcentaje de identidad se calculó como PO/PM.
Para el test API 10S correspondiente al anexo del práctico 3 aplicado a la muestra problema 8, los resultados fueron los siguientes. Tabla 3: Resultados del test API 10S para muestra p roblema 8. Te st
Nume raci ón
Re acci ón
ONPG
1
+
GLU
2
+
ARA
4
+
LDC
1
+
ODC
2
-
CIT
4
+
H2S
1
-
URE
2
+
TDA
4
-
IND
1
-
OX
2
-
NO2
4
-
Total
Ide nti dad
Certeza
K. pneumoniae 96,70% 7
5
2
0
Se presentan los resultados para cada una de las pruebas (+: positivo, - : negativo) y además se indica el porcentaje de certeza que otorga el análisis computacional del test junto con el M.O. de mayor similitud.
Las descripciones de placas de lisis del práctico n° 4 se detallan en la siguiente tabla. Tabla 4: Observaciones sobre placas de lisis con fagos P22 y H5.
Fago
Observaciones
P22
Presencia de espacios circulares translucidos. Círculos irregulares y pequeños.
H5
Son círculos grandes e irregulares con una argolla a su alrededor.
Observaciones macroscópicas que se realizaron sobre las placas de lisis entregadas por los a yudantes.
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Las observaciones para las siembras en placa verde de fagos del práctico n° 4 luego de su cultivo se detalla en la siguiente tabla. Tabla 5: Observaciones macroscópicas sobre fagos en placas verdes.
Fago
Observaciones Colonias oscurecidas y no se aprecia
P22 en placa verde
desarrollo e n el zigzagueo realizado. Colonias oscurecidas y no se aprecia desarrollo en el zigzagueo Colonias oscurecidas, sin embargo presentan coloración más clara que placa verde
H5 en placa verde
con p22
Se anotaron las observaciones examinando las placas a contraluz y de forma completa luego de su incubación.
Para la concentración de fagos se utilizó la formación de placas de lisis por los fagos del práctico n° 4 y su observación se detalla en la siguiente tabla. Tabla 6: Observaciones sobre placas de lisis por fagos sembrados.
Placas de lisis 0
Concentración del fago Desconocida
Observaciones Color opaco, no hubo crecimiento del fago.
La observación fue de carácter macroscópico y el 0 corresponde a que no se evidencia lisis en la placa.
En las siguientes tablas se detalla lo observado para las placas con antibióticos y sus correspondientes siembras del práctico n° 4. Tabla 7: movilización plasmidos por conjugación.
Placa Placa LB Kanamicina-Ampicilina 3 cuadrantes Placa LB Kanamicina-Ampicilina en todo volumen
Observaciones Creció sólo Salmonella 2C No se observa crecimiento de ningún M.O.
La observación macroscópica se realizó tomando en cuenta todos los ángulos de la placa. Tabla 8: transducción de plasmidos.
Placa Siembra zig-zag LB Ampicilina Siembra césped LB Ampicilina en todo volumen
Observaciones Punto rosado-amarillo y no hubo crecimiento de todo el cultivo. No hubo crecimiento de ningún M.O.
La observación macroscópica se realizó tomando en cuenta todos los ángulos de la placa.
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Tabla 9: Mutagénesis usando fagos como transposones.
Placa
Observaciones
McConkey – Kanamicina en zigzag
Crecimiento de colonia rosada de Salmonella WT No hubo crecimiento de ningún M.O.
McConkey – Kanamicina en césped todo volumen
La observación macroscópica se realizó tomando en cuenta todos los ángulos de la placa.
En las tablas a continuación se detallan las características macroscópicas observadas para los distintos cultivos de hongos y levaduras del práctico n° 5. Tabla 10: Observaciones macroscópicas para levaduras.
Hongo
Forma
Elevación
Borde
Superficie
Otros
C. albicans
Circular
Liso
Liso
C. neoformans
Circular
Levantadaconvexa Pulvinada
Liso
Liso
Rhodotorula
Circular
Pulvinada
Liso
Liso
Color lechoso Color lechoso Color rosado
Se realizó el análisis macroscópico inspeccionando la placa por completo y a contraluz. Tabla 11: Observaciones macroscópicas para hongos filamentosos
Hongo Mucor
Características macroscópicas Algodonado, opaco con fibras brillantes. Presenta color lechoso y crecimiento en toda la placa llenándola de fibras.
Aspergillus niger
La base del hongo presenta un relieve irregular. En la parte superior de la placa se aprecian pelos de coloración negra, estando algunos pegados a la base.
P. notatum
En su base presenta mucho relieve, en forma de pétalos de flor. En la superficie de la placa se puede apreciar bordes blancos y zona céntrica de color verde azulado con algunas estrías.
Se realizó el análisis macroscópico inspeccionando la placa por completo y a contraluz.
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En las siguientes tablas se detallan las observaciones microscópicas de levaduras y hongos filamentosos correspondientes al práctico n°5. Tabla 12: Evaluación microscópica de levaduras con tinción Gram
Organismo sometido a tinción Gram C. albicans
Rhodotorula
C. neoformans
Observaciones Agrupaciones celulares en racimo que presentan una coloración violeta y en general cada unidad es de tamaño similar. Se aprecian más separadas y en agrupaciones pequeñas en comparación a la C. albicans. Su coloración es rojiza. Hay gran presencia y no se puede distinguir una agrupación en algún patrón específico, todas tienen tamaños similares y aparecen de color violeta.
Se realizó una tinción Gram y luego se observó con objetivo 100x en inmersión. Tabla 13: Observaciones microscópicas de levaduras con examen al fresco
Organismo sometido a examen al fresco C. albicans
Rhodotorula
C. neoformans
Observaciones Abundante presencia y no se aprecia un patrón marcado. Son blancas en relación al fondo azul del marcaje. Son unidades pequeñas y abundantes, un poco más opacas en comparación a C. albicans y el fondo azulado. Unidades similares sin agrupación particular más que un desorden aleatorio. Son de color verdoso en comparación con el fondo azulado.
Se realizó el examen al fresco con azul de lactofenol y luego se observó con objetivo 40x.
Tabla 14: Examen al fresco de cápsula de C. neoformans.
Organismo C. neoformans
Observaciones En general se nota una agrupación de cocos y diplococos y es evidente la presencia de una cápsula central en cada unidad. No se reconoce otro patrón de agrupación mayor que no sea racimo.
El examen al fresco se realizó con tinta china y se observó con objetivo 40x.
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En la siguiente tabla se detallan las observaciones de importancia para reconocer estructuras que producen esporas en los hongos filamentosos disponibles del práctico n°5.
Tabla 15: Examen al fresco de hongos para identificación de estructuras que producen esporas.
M.O. sometido a examen Mucor
A. niger
P. notatum
Observaciones Se nota una estructura filamentosa sifonada pues no presenta tabiques en las ramificaciones. También es posible identificar el esporangióforo con su correspondiente esporangio notoriamente más oscuro que el cuerpo del hongo. Se observa la estructura separada de las ramificaciones en forma de tabique, además se aprecia la cabeza aspergilar más oscura conectada al resto del cuerpo del hongo mediante el conidióforo. Se aprecia la estructura separada mediante tabiques dentro de los filamentos del hongo, que a través de otra subdivisión con el conidióforo dan origen a los conidios que muestran ramificaciones más pequeñas.
Las observaciones se realizaron bajo microscopio con objetivo de 40x.
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Discusión Con respecto a la parte del práctico anexo 3, partiendo de la base que el M.O. de la muestra problema 8 pudiese ser K. pneumoniae de acuerdo a los resultados mostrados en las tablas 2 y 3 se puede afirmar sobre la batería bioquímica convencional que para el test de glucosa presenta un resultado positivo ya que este M.O. es capaz de fermentar glucosa (20) y en su proceso hay formación de gas. De manera análoga, la K. pneumoniae es capaz de fermentar el manitol (20) en el medio de cultivo del agar dando un resultado positivo a esta prueba. Con respecto a la prueba del citrato, también el resultado es positivo pues K. pneumoniae es efectivamente capaz de utilizarlo como única fuente de carbono (20) en el tipo de agar en que se cultivó. En cuanto a la prueba del caldo urea, esta dio positivo pero es posible que diera este resultado porque la K. pneumoniae es considerada como positivo débil (21) o negativo para esta prueba y se hace cada vez más positiva a medida que pasa el tiempo, como en este caso que la incubación fue de dos semanas. En cuanto a la prueba del caldo corriente utilizando reactivo de Kovacs, donde se obtuvo un resultado negativo, concuerda con el comportamiento de la K. pneumoniae pues esta no es capaz de producir Indol (20) a partir del triptófano. Para la prueba de Voges-Proskauer si bien se considera esta prueba ideal para separar E.coli de K. pneumoniae cuando se trata de un cultivo puro como el de la muestra problema se puede afirmar que al ser negativo solo estaría siendo parte de una de estas dos bacterias, es decir, del género Klebsiella y específicamente en este caso de K. pneumoniae subesp. Ozaenae (22). Sobre la prueba en agar corriente de pigmentación donde no se presenta resultado, esto debido a que morfológicamente este tipo de M.O. no presenta pigmentación o presenta muy poca (23) en agar normal. En relación a la respuesta presentada en el agar TSI, se puede afirmar que el resultado positivo se debe a que K. pneumoniae es capaz de fermentar los tres azúcares (24) que se contienen en la prueba dando como resultado el viraje amarillo-amarillo de la superficie y la profundidad. En cuanto a la Descarboxilación de la lisina, que da resultado positivo en el agar LIA se condice con el comportamiento de K.pneumoniae (25). En relación a la motilidad de la bacteria, que no es apreciada en el agar MIO se puede decir que también coincide con lo documentado en K. pneumoniae (26). Por último, la producción de H 2S es negativa tal como lo sería para un tipo de bacteria K. pneumoniae (27). Con respecto a las pruebas realizadas en el test API 10S cuyos resultados se encuentran en la Tabla 3, se puede discutir lo siguiente en relación a las pruebas que no se consideran en la batería bioquímica convencional. El test de ONPG da resultado negativo y esto demostraría que la bacteria no es capaz de producir la enzima β-galactosidasa, hecho que concuerda con las características de K. pneumoniae (28). En cuanto a los tests de GLU y ARA, estos dan positivo ya que la K. pneumoniae puede efectivamente fermentar/oxidar la glucosa y la arabinosa (29). El test LDC presenta un resultado positivo y el ODC presenta resultado negativo que se relaciona completamente con el metabolismo de la K. pneumoniae ya que esta en todo su género excepto K. mobilis, puede producir lisina descarboxilasa pero no ornitina descarboxilasa (30).
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Los tests de CIT y H2S dan resultado positivo y negativo respectivamente ya que K. pneumoniae si puede utilizar el citrato como única fuente de carbono (20) y no puede producir H2S (27). La prueba para URE es positiva aunque K. pneumoniae se considera como un productor de ureasa bastante débil (31), esto podría deberse a que se trate de una subespecie o cepa particular que sea capaz de producir esta enzima en mayores cantidades. El test de IND es el único que no se condice con el comportamiento de la K. pneumoniae, que debería ser positivo (32) pero da negativo porque pudo haber un problema con la utilización del reactivo de james al interpretar mal la reacción. Cabe destacar que también la muestra 8 es la más relacionada en la batería convencional con un porcentaje de certeza de identidad de un 79,60%, que junto con el 96,70% otorgado por el API 10S dan seguridad para afirmar que ésta se trataría de K. pneumoniae. En cuanto a los resultados obtenidos para el práctico n°4 se pueden analizar las tablas y explicar lo ocurrido de la siguiente manera. Para la Tabla 4 se puede afirmar que la presencia de espacios circulares translúcidos se debe a que el fago P22 es capaz de inducir el ciclo lítico en el M.O. presente en la placa que debería ser S. typhimurium sufriendo un proceso de transducción generalizada (33). Lo anterior hace suponer que el fago H5 no sería del tipo lítico pues su efecto debe haber sido más lento por el menor grado de lisis presente en la placa dando razón a que este es un fago producto de una mutación en el fago P22 que le confiere la capacidad de ser lisogénico (34). Sobre la Tabla 5 es posible discutir que la poca diferencia entre las placas verdes en cuanto a la opacidad del zigzagueo se podría deber a que el tiempo que transcurrió desde que se cultivaron las placas hasta que se examinaron fue suficiente para que los ciclos de ambos fagos (P22, lítico y H5, lisogénico) (34) alcanzaran niveles de lisis similares y no se pudiese encontrar diferencias significativas reflejadas en la opacidad entre ellos. La discusión sobre los resultados de la Tabla 6 radica en que la ausencia de cultivo puede deberse principalmente a una falla de operación en el momento de la siembra del agar que no haya permitido el proceso de lisis y por lo tanto no se pudiera efectuar algún tipo de conteo de fagos. Esta falla podría haber sido el hecho de mezclar el agar que se encontraba a 70°C con el fago que tiene una temperatura óptima de 37°C (35) constituyendo en una destrucción de éste. Sobre la Tabla 7 es necesario recalcar que solo creció Salmonella 2C y en la placa con todo el volumen no creció nada, esto sugiere que probablemente haya habido contaminación (36) del agar (pues ocurrió en la mayoría de los grupos) o simplemente éste no contenía los antibióticos, de la misma manera se puede decir que la ausencia del antibiótico hace que se pueda apreciar el resultado de una posible conjugación.
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Con respecto a la Tabla 8 se puede inferir que la siembra en césped no fue satisfactoria probablemente por un error de operación, pero la que se realizó en zigzag muestra una mancha que da coloración Cherry correspondiente a una satisfactoria transmisión del gen de resistencia a la ampicilina, que en este caso está mediado por el plásmido pUC8 (37). Para la Tabla 9 cabe discutir que nuevamente en césped no hubo crecimiento probablemente por algún error de operación en la siembra o en su cultivo (la placa estaba congelada), pero la que fue sembrada en zigzag muestra crecimiento de una colonia rosada de Salmonella WT porque no hubo transferencia del transposón que además se condice con que la Salmonella WT sea capaz de fermentar la lactosa en el agar McConkey (38). En relación a las observaciones realizadas en el práctico n°5 y resumidas en las Tablas 10 a 15 se pueden hacer las siguientes discusiones. Con respecto a la Tabla 10, las observaciones resultaron satisfactorias ya que los cultivos presentaban características macroscópicas evidentes aunque a veces estas coincidían lo que hace suponer que el método de diferenciación macroscópico (39) es muy rudimentario en cuanto a levaduras. Para la Tabla 11, se puede afirmar que las observaciones realizadas corresponden a un análisis satisfactorio pues coinciden con lo presupuestado para cada uno de los hongos filamentosos y su caracterización macroscópica (40) es más acertada en comparación a la de las levaduras. En cuanto a los resultados de las Tablas 12 y 13 conviene rescatar el uso de la tinción Gram para hongos en cuanto a su mejor visualización, haciéndolos parecer en su mayoría Gram positivos (41). El azul de lactofenol tiene como propósito hacer de medio de un contraste para poder tener una mejor perspectiva de los hongos (42). En la Tabla 14 se ve que la tinción de cápsula con tinta china permitió apreciar la cápsula (43) del C. neoformans de manera satisfactoria y sirvió como medio de contraste. Finalmente, en la Tabla 15 se pudieron apreciar los órganos productores de esporas de los M.O. P. notatum, Mucor y A. niger tal como se describen en la literatura (44) sin tener ningún tipo de problema.
Conclusiones Con respecto al objetivo 1: Se logró reconocer efectivamente la muestra problema entregada con un porcentaje de certeza de un máximo de 96,7% y mínimo de 76,90% mediante el test API 10S y la batería bioquímica convencional. La muestra problema n°8 correspondería a K. pneumoniae. Con respecto al objetivo 2: Se pudo apreciar efectivamente en ciertos casos la evidencia de adquisición de material genético en bacterias. Con respecto al objetivo 3: Se pudo evidenciar y describir todos los tipos de hongos y levaduras disponibles de manera efectiva y satisfactoria.
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Referencias bibliográficas 1) “Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica ”, MacFaddin J., 3° Ed., Ed. Panamericana, Año 2003, Pág. 194. 2) “Microbiología basada en la experimentación”, Gamazo, C., 2° Ed, Ed. Elsevier, Año 2013, Pág. 211. 3) “Guía de trabajos prácticos ”, Bueno S., Serrano C. y Diez B, 2014, Pág. 59. 4) “Genética molecular bacteriana”, Jiménez A., Guerrero R., 1° Ed , Ed. Reverté, Año1982, Pág. 99. 5) “Introducción a la microbiología”, Tortora G.J, Funke B.R y Case C.L, 9° Ed, Ed. Pearson, Año 2007, Pág. 244. 6) “Genética y genómica”, de Frutos, R. 1° Ed, Ed. Universitat de valenc ia, Año 2001, Pág. 22. 7) Ref. 2. Pág. 242. 8) Ref. 4. Pág. 143. 9) “Microbiología”, Stanier, R., 2° Ed., Ed. Reverté, Año 1992, Pág. 276 10) “Biología I con enfoque en competentes ”, Oñate, L., 1° Ed., Ed. Cengage. , Año 2010, Pág. 206. 11) Ref. 9 Pág. 578. 12) “Biología y botánica tomo II”, Santamarina M.P., 1° Ed., Ed. Universidad politécnica de Valencia, Año1997, pág. 102. 13) “Biotecnología alimentaria “, García, M., 5° Ed., Ed. Limusa, Año 2004, pág. 287. 14) Ref. 3. Pág. 58. 15) Ref. 3. Pág. 64. 16) Ref. 3. Pág. 68. 17) Ref. 3. Pág. 69. 18) Ref. 3. Págs. 33 – 35. 19) Ref. 3 Págs. 65-67. 20) “Manual de microbiología médica “, García, A., 4° Ed., Ed. UNAM, Año1998, Pág. 134. 21) Ref. 1. Pág. 401. 22) Ref. 1. Pág. 411. 23) “Clinical veterinary Microbiology”, Markey, B., 2° Ed., Ed. Mosvy – Elsevier, Año 2013, Pág. 271.
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24) “NCA Review for the Clinical Laboratory Sciences ”, Beck, S., 4° Ed., Ed. LWW, Año 2002, Pág.127. 25) “Koneman. Diagnostico Microbiologico” , Konemann, H., 6° Ed., Ed. Panamericana, Año 2006, Pág. 62. 26) “Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos”, Corrie, B., 1°Ed. Ed. Díaz de santos, Año 2002, Pág. 178. 27) “Técnico Especialista en Laboratori o Del Servicio Gallego de Salud volumen II”, Silva M., 1°Ed., Ed. Mad SL. , Año 2006, Pág. 139. 28) Ref. 1. Pág. 151. 29) Ref. 25. Pág. 251. 30) “The Prokaryotes: vol 6”, Dworkin, M., 3° Ed., Ed. Springer NY, Año 2006, Pág. 163. 31) “Introduction to Diagnostic Microbiology for the Laboratory Sciences ”, Dannessa, M., 1° Ed., Ed. J&B learning, 2014. Pág. 218. 32) Ref. 25. Pág. 222. 33) Ref. 9. Pág. 288. 34) Davis, R., D. Botstein, and J. Roth. Año 1980. Advanced Bacterial Genetics, p. 16-18. Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 35) Hoja de producto bacteriofago P22, ATCC, American Type Culture Collection PO Box 1549Manassas, VA 20108 USA. 36) Ref. 9. Pág. 18. 37) Genomas, Brown T., 3ª edición, Panamericana, Año 2008, Pág. 47. 38) “Bacteriología General: Principios y Prácticas de Laboratorio ”, Rodríguez, E., 3° Ed., Ed. Reverté, Año 2004, Pág. 134. 39) “Microbiología Clínica”, Prats, G., 1° Ed., Ed. Panamericana, Año 2007, Pág. 94. 40) “Introducción a la microbiología”, García, V., 2° Ed., Ed. EUNED, Año 2004, Pág. 86. 41) “Técnico especialista en laboratorio “, García, MJ., 1° Ed., Ed. Mad SL, Año 2006, Pág. 333. 42) Ref. 39 Pág. 93. 43) Manual del técnico superior de laboratorio de análisis clínicos, García M., Silva M., 1ª edición, Mad, 2004, Pág. 383. 44) Ref. 3. Pág 70.
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