UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA
INFORME Nº2 “RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA”
AUTORES:
Arenas Rodríguez, Rodríguez, Andrés Arturo. Arturo. Cárdenas Quijaite, Ingrid Yesenia. Céspedes Valenzuela, Gianfranco Antonio. Flores Huamán, Andrea Milagros. Monge Echevarría, Brenda.
ASIGNATURA:
Ingeniería de los procesos alimentarios. alimentarios.
DOCENTE:
Mg. Víctor Terry Calderón.
FECHA:
23 de abril de 2017.
LABORATORIO:
Grupo día martes – martes – Mesa Mesa 3.
2017
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
2017
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
Autores: Arenas Rodríguez, Andrés Arturo; Cárdenas Quijaite, Ingrid Yesenia; Céspedes Valenzuela, Gianfranco Antonio; Flores Huamán, Andrea Milagros. Monge, Echevarría, Brenda.
RESUMEN En el presente informe se detalla el estudio realizado para el reconocimiento de la enzima peroxidasa, su reacción con el peróxido de hidrógeno y con el guayacol y para poder conocer el tiempo necesario para la inactivación de esta enzima, que es una de las que cataliza reacciones de degradación en un alimento, siendo esta también una de las enzimas más resistentes al calor. En el ensayo se realizaron tratamientos preliminares para determinar cuál es la reacción entre los reactivos previamente mencionado. Para las pruebas se utilizó como muestra el extracto de rabanito. En el caso de la determinación del tiempo necesario para inactivar la enzima, el extracto fue sometido a un tratamiento térmico en agua caliente (100°C) y posteriormente se le añadieron los reactivos mencionados. El tiempo necesario fue de 180 segundos y esto se determinó cuando el tubo de ensayo no presentaba la coloración típica que indica la presencia de la enzima peroxidasa en una muestra.
Palabras clave: peroxidasa, guayacol, peróxido de hidrógeno, enzima, rabanito.
ABSTRACT This report details the study carried out for the recognition of the enzyme peroxidase, its reaction with hydrogen peroxide and guaiacol and to know the time required for the inactivation of this enzyme, which is one of those that catalyzes degradation reactions in Food, being also one of the enzymes more resistant to the heat. In the experiment, preliminary treatments were performed to determine the reaction between the previously mentioned reagents. For the tests, the extract of radish was used as sample. In the case of determining the time required to inactivate the enzyme, the extract was subjected to a heat treatment in hot water (100 ° C) and subsequently the mentioned reagents were added. The time required was 180 seconds and this was determined when the test tube did not show the typical staining indicating the presence of the enzyme peroxidase in a sample.
Keywords: peroxidase, guaiacol, hydrogen peroxide, enzyme, radish.
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
I.
INTRODUCCIÓN
El
deterioro
II.
causado
por
2017
OBJETIVO ESPECÍFICO:
Determinar
la
microorganismos es resultado de las
catalasa
peroxidasa
relaciones ecológicas entre el alimento y
rabanito mediante la actividad de
el microorganismo. Para poder predecirlo
reactivos.
y
controlarlo
hay
que
conocer
las
características del alimento como medio soporte
del
crecimiento
colonizan
habitualmente
III.
y
inactividad en
de el
FUNDAMENTO:
de
microorganismos y los microorganismos que
dicho
Existen dos sistemas enzimáticos que se utilizan como indicéis de la eficacia del proceso de inactivación enzimática; el de
alimento.
las peroxidasas y el de las catalasas. Las La actividad de una enzima se
peroxidasas
están
presentes
en
los
evalúa en función de la velocidad de la
tejidos de los vegetales y constituyen el
reacción. La cinética enzimática estudia
sistema enzimático más termo resistente
la velocidad de la reacción, los factores
y,
que la modifican y el mecanismo de la
térmicamente este sistema se garantiza
misma. Los factores fisicoquímicos que
la inactivación de otros sistemas que
modifican la actividad de la enzima son:
pudiesen estar presentes. La actividad de
concentración del sustrato, concentración
la peroxidasa es muy fácil de medir en
de la enzima, pH, temperatura, fuerza
forma cualitativa.
por
consiguiente,
al
inactivar
iónica, inhibidores.
IV. I.
MARCO TEÓRICO:
OBJETIVO: La conservación de los alimentos es una Analizar
algunos
factores
sobre
la
inciden enzimática
de
la
que
actividad catalasa
y
peroxidasa.
Establecer los métodos de control de los factores que originan el deterioro de los alimentos.
práctica que se remonta a los mismos orígenes de la humanidad, dado que desde siempre el hombre tuvo que conservar los alimentos para asegurar su supervivencia. La propia evolución del hombre como especie
está
ligada
a
sus
hábitos
alimentarios y, a su vez, el desarrollo intelectual y tecnológico de la humanidad
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
dio lugar a una evolución de las técnicas
Función
de conservación de los alimentos.
hortalizas
La conservación de los alimentos, o más
2017
de la catalasa en fruta y
La catalasa es una enzima común
genéricamente la Tecnología Alimentaria,
encontrada
es por ello un área del conocimiento en
donde funcionan como catalizadores en
permanente evolución cuyo objeto es
las reacciones de descomposición del
suministrar al consumidor alimentos cada
peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y
vez
oxígeno.
más
nutritivos,
apetecibles,
saludables y baratos
en los organismos vivos,
La catalasa tiene uno de los
La causa de las alteraciones de
recambios
más
de
diversos agentes que podríamos clasificar
podría convertir millones de moléculas de
genéricamente
peróxido de hidrógeno a agua y oxigeno
físicos,
químicos y biológicos:
catalasa
por segundos.
Función de la peroxidasa en fruta y
La catalasa es un tetrámero de
hortalizas
cuatro cadenas polipeptídicas, cada una
La peroxidasa pertenece al grupo de
de
las
enzimas.
Agentes
molécula
todas
los alimentos pueden ser debidas a
en:
Una
altos
oxidoreductasas.
Las
cuales
descomponen peróxido de hidrógeno en presencia de un donador de hidrógeno es una de las enzimas que controlan el crecimiento fisiológico de las plantas, su diferenciación
y
desarrollo.
Es
bien
larga
cadena
con
500
aminoácidos.
Contiene cuatro grupos hemo porfirinicos (hierro)
que
llevan
a
la
enzima
a
reaccionar con el peróxido de hidrógeno. El pH
óptimo
para la catalasa es
aproximadamente de 7, la temperatura varia por especie.
conocido, que esta enzima participa en la construcción y lignificación de la pared celular, la biosíntesis de etileno a partir del ácido 1- aminociclopropanocarboxílico y peróxido de hidrógeno (H2O2), la regulación
de
niveles
de
auxina,
la
protección contra el deterioro de tejidos e infección patógenos,
por la
indolacético, etc.
microorganismos oxidación
de
ácido Representación de la catalasa positiva y negativa
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
El escaldado
V.
El escaldado tiene distintos efectos sobre
2017
METODOLOGÍA: VI.I. MATERIALES:
los alimentos. La cantidad de calor que el alimento recibe durante el escaldado altera inevitablemente su valor nutritivo y sus características organolépticas. Por lo
MATERIALES Y EQUIPOS
general, la combinación de tiempo y temperatura utilizada para el escaldado
Vaso precipitado:
se
Material de laboratorio de vidrio que se utiliza para contener sustancias, disolverlas, atacarlas, calentarlas y en general cualquier cosa que no necesite una medida de precisión del volumen.
establece
como
solución
de
compromiso para que, reduciendo al mínimo volátiles
las
pérdidas
responsables
de
compuestos
del
flavor
y
compuestos nutricionales, se asegure la adecuada inactivación de enzimas, sin reblandecer excesivamente el producto.
Piscetas: Material
Escaldado en el rabanito
de plástico que contiene agua destilada, la cual permite el enjuague de los electrodos luego de cada medida para que no se alteren los resultados.
Tubos de ensayo: El tubo de ensayo forma parte del material de vidrio de un laboratorio químico. Este instrumento permite la preparación de soluciones.
GRAFICOS
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
VI.II.
REACTIVOS:
REACTIVOS Peróxido
2017
VI.IV. TOMADE DATOS: GRÁFICOS
Muestra de limones
de
hidrogeno:
Color
Pulpa blanca
también
Olor
Sui generis
conocido
como
Temperatura
agua
oxigenada, es un
Lugar de
compuesto químico
procedencia
con características
Unidades
de
utilizadas
un
líquido
altamente
Ambiente (20 °C) Tienda Miraflores 4
polar,
fuertemente enlazado
con
el
hidrógeno tal como
VI.V. PROCEDIMIENTO:
el agua.
EXTRACTO DE RABANITO
Guayacol: es el fenol derivado de la bencina
y
fue
denominado
Rabanito
ácido
Agua
piroguayácico, guayol e hidruro de guayacilo,
y
se
encuentra,
1
Lavado
2
Corte
3
Molienda
4
Filtrado
Residuos
mezclado con otros fenoles.
H2O
VI.III. MUESTRA: MUESTRA
GRÁFICO
Rabanito: Es una raíz
gruesa,
carnosa,
muy
variable en cuanto a la forma y al tamaño,
de
roja, rosada.
piel
Almacenado (Beacker)
Residuos
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
2017
ENSAYO 1 A un tubo de ensayo se le agregó 0.5 ml de H2O2 y 0.5 ml de Guayacol y se observó la reacción.
Img.1. Extractado del rabanito. Img. 3. Adición de H 2O 2 y guayacol.
ENSAYO 2 A un tubo de ensayo se le agregó 1 ml de extracto de rabanito y 1 ml de H 2O2. Se observó la reacción
Img. 2. Filtrado y obtención del rabanito.
Img.4.Adición de extracto y H 2O 2.
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
2017
ENSAYO 3 A un tubo de ensayo se le agregó 0.5 ml de extracto de rabanito, 0.5 ml de H2O2 y 0.5 ml de guayacol y se observó la reacción.
ENSAYO 4 En 6 tubos de ensayo de adicionaron 10 ml de extracto de rabanito. Estos tubos se llevaron a baño de agua caliente a su punto
de
ebullición
por
determinados
tiempos
Img. 6. Reacción del H 2O 2 y guayacol.
ENSAYO 2 Se observa el resultado de prueba catalasa Positiva (+), debido a la presencia de enzimas que al reaccionar con el peróxido se produce el desprendimiento de oxígeno en forma de efervescencia. Img. 5. Batería de tubos conteniendo extracto de rabanito.
VI.
RESULTADOS:
ENSAYO 1 En el primer ensayo se observó un resultado Negativo (-), debido a que no hay presencia de enzimas y no se produce la liberación de oxígeno.
Img. 7. Reacción efervescente del extracto y H 2O 2
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
2017
ENSAYO 3
El ensayo indica un resultado Positivo (+) mostrando un cambio en la coloración del extracto, al agregarle los reactivos (H 2O2 y guayacol), lo que nos indica la presencia de la enzima peroxidasa.
Tubos
Tiempo
A B C D E F G H
10 segundos 20 30 40 60
Resultados (+/-) +
segundos segundos segundos segundos
90 segundos 100 segundos 180 segundos
Img. 8. Reacción entre el extracto, H2O2 y
Img. 9. Reacción entre los reactivos y el
guayacol.
extracto.
En
ENSAYO 4
la
Imagen
9
se
muestran los tubos D, E, F, G Y H (en ese orden), y se observa la coloración que cada uno obtuvo respecto al tiempo que fueron sometidos al baño de agua caliente. Como se puede observar,
el
tubo
H
ya
no
presenta la coloración rojiza parda, lo que indica que el tiempo de residencia (tiempo necesario
para
inactivar
la
enzima) para nuestra muestra Img. 9. Batería de tubos luego de haber sido sometidos a baño de agua caliente.
fue de 180 segundos.
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
VIII.
DISCUSIONES:
2017
electrones en presencia de peróxido de hidrógeno, generando radicales libres que reaccionan entre sí y
WITHAKER,
Según
1972:
La
producen dímeros.
Peroxidasa es una oxidorreductasa que
cataliza
reacciones
usando
Serra, B. (2002). La
Según
oxígeno o peróxido como aceptor de
inactivación
hidrógeno,
reacción:
durante la oxidación de fenoles se
ROOH + AH2 ROH + A + H2O
debe principalmente a la formación
Cataliza
de
la
la
siguiente
reacción
de
ciertos
de
la
polifenoles
peroxidasa
que
se
unen
compuestos dadores de hidrógeno,
inespecíficamente a la enzima. Los
como fenoles (guayacol, pirogalol) por
Compuestos I y II formados tras la
medio
El
oxidación de la peroxidasa por el
sustrato oxidable más usado es el
peróxido de hidrógeno, pueden ser
guayacol,
reducidos a la forma nativa de la
de
peróxidos
que
es
(H202).
oxidado
a
un
complejo coloreado de tetraguayacol en
presencia
de
peróxido.
La
velocidad de formación del color rojo ladrillo
puede
ser
utilizada
enzima mediante fenoles.
como
medida de la actividad enzimática por lecturas espectrofotométricas de las
En la práctica elaborada de acuerdo con el autor las peroxidasas presentes en la piel del rábano (extracto) con la concentración
de
peróxido
hidrógeno pueden originar la formación
absorbancias con relación al tiempo.
de un complejo sea En la práctica tal como indica el autor se utilizó
guayacol
y
H202
para
de
el
Reconocimiento de la Peroxidasa, dando un color de la reacción rojo ladrillo, el
Compuesto
el peróxido y el
I (Fe(IV) y un radical
porfirina (P·) ),
provocando así la
inactivación enzimática. Según Ramírez C. La peroxidasa ha
cual nos podría explicar la medida de la
sido
actividad enzimática de las absorbancias
indicadora
con relación al tiempo en los rabanitos.
escaldado por su alta tolerancia a
ampliamente de
usada efectividad
como del
tratamientos térmicos. Se espera
Rivas, J.; Baltazar, M.;
que si la POD ha sido inactivada, las
Moreno, V. & Garcia, L. (s.a). Las
otras enzimas también. Además, es
peroxidasas
importante inactivar la POD debido a
Según
distribuidas
están
plantas
su vinculación con cambios en la
superiores, parte de su importancia se
coloración de frutas y hortalizas,
debe a que catalizan la oxidación de
degradación
varios
entre
ampliamente
fenoles
las
donadores
de
de
compuestos
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
fenólicos
con
importante
IX.
valor
2017
CONCLUSIONES:
antioxidante y pérdida de aroma. Cuando se usa esta enzima como
Se
pudo
determinar
un
tiempo
adecuado para que la inactivación de
indicadora, se espera que a un
enzimas en la muestra de rabanito,
mayor grado de inactivación, la
mediante el ensayo 4.
calidad se mantenga por un mayor tiempo.
La
peroxidasa
es
una
enzima
En nuestra experimentación con en el
oxidorreductora
ensayo nº4 pudimos obtener el tiempo
guayacol en presencia de peróxido de
de residencia del extracto de nuestra
hidrógeno originando un producto de
muestra de rabanito, el cual fue de 180
color pardo-café.
capaz
de
oxidar
segundos. Como se sostiene en lo citado, al usar la peroxidasa como
La
Peroxidasa
se
encuentra
indicadora de efectividad de escaldado,
ampliamente distribuida en plantas
podemos sostener que el tiempo de
superiores, encontrándose en altas
residencia es el tiempo necesario que
concentraciones
se requiere en el proceso de escaldado
rábanos.
en
extractos
de este vegetal, de tal manera que se garantice
la
inactivación
de
esta
enzima. Según
La importancia de una enzima es que aceleran
Moschos,
A.,
2007,
las
reacciones,
en
los
vegetales las enzimas constituyen el
El
principal catalizador de las reacciones
peróxido de hidrógeno es capaz de
indeseables del pardea miento de tipo
actuar ya sea como agente oxidante o
enzimático.
como reductor. Las ecuaciones que se muestran a continuación presentan
las semirreacciones en medio ácido:
Las peroxidasas de diversas fuentes presentan térmicas diferentes
variadas y
son
presumiblemente
peroxidasa del rábano es una enzima
heterogeneidad
que cataliza la oxidación de un amplio
enzimas.
de
inorgánicos,
sustratos utilizando
orgánicos el
a
por
calor,
debido
a
estructural
de
las
e
poder
oxidante del peróxido de hidrógeno.
inactivadas
velocidades
En vegetales, es de destacar a la
número
estabilidades
Las altas concentraciones de H2O2 con las peroxidasas distribuidas en el rábano generan la inactivación de estas mismas.
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
2017
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2
Se observó la formación de burbujas
009/far173e/doc/far173e.pdf (Leído
al inocular peróxido de hidrogeno en
el 22 de abril de 2017)
el tubo de ensayo con la muestra, esto es oxígeno que se desprende como uno de los productos de la reacción química de descomposición del peróxido de hidrógeno, por acción de la enzima peroxidasa que se
Rivas, J.; Baltazar, M.; Moreno, V. & Garcia, L. (s.a). Determinación de actividad peroxidasa en extractos crudos
de
diferentes
vegetales.
Iztapalapa: México. Disponible en: http://www.smbb.com.mx/congresos
encuentra en el rabanito.
%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Ar
Se observó el cambio de color en el
ea_I/Carteles/CI-16.pdf (Leído el 22
tubo de ensayo al inocular peróxido
de abril de 2017)
de hidrogeno y guayacol, el color que apareció fue rojo, ya que la peroxidasa
cataliza
deshidrogenación
una
directa
en
presencia de peróxidos; en este caso el guayacol es oxidado dando una quinona coloreada.
Serra,
B.
Desarrollo
de
electrodos compósitos enzimáticos para la detección y determinación de compuestos
fenólicos.
Madrid.
Disponible
en:
http://biblioteca.ucm.es/tesis/qui/ucm -t26000.pdf Whitaker,
X.
(2002).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Fennema, O. (1980) Química de los
J.
1972.
Principles
of
enzymology for the Food Sciences. Editorial Marcel Dekker In. New York. Vol 2: 592-615 p. Disponible
alimentos. Ed. Reverté: España.
en: Moschos, A. (2007). Analysis of fluid in
http:
//cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2003/f
vegetables- in particular de activity
al864i/doc/fal864i.pdf, (Leído el 22
of the enzyme myeloperoxidase in
de abril de 2017)
synovia from diseased . Thesis,FUBerlin Germany) Ramírez,
C.
(2009).
Estudio
experimental de la desactivación de la enzima peroxidasa durante el proceso de escaldado de papas y el almacenamiento Universidad Disponible
a
Austral
-18ºc. de
Chile: Chile. en:
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
XI.
ANEXOS:
catalasas
1. ¿Qué es la peroxidasa y que es la catalasa?
existen
estructurales catalasas
diferencias
importantes.
pequeñas
2017
son
Las menos
resistentes a la desnaturalización, unen
LAS PEROXIDASAS
NADPH, tienen hemo b y se inhiben e inactivan por sustrato.
Corresponden a un grupo de enzimas de las oxido reductasas, se encuentran en muchos productos de origen vegetal que
contribuye
al
oscurecimiento
enzimático de alimentos.
En
cambio,
las
catalasas
grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la
La prueba de la peroxidasa es la
desnaturalización,
tienen
d ,
que se utiliza para ver la efectividad del
presentan
escaldado debido a la gran resistencia
inusuales cercanos al sitio activo y son
térmica y consiste en añadir guayacol y
resistentes a concentraciones molares
Fe al alimento; si la enzima no se
de H2O2. Aquí revisamos los aspectos
inactivó durante el tratamiento térmico
estructurales de las catalasas y sus
se produce una coloración que se debe
posibles implicaciones funcionales.
a la polimerización de cuatro moléculas
enlaces
hemo
covalentes
2. ¿Qué es el guayacol?
de guayacol. El guayacol es el fenol derivado de la
LA CATALASA
bencina
y
fue
denominado
ácido
piroguayácico, guayol e hidruro de Es una enzima antioxidante presente
guayacilo, y se encuentra, mezclado
en
organismos
con otros fenoles, en la solución que
aerobios. Cataliza la dismutación del
resulta de tratar la creosota por la lejía
peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua
de sosa:
la
mayoría
de
los
y oxígeno. Fue descubierto por Ascanio La mayoría de estas enzimas
Sobrero (del Guaiacum, género de la
son homotetrámeros con un grupo
familia de las Rutáceas, serie de las
hemo
zigofiláceas, con flores tetrámeras o
en
cada
determinado cristalográfica
subunidad. la
de
Se
ha
estructura
nueve
catalasas.
Algunas catalasas tienen subunidades pequeñas (masa molecular ≈ 60 kDa) y otras grandes (masa molecular > 80 kDa).
Entre
estos
dos
pentámeras).
tipos
de
CARACTERISTICAS:
Es líquido
Incoloro
Muy refrigerante
RECONOCIMIENTO DE LA PEROXIDASA
Hierve a 200º
2017
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos
3. Explique
la
presencia
de
compuestos
dadores
de
hidrógeno,
burbujas cuando se adiciona
como fenoles (guayacol, pirogalol) y
agua oxigenada
aminas aromáticas (o-fenilendiamina)
Para que se de esta reacción estos
por medio de peróxidos (H2O2). El
catalizadores utilizan dos moléculas de
substrato oxidable más usado es el
peróxido de hidrógeno, una de ellas
guayacol,
actúa
complejo coloreado de tetraguayacol
como
substrato
dador
de
electrones y la otra como oxidante o receptor de electrones. La reacción que
que
es
oxidado
a
un
en presencia de peroxidasa.
5. Explique porque no hay cambio
se produce se puede escribir de la
de
siguiente forma:
térmicamente a las muestras
2 H2O2
color
cuando
se
trata
Cuando las muestras fueron sometidas
2 H2O + O2
a tratamiento térmico por determinado Durante el proceso se libera
tiempo, se produce la inactivación de
oxígeno, de forma que, si a una
la enzima peroxidasa. Por lo tanto,
muestra que contiene catalasas le
cuando después de este proceso se
añadimos peróxido de hidrógeno, se
añade el H2O2 y el guayacol al tubo
observa la formación de burbujas como
que contiene el extracto y la enzima
consecuencia
se
inactivada, no se va a producir la
desprende en la reacción, esto es
coloración en el tubo debido a que la
debido a la presencia de la enzima
peroxidasa ya no tendrá la capacidad
catalasa que va a reaccionar con el
de catalizar la deshidrogenación del
oxígeno presente en la muestra
peróxido
del
oxígeno
que
y
el
guayacol
no
será
oxidado, por lo que la coloración se
4. Explique
el
cambio
de
coloración cuando se adiciona agua oxigenada y guayacol a las muestra sin tratamiento térmico. La
peroxidasa
cataliza
una
deshidrogenación directa en presencia de peróxidos; en este caso el guayacol es
oxidado
coloreada.
dando
una
quinona
observará.