Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Pengolahan Plaa-Som, Produk Fermentasi Ikan I kan Tradisional Tradisional Thailand
Abstrak
Plaa Plaa-so -som m adala adalah h prod produk uk ferme ferment ntasi asi ikan ikan ala Thai Thai dari dari ikan ikan utuh utuh maup maupun un filet filet yang yang difermentasi dengan nasi, garam, dan bawang. 762 jumlah total bakteri asam laktat (!"# diisolasi dari kultur agar lempeng $a$%&-') selama fermentasi plaa-som. !" disaring dan dikelo dikelompo mpokka kkan n dengan dengan analis analisaa restrik restriksi si *+! ribosom ribosom (!*! (!*!#, #, mengha menghasilk silkan an 6 kelompok kelompok berdasarkan *+! ribosom-nya ribosom-nya yaitu "atoous garieae, )treptoous bois, eissella e issella ibaria ibaria,, Pedio Pedioous ous pento pentosaeus, saeus, "ato "atobaillu bailluss plant plantarum, arum, dan "atob "atobaillu ailluss ferm rmen enttum. ahan ahan seg segar yang ang dia diam mpurk purkan an meng engandu andung ng popu popula lasi si !" rend rendah ah (kur (kuran ang g dari dari /0 $1 $1 3 g# selam selamaa ferme ferment ntasi asi dan dan popu popula lasi si ferm fermen enta tasi si akhi akhirr sekita sekitarr /07 $1 3 g. Pada proses proses awal didominas didominasii ". garieae, ). bois, and . ibaria. Pada fermenta ferm entasi si sela selama ma 45 jam terd terdapat apat . ib ibaria aria,, P. pen pentos tosaeu aeus, s, and "b. pla planta ntarum rum yan yang g didominasi "b. Plantarum sampai fermentasi selesai. $ampuran spesies-spesies !" tersebut dianggap spesies yang dapat dikembangkan sebagai kultur starter fermentasi Plaa-som.
1. Pe Pend ndah ahul ulua uan n
Plaa-som adalah produk fermentasi ikan ala Thai dari ikan utuh maupun filet yang diferm difermenta entasi si dengan dengan nasi, nasi, garam, garam, dan bawang sampai sampai dihasil dihasilkan kan rasa asam yang yang dapat dapat diterim diterimaa (T), 200#. 200# . )etelah )etelah fermentasi fermentasi,, ikan ikan dimasak dimasak dengan dengan deep frying atau dibakar sebelum dikonsumsi. )ebagai produk fermentasi tradisional, resep pembuatannya berbeda beda menurut kerajaan-kerajaan Thailand, tergantung dengan konsumen lokal dan ketersediaan bahan (8alyasei and olle, 2002#. 2002#. 9asilnya mikrobiologi, karakteristik kimia dan sensoriknya berbeda-beda. Proses produksi seara tradisional bergantung pada fermentasi spontan spontan yang ditandai dengan munulnya munulnya mikroorganism mikroorganismee alami, terutama bakteri bakteri asam laktat (!"#, yang ditemukan dalam bahan, peralatan pengolahan, dan atmosfer lokal sebagai starter starter alami (:hieokhahee et al., /;;7< 8alyasei and olle, 2002< 8isessanguan et al., 2004#. )el )elama ama ferment fermentasi asi,, !" memanfaatkan memanfaatkan substrat karbohidrat karbohidrat yang tersedia tersedia dalam sistem sistem fermenta fermentasi si dan mengha menghasilk silkan an asam-asa asam-asam m organi organik, k, terutam terutamaa asam laktat laktat,, sebaga sebagaii bagian dari metabolitnya (:andler, /;5&< Paludan-'=ller et al., 2002a#. !sam-asam 2002a#. !sam-asam tersebut tidak hanya menghasilkan rasa, aroma, dan tektur tetapi juga mengakibatkan p9 rendah yang mana ma na me menja njadi di fa fakt ktor or ku kun nii mu mutu tu da dan n ke keam aman anan an (%wen (%wenss and 'endo>a, /;5< Palud Paludanan-
'=ller et al., 2002a< 8isessanguan et al., 2006< :opermsub and ?unhalard, 2005#. Penelitian untuk menentukan dan mengembangkan kultur starter !" untuk produksi Plaa-som akan memungkinkan proses yang lebih terkontrol dan menghasilkan produk dengan konsistensi yang lebih besar dalam kualitas dan keamanan. Pembentukan starter seperti itu perlu dikembangkan dari spesies utama !" yang diinginkan selama proses fermentasi Plaa-som. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan spesies dominan !" yang tumbuh selama proses tradisional tapi diharapkan keberadaannya dalam fermentasi Plaa-som di wilayah timur laut Thailand.
2. ateri dan etode 2.1. Pre!arasi Plaa-som dan Sam!ling
*ua bath Plaa-som /0 kg produksi lokal terpilih dari :hon :aen, sebuah proinsi di wilayah timur laut Thailand dengan teknik tradisional dan resep produsen. kan air tawar Thai, arb Perak (arbodes gonionotus#, dengan nama lokal Plaa-ta-pien, masing-masing sekitar &00 g sebagai bahan baku utama. kan disiangi, dihilangkan sisiknya, dibelah kedua sisi, diui dengan air bersih selama &-4 kali, direndam dalam air garam laut 2@ (b3# selama kurang lebih & jam, kemudian dibilas dengan air bersih dan dikeringkan. kan yang bersih dan kering kemudian diampurkan dengan garam laut dan gula, masing-masing sekitar /0 g dan 0 g3/0 kg ikan, diikuti dengan beras jasmine kukus dan bawang putih inang /000 g dan 0 g3/0 kg ikan. $ampuran bahan juga dimasukkan ke dalam perut ikan. Tempatkan ikan dalam mangkok yang ditutupi dengan lembaran plastik dan disimpan pada suhu &0A$ selama 6 jam untuk difermentasi. :emudian ikan disimpan pada suhu -/5A$ selama 6 jam setelah masing-masing ikan dikemas dalam kantong plastik / kg. dara dikeluarkan dari kantong dengan menekannya kemudian diikat dengan karet gelang. 1ermentasikan pada suhu &0 A$ selama /44 jam (6 hari#. )ampel Plaa-som dianalisa kimia dan mikrobiologinya selama proses
produksi pada langkah-langkah dan waktu sebagai
berikutB )etelah penampuran dan pengisian bahan ke dalam perut ikan, disebut sampel /< 6 jam
setelah penampuran disebut sampel 2, setelah dikemas dan disimpan dalam alat
pembekuan pada suhu -/5A$ disebut sampel &, dan setiap selang 24 jam selama fermentasi pada suhu &0 A $ selama /44 jam disebut sampel 4 C ;. 2.2.
Isolasi Bakteri Asam Laktat
)atu kan utuh diambil sebagai sampel dengan aseptis dipotong keil-keil sebelum dihomogenisasi dengan )tomaher 400 "ab lender ()eward "td, orthington, nggris# keepatan tinggi selama & menit dan dienerkan dengan pengeneran desimal dalam air
garam pepton (0,/@ (b3# pepton dan 0,5@ (b3# +a$l dalam air suling# dan diinokulasikan seara triplo untuk dihitung koloninya kemudian diisolasi dengan teknik lempeng spread ()pek, /;54#. !" diisolasi menggunakan inkubator mikroaerob dalam candle jar pada suhu &0A$ selama &- hari dengan agar ') ('an et al., /;60# dimodifikasi dengan penambahan /,0@ (b 3 # $a$%&. !sam yang diproduksi koloni bakteri diambil dari agar lempeng. :emungkinan lebih dari /00 isolat terambil dari tiap sampel. )emua isolat dimurnikan dan dipastikan sebagai !" setelah diketahui karakteristik biokimia dan mikroskopiknya dengan menggunakan pewarnaan gram, uji katalase, dan uji fermentasi glukosa %-1. )emua isolat !" disimpan pada suhu -50 A $ dalam alat pembekuan (Dibson dan :houry, /;56# sampai dapat diidentifikasi dengan !nalisis estriksi *+! ibosom (!mplified ibosomal *+! estrition !nalysis (!*!## dan sekuensing *+! ribosom (ibosomal *+! )eEuening#. 2.".
#kstraksi dan !ersia!an genom $%A dari isolat BAL
solat !" dibiakkan selama /2 jam dalam /, ml ') broth pada suhu &0A$ dan sel-sel disentrifus (pemisahan komponen-komponen sel# dengan keepatan 000 rpm selama & menit Fefrigerated
miroentrifuge (modelB )igma &:/, )D'! "abor>entrifugen
Dmb9, German#H. ') broth dikeluarkan dari tabung dan genom *+! diekstraksi dari pelet selnya (struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di bagian bawah tabung sentrifuge#, menurut modifikasi metode !nderson dan ':ay (/;5&# dan ilson (/;;0#. Denom *+! diekstraksi dari setiap isolat !" dengan elektroforesis gel horisontal Faparat gel horisontal (Del'ate DIP/02, Toyobo $o, "td, %saka, Gepang#H dengan 0,5@ (b 3 # agarosa yang mengandung 0, mg 3 ml ethidium bromida di TI 0.J menggunakan /00 8 selama 20 menit. Del itu diisualisasikan menggunakan mage 'aster K 8*)
(!mersham Pl.,
ukinghamshire, nggris#. :onsentrasi dan kemurnian *+! juga ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri ()pektrofotometer 8-8), )himad>u $orp, :yoto, Gepang# berdasarkan 'aniatis dkk. (/;52#. Preparasi *+! disimpan dalam 40 Ll air bebasnuklease pada suhu -20A$ sampai digunakan. 2.&.
Am!lifikasi r$%A 1'S isolat BAL
*+! dari stok yang disimpan dalam suhu -20A$ dienerkan antara /0 pg dan / Lg30 ml menggunakan air suling bebas ganda-nuklease. 1ragmen r*+! /6) diamplifikasi dengan P$ menggunakan uniersal primer set dari 27-f (M-!DT TTD !T$ $TD D$T $!D-& M# dan /4;0-r (M-DTT !$$ TTD TT! $D! $TT $-& M# menurut $hen et al. (200# menggunakan $yler i$ylerThermal (io-ad "aboratories n, 9erules, )!#. )emua reagen yang digunakan dalam amplifikasi P$ dibeli dari di 1ermentas nternational n,
%ntario, :anada. !mplifikasi ini dilakukan dengan 0 Nl olume reaksi seperti yang dijelaskan oleh 9oefel et al. (200#. )etiap eaksi P$ terdiri dari 200 L' setiap d+TP, /.0 p' primer masing-masing, 2. m' 'g$l2, /O P$ buffer, 2. TaE polimerase *+!, dan / Ll *+! template. )iklus termal yang terjadi meliputi denaturasi tahap awal pada ;A$ selama /0 menit, &0 siklus dari tahap denaturasi padasuhu ;A$ selama &0 detik, tahap anil pada suhu 0A$ selama / menit, tahap ektensi pada suhu 72A$ selama 2 menit, dan ekstensi terakhir pada suhu 72A$ selama /0 menit. Produk P$ diperiksa menggunakan 0,5@ (b 3 # elektroforesis agarose gel. Del diisualisasikan dengan menggunakan mage 'aster K 8*). 2.(. Analisis Pembatasan !roduk P)* r$%A 1'S Produk P$ r*+! /6) dari masing-masing isolat !" dipotong dengan indiidual
tetrameri restrition endonulease en>ymeB ! ($D 3 $D# atau 9ae (DD 3 $$# menurut )ato et al. (2000# dan $hen et al. (200# , mengikuti prosedur yang diuraikan oleh 1ermentas nternational n, %ntario, :anada. $ampuran reaksi pembatasan endonuklease diampur dengan lembut dan diputar menurun selama beberapa detik. $ampuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu &7 A $ selama & jam. Pola pembatasan atau profil !*! diperiksa dengan menggunakan &,0@ (b 3 # gel agarosa di 0.J penyangga TI pada /00 8 selama
40
menit
Faparat
gel
horisontal
(Del'ate
DIP/02,
Toyobo
$o, "td, %saka, Gepang#H dengan tangga *+! (Deneuler /00 bp *+! tangga#. Del itu diisualisasikan menggunakan mage 'aster K 8*). 2.'. Se+uening r$%A 1'S 'asing-masing pola kelompok !*! seara aak dipilih untuk analisis sekuens. !nalisis sekuens *+! dilakukan sesuai dengan metode dideoksi-dimediasi rantai terminasi ()anger et al., /;77# menggunakan 'ega!$I /000 automated *+! seEuener (Pharmaia ioteh, )wedia# di laboratorium khusus sekuensing *+! *epartemen iokimia, 1akultas :edokteran, :hon :aen niersity. Penarian homologi r*+! /6) diurutkan dengan Denank dengan program last+.
". asil
)ebanyak 762 isolat !" yang ditemukan dan dimurnikan dari sampel / sampai ;. )emua isolat dipastikan termasuk kelompok !" berdasarkan Dram-positif, tidak ada aktiitas katalase, dan hasil positif untuk kemampuan fermentasi glukosa (data tidak ditampilkan#. *ari semuanya, hanya dua isolat !" yang ditemukan dari sampel /. )eratus isolat !" masing-masing ditemukan dari sampel 2 sampai 5, dan 60 solat !" yang ditemukan dari sampel ; seperti yang terantum dalam Tabel 2.
*itemukan bahwa dua primer terpilih mampu memperkuat fragmen r*+! /6) setiap isolat !" yang mengakibatkan amplikon dari sekitar ukuran /46& bp (data tidak ditampilkan#. :edua en>im tetramerik dipilih (baik ! atau 9ae# untuk pembatasan amplikon sehingga mampu membedakan semua 762 isolat !" menjadi 6 pola pembatasan. Pola-pola ini, atau profil !*!, tertulis !, , $, *, I, dan 1 seperti ditunjukkan pada Dambar. / dan terantum dalam Tabel /. solat yang mewakili setiap profil dianalisis untuk urutan r*+! /6). Penarian homologi urutannya melampirkan (dengan ;;-/00@ homologi# profil yang ! milik "atoous garieae, profil milik )treptoous bois, profil $ milik eissella ibaria, Profil * milik Pedioous pentosaeus, profil I milik "atobaillus plantarum, dan profil 1 milik "atobaillus fermentum. rutan tersebut disetorkan ke
Denank *atabase. +omor aksesi urutannya ditunjukkan pada Tabel /. 1rekuensi isolasi setiap spesies dari /00 isolat yang diambil pada setiap waktu sampel terantum dalam Tabel 2.
9anya dua isolat !" (". garieae dan ). bois# ditemukan dari bahan baku setelah penampuran (sampel /#. )elanjutnya, sebanyak &7 isolat dari 762 isolat !" yang ditemukan adalah ). bois (; dan 25 isolat dari sampel 2 sampai & diambil selama tahap awal fermentasi#. *engan demikian, hanya &5 isolat yang diambil dari sampel / sampai & diidentifikasi sebagai ). bois. ". garieae yang tumbuh selama penyimpanan 6 jam berikutnya dengan bahan tambahan yang diampurkan dan mewakili 55@ isolat !". Pada isolasi tahap ini terdapat sedikit ). bois dan . ibaria. ". garieae juga dominan (6@# di ampuran setelah pembekuan, diikuti oleh ). bois (25@# dan . ibaria (/6@#. )elama fermentasi, ". garieae semakin menghilang dari sampel 4 sampai 7 dan masing-masing /&, /&, 2, serta 4@ dari isolat. . ibaria pertama ditemukan dari sampel 2 sebesar &@ kemudian mengalami peningkatan pada sampel &. . ibaria ditemukan sebagai spesies dominan dalam sampel 4, mewakili 5@ dari isolat. +amun, kemudian menurun selama fermentasi (sampel sampai ;#, dan hanya /,6@ pada sampel ;. P. pentosaeus dan "b. plantarum pertama kali diisolasi pada frekuensi /@ pada sampel 4 kemudian menjadi dominan dalam sampel dan 6 pada masing-masing frekuensi &0@, 2;@ dan 2;@, 7@. )etelah itu, P. pentosaeus menurun menjadi sekitar 5@ pada sampel ;. Tahap akhir fermentasi didominasi dengan "b. plantarum yang memberikan frekuensi isolasi sama tingginya 70-;0@ pada sampel 7 sampai ;. "b. fermentum kadangkadang ditemukan dari sampel 6 sampai 5, tapi pada frekuensi yang rendah (sekitar /@#.
&. Pembahasan
*alam memproduksi makanan berfermentasi, matriks awal makanan menyajikan kondisi abiotik dan biotik yang dipilih untuk pertumbuhan koloni mikroba tertentu (Diraffa, 2004#. Pada Plaa-som, konsentrasi awal garam (/,4&@ b3b# dan gula (0,@ b3b# dengan pengaruh antimikroba dari bawang putih terpilih bertujuan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat yang berkembang dari populasi awal sangat rendah sampai lebih besar dari /07 $13g. !kibatnya, p9 produk menurun dari sekitar 6, menjadi sekitar 4,. Penemuan ini konsisten dengan penelitian sebelumnya dengan produk yang sama (Tanasupawat dan :omagata, /;;< Paludan-'=ller et al, /;;;.< :opermsub dan ?unhalard, 2005#. *alam penelitian ini, !*! melakukan penyaringan dan identifikasi dalam jumlah besar (762# isolat !" yang diperoleh dari fermentasi Plaa-som. erdasarkan penyaringan ini, isolat dikategorikan menjadi enam kelompok berbeda yang diurutkan menjadi enam spesies (Tabel /#. Peneliti lain juga melaporkan kegunaan !*! untuk pengelompokan epat dan identifikasi isolat !" ()ato et al, 2000.< 8aneehoutte dan 9eyndrikJ, 200/< $hen et al, 200, 2006#. akteri asam laktat dari ampuran bahan baku segar dan bisa disebabkan proses higienis yang diadopsi oleh tempat produksi lokal. Tahap pembersihan dan penuian sebelum bahan baku dan bahan-bahan tambahan diampurkan menghasilkan !" kurang dari /0 $1 3 g. +amun, pada penyimpanan berikutnya dari ampuran bahan (sampel 2# menghasilkan pertumbuhan !" yang didominasi ". garieae, ). bois, dan . ibaria dan jumlah total ditemukan meningkat menjadi /04 $1 3 g. niknya proses pembekuan digunakan dalam proses ini diperlukan untuk membuat tekstur ikan padat dan juga, memungkinkan penyimpanan jangka panjang dalam produksi Plaa-som skala besar. Proses pembekuan dan pelelehan menyebabkan pengurangan jumlah total populasi !" yang keil sampai sekitar Q /0& $1 3 g. +amun demikian, spesies !" yang ditemukan dari tahap awal seperti ". garieae, ). bois, dan . ibaria masih ada dan ditemukan dari sampel & setelah pembekuan dan pelelehan. ). bois ditemukan pada tahap awal produksi dan konsisten menghasilkan amilase yang mungkin berperan dalam degradasi pati nasi, yang menjadi bahan kuni dari Plaa-som ($otta, /;55<. +arita et al, 2004#. 'onosakarida dan disakarida yang dihasilkan oleh aktiitasnya akan menyediakan karbohidrat untuk !" lain dalam melakukan proses fermentasi dan menghasilkan asam laktat (:andler, /;5&# yang memberikan rasa asam yang diinginkan dan flaor Plaa-som. ). bois dilaporkan terkait dengan mikroba di hewan dan sebelumnya diisolasi dari perut babi (1uller et al., /;75#. %leh karena itu, ditemukannya ). bois dari tahap awal proses bisa disebabkan oleh kontaminasi dari lingkungan pedesaan
yang berdekatan dengan peternakan hewan dan pengolahan daging babi dalam pembuatan produk
lainnya
di
lokasi
produksi.
'eskipun
!"
umumnya
dikenal
sebagai
mikroorganisme yang aman, ada beberapa kekhawatiran tentang patogenisitas ). bois dan ". garieae ($ollins et al, /;5&<. $ai et al, /;;;<. *e 9erdt et al, /;;2<. 8endrell et al, 2006#. ". garieae yang biasanya telah diperkenalkan ke produk makanan dari ternak dan ikan dan sering dikenal sebagai ternak atau ikan patogen ($ollins et al., /;5&< 8endrell et al, 2006#. +amun, ". garieae juga dapat diisolasi dari spesies dominan dari usus ikan yang sehat ($ai et al., /;;;#. )elain itu, ". garieae telah ditemukan dalam sosis dan ikan fermentasi (Paludan-'=ller et al, 2002a< !mmor et al, 200#. 'eskipun ). bois umumnya menghuni saluran penernaan ruminansia, terkadang ditemukan sebagai penyebab penyakit manusia (*e 9erdt et al, /;;2<. hitehead dan $otta, 2000# . +amun, itu bukan masalah kesehatan yang serius karena ditemukan juga dalam produk susu seperti susu fermentasi dan keju (anda>>o et al, 2002<.. ashid et al, 2007#. Terlepas dari masalah kesehatan, strain ). boiswas disarankan sebagai starter probiotik dalam fermentasi makanan sehari-hari karena dapat menghasilkan angiotensin tinggi, mengubah senyawa en>impenghambat yang bermanfaat untuk menurunkan tekanan darah tinggi manusia dan hewan (asyid dkk., 2007#. !danya . ibaria pada tahap awal produk pengasaman fermentasi sesuai dengan !mpe et al. (/;;;#, yang melaporkan spesies dari kelompok "euonosto-eissella selalu ada pada tahap awal fermentasi sayuran dan po>ol yang berkontribusi dalam pengasaman produk. )elain itu, . ibaria juga ditemukan dan terisolasi dari Plaa-som dalam penelitian sebelumnya ditemukan dapat menghasilkan >at antimikroba yang disebut eisselliin //0 ()rionnual et al., 2007#. )etelah melalui proses pembekuan dan pelelehan, Plaa-som mengalami fermentasi !" yang kuat yang ditandai dengan pergeseran ekologi dari spesies yang terlibat. *ari sampel 4 sampai ;, tiga-langkah suksesi !" diamati. Pertama, spesies heterofermentatif dominan . ibaria memberi jalan untuk !" yang mendominasi lain dari spesies heterofermentatif
. ibaria, dan "b. plantarum, dan spesies homofermentatif, P.
pentosaeus. 9al ini akhirnya memberi jalan untuk "b. Plantarum sebagai spesies dominan. :eunggulan )pesies ini konsisten dengan ditemukannya pada produk fermentasi ikan Thailand lainnya (Tanasupawat dan *aengsubha, /;5&< Paludan-'=ller et al, /;;;, 2002a, b<. )rionnual et al, 2007#. "b. plantarum, ditemukan dalam tahap akhir fermentasi Plaa-som, disebutkan pula sebagai arietas dalam fermentasi sayuran ('*onald et al, /;;0<. rauman et al, /;;6.#. Penelitian ini seara khusus hanya menyelidiki spesies !" untuk fermentasi Plaa-som karena pentingnya !" dalam memproduksi produk dengan karakteristik yang
diinginkan. akteri lain serta ragi mungkin juga terlibat, dan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki kemungkinan ini.
(. esim!ulan
9asil yang diperoleh dari penelitian ini adalah menetapkan distribusi dan suksesi spesies !" yang dominan selama fermentasi Plaa-som. )pesies !" yang dominan adalah ". garieae, ). bois, . ibaria, P. pentosaeus, dan "b. plantarum. ni menjadi informasi berguna yang diperlukan lebih lanjut untuk mengembangkana starter !" yang diinginkan sehingga proses fermentasi Plaa-som lebih terkendali dan akan memberikan kualitas produk yang lebih sesuai. :ultur starter Plaa-som yang sesuai berisi ampuran dari semua atau sebagian spesies !" dominan yang saat ini perlu dipertimbangkan.
