Humana Genetika Ispitna Pitanja i Odgovori Za Studente Medicine

HUMANA GENETIKA ISPITNA PITANJA I ODGOVORI

HUMANA GENETIKA 2

ISPITNA PITANJA I ODGOVORI ZA STUDENTE MEDICINE

Rašović Nenad

3

SADRŽAJ 1. CENTRALNA DOGMA MOLEKULARNE BIOLOGIJE ..................................................................................... 6 2. STRUKTURA DNA MOLEKULE .................................................................................................................... 7 3. KVANITITATIVNA HROMATOGRAFSKA ANALIZA DNA .............................................................................. 8

4

4. STUPNJEVI KONDEZACIJE HROMATINA .................................................................................................... 9 5. STRUKTURA RNA MOLEKULA .................................................................................................................. 10 6. REPLIKACIJA DNA .................................................................................................................................... 11 7. STRUKTURA GENA KOD PROKARIOTA .................................................................................................... 15 8. STRUKURA GENA KOD EUKARIOTA ......................................................................................................... 16 9. TRANSKRIPCIJA ........................................................................................................................................ 18 10. TRANSLACIJA ......................................................................................................................................... 22 11. TRANSKRIPCIJA I TRANSLACIJA KOD PROKARIOTA ............................................................................... 25 12. USMJERAVANJE PROTEINA PREMA MJESTU DJELOVANJA ................................................................... 29 13. REGULACIJA GENSKE EKSPRESIJE KOD EUKARIOTA .............................................................................. 30 14. REGULATORNE SEKVENCE, MODEL OPERONA ..................................................................................... 35 15. MUTACIJE I TIPOVI GENSKIH MUTACIJA ............................................................................................... 37

16. MOLEKULARNA OSNOVA TAČKASTIH MUTACIJA ................................................................................. 38 17. GENOTOKSIČNI AGENSI ......................................................................................................................... 42 18. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZA I NJENA PRIMJENA – PCR TEHNIKA ................................................ 46 19. DNA POPRAVKA, REPARACIONI MEHANIZMI ....................................................................................... 47 20. MOLEKULARNI MEHANIZMI EKSCIZIJSKE REPARACIJE.......................................................................... 49 21. SOS REPARACIJA .................................................................................................................................... 51 22. STRUKTURA I FUNKCIJA HROMOZOMA ................................................................................................ 53 23. REPRODUKCIJA I SEKSUALITET .............................................................................................................. 54

24. ĆELIJSKA DIOBA MITOZA I KONTROLA ĆELIJSKOG CIKLUSA ................................................................. 55 25. ĆELIJSKA DIOBA MEJOZA, GAMETOGENEZA ......................................................................................... 60 26. GENSKE REKOMBINACIJE ...................................................................................................................... 63 27. DETERMINACIJA I DIFERENCIJACIJA POLA ............................................................................................ 65 28. HROMOZOMSKE ABERACIJE (DELECIJE I DUPLIKACIJE) ........................................................................ 67 29. HROMOZOMSKE ABERACIJE (INVERZIJE) .............................................................................................. 69 30. HROMOZOMSKE ABERACIJE (TRANSLOKACIJE) .................................................................................... 70 31. HROMOZOMSKE ABERACIJE (RING HROMOZOM)................................................................................ 71

32. NUMERIČKE ABERACIJE ......................................................................................................................... 72 33. ANEUPLOIDIJE POLNIH HROMOZOMA ................................................................................................. 73 34. SINDROMI GENSKIH ANOMALIJA .......................................................................................................... 75

35. DETERMINACIJA I DIFERENCIJACIJA EMBRIONALNIH ĆELIJA I TKIVA ................................................... 76 5

36. GENETIČKO SAVJETOVALIŠTE ................................................................................................................ 79

1. CENTRALNA DOGMA MOLEKULARNE BIOLOGIJE Centralna dogma molekularne biologije jeste pravilo prenosa genetske informacije unutar ćelije (produkcija proteina) i sa roditeljskih na potomačke celije (kroz generacije).

: prenos genetske informacije sa DNK na RNK i sa RNK na protein, odnosno Unutar ćielije transkripcijom translacijom.

6

Kroz generacije: geni se kroz generacije prenose zahvaljujući procesu replikacije koji omogućava da potomačke ćelije dobiju iste gene koje je imala i ćelija od koje su nastale. Ova dogma je univerzalna za sve ćelijske organizme i predstavlja osnovu biosinteze makromolekula. Frensis Krik je formulisao ovu dogmu 1958. godine. Sa otkrićem retrovirusa (HIV-virus

spada u ovu grupu) dogma se jako poljuljala pošto ovi virusi imaju RNK koju prepisuju u DNK, a zatim tu DNK ugraduju u DNK ćelije domacina koja po uputstvima DNK virusa sintetiše nove virusne čestice.

2. STRUKTURA DNA MOLEKULE Osnovne jedinice greađe nukleinskih kiselina su nukleotidi. Za DNK, to su dezoksiribonukleoti, a za RNK – ribonukleotidi. Nukleotidi se sastoje od tri osnovne komponente: pentoze, azotne baze i ostatka fosforne

kiseline. Molekul šećera se nalazi u sredini građe nukleotida: za njegov prvi C atom je vezana azotna

baza, a za peti C atom ostatak fosforne kiseline. Šećer i azotna baza čine nukleozid. Pentozni šećer u sastavu dezoksiribonukleotida je dezoksiribonukloza, a u sastavu ribonukleotida – riboza.

Azotne baze mogu da budu purinske: adenin (A) ili guanin (G), i pirimidinske: citozin (C), timin (T) ili uracil (U). Timin se nalazi samo u dezoksiribonukleotidima, a uracili samo u ribonukleotidima. Purinske baze su dvoprstenaste, a pirimidinske jednoprstenaste. Molekuli nukleinskh kiselina su polinukleotidi. U jednom polinukletidnom lancu nukleotidi su povezani jakim fosfordiestarskim vazama, koje se uspostavljaju izmeđe OH grupe na 3'C atomu jednog, i ostatka fosforne kiseline na 5'C atomu drugog nukleotida. Stoga svaki polinukleotidni lanac na jednom kraju ima nukleotid sa slobodnom 5'PO3 grupom, a na drugom kraju nukleotidsa slobodnom 3'OH

grupom. Ovi krajevi, su označeni kao 5' i 3' kraj, daju orijentaciju i polarnost polinukleotidnom lancu. Lančana građa zasnovana na fosfordiestarskim vezama čini primarnu strukturu nukleinskih kiselina. Primarna struktura je određena redosljedom n ukleotida. Prostorna organizacija molekula predstavlja sekundarnu strukturu DNK i RNK.

U čitavom živom svijetu molekuli DNK se sastoje od dva lanca nukletida koji su međusobno povezani i spiralno uvijeni oko svoje osovine. To je potvrđeno Votsonovim i Krikovim modelom dvostruke zavojnice.

Sekundarna struktura DNK je u stvari zavojnica ili heliks izgrađen od dva antiparalelna polinukleotidna lanca. Antiparalelnost znači da naspram 5' kraja jednog lanca leži 3' kraj drugog lanca, i obrnuto. Lanci su međusobno povezani nekovalentnim vodoničnim vezama koji se formiraju između azotnih baza o značenih kao komplementarne baze. Tako se formiraju parovi baza A-T i C-G . Uvijek postoji jednaka zastupljenost guanina i citozina, odnosno adenina i timina. Odnos parova baza AT/CG je

obično različit.

7

Komplementarni lanci su uvijeni na desno jedan oko drugog, tako da se duž molekula formiraju dva spiralna žljeba, označena kao veliki i mali žljeb. Jedan okret ili hod zavojnice sadrži 10 nukletida. Opisani model je ujedno i najčešća forma molekula DNK u prirodi, označe na kao B forma. Pri visokim koncentracijama soli ili u dehidratisanom stanju DNK se javlja u A formi, u kojoj je zavojnica takođe desna, ali zbijenija sa 11 baznih parova po punom okretu. Z forma molekula DNK, koju karakteriše lijevostrana zavojnica sa okosnicom cik-cak oblika, po čemu je i dobila naziv. Jedan zavoj ima 12 baznih parova i formira samo jedan duboki žljeb. Jedinica dužine dvolančanog molekula DNK je par nukleotida. Jedan bazni par se označava kako 1 bp, 1000 bp = 1 kilobaza ili kb a 1 000 000 bp = 1 megabaza ili 1 Mb.

Kao osnovni genetički materija DNK ulazi u sastav hromozoma. U jednom hromozomu, u ćeliji ban diobe, se nalazi jedan molekul DNK. U prokariotskoj ćeliji DNK je locirana u regionu nukleoida, a kod eukariota u ćelijskom jedru, ali i u mitohondrijama kao i u hloroplastima biljaka. DNK je osnovni nasljedni molekul. Upravlja sintezom proteina. Redosljed nukleotida u

određenim djelovima molekula DNK – genima čini šifru koja određuje redosljed aminokiselina u polipeptidnom lancu.

Zahvaljujui svojoj specifičnoj građi molekul DNK obezbijeđuje čuvanje genetičke informacije i njen prenos s jedne ćelije na ćerke ćelije, i od roditelja na potomke . Naime, struktura molekula DNK

omogućava njegovo precizno udvajanje – autoreprodukciju tj. replikaciju. Denaturacija je proces narušavanja sekundarne strukture molekula DNK usljed raskidanja vodoničnih veza između komplementarnih baza visokom temperaturom (75 step. C) ili promjenom pH. Segmenti DNK sa većim sadržajem C -G parova se teže denaturišu. Između C i G parova postoje tri, a između A i T samo dvije vodonične veze. U povoljnim uslovima može doći do ponovnog povezivanja lanca i formiranja dvostruke zavojnice i to je renaturacija DNK. Treći proces vezan za promjenu sekundarne strukture DNK je proces hibridizacije, koji podrazumijeva spajanje komplemenarnih djelova

lanca iz različitih molekula DNK (kao i lanaca DNK i RNK, ili dva lanca RNK). Sposobnost hibridizacije nukleinskih kiselina se danas najšire koristi u genetičkom inžinjeringu.

3. KVANITITATIVNA HROMATOGRAFSKA ANALIZA DNA Kvanitativnu hromatografsku analizu DNK je izvršo Šargaf i uspostavio je sljedeća pravila: 1. udio pojedinih baza nije jednak kod svih organizama 2. bliske vrste imaju sličan molarni udio pojedinačnih nukleotida 3. sastav nukletida se ne mijenja starenjem, ishranom ili promjenama u okolini i jednak je u

različitim tkivima iste vrste 4. pravila ekvivalencije: 8

a.

jednaki su molarni udijeli adenina i timina sa jedne strane, i guanina i citozina sa druge strane

b. udio piridinskih baza jednak je udijelu purinskih baza

4. STUPNJEVI KONDEZACIJE HROMATINA Hromatin predstavlja kompleks DNK, proteina i male količine RNK , prisutnih u jedru eukariotske ćelije. Najopštija, klasična definicija kaže da je hromatin sadržaj jedra u interfazi. Proteini hromatina su grupisani u dvije grupe: grupu histona i nehistonskih proteina.

Histoni su proteini sa kojima je neposredno zapakovana DNK eukariota. Prema sastavu i primarnom redosljedu aminokiselina svrstani su u pet grupa: H1, H2A, H2B, H3 i H4. Histoni su mali bazni globularni

proteini bogati aminokiselinama lizinom i argininom. Imaju izražen afinitet za vezivanje za DNK. U eukariotskom hromozomu masa histona jednaka je masi DNK.

Nehistonski proteini su obično prisutni u maloj količini i vezani su za specifične regione DNK. Oni kao

strukturne jedinice učestvuju u „pakovanju“ molekula DNK, a kao funkcionalne javljaju se u ulozi enzima i faktora odgovornih za replikaciju, transkripciju, regulaciju genske ekspresije i druge procese. Najjednostavniji i osnovni nivo pakovanja DNK u eukariotskom hromozomu je namotavanje oko

histonskog jezgra. Po dva molekula histona H2A, H2B, H3 i H4 grade osmočlano jezgro – oktamer, oko koga se obavija molekul DNK kao konac oko kalema. Pri tome segment DNK od približno 140 bp stvara nepuna dva navoja oko histonskog jezgra. Tako se formira struktura nazvana nukleozom, koja

predstavlja osnovnu jedinicu građe hromatina. Nakon kratkog segmenta od oko 60 bp „gole“ inter nukleozomske DNK, stvara se sljedeći kompleks histonsko jezgro -DNK. Nukleozomi i međunukleozomski

segmenti se smjenjuju duž molekula DNK. Ova struktura čini prvi nivo organizacije hromatina koji se naziva nukleozomna nit.

H1 ne ulazi u sastav samog nukleozomskog jezgra već se bočno vezuje za ivice dva susjedna nukleozoma. U njegovoj građi se razlikuje centralno „tijelo“ i „ruke“ koje čine N -terminalni i C-terminalni produžeci. Preko svojih „ruku“ histoni H1 povezuju susjedne nukleozome formirajući hromatinsku ili solenoidnu nit, koja predstavlja osnovni oblik hromatina u interfazi . Kada se hromatinska nit izloži niskim koncentracijama enzima dezoksiribonukleaze, doći će do hidrolize DNK na mjestima koja nijesu zaštićena histonima i to su tzv. hipersenzitivna mjesta. Ona imaju važnu ulogu u kontroli transkripcije gena, jer se za njih vezju regulatorni nehistonski proteini.

Histoni imaju i važnu ulogu u regulaciji aktivnosti gena. Bliska povezanost DNK i histona spriječava transkripciju te oni vrše nespecifičnu inaktivacjiu gena. Hromatinske niti se dalje savijaju u petlje dužine od 20 kb do 100 kb. Na osnovu morfoloških i funkcionalnih osobenosti postoje dva različita tipa hromatina: euhromatin i heterohromatin. Euhromatin se slabije boji, svjetliji je, rastresitiji – nije kondezovan, ranije se replicira i uglavnom sadrži genetički aktivne regione. Heterohromatin je tamniji, kondezovan, dobro

se boji i uglavnom je genetički neaktivan. Razlikuju se dva tipa heterohromatina. Konstitutivni 9

heterohromatin može da bude sa određenim, uvijek istim položajem na hromozomu, kao što je npr. heterohromatin u regionu centromera ili telomera. Drugi oblik konstitivnog hromatina ima promjenljiv

položaj. Fkultativni heterohromatin je onaj čije postojanje nije obavezno niti stalno. On zahata samo jedan homolog. Primjer fakultativnog heterohromatina je inaktivni X hromozom kod žena, poznat kao Barovo tijelo.

5. STRUKTURA RNA MOLEKULA Molekuli ribonukleinskih kiselina su polimeri ribonukleotida. Oni su u osnovi povezani na isti

način kao i polimeri nukleotida u DNK – 3'-5' fosfordiestarskim vezama. U njihovom sastavu za razliku od DNK, od šećera srećemo ribozu, a umjesto azotne baze timin nalazi se uracil, koji je takođe komplementaran sa adeninom. RNK su po pravilu jednolančani molekuli. Redosljed nukleotida u molekulu RNK odeđuje njegovu primarnu strukturu. Međutim, i nukleotidi u RNK se mogu komplementarno sparivati, pri čemu se parovi azotne baze A i U, odnosno C i G. Vodonične veze se većinom ostvaruju unutar jednog lanca, čime molekul poprima sekundarnu strukturu. Molekul RNK je daleko nestabiliniji od DNK. Molekuli RNK pokazuju veliku raznovrsnost funkcije. Uprkos razlikama, svim tipovima RNK je

zajedničko da se sintetišu kako komplementarne kopije DNK u procesu transkripcije. U eukariotskoj ćeliji oko 50% molekula RNK se nalazi u sastavu ribozoma, oko 24% je u citosolu, oko 15% u mitohondrijama, a samo 11% u jedru. Tri su osnovne grupe RNK: informaciona (iRNK ili mRNK), transportna (tRNK) i ribozomska

(rRNK). Molekuli iRNK su prenosioci genetičke informacije tj. poruke sa DNK na protein, i služe kako neposredna matrica za sintezu polipeptida. Redosljed nukleotida u iRNK se na ribozomima prevodi u redosljed aminokiselina u polipeptidu.

tRNK prenose aminokiseline do ribozoma, gdje se povezuju sa iRNK i učestvuju u prevođenju genetičke

šifre u redosljed aminokiselina u polipeptidu. 49 tipova tRNK funkcioniše u citoplazmi, a 22 i u miohondrijama kod Eukariota. Svi molekuli tRNK imaju karakterističnu sekundarnu strukturu u vidu djeteline sa tri lista.

rRNK su dobile naziv po tome što učestvuju u građi subjedinica ribozoma, čineći oko 65% njihovog

sastava. Novija saznanja ukazuju na njihovu katalitičku ulogu u toku sinteze polipeptida. Tako je utvrđeno da upravo rRNK, a ne protein, katalizuje formiranje peptidne veze između aminokiselina u toku translacije. Inače, danas se zna za veliki broj molekula RNK sa enzimskom aktivnošću, koji se oznočavaju kao ribozimi.

Pored navedenih osnovnih tipova RNK, kod eukariota postoje određene frakcije tzv. malih i mikro RNK koje su uglavnom uključne obradu i modifikaciju glavnih kategorija RNK i kontrolu sinteze proteina. 10

Male jedarne (nukleusne) RNK – snRNK (engl. sn – small nuclear) učestvuje u obradi primarnog prepisa iRNK.

Male nukleolusne (jedarceta) RNK – snoRNK (engl. sno – small nucleolar) vrše obradu i modifikaciju baza rRNK u jedarcetu – nukleolusu.

Mikro RNK – miRNK (engl. mi – micro) se vezuju za iRNK u citoplazmi i tako regulišu sintezu proteina. Antisens RNK su označene kao takve jer spriječavaju ekspresiju kodirajućeg tj. „sens“ niza na DNK. Glavna im je uloga u regulaciji genske aktivnosti putem komplementarnog vezivanja za molekul DNK. Ovdje spada i XIST (engl. XIST – X-inactive specific transcript) RNK koja je zadužena za inaktivaciju X

hromozoma kod žena.

RNK u sastavu enzima telomeraze, koji omogućava replikaciju telomernih regiona hromozoma, SRP (engl. SRP – signal recognition particle) RNK ili 7SL RNK ulazi u sastav kompleksa koji prepoznaje signalnu

sekvencu na proteinima i omogućuje njihov prolaz kroz ćelijsku membranu. Pored strukturnih razlika između DNK i RNK, važno je napomenuti da DNK u prisustvu alkalija ne hidrolizuje, kao što je to slučaj sa RNK.

6. REPLIKACIJA DNA Replikacija je proces udvajanja molekula DNK. Pri tom se od jednog molekula DNK dobijaju dva

nova molekula koja su identična sa njime kao i međusobno. Naime, prije nego što se ćelija podijeli, ona mora produkovati novu kopiju svakog hromo zoma, dakle mora obaviti replikaciju DNK da bi majka ćelija mogla da prenese identičnu kopiju nasljednog materijala obijema ćerkama ćelijama. Na taj način proces replikacije obezbijeđuje stalnost u količini i sadržaju DNK, a time i konstantnost u prenosu g enetičke informacije između ćelija. U hemijskom pogledu replikacija je proces sinteze molekula DNK. Ona se zasniva ma sposobnosti

autoreprodukcije DNK, pri čemu svaki od dva polinukleotidna lanca služi kao model – matrica za sintezu novog lanca, a time i stvaranje novog molekula DNK. Po završetku replikacije nastaju dva molekula DNK, a oba sadrže jedan stari – roditeljski i jedan novi – novosintetisani lanac. Ovakav model replikacije označen je kao semikonzervativan. Replikacija DNK zahtijeva prisustvo čitavog niza enzima i proteina koji čine replikacionu mašineriju. Enzimi učestvuju u procesima vezanim za sintezu nukleinskih kiselina mogu se po svojoj aktivnosti mogu svrstati u tri osnovne grupe: polimeraze, nukleaze i ligaze. Polimeraze su enzimi koji

vrše polimerizaciju nukleotida u lance, katalizujući formiranje fosfordiestarskih veza. Sineteza se vrši po principu komplementarnosti između nukleotida. Nukleaze su enzimi koji raskidaju fosfordiestarske veze između dva nukleotida u lancu, a mogu biti: 1. Egzonukleaze raskidaju terminalne veze odvajajući tako posljednji nukletid iz lanca.

11

2. Endonukleaze raskidaju unutrašnju fosfordiestarsku vezu unutar polinukletidnog lanca, sjekući ga time na fragmente.

Ligaze, suprotno endonukleazama, formiraju fosfordiestarske veze između dva fragmenta DNK – one

znači vezuju djelove skeleta. Najznačajniju grupu enzima u replikaciji čine DNK polimeraze. Njihova osnovna funkcija je u sintezi novih lanaca DNK. Po principu komplementarnosti sa matičnim lancem one biraju nukleotide i vezuju ih u polinukletidni niz. Sinteza se uvijek vrši u smjeru 5' -3', što znači da se novi nukleotid svojom 5'PO3 grupom vezuje za 3'OH grupu prethodnog nukleotida. Prekursorski nukleotidi, spremni za ugradnju se nalaze u obliku nukleozid-trifosfata, a energija potrebna za uspostavljanje fosfordiestarske veze se obezbijeđuje hidrolizom dva fosfatna ostatka. Aktivnost DNK polimeraza katalizuje jon Mg++. DNK polimeraze imaju i egzonukleaznu aktivnost, zahvaljujući kojoj mogu da isjeku i uklone posljednji

nukleotid u nizu. Većina DNK polimeraza ima egzonukleazno djelovanje u smjeru 3' -5' tj. Suprotno od smjera polimerizacije. Ipak DNK polimeraza I kod prokariota ima 5'-3' egzonukleaznu aktivnost. Zbog svoje egzonukleazne aktivnosti DNK polimeraze nisu u stanju da započnu sintezu novog lanca, već je

primaza enzim koji započinje replikaciju, a čini ga kratki segment RNK nazvan RNK početnica (prajmer).

Replikacija DNK može se podijeliti u tri faze: incijacija, elongacija i terminacija. REPLIKACIJA KOD PROKARIOTA Za fazu icijacije kod Prokariota značajno je da se na cirkularnom molekulu DNK nalazi samo jendo

specifično mjesto na kome počinje process replikacije – inicijalno mjesto. Stoga čitav prokariotski hromozom čini jedan replikon. Mjesto početka replikacije je rgion očuvane structure u kome se uz učešće enzima DNK helikaze vrši raskidanje vodoničnih veza. Denaturacijia je olakšana jer je mjesto početka replikacije bogato parovima A -T, koji su povezani sa svega dvije vodonične veze . U regionu raskidanja vodoničnih veza dolazi do razmicanja dva antiparalelna lanca DNK, što se uočava kao mjehur. U replikacionom mjehuru oba lanca DNK služe kao modeli za stvaranje komplementarnih lanaca. Dvije helikaze se vezuju za inicijatno mjesto replikacije i kreću se u suprotnim smjerovima, zahvaljujući energiji koju dobijaju hidrolizom ATP-a. Na taj način se sa obije strane replikacionog početka formiraju, replikacione viljuške u obliku slova „Y“. Da bi se stabilizovale jednolančane strukture u rep likacionoj viljušci za njih se vezuju SSB (eng. single strain binding) proteini. Tek nakon stabilizacije replikacione viljuške započinje sinteza novog lanca, za koju je odgovoran enzim primaza. Primaza ugrađuje komplementarne ribonukleotide i formira RNK početnicu. S obzirom da RNK početnica sadrži slobodnu 3'OH grupu na svom posljednjem nukleotidu, ona time stvara mogućnost za aktivaciju DNK polimeraze, koja može da nastavi proces sinteze ugrađivanjem dezoksiribonukleotida. Time se završava prva, a počinje druga faza replikacije označena kao elongacija. Elongacija podrazumijeva proces sinteze tj. rasta novih lanaca DNK. Sinteza se obavlja u oba smjera u odnosu na

inicijalno mjesto replikacije, što je označeno kao bidirekciona replikacija. Glavni enzim replikacije kod Prokariota je DNK polimeraza III, koja se naziva replikaza. Ovaj enzim je zapravo dio velikog

multimernog kompleksa od bar deset subjedinica. Po principu komplementarnosti sa matričnim lancem DNK polimeraza III bira nukleotide i vezuje ih u polinukleotidni niz, a sinteza se vrši u smjeru 5' -3'. Važno 12

je istaći da DNK polimeraza III ima i egzonukleaznu aktivnosti, za koju je zadužena posebna subjedinica. Egzonukleazna aktivnost se odvija u smjeru 3'-5', a ogleda se u uklanjanju pogrešno ugaređenih , nekomplementarnih nukleotida. Naime, DNK polimeraza III nakon povezivanja određenog nukleotida obavlja provjeru da li je on korektno sparen, a ukoliko nije vrši njegovo isjecanje. To je tzv. editorska samoksrcujuća funkcija DNK polimeraze. Matrični lanc i – kalupi za replikaciju su antiparalelni, sinteza polinukleotidnog lanca se uvijek vrši u smjeru 5' -3' i u okviru ove faze jasno se izdvaja sinteza jednog vodećeg i drugog zaostajućeg lanca. a) Sinteza vodećeg lanca: Na jednom matičnom lancu – kalupu proces elongacije se vrši kontinuirano. Pri tome DNK polimeraza III neposredno slijedi aktivnost helikaze koja otvara

replikacionu viljušku. Tako sintetisani novi lanca se naziva vodeći lanac. b) Sinteza zaostajućeg lanca: Ovaj lanac se konstituiše u smjeru suprotnom od smjera otvaranja replikacione viljuške. Iz tog razloga on se formira dio po dio – diskontinuirano, a svaki dio ima svoju novu RNK početnicu. Djelovi zaostajućeg lanca se nazivaju Okazakijevi fragmenti. U sintezi ovog lanca učestvuje poseban proteinski kompleks nazvan primozom, koji u svom sastavu ima DNK helikazu, primazu i još pet proteina. Primozom se kreće duž matričnog lanca DNK i na određenim mjestima sintetiše RNK početnice. Za njih se vezuje DNK polimeraza III koja nastavlja elongaciju pojedinih Okazakijevih fragmenata u smjeru 5'-3' tj. suprotno od smjera

otvaranja replikacione viljuške. Uklanjanje RNK početnice obezbijeđuje enzim DNK polimeraze I (Kornbergov enzim). Ovaj enzim je građen od samo jendog polipeptidnog lanca, koji ima klasičnu polimeraznu aktivnost u smjeru 5'-3' i egzonukleaznu aktivnost u oba smjera. To mu omogućava da uklanja jedan po jedan ribonukleotid RNK početnice, i istovremeno popunjava nastalu prazninu dezoksiribonukleotidima koje vezuje za posljednji nukleotid prethodnog Okazakijevog fragmenta. Okazakijeve fragmente povezuje enzim ligaza. Tokom čitave replikacije rasplitanje lanca molekula DNK i otvaranje replikacionih viljuški potpomognuto je aktivnošću helikaza i SBB proteina. Pored toga, značajnu ulogu u procesu replikacije imaju enzimi DNK

topoizomeraza I i II. Ovi enzimi su reverzibilne endonukleaze, koje spriječavaju formiranje supernavoja

pri raskidanju vodoničnih veza u dvostrukoj spir ali DNK. DNK topoizomeraza I uklanja sabijanje navoja molekula DNK u korijenu replikacione viljuške tako što najprije presjeca jedan lanac DNK, omogućava njegovu despiralizaciju, a zatim katalizuje pnovno spajanje presječenih krajeva. Jedna DNK polimeraza II nazvana žiraza presjeca oba lanca DNK, rotira molekul u suprotnom smejru tj. dodaje „negativne“ supernjavoje, a zatim pnovo spaja prekinute krajeve.

Završna faza replikacije DNK je terminacija – završetak replikacije, koji se izvodi takođe na specifičnom mjestu – replikacionom završetku. Replikacioni završetak se nalazi tačno naspram mjesta početka replikacije i omogućava koordinisano susretanje dvije replikacione viljuške uz učešće odgovarajućih proteina terminacije. Po obavljenoj replikaciji enzim topoizomeraza II presjeca oba matična lanca, čime se omogućava odvajanje novonastalih molekula DNK. REPLIKACIJA KOD EUKARIOTA

Replikacija kod Eukariota se vrši isključivo u S fazi interfaze.

13

Kao i kod prokariota, i kod eukariota je replikacija semikonzervativna, a istovremeno i bidirekciona, u jednom vodećem lancu kontinuirana, a u drugom – zaostajućem lancu diskontinuirana. U Eukariotskoj

ćeliji postoji više tipova DNK polimeraza: DNK polimeraza (delta) vrši replikaciju vodećeg lanca. DNK polimeraza (alfa) počinje replikacju zaostajućeg lanca, s tim što posjeduje i primaznu aktivnost. DNK polimeraza (gama) vrši replikaciju mitohondrijalne DNK. DNK polimeraza (beta) je reparacioni enzim, a za DNK polimerazu (epsilon) se smatra da može da učestvuje u sintezi vodećeg lanca. Duž svakog dvostrukog lanca DNK postoje brojna inicijalna mjesta odakle počinje proces replikacije. Ukoliko se ćelija brže dijeli tim je broj replikacionih početaka na hromozomima već što omogućava veću brzinu replikacije. Replikacioni počeci se ne aktiviraju svi istovremeno, pa se različiti replikoni istog molekula replikuju u različitom vremenu u toku S faze. Regioni rastresitog i aktivnog hromatina se replikuju rano u S fazi. Tzv. „house keeping“ geni, koji su aktivni u svim ćelijama jednog organizma, se takođe repliciraju vrlo rano u S fazi. Jako kondezovani i neaktivni heterohromatin replikuje se uvijek kasnije. Takođe, kod žena, Barovo tijelo se uvijek kasnije replicira u odnosu na drugi, aktivni X hromozom.

Regioni replikacionih početaka imaju specifičnu strukturu i označeni su kao ARS elemnti (eng. autonumosly repliacation sequences). Proces inicijacije je pod kontrolom specifičnih proteina (RFA i RFC – engl. replication factor A and replication factor C ) koji se vezuju za hromatin i obezbijeđuju da se svaki region replikujesamo jedanput u jednom ciklusu sinteze. U vodećem lancu sintezu RNK početnice vrši enzim primaza, a polimerizaciju nastavlja DNK polimeraza

 Ovaj enzim je aktivan isključivo u prisustvu proteina PCNA (engl. proliferating cell nuclear antigen) , koji se nalazi samo u ćelijama koje se dijele. DNK polimeraza  je enzim građen od dvije subjedinice koji pored 5'-3' polimerazne aktivnosti ima i 3'-5' egzonukleaznu aktivnost. U zaostajćem lancu sintezu započinje DNK polimeraza  čija jedna subjedinica ima primaznu aktivnost

pa je označena kao DNK primaza. Elongaciju zaostajućeg lanca nastavlja DNK polimeraza  U fazi terminacije, specifičnost se odnosi na replikaciju krajeva linearnih molekula DNK, koji odgovaraju

telomerama eukariotskih hromozoma. Telomere su izgrađene od tandemskih ponavljanih nizova nukleotida (TTAGGG). Naime, na samom 5' kraju novosintetisanog zaostajućeg lanca nakon uklanjanja RNK početnice ostaje praznina. DNK polimeraza sa svojom 5'-3' sintetskom aktivnosti ne može da izvrši popunjavanje ove praznine, jer nedostaje nukleotid sa slobodnom 3'-OH grupom od koga bi počela polimerizacija. Iz tog razloga se sa svakom polimerizacijom hromozomi eukariota sve više skraćuju, da bi nakon određenog broja ciklusa došlo do prestanka diobe i smrti ćelije. Međutim, za vrijeme embrionalog razvića postoji specijalni enzim za repliciranje telomera koji ne uključuje uobičajenu replikacionu mašineriju. Tu ulogu obavljaju enzi mi telomeraze koji se sastoje od proteinske komponente i segmenta RNK. Telomeraza počinje svoju aktivnost vezivanjem na starom lancu koji je ostao nerepliciran, i uz pomoć RNK fragmenta kao matrice sintetiše niz nukleotida koji će produžiti ovaj lanac za n ekoliko telomernih ponavaka. RNK se zatim koristi kao početnicu na koju će se dodavati dezokisribonukleotidi radi popunjavanja praznine na novom lancu. Na taj način se postiže normalna dužina novog lanca i spriječava skraćivanje telomera. 14

Važno je istaći da replikacija kompletnog hromozoma kod Eukariota uključuje ne samo replikaciju DNK već i sintezu histona i nehistonskih proteina. Za razliku od ostalih proteina čija se sinteza odvija u G1 ili G2 periodu interfaze, histoni se sintetišu upravo u S fazi inte rfaze.

7. STRUKTURA GENA KOD PROKARIOTA U klasičnoj genetici gen je bio definisan kao dio molekula DNK koji sadrži informaciju za sintezu jednog polipeptidnog lanca. Po savremenoj definiciji gen je dio molekula DNK koji nosi informaciju za sintezu bilo kog molekula RNK . Gen je dio molekula DNK potreban za stvaranje funkcionalnog produkta, bilo da je to protein ili funkcionalni molekul RNK . Geni za polipeptide tj. za proteine često se označavaju kao strukturni geni. Geni čiji je krajnji produkt neki od molekula RNK su i označeni kao RNK geni.

Sastavni djelovi gena su i susjedni segmenti. Najvažniji je promotor, koji se nalazi na kraju gena i sadrži nazove nukleotida neophodne za ispravno započinjanje transkripcije. Ostali regulatorni regioni kontrolišu količinu vrijeme i mjesto sinteze datog tipa RNK. U genima Prokariota genetička informacija je kontinuirana, tj. prostire se bez prekida u određenom segmentu molekula DNK. Jedan promotor po pravilu kontroliše transkripciju više gena u nizu, a ostali regulatorni djelovi su u blizini promotora ili se sa njim preklapaju.

Od saznanja da geni kontrolišu strukturu polipeptida, pažnja istraživača je bila usmjerena na pitanje kako nizovi od četiri različita nukleotida u DNK kontrolišu strukturu I funkciju protein građenih od 20 aminokiselina. Polazeći od broja različitih aminokiselina u sastavu proteina (20) I broja azotnih baza u 3 zaključka da niz od tri baze – triplet predstavja šifru za jednu molekulu DNK i(4), došlosu se 4do =64 kombinacije tripleta nukleotida. aminokiselinu moguće

Skup tripleta nukleotidnih baza koji predstavlja šifru za pojedine aminokiseline označen je kao genetički kod. U užem smislu kod je naziv za triplet baza DNK. Njima komplementarni triplet baza iRNK označeni su kao kodoni. Triplet baza tRNK koji je komplementaran kodonu naziva se antikodon. Pokazalo se da od 64 kodona njih 61 određuje aminokiseline. Preostala tri kodona: UAA, UGA i UAG su označeni kao besmisleni ili nonsens kodoni, jer su oni jedini koji ne nose informaciju ni za jednu aminokiselinu. Međutim, kasnije je utvrđeno da ovi kodoni imaju posebnu i specifičnu funkciju, jer predstavljaju signal za završetak sinteze polipeptida. Zato su nazvani terminacioni ili stop kodoni. Eksperiment je takođe pokazao da startni signal u sintezi polipeptida predstavlja kodon AUG, koji određuje aminokiselinu metionin. Iz tog razloga je u svim polipeptidima koji se sintetišu u ćeliji upravo metionin početna – inicijalna aminokiselina. Genetiči kod je je univerzalan (isti za sve forme života na Zemlji, ali su pronađena izvjesna istupanja kod mitohondrijalne DNK), specifičan (jedan kodon uvijek oderđuje jednu te istu aminokiselina), degenerativan (više od jednog kodona određuje jednu te istu aminokiselinu), nepreklopljiv (jedna baza može istovremeno pripadati samo jednom kodonu) i kolebljiv (komplementarnost kodona i antikodona nije striktna).

15

Dok je gen osnovna jedinica naslijeđivanja, genom je kompletan nasljedni materijal jednog organizma. Ovaj pojam obuhvata sve gene.

Osnovne karakteristike genoma su njegova ukupna veličina, izražena u baznim parovima i broj i

vrsta gena koje sadrži . U pogledu građe, posmatra se da li su neki segmenti genoma po svom nukleotidnom sastavu jedinstveni, ili se javljaju više puta u haploidnom setu nasljednog materijala. Odakle proizlazi podjela na jedinstvene nizove nukleotida i nizove nukleotida koji se ponavljaju tj. koji su repetitivni. Nizovi koji se ponavljaju, prema broju kopija, dijele se na umjereno-repetitivne i visoko-repetitvne nizove.

U pogledu funkcije, za osnovna klasifikacija se odnosi na sadržaj informacije. nose genetičku informaciju bilo koju RNK se nazivaju kodirajući genigenetičke , dok su regioni koji neRegioni sadrže koji genetičku informaciju označeni kao nekodirajući. Kodirajući regioni se dalje klasifikuju prema tome koji molekul je njihov krajnji produkt – polipeptid ili neki molekul RNK. Genomi prokariota su mali po veličini jer nasljedni materijal prokariota predstavlja jedan jedini kružni molekul DNK, uz event ualno postojanje plazmida. Organizacija ovako haploidnog genoma je jednostavna: većinu molekula DNK zauzimaju kodirajući regioni tj. geni, dok je mali dio DNK bez genetičke informacije. Kod prokariota se geni srodne funkcije najčešće nalaze u n izu, pod kontrolom istog promotora. Segmenti koji se ponavljaju su rijetki, i odnose se uglavnom na RNK gene.

8. STRUKURA GENA KOD EUKARIOTA U klasičnoj genetici gen je bio definisan kao dio molekula DNK koji sadrži informaciju za sintezu jednog polipeptidnog lanca. Po savremenoj definiciji gen je dio molekula DNK koji nosi informaciju za sintezu bilo kog molekula RNK . Gen je dio molekula DNK potreban za stvaranje funkcionalnog produkta, bilo da je to protein ili funkcionalni molekul RNK . Geni za polipeptide tj. za proteine često se označavaju kao strukturni geni. Geni čiji je krajnji produkt neki od molekula RNK su i označeni kao RNK geni.

Sastavni djelovi gena su i susjedni segmenti. Najvažniji je promotor, koji se nalazi na kraju gena i sadrži nazove nukleotida neophodne za ispravno započinjanje transkripcije. Ostali regulatorni regioni kontrolišu količinu vrijeme i mjesto sinteze datog tipa RNK. Geni Eukariota su složene strukture. Prije svega, za gene koji kodiraju polipeptide karakterističan je diskontinuitet genetičke informacije. Tipičan eukariotski gen sadrži djelove koji nose genetičku informaciju – egzone, između kojih se nalaze segmenti koji ne nose genetičku informaciju — introni. Dokazano je da se prilikom transkripcije prepisuje čitav gen dajući primarni prepis iRNK; zatim se u

procesu obrade introni isijecaju dok se egzone međusobno povezuju u zrelu iRNK. Pored navedenog, u genima za polipeptide i na 5' i 3' kraju se nalaze djelovi koji neće biti prevedeni u protein, ali ulaze u sastav zrele iRNK, i imaju bitnu ulogu u regulaciji translacije. To su 5' UTR (engl. untranslated region) region, označen kao čeoni niz, i 3' UTR region označen i kao trailer. Svaki eukariotski gen za polipeptide ima svoj poseban promotor.

16

Svaki gen zauzima određeno mjesto na hromozomu, koje se naziva genski lokus. Postupak kojim se utvrđuje položaj gena na hromozomu predstavlja mapiranje gena. Od saznanja da geni kontrolišu strukturu polipeptida, pažnja istraživača je bila usmjerena na pitanje kako nizovi od četiri različita nukleotida u DNK kontrolišu strukturu I funkciju protein građenih od

20 aminokiselina. Polazeći od broja različitih aminokiselina u sastavu proteina (20) I broja azotnih baza u molekulu DNK (4), došlo se do zaključka da niz od tri baze – triplet predstavja šifru za jednu aminokiselinu i moguće su 43=64 kombinacije tripleta nukleotida. Skup tripleta nukleotidnih baza koji predstavlja šifru za pojedine aminokiseline označen je kao genetički kod. U užem smislu kod je naziv za triplet baza DNK. Njima komplementarni triplet baza iRNK označeni su kao kodoni. Triplet baza tRNK koji je komplementaran kodonu naziva se antikodon. Pokazalo se da od 64 kodona njih 61 određuje aminokiseline. Preostala tri kodona: UAA, UGA i UAG su označeni kao besmisleni ili nonsens kodoni, jer su oni jedini koji ne nose informaciju ni za jednu aminokiselinu. Međutim, kasnije je utvrđeno da ovi kodoni imaju posebnu i specifičnu funkciju, jer predstavljaju signal za završetak sinteze polipeptida. Zato su nazvani terminacioni ili stop kodoni. Eksperiment je takođe pokazao da startni signal u sintezi polipeptida predstavlja kodon AUG, koji određuje aminokiselinu metionin. Iz tog razloga je u svim polipeptidima koji se sintetišu u ćeliji upravo metionin početna – inicijalna aminokiselina. Genetiči kod je je univerzalan (isti za sve forme života na Zemlji, ali su pronađena izvjesna istupanja kod mitohondrijalne DNK), specifičan (jedan kodon uvijek oderđuje jednu te istu aminokiselina), degenerativan (više od jednog kodona određuje jednu te istu aminokiselinu), nepreklopljiv (jedna baza može istovremeno pripadati samo jednom kodonu) i kolebljiv (komplementarnost kodona i antikodona nije striktna). Dok je gen osnovna jedinica naslijeđivanja, genom je kompletan nasljedni materijal jednog organizma. Ovaj pojam obuhvata sve gene.

Osnovne karakteristike genoma su njegova ukupna veličina, izražena u baznim parovima i broj i

vrsta gena koje sadrži . U pogledu građe, posmatra se da li su neki segmenti genoma po s vom nukleotidnom sastavu jedinstveni, ili se javljaju više puta u haploidnom setu nasljednog materijala. Odakle proizlazi podjela na jedinstvene nizove nukleotida i nizove nukleotida koji se ponavljaju tj. koji su repetitivni. Nizovi koji se ponavljaju, prema broju kopija, dijele se na umjereno-repetitivne i visoko-repetitvne nizove.

U pogledu funkcije, osnovna klasifikacija se odnosi na sadržaj genetičke informacije. Regioni koji nose genetičku informaciju za bilo koju RNK se nazivaju kodirajući geni, dok su regioni koji ne sadrže genetičku informaciju označeni kao nekodirajući. Kodirajući regioni se dalje klasifikuju prema tome koji molekul je njihov krajnji produkt – polipeptid ili neki molekul RNK. Genom eukariota se preciznije definiše kao kompletan nasljedni materijal sadržan u haploidnom setu hromozoma. Mnogi pak pod genomom podrazumijevaju ukupnu količinu nasljednog materijala – DNK jedne diploidne tjelesne ćelije. U svakom slučaju kod eukariota se radi zapravo o dva genoma: 1. Genom jedra obuhvata nasljedni material sadržan u haploidnom setu hromozoma. Može se

takođe reći da jedan genom tjelesnih ćelija eukariota sadrži dva haploidna genoma: jedan naslijeđen od oca, drugi od majke. 17

2. Mitohondrijalni genom predstavlja kružni molekul DNK – mitohondrijalni hromozom. On sadrži relativno mali broj gena koji kontrolišu sintezu proteina u samim mitohondrijama, a po strukturi

je veoma sličan genomu prokarita. Ukupna količina DNK, u genomu je karakteristična za određenu vrstu organizma. To je u literaturi označeno kao tzv. C-vrijednost. Pokazalo se da je u načelu C-vrijednost u neposrednoj korelaciji – zakonitom odnosu sa stepenom složenosti građe organizma. Pored veličine genoma i broj gena se u načelu povećava sa složenošću organizma. Istovremeno, povećava se i udio

nekodirajuće DNK.

9. TRANSKRIPCIJA

Transkripcija je process kopiranja genetičke informacije sa molekula DNK na molekul RNK. To je

biohemijski proces sinteze svih tipova RNK koja se zasniva na istim osnovnim principima. Prije svega, kao model za sintezu ne koristi se cio molekul DNK, već samo jedan određeni dio molekula – gen. U procesu transkripcije samo jedan od dva polinukleotidna lanca molekula DNK (matrični lanac) služi kao matrica za sintezu RNK. Drugi, njemu komplementaran lanac DNK je

nematrični. Redosljed nukleotida nematričnog lanca je identičan redosljedu nukleotida u sintetisanom

molekulu RNK s tom razlikom što je timin u DNK zamijenjen uracilom u RNK. Stoga se nematrični lanac naziva i kodirajući ili sens. Za sprovođenje transkripcije odgovoran je enzim RNK polimeraza. Ona kao supstrat koristi ribonukleozid-trifosfate koje ugrađuje u rastući lanac nukleotida, uz oslobađa nje pirofosfata. Za razliku od DNK polimeraze, RNK polimeraza ne posjeduje samoksrcujuću aktivnost i može

samostalno da započne sintezu polinukleotidnog lanca. RNK polimeraza, kao i DNK polimeraza, ima 5'-3' polimeraznu aktivnost. To znači da se fosfordiestarska veza uspostavlja između 3'OH grupe prethodnog i 5'PO3 grupe novog nukleotida u lancu, a energija za ovaj proces se obezbijeđuje hidrolizom pirofosfata. Lanac RNK se uvijek sintetiše uvijek u smjetu 5 '-3', dok se matrični lanac očitava u

suprotnom, 3'-5' smjeru. Dok kod Prokariota samo jedan tip RNK polimeraze transkribuje sva tri tipa RNK, kod Eukariota postoje bar tri različita tipa RNK polimeraza. RNK polimeraza I nalazi se samo u nukleolusu i katalizuje

transkripciju 3 od 4 postojeće rRNK. RNK polimeraza II sintetiše sve iRNK i neke snRNK. RNK polimeraza III sintetiše tRNK, 5S rRNK 1i preostale snRNK. Transkripcija svih vidova RNK ima četiri osnovne faze: prepoznavanje promotora, inicijaciju, elongaciju i terminaciju. Prepoznavanje promotora:

1

5S rRNK se sastoji od otprilike 120 nukleotida, strukturna je i funkcionalna komponenta velike subjedinice

ribozoma, a oznaka 5S se odnosi na brzinu sedimentacije molekula u ultracentrifugi, što se izražava pomoću jedinice svedberg (1S=10-13s)

18

Promotor je segment molekula DNK specifične strukture, koji enzim RNK polimeraza prepoznaje i vezuje se za njega. Prepoznavanje promotora je signal za despiralizaciju i raskidanje vodoničnih veza u

molekuli DNK: dva lanca se razdvajaju da bi jedan od njih poslužio kao matrica za prepisivanje. Denaturacija molekula se odigrava u malom fragmentu čime se formira sočivasta struktura označena kao transkripcioni mjehur. Inicijacija sinteze:

RNK polimeraza može samostalno da počne sintezu polinukleotidnog lanca, pa za ovaj proces nije potrebno prethodno formiranje prajmera. Prvi — startni nukleotid segmenta DNK koji se prepisuje označen je kao +1, dok je nukleotid ushodno od njega -1. (Obilježavanje se odnosi na kodirajući, a ne na matrični lanac DNK.) Poslije ugradnje prva dva ribonukleotida komplementarna matičnom lancu DNK i formiranja fosfordiestarske veze završava se inicijacija i počinje sljedeća faza. Elongacija lanca:

RNK polimeraza kreće da se nastavlja duž matričnog lanca DNK u 3'-5' smjeru; po principu komplementarnosti sa ovim lancem ona bira i ugrađuje ribonukleotide u rastući lanac i povezuje ih formirajući fosfordiestarske veze u smjeru 5'-3' . Kako se RNK polimeraza pomjera, pomjera se i transkripcioni mjehur koji ostaje iste veličine. Terminacija sinteze:

Terminacija sinteze zavisi od tipa organizma i molekula RNK koji se sintetiše. Transkripcija kod Eukariota se odvija u jedru, a procesi transkripcije i translacije su međusobno odvojeni. SINTEZE INFORMACIONE RNK

Transkripciju gena za polipeptide tj. sintezu iRNK kod Eukariota vrši RNK polimeraza II, koja je veliki molekul sastavljen od 10 subjedinica. Kod Eukariota svaki gen za polipeptide daje svoj pojedinačni prepis, pa je iRNK uvijek monocistronska.

U eukariotskom genomu postoji veliki broj segmenata DNK uključenih u regulaciju transkripcije, koji se jednim imenom nazivaju regulatorni elementi.

Promotor se nalazi neposredno ushodno od startnog mjesta transkripcije. Region promotora se

sastoji od nekoliko specifičnih segmenata koji su nazvani promotorski elementi. Mjesto početka transkripcije određuju elemenati u tzv. srži promotora koji imaju stalan položaj. Najznačajniji je TATA blok nukleotida koji se nalazi u regionu -25 (tj. oko 25 nukleotida ispred startnog mjesta). Sekvenca ovog bloka je 5’-TATAAA-3’, a okružen je regionom bogatim GC nukleotidima. Promjena strukture TATA bloka ne mijenja nivo transkripcije ali dovodi do pomjeranja mjesta od kog transkripcija započinje. Značajni su i BRE2 (engl. B recognition element) na poziciji -35, inicijatorski niz na samom startnom mjestu i tzv. DPE3 (engl. downstream promoting element) na poziciji +30.

2

BRE (engl. B recognition element) je niz u molekulu DNK kojeg prepoznaje TFII-B (Transcription Factor IIB) DPE (engl. downstream promoting element) je promotorski element kojeg prepoznaju subjedinice TFIID (Transcription Factor IID) 3

19

Intenzitet transkripcije regulišu elementi u tzv. proksimalnom promotorskom regionu, koji se nalazi u regionu -50 do - 200 od mjesta početka transkripcije. Najznačajniji su CAAT blok i GC blok, koji se

obično nalaze u više kopija. Oba segmenta djeluju na pojačavanje transkripcije. Pored promotora kao osnovnog regulatornog elemenata koji je neophodan za početak transkripcije, postoje i posebni elementi koji utiču na intenzitet transkripcije, kao što su pojačivači koji povećavaju nivo transkripcije i prigušivači koji ga smanjuju. U prvoj fazi transkripcije neophodno je da RNK polimeraza II prepozna promotor i veže se za njega. U ovom procesu neophodno je i učešće kompleksa proteina, poznati kao opšti transkripcioni faktori. Transkripcioni faktori (TF) vezani za funkciju RNK polimeraze II su i označeni kao TFII, i slovima abecede (identifikovano ih je bar osam: A-J). Prvi se vezuje TFII-D, koji neposredno prepoznaje TATA blok. Zatim se po određenom redosljedu uključuju i ostali TFII , a samu RNK polimerazu II donosti TFII-F. Na taj način se na promotoru formira proteinsko-enzimski kompleks označen kao preinicijacioni kompleks (PIK), koji je preduslov za započinjanje transkripcije.

Neophodno je da dođe do aktivacije PIK-a koja se vrši uz hidrolizu ATP-a i katalitičko djelovanje TFII-H. Tek potom, RNK polimeraza II može da počne sintezu RNK lanca. Važno je reći da se u procesu transkripcije prepisuje čitav gen, uključujući egzone, introne i UTR regione. Produkt ove sinteze je primarni transkript ili primarni prepis iRNK, skraćeno nazvan pre-iRNK. Zanimljivo je da terminacija transkripcije iRNK kod Eukariota nije precizno regulisana, a brzina i vrijeme trajanja transkrpcije pre-iRNK kod Eukariota jako varira. U jedru Eukariotske ćelije nastaje veliki broj primarnih prepisa koje produkuje RNK polimeraza II. Ovi molekuli su izrazito raznoliki kako po veličini tako i strukturi, pa se nazivaju heterogene nuklearne

RNK (hnRNK). OBRADA PRIMARNOG PREPISA iRNK Primarni prepis mora biti modifikovan kroz seriju događaja koji su označeni kao obrada RNK. Obrada se odvija u jedru, a nakon nje nastaje zrela iRNK.

Obrada 5' kraja primarnog prepisa obuhvata dodavanje cap strukture ili kape, koju čini 7-metil guanozin. On se vezuje za početni 5'-nukleotid neuobičajenom 5'-5' vezom uz pomoć „capping“ enzima. Cap struktura ima veoma važnu ulogu u vezivanju ribozoma za 5' kraj iRNK i inicijaciju translacije. Obrada 3' kraja primarnog prepisa podrazumijava njegovu modifikaciju dodavanjem niza od oko 50-250 nukleotida adenina, koji se naziva poli(A) rep. Transkripcija iRNK može da se nastavi i 100 ili 1000

nukleotida iza specifičnog mjesta koje se zove poli(A) mjesto. Neposredno iza ovog mjesta transkript će biti naknadno presječen, a enzim poli-A polimeraza dodaje adenine na 3'OH grupu posljednjeg nukleotida. Poli(A) rep je važan za stabilnost iRNK jer je štiti od degradacije ribonukleazama. Pored toga on pomaže pri transportu iRNK iz jedra u citoplazmu. Sljedeća faza obrade primarnog prepisa iRNK je isijecanje introna, da bi u zreloj iRNK ostale samo kodirajući djelovi tj. kontinuirani niz egzona. Ovaj proces se često naziva splajsovanje ili splajsing. Faza isijecanja introna je od ključnog značaja. U isijecanju introna iz pre-iRNK učestvuju molekuli snRNK, enzim nukleaza i još nekoliko proteina, koji zajedno čine ribonukleo -proteinski kompleks označen kao snRPP. Vezivanjem snRNP kompleksa za pre-iRNK formira se splajsozom. U svim eukariotskim genima 20

introni počinju nizom GT (tj. GU u pre-iRNK), koji je označen kao donorsko mjesto, a završavaju se nizom AG, koji je akceptorsko mjesto obrade. Očito su ovi dinukleotidi ključni signali za prepoznavanje introna, koji kontrolišu njihovo savršeno precizno isijecanje i uklanjanje iz kodirajućeg niza. Sumarno, zrela iRNK Eukariota ima sljedeću strukturu: na početku je 5' kapa, slijedi neprevodivi 5'UTR tj. čeoni niz na koji se nastavlja startni kodon, a zatim kodirajući niz sa stop kodonom na kraju; poslije 3'UTR molekul se završava poli -A repom. TRANSKRIPCIJA RIBOZOMSKE RNK

Kod Eukariota postoji veliki broj kopija gena za rRNK . Tako se geni za 18S, 28S i 5.8S rRNK

nalaze u nizu i to ponovljeni u više tandemskih kopija. Svaki niz od tri gena ima zajednički promotor i stoga predstavlja jednu transkripcionu jedinicu čije prepisivanje vrši RNK polimeraza I. Zajednički primarni transkript koji pri tom nastaje je 45S rRNK. Isijecanjem primarnog transkripta pomoću

specifičnih ribonukleaza dobijaju se zrele 18S, 28S i 5.8S rRNK. U genomu postoji više regiona u kojima se nalaze kopije rRNK gena; kod čovjeka oni se nalaze na kratkim kracima svih akrocentičnih hromozoma. Oko rRNK gena se formira jedarce ili nukleolus, pa se oni i nazivaju regioni organizatori nukleolusa (NOR-ovi). U regionu nukleolusa se vrši ne samo transkripcija rRNK, već i isijecanje 4S rRNK i formiranje ribozomskih jedinica povezivanjem rRNK molekula sa ribozomskim proteinima. U odnosu na to, u strukturi nukleolusa se od centra prema periferiji mogu razlikovati tri zone: hromozomska, fibrilarna i granularna. Hromozomsku zonu čine sami geni za RNK tj. NOR-ovi. U fibrilarnoj zoni se nalaze primrarni prepisi rRNK i produkti njihovog isijecanja,

već povezani sa ribozomskim proteinima. Granularna zona sadrži novoformirane ribozomske subjedinice. Geni za 5S rRNK ne na se zajedno sa ostalim Kod III čovjeka su prvenstveno lokalizovani na hromozomu 1. laze Trasnkripciju ovih gena vrširRNK RNKgenima. polimeraza . TRANSKRIPCIJA TRANSPORTNE RNK

Molekuli tRNK imaju specifičnu sekundarnu i tercijarnu strukturu. Model sekundarne strukture molekula tRNK je tzv. model trolisne djeteline (četiri „drške“ i tri „petlje“ ) i ovakva struktura uslovljava

četiri funckionalna mjesta na molekulu:

1. Na 3' kraju u okviru glavne drške, nalazi se triplet CCA, za koji se vezuje aminokiselina. 2. Središnja petlja nosi triplet nukleotida koji se naziva antikodon a koji se sparuje, tokom translacije sa kodonom na iRNK. U odnosu na strukturu antikodona postoje 49 različitih tRNK. 3. Jedna od bočnih petlji na molekulu tRNK se vezuje za ribozom. 4. Druga od bočnih petlji na molekulu tRNK se vezuje za enzim aminoacil-tRNK-sintetazu.

Tercijarna struktura tRNK nastaje preklapanjem po dva susjedna kraka, što funkcionalnom molekulu daje oblik latiničnog slova „L“.

21

U genomu postoje brojne kopije gena za tRNK. Kod Eukariota sve tRNK prepisuje RNK polimeraza III. I geni za tRNK imaju promotore unutar kodirajućeg niza. Primarni transkript je

pre-tRNK koja mora de se modifikuje da bi postala zrela tRNK. Prvi korak u m odifikaciji je dodavanje CCA niza na 3' kraj molekula, a drugi korak je hemijska modifikacija mnogih nukleotida duž lanca.

10. TRANSLACIJA Translacija je složen proces sinteze polipeptida na ribozomima. Ribozomi se u funkionalnom stanju nalaze samo u toku translacije . Van ovog procesa oni su u

dinamičkoj ravnoteži, sa svojim subjedincama, na koje se spontano razdvajaju. Svi ribozomi u određenom ćelijskom tipu su identični i nespecifični. Na njima se vrši sinteza različitih polipeptida zahvaljujući očitavanju iRNK sa različitim kodirajućim nizovima. Tokom translacije ribozom „putuje“ duž iRNK u smjeru 5'-3' pomjerajući se pri tom za po jedan kodon sve dok ne stigne do stop kodona, čime se završava sinteza polipeptidnog lanca. Aminokiseline do ribozoma donose molekuli tRNK. Na samom ribozomu obezbijeđeno je adekvatno prepoznavanje kodona sa iRNK i antikodona sa tRNK . Ribozom može da prihvati najviše dvije

tRNK, i to na dva karakteristična mjesta koja su označena kao P i A mjesto. Na P ili peptidnom mjestu se nalazi tRNK koja nosi rastući polipeptidni lanac, dok se na A ili aminoacilnom mjestu prihvata tRNK koja donosi novu aminokiselinu. Podaci ukazuju da na ribozomima postoji i treće E (engl. exit) ili izlazno mjesto, preko koga slobodne tRNK izlaze u citoplazmu. Kod Eukariota se translacija vrši pri brzini od 2 aminoksiseline u sekundi. AKTIVACIJA AMINOKISELINA

Aktivacija aminokiselina predstavlja proces vezivanja pojedine aminokiseline za odgovarajući molekul tRNK. Na taj način se formira kompleks označen kao aminoacil-tRNK.

Proces aktivacije aminokiselina i njihovo prenošenje do ribozoma se odvija u citoplazmi, uz prisustvo odgovarajuće tRNK, enzima aminoacil-tRNK-sintetaze, molekula ATP i katjona Mg++. Enzim aminoacil-tRNK-sintetaze prepoznaje sa jedne strane određenu aminokiselinu, a sa druge strane tRNK sa odgovarajućim antikodonom. Ovaj enzim je specifičan za svaku aminokiselinu , a za njegovu aktivnost je veoma važno prisustvo jona Mg++ i molekula ATP. Prvi korak u formiranju kompleksa aminoacil-tRNK podrazumijeva aktivaciju aminokiseline u prosustvu energije ATP, pri čemu dolazi do oslobađanja pirofosfata. Zatim enzim prebacuje aminokiselinu na 3' kraj molekula tRNK, uz oslobađanje AMP.

Aminokiselina se vezuje za tRNK preko adenozina iz tripleta CCA , koji se nalazi na 3' kraju svake tRNK. Pri tom se forimra visokoenergetska estarska veza između karboksilne grupe aminokiseline i 3'OH

grupe riboze. Ova energija će se kasnije koristiti za povezivanje aminokiselina u polipeptidni lanca, gdje su aminokiseline energetski slabije. 22

Aktivacija aminokiselina je samo preduslov za odvijanje procesa translacije koji se sastoji od tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija. INICIJACIJA TRANSLACIJE

Inicijacija označava početak sinteze polipeptidnog lanca. Svi polipeptidi koji nastaju na ribozomima u ćeliji počinju sintetu aminokiselinom metionin, kojoj odgovara startni kodon AUG, a doprema je specifična Met-RNK.

Inicijacija započinje na ribozomskim subjedinicama, koje tokom ove faze formiraju kompletan ribozom. U proces inicijacije uključeni su prije svega iRNK koja se prevodi, tRNK koja nosi prvu aminokiselinu – metionin, mala i velika subjedinica ribozoma. Za proces su takođe neophodni GTP (guanozin-trifosfat), katojoni Mg++ i proteini – faktori inicijacije.

Proces inicijacije počinje vezivanjem slobodne male subjednice ribozoma za iRNK. Eukariotska iRNK nema posbnu sekvencu za vezivanje sa ribozomom, već se 5' region prepoznaje zahvaljujući cap

strukturi. Mala jedinica se postavlja tako da se startni kodon AUG nalazi na P mjestu ribozoma. Za ovaj kompleks se potom vezuje inicijatorna tRNK, koja nosi prvu aminokiselinu – metionin. Inicijatorna tRNK

sadrži antikodon UAC, koji se prepoznaje i komplementarno sparuje sa startnim kodonom AUG na iRNK. Posljednji korak inicijacije je vezivanje nastalog kompleksa sa velikom subjednicom ribozoma, u prisustvu faktora inicijacije IF1 i GTP kao izvora energije. Formirani funkcionalni ribozom na P mjestu ima tRNK-Met vezanu za startni kodon, i spreman je za sljedeću fazu translacije – elongaciju. ELONGACIJA TRANSLACIJE

Sljedeća faza u translaciji je faza elongacije, u kojoj se odvvija sintetisanje tj. polimerizacija samog polipeptidnog lanca. U svakom ciklusu elongacije se veže po jedna aminokiselina, na koji način i raste polipeptidni lanac.

Aminokiseline se međusobno povezuju peptidnim vezama. Faza elongacije ima tri opšta koraka koji se ciklično ponavljaju. Prvi korak je vezivanje nove aminoacil-tRNK na slobodno A mjesto na ribozomu: koja će se aminoacil-tRNK vezati zavisi od kodona na iRNK. U drugom koraku se formira peptidna veza između novopridošle aminokiseline i rastućeg polipeptidnog lanca. Treći korak je premještanje – translokacija ribozoma duž iRNK za jedan kodon, u smjeru 3'-5'.

Na početku elongacije na P mj estu ribozoma se nalazi Met-iRNK. Nova tRNK sa odgovarjućom aminokiselinom dospijeva na slobodno A mjesto.

U sljedećem koraku se na P mjestu najprije raskida veza metionina i inicijatorske tRNK. Oslobođena energija se koristi za uspostavljanje prve petidne veze. tRNK na A mjestu sada nosi vezane dvije aminokiseline tj. dipeptid, označava se kao peptidil-tRNK.

23

Za formiranje peptidne veze potrebna je katalitička aktivnost peptidil-transferaze, čiju ulogu ima sam molekul rRNK. Takav RNK molekul sa katalitičkom aktivnošću se naziva ribozim.

Nakon uspostavljanja prve peptidne veze, slobodna inicijatorska tRNK napušta P mjesto, i izlazi iz ribozoma preko E mjesta

Dalje očitavanje informacije sa iRNK, a time i rast polipeptidnog lanca, omogućeno je pomjeranjem ribozoma za po jedan kodon duž iRNK u 5'-3' pravcu. Pomjeranjem ribozoma za jedan

triplet tRNK sa dipeptidom sada zauzima P mjesto, dok se na slobodnom A mjestu nalazi sljedeći (teći) kodon iRNK. Na njega se vezuje tRNK sa odgovarajućom aminokiselinom, kompplementarno se vezuju kodon i antikodon, i proces se ponavlja. Naime, dipeptid se odvaja od tRNK na P mjestu i povezuje se sa

aminokiselinom na A mjestu. Uz učešće ribozima uspostavlja se druga peptidna veza čime se na A mjestu formira tripeptid (ili tripeptidil-tRNK).

Kodirajući niz iRNK koji počinje startnim kodonom, a koji se prevodi u procesu translacije, čini otvoreni okvir čitanja genetičke informacije (engl, open reading frame). Pomjeranje ribozoma duž iRNK u procesu elongacije polipeptidnog lanca traje sve dok ribozom ne naiđe na jedan od sljedećih stop kodona: UAA, UAG ili UGA. TERMINACIJA TRANSLACIJE

Ulaskom u ribozom jednog od stop kodona na iRNK , sinteza polipeptidnog lanca prestaje, jer se

za ove kodone ne vezuje ni jedan od postojećih tRNK molekula. Kada na A mjesto ribozoma dospije završni stop kodon, umjesto tRNK sa odgovarajućom aminokiselinom, za njih se vezuje posebni proteinski faktori R1 i R2, pri čemu R1 prepoznaje UAA ili UAG kodon, a R2 UAA ili UGA kodon. Aktivnost ovih proteinskih faktora vezana je isključivo za A mjesto ribozoma. Poslije razdvajanja polipeptida od molekula tRNK dolazi i do razdvajanja kompleksa ribozom-iRNK.

Važno je istaći da jedan molekul iRNK može biti prevođen od strane većeg broja ribozoma koji se po njemu kreću jedan za drugim. Novi ribozom se vezuje za 5' kraj iRNK, u momentu kada je prethodni koji vrši translaciju na istom molekulu, odmakao za oko 80 nukleotida. Tako nastaju poliribozomi (polizomi). Svi polipeptidi koji nastaju na poliribozomu su identični jer je i matrica za njihovu sintezu ista. I nakon završene translacije usmjeravanje novosintetisanih proteina u eukariotskoj ćeliji je pod genetičkom kontrolom. Svi proteini koji napuštaju ćeliju, kao i oni koji se ugrađuju u njene membrane ili ulaze u sastav organela, imaju na N-terminalnom kraju dodatni segment od 15-30 aminokiselina, koji se naziva signalna sekvenca. Protein bez signalne sekvence ostaje u citoplazmi tj. ne ulazi u kanaliće ER-a.

Kada se formira signalna sekvenca, za nju se vezuje signalna čestica za prepoznavanje SRP (engl. signal recognition particle), koja je kompleks 7S RNK i šest proteina. Ona upravo prepoznaje specifični receptor na membrani ER-a, čime se omogućava vezivanje ribozoma za ovu organelu, a novonastali polipeptid ulazi u njenu unutrašnjost.

24

11. TRANSKRIPCIJA I TRANSLACIJA KOD PROKARIOTA Transkripcija je process kopiranja genetičke informacije sa molekula DNK na molekul RNK. To je biohemijski proces sinteze svih tipova RNK koja se zasniva na istim osnovnim principima.

Prije svega, kao model za sintezu ne koristi se cio molekul DNK, već samo jedan određeni dio molekula – gen. U procesu transkripcije samo jedan od dva polinukleotidna lanca molekula DNK (matrični lanac) služi kao matrica za sintezu RNK. Drugi, njemu komplementaran lanac DNK je

nematrični. Redosljed nukleotida nematričnog lanca je identičan redosljedu nukleotida u sintetisanom molekulu RNK s tom razlikom što je timin u DNK zamijenjen uracilom u RNK. Stoga se nematrični lanac naziva i kodirajući ili sens. Za sprovođenje transkripcije odgovoran je enzim RNK polimeraza. Ona kao supstrat koristi ribonukleozid-trifosfate koje ugrađuje u rastući lanac nukleotida, uz oslobađa nje pirofosfata. Za razliku od DNK polimeraze, RNK polimeraza ne posjeduje samoksrcujuću aktivnost i može samostalno da započne sintezu polinukleotidnog lanca. RNK polimeraza, kao i DNK polimeraza, ima 5'-3' polimeraznu aktivnost. To znači da se fosfordiestarska veza uspostavlja između 3'OH grupe prethodnog i 5'PO3 grupe novog nukleotida u lancu, a energija za ovaj proces se obezbijeđuje hidrolizom pirofosfata. Lanac RNK se uvijek sintetiše uvijek u smjetu 5 '-3', dok se matrični lanac očitava u

suprotnom, 3'-5' smjeru. Dok kod Prokariota samo jedan tip RNK polimeraze transkribuje sva tri tipa RNK, kod Eukariota

postoje bar tri različita tipa RNK polimeraza. RNK polimeraza I nalazi se samo u nukleolusu i katalizuje transkripciju 3 od 4 postojeće rRNK. RNK polimeraza II sintetiše sve iRNK i neke snRNK. RNK polimeraza III sintetiše tRNK, 5S rRNK 4i preostale snRNK. Transkripcija svih vidova RNK ima četiri osnovne faze: prepoznavanje promotora, inicijaciju, elongaciju i terminaciju. Prepoznavanje promotora: Promotor je segment molekula DNK specifične strukture, koji enzim RNK polimeraza prepoznaje i vezuje se za njega . Prepoznavanje promotora je signal za despiralizaciju i raskidanje vodoničnih veza u molekuli DNK: dva lanca se razdvajaju da bi jedan od njih poslužio kao matrica za prepisivanje.

Denaturacija molekula se odigrava u malom fragmentu čime se formira sočivasta struktura označena kao transkripcioni mjehur. Inicijacija sinteze:

RNK polimeraza može samostalno da počne sintezu polinukleotidnog lanca, pa za ovaj proces nije potrebno prethodno formiranje prajmera. Prvi — startni nukleotid segmenta DNK koji se pre pisuje označen je kao +1, dok je nukleotid ushodno od njega -1. (Obilježavanje se odnosi na kodirajući, a ne na matrični lanac DNK.) Poslije ugradnje prva dva ribonukleotida komplementarna matičnom lancu DNK i formiranja fosfordiestarske veze završava se inicijacija i počinje sljedeća faza. 4

5S rRNK se sastoji od otprilike 120 nukleotida, strukturna je I funkcionalna komponenta velike subjedinice

ribozoma, a oznaka 5S se odnosi na brzinu sedimentacije molekula u ultracentrifugi, što se izražava pomoću jedinice svedberg (1S=10-13s)

25

Elongacija lanca:

RNK polimeraza kreće da se nastavlja duž matričnog lanca DNK u 3'-5' smjeru; po principu komplementarnosti sa ovim lancem ona bira i ugrađuje ribonukleotide u rastući lanac i povezuje ih formirajući fosfordiestarske veze u smjeru 5'-3' . Kako se RNK polimeraza pomjera, pomjera se i transkripcioni mjehur koji ostaje iste veličine. Terminacija sinteze:

Terminacija sinteze zavisi od tipa organizma i molekula RNK koji se sintetiše. Sintezu svih tipova RNK kod prokariota katalizuje jedna RNK polimeraza. U prokariotskom genomu obično jedan promotor kontroliše transkripciju više gena u nizu, koji se prepisuju u jedinstvenu policistronsku RNK.

Terminacija transkripcije može biti određena specifičnim nizom nukleotida koji ima palindromsku strukturu tj. sadrži simetrično postavljene međusobno komplementarne baze. Zahvaljujući sparivanju komplementarnih baza ovaj segment u molekulu RNK se savija kao ukosnica, što spriječava dalju aktivnost DNK polimeraze. Druga mogućnost je terminacija pomoću proteina označenog kao (ro) faktor.

Policistronska iRNK, sadrži prepis više gena za polipeptide, koji najčešće kontrolišu povezane biohemijske procese. Sintetisana iRNK kod Prokariota predstavlja zrelu iRNK koja se odmah koristi kao matrica za translaciju. Transkripcija kod Prokariota nije ni vremenski ni prostorno razdvojena od translacije.

Translacija je složen proces sinteze polipeptida na ribozomima. Ribozomi se u funkionalnom stanju nalaze samo u toku translacije . Van ovog procesa oni su u

dinamičkoj ravnoteži, sa svojim subjedincama, na koje se spontano razdvajaju. Svi ribozomi u određenom ćelijskom tipu su identični i nespecifični. Na njima se vrši sinteza različitih polipeptida zahvaljujući očitavanju iRNK sa različitim kodirajućim nizovima. Tokom translacije ribozom „putuje“ duž iRNK u smjeru 5'-3' pomjerajući se pri tom za po jedan kodon sve dok ne stigne do stop kodona, čime se završava sinteza polipeptidnog lanca. Aminokiseline do ribozoma donose molekuli tRNK. Na samom ribozomu obezbijeđeno je adekvatno prepoznavanje kodona sa iRNK i antikodona sa tRNK . Ribozom može da prihvati najviše dvije

tRNK, i to na dva karakteristična mjesta koja su označena kao P i A mjesto. Na P ili peptidnom mjestu se nalazi tRNK koja nosi rastući polipeptidni lanac, dok se na A ili aminoacilnom mjestu prihvata tRNK koja donosi novu aminokiselinu. Podaci ukazuju da na ribozomima postoji i treće E (engl. exit) ili izlazno mjesto, preko koga slobodne tRNK izlaze u citoplazmu. Kod bakterija se translacija vrši pri brzini od 15 aminoksiselina u sekundi. AKTIVACIJA AMINOKISELINA

26

Aktivacija aminokiselina predstavlja proces vezivanja pojedine aminokiseline za odgovarajući molekul tRNK. Na taj način se formira kompleks označen kao aminoacil-tRNK.

Proces aktivacije aminokiselina i njihovo prenošenje do ribozoma se odvija u citoplazmi, uz prisustvo odgovarajuće tRNK, enzima aminoacil-tRNK-sintetaze, molekula ATP i katjona Mg++. Enzim aminoacil-tRNK-sintetaze prepoznaje sa jedne strane određenu aminokiselinu, a sa druge strane tRNK sa odgovarajućim antikodonom. Ovaj enzim je specifičan za svaku aminokiselinu , a za njegovu aktivnost je veoma važno prisustvo jona Mg++ i molekula ATP. Prvi korak u formiranju kompleksa aminoacil-tRNK podrazumijeva aktivaciju aminokiseline u prosustvu energije ATP, pri čemu dolazi do oslobađanja pirofosfata. Zatim enzim prebacuje

aminokiselinu na 3' kraj molekula tRNK, uz oslobađanje AMP. Aminokiselina se vezuje za tRNK preko adenozina iz tripleta CCA , koji se nalazi na 3' kraju svake

tRNK. Pri tom se forimra visokoenergetska estarska veza između karboksilne grupe aminokiseline i 3'OH grupe riboze. Ova energija će se kasnije koristiti za povezivanje aminokiselina u polipeptidni lanca, gdje su aminokiseline energetski slabije. Aktivacija aminokiselina je samo preduslov za odvijanje procesa translacije koji se sastoji od tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija. INICIJACIJA TRANSLACIJE

Inicijacija označava početak sinteze polipeptidnog lanca.

Svi polipeptidi koji nastaju na ribozomima u ćeliji počinju sintetu aminokiselinom metionin, kojoj odgovara startni kodon AUG, a doprema je specifična Met-RNK.

Inicijacija započinje na ribozomskim subjedinicama, koje tokom ove faze formiraju kompletan ribozom. U proces inicijacije uključeni su prije svega iRNK koja se prevodi, tRNK koja nosi prvu aminokiselinu – metionin, mala i velika subjedinica ribozoma. Za proces su takođe neophodni GTP (guanozin-trifosfat), katojoni Mg++ i proteini – faktori inicijacije.

Proces inicijacije počinje vezivanjem slobodne male subjednice ribozoma za iRNK. Eukariotska iRNK nema posbnu sekvencu za vezivanje sa ribozomom, već se 5' region prepoznaje zahvaljujući cap strukturi. Mala jedinica se postavlja tako da se startni kodon AUG nalazi na P mjestu ribozoma. Za ovaj kompleks se potom vezuje inicijatorna tRNK, koja nosi prvu aminokiselinu – metionin. Inicijatorna tRNK

sadrži antikodon UAC, koji se prepoznaje i komplementarno sparuje sa startnim kodonom AUG na iRNK. Posljednji korak inicijacije je vezivanje nastalog kompleksa sa velikom subjednicom ribozoma, u prisustvu faktora inicijacije IF1 i GTP kao izvora energije. Formirani funkcionalni ribozom na P mjestu ima tRNK-Met vezanu za startni kodon, i spreman je za sljedeću fazu translacije – elongaciju. ELONGACIJA TRANSLACIJE

27

Sljedeća faza u translaciji je faza elongacije, u kojoj se odvvija sintetisanje tj. polimerizacija samog polipeptidnog lanca. U svakom ciklusu elongacije se veže po jedna aminokiselina, na koji način i raste polipeptidni lanac.

Aminokiseline se međusobno povezuju peptidnim vezama. Faza elongacije ima tri opšta koraka koji se ciklično ponavljaju. Prvi korak je vezivanje nove aminoacil-tRNK na slobodno A mjesto na ribozomu: koja će se aminoacil-tRNK vezati zavisi od kodona na iRNK. U drugom koraku se formira peptidna veza između novopridošle aminokiseline i rastućeg polipeptidnog lanca. Treći korak je premještanje – translokacija ribozoma duž iRNK za jeda n kodon, u smjeru 3'-5'.

Na početku elongacije na P mjestu ribozoma se nalazi Met -iRNK. Nova tRNK sa odgovarjućom aminokiselinom dospijeva na slobodno A mjesto.

U sljedećem koraku se na P mjestu najprije raskida veza metionina i inicijatorske tRNK. Oslobođena energija se koristi za uspostavljanje prve petidne veze. tRNK na A mjestu sada nosi vezane

dvije aminokiseline tj. dipeptid, označava se kao peptidil-tRNK. Za formiranje peptidne veze potrebna je katalitička aktivnost peptidil-transferaze, čiju ulogu ima sam molekul rRNK. Takav RNK molekul sa katalitičkom aktivnošću se naziva ribozim.

Nakon uspostavljanja prve peptidne veze, slobodna inicijatorska tRNK napušta P mjesto, i izlazi iz ribozoma preko E mjesta

Dalje očitavanje informacije sa iRNK, a time i rast polipeptidnog lanca, omogućeno je pomjeranjem ribozoma za po jedan kodon duž iRNK u 5'-3' pravcu. Pomjeranjem ribozoma za jedan triplet tRNK sa dipeptidom sada zauzima P mjesto, dok se na slobodnom A mjestu nalazi sljedeći (teći) kodon iRNK. Na njega se vezuje tRNK sa odgovarajućom aminokiselinom, kompplementarno se vezuju kodon i antikodon, i proces se ponavlja. Naime, dipeptid se odvaja od tRNK na P mjestu i povezuje se sa

aminokiselinom na A mjestu. Uz učešće ribozima uspostavlja se druga peptidna veza čime se na A mjestu formira tripeptid (ili tripeptidil-tRNK).

Kodirajući niz iRNK koji počinje startnim kodonom, a koji se prevodi u procesu translacije, čini otvoreni okvir čitanja genetičke informacije (engl, open reading frame). Pomjeranje ribozoma duž iRNK u procesu elongacije polipeptidnog lanca traje sve dok ribozom ne naiđe na jedan od sljedećih stop kodona: UAA, UAG ili UGA. TERMINACIJA TRANSLACIJE

Ulaskom u ribozom jednog od stop kodona na iRNK , sinteza polipeptidnog lanca prestaje, jer se

za ove kodone ne vezuje ni jedan od postojećih tRNK molekula. Kada na A mjesto ribozoma dospije završni stop kodon, umjesto tRNK sa odgovarajućom aminokiselinom, za njih se vezuje posebni proteinski faktori R1 i R2, pri čemu R1 prepoznaje UAA ili UAG kodon, a R2 UAA ili UGA kodon. Aktivnost

28

ovih proteinskih faktora vezana je isključivo za A mjesto ribozoma. Poslije razdvajanja polipeptida od molekula tRNK dolazi i do razdvajanja kompleksa ribozom-iRNK.

Važno je istaći da jedan molekul iRNK može biti prevođen od strane većeg broja ribozoma koji se po njemu kreću jedan za drugim. Novi ribozom se vezuje za 5' kraj iRNK, u momentu kada je prethodni koji vrši translaciju na istom molekulu, odmakao za oko 80 nukleotida. Tako nastaju poliribozomi (polizomi). Svi polipeptidi koji nastaju na poliribozomu su identični jer je i matrica za njihovu sintezu ista.

12. USMJERAVANJE PROTEINA PREMA MJESTU DJELOVANJA Usmjeravanje proteina prema mjestu djelovanja (proteinska translokacija) zapravo predstavlja jedan od ciljeva post-translacionih modifikacija novosintetisanog lanca aminokiselina. Proteinska

translokacija je od krucijalnog značaja za ćeliju i greške mogu dovesti do bolesti. U godini 1970. Günter Blobel je sproveo eksperimente koji su se ticali proteinske translokacije preko membrana. Za svoje pronalaske je u 1999. godini dobio Nobelovu nagradu. On je otkrio da mnogi proteini imaju signalnu sekvencu koja funckioniše kao poštanski kod za organelu do koje protein treba

da dospije. Protein može da dospije do organele „kojoj pripada“ ko-translacionom translokacijom (translokacijom za vrijeme translacije) ili post-translacionom translokacijom (translokacijom nakon translacije). Prije svega, treba razumjeti ulogu proteina u ćeliji. Oni su katalizatori reakcija koje se odvijaju u svakoj organeli i vrše selektivni transport malih molekula kroz membranu organele u oba smjera.

Proteini su takođe površinski markeri specifični za svaku organelu i služe za usmjeravanje novosintetisanih proteina i lipida ka određenoj orga neli. Sinteza proteina u eukariotskoj ćeliji započinje na ribozomima u citosolu (osim nekoliko proteina koji se sintetišu na ribozomima mitohondrija). Dalja sinteza i transfer proteina kroz ćelijske odjeljke zavisi od prisustva karakterističnih signalnih sekvenci aminokiselina koje služe za usmjeravanje ovih proteina, vezujući se za pomenute površinske markere – receptore. Signalna sekvenca je kratak (1530 aminokiselina dugačak) peptid prisutan na N-terminalnom kraju većine novosintetisanih proteina koji su namijenjeni prolazu kroz sekretorne puteve. U ovu grupu proteina se ubrajaju oni koji borave unutar pojedinih organela (ER, Goldžijev aparat), koji se izlučuju iz ćelije ili se pak umeću u ćelijske membrane. Oni proteini koji nemaju ove signalne sekvence, ostaju u citosolu. U zavisnosti od prisustva

karakteristične signalne sekvence proteini dospijevaju na određene destinacije u ćeliji uglavnom na tri načina: a) kroz nukleusne pore (u nukleus) b) transmembranskim transportom (u ER, u mitohondrije, u peroksizome) c)

vezikularnim transportom (iz ER-a u Goldžijev aparat, pa iz njega u lizozome, sekretorne vezikule, plazmalemu)

Da bi se neki protein usmjerio na svoje mjesto on mora da prođe kr oz ER i kroz određene modifikacije. Za signalnu sekvencu proteina koji ulazi u ER vezuje se još i SRP koji prepoznaje signalni receptor na membrani ER-a. Ovim mehanizmom omogućava se vezivanje ribozoma za ER, i ulazak 29

novonastalog polipeptida u njegovu unutrašnjost. Uklanja se signalna sekvenca, a slijede i druge modifikacije, nakon čega se transportnim vezikulama protein prosljeđuju u Goldžijev aparat. Tu dolazi do njihovog sazrijevanja, obilježavanja i sortiranja, da bi se usmjerili ka tačnom odredištu u ćeliji. Iz endoplazmatičnog retikuluma u Goldžijev aparat dospijevaju: • sekretorni proteini (oni koje će ćelija egzocitozom, putem sekretornih vezikula, izbaciti u međućelijski prostor, npr. insulin u ćelijama pankreasa) • proteini koji će biti poslati u ćelijsku membranu •proteini (enzimi) koji će obrazovati lizozome.

13. REGULACIJA GENSKE EKSPRESIJE KOD E UKARIOTA Pod pojmom ekspresija gena podrazumijeva se njegovo izražavanje u vidu funkcionalnog produkta. Primarni produkt gena je uvijek molekul RNK, koji se formira u procesu transkripcije. U slučaju gena za protein molekul iRNK se dalje prevodi u konačni proizvod – polipeptidni lanac. Za dobijanje funkcionalnog proteina često su potrebne funkcionalne modifikacije polipeptida.

Regulacija ekspresije gena obuhvata mehanizme koji kontrolišu intezitet i način aktivnosti gena u datim uslovima, odnosno skup procesa koji obezbjeđuju da se u određeno vrijeme i u određenim uslovima eksprimiraju određeni geni.

ZNAČAJ: I prokariotske i eukariotske ćelije su sposobne da mijenjaju aktivnost svojih gena u skladu sa promjenama okruženja. Kontrolisanom ekspresijom gena ćelija je u stanju da sintetiše one proteine koji su joj u datom trenutku od posebne važnosti. Zahvaljujući tome, dolazi do fenotipskih (fizioloških ili morfoloških) promjena koje su izraz sposobnosti adaptacije na date uslove življenja. Kod Eukariota regulatorni faktori uglavnom dolaze iz unutrašnje sredine organizma. U složenom višećelijskom organizmu svaki tip tkiva kao i stepen razvića karakteriše odgovarajuće prisustvo proteina u ćeliji. Prema tome, raznovrsnost tipova ćelija kod ovih organizama posljedica je prije svega razlika u njihovom proteinskom sastavu. Značaj selektivne ekspresije gena i mehanizama koji je kontrolišu potvrđuje činjenica da je u određenoj ćeliji aktivno najviše 10 -20% od ukupne količine DNK.

Svi geni se prema tipu aktivnosti u ćeliji dijele na: 1. gene koji su stalno aktivni; geni čuvarkuće (eng. house keeping geni) – aktivni u svim

uslovima sredine i životne dobi ćelije; njihovi produkti kontrolišu vitalne procese u ćeliji (respiracija, aktivni transport; geni za tRNK i rRNK…); njihova ekspresija je neophodna za opstanak organizma. 2. gene čija aktivnost nije stalna – uključuju se i isključuju prema određenim regulatornim programima.

Mehanizmi regulacije genske ekspresije mogu biti: 1. pozitivni – kod kojih se regulacija vrši stimulisanjem aktivnosti gena, pomoću određenih faktora (dominantni kod eukariota) 2. negativni – kod kojih se regulacija vrši inhibiranjem aktivnosti gena 30

Kod eukariotskih organizama srijeće se više tipova ćelija. Takve ćelije specifične građe i funkcije nazivaju se diferencirane ćelije. Na molekularnom nivou one se međusobno razlikuju u broju i vrsti sintetisanih proteina – genskih produkata, što dokazuje da je aktivnost gena u različitim tipovima ćelija strogo kontrolisana. U složenom i višefaznom procesu samoj diferencijaciji prethodi determinacija ćelije.

To je moment kada je sudbina ćelije već definitivno određena, prisustvom specifičnih proteina, ali još uvijek nije došlo do vidljivih promjena njene građe. Danas je nepobitno utvrđeno da se tokom procesa razvića i diferencijacije ne mijenja sadržaj genetičkog materijala . Ako se tokom diferencijacije ćelije ne mijenja sadržaj genetičkog materijala, znači da postoje razlike u aktivnosti gena, koje dovode do si nteze specifičnih proteina. Procjenjuje se da se u jednoj diferenciranoj ćeliji viših eukariota eksprimira svega 3% gena, dok se ostali nalaze u neaktivnoj formi.

NIVOI KONTROLE EKSPRESIJE GENA: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

pretranskripcioni nivo (na molekulu DNK) kontrola transkripcije kontrola obrade primarnog prepisa RNK kontrola transporta iRNK iz jedra u citoplazmu kontrola translacije postranslaciona kontrola protein

1.) Pretranskripcioni nivo (na molekulu DNK): A. Dekondenzacija hromatina - Tijesna povezanost DNK i histona u okviru nukleozoma i

solenoida sprječava RNK polimerazu i druge regulatorne proteine da pristupe molekulu DNK i započnu transkripciju. To znači da je spiralizovana DNK transkripciono neaktivna, pri čemu histoni vrše nespecifičnu inaktivaciju gena. Zato je dekondenzacija važan uslov za odvijanje transkripcije. U ovom procesu učestvuje proteinski regulatorni kompleks – NRF (engl. nucleosom remodeling factors) , čija aktivnost zavisi od ATP -a. NRF kompleks mijenja strukturu nukleozoma i omogućava pristup RNK polimeraze m olekulu DNK. Transkripcioni factor TFIIH sprječava ponovno vezivanje DNK i histona sve do uspostavljanja inicijacije transkripcije. B. Hemijske modifikacije DNK i histona - Hemijske modifikacije DNK podrazumijevaju prije svega metilaciju, dok modifikacije histona mogu biti raznovrsne: acetilacija, metilacija, fosforilacija. Ove promjene se odvijaju djelovanjem specifičnih enzima i imaju povratan – reverzibilan karakter, tako da DNK i histoni mogu da prelaze iz jednog u drugo funkcionalno stanje prema potrebi.

Modifikacije DNK i histona međus obno su povezane i koordinisane i djeluju u istom smjeru, bilo da utiču na olakšavanje transkripcije ili da dovode do inaktivacije određenih regiona. Metilacija DNK predstavlja mehanizam inaktivacije određenih gena, dodavanjem metil

grupe – CH3 na citozin iz niza CG baza (označavaju se kao CpG niz, da bi se istaklo da se radi o nukleotidima u istom polinukleotidnom lancu koji su povezani fosfodiestarskim vezama), uz prusustvo enzima DNK-metil-tranferaze. Pri tom se dodavanjem CH 3 gupe na 31

5’C atom citozina formira 5-metil-citozin. Obrazac metilacije DNK u tjelesnim ćelijama nasljeđuje se kroz mitotske diobe – ćerke ćelije imaju iste metilirane gene kao majke ćelije, a time i iste inaktivne gene. Tako metilacija služi kao svojevrsni oblik ćelijske memorije. Uklanjanje metil grupe vrše enzimi demetilaze, obezbjeđujući povratak molekula DNK u prvobitno stanje. Aktivacija gena je uvijek praćena demetilacijom DNK, ali demetilacija ne vodi neposredno do aktivacije transkripcije, već je samo jedan od uslova za inicijaciju – započinjanje transkripcije. Promjena aktivnosti gena putem metilacije ne zasniva se na promjeni njegove strukture

već predstavlja „spoljašnju“ modifikaciju, pa se mehanizam metilacije svrstava u tzv. epigenetske regulatorne mehanizme. Utvrđeno je da se u različitim fazama života jedinke mijenja stepen metilacije DNK, saglasno sa promjenama aktivnosti genoma. U gametima

je DNK visoko metilirana. Nakon oplođenja aktivira se sopstvena nasljedna osnova zametka, praćena demetilacijom DNK. Ubrzo, tokom embrionalnog razvića opet slijedi metilacija koja je specifična, povezana sa inaktivacijom određenih gena tokom determinacije i diferencijacije ćelija i tkiva. Hemijska modifikacija histona: Acetilaciju histona vrše enzimi histonske acetil-transferaze (HAT), koje dodaju acetil

grupu COCH3 na određene aminokiseline u polipeptidu. Za uklanjanje acetil grupe u povratnom procesu odgovorne su histonske de-acetilaze (HDAC). Utvrđeno je da se

hemijske modifikacije uvijek dešavaju na „repovima“ histona, koji se nalaze na površini histonskog jezgra i predstavljaju N-terminalni dio polipeptida. Posebno podložni promjenama su histoni H3 i H4. Acetilacija histona dovodi do slabljenja njihove veze sa

DNK pa je udružena sa povećanjem transkripcione aktivnosti gena. Smatra se da HAT enzimi funkcionišu kao ko-aktivatori transkripcije, učestvujući sa nizom drugih regulatornih proteina u kompleksnoj regulaciji ovog procesa kod eukariota.

Acetilaciju histona uvijek prati demetilacija DNK, a metilaciju DNK deacetilacija histona,

što u prvom slučaju za krajnji efekat ima dekondenzaciju hromatina i aktiviranje gena, a u drugom slučaju inaktiviranje gena. C. Amplifikacija – umnožavanje broja onih gena čiji su produkti neophodni u većoj količini u određenim procesima. D. Preraspored gena i genskih segmenata – pojava preuređenja nekih gena kao preduslova za njihovu transkripciju.

2.) Kontrola transkripcije: A. Regulacija inicijacije transkripcije gena - Kontrola transkripcije je jedan od najznajčajnijih

nivoa regulacije genske kod eukariota. Razlikeživota, u sastavu proteina između dva tipa ćelija, ili u istoj ćelijiekspresije u različitim periodima ćelijskog rezultat su prije svega razlika u transkripciji gena. Ključno mjesto u regulaciji transkripcije imaju specifični regioni

32

DNK za koje se vezuju regulatorni proteini, dovodeći do eksprimiranja gena ili blokade njihovih aktivnosti.

U regione DNK koji učestvuju u regulaciji transkripcije spada prije svega promotor, zatim pojačivači (eng. enhancers), prigušivači (eng. silencers), elementi odgovora (eng. response elements – RES) i tzv. insulatori. Kako se navedeni regioni nalaze na istom molekulu DNK na kojem je i transkripciona jedinica – gen, označeni su zajedničkim imenom kao cis-elementi (cis-faktori). Proteini koji prepoznaju ove regione i vezuju se za

njih označeni su kao transkripcioni faktori ili trans-elementi. Oni mogu biti opšti, specifični i inducibilni. Pojedini tipovi cis-elemenata imaju svoje odgovarajuće transelemente. Tako opšti transkripcioni faktori prepoznaju promotor, specifični regione prigušivače i pojačavače, dok se inducibilni transkripcioni faktori vezuju za RES elemente. Promotor predstavlja kombinaciju odgovarajućih nizova nukleotida u molekulu DNK, preko kojih se vrši osnovna kontrola transkripcije gena. Uvijek se nalazi ispred u odnosu na kodirajući region. Opšti transkripcioni faktori koji se vezuju za promotor su isti za sve gene i tipove ćelija kod eukariota. Regioni pojačivači i prigušivači su segmenti DNK koji vrše dodatnu kontrolu inteziteta transkripcije. Mogu se nalaziti u okviru samog promotora, a takođe i ushodno ili nishodno od gena, ponekad i znatno daleko od njega. Za njih se vezuju specifični transkripcioni faktori, koji su specifični za određeni tip ćelija, period razvića ili određeno fiziološko stanje. Na taj način se u datim uslovima selektivno pojačava ili inhibira transkripcija pojedinih gena.

Pojačivači sadrže različite nizove za koje se vezuju transkripcioni faktori označeni kao aktivatori. Rezultat njihovog djelovanja je intenziviranje transkripcije. Da bi ostvario svoju

ulogu, aktivator mora da bude vezan s jedne strane za svoj odgovarajući pojačivač u DNK, a sa druge strane da uspostavi neposredan kontakt sa preinicijacionim kompleksom na

promotoru. Za ovu interakciju često je neophodno da molekul DNK promijeni prostornu konformaciju tj. da se savije, posebno ukoliko je pojačivač udaljen od promotora. U čitav kompleks mogu biti uključeni i molekuli koaktivatori, koji se vezuju za sam aktivator. Veze između aktivatora, koaktivatora i preinicijacionog kompleksa od presudnog su značaja za regulaciju inteziteta transkripcije.

Prigušivači su kontrolni elementi u molekulu DNK koji inhibiraju aktivnost gena. Faktori koji se povezuju sa njima su označeni kao represori, jer djeluju u pravcu smanjenja inteziteta ili potpune blokade transkripcije. Kompleks prigušivač–represor najčešće smanjuje aktivnost gena čiji produkt nije potreban u dato vrijeme i na datom mjestu. Tako npr. pojedini represori isključuju gene koji su specifični za nervne ćelije u svim drugim nenervnim tkivima.

Elementi odgovora (eng. response elements - RES) su dobili taj naziv jer odgovaraju na

hormone i druge signale koji dolaze izvan ćelije. Po položaju i funkciji slični su pojačivačima, a za njih se neposredno vezuju inducibilni transkripcioni faktori. Insulatori (lat. insula) su segmenti u molekulu DNK veličine 0.5 – 3 kb čija uloga je da funkcionalno izdvoje pojedine gene ili grupe gena. Oni ograničavaju djelovanje pojačivača ili prigušivača i spriječavaju da se njihov uticaj proširi van željenih regiona. 33

Molekularna struktura tranksripcionih faktora:

Svi transkripcioni faktori, bez obzira na vrstu, posjeduju regione za vezivanje sa DNK, i

regione koji učestvuju u aktivaciji transkripcije. Na osnovu građe dijele se u četiri osnovne kategorije, koje su dobile naziv prema obliku molekula: „zavojnica-petlja-zavojnica“, „zavojnica-žlijeb-zavojnica“, „cinkovi prsti“ i „leucinski rajsferšlus“. Korišćenje različitih promotora: Kod Eukariota u istom genu može da postoji više promotorskih regiona, pa je odabir promotora koji će se koristiti još jedan od mehanizama regulacije inicijacije transkripcije. Alternativni promotori se najčešće sreću kod gena koji se eksprimiraju u više tkiva, pa je i njihova aktivacija tkivno specifična.

3.) Kontrola obrade primarnog prepisa RNK: Kod Eukariota u toku obrade primarnog prepisa iRNK dolazi do isijecanja introna i međusobnog povezivanja, egzona na 5' kraj se dodaje cap struktura, a na 3' kraj poli-A-rep. U ovom procesu su

moguće varijacije koje se prije svega odnose na različit model iskrajanja introna i povezivanja egzona, i različito mjesto povezivanja poli-A repa. Primjer ovog načina regulacije genske aktivnosti je aktivnost gena za kalcitonin. Gen za kalcitonin u svojoj strukturi ima pet egzona, i četiri introna, a glavno mjesto njegove ekspresije su ćelije paraštitne žlijezde . Ovdje se u toku obrade primarnog prepisa spajaju prva četiri egzona i na kraju tog niza se vezuje poli-A rep, a peti egzon se odbacuje zajedno sa intronima. Tako formirana zrela iRNK odlazi na ribozome, i nakon translacije i određ enih post-translacionih modifikacija nastaje polipetid kalcitonin. Drugo mjesto eksprimiranja gena za kalcitonin su neuroni. Ovdje se takođe formira kompletan primarni prepis, ali razlika nastaje u njegovoj obradi. Naime u nervnom tkivu dolazi do povezivanja egzona 1, 2, 3 i 5, dok se egzon 4 isijeca zajedno sa intronima. Na kraju egzona 5 se aktivira mjesto za pripajanje poli-A repa. Zrela iRNK se prevodi u polipeptid koji poslije određenih modifikacija daje CRP (engl. calcitonine realted protein). Obrada primarnog prepisa je čest vid regulacije

genske aktivnosti kod čovjeka. Obrada primarnog prepisa iRNK je jedan od vidova regulacije genske aktivnosti na nivou

posttranskripcione obrade. Još jedan je i programiranje aktivnosti molekula iRNK. Poznato je da se tokom oogeneze u oociti sintetišu različite iRNK , koje će biti upotrebljene nakon oplođenja, u prvim stadijumima brazdanja. Prilikom obrade primarnog prepisa ove iRNK dobijaju skraćeni poli-A rep, i u takvoj neaktivnoj formi se nalaze u citoplazmi oocite. Nakon oplođenja, u određenom momentu se aktivira poli-A polimeraza koja produžava poli -A rep, dajući kompletno funckionalnu zrelu iRNK. Slično tome, moguće je „maskiranje“ regulatornih regiona koje spriječava neblagovremenu translaciju. U ovome učestvuju proteini, ali i male RNK koje se komplementarno vezuju za UTR regione, zrele iRNK. Molekuli iRNK su nestabilini, ali postoje činioci koji utiču na produženje polu-života iRNK, što mogućava da ista iRNK prođe kroz proces translacije. Krajnji efekat je povećana siteza proteina. Primjer ovakvog djelovanja je uticaj hromona prolaktina na kazein. Poznato je da prolaktin stimuliše lučenje mlijeka, što je povezano sa sintezom specifičnog proteina mlijeka – kazeina. Kada je u eksperimentu tkivo mliječne žlijezde u kulturi izlagano prolaktinu, produkcija iRNK za kazein je povećana svega tri puta, ali je polu34

život ove iRNK povećan čak 20 puta. To zači da glavni nivo djelovanja prolaktina na povećanu sintetu kazeina nije transkripcija odgovornog gena, već stabilizacija zrele iRNK. Zrela iRNK može da trpi planske modifikacije baza koje utiču na promjenu genetičke informacije. Ovaj mehanizam se zove RNK editovanje, i vrlo je rijedak kod čovjeka. 4.) Kontrola transporta iRNK iz jedra u citoplazmu: Kontrola transporta iRNK predstavlja regulaciju prelaženja transkripata iz jedra u citoplazmu. Od veoma heterogene grupe primarnih transkripata gena za kodiranje proteina (tzv. hnRNK – heterogena nuklearna RNK) najmanje 50% nikadane napusti jedro već se u njemu razgrađuje. 5.) Kontrola translacije:

Za odvijanje složenog procesa translacije neophodne su brojne komponente. Ukoliko bilo koja od njih izostane, neće doći do sinteze polipeptida. Posebno važnu regulatornu ulogu imaju 3’UTR regioni zrele iRNK, za koje se vezuju regulatorni proteini i mikro RNK, kontrolišući intenzitet translacije. Važno je naglasiti da se naovom nivou postiže brža promjena u ekspresiji gena, nego ako se djeluje na molekul DNK i njegovu transkripciju.

6.)Posttranslaciona kontrola proteina:

Veliki broj proteina nije funkcionalan odmah po završenoj sintezi. Da bi se to postiglo neophode su različite hemijske modifikacije polipeptida, spajanje subjedinica kompleksnih proteina i sl. U postranslacionoj obradi novosintetisanih polipeptida veoma važnu ulogu imaju šaperoni ili pratioci proteina. To su takođe proteinski molekuli, poznati kao proteini toplotnog stresa. Pokazalo se da ovi sveprisutni molekuli spriječavaju nepoželjna međudejstva i obezbijeđuju ispravna povezivanja polipeptida u funkcionalne komplekse.

Često je potrebno i uklanjanje pojedini djelova polipeptidnog lanca pod djelovanjem proteolitičkih enzima. Mnogi enzimi i hormoni se sintetišu u formi neaktivnih pro -enzima i pro-hormona, koji se aktiviraju tek nakon proteolize. Takav je primjer hormona insulina, koji se sintetiše u vidu prekursora nazvanog pre-pro-insulin. Uklanjanjem 23 aminokiseline sa N-terminalnog dijela nastaje pro-insulin, iz koga se proteolizom izdvajaju lanci insulina A, B i C.

14. REGULATORNE SEKVENCE, MODEL OPERONA Regulatorna sekvenca je segment nukleinske kiseline koji može da poveća ili smanji ekspresiju specifičnih gena unutar jednog organizma. Regulacija ekspresije gena je od esencijalnog značaja za sve žive organizme i viruse. Kod DNK, regulacija ekspresije gena se normalno dešava na nivou transkripcije i ostvaruje se kroz aktivnost transkripcionih faktora koji aktiviraju ili inhiniraju transkripciju. Transkripcioni faktori mogu da

se ponašaju kao represori, aktivarori, ili oboje. Represori često djeluju na takav način da spriječavaju RNK polimerazu da stvori produktivni kompleks sa promotorom, dok aktivatori olakšavaju stvaranje istog.

35

Kod RNK, regulacija se može odvijati na nivou translacije, RNA cleavage5, RNA splicing, ili terminacije transkripcije. Regulatorne sekvence su često asocirane sa molekulima iRNK i u tom slučaju kontrlišu

njenu sintezu ili translaciju. Veliki broj biomolekula može da se veže sa RNK da ostvari ovu regulaciju : proteini (npr. translacioni represori6 ili splajsing faktori), drugi RNK molekuli (miRNK) i mali molekuli, u slučaju riboswitch7 sekvence.

Istraživanja s ciljem nalaženja svih regulatornih sekvenci u genomima svih vrsta su u toku. Konzervirane nekodirajuće sekvence često sadrže regulatorne sekvence, tako da su one često predmet tih analiza U genetici, operon je funkcionalna jedinica genomske DNK koja sadrži grupu gena koja je pod kontrolm jednog promotora. Geni bivaju zajdno prepisani u niz iRNK i bivaju svi prevedni zajedno u 8

citoplazimi ili pak podliježu trans-splajsingu u cilju stvaranja monocistronske iRNK koja se prevodi

odvojeno. Rezultat ovoga je da se geni u operonu eksprimiraju svi zajedno, ili se ne eksprimiraju uopšte. U globalu, ekspresija prokariotskih operona vodi do stvaranja policistronske iRNK. Generalna struktura operona – Operon se sastoji od 3 osnovne DNK komponente:



Promotor – nukleotidni niz koji omogućava genu da bude transkribovan. RNK polimeraza prepoznaje promotor, i onda dolazi do inicijacije transkripcije. U sintezi RNK, promotor

kazuje koji geni trebaju biti iskorišteni za sintetu iRNK i samim tim kontroliše koje proteine ćelija stvara.  Operator – segment DNK za koji se vezuje represor. U lac operonu9 se klasično definiše kao segment između promotora i gena operona. U slučaju represora, repesorni protein fizički obstruira RNK polimerazu da ne transkribuje gene.  Strukturni geni – geni koji su ko-regulisani od strane operona. Nije uvijek uključen u njegovu strukturu, ali važan za funkciju operona je regulatorni gen koji je konstantno eksprimiran i kodira represorne proteine. Regulatorni gen ne mora da bude u samom operonu, pa čak ni u njegovoj blizini. Regulacija – Konrola operona je vid genske regulacije koja omogućava organizmima da

regulišu ekspresiju različitih gena u zavisnotsti od uslova spoljašnje sredine. Operonska regulacija može biti negativna ili pozitivna indukcijom ili represijom. Negativna kontrola uključuje vezivanje represora za operator u cilju spriječavanja transkripcije.



Kod negativnih induktibilnih operona regulatorni represorni protein je vezan za

operator, što spriječava transkripciju gena u operonu. Ako je prisutan molekul induktor10, on veže represor i mijenja njegovu konformaciju tako da je u RNA cleavage – isijecanje 3' signalnog regiona iz novosintetisane pre-iRNK u procesu transkripcije translacioni represori - Regulacija ekspresije gena translacionom represijom podrazumeva postojanje neke vrste „represora“ koji blokira proces translacije Primjer ove vrste regulacije ekspresije gena su ribozomski proteini koji su translacioni represori sopstvene sinteze. 7 riboswitch – regulatorni segment molekula iRNK za koji se vezuje mali molekul što rezultira u promjeni produkcije proteina kojeg iRNK kodira 5 6

trans-splajsing – posebna forma obrade RNK kod eukariota kod koje su egzoni iz dva različita primarna RNK prepisa združeni kraj uz kraj i spojeni ligazom 9 lac operon – laktatozni operon je operon koji je potreban za transport i metabolizam laktoze kod E. coli i mnogih 8

drugih enterobakterija 10 induktor – molekul koji reguliše ekspresiju gena tako što se vezuje za represor ili aktivator

36

nemogućnosti da se veže za operator. Ovo omogućava e kspresiju operona. Lac operon je primjer ovakvog operona i ovdje je molekul induktor alolaktoza.



Kod negativnih represibilnih operona transkripcija operona se normalno dešava.

Represorne proteine stvara regulatorni gen, ali su u nemogućnosti da se vežu za operator u svojoj normalnoj konformaciji. Međutim, određeni molekuli zvani korepresori bivaju vezani od strane represornog proteina, izazivajući konformacionu promjenu na aktivnom mjestu. Aktivirani represorni protein veže se za operator i spriječava transkripciju. Trp operon, koji je uključen u sintezu triptofana, je primjer ovakvog operona. Operoni mogu biti i pozitivno kontrolisani. Sa pozitivnom kontrolom, activator stimuliše

transkripciju vezivanjem za DNK (obično za dio koji nije operator). 

Kod pozitivnih induktibilnih operona, aktivatorni proteini se ne mogu vezati za

značajni dio DNK. Kada je aktivator vezan za induktor on podliježe promjenama u konformaciji tako da može da se veže za DNK i aktivira transkripciju.  Kod pozitivnih represibilnih operona, aktivatorni protein se vezuje za značajni DNK segment. Međutim, kada je aktivator vezan za inhibtor, spriječen je da se veže za DNK. Ovo spriječava aktivaciju i transkripciju. Model lac operona kod E. coli – Ovo je prvi otkriveni operon i sastoji se od tri bliska strukturna gena: promotora, terminatora i operatora. lac operon reguliše nekoliko faktora, uključujući dostupnost glukoze i laktoze.

15. MUTACIJE I TIPOVI GENSKIH MUTACIJA Sve promjene na genetičkom materijalu su označene kao mutacije. Zajedno sa rekombinacijama predstavljaju izbor varijabilnosti nasljedne osnove. Ukoliko one daju prednost jedinki i poboljšavaju

njen fenotip, naslijediće se u potomstvu kao normalne i zakonite. Mutacije se mogu definistati i kao bilo koja promjena u nasljednom materijalu, nukleotidnom

nizu, uređenju ili količini DNK. Šira klasifikacija mutacija obuhvata promjene na nivou hromozoma – hromozomske aberacije, i promjene na nivou gena – genske aberacije. Hromozomske aberacije se mogu uočiti pmoću mikroskopije, a genske ne mogu jer se radi o promjenama na molekularnom nivou. Genskom mutacijom se naziva svaka promjena primarne strukture DNK, nezavisno od njenih

funkcionalnih posljedica. To su obično stabilne promjene nasljednog materijala, koje se kao takve mogu prenijeti na potomstvo. Mutacijama nastaju nove forme jednakih gena – nastaju aleli. Prvobitna forma gena se naziva divlji tip, dok novi alel predstavlja mutiranu formu ili mutant. Promjena divljeg tipa gena u mutiranu formu naziva se direktna mutacija. Nova, sekundarna

mutacija koja vraća mutantni alel u divlji, se naziva povratna ili rezervna mutacija. Ako se divlji tip mijenja uvijek I istu mutantnu formu, to su rekurentne mutacije. Prma uzorku nastanka mutacije mogu da spontane i indukovane. Spontane mutacije nastaju

prirodnim mehanizmima u fiziološkim uslovima, dok su indikovane mutacije rezultat djelovanja 37

određenih fizičkih, hemijskih ili bioloških agenasa. Faktori koji izazivaju pojavu mutacija nazivaju se mutageni.

Prema tipu ćelijau kojima se promjena dešava, mutacije mogu biti germinativne i somatske. Germinativne mutacije su prisutne u gametima pa se stoga prenose na ptomstvo . Moguće je, međutim da se mutacije nalaze samo u jednom dijelu germinativni – ishodnih ćelija iz kojih se f ormiraju gameti. Ova pojava se naziva germinaticni mozaicizam i ima za posljedicu formiranje i normalnih i mutarini gameta kod iste osobe. Somatske ćelije zavataju DNK u tjelesnim ćelijama. One se ne prenose na ptomostvo. Prema posljedicama koje imaju na nosioca, neke mutacije mogu da budu letalne i subletaln e. Letalne mutacije dovode do smrti jedinke u toku embrionalnog razvića ili odmah po rođenju. Subletalne

mutacije su povezane sa značajno skraćenim životnim vijekom, tako da jedinka ne doživi reproduktivni period.

Uslovne mutacije se ispoljavaju samo pod određenim uslovima sredine.

Mutacije mogu da se izraze u fenotipu u različitim periodima života jedinke. Ponekad fenotipske promjene postoje još tokom embrionalnog razvoja (ahondroplazija). Uglavnom se nepovoljni efekti mutacija uočavaju na rođenju ili u najranijem djetinjstvu (cistična fibroza). Na suprot tome, postoje mutacije koje se u fenotipu prvi put izražavaju u kasnijem životnom dobu (Hantingtonova bolest). Prema tipu interakcije između alela, od koje zavisi i izražavanje u fenotipu, mutacije mogu biti dominantne i recesivne. Dominantne mutacije su one koje se ispoljavaju bilo da se nađu homozigotnom ili u heterozigotnom stanju. Nasuprot tome recesivne mutacije se izražavaju u fenotipu samo kada se

nalaze u homozigotnom stanju. Ukoliko se kod heterozigota iz para podjednako ispoljavaju, riječ je o kodominantnom odnosu. A kada heterozigot ima novi, „srednji“ fenotip, koji je mješavina dominantnog i recesivnog, on je označen kao intermedijarni. U genetici čovjeka značajna je podjela na familijarne i „svježe“ tj. nove mutacije. Familijarne mutacije su one koje su naslijeđene od roditelja, a često se nalaze i kod bliskih rođaka. Svježe (nove) mutacije su one koje se po prvi put javljaju kod oboljelog, a nisu ranje zabilježene u porodici.

16. MOLEKULARNA OSNOVA TAČKASTIH MUTACIJA U odnosu na vrstu promjene u molekula DNK, osnovni tipovi mutacija su: supstitucije baza,

delecije i insercije. Četvrta vrsta mutacija – povećanje broja nukleotidnih pnovaka, se može klasifikovati kao podvrsta insercija.

Supstitucija baza su zamjene jedne baze drugom tj. jednog baznog para drugim baznim parom.

Supstitucije se nazivaju i tačkaste ili point mutacije. Tranzicije su zamjene bazom istog tipa, a transverzije su zamjene bazom drugog tipa. Dakle, postoje četiri tipa tranzicija i osam tipova transverzija.

38

Delecije predstavljaju gubitak segmenta DNK. Delecija može da zahavti dio različite dužine, od samo jednog nukleotida, do velikih blokova koji imaju više stotina hiljada baznih parova. Suprotno deleciji insercija je umetanje segmenata DNK u postojeći nukleotidni niz. Ukoliko se u umetnutom dijelu ponavlja strujtura iz samog gena, reč je o duplikaciji. Smatra se da su male delecije i insercije, od nekiliko baznih parova, posljedica poremećaja u replikaciji, dok se veće povezuje sa pormećajima u krosing overu. Takođe, pri razmjeni sestrinskih hromatida, zbog sličnosti sekvenci može doći do greške. Ove pojave, poznate kao nejednaki krosing over , imaju za posljedicu deleciju i duplikaciju gena.

Pogrešno sparivanje i rekombinacija između sličnih sekvenci koje se ponavljaju može da se desi i unutar istog molekula DNK. U zavisnosti od orijentacije tih segmenata može doći do delecija ili inverzija. Velike insercije mogu nastati i djelovanjem pokretnih genetičkih elemenata – transpozona. Ovaj mehanizam je poznat kai inserciona mutageneza.

Povećanje broja tinukleotidnih ponovaka ,ili ekspanzija trinukleotida, je nova vrsta mutacije. Mutaciju prestavlja patološko povećanje broja pnovaka, iznad kritičnog broja. Najčešće se javlja ekspanzija tripleta CAG. Ova mutacija je odgovorna za Hantingtonovu bolest. Uzrok ove vrste mutacija

nije u potpunosti razjašnjen. Jedna pretpostavka je da je u pitanju „proklizavanje“ DNK polimeraze tokom replikacije niza koji se ponavlja, a druga da se radi on neefikasnim sistemima popravke grešaka DNK. Zapažena je tendencija da se u porodicama sa ovim tipom mutacije iz generacije u generaciju povećava broj ponovaka, pa se one nazivaju dinamičke mutacije. Mutacijama mogu biti pogođeni kodirajući i nekodirajući nizovi u DNK. Mutacije koje pogađaju kodirajuće regione, u zavisnosti od tipa, mogu da imaju različite efekte na aminokiselinsku strukturu polipeptida.

Supstitucije zamjenom baza mijenjaju i strukturu kodona. U odnosu na značenje novoformiranog kodona one mogu da budu pogrešnog smisla (engl. missense), besmislene (engl. nonsense), tihe (engl. silence) i neutralne.

Ukoliko se baznom supstitucijom kodon za jednu aminokiselinu u kodon za drugu amniokiselinu, riječ je o pogrešnoj ili misens mutaciji . Nastali polipeptid ima izmijenjenu strukturu, a najčešće i izmijenjenu funkciju. Ako se nakon supstituciji od funkcionalnog kodona formira jedan od stop kodona, to je nonsens ili

besmislena mutacija. Posljedica je prijevremeni prekid sinteze polipeptida.

Moguće je da bazna supsitucija ne mijenja značenje kodona, što je označeno kao silence ili tiha mutacija. U osnovi ove pojave se nalazi degeneracija genetičkog koda. Silence mutacije nemaju fenotipskog efekta.

Slično tome, bazna supstitucija može dovesti do formiranja kodona za hemijski sličnu aminokiselinu. Ovakva mutacija se naziva neutralna i takođe je bez značajnog efekta na strukturu i funkciju polipeptida. Delecije i insercije mogu da imaju različite efekte na genetički kod i prevod kodirajućeg niza. Najčešće se nishodno od mjesta mutacije mijenja način očitavanja kodona tj. pomjera se okvir čitanja

39

genetičke informacije. Zbog toga se ovaj tip mutacija naziva frame-shift mutacijama. Segment sa izmijenjenim genetičkim kodom će kodirati drugačiji niz aminokiselina u odnosu na normalnu formu gena, a sintetisani polipeptid će imati izmijenjen sastav i funkciju. Nasuprot tome, postoje delecije i insercije koje ne mijenjaju sadržaj genetičke informacije odnosno značenje kodona nishodno od mutacije. U tom slučaju izgubljeni ili umetnuti segment se nalazi između dva cjelovita kodona, a i on sam sadrži cio (tačan) broj tripleta nukleotida. Promjene u nekodirajućem dijelu DNK mogu takođe da budu različite. Moguće je takođe da primarni efekat mutacije bude promjene načina obrade primarnog

preprisa iRNK. Promjena u nukleotidnom nizu može formirati novo signalno mjesto za isijecanje intorna,

ili ukinuti već postojeće. Najčešće ovakve efekte imaju supstitucije, a rijeđe male delecije i insercije. U svakom slučaju zrela iRNK, a time i sintetisani polipeptid imaće znatno drugaičiju strukturu od normalne. Mutacije mogu da pogode i druge regulacine regine van kodirajućeg niza. To mogu da budu 5' i

3' UTR segmenti. Takođe može biti izmijenjena struktura kontrolnih elemenata transkripcije: promotora

i pojačivača. U spektru mehanizama djelovanja mutacije treba pomenuti i pozicioni efekat. To je pojava da gen promjenom svog mjesta mijenja aktivnost iako njegova struktura ostaje nepromjenjena. Naime, u

novom okruženju gen potpada pod uticaj drugih regulacionih regiona koji utiču na njegovu ekspresiju. Najčešći uzrok ovakvog poremećaja su premještanja – translokacija gena ili delecija velikih segmenata u blizini kodirajućeg niza. Povećanje broja trinukleotidnih ponovaka može takođe da se javi u kodirajućem ili nekodirajućem regionu gena, od čega i zavisi njegov efekat na sintezu polipeptida. Smatra se da kod čovjeka svaki zigot ima prosječno 100 baza različitih u odnosu n a nasljednu osnovu roditelja. Pod pojmom genskog ili DNK polimorfizma podrazumijevaju se razlike u nasljednom materijalu

u opštoj populaciji tj. populaciji zdravih ljudi . Da bi jedna alelna varijanta bila označena polimorfizom , potrebno je da učestalost tog alela bude veća od 0.1, odnosno da broj heterozigotnih osoba bude veći od 2%. Aleli sa manjom učestalošću od navedene nazivaju se rijetke varijante. DNK polimorfizam kod ljudi se javlja u tri glavna oblika. Najčešći je polimorfizam pojedinačnih nukleotida, kada postoji zamjena nukleotida drugim u nizu. Drugi vid je različit broj uzastopnih ponovaka u repetitivnim regionima, prije svega vezano za minisatelitne i mikrosatelitne nizove. Treća kategorija je insercioni/delecioni polimorfizam, kod koga određ eni segment postoji/ne postoji u molekulu DNK. Procjenjuje se da je u genomu čovjeka svaki 1000. nukleotid polimorfan. U odnosu na to smatra se da je svaki čovjek heterozigot u oko 20% svojih genskih lokusa.

Učestalost mutacija se izražava stopom mutacija. Stopa mutacija predstavlja broj mutacja po generaciji ili broj mutacija određenog gena po generaciji. Kod čovjeka je prosječna stopa mutacija nekog gena 10-4 do 10-6 po generaciji. To znači da se nova mutacija određenog gena javlja kod jednog od 10.000 40

do 1.000.000 novorođene djece. 1 od 10 spermatozoida nosi novu štetnu mutaciju. Pošto je DNK u

spermatozoidima prošla kroz daleko veći broj replikacija nego DNK u jajnim ćelijama, očekuje se da genske mutacije koje su posljedica grešaka u toku replikacije budu češće očevog nego majčinog porijekla. Dodatni faktor rizika treba da bude životna dob, jer je kod starijih muškaraca veći broj replikacija prethodio mejotičkim diobama. S obzirom na važnu ulogu enzima replikacije i enzima za popravku DNK u nadgledanju i spriječavanju mutacija, nasljedni poremećaji koji mijenjanju funkciju ovih enzima mogu da dovedu do dramatilnog povećanja učestalosti svih tipova reakcija. Prema uzroku nastanka mutacije mogu da budu spontane i indukovane.

Greške u replikaciji sejavljaju sa malom učestalošću. Spontane supstitucije nastaju pogrešnim sparivanjem baza. DNK polimeraza ugrađuje jedan pogrešan nukleotid na svakih 10.000.000 nukleotida, a odmah zahvaljujući svojoj korektorskoj ulozi ispravi čak 99% ovih promjena, tako da će greška zahvatiti samo jedan nukleotid po ćeliji po diobi. Promjene u strukturi DNK koje nastaju van replikacije mogu da budu raznovrsne. Votson i Kirk su ukazali

da strukture baza u molekulu DNK nisu stabilne kategorije, već se atomi vodonika mogu pomjerati sa jedne pozicije na drugu. Takve promjene su označena kao tautomerija. Značajne su za mutagenezu je mijenjaju afinitet sparivanja azotnih baza. Najčešće spontane hemijske promjene na bazama DNK su formiranje AP mjesta i dezaminacija. Gubitkom purinske ili pirimidinske baze nastaju apurinska odnosno apirimidinska (AP) mjesta, još

označena i kao abazna mjesta. Ukoliko se naspram AP mjesta ugradi bilo koja baza umjesto one koja bi bila komplementarna nedostajućoj bazi, nastaje mutacija. Dezaminacija azotne baze označava spontani prelazak njene primarne amino grupe u keto grupu . Na

ovaj način se u sisarskoj ćeliji dnevno nekoliko stotina baza prevodi u odgovarajuće bazne analoge, koji imaju drugačiji afinitet sparivanja. Dezaminacijom metiliranog citozina nastaje timin, koji je normalan gradivni element molekula DNK pa ga kontrolni mehanizmi ne uklanjaju. U sljedećoj replikaciji timin će se spariti sa adeninom, tako da prvobitni CG par biva zamijenjen parom TA, tj. dolazi do CG

AT

tranzicije. Citozin u CpG nizov ima je veoma podložan ovakvim transformacijama pa su CpG nizovi

označeni kao „hot spots“ za mutacije. Dezaminacijom citozina koji nije metiliran nastaje uracil. Uracil se u sljedećoj replikaciji sparuje sa

adeninom, što će usloviti takođe CG AT tranziciju. Dezaminacijom adenina nastaje hipoksantin koji se sparauje sa citozinom, što sljedom događaja dovodi do AT CG tranzicije. Indukovane mutacije nastaju djelovanjem na organizam različitih faktora, koji dovode do povećanja stope mutacija. U toku normalnog ćelijskog aerobnog metabolizma nastaju aktivne vrste kiseonika, kao što su slobodni radikali koji mogu dovesti do oksidativnog oštećenja baza u molekulu DNK, kao i u slobodnim dezoksinukleozid trifosfatima koji su supstrati za replikaciju.

41

Mnoge supstance iz životne sredine, koje su najčešće unijete hranom, mogu dovesti do dodavanja metil, etil ili druge alkil grupe na azotne baze u molekulu DNK i u slobodnim dezoksinukleozid trifosfatima. Ovo se naziva alkilacija baza.

17. GENOTOKSIČNI AGENSI Genotoksičnost je termin koji opisuje štetne uticaje koje mogu da imaju neke hemijske supstance i jonizirajuće zračenje na genetski material ćelije. Ono se opisuje i kao osobina hemijskih agenasa koji oštećuju genetičku informaciju u ćeliji izazivajući mutaciju, koja može dovesti do razvoja karcinoma. Genotoksičnost se često miješa sa mutagenošću, ali je važno zapamtiti da nisu svi mutageni genotoksični, dok su sve genotoksične supstance mutagene. Izmjene koje one izazivaju mogu imati direktan ili indirektan uticaj na DNK: indukovanje mutacija, nepravovremena aktivacija događaja, i direktno DNK oštećenje što dovodi do mutacija. Trajne, heriditarne promjene mogu pogoditi somatske ćelije organizma ili germinativne ćelije i tako biti prenijete na sljedeće generacije. Ćelije spriječavaju ekspresiju genotoksičnih mutacija ili DNK reparacijom ili apoptozom; međutim, šteta ne može uvijek da se popravi i to vodi do mutageneze.

Da bi ispitali genotokične molekule, istraživači proučavaju oštećenja DNK u ćelijama koje su bile izložene toksičnim supstratima. Ova oštećenja mogu biti u vidu jednolančanih ili dvolančanih prekida, gubitka ekscizijske reparacije, unakrsnog vezivanja, alikl-labilnih mjesta, tačkastih mutacija i strukturnih i numeričkih hromozomskih aberacija. Ovako kompromitovan integritet genetskog materijala je u stanju da dovede do pojave karcinoma.

Genotoksični agens je hemikalija ili neki drugi agens koji nanosi štetu ćelijskoj DNK, što rezultira pojavom mutacija ili karcinoma. Toksični su i za genom i mogu uticati na spermatozoide i jajne celije što

rezultira genetičkim promjenama u potomstvu! Genotoksične supstance mogu biti mutagene i kancerogene kada se inhaliraju, progutaju ili penetriraju kožu . Mutagen je agens koji je odgovoran za izazivanje promjena na genetičkom materijalu organizma. Takav agens može biti fizički, hemijski ili biološki. Kako mnoge mutacije mogu da na kraju rezultiraju pojavom karcinoma (ili da budu dio višefaznog procesa karcinogeneze), mutageni su takođe često i kancerogeni. Epigenetski karcinogeni ne oštećuju DNK, ali oštećuju enzime DNK reparacije čineći genom nestabilnim. U tom slučaju posljednja šansa za spasenje ćelija su NK ćelije. Hemijski karcinogeni: 1. direktno djelujući agensi 2. indirektno djelujući agensi (prokarcinogeni) 3. prirodni biljni i mikrobiološki proizvodi

1. DIREKTNO DJELUJUĆI AGENSI a. Alkilujući agensi – Alkilovana DNK se ni savija ni odvija pravilno, i ne može biti

procesuirana od strane enzima. Ovo rezultira citotoksičnošću koja ima efekat inhibicije ćelijskog rasta i apoptoze. Međutim, takođe se izazivaju i mutacije, uključujući i karcinogene mutacije, što objašnjava veću incidencu karcinoma nakon izlaganja. Primjeri ovakvih agenasa su: β-propiolakton, dimetil-sulfat, diepoksibutan, antineoplastični agensi (ciklofosfamid, hlorambucil, nitrozoureja...)

42

b. Acilovajući agensi – 1-aktil-imidazol, dimetilkarbamil hlorid 2. INDIREKTNO DJELUJUĆI AGENSI (PROKARCINOGENI) a. Policiklični aromatični ugljovodonici – Nalaze se u duvanskom dimu i izduvnim gasovima. Primjeri uključuju: benz(a)antracen, benz(a)piren,dibenz(a,h)antracen, 3-metilholantren, 7,12-dimetilbenz(a)antracen b. Aromatični amini, amidi, azo boje – Aromatični amini formiraju kovalnetnu vezu sa DNK i spriječavaju replikaciju. Primjeri uključuju: 2-naftilamin 3. PRIRODNI BILJNI I MIKROBIOLOŠKI PROIZVODI aflatoksin B1, griseofluvin, cikazin, betel orasi

Genotoksične hemijske agense možemo podijeliti u dvije osnovne grupe: 1. inicijatori 2. promotori

Dejstvo inicijatora je nepovratno, dok je dejstvo promotora do određenog trenutka reverzibilno. Zaštita od genotoksično supstanci se može postići antioksidantnim vitaminima (A, C I E) kroz, na primjer, redukciju nakon oksidacije od strane slobodnih radikala. EFEKTI NA ZDRAVLJE:  somatska mutacija  karcinom  razvojni defekti  tokom trudnoće  teratogeneza  germinativna mutacija (npr. izlaganje genitalija zračenju – stohastični efekti sa dugom

latentnošću)  hereditarni poremećaj Genotoksični agensi ne moraju biti samo hemijske prirode. Bilo koji faktori sredine koji mogu izazvati promjene naslednog materijala nazivaju se mutageni. Prema svojoj prirodi, mutageni su svrstani u 3 grupe:

 fizički mutageni  hemijski mutageni  biološki mutageni

FIZIČKI MUTAGENI Različite vrste zračenja, kao i izlaganje ekstremno niskim ili visokim temperaturama spadaju u fizičke mutagene. Temperatura može imati i mutageni i genotoksični efekat. Povećavanje temperature dovodi do povećanja kinetičke energije atoma i molekula u ćeliji, što ubrzava hemijske reakcije. Zbog ubrzanog opšteg metabolizma ćelije, frekvencija sudara molekula se povećava. U toku d irektnih sudara sa molekulom DNK može doći i do raskidanja veza unutar molekula, što se manifestuje pojavom jednolančanih i dvolančanih prekida. Izlaganje visokim temperaturama dovodi i do dezaminacije citozina pri čemu se dobija uracil, koji nije azotna baza DNK, što dovodi do prekida replikacije. Može indukovati promjenu u genskoj ekspresiji, kao i inaktivaciju reparacionih mehanizama, što za posljedicu ima letalan ishod.

43

Niska temperatura je posebno stresna za homeoterme. Stanje stresa je praćeno povećanjem lučenja hormona i ubrzavanja procesa na koje utiču, što nekada dovodi do smanjene kontrole i pojave grešaka koje se nagomilavaju. Povećanje koncentracije hormona je genotoksično, jer ako stupe u reakciju sa nasljednim materijalom ćelije, uslijediće razni mutacioni događaji. Zračenje može biti jonizujuće i nejonizujuće. Jonizujuće zračenje je zračenje vrlo visoke energije koje je u stanju da direktno ili indirektno stvara jone. Ovaj efekat imaju X zraci, , i zraci, protoni i neutroni. Izvori jonizujućeg zračenjaprirodni su i vještački. U prirodne izvore zračenja spadaju: kosmičko zračenje Zemlje i unutrašnje zračenje – kada se u organizam unesu radioaktvne čestice. U vještačke izvore spadaju: nuklearni reaktori, elektrane, radioaktivni izotopi, rentgenski aparati i sl. Doze zračenja se mjere količinom energije koju su tkiva apsorbovala i ne postoji minimalna doza koja ne izaziva efekat. Zračenje ima i kumulativan efekat – svaka naredna doza zračenja pridodaje se postojećoj. Jedinica za mjerenje apsorbovane doze jonizujućeg zračenja je grej (Gy), a ozračenje od 30 cGy udvostručuje stepen mutabilnosti gena. Posledice zračenja su fragmentacija hromozoma, strukturne i numeričke aberacije. Efekti na nivou gena su povećanje stope spontanih mutacija. Genotoksikološki efekti jonizujućeg zračenja zavise od kiseonika u ćeliji i faze ćelijskog ciklusa. Sam

kiseonik ne može izazvati mutacije. Dejstvom zračenja dolazi do jonizacije vode i u prisustvu kiseonika stvara se vodonikperoksid (H₂O₂), koji je vrlo reaktivan i odgovoran za indukovanje mutacija. Na nivou ćelijskog ciklusa, zračenje u G₁ fazi dovodi do strukturnih aberacija, u S fazi do aberacija hromozoma i hromatida, a u G₂ fazi do hromatidnih aberacija. Ćelije u mejozi su osjetljivije na zračenje od ćelija u mitozi, a zigot je posebno osjetljiv na zračenje kada počne brazdanje.

Nejonizujuće zračenje je UV zračenje i jedino je sposobno da poveća fragmentaciju hromozoma i učestalost mutacija.Elektromagnetni zraci djeluju na jedinjenja koja ih direktno apsorbuju, a to su upravo nukleinske kiseline. Pirimidini apsorbuju velike doze UV zraka i 10 puta su osjetljivije od purina. U fotolizi pirimidina obrazuju se pirimidinski dimeri: TT, TC i CC, koji blokiraju funkciju DNK i RNK polimeraza i prekidaju replikaciju. Ćelija se od navedenog brani reparacionim mehanizmima. Ukoliko je

oštećenje veće od reparacionih mehanizama ćelije, može doći do njene smrti. UV zračenje i X zračenje mogu dovesti i do takve mutacije gena da on ima sposobnost indukovanja nekontrolisane diobe ćelija i pojave tumora. Ovakvi geni se nazivaju onkogeni.

HEMIJSKI MUTAGENI

Svakodnevno smo u kontaktu sa velikim brojem hemikalija i veoma je važno ispitati da li one imaju mutageni efekat. Posebna pažnja se poklanja materijama iz hrane, vode, vazduha, farmaceutskih i kozmetičkih sredstava ili industrijskih procesa. Samo mali broj hemijskih agenasa su direktni mutageni, većina ne reaguje sa nukleinskim kiselinama i proteinima. Prolazeći kroz metaboličku transformaciju,

neaktivni mutageni i kancerogeni postaju aktivni. Oni su visoko reaktivni prema nukleinskim kiselinama, ali nam je za mnoge mehanizam dejstva nepoznat.

44

AGENSI KOJI SE NALAZE U VODI I HRANI

AGENSI IZ INDUSTRIJSKIH PROCESA

FARMACEUTSKI PROCESI

PESTICIDI

Prirodni sastojci: toksini gljiva i proizvodi metabolizma nekih bakterija Konzervansi: nitriti i nitrati

Organski rastvarači

Određeni ljekovi iz

Organska halogena jedinjnja

Vještački zaslađivači:

Materije koje se koriste u izradi celuloznih

kozmetičkih preparata

vlakana i plastičnih

(aromatični amini i

masa Neorganska jedinjnja As, Be, Cr, Co, Cd, Ni i Pb

drugi aditivi)

saharin

Hlorisanjem vode nastaju trihlormetan i hlorfenoli.

Organska jedinjena

grupa: citistatika, psihofarmaka, narkotika, anestetika Supstance koje ulaze u sastav nekih

Rodenticidi

npr. boje za kosu

Insekticidi

Hemijski mutageni djeluju na 3 načina: 1. Reaguju sa DNK i transformišu bazu 2. Djeluju samo pri replikaciji analogne baze koja se uključuje u molekul DNK umjesto uobičajenih baza 3. Treći tip djelovanja hemijskih mutagena je djelovanje akridinskih boja koje umetanjem u molekulu DNK mogu da izazovu delecije i insercije.

Od hemijskih mutagena, veoma značajna je azotasta kiselina (HNO₂), koja je vrlo snažan mutagen – djeluje direktno na DNK, odnosno tra nsformiše baze iz amino – forme u keto – oblik. Pod

dejstvom azotne kiseline adenin se mijenja u hipoksantin. U lancu DNK koji sadrži hipoksantin, pri replikaciji, ugradiće se nukleotid sa citozinom koji je komplementaran hipoksantinu. U drugoj replikaciji, u jednostruki lanac koji sadrži citozin će se ugraditi komplementaran nukleotid koji nosi guanin, pa će u tom položaju umjesto AG biti GC tj. izvršiće se supstitucija tipa tranzicije. Slično će se dogoditi pod dejstvom etil -metan-sulfanata koji je takođe mutagen i mijenja guanin u etilguanin → etil-guanin je komplementaran timinu, pa će se i u ovom slučaju desiti tranzicija, odnosno umjesto GC, nalaziće se AT. Druga vrsta mutagena obuhvata analoge baze. Ove supstance su hemijski slične bazama i mogu se inkorporirati u DNK umjesto jedne od normalnih baza. Analoge baze se češće pogrešno sparuju nego normalne baze i tako povećavaju stope mutacija. Posljedice dejstva aktivnih mutagena su nekovalentne interakcije sa molekulom DNK. Može doći do umetanja molekula mutagena između parova baza unutar DNK, ili njegovog spoljašnjeg vezivanja na mjestima koja ne učestvuju u vodoničnim vezama naspramnih baza. Sve ovo dovodi do genetskih mutacija. 45

Djelovanje pojedinih hemijskih mutagena može indukovati prekide translacije, inverzije ili promjene u broju hromozoma. Osim mutagenog i kancerogenog efekta, hemijski agensi mogu da imaju za posljedicu i poremećaje u toku razvića i teratogeni efekat. Neki ljekovi kod čovjeka i nekih primata

izazivaju drastične malformacije udova. Kada žena tokom trudnoće uzima neki potencijalno teratogeni lijek, ne može se sa sigurnošću utvrditi da je anomalija u razvoju ploda posljedica djelovanja lijeka. Nekada je posledica uticaja bolesti zbog koje je lijek propisan ili međudejstva više teratogena, što svakako otežava teratološka istraživanja. BIOLOŠKI AGENSI Kao biološki agensi, poznati su mnogi virusi koji mogu izazvati mutacije genetičkog materijala ili uticati na razvojne promjene. Ovakvi efekti su često prisutni u embrionalnom razviću čovjeka. 

Infekcija trudnice rubeolom može dovesti do anomalije srca embriona



Virusi kao B-virus hepatitis, virus varičele, poliovirus, virus azijskog gripa itd. mogu imati teratogene efekte i dovesti do mutacije pojedinih gena. Neki virusni geni mijenjaju gene

domaćina u onkogene i dovode do stvaranja kancera. U eukariotskim ćelijama postoje veoma stari geni koji kontrolišu rast i diferencijaciju ćelija i nazivaju se

protoonkogeni ili onkogene ćelije. U humanom genomu otkriveno je više od 30 ovakvih gena, ali se

pretpostavlja da ih je čak i stotinu. Dejstvom različitih kancerogenih materija, ovi korisni geni se mogu izmijeniti i postati onkogeni. Jedan od načina njihove promjene je i uključivanje virusa (transformišući virus) u genom normalne ćelije. Ako je virus pozicioniran u sekvenci DNK čiji produkt učestvuje u nekom vitalnom procesu ćelije, zamijenjena aktivnost remeti i sam proces. Matematički proračuni pokazuju da štetna mutacija koja se samo jednom pojavi ostaje oko 600

godina – 30 generacija, dok se ne eliminiše prirodnom selekcijom, pod uslovom da se pojavi samo jednom i nikad više.

18. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZA I NJENA PRIMJENA – PCR TEHNIKA PCR (engl. polymerase chain reaction) ili reakcija lančane polimerizacije je metod koji omogućava selektivno umnožavanje određenog segmenta molekula DNK. Zbog svoje jednostavnosti, brzine i pouzdanosti PCR metoda se danas najšire primjenjuje u molekularnogeetičkim analizama. PCR metoda se zasniva na principima replikacije DNK. Da bi se izvršilo umnožavanje odabranog regiona DNK, neophodno je da poznajemo strukturu njegovih graničnih regiona. Na osnovu tih podataka konstruišu se jednolančani nizovi od oko 20 nukleotida – tzv. prajmeri, koji su komplementarni ovim regionima. U PCR reakciji prajmeri se vezuju za matrične niti DNK i služe kao DNK polimerazi kao početnice za sintezu novih lanaca nukleotida. U jednom ciklusu umnožavanja se mogu izdvojiti tri

osnovne faze, slično kao pri fiziološkoj replikacij DNK u ćeliji: 1. denaturacija DNK 2. komplementarno vezivanje prajmera 46

3. sinteza novih lanaca

Svaka faza PCR reakcije je određena temperaturom na kojoj se odvija i vremenom trajanja. Ciklusi umnožavanja se ponavljaju 25-40 puta. Ključni korak u razvoju metode označila je izolacija termostabilne DNK polimeraze, koja može da sačuva efikasnot tokom cikličnih temperaturnih promjena i poznata je kao Tag polimeraza.

U klasičnoj reakcionoj smješi za PCR nalaze se: DNK koja se analizira, specifični prajmeri, enzim Tag polimeraza, slobodni nukleotidi za sintezu novih lanaca, joni Mg++ i odgovarajući pufer. Za izvođenje PCR reakcije koriste se automatizovani aparati. 25-40 ciklusa PCR se završi za oko 2.5 -3 sata.

Na početku svakog ciklusa vrši se denaturacija uzorka DNK na temperaturi od 94 -95 °C. U drugoj fazi – fazi annealing-a ili hibridizacije, par prajmera se specifično vezuje za komplementarne regione DNK, ograničavajući segment koji treba da bude amplifikovan. Povezivanje prajmera se odvija na temperaturi koja zavisi od njihove sekvence tj. redosljeda nukleotida, a iznosi 5070 °C. Izbor optimalne strukture prajmera i temperature njiovog vezivanja je od ključnog značaja za

specifčnost PCR reakcije. Treća faza je faza sinteze DNK, poznata i kao faza ekstenzije. Enzim Tag DNK polimeraza vrši sintezu novih (komplementarnih) lanaca nukleotida, koji se nastavljaju na prajmere u 5'-3' smjeru. Prekursorski molekuli za sintezu su su slobodni nukleotidi u obliku deznukleozid trifosfata, a reakciju katalizuju joni Mg++. Tag polimeraza ostvaruje optimalno dejstvo na 72 °C, pa je to uobičajena

temperatura na kojoj se odvija faza ekstenzije; vrijeme trajanja je određeno veličinom regiona koji se umnožava. Na završetku ove faze dobijaju se dvije kopije segmenta DNK koji je ograničen prajmerima. Reakcija se zatim ciklično ponavlja (denaturacija DNK – hibridizacija prajmera – sinteza...) a u svakom novom ciklusu kao matrice služe i novosintetisani molekuli DNK. Nakon 25-40 ciklusa željeni segment DNK je umnožen 104-106 puta, što omogućava njegovo

uočavanje – vizuelizaciju poslije gel-elektroforeze i bojenja. Osnovne prednosti PCR metode su:



brzina (nekoliko sati)



jednostavnost (nisu potrebni restrikcioni enzimi niti radioaktivitet, odvija se u aparatu)



visoka specifičnost (obezbijeđena adekvatnim prajmerima).

19. DNA POPRAVKA, REPARACIONI MEHANIZMI Sva oštećenja molekulda DNK moraju biti odmah popravljena, u cilju držanja kontinuiteta genetičke informacije. Iako je direktno popravljanje oštećenja najneposredniji put obnavljanja genetičke informacije, ono nije uvijek moguće, budući da su neki tipovi oštećenja u suštini ireverzibilni. 47

Danas je najbolje izučena fotoreaktivacija ciklobutanskih dimera pirimidina11 pomoću enzima fotoliaze. Fotoliaza sadrži komoponentu metil tetraidrofolat (MTHF) koja služi kao primarni sakupljač svjetlosti i prenosi prikupljenu energiju na FADH12. Ova energija se koristi za cijepanje kovalentnih veza

među dimerima. Drugi primjer direktne popravke oštećenja je popravka O6 metil guanina13, pomoću enzima O6 metil G DNK transferaze (MGMT). Ovaj enzim, prisutan u svim živim bićima, je sposoban ta ukloni metil grupu sa O6 metil guanina premještajući je na svoj cistein. Treći primjer direktne reverzije oštećenja molekulu DNK je popravka jednolančanih prekida u polinukleotidnom lancu pomoću enzima DNK ligaze. Ovaj enzim je u stanju da obnovi fosfordiestarsku

vezu između nukleotida samo ako su u tačkama prekida prisutni: 5' fosfatni ostatak i 3' hidroksilna grupa.

REPARACIJA POGREŠNO SPARENIH NUKLEOTDA Reparacija pogrešno sparenih nukelotida ili MMR (engl. missmatch repair) se odvija u tri faze: 1. prepoznavanje heterodupleksa i formiranje reparozoma 2. degradacija lanca koji sadrži grešku 3. reparaciona sinteza degradovanog dijela lanca DNK

MMR KOD PROKARIOTA

Pogrešno sparene baze ili insercije/delecije malog broja nukleotida u jednom lancu dovode do lokalne distorzije molekula DNK. Taj segment, u kome ne postoji komplementarnost između dva lanca, označen je kao heterodupleks. Kod E. coli ovu promjenu prepoznaje i za nju se vezuje kompleks proteina MutS-MutL (engl. Mutator S; Mutaror L) , koji potom aktivira protein MutH (engl. Mutator H). U cilju pirimidinski dimeri su molekulska oštećenja formirana od timinskih ili citozinski baza DNK molekula putem fotohemijske reakcije. Ciklobutanski dimer pirimidina sadrži četvoročlani prsten formiran putem dva sparivanja C=C dvostrukih veza pirimidina. Ovakvi dimeri ometaju sparivanje baza tokom replikacije DNK, te dovode do mutacija. 12 flavin adenin dinukleotid (FAD) je redoks kofaktor koji učestvuje u nekoliko važnih metaboličkih reakcija. FAD 11

može da postoji u dva različita redoks stanja, između kojih se on konvertuje primanjem ili doniranjem elektrona. Ovaj molekul se sastoji riboflavina (vitamina B2) vezanog za fosfatnu grupu ADP molekula. Flavinska grupa je vezana za ribitol, šećerni alkohol, ugljenik-azot vezom, koja nije glikoziDNK veza. Stoga, riboflavin nije tehnički

nukleotid. Ime flavin adenin dinukleotid je nepravilan naziv. FAD se može redukovati do FADH2, pri čemu prima dva atoma vodonika, a o vaj se može oksidovati do FADH gubitkom jednog atoma vodonika. 13

O6 metil guanin je derivat guanina kod koga je metil grupa vezana za atom kiseonika. Nastaje alkilovanjem atoma kiseonika. O6 metil guanin se radije komplementarno vezuje sa timinom nego cito zinom, izazivajući CGAT tranziciju.

48

razlikovanja starog matričnog i novosintetisanog lanca DNK sa greškom, MutH prepoznaje molekul DNK u okolini heterodupleksa, u potrazi za metilovanim bazama. Budući da metilacija nekoliko minuta zaostaje za replikacijom, novosintetisani lanci nisu metilovani. Na taj način MutH prepoznaje stari metilovani lanac i pravi jednolančani prekid u novosintetisanom nemetilovanom lancu. UvrD protein koji predstavlja helikazu tipa II, odmotava novosintetisani lanac a egzonukleaza potom uklanja jedan po

jedan nukleotid iz ovog „oljuštenog“ segmenta DNK, uključujući i pogrešno spareni nukleotid. DNK polimeraza III zatim popunjava nastalu prazninu, a spajanje sa ostatkom lanca obavlja DNK ligaza. MMR KOD EUKARIOTA

Najprije, razlikovanje novosntetisanih lanaca DNK se ne odigrava na osnovu njihovog

metilacionog statusa, već na osnovu prisustva jednolančanih prekida u novosintetisanim lancima DNK: na 3' kraju vodećeg lanca i na 5' kraju zaostajućeg lanca. Pored toga, kod eukariota ne postoje homolozi MutH i UvrD gena, ali postoje brojni homolozi MutS i MutL gena. Veći broj takiv gena nađen je u nasljednoj osnovi kvasca. U genima čovjeka postoji 5 gena čiji su produkti strukturno i funkcionalno slični produktima MutS i 3 homologa MutL gena i to hMLH1, hPMS1 i hPMS2. MutS i MutL proteini

funkcionišu kod bakterija kao monomeri ili kao homodimeri14, dok njihovi eukariotski homolozi funkcionišu kao heterodimeri15. Kod čovjeka su uočena i dva tipa heterodimera MutS homologa (MutS i MutS) i tri tipa heterodimera MutL homologa (MutL, MutL i još jedan heterodimer sastavljen od MLH1 i PMS2 kod čovjeka kome još nije dodijeljeno ime).U izgradnji reparozoma učestvuju endonukleaze koje imaju zadatak da uklone novosintetisani lanac koji sadrži pogrešne nukleotide. Ugradnju ispravnih nukleotida u upražnjenom segmentu obavljaju enzimi koji i inače učestvuju u replikaciji molekula DNK kao što su: 

DNK polimeraza



PCNA (engl. proliferating cell nuclear antigen) koji djeluje kao kofaktor za DNK polimerazu

 i  tako što stabilizuje MutS i MutL heterodimere na mjestima pogrešno sparenih baza. 

RPA (engl. replication protein A) protein koji se vezuje u jednolančanu DNK



RFC (engl. replication factor S) koji dovodi PCNA na kraj početnice.

20. MOLEKULARNI MEHANIZMI EKSCIZIJSKE REPARACIJE REPARACIJA EKSCIZIJOM BAZA (engl. Base Excision Repair

– BER)

Ekscizijom baza najčešće se uklanjaju pogrešne – strane baze ili alkilovane baze. Ovaj sistem je praktično specifičan za svaki tip pogrešne baze. Međutim, sve različite varijante BER -a se odvijaju u 3 osnovna koraka:

homodimer – protein koji se sastoji od dva polipeptiDNK lanca koji su identični po redosljedu, broju i vrsti aminokiselina 15 heterodimer – protein koji se sastoji od dva polipeptiDNK lanca koji se razlikuju p o redosljedu, broju ili vrsti aminokiselina 14

49

 

Uklanjanje pogrešne baze odgovarajućom N glikozilazom čime se formira AP mjesto; Formiranje jednolančanog prekida i stvaranje slobodnog 3'OH kraja, djelovanjem AP endonukleaze uzvodno od AP mjesta;



Sinteze novog lanca počev od 3'OH kraja uz izbacivanje AP mjesta, pomoću DNK polimeraze.

DNK N glikozilaze posjeduju mjesto sa sanžnim afinitetom za vezivanje specifične baze ili baznog

analoga. Pregledajući molekul DNK u potrazi za pogrešno sparenom bazom, ovi enzimi svojom konformacijom dovode do toga da na mjestu lokalne nestabilnosti, pogrešno sparena baza bude isturena iz molekula DNK i „upadne“ u vezujuće mjesto enzima. Ukoliko ovo mjesto specifično prepozna određenu bazu, ona će se tu zadržati dovoljno dugo da N glikoziDNK veza između baze i dezoksiriboze bude raskinuta. Tako nastaje AP mjesto koje potom ulanja endonukleaza, vršeći hidrolizu fosfordiestarske veze u 5' smjeru od AP mjesta.

Nakon toga dolazi do hidrolize fosfordiestarske veze u 5' smjeru od AP mjesta pomoću AP endonukleaze. Najbolje izučena endonukleaza je enzim kod E. coli koji nosi naziv endonukleaza III. Nakon formiranja jednolančanog prekida u 5' smjeru od AP mjesta, u sljedećem koraku DNK polimeraza

, ugrađuje jedan nukleotid počev od 3'OH grupe uzvodno od AP mjesta. Otkriveno je i da DNK ima i dezoskiribofosfataznu aktivnost čime se uklanja dezoksiribofosfatni ostatak. Restauraciju dvolančanog molekula DNK i ovdje obavlja enzim ligaza. polimeraza

REPARACIJA EKSCIZIJOM NUKLEOTIDA (engl. Nucleotide Excision Repair – NER)

NER uključuje sljedeće korake:



prepoznavanje oštećenja; vezivanje nukleoproteinsog kompleksa za oštećeno mjesto; dvostruka incizija – isijecanje sa obije strane oko izmijenjenog mjesta; uklanjanje nukleotida koji se nalaze između ovih jednolančanih prekida;



popunjavanje praznine DNK polimerazom;



ligacija.

  

Kod E. coli postoje 3 proteina uključena u prepoznavanje oštećenog mjesta: uvrA, uvrB i uvrC. Najprije se kompleks sastavljen od dva uvrA proteina i jednog uvrB monomera vezuje za molekul DNK i klizi po

njemu u potrazi za lokalnim disterzijama (koje mogu nastati kao posljedica oštećenja u molekulu DNK). Kad dođe do mjesta oštećenja, dimer uvrA se otpušta, omogućavajući još ćvršće vezivanje uvrB i povećanje lokalne distorzije molekula DNK. Potom se za kompleks uvrB/DNK vezuje uvrC protein. Time se uvrB aktivira da izvrši jednolančani prekid 4 baze nizvodno (u 3' s mjeru) od mjesta oštećenja, dok sam uvrC vrši jendolančani prekid približno 7 baza uzvodno (u 5' smjeru) od mjesta oštećenja. U toku ovih procesa dolazi do vezivanja ATP-a ali ne i do njegove hidrolize. Vezana energija je potreba tek četvrtom proteinu iz ovog kompleksa, produktu uvrD gena koji je poznat kao DNK helikaza II, da ukloni oligonukleotide, među kojima je i oštećeni nukleotid.

50

Nastali jendolančani prekid popunjava DNK polimeraza I, a DNK ligaza potom vrši potpunu restituciju dvolančanog molekula DNK. Kod eukariota se proces NER-a načelno dovija na sličan način, ali postoje mnoge razlike u detaljima. U

formiranju reparozoma učestvuje više od 25 proteina koji se udružuju na mjesu oštećenja na precizno uređen način. Vezivanje ovog kompleksa povećava lokalnu distorziju molekula DNK čime se pokreće meanizam globalnom genomskog repera ekscizijom nukleotida (GG-NER). Naime, povećanjem lokalne distorzije molekul DNK se „otvara“ za pristup druga 3 proteina ili proteinska kompleksa. Jedan od njih je opšti transkripcioni faktor TFIIH, sastavljen od 9 subjedinica od kojih neke imaju funkciju helikaza i odmotavaju molekul DNK u oba pravca od mjesta oštećenja. Pored TFIIH u ovaj kompleks ulazi i RPA i XPA. RPA se vezuje za jednolančanu DNK i stabilizuje otvoreni DNK kompleks, a takođe je uključen u pozicioniranje dvije endonukleaze (XPG i XPF) koje specifično prepoznaju mjesta spoja između jednolančane i dvolančane forme molekula DNK, što sugeriše da je za njihovu funkciju neophodno prethodno rasplitanje dvolančane spirale, pomoću TFIIH monomera. Precizna uloga XPA još uvijek nije poznate.

Oštećenja u okviru regiona koji su transkripciono aktivni se moraju brže popraviti. Reparacija transkripciono aktivnih regiona (engl. Transcription Coupled – TC-NER) uključuje sve proteine potrebne za GG-NER izuzev XPC-bHR23B kompleksa. Naime, u ovim regionima DNK je despiralizovana pa su

oštećenja dostupnija reparacionoj mašineriji, tako da ih prepoznaje sam kompleks RNK polimeraze II. Pritom, usporavanje RNK polimeraze može biti signal da postoji oštećenje. Dva proteina CSA i CSB (označeni tako jer su defektni kod pacijenata koji boluju od Cockayne sindroma (CS)) pomažu ukljanjanje RNK polimeraze II sa molekulda DNK tako da TFIIH, XPA i RPA mogu da pristupe mjestu oštećenja. Slično GG-NER-u nakon sklapanja ovog kompleksa, dolazi do odmotavanja niza 20-30 nukleotida sa obije strane

oko oštećenog regiona. odvija se na sličan načinDvostruko GG -NER-u.isijecanje endonukleazama i naknadno popunjavanje nastale praznine

OBOLJENJE

KLINIČKA SLIKA

NER I OBOLJENJA KOD LJUDI Xeroderma Trihotiodistrofija pigmentosum velika osjetljivost na krte dlake sa svjetlost, izražene nedostatkom sumpora, nepravilnosti abnormalnosti lica, pigmentacije kože, nizak rast, ihtioza, visoka incidenca ranog osjetljivost na svjetlost

raka kože, povećana učestalost drugih oblika kancera, česta neurološka oštećenja.

u oko 50% slučajeva.

Cockayne syndrom patuljasti rast, abnormalnosti lica

i ekstremiteta, neurološke abnormalnosti, osjetljivost na svjetlost (u nekim slučajevima),

skraćen životni vijek usljed nurodegenerativnih promjena.

21. SOS REPARACIJA Godine 1974. Miroslav Radman je opisao i imenovao SOS odgovor koji u bakteriji E. coli održava integritet genoma pomoću replikacije preko oštećenja DNK tzv. translezijske sinteze (engl. translesion

51

synthesis – TLS) te mogu nastati greške i mutacije u DNK. SOS odgovor indukuju spolašnji štetni agensi

koji oštećuju DNK. Indukujući signali u bakteriji E. coli su: oštećenja DNK metaboličkim intermedijeri16, greške u replikaciji, rekombinaciji ili hromozomskoj segregaciji17, povišena temperatura iznad svojstvene

metaboličke, izloženost antibioticima i visokom pritisku, blago alkalni uslovi, toksične materije i mutageni. Iznenađujuće je da se SOS odgovor može aktivirati i prekidom dvostruke ovojnice koja je nastala restrikcionom endonukleazom18 same E. coli. Signal za ekspresiju gena regulona19 SOS javlja se upravo u regiji jednolančane DNK kada se DNK

polimeraza III zaustavi na oštećenu u DNK. Odgovor SOS regulisan je represorom LexA kao i proteinom RecA koji se veže na jednolančanu nakon zastoja replikacije DNK te djeluje kao aktivator. Kompleks RecA-DNK tzv. RecA filament odgovoran je za tri međusobno važne funkcije: indukciju SOS odgovora i indukovanu SOS mutagenezu, te rekombinaciju DNK. Represor LexA u neindukovanom stanju sprječava

ekspresiju gena koji kodiraju proteine uključene u SOS odgovor. Nakon izlaganju nekom mutagenom agensu dolazi do oštećenjaDNK i nastajanja regije jednolančane DNK. Na jednolančanu DNK (eng. single strand DNK – ssDNK) se veže protein RecA koji postaje aktiviran te indukuje autoproteolizu represora LexA. Indukovanjem SOS odgovora sinteza proteina RecA je brza (10 molekula u sekundi), a maksimum

se postiže sat vremena nakon djelovanja mutagenog agensa. Veća koncentracija nukleoprotein kompleksa i interakcija RecA s LexA izaziva razaranje sve većeg broja represora LexA čime se omogućava ekspresija sve više gena regulona SOS. Produkti ekspresije prvih gena su enzimi (UvrA i UvrB) koji promiču popravak oštećene DNK, a produkti kasnih gena su polimeraze sklone greškama. Kada polimeraze pređu preko oštećenja u DNK i ugrade bilo koju nukleinsku bazu onda djeluje DNK ligaza. Tada nestaje jednolančana DNK pa se sitetisani represor LexA više ne cijepa već se ponovno veže na operatorska mjesta gena SOS odgovora i ćelija ulazi u neindukovano stanje. Istraživanja kod E. coli su pokazala da se u uslovima stresa kada dolazi do aktivacije odgovora SOS aktiviraju tri DNK polimeraze i to II, IV i V koje mogu uvesti mutacije translezijskom sintezom DNK.

DNK polimeraza II je uključena je u ćelijsku popravaku, što znači da može replikovati oštećenu DNK.

Sinteza DNK polimeraze II je indukovana u stacionarnoj fazi kad se nakupljaju DNK oštećenja koja blokiraju aktivnost DNK polimeraze III i tako zaustavljaju replikaciju. U tim uslovima aktivnost DNK

polimeraze II pokreće replikacione viljuške u zastoju nizvodno od oštećenja. Ona je procesivna i u većini slučajeva tačna, međutim tokom SOS odgovora uvodi mutacije.

16 17

metabolički intermedijeri – molekuli koji su prekursori ili metaboliti biološki značajnih molekula. hromozomska segregacija – stepen u ćelijskoj diobi, u kome se hromozomski parovi razdvajaju. U mitozi se

formira kompletna kopija svakog hromozoma. U mejozi hromozomi svakog para migriraju u suprotnom smjeru

ćelije, te dolazi do razdvajanja gena radi formiranja gameta. restrikciona endonukleaza - enzim koji presij eca DNK na specifičnim prepoznatljivim nukleotid nim sekvencama poznatim kao restrikciona mjesta. Ovi enzimi, nađeni kod bakterija i arheja, su vjerovatno nastali kao odbrambeni mehanizam protiv virusne invazije. 19 regulon – grupa gena koja je regulisana kao jedinica, generalno kontrolisana od strane istog regulatornog gena 18

koji eksprimira protein koji se ponaša kao represor ili aktivator. 52

DNK polimeraze V i IV su isključivo sklone greškama što rezultira nastankom mutacija koje su od velike važnosti za prilagođavanje bakterije E. coli tokom stresnih uslova. DNK polimeraza V je aktivni enzim i sastoji se od jedne podjedinice UmuC i dvije aktivirane podjedinice umuD'. U normalnim ćelijama ima je manje od 15 molekula po ćeliji. Vrlo je uspješna u prelaženju preko pirimidinskih dimera nastalih djelovanjem UV zraka. DNK polimeraza IV je takođe sklona greškama i manja oštećenja može tolerisati. DNK polimeraze V i IV karakteriše sposobnost replikacije oštećene DNK, nedostatak procesivnosti i niska vjernost replikacije. DNK polimeraza IV je u normalnim ćelijama prisutna na relativno visokom nivou – do 250 molekula po ćeliji u poređenju sa polimerazom III koje ima do 20 molekula po ćeliji. SOS indukcijom nivo DNK polimeraze IV raste dodatnih 10 puta. Istraživanjima je dokazano da značajno doprinosi

mutagenezi ćelija u mirovanju tzv. adaptivnoj mutagenezi. Precizna uloga DNK polimeraze IV u normalnim i SOS indukovanim ćelijama još uvijek je nedovoljno istražena. Međutim, istraživanja su pokazala da DNK polimeraza IV i DNK polimeraza V kada su indukovane, bilo putem SOS odgovora ili

nekim drugim načinom, povećavaju stopu ćelijske mutacije čak i u odsutnosti oštećenja DNK. Posmatranjem u laboratoriji s konstitutivno aktiviranim SOS odgovorom utvrđeno je da jeDNK polimeraza IV povećava frekvenciju mutacije za 10 puta, a DNK polimeraza V za više od 13 puta. Reakcija na stresna stanja je povećana stopa mutacije koja nastaje SOS odgovorom tokom kojeg dolazi do mogućnosti popravke oštećenja kao i djelovanja DNK polimeraza II, IV i V.Ove polimeraze sklone greškama (DNK mutaze) mogu uvesti pogrešnu bazu tokom replikacijepreko oštećenja u lancu DNK koji je matrica. Na taj način mogu nastati nove kombinacije gena što može da rezultira sintezom drugačijih proteina i nekom novom sposobnošću preživljavanja bakterije u novoj niši. (npr. rezistencija na neki antibiotic). Dokazano je da neki antibiotici indukuju SOS odgovor i tako povećavaju rezistenciju E. coli. Zato danas naučnici nastoje ljekovima onemogućiti aktivnost proteina SOS odgovora kod patogenih bakterija da bi se onemogućila pojava rezistencije na specifične antibiotike putem njegove aktivnosti.

22. STRUKTURA I FUNKCIJA HROMOZOMA Hromozomi predstavljaju zapakovane spiralizovane DNK molekule. Broj i vrsta hromozoma su

karakteristični za vrstu. Razlikujemo građu hromozoma prokariotskog i eukariotskog organizma. Hromozom prokariota predstavlja hromozom kružnog oblika smješten u citoplazmi u vidu nukleoida. To bi značilo da nije odvojen nukleusnom membranom od okoline. Osim toga za njega je

značajno da ne sadrži histone. Takođe je karakterisitčno i postojanje samo jednog replikacionog početka. Građa eukariotskog hromozoma se najbolje vidi na primjeru metafaznog hromozoma. Na metafaznom hromozomu razlikujemo dvije hromatide (sestrinske) koje predstavljaju spiralizovan, za

histone povezan molekul DNK. Među sobom oni su povezani centromerom koja predstavlja veoma složen kompleks proteina. Centromera ili primarna konstrikcija hromozoma je region koji spaja dvije sestrinske hromatide.

Prema položaju centromere hromozomi se mogu podjeliti na: metacentrične, submetacentrične, akrocentrične i telocentrične. Metacentrični hromozom je hromozom kod koga su p i q krak jednake dužine. Submetacentični hromozom je hromozom kod koga je p krak kraći od q kraka. Akrocentrični 53

hromozomi su hromozomi koji sadrže veoma mali p krak dok je q krak mnogo veći (centromera postavljena oko 1/5 hromozoma). Telocentrični hromozom je hromozom kod koga se centromera nalazi terminalnio, tako da nemaju p krak. Kod čovjeka nemamo telocentričnih hromozoma Na svakom kraju eukariotskog hromozoma nalaze se djelovi visokoponavljajuće DNK koji se nazivaju telomere. Telomere imaju funkciju u stabilizaciji hromozoma. Hromozomi bez telomera su

međusobno ljepljivi šro dovodi do njihove fuzije. Pri replikaciji DNK ne dolazi do replikacije telomera. To podrazumjeva da se svaka telomera poslije diobe skrati. U jednom m omentu telomere će postati toliko male da se ne mogu više skraćivati. To dovodi do prekida dioba i smrti ćelije. S obzirom na to da dužina telomera određuje ukupan broj dioba jedne jedinke, one su označene kao mitotski časovnik. Postoje specifični enzimi telomeraze koje mogu replicirati telomere. Ovi enzimi se nalaze u embrionalnim ćelijama ili ćelijama tumora. Replikacioni početak predstavlja region na DNK lancu na kome počinje udvajanje DNK. Kod prokariota postoji samo jedan replikacioni početak, dok se k od eukariota nalazi veliki broj ovih struktura što predstavlja značajnu razliku u replikaciji prokariotske i eukariotske DNK. Pored primarnog suženja – centromere na određenim hromozomima (akrocentričnim kod čovjeka) nalazi se sekundarno suženje. Sekundarno suženje se kod čovjeka nalazi na kratkim kracima hromozoma D i G grupe. Geni koji se nalaze na sekundranim suženjima predstavljaju regione organizatore nukleolusa jer rRNK, koja se sa njih prepisuje, i ovi geni grade zajedno nukleolus. Na ovim hromozomima opisujemo i satelite. Sateliti su terminalni djelovi hromozoma koji su sekundarnim

suženjem povezani za preostali dio hromozoma. Sateliti ne nose gene, ali mogu biti jedan od markera ovih hromozoma.

23. REPRODUKCIJA I SEKSUALITET Reprodukcija predstavlja fundamentalnu karakteristiku života na kojoj se zasniva širenje žive materije u prostoru i vremenu. Na ovom procesu se zasniva kontinuitet žive materije. Razlikujemo tri osnovna tipa reprodukcije: reprodukcija molekula, reprodukcija ćelije i

reprodukcija organizama. Reprodukcija molekula podrazumjeva: akumulaciju, sintezu uz pomoć enzima, sintezu na osnovu modela i autoreprodukciju. Akumulacija predstavlja najjednostavniji oblik reprodukcije molekula. Da bi došlo do umnožavanja određenog molekula on mora biti unesen u organizam.

Sinteza uz pomoć enzima podrazumjeva i akumulaciju, jer da bi došlo do sinteze određenog produkta njegovi sastavni djelovi moraju biti uneseni u organizam. Ovaj proces sinteze vrši se pomoću enzima – bioloških katalizatora. Sinteza na osnovu modela uključuje povezivanje aminokiselina u molekule proteina pomoću iRNK koja se transkribuje sa DNK. iRNK u ovom slučaju predstavlja model. Pored toga ovaj proces uključuje i 54

prethodna dva jer da bi došlo do povezivalja aminokiselina potrebn o je te aminokiseline unijeti u

organizam, a ovaj proces reguliše veliki broj enzima i zato možemo reći da on predstavlja sintezu uz pomoć enzima. Autoreplikacija podrazumjeva sposobnost molekula DNK da samu sebe replikuje. Ovaj proces objedinjuje i prethodna tri procesa jer da bi došlo do replikacije DNK prvo mora doći do akumulacije

proteina, veliki broj enzima kontroliše ovaj proces, a model za novosintetisani lanac predstavlja stari lanac DNK. Postoje dva tipa reprodukcije ćelije: binarna dioba i mitoza.

Binarnom diobom dijele se prokarioti. Oni imaju jedan kružni molekul DNK koji se nalazi uz plazmalemu na mjestu koji se označava kao zona rasta, jer u tom smjeru bakterija raste. Prije početka diobe dolazi do replikacije bakterijskog hromozoma, koji se zatim podjeli. Poslije toga dolazi do podjele

citoplazme čime od jedne bakterije nastaju dvije. Reprodukcija organizma može biti polna – seksualna i bespolna – aseksualna. Aseksualan tip reprodukcije odlikuje se nastankom identičnih potomaka – klonova. Genetičke varijacije genetičkog materijala odvijaju se samo na osnovu mutacija. Ovakav tip reprodukcije nalazimo kod protozoa, kao i kod mnogih biljaka (npr. jagoda – stolone). Kod protozoa (npr. paramecijum – razmjena mikronukleusa) imamo smjenu aseksualne i seksualne faze.

Seksualni tip reprodukcije odlikuje veća raznovrsnost. U ovom tipu dolazi do razmjene genetičkog materijala – rekombinacije koja ovu reprodukciju čini složenijom, a osim toga omogućava raznovrsnost.

Rekombinacije genetičkog materijala se vrše na tri nivoa: krosing-over, razdvajanje hromozoma u anafazi mejoze i fuzija genetičkog materijala gameta, tako da se seksualnost može definisati i kao akumulacija genoma iz dvije jedinke u jednu. Drugim riječima, genetska reprodukcija omogućava ko mbinovanje nasljednog materijala dvije različite jedinke i nastanak potomka koji nije identična kopija roditelja. Pored

toga što dolazi do m iješanja genetičkog materijala roditelja, prije oplodnje u gonadama roditelja dolazi do razmjena segmenata hromozoma, a kasnije dolazi do razdvajanja hromozoma, jer gameti sadrže samo jednu garnituru hromozoma. Smatra se da su prednosti seksualnog razmnožavanja nad aseksualnim varijacije nastale rekombinacijama koje omogućavaju bolje preživljavanje u promjenljivim uslovima sredine kao i adaptacije koje omogućavaju odabir genotipova ,jer selektivnost uz mutacije predstavljaju osnov evolucije.

24. ĆELIJSKA DIOBA MITOZA I KONTROLA ĆELIJSKOG CIKLUSA Ćelijski ciklus podrazumjeva sjemnu rasta i diobe ćelije. To bi značilo da se ćelijski ciklus sastoji iz interfaze i diobe ćelije. Interfaza podrazumjeva fazu rasta koja se može podjeliti na tri podfaze: G1, S i G2 podfazu. U G1 fazi dolazi do intezivne sinteze proteina što znači da se neprestano odvija transkripcija i translacija. U ovoj fazi se sintetišu proteini potrebni za diobu (po nekim autorima). U S fazi dolazi do replikacije DNK lanca, kao i do sinteze histona i nehistonskih proteina. U G2 fazi dolazi do sinteze

55

proteina koji su potrebni za diobu ćelije. U ovoj fazi DNK počinje da se gusto spiralizuje što sve više smanjuje mogućost sinteze proteina. Trajanje ćelijskog ciklusa je varijabilno. Sve faze ćelijskog ciklusa su pod kontrolom intraćelijskih i ekstraćelijskih faktora. Intraćelijski faktori potraumjevaju postojanje kontolnih tački i kontolnih signala koji ubrzavaju ili usporavaju, iniciraju ili zaustavljaju ćelijsku diobu. Tako razlikujemo tri kontolne tačke pri čemu se dvije nalaze u interfazi – na granici između G1 i S faze i G2 faze i mitoze, dok se treća nalazi u samoj diobi – mitozi. Broj i vrsta ćelijskih dioba zavisi od tipa ćelije, dok se neke ćelije nikada ne djele. Za vrijeme G1 faze određene ćelije ulaze u G0 fazu. U G0 fazu ćeliju dovode sledeći faktori: 

krajnja diferencijacija ćelije. Ćelija se nalazi u tkivu i obavlja sve svoje funkcije koje u stvari predstavljaju funkciju tkiva, npr. ćelije epitela alveole...



potrošen kapacitet diobe – karakterističan za stare (senescentne) ćelije, koje ubrzo nakon toga umiru apaptozom.

 

ćelija nema hranljivih materija, temperatura je neodgovarajuća ili pH vrijednost. U ovom slučaju G0 faza predstavlja fazu mirovanja. pod uticajem određenih regulacionih fak tora (hormona), npr. primarna oocita je blokirana do puberteta.

Postoje čak i ćelije koje se nikada ne djele – nervne ćelije. Čitav svoj životni ciklus provode u G0 fazi.

KONTROLA ĆELIJSKOG CIKLUSA Ćelijski ciklus predstavlja složen proces koji dovodi do duplikacije DNK kao i drugih ćelijskih struktura prije ulaska ćelije u diobu. Ovaj proces zahtejva sintezu velikog broja molekula koji imaju enzimsku funkciju. Osim toga ćelija sintetiše i proteine koji imaju funkciju u regulaciji diobe. Ovi molekuli po potrebi stimulišu diobu ili je pak koče ako dođe do određenih grešaka. Razlikujemo tri grupe molekula sa ovom regulatornom funkciom: ciklini, ciklin-zavisne kinaze (engl. cyclin-dependent kinase – CDK) i inhibitore CDK.

Ciklini su proteinski molekuli koji imaju funkciju da se vezuju za CDK i na taj način ih aktiviraju. Postoji više različitih vrsta ciklina i njihova koncentracija se mijenja u zavisnosti od perioda ćelijskog ciklusa po čemu su dobili i naziv. Oni se specifično vezuju za CDK pa aktiviraju tačno određenu CDK. CDK su molekuli koji imaju funkciju da dodaju fosfatnu grupu na molekul supstrata. Svaka CDK je

bilobarne građe i u njenoj sredini se nalazi jedan usjek. U ovom usjeku vezuje se molekul su pstrata. Kod neaktivnih CDK u usjeku se nalazi vezana T-petlja, dok se alfa heliks za koji se vezuje ATP, koji ima funkciju u fosforilizaciji supstrata, nalazi udaljen od usjeka.

Aktivacija CDK podrazumjeva vezivanje ciklina za ovaj protein čime dolazi do promjene njegove konformacije. Promjena konformacije podrazumjeva pomjeranje T-petlje sa mjesta usjeka, dok alfa 56

heliks koji služi za vezivanje ATP -a dolazi na mjesto usjeka. Osim ovog procesa, da bi došlo do aktivacije CDK molekula, potrebno je izvršiti njegovu fosforilizaciju jer se fosforilizaciom povećava njegova enzimska vrijednost.

Inaktivacija CDK se može vršiti na dva načina. Jedan od načina je fo sforilizacija aminokiselina koje se nalaze u aktivnom centru enzima, dok drugi način podrazum ijeva vezivanje inhibitornih proteina za CDK ili CDK-ciklin kompleks čime dolazi do promjene njihove konformacije. G1 faza ciklusa

faza najdužu fazu ćelijskog ciklusa. U ovoj donosi dailili će uđeod u diobu G1 ili će da predstavlja se diferencira i specijalizuje i da pređe u G0 fazu.fazi Daćelija li će se ćelijaodluku podjeliti ne da zavisi mnogih faktora spoljašnje sredine: faktora rasta (mitogena), njenog odnosa sa drugim ćelijama ili interakcije sa vanćelijskim matriksom. Ćelije sadrže određeni tip receptora koji reaguje na faktore rasta. Upravo od količine faktora rasta koji djeluju na ćeliju kao i dužine njihovog djelovanja zavisi da li će se ćelija podjeliti ili ne. Duže djelovanje faktora rasta na ćeliju pri kraju G1 faze dovodi do ulaska ćelije u restrikcionu tačku kada ona zaključava receptore za faktore rasta i ulazi u proces diobe. Kasniji proces diobe zavisiće samo od intraćelijskih proteina. Ako pak prije restrikcione tačke prestane dejstvo mitogena ćelija se neće podjeliti. Receptori za faktore rasta prenose signal do kinaza koje se nalaze u citoplazmi, a zatim kinaze vrše fosforilizaciju citolazmatskih proteina koji zatim prenose signal do jedra. U jedru se odgovor na ćelijske signale odvija u dva stupnja. Prvo dolazi do ekspresije gena ranog odgovora, koji predstavljaju određene transkripcione faktore. U drugom stupnju ovi transkripcioni faktori utiču na transkripciju određenih gena koji utiču na sintezu ciklin D kompleksa. Ciklin D se specifično vezuje za CDK 4 ili CDK 6, a CDK 4 ili 6 vrši fosforilizaciju retinoblasta. Retinoblasti su proteini koji u svom hipofosforilisanom obliku vezuju

transkripcione faktore neophodne za nastavak ćelijske diobe sa jedne strane ili se vezuju za histonsku deacetilazu pri čemu je aktiviraju. Aktivacija histon ske deacetilaze dovodi do deacetilizacije histona i na taj način sprječavanja ekspresije gena. To bi značilo da fosforilizaciom retinoblastoma dolazi do oslobađanja transkripcionih faktora koji imaju funkciju u nastavku ćelijske diobe , kao i do deaktivacije histonske deacetilaze. Oslobođeni transkripcioni faktori dovode do ekspresije gena za dihidroflorat reduktazu i timidin kinazu koje imaju funkciju u sintezi DNK, kao i za ciklina E i ciklina A. Ciklin E se veže za CDK 2 i na taj način dovodi do krajnje fosforilizacije retinoblastoma , koji zatim omogućava ćeliji da uđe u S fazu. S faza

U taku S faze dolazi do potrošnje ciklina E, dok je ciklin A glavni ciklin koji ima funkciju da provede ćeliju kroz S podfazu ciklusa. Ciklin A se na početku vezuje za CDK 2, a zatim se pri kraju ove faze vezuje za CDK 1 što predstavlja kraj S faze i ulazak u G2 fazu. G2 faza

57

Na prelazu iz G2 f aze ćelijskog ciklusa u mitozu dolazi do sinteze ciklina B koji se vezuje za CDK 2. Da bi se ciklin B vezao za ovu kinazu mora da se prethodno aktivira ova kinaza. Njenu aktivaciju vrši Cdc25 (enzim). Međutim, ako DNK nije do kraja replicirana ili ako postoji određena greška u njenoj

repelikaciji neće doći do ćelijske diobe. U slučaju prethodno navedenih grešaka dolahzi do aktivacije CHK (engl. checkpoint kinase) kinaze koja vrši fosforilizaciju Cdc25 i na taj način spričava njegovu replikaciju. Mitoza

Kontrolu ćelijskog ciklusa u mitozi omogućavaju ciklini D koji se vezuju za CDK 1. Međutim, CDK 1 je prije mitoze fosforilisana i neaktivna, a njenu fosforilaciju vrši Wee1 protein. CDK1 kinaza ima sposobnost da aktivira Cdc25, enzim koji ima funkciju u defosforilizaciji CDK1, a osim toga njenom aktivacijom dolazi do inhibicije Wee1 proteina, što znači da ovd je imamo tipičan primjer pozitivne povratne sprege. Jedna od osnovnih funkcija CDK1-ciklin D kompleksa jeste da razlaže lamine i na taj

način dovede do resorpcije nukleusne membrane. Osim toga utiče na organizovanje diobenog vretena, defosforilizaciju DNK...

Značajna kontrolna tačka ćelijskog ciklusa je metafazna tačka. U ovoj tački dolazi do spriječavanja ćelijske diobe ako neki od hromozoma svojom kinetohorom nije povezan za niti diobenog vretena. Ovo daje negativan signal što dovodi do aktivacije Mad2 proteina koji se potom vezuje za Cdc20 protein koji je neophodan za otpočinjanje anafaze. Osim ove kontrolne tačke postoji još i anafazna kontrolna tačka u kojoj se Cdc 20 protein vezuje za APC (anafazni kompleks proteina) koji zatim inhibira sekjuring protein. Sekjuring protein je inače

normalno vezan za separazu i inaktivira je. Međ utim formiranjem APC-sekjuring kompleksa dolazi do aktivacije separaze koja zatim cijepa centromerni kompleks proteina i dovodi do razdvajanja hromatida. Na kraju mitoze svi proteini koji su se fosforizovali moraju biti defosforilizovani ili obrnuto.

Najčešće prvo dolazi do defosforilizacije CDK1 -ciklin M kompleksa, što zatim dovodi do spriječavanja dalje fosforilizacije proteina. Osim toga dolazi do dekondezovanja genetičkog materijala, obrazovanja nukleusne membrane... APOPTOZA I NEKROZA

Apoptoza po drazumjeva programiranu ćelijsku smrt. Danas je poznato da određene grupe gena podstiču ili spriječavaju ovaj proces. U zavisnosti od toga kako utiču na apoptozu gene možemo podjeliti na proapoptotičke gene i antiapoptotičke gene. Proapoptotički geni podstiču apoptozu i od njih je najznačajniji Bcl kompleks gena. Antiapoptotički geni spriječavaju razvoj apoptoze. Od njih je najznačajniji p53 gen. U zavisnosti od sabirnog efekta ovih gena zavisi i to da li će doći do apoptoze ili ne. Takođe, apoptozu izaziva i greška u nasljednom materijalu koja budi aktivnost ovih gena. Međutim, kada ćelija započne apoptozu, ona je može prekinuti u slučaju da dođe do ispravke ove greške.

Jedan od bitnih faktora apoptoze jeste smanjena količina ATP -a u ćeliji. U slučaju da se količina ATP-a smanji ispod 30% dolazi do nekroze. Ćelija na jači stres reaguje nekrozom, a na slabiji apoptozom.

58

Oštećenje DNK molekula dovodi do aktivacije Bcl gena koji zatim izazivaju istiskivanje citohroma C iz mitohondrije. Citohrom C iz mitohondrija pokreće mehanizam kaskadne reakcije kaspaza. Kaspaze

dovode do fragmentacije jedra i vakuolizacije citoplazme. Na kraju ćelija biva fagocitovana od strane makrofaga.

P53 protein se aktivira kada dođe do greške u molekulu DNK. On se zatim vezuje za akc eptorsko mjesto na p21 gen koji predstavlja proapoptotički gen. Produkt p21 se vezuje za CDK i na taj način ih

inaktivira. Njega specifično cijepa određeni tip kaspaze, što dovodi do oslobađanja CDK i početka procesa apoptoze. Pored toga, p21 se može veziv ati i za proliferativni nuklearni antigen i formirati kompleks koji ima funkciju u reparaciji DNK. Na ovaj način se započeta apoptoza može prekinuti i ćelija nastaviti diobu.

Nekroza ćelije podrazumjeva pucanje plazmaleme ćelije koja dovodi do oslobađanja sadržaja citoplazme u međućelijski matriks. S obzirom na to da se u citoplazmi nalazi velika količina citokina ovaj proces dovodi do razvoja inflamacije i to predstavlja osnovnu razliku između apoptoze i nekroze. MITOZA

Mitotičkom diobom od majke ćelije dobijaju se dvije identične ćerke ćelije. I majka ćelija , kao i ćerke ćelije imaju diploidan broj hromozoma. Mitotički (proliferativniI) procesi su: brazdanje (jajne ćelije), rast (organizma), regeneracija (tkiva) i zarastanje (rana). Mitoza obuhvata kariokinezu i citokinezu. Kariokineza obuhvata: profazu, prometafazu,

metafazu, anafazu i telofazu, dok se citokineza dešava na kraju telofaze. Profaza predstavlja prvu fazu ćelijske diobe u kojoj hromozomi postaju vidljivi. Hromozomi se sastoje od dvije hromatide međusobno povezane centrozomom. Kako odmiče profaza tako se DNK sve

više spiralizuje. Centromere se kreću ka jednom od polova. Prometafaza podrazumjeva fazu ćelijskog ciklusa u kojoj dolazi do dezintegracije nukleusne membrane i nukleolusa. DNK materijal je više spiralizovan u odnosu na profazu.

Metafaza podrazumjeva fazu ćelijskog ciklusa u kojoj dolazi do sinteze diobenog vretena. Diobeno vreteno nastaje rastom mikrotubula centriola. Na diobenom vetenu razlikjemo: asteralne, hromozomske i kontinualne niti. Asteralne niti se slobodno završavaju u citoplazmi. Kontinualne niti povezuju

centrozome sa suprotnim polom ćelije. Hromozomske niti povrzuju centrozome i hromozome. Hromozomi se vezuju za niti diobenog vretena svojim djelovima označenim kao kineto hori. U metafazi hromozomi se nalaze u ekvatorijalnoj ravni normlno u odnosu na niti vretena.

Anafaza dovodi do uzdužne podjele svakog hromozoma, a zatim se , kontrakcijom diobenog vretena, hromatide kreću ka jednom od polova ćelije. Iz istog hromozoma hromatide idu na suprotne

polove ćelija. Telofaza podrazumjevadva obrazovanje nukleusne membrane, nukleolusa kao i despiralizaciju

genetičkog materijala. Osim toga u ovoj fazi dolazi i do citokineze – podjele citoplazme. Kod životinja i 59

čovjeka do podjele citoplazme dolazi formiranjem usjeka između dvije ćelije koji se sve više produbljuje dok se ćelije potpuno ne podjele.

25. ĆELIJSKA DIOBA MEJOZA, GAMETOGENEZA Gametogeneza podrazumijeva proces nastanka polnih ćelija ili gameta. Ovaj proces se sastoji iz tri faze: faze razmnožavanja (diobe), faze rasta i faze sazrijevanja.

Faza razmnožavanja podrazumjeva mitotičku diobu germinativnih ćelija polnih žlijezda (jajnika ili testisa) i nastanak gonija. Kod muškarca su to spermatogonije, a kod žene oogonije. Gonije su slične u oba pola, imaju veliko jedro i diploidan broj hromozoma.

Faza rasta podrazumjeva rast gonija pri čemu dolazi i do duplikacijije njenog genetičkog materijala. Kod oogonija ova faza je nešto složenija u odnosu na spermatogonije. Sastoji se iz previteogeneze i vitelogeneze. U previtelogenezi dolazi do duplikacije genetičkog materijala i prekursora vitelusa. U vitelinskoj fazi dolazi do nakpljanja hranljivih materija bogatih energiom i formiranja vitelusa. U ovoj fazi oogonije se diferenciraju u primarne oocite, a spermatogonije u primarne spermatocite.

Faza sazrijevanja podrazumjeva ulazak primarnih spermatocita(oocita) u mejotičku diobu, pri čemu nakon prve mejotičke diobe nastaju sekundarne spermatocite sa haploidim brojem hromozoma, a zatim spermatide.

Mejoza se odvija u dvije faze koje se označavaju kao prva mejotička (redukciona) dioba i druga mejotička (ekvaciona) dioba. PRVA MEJOTIČKA DIOBA Profaza predstavlja najsloženiju fazu mitoze, pa je z bog toga podjeljena u 5 podfaza: leptoten, zigoten, pahiten, diploten i dijakinezis. U leptotenu dolazi do spiralizacije DNK i hromozomi se pod mikroskopom jasno vide u vidu

končića. Na hromozomima se primjećuju određeni gusto spiralizovani segmenti, odnosno hromomere. U zigotenu dolazi do međusobnog primicanja homologih hromozoma i njihovog spajanja. Spajanje hromozoma se odvija u početku na krajevima hromozoma, a kasnije dolazi do potpunog primicanja jednog hromozoma uz drugi i obrazovanja bivalenata. Postoji mišljenje da se između homologih hromozoma u bivalentu nalazi atraktivna snaga koja se bazira na proteinskim molekulima, koji sa

hromozomima obrazuju sinaptički kompleks. Zbog sinapsiranja hromozoma u zigotenu stiče se utisak da je broj hromozoma u ćeliji duplo manji što se naziva lažna redukcija. U pahitenu dolazi do dodatne spiralizacije molekula DNK. Upravo iz tog razloga u ovoj fazi jasno

vidimo da je svaki bivalent izgrađen od dva hromozoma ili 4 hromatide, pa hromozome u ovoj fazi nazivamo tetrade. Po nekim udžbenicima u ovoj fazi počinje i krosing over.

60

Diploten predstavlja podfazu profaze u kojoj dolazi do razdvajanja hromozoma. Međutim,

razdvajanje hromozoma nije potpuno, već oni ostaju povezani na hijazmama. Hijazme predstvljaju

mjesto na kome se vrši krosing over – razmjena segmenata homologih hromozoma. Krosing over se može vršiti između dvije unutrašnje hromatide, unutrašnje i spoljašnje ili pak dvije spoljašnje hromatide. Dijakinezis dovodi do još veće spiralizacije genetičkog materijala, čime se hijazme pomjeraju

terminalno. U diplotenu hromozomi se nalaze periferno pa dolazi do dezintegracije nukleolusa, dok

nukleusna membrana počinje da se dezintegriše. Metafaza se odlikuje potpunom dezintegracijom nukleusne membrane. Dolazi do obrazovanja diobenog vretena. Za niti diobenog vretena pričvršćuju se tetrade i postavljaju se u ekvatorijalnu ravan.

Anafaza se odlikuje razdvajanjem homologih hromozoma, pri čemu se jedan od homologih hromozoma kreće ka jednom od polova ćelije. Telofaza je malo atipična u odnosu na mitozu. U telofazi dolazi do reorganizacije nukleusne membrane, dok se citoplazma ne djeli potpuno već se zadržava mali segment citoplazme pomoću koga

komuniciraju ove ćelije. Nakon telofaze nastaju sekundarne spermatocite ili oocite sa haploidnim brojem hromozoma.

Međutim, svaki od ovih hromozoma se sastoji od dvije hromatide. Nakon telofaze prve mejotičke diobe dolazi do kratke interfaze u kojoj ne dolazi do replikacije genetičkog materijala. Međutim dolazi do sinteze RNK, kao i proteina potrebnih za drugu mejotičku diobu.

DRUGA MEJOTIČKA DIOBA Druga mejotička dioba je slična mitozi. Profaza traje kratko i odmah nastupa metafaza u kojoj dolazi do dezintegracije nukleusne membrane, kao i do obrazovanja diobenog vretena, pri čemu se hromozomi postavljaju u ekvatorijalnu ravan. U anafazi dolazi do uzdužene podjele svakog hromozoma i kretanja hromatida ka polovima ćelija. U telofazi nastaju 4 ćelije sa haploidnim brojem hromozoma.

SPERMATOGENEZA

Spermatogneneza predstavlja proces nastanka muških polnih ćelija ili spermatozoida. Proces spermatogeneze počinje u periodu puberteta kada se mitozom germinativnih ćelija testisa formiraju spermatogonije. Spermatogonije rastu, repliciraju svoj genetički materijal i diferenciraju se u primarne spermatocite. Primarne spermatocite ulaze u mejotičku diobu i poslije prve mejotičke diobe od njih nastaju sekundarne spermatocite sa haploidnim brojem hromozoma. Od sekundarnih spermatocita

drugom mejotičkom diobom nastaju 4 spermatide. Proces diferencijacije spermatida u spermatozoide naziva se spermiogeneza. Spezmiogeneza podrazumjeva gubitak vode iz nukleusa i formiranje gustog i

tamnog nukleusa. Od Goldžijevog aparat a formira se akrozom koji zajedno sa jedrom čini glavu 61

spermatozoida. Na suprotnoj strani spermatozoida od centriole se rastom formira rep spermatozoida. Oko centriola nalaze se nakupine mitohondrija koje imaju funkciju u proizvodnji energije za kretanje spermatozoida. Dolazi do fagocitoze citoplazme od strane Sa rtolijevih ćelija, a samo tanak sloj citolazme

zadržava se u predjelu ispred akrozoma, oko jedra i u predjelu vrata spe rmatozoida. Germinativne ćelije testisa nalaze se u izvijuganim sjemenim kanalićima. Osim njih u izvijuganim sjemenim kanalićima nalaze se još i Sartolijeve ćelije. Sartolijeve ćelije su velike piramidalne ćelije koje imaju potpornu funkciju, funkciju u ishrani, u obrazovanju krvnotestisne barijere, kao i u lučenju muškog polnog hormona – testosterona. Idući prema lumenu razlikujemo stadi jume razvoja spermatozoida, pa tako razlikujemo redom spermatogonije, primarne spermatocite, sekundarne spermatocte, spermatide i

spermatozoide. Sve ove ćelije sm ještene su uz membranu Sertolijevih ćelija.

OOGENEZA

Oogeneza počinje u embrionalnom periodu kada se germinativne ćelije korteksa jajnika dijele mitozom i formiraju oogonije. Oogonije se zatim diferenciraju u primarne oocite sa diploidnim brojem

hromozoma koje su okružene jednim slojem folikularnih ćelija. Primarne oocite ulaze u prvu mejotičku diobu i zaustavljaju se u diplotenu. Dolazi do despiralizacije genetičkog materijala i ovaj stadijum naziva se stadijum diktiotena. Primarne oocite miruju sve do puberteta kada se početkom menstrualnog ciklusa nastavlja njihova dioba. Primarne oocite zatim nastavljaju prvu mejotičku diobu. Od primarne oocite poslije prve mejotičke diobe nastaje sekundarna oocita i primarna pol ocita. Sekundarna oocita se zatim u slučaju oplodnje dijeli i nastaje ootida i sekundarna polocita. Na kraju se primarna polocita podjeli i nastaju 2 sekundarne polocite. Krajnji ishod jedna ootida i 3 sekunarne polocite. Bitno je napomenuti da je spermatogeneza kontinuiran proces koji se odvija od puberteta i kasnije

tokom čitavog života, dok je oogeneza diskontinuiran proces koji se počinje u embrionalnom periodu, nastavlja se u pubertetu i traje do klimakterijuma (45. godina života). FOLIKULOGENEZA Oko primarne oocite koja je nastala diferencijaciom i rastom oogonije formira se još u embrionalnom periodu jedan sloj folikularnih ćelija što zajedno čini primarni folikul. S obzirom na to da se dioba zaustavlja u diplotenu, folikuli će ostati na ovom stadiju mu razvoja sve do puberteta. U pubertetu se nastavlja razvoj folikula i nastanak sekundarnog. Diobom folikularnih ćelija formira se granulozni sloj (stratum granulosum). Plazmalema oocite zadebljava i naziva se oolema. Oko oocite

formira se jedan prozračan membranozni sloj koji formiraju folikularne ćelija i sama oocita koji se naziva zona pelucida. Uz samu zonu pelucidu formira se corona radiata koja se sastoji od ćelija koje svojim produžecima dospjevaju do membrane oocite i učestvuju u njenoj ishrani. Iz nad stratuma granulosuma je vezivni omotač (theca foliculi) koji se sastoji od unutrašnjeg membranoznog sloja i okolnog fibroznog sloja i velike količine krvnih sudova. Daljim rastom između stratuma granulosuma i corone radiate formira se antrum koji je is punjen folikularnom tečnošću. Sama oocita nalazi se ekcentrično u jednom

62

izvratu folikularnih ćelija (cumulus ophorus). Folikul sa antrumom i folikularnom tečnošću naziva se De Grafov ili tercijarni folikul. Prskanjem De Grafovog folikula dolazi do ovulacije. Ovo se dešava pri kraju prve mejotičke diobe oocite.

Prskanjem folikula sekundarna oocita okružena coronom radijatom i zonom pelucidom, zajedno sa primarnom polocitom ulazi u tubu uterinu. Sekundarna oocita nastavlja diobu i dolazi do metafaze druge

mejotičke diobe. Ako dođe do oplodnje ona će nastaviti drugu mejotičku diobu i od nje će nastati ootida i sekundarna polocita.

26. GENSKE REKOMBINACIJE

Transformacija podrazumjeva proces unosa DNK iz spoljašnje sredine u ćeliju , a da pri tome ne dolazi do ćelijskog kontakta. Karakteristična je za bakterije, cijanobakterije i neke vrste gljiva. Strana DNK može poticati iz istog organizma, ali isto tako može poticati i iz različitih organizama.

Jedan od najznačajnih eksperimenata za dokaz ovog procesa izveo je Grifit na patogenom i nepatogenom soju S. pneumoniae. One se inače nalaze u normalnoj flori ždrijela čovjeka, ali mogu izazvati upalu pluća. Kod miševa ove bakterije izazivaju smrtonosnu upalu pluća. Patogeni soj ovih bakterija posjeduje S-gen koji ima ulogu u proizvodnji kapsule otpornu na imuni sistem

miševa, dok R-gen prestavlja mutirani S gen koji ne dovodi do sinteze kapsule. Grifit je u organizam miševa ubrizgao R-bakterije, zajedno sa prokuvanim S bakterijama, koje nisu mogle da izazovu infekciju. Međutim, on je primjetio da su miševi uginuli za 24 h. Kasnije je dokazano da su fragmenti gena iz prokuvanih patogenih bakterija ušle u ćeliju zdravih bakterija. Njihovim ulaskom enzimi transferaze u organizmu zdravih bakterija su isjekle fragment DNK sa jednog njegovog lanca, a energija koja se oslobodila prilikom isjecanja upotrebljena je za ubacivanje stranog fragmenta u homologi segment recipijenta. Tako da u predjelu DNK gdje se nalazio R-gen imamo jedan lanac R-gena i jedan lanac S-gena koji nisu međusobno potpuno komplemenarni pa njihovi nukleotidi obrazuju heterodupleks. Replikacijom bakterije, međutim, pomoću reper mehanizama ova promjena u lancu

može biti ispravljena u korist S-gena ili R-gena. Ovo je prilično značajan proces za rezistenciju bakterija na antibiotike. Pored toga, ovaj proces je imao značaj i u mapiranju gena. S obzirom na to da svaki strani segment sadrži bar 2 gena, oni se na hromozomu moraju naći jedan pored dru gog. Ovakav segment, prema tome vrši tranformaciju dva gena, a prema fenotipskim karakteristikama može se utvrditi koji su to geni.

Konjugacija predstavlja prenos genetičkog materijala između organizama pri čemu dolazi do kontakta između dvije ćelije. Ona je prvi put primjećena kpod E.coli. Luderberg i Tatum su u ćelijama E.coli izazvali po tri mutacije i ubacili ih zajedno u isti supstrat. Oni su očekivali da sve ćelije uginu jer ne mogu preživljeti taj broj mutacija. Međutim, ćelije su počele da se dijele. Oni su kasnije uvidjeli da postoji određeni broj bakterija u supstratu kod kojih su bili sve divlji geni. Došli su do zaključka da je

došlo do rekombinacija genetičkog materijala među bakterijama. Takođe su utvrdili da je prenos genetičkog materijala jednosmjeran tako da je jedna ćelija dav alac – donor genetičkog materijala, a druga primalac – recipijent genetičkog materijala. U prilog ovom zaključku ide istraživanje kod kog je 63

izazvana mutacija kod svih recipijenata, pri čemu je zbog prijema genetičkog materiala od donora došlo do preživljavanja bakterija. Za razliku od prethodnog, kada je u svim ćelijama donora izazvana mutacija, kolonija nije rasla.

Kasnije je utvrđeno postojanje plazmida ili F-faktora koji predstavlja jednu jedinicu replikacije – replikon. DNK plazmida nosi informaciju za sintezu proteina koji imaju funkciju u obrazovanju

citoplazmatičnog mostića između ćelija između kojih se vrši razmjena genetičkog materijala. Za ovu DNK se danas zna da ima samo jedan operator tj. da transkripciom daje policistronsku RNK. Proces prenošenja genetičkog materijala se odvija tako što se približi bakterija donor (F+) i bakterija recipijent (F-) pri čemu se između ovih bakterija formira citoplazmatični mostić. Kasnije dolazi do prelaza jedne niti DNK plazmida F+ faktora u F- faktor. Pri prelasku ovoj niti se dodaju komplementarni

nukleotidi tako da se ulaskom u recipijenta formira cjelokupna dvolančana DNK plazmida. Takođe i u F+ faktoru proces replikacije se završava. Bakterija F - kada primi plazmid postaje F+ i može prenositi genetički materijal. Kasnije je otkriveno da DNK plazmida nekada može biti ugrađena u hromozom bakterija. Ove ćelije imaju veliku sposobnost rekombinacije i nazivaju se Hfr-ćelije (engl. high-frequency recombination). Pri prelazu ove DNK u recipijent uvijek će osim dijela DNK koji odgovara plazmidu preći i jedan dio DNK koji se nalazi poslije njega. Na taj način F - faktor i nakon završene konjugacije ostaje F -. DNK koja je ušla u recipijenta sadrži određen DNK koja se nalazi u recipijentu pa je zbog toga recipijent diploidan za odgovarajuće gene što je za organizam bakterije nestabilno stanje. To dovodi do krosing overa između homologih sekvenci F faktora i hromozoma, odnosno do rekombinacija. Povratnim krosing overom može doći do izdvajanja F + faktor iz bakterijskog hromozoma pri čemu od Hfr-ćelije nastaje F+. Međutim, nekada ne dođe do pravilnog izdvajanja tih sekvenci što uzrokuje da F + faktor prenese i gene glavnog hromozoma, što se označava kao F’ faktor. Isto se dešava kao i u prethodnom slučaju – krosing over.

Transdukcija podrazumjeva proces prenosa DNK materijala putem prenosioca – vektora. Vektori

su najčešće virusi. Razlikujemo dva tipa transdukcije – opštu i specijalizovanu. Pri opštoj transdukciji fragmenti DNK domaćina ugrađuju se u kapsid virusa i pri infekciji određene ćelije virusom prenose i genetički materijal u organizam domaćina koji se zatim rakombinuje sa domaćinskom DNK. Ovi virusi se ne ugrađuju u genetički materijal domaćina već se nalaze u ćeliji i vrše litički ciklus. Ovaj fragment DNK mora imati određenu veličinu tako da može stati u kapsid virusa. Ako je fragment predugačak njegovo isijecanje vrši endonukleaza. Endonukleaze su inače i enzimi koji vrše is ijecanje palindromskih sekvenci DNK (segment nukleinske kiseline na dvostrukom lancu DNK ili RNK u kojima se

očitavanje nukleotida od 5' ka 3' na jednom lancu poklapa o čitavanju od 5' ka 3’ na komplementarnom lancu), tako da one ovaj segment mogu isjeći i direktno iz DNK lanca. Pri specijalizovanoj transdukciji virusi se integrišu sa genetičkim materijalom domaćima, ali se pri njihovom odvajanju vrši i odvajanje djela genetičkog materijala domaćina. Ulaskom u drugog domaćina virus unosi gene prethodnog domaćina pa se na taj način i geni domaćina rekombinuju. Nekada 64

otkidanjem virusa dođe do otkidanja prevelikog segmenta koji ne može da uđe u kapsid. Da bi ovaj segment ušao u kapsid endonukleaze isjecaju najčešće virusne gene.

Krosing over predstavlja jedan od vidova rekombinacije. Odvija se u mejotičkoj diobi eukariota i to sa početkom u pahitenu dok se završava u diplotenu. Da bi otpočeo ovaj proce s prvo treba da dođe do sparivanja homologih hromozoma u zigotenu, a zatim se formira sinaptonemalni kompleks koji se sastoji od dva lateralna zbijena elementa i jedanog centralnog tankog elementa koji su međusobno

povezani poprečnim elementima. Svi ovi elementi su proteinske prirode. Sinaptonemalni kompleks predstavlja mjesto na kome se odvija krosing over. Početkom krosing overa prvo endonukleaze prekidaju isto orijentisane homologe lance na nesestrinskim hromatidama, a zatim se oni spajaju sa prekinutim preostalim dijelom na nesestinkoj hromatidi pod uticajem ligaza čime se formira jedna forma

u obliku slova X. Zatim dolazi do njene modifikacije čime se formira oblik krsta čije krakove predstavlja dvolančana DNK , a centralni dio jednolančana DNK. Zatim može doći do prekida u dva pravca. Ako dođe do prekida u pravcu sjever-jug nesestrinske hromatide će razmjeniti genetički preostali dio lanca i krosing over će se odigrati pravilno. Međutim, ako dođe do presjecanja lanaca u pravcu istok-zapad zamijenjeni segment DNK molekula će se sastojati iz jednog lanca porijeklom od homologog hromozoma i drugog lanca koji je porijeklom od istog hromozoma. Doći će do pojave heterodupleksa. Heterodupleks će ispraviti reper mehanizmi u dva pravca: ili u pravcu mutirane DNK ili u pravcu divlje. Rekombinacije kod eukariota podrazumjevaju:

1. 2.

Krosing over Razdvajanje hromozoma u anafazi prve mejotičke diobe

3.

Spajanje gameta prilikom oplođenja

27. DETERMINACIJA I DIFERENCIJACIJA POLA Postoje tri nivoa diferencijacije pola: 1. hromozomski pol: određen konstitucijom polnih hromozoma (muški pol: XY; ženski pol: XX) 2. gonadni pol: zavisi od toga koji tip gonada posjeduje jedinka (muški pol: testis; ženski pol: ovarijumi) 3. fenotipski pol: određen je prisustvom određenih polnih odvoda, spoljašnjih polnih organa i

drugih odlika pola, kao što su: karakterističan raspored maljavosti i masnog tkiva, razvoj mlječnih žlijezda, specifična boja glasa itd. Ukoliko je proces diferencijacije pola normalan, ove tri kategorije pola su međusobno uskljađene i proističu jedna iz druge. Tako će u muško m polu hromozomska konstitucija XY usloviti raziće testisa, a njihova aktivnost dalje će dovesti do fenotipskih odlika muškog pola. S obzirom na to da u ostvarivanju funkcija vezanih za pol centralno mjesto imaju gonade (predstavljaju

mjesto proizvodnje specifičnih gameta, luče hormone i druge faktore od kojih zavisi formiranje fenotipskih odlika pola), one se smatraju primarnim polnim odlikama. Sve fenotipske odlike pola, uključujući i polne odvode i spoljašnje polne organe, pripadaju sekundarnim polnim odlikama.

POLNI HROMOZOMI ČOVJEKA 65

U gametogenezi, tj. u prvoj mejotičkoj diobi, dolazi do razdvajanja polnih hromozoma, tako da gameti posjeduju samo po jedan polni hromozom. Jajne ćelije se ne razlikuju po sastavu polnih hromozoma, jer mogu da nose samo X hromozom, pa kažemo da je ženski pol homogametan. U muškom polu 50% spermatozoida posjeduje X, a 50% Y hromozom, pa je muški pol označen kao he terogametan. Tako će hromozomski pol zametka zavisiti zapravo od muškog gameta. Polni X i Y hromozomi se razlikuju. X hromozom je submetacentričan, srednje veličine, sličan hromozomima C grupe. Y je akrocentričan, mali hromozom najsličniji autozomima iz G grupe. Na citogenetičkom nivou : 

Y hromozom posjeduje veliki heterohromatinski blok u distalnom dijelu dugog kraka, koji varira

u veličini i kod zdravih muškaraca, a često je deletiran kod osoba sa smanjenom plodnošću. Ima oko 90 Mb i u cjelini je siromaš an genima. 30-40% Y hromozoma čini neaktivni heterohromatin. Na kratkom kraku nalazi se SRY (engl. sex region on Y cromosome) , koji je ključan za diferencijaciju testisa. Na dugom kraku se nalazi grupisano nekoliko regiona koji



kontrolišu spermatogenezu. X hromozom: na njemu se nalaze geni koji određuju različita tjelesna svojstva. Dok az za ovo je postojanje značajnog broja bolesti koje se nasljeđuju vezano za X hromozom (npr. Dišenova mišićna distrofija, hemofilija A i B, daltonizam...). Ima veličinu od ok o 165 Mb i posjeduje oko 170 gena. Na kratkom kraku (Xp ) smješten je gen koji kontroliše funkciju pola: DAX1 (ili DSS). Na Xq samješten je gen koji kodira sintezu receptora za testosteron (njihovom mutacijom nastaju teški poremećaji u diferencijaciji pola) . Neposredno ispod centromere, u regionu Xq13, nalazi se centar inaktivacije X hromozoma, koji upravlja procesom formiranjem Barovog tijela (Barovo tijelo: tamno, heterohromatinski tjelašce smješteno u jedru). Inaktivacija X hromozoma: Do ovog dolazi da bi se uravnotežio nesklad u količini genetičkog materijala u muškom I ženskom polu. Ovo je nazvano „doza kompenzacije“. Stvar je slučaja koji

će od dva X hromozoma biti aktivan u određenoj ćeliji. Na inaktivnom X hromozomu ipak ostaju regioni koji su stalno aktivni (Dokaz: razlika u fenotipu žene sa jednim X hromozomom i normalne žene).

Inaktivacija se prvi put javlja na stadijumu blastociste i taj obrazac inaktivacije prenosi se na sve

ćelije koje nastaju u daljim diobama. I pored više nego jasnih razlika, X i Y hromozomi čovjeka ipak imaju međusobno homolge regione. To su mali segmenti na samom kraju p i q kraka oba hromozoma, a označeni su kao pseudoautozomalni regioni (PAR). Naime, u terminalnom dijelu kratkih kraka X i Y hromozoma nalazi se region PAR-1. Preko ovog regiona X i Y hromozomi se obavezno sinapsiraju u mejozi I, a učestalost krosing overa je oko 50%. S obzirom da se napomenuti SRY gen nalazi u neposrednoj blizini PAR-1, nepravilnim krosing overom on može da pređe na X hromozom i uslovi poremećaje diferencijacije pola. DIFERENCIJACIJA GONADA

Gonade vode porijeklo od središnjeg klicinog lista – mezoderma, dok primordijalne germinativne ćelije nastaju van samog embriona, u endodermu žumančane kese, Začetak gonada formira se u periodu od 4. do 6. nedjelje embrionalnog života, i to na isti način kod oba pola: u blizini začetka bubrega – mezonefrosa, javlja se u epitelu celoma parni nabor, koji se naziva genitalni nabor. U ovaj region aktivnim kretanjem dospijevaju primordijalne g erminativne ćelije. Tako nastaje indiferentna gonada. Površina gonade zadebljava, dajući korteks, a unutrašnji dio formira medulu.

66

Kod muškog embriona indiferentna gonada će se diferencirati u testis, koji se formira prvenstveno iz medule. Formiraju se začeci sjemenih kanalića, a u njima se nalaze spermatogonije i Sartolijeve ćelije. U intersticijumu testisa se diferenciracju Lajdigove ćelije, koje počinju produkciju testosterona. Kod ženskog embriona indiferentna gonada se diferencira u ovarijum, i to prvenstveno na račun korteksa. Formiraju se primordijalni folikuli, u kojima se uočava centralno postavljena oogonija okružena jednim slojem ćelija. Geni koji kontrolišu diferencijaciju gonada: 1. Genetička kontrola diferencijacije testisa: Region na Y hromozomu koji ima ključnu ulogu pri diferenciranju indiferentne gonade u testis označen je kao SRY gen. Nalazi se u distalnom dijelu p kraka Y hromozoma. Njegov produkt je protein koji se označava kao TDF (engl. testis-determing factor). To je polipeptid koji ima ulogu transkipcionog faktora, i sadrži region kojim se vezuje za DNK. Vezivanje TDF -a za specifične segmente DNK dovodi do aktivacije drugih gena uključenih u diferencijaciju tes tisa. Pored toga, dokazano je i učestvovanje u kontroli aktivnosti gena koji su važni za diferencijaciju sekundarnih polnih karakteristika . SRY gen je neophodan, ali ne i dovoljan za diferencijaciju testisa, s obzirom na to da pri promjenama u genima smještenim na autozomima, u nekim slučajevima, ne dovodi do formiranja testisa. 2. Genetička kontrola diferencijacije ovarijuma: U nedostatku Y hromozoma, tj. SRY gena, indiferentna gonada sisara se diferencira u ovarijum. Za diferenciranje ovarijuma dovoljan je jedan X hromozom, ali su za njegovo normalno funkcionisanje neophodna dvije (poznato je da kod žena sa XO konstitucijom dolazi do formiranja ovarijuma, ali zbog nedostatka drugog X hromozoma brzo dolazi do gonadne disgeneze). Na kratkom kraku X hromozoma prisutan je DAX1 ili DSS gen. On je u kompeticiji sa SRY faktorom i ima važnu ulogu u razviću ovarijuma. Tokom normalne diferencijacije testisa ovaj gen je suprimiran. Autozomalni gen za diferncijaciju ovarijuma, WT1, smješten je na p kraku hromozoma 11.

DIFERENCIJACIJA POLNIH ODVODA I SPOLJAŠNJIH POLNIH ORGANA Formirane gonade, kao primarne polne karakteristike, usmjeravaju diferenciranje polnih odvoda i

spoljašnjih polnih organa.

U stadijumu indiferentne gonade u oba pola postoje dva para kanala: Wolfovi (mezonefrosni) i Milerovi (paramezonefrosni). U muškom polu, polni odvodi (epididimis i sjemevod) će se formirati iz Wolfovih kanala pod uticajem testosterona iz Lajdigovih ćelija testisa. Uporedo sa tim, u muškom embrionu dolazi do gubljenja Milerovih kanala, zahvaljujući djelovanju MIF-a (engl. Müllerian-inhibiting factor), koji je produkt Sartolijevih ćelija.

U ženskom polu nema lučenja testosterona, pa dolazi do gubljenja Wolfovih kanala. S druge strane, nema ni produkcije MIF-a, tako da Milerovi kanali opstaju i iz njih se diferenciraju polni odvodi (jajovodi, materica i dio vagine). Spoljašnji polni organi se diferenciraju iz genitalne kvržice. Muške genitalije nastaju pod djelovanjem

derivata testosterona. U ženskom polu, u nedostatku testosterona, iz genitalne kvržice se formiraju ženski spoljašnji organi.

28. HROMOZOMSKE ABERACIJE (DELECIJE I DUPLIKACIJE) Delecije spadaju u grupu strukturnih hromozomskih aberacija. Možemo ih podijeliti u dvije grupe:

67



Čiste delecije koje su posljedica prekida na hromozomu i gubitka prekinutog dijela bez centromere. Ako se na hromozomu pojavi samo jedan prekid, onda je to terminalna delecija, a ako se pak u nivou jednog kraka dogode dva prekida, pa se dio hromozoma

između tih prekida izgubi, onda je to intersticijalna delecija. 

Druga grupa delecija predstavlja kombinaciju sa duplikacijama i nastaje usljed strukturnog

preraspoređivanja kod roditelja, inverzija i translokacija. U suštini, delecije su parcijalne monozomije. Delecije autozoma su uvijek štetne. U homozigotnom stanju su letalne, jer je većina regiona hromozoma neophodna za normalan varijabilitet jedinke. Delecije u heterozigotnom stanju takođe mogu biti letalne, što zavisi od značaja izgubljenih genetičkih segmenata koji prouzrokuju različite fenotipske efekte ili funkcije gena na neoštećenom homologom hromozomu, jer se štetni recesivni geni sada mogu nesmetano izraziti u fenotipu. Ova pojava je označena kao pseudodominacija. Najčešći sindrom uslovljen ovom strukturnom promjenom je sindrom mačjeg plača koji je rezultat terminalne delecije kratkog kraka hromozoma broj 5. Naziv sindroma potiče od toga što plač novorođenčadi podsjeća na mjaukanje mačke. Osnovne fenotipske karakteristike: mikrocefalija, oči široko razmaknute, mali rast i teška mentalna retardacija. Prader-Vilijev i Angelmanov sindrom su primjer genetičkog imprintiga (različita ekspresija genetičkog

materijala u zavisnosti od toga da li se genetički materijal nasljeđuje od oca ili od majke). Oba sindroma su rezultat intersticijalne delecije hromozoma broj 15, s tim da je prisutni hromozom 15 kod nosilaca Prader-Viliijevog sindroma porijeklom od oca, dok je kod nosilaca Angelmanovog sindroma porijeklom od majke. Fenotip: gojazni, kratko tijelo, male ruke i stopala, mentalna retardacija.

Duplikacije predstavljaju višak genetičkog materijala u kariotipu. Nastaju nakon spontanih ili indukovanih hromozomskih prekida, kao rezultat nepravilnog krosing overa, translokacija... Uglavnom su stabilne i nebalansirane i njihovo prisustvo je najčešće manje štetno po fenotip od delecija. Kod heterozigota, u pahitenu mejoze I, prilikom sinapsiranja homologih hromozoma, na hromozomu sa

duplikacijom se formira petlja koja se može detektovati citogenetički. Duplikacije mogu da se nađu na različitim hromozomima ili jedna pored druge na istom hromozomu (tandem raspored). Duplikacije mogu imati i pozitivan efekat, jer se smatra da su duplikacije dovele tokom evolucije do

usložnjavanja genetičkog materijala. U genomu eukariota se sreću multiple kopije gena koje imaju identične ili slične sekvence. To su multigenske familije (npr. familija globinskih gena). Nakon duplikacije može doći do promjene u sekvenci nekih genskih kopija što ih čini nefunkcionalnima pri čemu se formira tzv. pseudogen. Moguće je da promjena sekvence nukleotida vodi i do promjene funkcije proteinskog gena.

68

29. HROMOZOMSKE ABERACIJE (INVERZIJE) Inverzije nastaju kao rezultat dva prekida na hromozomu nakon čega se dio unutar prekida rotira za 180˚. Mogu biti:  

Pericentrične – ukoliko su se prekidi odigrali na oba hromozomska kraka, pa je centromera smještena unutar segmenta koji rotira Paracentrične – ako su se prekidi desili u nivou jednog od kraka, pa je centromera izvan segmenta koji rotira

Kako pericentrične inverzije mijenjaju proporciju hromozomskih kraka, one su i jednostavnije za citogenetsko detektovanje. Osobe nosioci inverzije imaju balansirani karioptip i uglavnom su fenotipski potpuno normalne jer je

ukupan genetički materijal prisutan, ali je raspored gena je promijenjen. Međutim, ukoliko dođe do promjene ekspresije gena usljed promjene položaja gena (pozicioni efekat), do prekida gena ili duplikacija i delecija, ove promjene se onda odražavaju na fenotip. Ukoliko je inverzija homozigotna, mejoza nosioca će biti normalna pa je i rizik za formi ranje nebalansiranih gameta mali. Ako je inverzija prisutna samo na jednom od homologih hromzoma

(heterozigotna), onda u mejozi I normalan i invertovan hromozom teže sinapsiranju i formiraju inverzionu petlju kako bi homologi genski lokusi bili postavljeni jedan naspram drugog. Ukoliko ne dođe do krosing overa u okviru inverzione petlje formiraće se normalni i balansirani gameti što daje dobru prognozu za potomstvo. Naime, ovi gameti sa normalnim gametima formiraju zigote sa normalnim fenotipom. Međutim, ako dođe do krosing-overa na kraju mejoze I nastaće 2 kćerke ćelije. U jednoj će

biti prisutan hromozom sa jednom normalnom hromatidom i drugom koja će zbog rekombinacije posjedovati delecije i duplikacije. U drugoj ćeliji je hromozom koji ima jednu invertovanu hromatidu i drugu koja će kao rezultat krosing overa imati duplikacije i delecije. U toku mejoze II formiraće se 4

moguća tipa gameta: normalan, balansiran (sa invertovanom hromatidom) i dva tipa nebalansiranih gameta (sa delecijama i duplikacijama).

Kao rezultat rekombinacije u inverzionoj petlji nosioca inverzije, formiraće se dicentrični hromozom i jedan acentrični fragment koji će se u daljem toku diobe izgubiti. Dicentrični hromzozom je nestabilan i u anafazi I mejoze neminovno dolazi do prekida dijela dicentrika koji se naziva anafazni most. Tokom

telofaze I formiraće se dvije ćelije: jedna koja nosi hromozom sa jednom normalnom hromatidom i drugom koja je zbog delecije nebalansirana, i druga koja nosi hromozom sa jednom invertovanom

hromatidom i drugom koja je zbog delecije nebalansirana. Na kraju druge mejotičke diobe formiraće se 4 moguća tipa gameta: normalan, balansiran (sa invertovanom hromatidom) i dva tipa nebalansiranih gameta (sa delecijama). Oko 1% pojedinaca koji se testiraju u citogenetičkim laboratorijama ima malu pericentričnu inverziju hromozoma broj 9, i to je najveća inverzija kod čovjeka. Ova strukturna promjena se smatra normalnom pošto nijesu nađeni nikakavi štetni efekti kod nosilaca n iti postoji rizik od spontanog odbacivanja ploda ili pojave anomalija kod potomstva.

69

Pericentrična inverzija hromozoma broj 3 je jedna od malobrojnih za koju postoji dovoljno podataka koji ovu strukturnu promjenu povezuju sa eventualnim aberacijama koje se mogu javiti kod potomaka. Nosioci ove inverzije su srodnici starosjedilaca Njufaundlenda i fenotipski su normalni.

Inverzije su veoma značajna strukturna promjena hromozoma sa stanovišta evolucije pošto je njihova uloga u specijaciji čovjekolikih majmuna i čovjeka velika.

30. HROMOZOMSKE ABERACIJE (TRANSLOKACIJE) Translokacije podrazumijevaju razmjenu hromozomskih segmenata između nehomologih i homologih hromozoma. Sve translokacije dijelimo u 3 grupe: recipročne translokacije, Robertsonove translokacije i insercije.

Recipročne translokacije predstavljaju međusobnu razmjenu segemata nehomologih hromzoma. Pošto je razmjena recipročna, broj hromozoma u ćeliji ostaje nepromijenjen i osobe nosioci su uglavnom fenotipski potpuno normalne. Ovaj tip translokacija predstavlja balansirane i stabilne strukturne

aberacije. Do poremećaja balansa ipak može doći usljed pozicionog efekta ili prekida unutar gena nakon čega slijede oštećenja praćena određenim anomalijama koje nijesu svojstvene ni jednom sindromu. Ove translokacije obično uključuju 2 hromzoma i obično su bezazlene za nosioca , ali podrazumijevaju značajan rizik za formiranje aberantnih gameta, a samim tim i štetne posljedice za potomstvo. U pahitenu mejoze I, kada se hromzomi nosioca recipročne translokacije sinapsiraju, formira se pahitenski kvadrivalent. Njega grade dva translocirana i dva odgovarajuća homologa hromozoma u težnji

da homologi genski lokusi budu postavljeni jedan naspram drugog. Obično se u anafazi mejoze I ova 4 hromozoma razdvajaju po tipu 2:2 segregacije, tako da 2 hromzoma iz kvadrivalenta odlaze na jedan pol

ćelije, a 2 na drugi. Razdvajanje se može desiti na 3 načina: 

Alternativna segregacija: kada na jedan pol ćelije odlaze 2 normalna hromozoma, a na drugi 2 translocirana. Nastaće normalni i balansirani gameti;



Susjedna jedan segregacija: hromozomi sa heterologim centromerama (jedan normalan i

jedan translociran) odlaze na isti pol ćelije; 

Susjedna dva segregacija: hromozomi sa homologim centromerama (jedan normalan i jedan translociran) odlaze na isti pol ćelije. Ova dva tipa segregacije dovode do formiranja nebalansiranih gameta (sa delecijama i duplikacijama).

Recipročna translokacija između hromozoma 8 i 14 uslovljava pojavu Burkitovog limfoma, a između hromozoma 9 i 22 je uočena kod pacijenata sa hroničnom mijeloidnom leukemijom.

Robertsonove translokacije su rezultat prekida obično u nivou centromera akrocentričnih autozomnih hromozoma nakon čega se fuzionišu dugi kraci hromzoma i tako se formira novi metacentričan ili submetacentričan hromozom. Kao rezultat translokacije doći će i do fuzije kratkih kraka pri čemu će nastati minutni hromozom koji će se u narednim diobama izgubiti. Kako se na kratkim

70

kracima svih akrocentričnih autozoma nalaze NOR (engl. nucleolus organizer region) regioni, gubitak kratkih kraka dva akrocentrika se neće odraziti na fenotip nosioca. Tako osoba nosilac Robertsonove translokacije ima balansirani karioptip sa 45 hromozoma i normalan fenotip.

Ukoliko su u ovaj tip translokacija uključena dva hromzoma iz istog para (npr. 13/13, 21/21) radi se o homologoj Robertsonovoj translokaciji i tada je novoformirani hromozom metacentričan. Nosioci su fenotipski normalni, uglavnom fertilni, ali ne mogu imati potomstvo. U toku anafaze mejoze I novonastali translocirani hromozom odlazi u jednu od kćerki ćelija koja će imati normalan broj

hromozoma (n) ali i duplikaciju q regiona datog akrocentrika. Druga ćelija će biti nulizomik (n -1) za dati akrocentrični hromozom. Gameti koji će biti formirani na kraju mejoze II su nebalansirani. Spajanjem ovih gameta sa normalnim gametima formiraće se monozomičan zigot ili zigot sa normalnin brojem hromzoma i translokacionom trizomijom datog akrocentrika. Monozomije su letalne dok translokacione trizomije (hromozoma 21 i 13) uslovljavaju ispoljavanje Daunovog ili Patau sindroma.

Heterologa Robertsonva translokacija uključuje akrocentrične autozome različitih homologih parova iz iste grupe. Nosoci su fenotipski normalni. U profazi mejoze I, kada homologi hromozomi sinapsiraju, kod nosioca translokacije se formira pahitenki trivalent koga čine translocirani hromozom i dva normalna

akrocentrika. Razdavajanje ovih hromzoma u anafazi I može biti alternativno (u jednu kćerku ćeliju odlaze 2 normalna akrocentrika, a u drugu translocirani hromozom; gameti su n-1), segregacija susjedna

jedan ili dva (u jednu kćerku ćeliju odlazi jedan normalan akrocentrik i ta ćelija je n-1, a u drugu translocirani hromozom sa drugim akrocentrikom i ta ćelija je n, ali sa duplikacijom q regiona odgovarajućeg akrocentrika). Sparivanjem ovih 6 tipova gameta sa normalnim, mogu se formirati genotipski i fenotipski normalan zigot, zigot sa balansiranim kariotipom i normalnim fenotipom,

monozomični zigoti i zigoti sa translokacionom trizomijom. Monozomije su letalne, a živorođeni sa translokacionom trizomijom 21 i 13 ispoljavaju karakteristika Daunovog, odnosno Patauovog sindroma. Insercije su nerecipročne translokacije kojima prethode tri hromozomska prekida, dva na jednom

hromozomu, jedan na drugom. Nakon toga, segment unutar dva prekida sa prvog hromozoma se

ubacuje na mjesto prekida na drugokm hromozomu što rezultira pojavom delecija, odnosno duplikacija određenih gena. Insertovani segment može biti sa prvobitnim redosljedom gena ili invertovan. Nosioci insercija mogu imati genotipski i fenotipski normalno potomstvo, potomke sa balansiranim kariotipom i normalnim fenotipom, ali i malformisanu djecu sa prisutnim delecijama i duplikacijama u kariotipu.

31. HROMOZOMSKE ABERACIJE (RING HROMOZOM) Ring hromozom nastaje kao rezultat dvije terminalne delecije nakon kojih se deletirani segmenti gube, dok se ostatak hromozoma rearanžira u prstenastu strukturu. Ova hromozomska forma je rijetka

ali je primijećena kod svih humanih hromozoma. Ring hromozomi su nebalansirane i nestabilne strukturne aberacije. Zbog specifičnog oblika tokom diobe (uglavnom u anafazi), ring hromozom teži naknadnom cijepanju i ponovnom rearanžiranju. Kod većine

nosilaca ring hromzoma primijećeni su poremećaji u rastu, dok je kod nekih pacijanata prisutna i blaga

71

mentalna retardacija. Ipak, mnogi nosioci ne pokazuju bilo kakve fenotipske anomalije, što je vjerovatno uslovljeno mikro delecijama koje su prethodile formiranju ringa kao i njegovom stabilnošću. Neke studije pokazuju da prstenasti hromozom može na stati i prostom fuzijom telomernih regiona hromozoma bez prethodnih delecija. Ovakav tip prstenastog hromozoma je naročito nestabilan i tokom dioba može usloviti aneuploidije koje mogu dovesti do smrti ćelija. Fenotip nosioca se označava kao „ring sindrom“.

32. NUMERIČKE ABERACIJE Numeričke hromozomske aberacije podrazumijevaju bilo koje odstupanje od normalnog broja hromzoma u kariotipu. Razlikujemo 3 grupe numeričkih promjena: o

Poliploidije – uvećanje broja cjelokupnog hromozomskog seta;

o

Aneuploidije – pojava viška ili manjka pojedinačnih hromozoma;

o

Miksoploidije – prisustvo dvije ili više ćelijskih linija, sa različitim brojem hromozoma, u okviru istog organizma. Ukoliko različite ćelijske linije potiču od jednog zigota organizam je mozaik, a ako potiču od različitih zigota onda je himer.

Poliplodije su veoma rijetke, ali su kao somatske poliploidije karakteristične za ćelije pojedinih humanih tkiva. Tipični primjeri su ćelije jetre koja je u regeneraciji i ćelije placente. Ova pojava je rezultat ubrzanih mitotskih dioba.

Najčešći tip poliploidnih promjena su triplodije (3n) koje su uglavnom rezultat dispermije (oplođenje koje uključuje dva spermatozoida) ili pak oplođenja koje uključuje već aberantne (diploidne) gamete. Fenotipska ekspresija triploidnog kariotipa zavisi od činjenice da li je set koji je u višku naslijeđen od oca ili majke. Ako je porijeklom od oca, obično se formira abnormalna placenta dok je embrion slabo razvijen. Ako je set koji je u višku porijeklom od majke placenta je mala, a razvoj embriona je usporen. Tetraploidije (4n) su uglavnom rezultat izostanka prve diobe zigota.

Aneuploidije su uslovljene ili nerazdvajanjem hromozoma ili anafaznim zaostajanjem hromozoma.

Nerazdvajanje hromozoma može biti posljedica pogrešnog sparivanja hromozoma u prvoj mejotičkoj diobi, što dovodi do poremećaja u njihovom odvajanju u anafazi I, ili nerazdvajanja sestrinskih hromatida u drugoj mejotičkoj diobi ili u mitozi. Hromozomi ili hromatide koje se nijesu odvojile migriraju na jedan pol ćelije koji će tako imati višak genetičkog materijala dok će se na drugom polu ćelije javiti manjak genetičkog materijala. Poremećaji u sparivanju homologih hromozoma se označavaju kao asinapsis, ukoliko sinapsiranje izostane, odnosno desinapsis, kada se sparivanje dogodi ali se sinaptički kompleks ili hijazme prerano odvajaju.

Hromozomsko nerazdvajanje može biti: 

Primarno – rezultat nerazdvajanja u mejozi I, mejozi II ili obje, pri čemu je ćelija koja ulazi u diobu sa normalnim kariotipom;

 72

Sekundarno – rezultat nerazdvajanja u mejozi I kod nosilaca aberantnog kariotipa (npr. 47,XXX);



Postzigotno – rezultat poremećaja u brazdanju zigota pri čemu nastaju mozaici.

Primarno nerazdvajanje hromozoma u mejozi I dovodi u telofazi I do formiranja jedne

nulizomične (n-1) i druge dizomične (n+1) ćelije koje će u slučaju oplođenja sa normalnim diploidnim gametima formirati dva tipa aneuploidnih zigota: monozomičan (2n -1) i trizomičan (2n+1). Ukoliko do greške dođe u jednoj od ćerki ćelija u drugoj mejotičkoj diobi formiraće se 3 tipa gameta: normalni, monozomični i dizomični, što će kao rezultat imati formiranje normalnog, monozomičnog ili trizomičnog zigota. Posljedica greške u obije mejotičke diobe je formiranje različitih tipova aberantnih hromozoma, ali i normalnih. Naime, kao posljedica greške u mejozi I formiraće se nulizomična i dizomična ćelije. U toku mejoze II od nulizomične ćelije će se formirati nulizomični gameti, dok se 4 hromatide dva homologa hromozoma dizomične ćelije mogu raspodijeliti na nekoliko načina formirajući različite tipove gameta (nulizomične, dizomične, trizomične, tertrazomične , ali i normalne). Sekundarno nerazdvajanje hromozoma je posljedica aneuploidije nosioca aberacije. Kod npr.

muškarca sa dizomijom Y hromzoma (47,XYY) postoje 2 mogućnosti kako će se tri polna hromozoma razdvojiti u mejozi I. Prva je mogućnost da X hromozom ode u jednu sekundarnu spermatocitu, a dva Y hromzoma u drugu. Od ovh ćelija će se tokom mejoze II formirati jedan normalan gamet (n,X) i jedan dizomičan (n+1,YY). Druga mogućnost jeste da X i Y hromozom odu u jednu sekundarnu spermatocitu, a drugi Y hromozom u drugu. U tom slučaju dolazi do formiranja jednog normalnog (n,Y) i jednog dizomičnog (n+1,XY) gameta. Postzigotno nerazdvajanje je posljedica poremećaja u mitozi. Ukoliko se greška desi u prvoj diobi brazdanja, kao rezultat nerazdvajanja sestrinske hromatide jednog hromozoma, doći će do formiranja 2

aberantne ćelije koje će u narednim diobama dati aneuploidne ćelijske linije: monozomičnu (2n -1) iIi trizomičnu (2n+1). Dati embrion na taj način postaje mozaik. Ukoliko se nerazdvajanje desi u drugoj ili bilo kojoj narednoj diobi kao rezultat će se pojaviti 3 ćelijske linije: jedna sa normalnim kariotipom i dvije aneuploidne.

Kao rezultat numeričkih aberacija mogu se formirati ćelije kod kojih su svi hromozomi porijeklom od jednog roditelja (uniparentalna diploidija) ili su pak dva prisutna homologa hromozoma porijeklom od istog roditelja (uniparentalna dizomija).

33. ANEUPLOIDIJE POLNIH HROMOZOMA Aberacije polnih hromozoma imaju manje štetan efekat na fe notip nego anomalije autozoma, što se može objasniti inaktivacijom svih prekobrojnih X hromozoma. Turnerov sindrom (45, X0) Incidencija ovog sindroma je 1:2500 ženske novorodjenčadi. Ova monozomija (kao i sve ostale) je veoma letalna, pa je 99% ovakvih fetusa abortirano u prvom mjesecu gestacije. Fenotip osoba sa ovim sindronom je uslovljen nedostatkom supresornih gena koji se nalaze na inaktivnom X hromozomu.

73

Ovaj fenotip karakteriše gonadalna disgeneza (ovarijumi postaju vezivne trake), što znači da su ovakve osobe su sterilne. Ipak, 3% ovih osoba ima menstruacije i fertilne su. Sekundarne polne karakteristike su

takođe nerazvijene. Ovaj sindrom se odlikuje nizom somatskih poremećaja: nizak rast (125 -150cm), kratak i naboran vrat, nizak rast kose na vratu, štitaste grudi sa razmaknutim bradavicama, hipoplazija prstiju, anomalije srca...

U 75% slučajeva X hromozom je porijeklom od majke, što ukazuje na neodvajanje hromozoma u spermatogenezi.

Super-žena (47, XXX)

Incidencija je 1:1000 ženske novorođenčadi, a povećava se sa starošću majke. Fenotip ovi h jedinki varira i nema karakterističnih somatskih anomalija. U 1/3 slučajeva je utvrđena blaža metalna retardacija i poremećaj ponašanja. Trizomija X hromozoma moze poremetiti mejozu i menstruaciju. Potomstvo ovakvih žena je uglavnom normalno, iako je rizik da će se roditi ćerka sa ovim oboljenjem 50%. Ova trizomija nastaje usljed neodvajanja X h romozoma u I ili II mejotičkoj diobi majke ili u II mejotičkoj diobi oca.

Polizomija X hromozoma kod žena Sve do sada ispitane žene sa kariotipom 48, XXXX su sa mentalnom retardacijom, a u nekim slučajevima i sa disfunkcijom ovarijuma. Nekad se sreću i anomalije karakteristične za Daunov sindrom. 49, XXXXX osobe se karakterišu sa još većom mentalnom zaostalošću, a i somatske anomalije su češće. Polizomije nastaju zbog neodvajanja hromozoma u I i II mejotičkoj diobi kod jednog roditelja. Klienfelterov sindrom (47,XXY)

Incidencija je 1:1000 muške novorođenčadi. Fenotip: izduženi ekstremiteti, viši od normalnih muškaraca, krupni zubi, evnuhoidni habitus i blaga mentalna retardacija. Testisi su smanjeni, sekundarne seksualne karakteristike su slabo razvijene, oskudna kosmatost, a u 40% se pojavljuje ginekomastija, odsustvo spermatogeneze.

Ova aberacija nastaje zbog neodvajanja hromozoma u mejozi roditelja, a rizik se povećava sa starošću majke.

Postoje i polizomije X hromozoma kod muškaraca (48, XXXY), koje su slične Klinefelterovom sindromu, osim sto je intezitet anomalija veći. 47, XYY

Ovakva aneuploidija se vezuje za agresivno ponašenje jedinki sa ovakvim kariotipom, ovakvi muškarci su nešto viši i imaju krupnije zube. Postoje i polizomije 48, XYYY i 49, XYYYY kod kojih se bilježi porast agresivnosti i pad inteligencije.

74

34. SINDROMI GENSKIH ANOMALIJA Mada je letalnost autozomnih trizomija zigota vrlo velika, neke trizomije su kompatibilne sa

životom I prisutne su u živorođenooj populaciji. Trizomija hromozoma 21 (Downov sindrom) Ova autozomna trizomija je najčešća, jedno dijete na 700 živorođene djece ima trzomiju 21. Incidencija ove abaracije je znatno veća u momentu začeća, ali više od 60% trizomičnih fetusa spontano abortira, a oko 20% su mrtvorođeni. Najizrazitiji fenotipski efekti trizomije 21 su mentalna retardacija i kongenitalne anomalije srca praćene u različitom stepenu izraženim anomalijama drugih organa. Trizomiju hromozoma 21 karakteriše i povećan rizik za pojavu akutne leukemije i prijevremeno starenje. Na osnovu ispitivanja parcijalnih trizomija utvrđeno je da je samo distalni dio dugog kraka (21q22) odnosno 1/8 do 1/5 hromozoma 21 značajan za patogenost ovog sindroma. Najveći broj slučajeva Downovog sindroma (95%) ima prostu trizomiju hromozoma 21. Trizomija najčešće nastaje usljed grešaka u mejozi majke. Mozacizam se javlja u 1 -2% pacijenata i klinička slika je u ovim slučajevima slabije izražena. U oko 5% slučajeva trizomija 21 nastaje usljed translokacije, kada je jedan roditelj nosilac balansirane translokacije u kojoj učestvuje hromzom 21 ili translokacija nastane de novo u mejozi jednog od roditelja.

Najnovija istraživanja su pokazala da se Downov sindrom javlja u kod djece sa naizgled normalnim kariotipom. U ovim slučajevima je u pitanju duplikacija malog segment a 21q 22 oko 2000 kb koji je odgovoran za fenotipske karakteristike ovog sindroma.

Trizomija hromozoma 18 (Edwardsov sindrom)

Incidencija ove trizomije je 1/6000 novorođenčadi, dok 95% fetusa sa ovom trizomijom završava spontanim pobačajem. Među živorođenom djecom preovlađuje ženski pol, što dokazuje da se fetusi muškog pola češće eliminišu spontanim pobačajem. Fenotip novorođenčadi sa ovom trizomijom se odlikuje multiplim anomalijama. Ova djeca umiru brzo poslije rođenja, samo oko 10% preživi prvu godinu života. Neodvajanje hromozoma u mejozi roditelja je glavni uzrok za ovog sindroma. Rijetko sindrom nastaje usljed balansirane translokacije jednog od roditelja, a još rijeđe se javlja mozaicizam koji prouzrokuje znatno blažu kliničku sliku. Trizomija hromozoma 13 (Patuov sindrom)

Učestalost ove trizomije se kreće oko 1/12.000 novorođenčadi. Djeca su sa multiplim malformacijama i samo oko 10% preživi prvu godinu. Najčešći uzrok trizomije 13 je neodvajanje hromozoma u mejozi roditelja. U oko 20% slučajeva jedan roditelj je nosilac balansirane translokacije, a u 5% slučajeva je prisutan mozaicizam.

75

Trizomija hromozoma 8

Prije primjene tehnika traka nije bilo moguće definisati ovaj sindrom, jer se nije znalo koji je hromozom iz grupe C u trizomičnom stanju. Većina do sada opisanih pacijenata ima ovu trizomiju u mozaičnoj formi uz prisustvo normalne ćelijske linije, pa zato i njihov fenotip varira zavisno od distribucije ćelijskih linija u organizmu. U svjetskoj literaturi do sada je opisano oko 100 slučajeva trizomije 8. Ostale trizomije autozoma u živorođenim populacijama se javljaju toliko rijetko da se ne može dati nikakva procjena njihove učestalosti. Kao kompletne trizomije potvrđene su više puta samo trizomija hromozoma 22 i trizomija 9, dok su ostale trizomije hromozoma 3, 7, 10, 12, 15, 16, 19 i 20 opisane

samo nekoliko puta ili kao pojedinačni slučajevi, najčešće u mozaičnoj formi.

35. DETERMINACIJA I DIFERENCIJACIJA EMBRIONALNIH ĆELIJA I TKIVA Život svake višećelijske jedinke počinje jednom jedinom, oplođenom jajnom ćelijom, zigotom. Zigot predstavlja novu, jedinstvenu kombinaciju gena roditelja, tako da ne postoje dvije jedinke koje bi

imale istovjetan genom (izuzetak su jednojajčani blizanci). U genomu zigota je upisan razvojni plan novog organizma koji treba da se realizuje tokom

embrionalnog i fetalnog perioda života. I humani embrion se razvija iz zigota dugim i složenim procesima, od kojih su najznačajniji proliferacija ćelija (rast), diferencijacija ćelija i oblikovanje nove jedinke, morfogeneze. Morfotgeneza je uslovljena rastom i diferencijacijom.

Centralni problem biologije razvića je pitanje: kako od jedne ćelije, zigota, nastaje složeni organizam od nekoliko milijardi ćelija. Kako te ćelije postaju specifične po formi i funkciji? Kako se reprodukuju u određene djelove novog organizma? Kako se organizuju u tkiva i organe? Sve te ćelije nastaju od zigota, zigot je totipotentan. Sa svakom novom diobom potencije blastomera se ograničavaju (pluripotentnost, multipotentnost) da bi se, ranije ili kasnije, zavisno od vrste kojoj pripada embrion, definitivno svele na jedan jedini razvojni put: embrionalne ćelije postaju unipotentne. Još uvijek nije jasno kada i kako jedna ćelija u toku daljeg razvoja može da postane samo ćelija jetre ili ćelija srca. Diferencirana ćelija ima nove morfološko -fiziološke karakteristike koje je čine posebnom, drugačijom od ostalih embrionalnih ćelija. Promijenila je oblik, veličinu, ponašanje prema susjednim ćelijama. Diferencirana ćelija je osposobljena da vrši posebnu funkciju. Dosadašnja ispitivanja su pokazala da je osnovna razlika među diferenciranim ćelijama u biosintezi specifičnih proteina. Neke diferencirane ćelije sintetišu veliki dio specifičnih proteina, npr. 90% proteina eritrocita čini hemoglobin; druge sintetišu male količine specifičnog proteina, npr. Enzim detoksikacije u ćelijama jetre. Jedne svoje proteine izlučuju direktno u krv (protein hormone), druge u spoljašnju sredinu (enzimi varenja, koje sintetišu ćelije egzokrinog pankreasa), treće u međućelijske prostore (vezivne ćelije sintetišu kolagen). 76

Zaključak bi bio da je diferencirana ćelija specifična po tipu proteina koji proizvodi i po ulozi koju ima u ortganizmu.

Strukturni elementi ćelije, proteini citomembrana, elementi koji omogućavaju diobu ćelije, kretanje, oblik ili promjenu oblika, komunikaciju između ćelija, proteini koji kontrolišu rast i diobu ćelije i sve druge procese u ćelijim, predstavljaju – fenotipsku ekspresiju gena ćelije. Ako u jednom trenutku embriogeneze blastomere počnu da se razlikuju između sebe po ovim karakteristikama, onda bi to značilo da u različitim blastomerama funkcionišu različiti geni. Da li različite blastomere imaju različite genome?

Zigot i ćelije koje od njega nastaju dijele se mitotskom diobom a sušt ina mitoze je u ravnomjernoj podjeli hromozoma i gena ćelija majke na ćelije ćerke. To znači da svaka naša ćelija ima iste hromozome i gene kao što je imao zigot: epitelna ćelija ima gen za hormon rastenja, ćelija hipofize gen za kolagen itd. Ako je tako onda mora da postoje vrlo precizni mehanizmi kontrole aktivnosti gena

koji u određeno vrijeme, na određenom mjestu u određenoj ćeliji jedne gene uključuju u rad, a druge isključuju iz rada. Za sada su najmanje jasni regulatorni mehanizmi koji obezbijeđuju aktivnost onih gena čiji su produkti, u određenoj fazi embrigeneze, potebni ćeliji, kao i mehanizmi koji kontrolišu suklađen razvoj cjelokupnog višećelijskog organizma. Problem molekularne osnove kontrole aktivnosti gena je centralni problem savremene biologije.

Nije čudno da se mnogo vremena pretpostavljalo da pri brazdanju zigota različite embrionalne ćelije dobiju različite „determinante“ koje određuju pravac razvoja svake embrionalne ćelije. Jednim relativno jednostavnim eksperimentom, ova teroija je oborena. Ako se mikropipetom iz oplođene jajne ćelije amfiba izvadi jedro, pa se u ovakvu „enukleiranu“ ćeliju unese jedro neke od ćelija blastule ili gastrule, u najvećem broju eksperimenata jajna ćelija počinje da se brazda i normalno se razvija. Kada bi se tokom brazdanja jedra kvalitativno mijenjala, ovakav eksperiment ne bi bio moguć. U novije vrijeme, čak i jedra različito diferenciranih ćelija larve (npr. ćelija crijevnog epitela ili neurona), prenijeta u jajnu ćeliju kojoj je uklonjeno rebro, obezbijeđuju normalan embrionalan razvoj. Ako se tokom razvića jedra kvalitativno ne mijenjaju, zašto ipak dolazi do diferencijacije, do nastanka razlika između embrionalnih ćelija? Druga važna komponenta jajne ćelije je citoplazma. U mnogim jajnim ćelijama, ne posredno po oplođenju, mogu da se uoče kvalitativno različiti predjeli citoplazme. Ti predjeli se razlikuju po konzistencji citoplazme, po prisustvu ili odsustvu različitih inkluzija (pigment, vitelus), po količini RNK, rasporedu organela, biohemijskim procesima i dr.

U toku brazdanja, sa svakom novom diobom embrionalne ćelije postaju sve manje i manje i ne mijenjaju svoj položaj u odnosu na predjele zigota. To znači da od početka brazdanja blastomere dobijaju kvalitativno različitu citoplazmu. Citoplazma predstavlja spoljašnju sredinu jedra i može da utiče na aktivnost jedra. Ako se jedro diferencirane ćelije presadi u citoplazmu zigota, prestaje transkripcija rRNK, karakteristična za difernciranu ćeliju. 77

Vrlo je vjerovatno da diferencijacija primarno zavisi od kvaliteta citoplazme u kojoj se nalazi

jedro. Ako jedra različito reaguju na kvalitativno različitu citoplazmu, onda ona postaju različita me po sadržaju gena, već po aktivnosti gena. Ta primarna razlika se produbljuje jer će se izmijeniti i interakcija izmijenjenog jedra sa citoplazmom. Progresivno, nukleo-plazmazični odnosi postaju sve specijalizovaniji i sve više se razlikuju

između ćelija usmjerenih u različitim pravcima. Da kavalitativno različita citoplazma može da utiče na diferencijaciju, dokazano je na primjeru Ascarisa (valjkasti crv).

Zapaženo je da se tokom razvića Ascarisa dio citoplazme zigota sa mnogo RNK uvijek nalazi samo u jednoj blastomeri. Blastomera bogata RNK ima 2n hromozoma. Sve ostale blastomere već poslije prve diobe dobijaju fragmentisane hromozome, odnosno imaju manje DNK od 2n. Ćelije sa fragmentisanim hromozomima diferenciraće se u somatske ćelije a ćelije sa intaktnim hromozomima daju ćelijsku liniju gonada. Izgleda da citoplazma bogata RNK utiče na stabilnost DNK i spriječava fragmentaciju hromozoma a time određuje razvojni put gonocita. Eksperimentalna biologija je i na drugim vrstama pokazala da citoplazma zigota utiče na diferencijaciju embrionalnih ćelija. Oplođena jajna ćelija kojoj je uklonjeno jedro može da s e brazda, zavisno od vrste kojoj pripada, do blastule, gastrule ili čak larve. Ako je zigot bez jedra sposoban da se brazda, onda moramo da peretpostavimo da se u samoj citoplazmi zigota nalaze izvjesne informacije koje obezbijeđuju brazdanje. Te informacije mora da potiču od genoma jer se i zigot bez jedra brazda po određenom nasljednom planu, na određen nasljedan način. Jajna ćelija sazrijeva u jajniku. Trajanje sazrijevanja je različito kod različitih vrsta: nekoliko dana, nedjelja pa i mjeseci. Kod čovjeka, jajna ćelija počinje da sazrijeva u jajniku u toku embrigeneze i u stanju diktiotena (I mejotička profaza) može da provede i desetine godina. Zavšiće sazrijevanje tek po ulasku spermatozoida, u jajovodu.

U jajnoj ćeliji kičmenjaka nakupljaju se hranljive materije iz okoline sredine ili iz krvotoka majke ali i sama jajna ćelija sintetiše brojne makromolekule, od kojih će neke koristiti tek poslje oplođenja. Najviše podataka o biosintetskoj aktivnosti ovocite prikupljeno je ispitivanjem amfiba, posebno vrste Xenopus laevis. Zapaženo je da mlada ovocita u stadionu pahitena ima u jedru dvije vrste DNK: rastresitu, hromozomsku DNK i kompaktnu, u vidu kalote, rDNK. Ribozomska DNK sadrži gene za prekursorsku, 45S rRNK. U ovociti ima 100-1000 puta više gena za rRNK nego u somatskim ćelijama. Povećanja broja gena za rRNK vrši se procesom amplifikacije, diferencijalnim umnožavanjem rDNK, pri čemu se hromozomi ne replikuju. Ribozomska DNK se u vidu prstenova odvaja od hromozoma i obrazuje brojne nukleoluse. Dok somatske ćelije imaju samo dva nukleolusa, u ovociti ih može biti i nekoliko

hiljada. Zahvaljujući ovakvom povećanju broja gena za rRNK, jedna ovocita može da sintetiše toliko rRNK koliko u istom vremenskom periodu sintetiše 20.000 ćelija jetre. 78

U stadijumu diplotena ovocita Xenopusa sadrži duke (oko 800.000 mikrona) hromozome, u vidu bivalenata. Oni imaju posebnu građu. Na njima se zapažaju mjesta hijazmi, jedna centralna osovina čini spiralizovana, u smislu transkripcije neaktivna DNK a od nje se bočno izdvajaju simetrične despiralizovane petlje. Ovakvi hromozomi podsjećaju na četke kojima su se nekad čistila stakla plinskih lampi, pa ih nazivaju lamp-bruch ili četkasti hromozomi. Na petljama, koje predstavljaju aktivne gene, transkribuju se vrlo raznovrsne, heterogene RNK.

One se spajaju sa proteinima (zaštita) pa se na petljama citohemijskim metodama dokazuju DNK petlje, niti tek sintetisanih RNK i granule nukleoproteina. Broj nukleotida u prepisanim RNK varira od nekoliko desetina do nekoliko hiljada. Pretpostavlja se da u heterogenim RNK ima i iRNK i tRNK. To su molekuli

koji mogu dugo vrijeme da se očuvaju u citoplazmi ovocita i da se aktiviraju tek po oplođenju. Neke od njih sadrže informacije za proteine hromatina, za proteine diobenog vretena, kontraktilnih struktura i dr. Neke od prepisanih RNK ne napuštaju jedro i najčešće bivaju razgrađene. Njihova uloga još uvijek nije objašnjena.

36. GENETIČKO SAVJETOVALIŠTE Genetičko savjetovanje je postalo najznačajnija oblast humane genetike. Genetičko savjetovanje obuhvata: a) postavljanje pravilne dijagnoze, b) procjenu prognoze i vrijednosti bilo kojeg od mogućih oblika liječenja i c)

utvrđivanje rizika ponovnog javljanja nasljedne bolesti i poremećaja u porodici.

Genetičko savjetovanje podrazumijeva i svestranu pomoć porodici u razumijevanju genetičkih implikacija, kao i iznalaženje različithih mogućnosti da se posljedice ublaže. Kada su u pitanju monogenski autozomno dominantni i recesivni poremećaji koji se nasljeđuju na jasan mendelski način, kao i kada je oboljenje vezano za X hromozom, rizik ponovnog javljanja bolesti u porodici se lako izračunava. Druga grupa su tzv. multi-faktorski poremećaji a to su mnoge česte bolesti u humanim populacijama u čijoj etiologiji naslijeđe ima značajnu ulogu, ali se te bolesti ne naslijeđuju po Mendelovim pravilima. Rizik njihovog ponovnog javljanja u porodici se procjenjuje na osnovu

posmatranja učestalosti bolesti kod srodnika probanada (empirijski rizik). U sklopu genetičkog savjetovanja su i brakovi između srodnika, koji imaju određen nivo zajedničkih gena, jer imaju zajedničke pretke. Što je stepen srodstva viši, postoji veća vjerovatnoća uspostavljanja homozigotnog stanja za štetne recesivne gene. Prenatalna dijagnoza nasljednih oboljenja

Za roditelje sa rizikom rađanja djeteta sa anomalijama ili nekom nasljednom bolešću mogućnost prenatalne dijagnoze i selektivnog pobačaja oštećenog ploda predstavlja značajno dostignuće. Jedna od široko primjenljivanih metoda prenatalne dijagnoze u svijetu i u našoj zemlji jeste amniocenteza. Ovim

79

postupkom se dobijaju ćelije plodove vode, koje se mogu kultivistati i koristiti za analiz hromozoma ploda.

Optimalno vrijeme za amniocentezu je oko 16. nedjelje trudnoće. Ćelije plodove vode (amnionske tečnosti) odgajaju se i umnožavaju in vitro na određenoj hranljivoj podlozi i poslije određenog vremena uzimaju za analizu urina. Nekultivisane ćelije plodove vode se ispituju u cilju određivanja ploda fetusa, putem analize X- ili Y-hromatina. Ovaj metod je je posebno značajan kad su posrijedi majke sa rizikom rađanja muškog

djeteta sa ozbiljnom bolešću vezanom za X hromozom. Da bi određivanje pola bilo sigurnije, obično se ispituje i kariotip fetusa. Druga metoda za prenatalno postavljanje dijagnoze hromozomopatija, koja se sve više koristi u citogenetičkim laboratorijama, jeste ispitivanje horionskih resica. Ova metoda se primjenjuje ranije, u prvom tromjesječju turdnoće, i zato ima izvjesne prednosti u odnosu na amniocentezu, jer stvara manje traume kod trudnica, zato što je period čekanja na rezultat kraći i trudnica se može odlučiti da blagovremeno prekine trudnoću.

Obije ove metode zahtijevaju prethodnu primjenu ultrazvuka za određivanje: tačnog vremena trudnoće, položaja placente, isključivanja blizanačke trudnoće ili smrti ploda. Kultivisane ćelije plodove vode se koriste za otkrivanje oko 60 urođenih biohemijskih poremećaja. Ispitivanjem nivoa alfa fetoproteina u amnionskoj tečnosti mogu se u ranoj trudnoći otkriti poremećaji nervne cijevi, anecefalija i spina bifida. Za otkrivanje anomalija centralnog nervnog sistema koristi se i ultrazvuk, kao i za anomalije drugih organskih sistema. Neke nasljedne bolesti se mogu otkrivati sistematskim traganjem (screening) kod novorođene djece. Prvi put je sistematsko traganje primijenjeno za otkrivanje fenilketonurije. Sistematsko traganje je

značajno i za otkrivanje prekliničkih slučajeva i osoba genetički predisponiranih za određene bolesti. Ovaj postupak omogućuje primjenu odgovarajuće terapije prije pojave simptoma bolesti. Otkrivanje nosilaca rcesivnih štetnih gena u humanim populacijama ima izuzetan značaj zbog visokog rizika ovih osoba da štetni gen prenesu na potomstvo. Heterozigoti za neka patološka svojstva su relativno česti u humanim populacijama. Nekada se ovi heterozigotni nosioci mogu lako prepoznati, kao, npr., u slučaju nedostatka u krvi enzima katalaze, dok se za neka oboljenja može identifikovati samo dio nosilaca, kao u slučaju fenilketonurije, hemofilije i dr. Postoje, međutim, i takvi genetički poremećaji za koje još uvijek nisu pronađene metode za otkrivanje nosilaca mutiranog štetnog gena. Danas se sve više koristi DNK tehnologija za postavljanje dijagnoze i prevenciju nasljednih bolesti.

Izolacija specifičnih sekveni DNK i njihovo kloniranje su neophodni uslovi za dijagnostikovanje nasljednih poremećaja. 80

Postoji nekoliko pristupa za dobijanje specifičnih sekvenci DNK koje su označene kao genske probe iz složene mješavine DNK sekvenci. Genske probe su komplementarne genu koji ispitujemo. 1. cDNK kloniranje 2. kloniranje genomne DNK 3. formiranje oligonukleotidnih proba

cDNK se dobija kada se na iRNK izolovanoj iz određenog tkiva uz pomoć reverzne transkriptaze sintetiše komplementaran lanac DNK. Ova cDNK se može ugraditi u vekror, plazmid ili virus, i umnožavati u bakterijskoj ćeliji. Genomna DNK se ekstrahuje iz jedra ćelija i dejstvom restrikcionih enzima se sječe u fragmente različite dužine, koji se ugrađuju obično u viralni vektor. Rekombinovanjem virusima se inficira bakterija i poslije umnožavanja virusa vrši se odabiranje (screening) odgovarajućih kloniranih sekvenci (genskih proba).

Kulture bakterija koje sadrže klonirane sekvence DNK se zovu biblioteke gena. Ako se zna redosljed aminokiselina u proteinskom produktu određenog gena, mogu se formirati djelovi vještačkog gena, koji takođe služe kao probe za identifikaciju gena (oligonukleotidne probe).

DNK dijagnoza

Izvori DNK za analizu su jedra limfocita periferne krvi, kultivisani fibroblasti kože, ćelije plodove vode i horionske resice. Ekstrahovana DNK iz ovih ćelija se sječe u fragmente odgovarajućim

restrikcionim enzimom. Fragmenti DNK iz bilo kog izvora mogu biti razdvojeni na osnovu dužine putem elektroforeze u agaroznom gelu i daljim postupkom denaturacije i hibridizacije sa

odgovarajućom radioaktivno obilježenom probom može se utvrditi genetički poremećaj u njima. Ovaj postupak je označen kao Southern blot tehnika, prema autoru koji ju je pronašao. Nasljedne bolesti se mogu otkriti direktno ili indirektno, DNK tehnologijom.

Ako u okviru jednog gena postoji mutacija u obliku delecije ili insercije, to može smanjiti ili povećati razmak između restrikcionih mjesta za odgovarajući restrikcioni enzim. Isijecanjem DNK tim enzimom i hibridizacijom fragmenta sa odgovarajućom obilježenom probom može se, autoradiografijom, uočiti kraći ili duži fragment u odnosu na dužinu fragmenta kod osoba koje nemaju datu mutaciju gena. Na primjer, osobe homozigoti, koje imaju normalne gene za beta globin, hibridizacijom sa probom, daju na autoradiografiji jednu traku koja pokazuje fragment od 5.2 kb,

nastao isijecanjem jednom restriktazom. Osobe homozigoti za mutirane gene će takođe imati jednu traku, koja otkriva kraći fragment od 4.6 kb, što je posljedica delecije u genu. Heterozigoti će pokazati dvije trake koje označavaju oba fragmenta od 5.2 kb do 4.6 kb. Na ovaj način, analizom dužine restrikcionih fragmenata može se sprovesti prenatalna dijagnoza

fetusa pod sumnjom za dato oboljenje.

81

Promjena restrikcionog mjesta može nastupiti i usljed pojave tačkaste mutacije u okviru jednog gena. Analizom dužine restrikcionih fragmenata može se otkriti ova mutacija. Ako je poznata tačkasta mutacija gena koja prouzrokuje neko oboljenje, može se i primjenom hibridizacije sa oligonukleotidima probama za normalan i mutiran gen dokazati da li jedna osoba ili fetus ima ili nema datu mutaciju u genomu.

Monogenski pormećaji se mogu otkrivati i indirektno. Sada se zna da su nekodirajućim regionima genoma, unutar samog gena i u njegovim susjednim sekvencama prisutne tačkaste

mutacije, koje nemaju fenotipsku ekspresiju. Ove mutacije, međutim, mogu da mijenjaju broj restrikcionih mjesta, što rezultira promjenom dužine restrikcionih fragmenata. Ovo je normalna pojava i označena je kao polimorfizam restrikcionih fragmenata. Ukoliko se polimorfno mjesto nađe u blizini mutiranog gena, nasljeđuje se zajedno sa mutiranim genom i može poslužiti kao koristan genetički marker u porodicama za otkrivanje članova porodice i fetusa pod sumnjom da su nosioci date mutacije. Primjena DNK analiza, direktna i indirektna, do sada je već omogućila prenatalnu i presimptomatsku dijagnozu niza nasljednih oboljenja, kao i otkrivanje heterozigotnih nosilaca

mutiranog gena. Sigurno je da će dalja ispitivanja na nivou DNK omogućiti da znatno veći broj nasljednih poremećaja bude dostupan analizi, naročito u fetalnom periodu, što će biti veliki doprinos prevenciji nasljednih oboljenja.

Može se očekivati da će u budućnosti DNK tehnologija biti primijenjena i u liječenju nasljednih bolesti zamjenom mutiranih gena normalnim genima (genoterapija). Indikacije za prenatalnu dijagnozu hromozomopatija i genopatija su: 1. starost majke (trudnce starije od 35. godina imaju povećan rizik za rađanje djeteta sa trizomijom hromozoma 21 i drugim varijabilnim trizomijama) 2. dijete – fetus iz prethodne trudnoće s a hromozomskom anomalijom 3. jedan roditelj nosilac balansirane hromozomske aberacije (translokacije, inverzije) 4. poremećaji vezani za X hromozom 5. marker X-sindrom (mentalna retardacija uslovljena fragilnim X-hromozomom) 6. hemoglobinopatije 7. urođene greške metabolizma 8. hemofilija A i neke druge nasljedne bolesti 9. poremećaji razvoja nervne cijevi

82