PRACTICA: HONGOS FILAMENTOSOS LIGNOLÍTICOS Y CELULOLÍTICOS I.
INTRODUCCIÓN.
Los hongos ligninolíticos mineralizan la lignina basados en la producción de radicales libres, principalmente por medio de las enzimas extracelulares lignino peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa. Se ha probado la eficiencia de estas enzimas en la degradación de hidrocarburos poliaromáticos (PAHs), fenoles clorados, plaguicidas y otros compuestos de interés ambiental. La lacasa cataliza procesos de polimerización o depolimerización a través del mecanismo de transferencia de electrones del sustrato al oxígeno que es reducido a agua, lo que le confiere una ventaja sobre las otras enzimas que requieren de peróxido para funcionar. Sin embargo, debido al bajo potencial redox de la lacasa (entre 0.7 y 0.8), el rango de sustratos es pequeño. Su actividad se puede expandir hacia compuestos más difíciles de oxidar usando mediadores. Un mediador puede ser una molécula pequeña de bajo peso molecular que actúa como una especie de lanzadera de electrones: una vez que es oxidado por la enzima, se difunde lejos del sitio catalítico y a su vez, oxida cualquier sustrato que, debido a su tamaño, no podría entrar directamente al sitio catalítico. Dependiendo de la estructura química, los mediadores actúan por medio de los mecanismos (i) Por transferencia de electrones, (ii) por transferencia de hidrógeno radical, para los sustratos que son más difíciles de oxidar, (iii) por medio de una oxidación iónica.
Dada la importancia de este mecanismo, se pretende descubrir nuevos mediadores para la degradación de plaguicidas y entender los mecanismos de acción de los mismos para poder ser aplicados a procesos de degradación de contaminantes.
II.
OBJETIVOS.
Determinar la presencia de hongos filamentosos lignoliticos.
III.
MATERIALES: MADERA
PAPEL TOALLA
FRASCO DE PAPILLA ESTERIL
PIPETA
MECHERO
BOTELLA
IV.
METODOLOGIA: Hongos lignolíticos y celulolíticos Detección de hongos filamentosos degradadores de lignina
Para la detección de la degradación de lignina, según Saldarriaga & Pineda (2001), los hongos filamentosos serán cultivados en PDA a 30 °C, por 72 horas y un fragmento de 0,5 cm de cada micelio se sembrará en el centro de frascos de vidrio con 15 mL de agar extracto de malta 2,5 % inclinado, siendo incubados a 30 °C por 1 semana. A continuación, se tomará un bloque de madera de 4x1x0,5 cm, previamente esterilizado en autoclave y se depositará en el extremo final del medio de cultivo, tal que se mantenga un ángulo de 45 ° de separación respecto a la superficie. Después de la incubación a 30 °C por 2 semanas, se investigará el desarrollo de los hongos sobre los bloques de madera, considerándose preliminarmente como degradadores de lignina, aquellos que formen micelio visible macroscópicamente. Valoración indirecta de la degradación de la lignina Para la valoración indirecta de la degradación de la lignina según Saldarriaga & Pineda (2001), en frascos de vidrio conteniendo 25 mL de agar agua inclinado se depositará una capa superficial de 0,5 mL de agar extracto de malta 2,5 % y sobre ésta se sembrará un fragmento de 0.5 cm del micelio del hongo filamentoso. Después de 72 horas de incubación a 30 °C, se depositará un bloque de madera y se incubará a 30 °C, durante 2 meses. Transcurridos 15,30 y 60 días se observará el desarrollo del micelio sobre el bloque de madera, calificándolo según una escala convencional elaborada para tal fin, donde 0-25 % del área colonizada corresponderá a colonización escasa, 26-50 % a colonización regular y 51-100 % a colonización buena. Detección y valoración de la degradación de celulosa Según la metodología descrita por Constantino & Manayay, se detectarán hongos degradadores de celulosa y se valorará la
degradación, calificando el área colonizada y degradada en el papel de filtro el papel de filtro, así como también se determinará el peso perdido. Obtención del inóculo Cada hongo filamentosos se cultivará en PDA, a 30 °C, por 72 horas y luego se obtendrá una suspensión de conidias en solución salina esterilizada (NaCl 0,87 % p/v), cuya concentración se estandarizará a 2 x 10 7 celmL-1, mediante la cámara de contaje de Levy con el rayado de Neubauer. Siembra de hongos filamentosos en papel filtro En tubos de ensayo de 20 mL de capacidad, con 2 mL de caldo sales minerales, se depositarán verticalmente tiras de papel filtro whatman N°1 de 6x1cm, con un peso inicial previamente determinado (Pi). A continuación, cuidadosamente se inocularán 0,2 mL de la suspensión de conidios, tratando que se distribuya uniformemente en el papel filtro y los tubos serán incubados a 30 °C, con agitación diaria, durante 15 minutos por 25 días. Calificación del área del papel filtro colonizada Transcurridos 25 días de incubación, se observará el micelio desarrollado sobre el papel filtro y se calificará con una escala convencional elaborada, donde 0-25 % del área colonizada corresponderá a colonización escasa, 26-50 % a colonización regular y 51-100% a colonización buena. Calificación del área del papel filtro degradada Cada papel filtro será extraido con una pinza y con ayuda de un ansa bacteriológica y una piseta será retirado cuidadosamente el micelio adherido. Luego se determinará el porcentaje del área degradada y se calificará con una escala convencional elaborada, donde 0 % del área degrada corresponderá a degradación no observable, 1-40 % a degradación regular, 41-80 % a degradación buena y 81-100% a una degradación muy buena. Determinación de la pérdida del peso del papel filtro
Cada papel filtro será secado en estufa a 40 °C, hasta alcanzar peso constante, obteniéndose luego el peso final (Pf). La diferencia entre el peso inicial y final se expresará como porcentaje de peso perdido.
V.
PROCEDIMIENTO: LOS HONGOS FILAMENTOSOS SERÁN CULTIVADOS EN PDA A 30 0C X 72 HORAS
PDA
En agar extracto de malta 2,5 % inclinado haciendo una incubación a 300C por una semana
SE TOMARA UN BLOQUE DE MADERA DE 4X1X0.5 CM PREVIAMENTE ESTERILIZADO
Se depositara en un extremo Se incubara a 300C por dos final del medio de cultivo tal que semanas, se investigara el mantenga un ángulo de 450 de desarrollo de los hongos sobre el separación respecto a la bloque de la madera superficie
VI.
RESULTADOS:
SE OBSERVÓ CRECIMIENTO
RESTO DE GRUPOS:
VII.
VIII.
CONCLUSIONES: En esta práctica se llevó a cabo el estudio de métodos para el lograr el reconocimiento de hongos limnoliticos. Se concluyó con éxito la práctica pues se logró el crecimiento de estos, en la madera.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
http://www.smbb.com.mx/congresos %20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_I/Carteles/CI-3.pdf http://www.scielo.org.pe/pdf/rpb/v16n1/a18v16n1 http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/productos_vitrina.php?c=315 https://www.google.com.pe/? gws_rd=ssl#q=introduccion+a+la+microbiologia+deL+suelo http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20ambiental/000introduccion%20micro%20aambient.htm
