UNIVERSIDAD
ANDRES BELLO
FACULTAD DE DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR BIO-035
GUÍA Nº 5: ORGANIZACIÓN SUBCELULAR
INTR ODUCCIÓ N
Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente debido a la agregación espontánea de moléculas. Las primeras células eran relativamente simples y pequeñas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron las células eucariontes, más grandes y de organización más compleja, que hoy forman parte de animales y plantas (Fig. 1 y 2). Por definición y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un núcleo que contiene la mayoría del ADN envuelto en una membrana. Esto deja al material genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas dentro de la célula.
Fig. 1: Célula Eucarionte animal
Fig. 2: Célula Eucarionte Vegetal
El Núcleo (Fig.3) es el organelo más grande de la célula y está separado del citoplasma por una envoltura nuclear compuesta por dos membranas; estas membranas aparecen perforadas por poros, a través de los cuales se lleva a cabo la comunicación con el citosol. El núcleo contiene todo el ADN cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su asociación con proteínas denominadas histonas.
Fig. 3: Núcleo.
El Retículo Endoplásmico (R.E.) (Fig.4) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas que se extienden a través del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la célula. La membrana del Retículo endoplásmico es una continuación de la membrana nuclear. Se especializa en la síntesis de lípidos y proteínas de membrana, así como también de materiales que están destinados a ser exportados de la célula. El Retículo endoplásmico rugoso (R.E.R.) está asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se encargan de la síntesis de proteínas. El Retículo endoplásmico liso (R.E.L.) está constituido por un sistema laberíntico de túbulos irregulares, ramificados que no contienen ribosomas y se encarga del metabolismo de lípidos.
Fig. 4: Esquema del retículo endoplásmico y microf otograf ía. Los Ribosomas (Fig.5) son grandes complejos de ARN y proteínas. Se componen de una subunidad mayor y una subunidad menor que se ensamblan para formar un complejo que se encarga de llevar a cabo el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Los ribosomas procariontes y eucariontes son muy similares y pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a membranas formando parte del retículo endoplásmico rugoso.
Fig. 5: Esquema del retículo endoplásmico con ribosomas y microf otograf ía.
Las Mitocondrias (Fig.6) son muy similares a las bacterias tanto en tamaño como en forma. Poseen dos membranas una externa y otra interna, que dan lugar a dos compartimentos, el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Las Mitocondrias contienen su propio ADN, sintetizan proteínas y pueden dividirse en dos, por lo que se cree que provienen de la simbiosis de una célula eucarionte primitivo con un organismo procarionte. Este organelo es responsable de los procesos de respiración celular y producción de energía.
Fig. 6: Mitocondria.
Los Cloroplastos (Fig.7), al igual que las mitocondrias, contienen su propio ADN y también tendrían un origen simbiótico. Se encuentran sólo en los organismos capaces de realizar fotosíntesis, como las algas verde-azules y las plantas. Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y están rodeados de una membrana doble. Los cloroplastos están compuestos por la envoltura, estroma y los tilacoides.
Fig. 7: Cloroplasto.
El Aparato de Golgi (Fig.8) está constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoprotéicas. Se encarga de la modificación, destinación, y empaquetamiento de macromoléculas de secreción o que están destinadas a otros organelos. Alrededor de él se encuentran numerosas vesículas pequeñas que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de la célula.
Fig.8 : Aparato de Golgi. Los Lisosomas son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas requeridas para la digestión de moléculas al interior de la célula. De este modo, estas enzimas se mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradación de moléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Los Peroxisomas también corresponden a vesículas. En ellas se produce peróxido de hidrógeno (H2O2) durante la oxidación de varios tipos de moléculas. Esta sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada del resto de los componentes de la célula. El Citoesqueleto está constituido por filamentos de proteínas que forman un enrejado en el citoplasma. Esta red de filamentos está formada por los microtúbulos, filamentos de actina y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la célula su forma y provee la base de sus movimientos. Generalmente se organiza desde una región cercana al núcleo donde se encuentran los centríolos y desde ahí se extiende al resto de la célula. La Membrana Plasmática (Fig.9) es la envoltura externa de la célula. Corresponde a una bicapa continua de fosfolípidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas proteínas integrales y periféricas. Algunas de estas proteínas sirven como bombas y canales para el transporte de moléculas hacia el interior de la célula, así como hacia el exterior de ella.
Fig. 9: Membrana plasm ática.
Aunque técnicas avanzadas como la Microscopía Electrónica permiten una visualización detallada de la estructura de la célula, esto no es suficiente para definir la función de sus componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la célula para realizar estudios bioquímicos que permitan determinar la función exacta de cada uno de ellos.
Objetivo General del laboratorio. Comprender el fundamento de la técnica de fraccionamiento subcelular por medio del rompimiento de la célula y la separación de los o rganelos mediante un campo gravitacional.
FRACCIONAMIENTO
SUBCELULAR
Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula basándose en su tamaño y densidad. El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenización de la muestra. Esto se logra a través de diferentes procedimientos como sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), shock osmótico, o simplemente moliendo las células en homogenizadores mecánicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la membrana plasmática y el retículo endoplásmico, los que quedan formando pequeños fragmentos o vesículas que dan origen a la fracción microsomal. El resto de los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas) permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de la función de cada organelo celular por separado. La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u homogenizado y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso, la cual se realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que los componentes de la célula se separan en un campo gravitatorio. “
“
”
”
Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto si la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentación también aumentará. Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrífugas (Fig.10). Estos instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotación. Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet y sobre él una parte líquida llamada sobrenadante.
Fig. 10: Esquema de una centrífuga. Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a baja velocidad a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las partículas subcelulares más grandes; los núcleos. Así, el primer pellet obtenido corresponde a una fracción enriquecida en núcleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en suspensión. El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se re-centrifuga a alta velocidad obteniéndose un pellet enriquecido en membrana plasmática y retículo endoplásmico (fracción microsomal). Una última centrifugación del sobrenadante anterior a velocidades aún mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando en el sobrenadante sólo la porción soluble del citoplasma, el citosol.
Fig. 11. Esquema de un fraccionamiento subcelular típico. Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con soluciones de sacarosa, polímeros o proteína. Permiten realizar el proceso de separación en gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayor grado de pureza. Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evalúa mediante el análisis de la presencia de algunos componentes celulares en las diferentes fracciones obtenidas. Estas moléculas son llamadas marcadores celulares. Por ejemplo, el ADN es un marcador de la presencia de núcleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias, y el proceso de fotosíntesis indica la presencia de cloroplastos. De este modo, el análisis de la distribución de los diferentes marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite conocer la distribución y pureza relativa de los distintos organelos, y el nivel y calidad de los comp onentes contaminantes de cada fracción. La obtención de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma relativamente específica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos particulares, aislándolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se puede estudiar la síntesis de proteínas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el transporte de sustancias a través de la membrana plasmática, la fotosíntesis en cloroplastos, el procesamiento de glicoproteínas en el aparato de Golgi, etc.
ACTIVIDADES
PRÁCTICAS
ACTIVIDAD Nº 1: Fraccionamiento subcelular
A) Fraccionamiento Subcelular de Hígado: El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptu ra u homogeneización y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. La etapa de ruptura y homogenización de la muestra se realiza utilizando un homogenizador. Se debe considerar que durante este procedimiento el tejido fresco a fraccionar se debe mantener en una cantidad adecuada de solución tampón, la que permite conservar la integridad de los organelos. El fraccionamiento o separación de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de su densidad y tamaño. Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobr enadan te que corresponde a la fracción líquida que permanece sobre el material sedimentado. Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, éstos se resuspenden y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que los sobrenadantes se vuelven a centrifugar. Todo el proceso se realiza en frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las estructuras celulares y así conservar intactas la mayor parte de las características funcionales originales del organelo que se pretende aislar.
Procedimientos y observaciones Sus profesores prepararán un homogenizado filtrado, el cual se obtendrá de la siguiente manera:
A.1. Preparación y fraccionamiento de la muestra.
Muestra: hígado de pollo, lavado con suero fisiológico frío 3 veces para eliminar restos de sangre. Picar el hígado, adicionar 100 ml de suero y homogenizar el tejido utilizando el ULTRA- TURRAX. En esta etapa de obtiene el Homogenizado Total (HT) Filtrar el HT a través de gasa posicionada s ob re un embudo de vidrio. Recibir en un vaso precipitado de 200 ml y mantener en hielo. El homogenizado obtenido post-filtración se denomina homogenizado crudo HC.
Mantener el HC en hielo y repartir un volumen de 10 ml a cada grupo de trabajo. Guardar 1mL de HC en un tubo eppendorf de 1,5mL y conservar en hielo. Centrifugar los 9 mL restantes a 600 g (2500 RPM aprox) por 10 minutos a 4ºC. Transferir el sobrenadante 1 a tubo de centrifugación y resuspender el pellet 1 (Fracción Nuclear) con 5 ml de suero frío, conservar en frío. Centrifugar el sobrenadante 1 a 7000 g (6000 RPM aprox) por 20 minutos a 4ºC. Transferir el sobrenadante 2 a tubo de centrifugación y resuspender el pellet 2 (Fracción Mitocondrial) con 1 ml de suero frío, conservar en frío. Centrifugar el sobrenadante 2 a 7000 g (6000 RPM aprox) por 20 minutos a 4ºC. Guardar el sobrenadante 3 (Fracción Miscrosomal) y eliminar el pellet conteniendo Recordar: Minimizando la exposición al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porción mitocondrial por largo tiempo. Por lo tanto tape con parafilm sus tubos hasta su evaluación. A 4ºC se minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas. Por lo tanto mantenga sus tubos en hielo todo el procedimiento. Marque adecuadamente sus tubos para evitar confusión.
A.2.1. Observación microscópica de las fracciones
En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensión de núcleos P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparación al microscopio usando para ello el objetivo de 40X Prepare una nueva muestra de núcleos como lo realizó anteriormente, pero antes de colocar el cubreobjetos adicione una gota de azul de tripán sobre los núcleos. Observe su muestra al microscópio con el objetivo 40X. ¿Qué observa?
Realice un dibujo esquemático de los núcleos antes y después de la tinción. Cada dibujo debe ser realizado dentro de un círculo de 8cm de diámetro, indicando a un costado de éste, título de muestra; tipo de muestra (temporal o permanente); tinción; aumento objetivo; aumento total y observaciones. Anote los nombres de las estructuras identificadas
A.2.2 Evaluación del marcadoresmoleculares.
fraccionamiento
subcelular
mediante
Cada organelo contiene enzimas o moléculas que lo caracterizan, las que no se encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos. El ADN es la molécula marcadora de núcleos. Esta macromolécula puede ser identificada mediante colorantes básicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul de tripán, azul de toluidina y azul B. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato deshidrogenada (SDH) que cataliza la deshidrogenación estéreo específica de Succinato a Fumarato durante el ciclo de Krebs, según la siguiente reacción:
SDH Succinato --------------> Fumarato + 2 H+ + 2 eLos protones y electrones liberados permiten seguir la reacción a través de la decoloración del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fácilmente ser oxidado por el oxígeno del aire, y recobrar su coloración azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reacción con aceite mineral o vaselina líquida, lo que permite realizar la reacción en ausencia de oxígeno.
Procedimientos y observaciones . Detección de mitocondrias a través de reacción de SDH en las fracciones. Separe 5 tubos de ensayo, rotúlelos en forma adecuada y colóquelos en hielo de manera que estén fríos. Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan según el siguiente esquema:
Nº
Muestra
1 2
Blanco
3 4
5
Homogenizado Crudo (HC) Fracción Nuclear (FN) Fracción Mitocondrial (FMit) Fracción Microsomal (FMic)
Succinato 0,1M 1mL 1mL
Azul de Metileto 1mL 1mL
Agua Destilada 1mL 1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
HC
FN
FMit.
FMic .
Observaciones, reacción (+) ó (-)
1mL 1mL 1mL
1mL
Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 200 uL de aceite mineral o vaselina líquida. Luego de agregar la vaselina, NO agite nuevamente el tubo. Coloque los tubos en un baño termorregulado a 37º C y observe si ocurre decoloración en algunos de los tubos (5-10 min).
BIBLIOGRAFIA Biología Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires.
Biología Celular y Molecular. Lodish ycol. (2002) 4 Edición, Ed. Panamericana. °
Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 2: Estructura y Función Celulares. Métodos de Estudio en Biología Celular. Fraccionamiento Subcelular. López, R. 1 ed., 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. ª
Molecular Biology of de Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson. 3ra ed., 1994, Garland Publishing Inc. , New York & London.
The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press, Washington, U.S.A. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Christian Frezza, Sara Cipolat & Luca Scorrano. NATURE PROTOCOLS VOL.2 NO.2. 2007.
Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular 1. Para el homogenizado Higado de pollo Pinzas. Bisturí. Tijeras. Homogenizador. Embudo. Gasa. Centrifuga. Hielo. Buffer IBc
2. Para el laboratorio ( p/g = por grupo de 3 alumnos) 3 Microscopios. Corte de hígado de rata Porta objetos. Cubreobjetos. 1 Lápiz rotulador
Centrifuga. Baño termorregulador. Hielo 2 gotarios. (p/g) 8 tubos de ensayo (p/g). Gradilla para tubos de eppdenf 1 baso precipitado de 50 ml (p/g). Azul de Metileno diluido 50 veces del stock. Succinato 0.1 M. H2O destilada. (picetas). Azul de tripan. Aceite mineral o vaselina. Tubos Falcon 15 mL para centrifuga (5 p/g) tubos eppdendorf 2 mL (5 p/g) Tubos eppdendorf 1.5 mL (5 p/g) Puntas de pipeta para 1 mL Puntas pipeta 200 uL
