UNIVERSIDAD ANDRES BELLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR PROFESORES: Macarena Kayser Francisco A. Duarte Olave
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: Organización Subcelular
Sección: Bio 131-18 Integrantes: Carolina Cruz Amandy Espinoza Ignacio Faúndez Randy Oñate
Introducción Los seres vivos nos encontramos formados por pequeñas estructuras básicas. Estas son las células, las unidades morfológicas y funcionales más básicas y fundamentales de la materia viva. Existen dos tipos, unas más simples y primitivas llamadas células procariontes que forman dos dominios en la naturaleza, denominados Eubacterias y Archaea y nos muestran lo más esencial de la vida. Y otras células llamadas Eucariontes que son mucho más complejas y con una estructura mucho más organizada y que pueden vivir una independiente de otras células o se pueden encontrar en agrupaciones, formando organismos multicelulares. Estas tienen propiedades fundamentales, que en conjunto y organizadas, cumpliendo con funciones especializadas como metabolismo, flujo de información genética, homeostasis, etc. para el correcto trabajo de los complejos sistemas que nos forman. Permitiendo así, el sustento de las necesidades más básicas y vitales en cada organismo. Los principales métodos utilizados para el estudio de las células se encuentran basados en la microscopia, la cual es una herramienta esencial para examinar tales estructuras, que con el pasar de los años y los avances de la ciencia se ha ido complementando con nuevas tecnologías para estudios más acabados. Habitualmente pueden conseguirse diferentes tipos celulares a partir de la disgregación de los tejidos en los que se encontraban, purificarse y obtener como resultado diferentes tipos celulares individuales que pueden ser cultivadas y desarrollarse fuera de estos. Más aún, podemos fraccionar éstas células y aislar cada uno de sus orgánulos hasta tener muestras puras de ellos; como también de los constituyentes macromoleculares que se encuentren. Esto último puede ser realizado mediante un proceso llamado centrifugación el cual permite obtener estructuras subcelulares sin perder las funciones que los caracterizan; comienza con la disgregación de una muestra que tiene diferentes maneras de realizarse: shock osmóticos, vibraciones ultrasónicas o moliendo las células en homogenizadores mecánicos. Provocando el rompimiento de las membranas y consiguiendo un homogenizado o lisado que luego es sometido a repetidas centrifugaciones con velocidades gradualmente mayores que fraccionarán los extractos celulares en sus componentes. Con este tratamiento se irá separando cada tipo de organelo según el tamaño y densidad que tenga; donde mientras menor sea el tamaño del componente subcelular mayor será la fuerza centrífuga requerida para conseguir la sedimentación. Posteriormente los pellets obtenidos pueden complementarse a marcadores moleculares que reaccionan frente a enzimas o moléculas propias de cada compartimiento subcelular. Para ahondar mucho más en las propiedades y características de las células presentamos el actual informe; donde nos dedicaremos al análisis de las células eucariontes, a partir de muestras realizadas en el laboratorio donde se aplicó la técnica, ya mencionada, enfocada en la identificación de estructuras internas de la célula, conociendo de forma mucho más cercana orgánulos como también constituyentes macromoleculares, y tales resultados han sido comparados y 1 complementados con otras fuentes científicas. Obejtivos: Entender y aplicar el método de fraccionamiento celular como también identificar organelos celulares con tinción y sin tinción. Entender las reacciones de los marcadores celulares y por ultimo aprender a utilizar el objetivo de inmersión. 1
Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introducción a la Biologia Celular 2004, Editorial Panamericana, 2ª edición, Estados Unidos. Pp. 147-174
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ateriales y métodos
Primero se recibió un homogenizado filtrado de hígado de Rattus Norvegicus realizado por las docentes previamente. Luego se procedió a la homogenización mecánica ( usando un aparato llamado ultra turax). Luego de realizado el homogenizado se prosiguió a filtrar la muestra 2 veces y mezclarla con Buffer IBC para la protección de organelos. Todo esto, manteniendo los materiales a 4 °C. Ya obtenido el filtrado se repartió 10 ml del filtrado a cada grupo en un tubo falcon para una centrifugación de 10 minutos. . Luego de realizada la primera centrifugació se obtuvo el pellet 1 (P1) correspondiente a nucleos sedimentados, el P1 de dejo en 1 ml de buffer IBC en hielo para el análisis. El sobrenadante del P1 se transfirió a otro tubo falcon y se centrifugo por 25 minutos obteniendo un sedimento mezclado con 1 ml de buffer IBC, obteniendo de esta manera el pellet 2 (P2), correspondiente a la fracción mitocondrial. El sobrenadante del P2 se transfirió a un tercer tubo falcon obteniendo asi la fracción microsomal (S2). En la actividad numero 1 se observaron mediante microscopios las muestras de P1 y P2. Esto se realizo colocando una gota de cada muestra usando una micropipeta para después colocarle encima un cubreobjeto. Cada pellet se observo sin tinción y con tinción de azul de tripan con un amento objetivo de 40x. En la actividad b) de la actividad 1, se trato de la identificación de la enzima Succinato desidrogenasa en distintas muestras. Este experimento se realizo colocando distintas especies en 4 tubos de ensayos para después colocarlos 15 minutos en baño maria a 37 °C y su posterior evaluación. Por ultimo la actividad numero 2 se trato en la observación de una muestra permanente de higo de Rattus Norvegicus usando el obetivo de inmersión, observándolo en diferentes aumentos.
En la actividad 1-b) se compararon diferentes muestras para reconocer la presencia de mitocondrias a través de la enzima Succinato Succinato ³³³SDH³ Fumarato + 2H+ + 2eLas muestras utilizadas son mostradas en la tabla N°1
Tabla N° 1
N°
Tubo
Succinato Azul de 0,1M metileno 1ml 2gotas 1ml 2gotas
Agua destilada 1ml 1ml
1 2
Blanco fracción nuclear
3
fracción mitocondrial
1ml
2gotas
1ml
4
fracción microsomal
1ml
2gotas
1ml
fracción nuclear
fracción fracción mitocondrial microsomal
1ml 1ml 1ml
Actividad Nº 2: Observación de un corte de hígado de Rattus norvegicus (Berkenhout) utilizando el objetivo de inmersión. En esta actividad observamos una muestra de un corte de hígado de Rattus norvegicus, la cual partimos observando con el objetivo de 4X para enfocar la parte a observar de la muestra, luego antes de poner el objetivo de inmersión, pusimos cuidadosamente una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos de la muestra observada y tras esto procedimos a poner el objetivo de 100X de manera en que quedara inmerso en el aceite para obtener un aumento de 1000X (ya que el aumento del ocular es de 10X) y regulando el enfoque con el micrométrico, poder observar claramente la muestra.
Resultados Actividad 1: Obervacion de pellets obtenidos con y sin tinción -Muestra: Núcleos Centrifugados -Tinción: Sin tinción. -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.
Resultados: Se observan nucleos en suspensión, también se observ una burbuja de grandes proporciones.
-Muestra: Núcleos Centrifugados -Tinción: Con tinción azul de tripan -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.
Resultados: Se logran dif erenciar óptimamente los núcleos, pero la solución acuosa se ve transparente. Se Pueden divisar movimi entos de las estructuras y se puede dif erenciar una notabl e distinción en
su coloración. Mediante el ADN, que es la macromolécula que se tiñe con el azul de Tripán, podemos dif erenciar los núcl eos. Pudimos identificar también restos de tejidos que se dif erencian de los núcleos.
-Muestra: Mitocondria Centrifugados -Tinción: Sin tincion -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.
Resultados: Se aprecia la muestra enriquecida en mitocondrias.
-Muestra: Mitocondria Centrifugados -Tinción: Con tinción azul de tripan -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.
Resultados: Aun no se puede lograr ver la mitocondrias con claridad ya que este coloide no puede colorarlo y solo se aprecia los núcleos por una mala separación del pellet con el sobrenadante, como se puede apreciar en la figura
Actividad 1-b): Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares Después de sacar los tubos de ensayo del baño María no se logro tener ninguna diferencia aparente ya que las muestras quedaron tal cual lo aviamos dejado. Este resultado puede ser debido a que la concentración fue muy pequeña y/o una mala manipulación de separación de las subunidades, por no incolorarce la muestra de mitocondrias.
Imagen de los tubos usados en la actividad. La rotulación corresponde al numero de tubo correspondiente a la tabla adjuntada en materiales y métodos.
Actividad Nº 2: Observación de un corte de hígado de Rattus norvegicus (Berkenhout) utilizando el objetivo de inmersión. Al comparar la imag en obtenida con el ob jetivo de 40X con la obtenida con el ob jetivo de 100X, este ultimo nos permitió visualizar células qu e con un aum ento menor no era posible visualizar,
pudimos obs ervar claramente marcados de color rosa las células d el hígado, con sus r espectivos núcl eos marcados de un color morado.
iscusión
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Actividad 1-a) Los resultados obtenidos en la primera 1ª actividad fueron los esperados ya que fue posible realizar de manera correcta la centrifugación de la homogenización del hígado de Rattus Norvegicus obteniéndose pellet de núcleos, mitocondrial y microsomal además de sus respectivos sobrenadante. En la actividad 1b los resultados obtenidos fueron los esperados ya que fue posible ver el pellet de núcleos con tinción de azul de tripan de manera correcta en un objetivo de 40x. En cambio con el pellet de mitocondrias con tinción de azul de tripan, estos no pudiendo ser observados de manera clara ya que este coloide no pudo colorarlo y solo fue posible observar algunos restos de núcleos debido a una mala separación del pellet con el sobrenadante. Según las actividades realizadas se logro comprender las etapas de la fragmentación subcelular en la cual debe se a grandes rasgos debe romperse las membranas celulares para lograr la separación de los organelos de la célula, para su luego la separación mediante la técnica del centrifugado donde se aumenta la fuerza de gravedad y se acelere la sedimentación según la densidades de los diferentes compuestos, como por ejemplo los núcleos son los primeros organelos en sedimentar ya qu e poseen el mayor peso, y los ribosomas son las ultimas en sedimentar debido a su peso bajo molecular, que en esta actividad no se extrajo de manera pura ya que mantuvo en la sobrenadante microsomal ya que se obtuvo en una tercera centrifugado mitocondrias como p ellet final. Las actividades realizadas y sus resultados esperados, no fueron conseguidas por nosotros ya que después de la fragmentación y la centrifugación fueron separados de mala manera 2 por el estudiante a cargo, no siguiendo los pasos a seguir adecuadamente
Actividad 1-b) En la primera centrifugación que se llevo a cabo se obtuvo un sedimento que corresponde a trozos de membrana y a los núcleos de las células del hígado de rata, esto se debe a que el núcleo es el organelo mas pesado de la célula. Luego el sobrenadante que se volvió a centrifugar a una velocidad más alta se extrajo otro pellet que corresponde a la fracción mitocondrial. Esto es producto del menor peso de las mitocondrias con respecto al núcleo. Estas muestras de pellet fueron aisladas y se agrego Buffer IBC para mantener aislados los organelos. Las muestras se mantienen durante todo el proceso en un medio frio (4°C) con el fin de minimizar la activación del daño generado por las fosfolipasas y proteasas.
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Universidad Andrés Bello, Guía N°5: Organización Subcelular, Curso Bio 131-18, Biología C elular 2011
En este procedimiento se observaron cuatro tubos, los cuales contenían distintas soluciones con el fin de evaluar el fraccionamiento. La solución de Succinato Deshidrogenasa se usa para identificar mitocondrias ya que el Succinato, proteína que interviene en el ciclo de Krebs, característico de las mitocondrias, al estar en reacción con la Succinato deshidrogenasa, esta ultima cataliza la deshidrogenación del Succinato y lo convierte en Fumarato, un alqueno. En una muestra rica en mitocondrias y tinción de azul de metileno, lo cual en un principio es de color azul, al entrar en contacto con el succinato a una temperatura de 37°C, que es la temperatura corporal de un ratón y la temperatura en la cual las mitocondrias actúan con mayor eficiencia, al haber pasado 45 minutos se observa que la muestra se torna transparente producto de la reacción del Succinato de las mitocondrias y la Succinato deshidrogenasa que se agregó a la muestra. En los tubos que preparamos para observación se observó cambios positivos solo en el tubo 3, lo cual era de esperar debido a que era una preparación rica en mitocondrias. El uso de vaselina liquida en los tubos se debe a que el azul de metileno reducido puede fácilmente ser oxidado por oxigeno del aire, y recobrar su coloración azul intensa, es por esto que se cubre el medio de reacción con la vaselina para que la reacción se lleve a cabo en ausencia de oxigeno.
Actividad 2 El mayor aumento obtenido se explica porque A diferencia del aire, el aceite de inmersión3 tiene un índice de refracción similar al del vidrio del cubre objetos y Al colocar aceite de inmersión entre el lente frontal del objetivo (diseñado p ara usarse con aceite de inmersión) y el cubre objetos, el rango angular de los rayos difractados capturados por los lentes se incrementan y, en efecto, incrementa el aumento y resolución del objetivo permitiéndonos visualizar muestras mas pequeñas. 4
Las células del hígado que observamos se llaman hepatocitos , participan de la biosíntesis proteica, y del almacenamiento de carbohidratos (glucógeno) y proteínas, también de la síntesis del colesterol, fosfolípidos y sales biliares. Cumplen también una función de desintoxicación, modificación y excreción de sustancias exógenas, y el inicio de la secreción de bilis.
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http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite _de _inm ersion.htm http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/h epatocitos.html
Bibliografía 1-Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introducción a la Biologia Celular 2004, Editorial Panamericana, 2ª edición, Estados Unidos. Pp. 147-174 2-Universidad Andrés Bello, Guía N°5: Organización Subcelular, Curso Bio 131-18, Biología Celular 2011 3-http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm 4-http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/hepatocitos.html
