FIJADORES COMPUESTOS: En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de complementar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. Fleming , mezcla cromo-osmio-acética a) Líquido de Fleming cromo-o smio-acética..
b) Líquido de Zenker , mezcla bicromato-sublimado-acétic bicromato-sublimado-acética. a.
Trata de combinar los efectos favorables del sublimado y del dicromato potásico. En la práctica habitual ha sido sustituido por B5. Su empleo ha quedado prácticamente restringido restringido al proceso de refinación-decalcificación a que son sometidas las biopsias de médula ósea cuando se realiza una fijación inicial con B5. Se la puede emplear para la preservación de componentes ricos en sangre y para la realización de métodos tricrómicos y coloración de miofilamentos.
Preparación: SOLUCIÓN STOCK DE ZENKER………………………………95.0 ZENKER………………………………95.0 ml. Cloruro de mercurio 12.5 gr Dicromato de potasio 6.3 gr Sulfato de sodio 2.5 gr Agua destilada 250 ml
ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………… GLACIAL……………………………………..… ……..… 5.0 ml.
El ácido acético reacciona con el dicromato y hace que la solución se oscurezca progresivamente, por lo que debe recomponerse antes de su uso. El tiempo de fijación puede ser mas prolongada que con la solución de b5 porque el ácido acético que contiene, produce un excesivo endurecimiento. Pero no se deben sobreasar las 48 horas. Tras la fijación el material debe ser tratado con sulfato sódico al 5% durante 1-2 horas.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
Solución muy usada como alternativo a la formalina cuando queremos fijar ciertos Tejidos como piel órganos endocrinos, testículos y tejido embrionario en general. Sin embargo no está fijado para la fijación de biopsias renales sobre los cuales provoca una severa distorsión. Preparación: - SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁC. PÍCRICO (ÁC. PÍCRICO AL 1- 2% EN AGUA DESTILADA)……..750 D ESTILADA)……..750.0 .0 ml.
FORMALINA CONCENTRADA………………………250.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………….50.0 ml. PH. FINAL…………………………………………………2.2 TIEMPO DE FIJACIÓN……………………………..2 a 24 horas
e) Líquido de Bouin-Hollander ,
es una variante del liquido de Bouin especialmente indicado para la fijación de los cilindros de biopsia de médula ósea cuando no es posible controlar el tiempo de fijación de la muestra en éste líquido, la conservación, puede incluso conservar las 48 horas sin que se produzca excesivo endurecimiento. Preparación: ACETATO NEUTRO DE COBRE………….……………2.5 gr. ÁC. PÍCRICO……………………………………………..4.0 gr. FORMALINA CONCENTRADA……………………....10.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………….……….1.5 ml. AGUA DESTILADA…………………………………..100.0 ml. Para preparar la solución se disuelve primero la sal de cobre en el agua destilada luego se añade el ácido pícrico y tras filtrarlos el formol y el ácido acético glacial. Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente el tiempo de fijación oscila entre 48-72 horas y sigue las mismas precauciones que el líquido de Bouin
f) Liquido de Duboscq-Brasil , o Bouin alcohólico.
Es una alternativa de líquido de Bouin cuando la pieza que se debe fijar es relativamente voluminosa porque posee una velocidad de penetración mucho mas elevada. Se utiliza también cuando se precisa una fijación específica de sustancias hidrosolubles como el glucógeno ya que evita su disolución. Preparación:
ALCOHOL ETILICO 80%...............................................75.0 ml. ÁC. PÍCRICO………………………………………………0.5 gr. FORMALINA CONCENTRADA………………...……..30.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………..….7.5 ml.
Mezclar antes de usar el tiempo medio de fijación para fragmentos con un espesor en torno a 5 milímetros es de 2 a 3 horas.
g) Liquido de Gendre,
Es una variación que está especialmente diseñada para la fijación del glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina. Preparación:
SOLUCIÓN SATRUADA DE ÁC. PÍCRICO EN ALCOHOL ETÍLICO AL 70%.....................................80.0 ml. FORMALINA CONCENTRADA………………………...15.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL………………………………….7.5 ml. El tiempo de fijación oscila entre 1 y 4 horas. Tras acabar el proceso debe realizarse sucesivamente 2 lavados cortos en etanol al 80, 95 y 100º h) Liquido de M üller,
Es la disolución acuosa de un fijador simple de dicromato potásico con la adición de sulfato sódico su importancia actual radica en que se emplea para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Preparación:
DICROMATO POTASICO…………………………………2.5gr. SULFATO SÓDICO………………………………………..1.0 gr.
AGUA DESTILADA ……………………………………100.0 ml. Tiempo de fijación 4 y 8 horas. Tras la fijación es necesario lavar abundantemente en agua corriente durante unas horas.
g) Liquido de Orth,
Hoy día se emplea exclusivamente en ciertas técnicas de fijación de tejido nervios. Preparación:
Solución stock de Orth: idéntica a la composición del fijador de Müller. Solución de trabajo: en el momento de su uso se mezclan: SOLUCIÓN STOCK………………………………..90.0 ml.
FORMULINA CONCENTRADA………………….10.0 ml.
El tiempo de fijación de tejido nervioso es de 48 horas y tras el proceso de fijación los tejidos han de ser lavados abundantemente en agua y almacenados en alcohol etílico al 70%
g) Liquido de Carnoy,
Es el mejor fijador conocido para el glucógeno y en general, para los hidratos de carbono simples y para proteínas fibrilares y sobre todo miofibrillas, su acción fijadora es extremadamente rápida deshidratando el tejido al mismo tiempo, sin embargo produce una excesiva retracción mística y una hemólisis m asiva de eritrocitos así como una pobre conservación estructural del ADN. Fórmula que penetra muy rápidamente y tiene aplicación en citología para la coloración de ácidos nucleicos. Está compuesta por:
ET ANOL ABOSLUTO…………………………………………..60.0 ml. CLOROFORMO………………………………………………….30.0 ml. ÁC. ACÉTICO GLACIAL………………………………………..10.0 ml. El tiempo de fijación puede ser acortado hasta 3 horas. Las muestras deben cambiarse directamente a alcohol etílico absoluto. El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado la deshidratación en alcohol, para prevenirlo se puede sustituir el etanol por metanol en la composición de líquido fijador, que además provoca menor retracción tisular, y para conservar la pieza se deposita en alcohol etílico absoluto. g) Liquido de Clarke, Se utiliza en citología exfoliativa. Provoca buena fijación de ácidos nucleicos y es muy empleada para la impregnación argéntica de NOR. Si se desea colorear el ARN con la técnica de Brachet (verde de metil-pironina) se debe agregar 30 ml de cloroformo por cada 70 ml de solución stock. preparación: Etanol absoluto 60 ml Acido acético 20 ml
Solución de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly): Ambas mezclas son en
esencia casi idénticas. La denominación B5 corresponde en realidad a una modificación de la de Zenker. La solución de Zenker-formol contiene dicromato potásico y sulfato sódico. La mayor utilidad de estos fijadores es que mejoran considerablemente la tinción nuclear, de hecho la fijación en una mezcla que contenga sublimado es hoy día prácticamente imprescindible para el diagnóstico morfológico en las patologías del sistema linfoide y hematopoyético. Es debido a la gran importancia que se da a la observación de finos detalles nucleares como es la presencia o no de hendiduras o repliegues nucleares y del nucleolo para catalogar un tumor maligno de ganglios
linfáticos, o de médula ósea (leucemias) como de alto o bajo grado de malignidad y por tanto recomendar la terapéutica más oportuna. Además estas soluciones B5 zenker formol son los fijadores de elección para el riñón, hígado, fibras de tejido conectivo y para fibrina. Se prefiere la solución de B5 porque al no contener dicromato, esto permite una mejor conservación de la cromatina nuclear y de la estructura antigénica tisular. Solución de 35: *Solución stock de B5 : Esta mezcla es estable durante bastante tiempo pero concentrado en frasco opaco y oscuridad. CLORURO MERCÚRICO...………………………………… 12.0 gr. ACETATO SÓDICO...………………………………………….2.5 gr. AGUA DESTILADA C.S.P…………………………………….200 ml. *Solución de trabajo de B5 : Esta solución es inestable debido a que el formaldehído reduce el sublimado a cloruro mercurioso y mercurio metálico que se depositan en forma de un precipitado blanco grisáceo, por este motivo y por el elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado, el tiempo de fijación no debe superar las 4 horas. Además el espesor máximo de las muestras no debe superar los 4 mm debido al escaso poder de penetración de la mezcla fijadora. Debido a la aparición de precipitados mercúricos sobre los tejidos las secciones histológicas antes de ser coloreados. Han de ser sometidas a un tratamiento específico mediante soluciones que eliminan estos depósitos. Tras la fijación los tejidos se pueden conservar indefinidamente en alcohol etílico al 70-80% - SOLUCIÓN STOCK DE B5…………………………………20.0 ml. - FORMALINA CONCENTRADA ………………………….…2.0 ml. Solución de Zenker-Formol Eliminación del pigmento mercúrico: *Solución stock de Zenker:
- CLORURO MERCÚRICO………………………………………5gr. - DICROMATO POTÁSICO……………………………….…..2.5 gr. - SULFATO SÓDICO ……………………………………………1 gr. - AGUA DESTILADA C.S.P. ……………………..………..100.0 ml. * Solución de trabajo: en el momento de su uso mezclamos:
- SOLUCIÓN STOCK DE ZENKER…………………………..95 ml. - FORMALINA CONCENTRADA……………………………...5 ml. Tanto para la solución almacenada como para la de trabajo deben guardarse las mismas precauciones que para la de B5 Eliminación del pigmento mercúrico o deszenkerización: Se realiza tratando las secciones histológicas antes de su coloración con soluciones yodadas y utilizamos: *Solución de LUGOL:
- YODURO POTÁSICO…………………………………………..2gr.
- CRISTALES DE YODO ………………………………………..1gr. - ALCOHOL ETÍLICO 70-80%................................................100 ml. *Solución de tiosulfato sódico:
- TIOSULFATO SÓDICO………………………………………..5gr. - AGUA DESTILADA………………………………………...100ml. Después de la desparafinación hay que tratar los cortes durante diez minutos con la solución yodada a continuación lavar bien en agua destilada después decolorar durante dos minutos en la solución en agua corriente durante 10 minutos antes de realizar la coloración. Aquellas que no contienen formol:
