LAPORAN RESMI PERCOBAAN FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL PERCOBAAN II ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI
Disusun oleh: Kelas : C
Golongan : IV
Kelompok : 3
Febri Wulandari
FA/09284
………………..
Anggita Tyaswuri
FA/09305
………………..
Naisbitt Iman Hanif
FA/09308
………………..
Candra Kirana M.
FA/09311
………………..
Lusy Andriani
FA/09314
………………..
Asisten Jaga
: Yolanda dan Christine
Asisten Ko Koreksi
: Yo Yolanda
LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGI
BAGIAN FARMAKOLOGI DAN FARMASI KLINIK FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2013 PERCOBAAN II ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI
I. TUJUAN
Agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah analisis obat di dalam cairan hayati.
II. DASAR TEORI TEORI
Untuk memberikan efek biologis, obat dalam bentuk aktifnya harus berinteraksi dengan reseptor atau tempat aksi atau sel target dengan kadar yang cukup tinggi. Sebelum mencapai reseptor, reseptor, obat terlebih dahulu dahulu harus melalui proses farmakokinetik farmakokinetik.. Fasa farmakokinetik farmakokinetik meliputi proses fasa II dan fasa III. Fasa II adalah proses absorpsi molekul obat yang menghasilkan menghasilkan ketersediaan ketersediaan biologis obat, yaitu senyawa aktif dalam cairan darah yang akan didistribusikan ke jaringan atau organ tubuh. Fasa III adalah fasa yang melibatkan proses distri distribus busi, i, metabo metabolism lismee dan ekskre ekskresi si obat, obat, yang yang menent menentuka ukan n kadar kadar senyaw senyawaa aktif aktif pada pada kompartemen tempat reseptor berada. Faktor-faktor penentu dalam proses farmakokinetik antara lain: 1. Sistem kompartemen kompartemen dalam dalam cairan cairan tubuh, tubuh, seperti seperti cairan intrasel, intrasel, ekstrasel ekstrasel (plasma (plasma darah, darah, cairan interstitial, interstitial, cairan cerebrospinal ) dan berbagai fasa lipofil dalam tubuh. 2. Protei Protein n plasma plasma,, protei protein n jaring jaringan, an, dan berbag berbagai ai senyaw senyawaa biolog biologis is yang yang mungki mungkin n dapat mengikat obat. 3. Distrib Distribusi usi obat dalam dalam berbag berbagai ai sistem sistem kompar kompartem temen en biolog biologis, is, teruta terutama ma hubung hubungan an waktu dan kadar obat dalam berbagai sistem tersebut, yang sangat menentukan kinetika obat.
4. Dosi Dosiss sedi sediaa aan n obat obat,, tran transp spor ortt anta antarr komp kompar arte teme men n sepe sepert rtii pros proses es abso absorp rpsi si,, bioaktivasi, biodegradasi, dan ekskresi yang menentukan lama obat dalam tubuh (Siswandono, 1998). Konsent Konsentrasi rasi obat obat adalah adalah elemen elemen pentin penting g untuk untuk menent menentuka ukan n farmako farmakokin kineti etika ka suatu suatu individu maupun populasi. Konsentrasi obat diukur dalam sampel biologis seperti air susu, saliva, plasma dan urin. Sensitivitas, akurasi, dan presisi dari metode analisis harus ada untuk pengukuran secara langsung obat dalam matriks biologis. Untuk itu, metode penetapan kadar secara umum perlu divalidasi sehingga informasi yang akurat didapatkan untuk monitoring farmakokinetik dan klinik. Pengukuran konsentrasi obat di darah, serum, atau plasma adalah pendekatan secara langsung yang paling baik untuk menilai farmakokinetik obat di tubuh. Darah mengandung elemen seluler mencakup sel darah merah, sel darah putih, keping darah, dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk Untuk mendap mendapatk atkan an serum, serum, darah darah dibeku dibekukan kan dan serum serum diambi diambill dari dari supern supernata atan n setelah setelah disen disentr trif ifug ugasi asi.. Plasm Plasmaa dipe dipero role leh h dari dari supe supern rnat atan an dara darah h yang yang dise disent ntri rifu fuga gasi si deng dengan an ditambahkan antikoagulan seperti heparin. Oleh karena itu, serum dan plasma tidak sama. Plasma mengalir keseluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen seluler dari darah. Dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium dengan dengan jaringan, jaringan, perubahan konsentrasi obat akan merefleksikan merefle ksikan perubahan konsentrasi perubahan konsentrasi obat di jaringan (Shargel, 1988). Adapun kandungan protein dalam sampel biologis yang akan dianalisa menyebabkan dibutuhkannya suatu tahap perlakuan awal dan/atau penyiapan sampel sebelum penentuan kadar obat dapat dilakukan. Hal ini untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel yang diperoleh. Protein, lemak, garam dan senyawa endogen dalam sampel akan mengganggu penentuan kadar obat yang bersangkutan dan selain itu dalam hal analisa menggunakan metode seperti HPLC, adanya zat-zat tersebut dapat merusak kolom HPLC sehingga usia kolom menjadi lebih singkat. Berbagai Berbagai prosedur prosedur untuk mendenaturasi mendenaturasi protein protein dapat digunakan sebagai perlakuan perlakuan awal awal samp sampel el biol biolog ogis is yang yang dipe dipero roleh leh dari dari suat suatu u pene peneli litia tian n farma farmako koki kine neti tik, k, meli melipu puti ti penggunaan senyawa yang disebut sebagai zat pengendap protein (protein (protein precipitatin precipitating g agent) seperti asam tungstat, tungstat, amonium sulfat, asam trikoroaseta trikoroasetatt (tricloro acetic acid , TCA) asam perklorat, methanol dan asetonitril. Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi
protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperatur, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat dianta diantaran ranya ya bersifa bersifatt sebaga sebagaii amfote amfoter, r, yakni yakni memili memiliki ki 2 muatan muatan yang yang berlai berlainan nan dalam dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat s aat di pH tertentu, protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif). Hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap (Poedjiadi, 1994). Penetapan kadar obat dalam badan dapat dianalisi dari cairan hayati lain seperti urin, saliva, saliva, atau lainnya lainnya.. Urin Urin merupa merupakan kan cairan cairan hayati hayati yang yang biasan biasanya ya diperg diperguna unakan kan dalam dalam farmakokinetik untuk mempelajari disposisi obat dan menentukann kadar obat untuk obatobatan yang disekresikan urin. Minimal 10%-nya terdapat dalam urin dalam bentuk utuh yang belum dimetabolisme. Hasil analisis analisis dalam farmakokin farmakokinetika etika dinyatakan dinyatakan dalam parameter farmakokine farmakokinetika. tika. Parameter Parameter farmakokin farmakokinetika etika didefinisik didefinisikan an sebagai sebagai besaran yang diturunkan diturunkan secara matematis matematis dari dari hasil hasil penguk pengukura uran n kadar kadar obat obat atau atau metabo metabolit litnya nya di dalam dalam cairan cairan hayati. hayati. Parameter Parameter farm farmak akok okin ineti etika ka obat obat dipe dipero roleh leh berd berdas asark arkan an hasil hasil peng penguk ukur uran an kada kadarr obat obat utuh utuh dan dan metabolitnya. Terdapat tiga jenis parameter farmakokinetik, yaitu: 1.
Para arameter pokok •
Tetapan kecepatan absorbsi (Ka) Menggambarkan kecepatan absorbsi, yaitu masuknya obat ke dalam sirkulasi sistemik dari tempat absorbsinya (saluran cerna pada pemberian oral, jaringan otot pada pemberian intramuskular).
•
Cl (Klirens) Klir Kliren enss obat obat adal adalah ah suatu uatu uku ukuran ran elim elimin inas asii
obat bat dari dari tubu tubuh h tanp tanpaa
mempermasalah mempermasalahkan kan mekanisme mekanisme prosesnya. prosesnya. Umumnya, jaringan jaringan tubuh atau organ dianggap sebagai suatu kompartemen cairan dengan volume terbatas (volume distribusi) dimana obat terlarut di dalamnya (Shargel, 1988). Klirens
merupakan fartor yang memprediksi laju eliminasi yang berhubungan dengan konsentrasi obat. •
Volume distribusi (Vd) Volume distribusi adalah volume yang
didapatkan pada
saat obat
didistribusikan. Menghubungkan jumah obat dalam tubuh dengan konsentrasi obat (C) dalam darah atau plasma. 2.
Parameter Sekunder •
Waktu paruh eliminasi (t1/2) Merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mengubah jumlah obat di dalam tubuh menjadi setengah atau separuh selama eliminasi (atau selama infus yang konstan) (Katzung, 1997).
•
Tetapan kecepatan eliminasi ( K el ) Kecepatan eliminasi adalah fraksi obat yang ada pada suatu waktu yang akan tereliminasi
dalam
satu
satuan
waktu. Tetapan
kecepatan
eliminasi
menunjukkan laju penurunan kadar obat setelah proses kinetik mencapai keseimbangan (Neal, 2006). 3.
Parameter Turunan •
Waktu mencapai kadar puncak (t maks) Waktu konsentrasi plasma mencapai puncak dapat disamakan dengan waktu yang diperlukan untuk mencapai konsentrasi obat maksimum setelah emberian obat. Pada fase ini, absorpsi ibat adalah terbesar dan laju absorpsi obat sama dengan laju eliminasi obat. Absorpsi masih berjalan setelah fase ini tercapai, tetapi pada laju yang lebih lambat. Harga tmaks menjadi lebih kecil (berarti sedikit waktu yang diperlukan untuk mencapai konsentrasi plasma puncak) bila laju absorbs obat menjadi lebih cepat.
•
Kadar puncak (Cpmaks) Parameter ini menunjukkan konsentrasi obat maksimum dalam plasma setelah pemberian secara oral. Untuk beberapa obat diperoleh suatu hubungan antara
efek farmakologi suatu obat dan konsentrasi obat dalam plasma (Shargel, 1998). •
Luas daerah di bawah kurva (AUC) AUC adalah permukaan di bawah kurva yang menggambarkan naik turunnya kadar plasma sebagai fungsi dari waku. AUC dapat dihitung secara matematis dan merupakan ukuran untuk bioavaibilitas suatu obat. AUC dapat digunakan untuk membandingkan kadar masing-masing plasma obat bila penentuan kecepatan eliminasinya tidak mengalami perubahan. Selain itu, antara kadar plasma puncak dan bioavaibilitas terdapat hubungan langsung (Waldon, 2008).
Cuplikan darah sangat relevan, karena semua proses obat dalam tubuh melibatkan darah sebagai media, suatu alat ukur dari organ satu ke organ lain seperti absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi. Oleh karena itu, agar nilai-nilai parameter obat dapat dipercaya, metode penetapan kadar harus memenuhi kriteria, yaitu: : 1.
Selektif atau spesifik Selektifitas metode adalah kemampuan suatu metode untuk membedakan suatu obat dari metabolitnya, obat lain, dan kandungan endogen cuplikan hayati. Selektifitas metode menempati prioritas utama karena bentuk obat yang akan ditetapkan dalam cuplikan hayati adalah dalam bentuk tak berubah atau metabolitnya.
Pemilihan
metode
yang memiliki selektifitas
tinggi
perlu
mendapatkan perhatian khusus karena hal ini berkaitan erat dengan rumus matematik yang diterapkan dalam menghitung parameter farmakokinetik. Rumus matematik yang diturunkan berdasarkan data pengukuran kadar obat tak berubah dalam cuplikan hayati tertentu, berbeda dengan yang diturunkan dari data kadar metabolitnya (Smith, 1981). 2.
Sensitif atau peka Sensitivitas metode analisis yang digunakan berkaitan dengan kadar terendah yang dapat
diukur
oleh
metode
analisis
yang
digunakan.
Dalam
penelitian
farmakokinetika, pemilihan metode analisis juga tergantung pada tingkat sensitivitas yang dimiliki oleh metode tersebut. Hal ini dapat dipahami mengingat dalam menghitung parameter farmakokinetika suatu obat, diperlukan sederetan
data kadar obat dari waktu ke waktu, atau data dari kadar tertinggi sampai kadar terendah dalam cuplikan hayati yang digunakan. Misalnya kita akan menghitung harga AUC, maka kita memerlukan data kadar obat dari waktu nol sampai tak terhingga. Karena itu, metode analisis yang dipilih harus dapat meliput kadar obat tertinggi sampai terendah yang ada di dalam badan. 3.
Ketelitian (accuracy) dan ketepatan ( precision) Ketelitian
(accuracy)
ditunjukan
oleh
kemampuan
suatu
metode
untuk
memberikan hasil pengukuran sedekat mungkin dengan true value (nilai sesungguhnya). Ketelitian suatu metode dapat dilihat dari perbedaan antara harga penetapan kadar rata-rata dengan harga sebenarnya atau konsentrasi yang diketahui. Jika tidak ada data nilai sebenarnya atau nilai yang dianggap benar tersebut maka tidak mungkin untuk menentukan berapa akurasi pengukuran tersebut.
Metode yang baik memberikan hasil recovery (perolehan kembali) yang tinggi yaitu 75-90% atau lebih dan kesalahan sistematik kurang dari 10%. Perolehan kembali merupakan tolok ukur efisiensi analisis, sedangakan kesalahan sistematik merupakan tolok ukur inakurasi penetapan kadar. Kesalahan ini dapat berupa kesalahan konstan atau proporsional. Ketelitian berkaian dengan purata. Bila suatu hasil itu teliti (accurate) berarti purata sama dengan harga sebenarnya, walaupun penyebarannya lebar (luas). Dalam hubungan ini, adalah lebih baik hasil yang kurang
teliti tapi
tepat daripada
teliti namun kurang
tepat. Ketepatan
menggambarkan hasil yang berulang-ulang tidak mengalami perbedaan hasil (reprodusibilitas data). Dengan kata lain, ketepatan menunjukkan kedekatan hasilhasil pengukuran berulang. Ketepatan pengukuran hendaknya diperoleh melalui pengukuran
ulang(replikasi)
dari
berbagai
konsentrasi
obat
dan
melalui
pengukuran ulang kurva konsentrasi standar yang disiapkan secara terpisah pada hari yang sama. Ketepatan berhubungan dengan penyebaran harga terhadapa purata kecil meskipun karena kesalahan sistematik, purata berbeda agak besar dengan
harga sebenarnya. Kemudian dilakukan perhitungan statistik yang sesuai dengan penyebaran data, seperti standar deviasi atau koefisien variasi.
Kesalahan acak merupakan tolok ukur inprecision suatu analisis, dan dapat bersifat positif atau negatif. Kesalahan acak identik dengan variabilitas pengukuran dan dicerminkan oleh tetapan variasi. Metode yang baik memiliki nilai kesalahan acak kurang dari 10%. 4.
Cepat Kecepatan berkaitan dengan banyaknya cuplikan hayati yang harus dianalisis dalam suatu macam penelitian farmakokinetika
5.
Efisien Metode tidak terlalu panjang karena dikhawatirkan akan menimbulkan suatu kesalahan sistematik (Sudjadi, 2008).
Dalam penetapan kadar obat dalam darah (cairan tubuh), metode yang digunakan harus tepat, dan dalam pengerjaannya diperlukan suatu ketelitian yang cukup tinggi agar diperoleh hasil yang akurat, sehingga nantinya dapat menghindari kesalahan yang fatal. Dalam analisis ini, kesalahan hasil tidak boleh lebih dari 10% (tergantung pula alat apa yang digunakan dalam analisis) (Ritschel, 1976). Cepat, simpel, dan sensitif telah membuat spektrofotometer UV-VIS menjadi suatu metode analisis farmasetika yang sangat popular untuk pengukuran secara kuantitatif obat dan metabolit dalam sampel biologi. Salah satu alasan penting atas kepopulerannya karena sensitivitas dari metode ini, yaitu 1-10 µg/ml. Identifikasi kualitatif dari obat atau metabolit menggunakan spektrofotometri UV-VIS berdasarkan pada panjang gelombang maksimum yang diabsorpsi. Pada absorpsi yang maksimum, sensitivitas optimum akan didapat. Karena perubahan absorbansi minimal untuk sedikit perubahan panjang gelombang,
error
diminimalkan. Hasilnya, akurasi dan presisi yang baik didapatkan (Smith,1981). Salah satu metode pengukuran kadar obat dalam analisis cairan hayati adalah metode Bratton-Marshall. Metode ini didasarkan pada prinsip kolorimetri, yaitu terbentuknya senyawa-senyawa berwarna yang intensitasnya dapat ditentukan secara spektrofotometri visibel dengan 3 tahap, yaitu pembentukan senyawa diazo, penghilangan sisa asam nitrit dengan penambahan asam sulfamat, dan pengkoplingan garam diazonium-NED.
III. ALAT DAN BAHAN
a) Alat : 1. Labu takar 10 ml 2. Pipet volume 0,1; 0,2; 1,0; 2,0 ml 3. Tabung reaksi/flakon 4. Pipet ukur 5 ml 5. Spektrofotometer dan kuvet 6. Skalpel/silet 7. Sentrifuge 8. Stopwatch 9. Ependorf 10. Alat vortex 11. Propipet 12. Mikropipet dan tip b) Bahan : 1. Asam trikloroasetat (TCA) 2. Natrium nitrit 0,1 % 3. Amonium Sulfamat 0,5% 4. N(1-naftil) etilendiamin 0,1% 5. Antikoagulan (heparin) 6. Sulfametoksazol 7. Darah tikus
IV. CARA KERJA
a) Pembuatan kurva baku: Diencerkan stok sulfametoksazol (1 mg/ml) dengan aquades sehingga diperoleh kadar sulfametoksazol: 25, 50, 100, 200, 400 µg/ml.
Ditambahkan 250 µl darah yang mengandung antikoagulan ditambah 250 µl aquadest, campur homogen, dan tambah 2,0 ml TCA 5% dengan vortexing.
Untuk pembuatan blanko kurva baku, 250 µl darah yang mengandung antikoagulan ditambahkan 250 µl aquades (tidak ditambah sulfametoksazol), campur homogen dan tambah 2,0 ml TCA 5% dengan vortexing.
Blanko kurva baku dan sampel yang telah divortex disentrifugasi (5 menit; 2500 rpm).
Diambil 1,0 ml beningan (supernatan) dan diencerkan dengan aquades 2,0 ml.
Ditambahkan larutan NaNO2 (0,1 ml; 0,1%) ke dalam tiap tabung diamkan selama 3 menit.
Ditambahkan larutan ammonium sulfamat (0,2 ml; 0,5%), diamkan selama 2 menit.
Ditambahkan larutan N(1-naftil)etilendiamin (0,2 ml; 0,1%), campur baik-baik, diamkan 5 menit di tempat gelap.
Larutan dipindahkan ke dalam kuvet, dibaca intensitas warna pada spektrofotometer (545 nm) terhadap blanko darah yang telah diproses dengan cara yang sama dan dibuat persamaan garis menggunakan persamaan y = ax + b. b) Penetapan Kadar Tikus diberi sulfametoksazol secara peroral dan ditunggu hingga 1 jam.
Diambil darah melalui vena lateralis pada ekor tikus sebanyak 1,5 ml, ditaruh pada ependorf yang sebelumnya telah diberi heparin.
Diambil 250 µl darah yang mengandung antikoagulan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 250 µl aquadest, dicampur homogen.
Ditambah 2,0 ml TCA 5% dengan vortexing .
Disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm.
Diambil beningan (1,50 ml) dan diencerkan dengan aquadest 2,0 ml.
Ke dalam tiap tabung ditambahkan larutan NaNO2 (0,1 ml; 0,1%) diamkan selama 3 menit.
Ditambahkan larutan ammonia sulfamat (0,2 ml; 0,5%) diamkan selama 2 menit.
Ditambahkan larutan N(1-naftil) etilendiamin (0,2 ml; 0,1%), dicampur baik-baik, diamkan 5 menit di tempat gelap.
Dipindahkan ke dalam kuvet, dibaca intesitas warna pada spektrofotometer (545 nm) terhadap blanko darah (sebagai control) yang telah diproses dengan cara yang sama.
c) Validasi Dimasukkan larutan stok 50,300 µg/ml masing-masing ke dalam tabung reaksi berbeda.
Ditambahkan darah/urin 250 µL.
Ditambahkan TCA 10% sebanyak 2 ml pada tiap-tiap tabung reaksi.
Dicampur homogen dengan vortex selama 15 detik.
Disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit.
Beningan diambil 1,5 mL dan Dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih.
Ditambahkan NaNO2 0,1 ml dan didiamkan 3 menit.
Ditambahkan ammonium sulfamat 1,5% sebanyak 0,2 ml dan didiamkan 2 menit.
Ditambahkan NED 0,2 ml lalu dibaca serapannya pada
menggunakan
spektrofotometer.
Dilakukan replikasi sebanyak 2 kali untuk masing-masing kadar.
Dihitung nilai recovery, kesalahan sistematik, dan kesalahan acak.
V. DATA DAN PERHITUNGAN Data Percobaan
Pembuatan Kurva Baku Darah Tikus
Kadar sulfadiazin dalam darah (µg/ml) 25 50 100 200 400
Absorbansi 0,006 0,000 0,036 0,104 0,211
Validasi Darah Tikus
Kadar sulfadiazin dalam darah (µg/ml) 50 300
Penetapan kadar •
Kelompok A Replikasi
•
1
0,218
2
0,199
3
0,231
4
0,188
Kelompok B Replikasi
•
Absorbansi
Absorbansi
1
0,136
2
0,134
3
0,147
4
0,144
5
0,130
Kelompok C Replikasi
Absorbansi
Absorbansi I
Absorbansi II
Absorbansi III
0,104 0,182
0,104 0,200
0,100 0,198
•
1
0,183
2
0,217
3
0,226
Kelompok D Replikasi
Absorbansi
1
0,118
2
0,102
3
0,107
4
0,122
5
0,132
Perhitungan 1. Perhitungan Pengenceran V1.M1 = V2.M2
Keterangan: V1 = Volume sulfadiazin yang diambil (ml) V2 = Volume labu takar (ml) M1 = Konsentrasi sulfadiazin stok (µg/ml) M2 = Konsentrasi sulfadiazin yang diinginkan ( µg/ml) Dengan menggunakan V 1 M1 = V2 M2, dapat ditentukan volume larutan stok yang diambil. a. Larutan stok untuk penetapan kurva baku Diketahui : M1 = 1mg/ml = 1000 µg/ml V2 = 5 ml Jadi, volume sulfadiazin yang diambil adalah sebagai berikut. 1) Jika kadar yang diinginkan 25 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 10 ml. 25 µg/ml V1
= 0,25 ml
2) Jika kadar yang diinginkan 50 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 10 ml. 50 µg/ml V1
= 0,5 ml
3) Jika kadar yang diinginkan 100 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 10 ml. 100 µg/ml V1
= 1 ml
4) Jika kadar yang diinginkan 200 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 10 ml. 200 µg/ml V1
= 2 ml
5) Jika kadar yang diinginkan 400 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 10 ml. 400 µg/ml V1
= 4 ml
b. Larutan stok untuk recovery Diketahui : M1 = 1mg/ml = 1000 µg/ml V2 = 5 ml Jadi, volume sulfadiazin yang diambil adalah sebagai berikut.
1) Jika kadar yang diinginkan 50 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 5 ml. 50 µg/ml V1
= 0,25 ml
2) Jika kadar yang diinginkan 300 µg/ml
V1.M1
= V2.M2
V1. 1000 µg/ml = 0,5 ml. 300 µg/ml V1
= 1,5 ml
2. Perhitungan Penentuan Volume Pemberian Sulfadiazin
BB tikus = 98,85 gram Stok yang digunakan = 10 mg/ml Volume pemberian =
= = 0,4943 ml 3. Pembuatan Kurva Baku Darah Tikus
Kadar sulfadiazin dalam darah (µg/ml) 25 50 100 200 400 * ditolak Dengan regresi linear didapat: a = -0,0120 b = r = 0,9980
Absorbansi 0,006 0,000* 0,036 0,104 0,211
Sehingga kurva baku yang diperoleh adalah
Keterangan : Y = absorbansi
X = kadar
4. Validasi Kadar Sulfadiazin dalam Darah Tikus
Kadar sulfadiazin dalam darah (µg/ml) 50 300
Absorbansi I
Absorbansi II
Absorbansi III
0,104 0,182
0,104 0,200
0,100 0,198
y = 5,5850 . 10 -4 x – 0,012 a. Untuk kadar 50 µg/ml
1) Perhitungan Kadar Terukur Replikasi 1
y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,104 = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,116 = 5,5850.10 -4x x = 207,6992 µg/ml
Replikasi 2 y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,104 = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,116 = 5,5850.10 -4x
x = 207,6992 µg/ml Replikasi 3 y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,100 = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,112 = 5,5850.10 -4x x = 200,5372 µg/ml
= 205,3119 µg/ml
2) Perhitungan Kesalahan Acak
x ̄ (µg/ml)
x (µg/ml)
205,3119
207,6992 200,5372
=
= 4,1350
= = 2,0140 %
3) Perhitungan Recovery Recovery =
Recovery 1 =
= 415,3384 %
Recovery 2 =
d = |x - x| ̄ 2,3873
5,6992
2,3873
5,6992
4,7747
22,7978
= 415,3384 %
Recovery 3 =
= 401,0744 % Rata-Rata Recovery
= = 410,5837%
4) Perhitungan Kesalahan Sistematik Kesalahan Sistemik = 100% - Recovery Kesalahan sistematik 1 = 100% - 415,3384% = -315,3384% Kesalahan sistematik 2 = 100% - 415,3384% = -315,3384% Kesalahan sistematik 3 = 100% - 410,0744% = -310,0744% Rata-Rata Kesalahan sistematik
= = -313,5837%
b. Untuk kadar 300 µg/ml
1) Perhitungan Kadar Terukur Replikasi 1 y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,182 = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,194 = 5,5850.10 -4x x = 347,3590 µg/ml Replikasi 2
y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,200 = 5,5850.10 -4x – 0,012
0,212 = 5,5850.10 -4x x = 379,5882 µg/ml Replikasi 3
y = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,198 = 5,5850.10 -4x – 0,012 0,210 = 5,5850.10 -4x x = 376,0072 µg/ml
= 367,6515 µg/ml
2) Perhitungan Kesalahan Acak
x (µg/ml)
x ̄ (µg/ml)
367,6515
=
= 17,9177
d = |x - x| ̄ 20,2925
411,7856
11,9367
142,4848
8,3557
69,8177
= = 4,8736 %
3) Perhitungan Recovery Recovery =
Recovery 1 =
= 115,7863 %
Recovery 2 =
= 126,5294 %
Recovery 3 =
= 125,3357 % Rata-Rata Recovery
= = 122,5505%
4) Perhitungan Kesalahan Sistematik Kesalahan Sistemik = 100% - Recovery Kesalahan sistematik 1 = 100% - 115,7863% = -15,7863% Kesalahan sistematik 2 = 100% - 126,5294% = -26,5294% Kesalahan sistematik 3 = 100% - 125,3357%
= -25,3357% Rata-Rata Kesalahan sistematik = = -22,5505%
5. Penetapan Kadar
•
•
•
Kelompok A
Replikasi
Absorbansi (y)
Kadar (X)
1
0,218
411,8174
2
0,199
377,7977
3
0,231
435,0940
4
0,188
358,1021
Replikasi
Absorbansi (y)
Kadar (X)
1
0,136
264,9955
2
0,134
261,4145
3
0,147
284,6911
4
0,144
279,3196
5
0,130
254,2525
Replikasi
Absorbansi (y)
Kadar (X)
1
0,183
349,1495
2
0,217
410,0269
3
0,226
426,1415
Kelompok B
Kelompok C
•
Kelompok D
Replikasi
Absorbansi (y)
Kadar (X)
1
0,118
232,7663
2
0,102
204,1182
3
0,107
213,0707
4
0,122
239,9284
5
0,132
257,8335
6. Recovery Data Kelompok B
Kadar Absorbansi = 265 µg/ml Kadar Obat total
= 4,9245 mg
Volume darah
= 7, 5 % x 98,85 g = 7, 41375 gram = 7, 060714 ml (p=1,05)
Kadar Sebenarnya = Kadar Obat Total/ ml darah = 4,9245 mg / 7,060714 ml = 0,697450 mg/ml darah = 697,450 µg/ml
•
•
•
•
•
%
= 38,5597 %
Rata-rata recovery :
Kesalahan sistematik : 100% - 38,5597 % = 61,4403 % x ̄ (µg/ml)
x (µg/ml)
d = |x - x| ̄
264,9955
3,9391
15,5165
261,4145
7,5201
56,5519
15,7565
248,2673
279,3196
10,3850
107,6462
254,2525
14,6821
215,5641
284,6911
268,9346
=
= 12,6841
= = 4,7164 VI. PEMBAHASAN
Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa memahami penetapan kadar analisis obat di dalam cairan hayati melalui metode Bratton-Marshall. Metode Bratton-Marshall bekerja melalui prinsip reaksi diazotasi, yaitu reaksi pembentukan warna pada senyawa yang memiliki gugus aktif amina aromatis primer. Pembacaan reaksi ini dilakukan menggunakan metode Spektrofotometri UV-vis.
Metode Bratton-Marshall berjalan melalui 3 tahap yaitu : 1. Pembentukan Senyawa Diazo Salah satu syarat reaksi diazotasi adalah senyawa harus memiliki gugus amina aromatik primer. Sulfametoksazol memiliki struktur standar amina aromatik primer, sehingga reaksi diazotasi dapat berlangsung dengan reaksi sebagai berikut: +
NaNO2 TCA
N
+ H2O
(garam diazonum dari sulfametoksazol) 2. Penghilangan Sisa Asam Nitrit dengan Penambahan Asam Sulfamat Pada proses terbentuknya garam diazonium, yang dihasilkan dari reaksi antara amina aromatik primer dengan asam nitrit (HNO 2) dari natrium nitrit, terjadi kelebihan asam nitrit yang harus dihilangkan dengan penambahan asam sulfamat. Apabila tidak dihilangkan, senyawa yang sudah berwarna akan dirusak (dioksidasi) oleh asam nitrit sehingga kembali lagi menjadi tidak berwarna. Reaksi penghilangan sisa asam nitrit adalah sebagai berikut: HNO2 + HSO3 NH2
N2 + H2SO4 + H2O
3. Pengkoplingan Garam Diazonium-NED Pada proses ini, garam diazonium yang sudah terbentuk segera direaksikan dengan reagen kopling dan membentuk senyawa kopling yang memiliki gugus kromofor yang lebih panjang sehingga dapat dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis. Reagen kopling yang khas dalam metode Bratton-Marshall adalah N-(1-Naftil) etilen diamin (NED). Dengan demikian, pergeseran bathokromik terjadi sehingga λ lebih panjang dan intensitas warnanya lebih tajam. Hasilnya, senyawa menjadi lebih mudah dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis. Untuk menguji ketepatan dan ketelitian metode yang digunakan, ditetapkan beberapa analisis dari parameter farmakokinetika yang berhubungan dengan metode penetapan kadar suatu obat dalam cairan hayati, seperti recovery (P%) dan kesalahan sistematik (100%-P%)
sebagai parameter ketelitian, serta perhitungan SD dan kesalahan acak (CV) sebagai parameter ketepatan. Metode yang baik ialah metode yang dapat memberikan nilai recovery yang tinggi >75% serta memiliki kesalahan acak dan sistematik kurang dari 10%. Parameter farmakokinetik merupakan tolak ukur yang digunakan untuk mengevaluasi pola absorbsi, distribusi, metabolisme, ekskresi suatu obat. Parameter farmakokinetik merupakan besaran yang diturunkan secara sistematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya dalam darah atau urin. Analisis ini dilakukan dengan membuat seri kadar obat tertentu dalam darah dan urin yang kemudian diproses lebih lanjut sehingga dpaat dibaca absorbansi dan dibuat kurva bakunya. Cairan hayati yang dapat digunakan sebagai media tolak ukur kualitatif maupun kuantitatif suatu obat ialah darah. Hal ini disebabkan karena darah merupakan media utama transportasi zat-zat di dalam tubuh, sehingga merupakan tempat dominan yang dilalui oleh obat, bahkan faktanya, penghitungan kadar obat di dalam tubuh mengacu pada Volume Distribusi (Vd) yang didasarkan oleh persebaran obat oleh darah. Pada percobaan ini, obat yang di analisis adalah sulfametoksazol. Analisis dilakukan dengan memberikan sulfametoksazol Per Oral (PO) dengan dosis 10 mg/200g BB dimana larutan stok yang digunakan adalah 10mg/ml. Berikut bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini antara lain: 1. Sulfametoksazol
Rumus molekul
: C10H11 N3O3S
Berat molekul
: 253,28
Pemerian
: Serbuk hablur, putih
sampai hampir putih, praktis tidak berbau
Sulfametoksazol mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% C10H11 N3O3S, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Kelarutan
: Praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam kloroform, mudah larut dalam aseton dan dalam larutan natrium hidroksida encer, agak sukar larut dalam etanol.
Waktu paruh :
11 jam
Sulfametoksazol diabsorbsi dalam saluran cerna cepat dan sempurna dan ± 20 % terikat oleh protein plasma. Dalam darah, 10-20 obat terdapat dalam bentuk terasetilasi. Kadar plasma tertinggi dicapai dalam 4 jam setelah pemberian secara oral, dengan waktu paro 10-12 jam. Dosis oral awal 2 g diikuti lagi 2-3 dosis perawatan sampai infeksi berakhir. Sulfametoksazol merupakan golongan sulfonamid yang termasuk dari derivat sulfanilamid dan mempunyai peranan sebagai agen bakteriostatik. Sulfametoksazol merupakan sulfonamid yang mempunyai kecepatan absorpsi dan ekskresi cepat. Pasangan elektron bebas yang dimiliki Sulfametoksazol terdapat pada atom-atom N primer, N-sekunder, N-tersier, O pada SO ₂ dan rantai siklik serta S pada SO ₂, sehingga dimungkinkan untuk dapat mengikat tembaga(II) pada protein azurin yang dibutuhkan oleh bakteri untuk proses fotosintesis (Anonim, 2012). 2. Heparin
Pemerian: Serbuk, putih atau putih daging agak higroskopis Kelarutan: Larut dalam 2,5 bagian air.
Heparin merupakan suatu mukopolisakarida dengan berat molekul 6000-20.000 kilo dalton. Karena sifat keasamannya, heparin juga disebut asam heparinat. Secara kimia, senyawa ini mirip asam hialuronat, kondroitin, dan kondroitin sulfat A dan B. Heparin berfungsi mencegah darah menggumpal. Sifat anti koagulan ini terjadi akibat penghambatan pengubahan protombin menjadi trombin dalam proses penggumpalan darah. Heparin merupakan anti-koagulansia langsung, yang mengandung gugus karboksil dan sisa sulfat, sehingga heparin merupakan salah satu asam terkuat dalam tubuh. Heparin bekerja dengan menghambat pembekuan darah yang kerjanya bergantung adanya Anti-trombin III (suatu α2-globulin dan kofaktor dari heparin dan memperkuat kerja heparin) sehingga membentuk kompleks heparin-antitrombin yang ammpu mengaktifkan faktor-faktor IXa, Xa, XIa, XIIa sehingga menghambat pembentukan trombin. Pada konsentrasi tinggi, heparin menghambat juga agregasi trombosit.
Heparin
juga
mempunyai
kerja
menjernihkan
plasma
yang
berlipid
(membebaskan lipoproteinlipase dari endotelium pembuluh yang mampu melarutkan khilomikron). Heparin mempercepat penguraian histamin dengan membebaskan diaminoksidase yang mengoksidasi histamin dan mereduksi pembentukan aldosteron. Mekanisme anti koagulasi : Heparin + Anti trombin III + Faktor penggumpalan ↔ Kompleks terner
Protrombin
X
Trombin
Ca2+
Heparin beraksi dengan mengikat anti trombin III membentuk kompleks yang berafinitas lebih besar daripada anti trombin III itu sendiri terhadap beberapa faktor pembekuan darah aktif (trombin dan faktor Xa/faktor stuart power). Heparin juga menginaktivasi faktor VIIIa/AHG dan mencegah terbentuknya fibrin yang stabil. Oleh karena itu, heparin mempercepat inaktivasi faktor pembekuan darah (Anonim, 2012). 3. TCA (Trichloro Acetic Acid / Asam Trikloro Asetat)
Rumus Molekul Berat Molekul Pemerian
: C2HCl3O2 : 163,39 : Massa hablur, sangat rapuh,
tidak berwarna, rasa lemah dan khas. Kelarutan
: Sangat mudah larut dalam air,
dalam etanol, dan dalam eter P. Asam trikloroasetat (nama sistematis: asam trikloroetanoat) adalah analog dari asam asetat, dengan ketiga atom hidrogen dari gugus metil digantikan oleh atom-atom klorin. Senyawa ini merupakan asam yang cukup kuat (pKa = 0.77, lebih kuat dari disosiasi kedua asam sulfat). Senyawa ini dibuat melalui reaksi klorin dengan asam asetat bersama katalis yang cocok (Anonim, 1979). 4. Natrium Nitrit
Pemerian
: Putih atau sedikit kuning, granul higrokopis, batang atau serbuk
Kelarutan
: Larut dalam 1,5 bagian air dingin, 0,6 bagian air mendidih. (Windholtz, 1976)
5. Ammonium Sulfamat
Pemerian : Kristal higroskopis. Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, sedikit larut dalam etanol, cukup larut dalam gliserol, glikol, formaldehida. (Windholtz, 1976)
Metode Analisis
Langkah pertama pada percobaan ini adalah memberikan larutan sulfametoksazol secara per oral kepada hewan uji. Pada percobaan ini, hewan uji yang digunakan ialah tikus putih Rattus novergicus dengan dosis 10 mg/200 mgBB dengan jarum berujung tumpul. Karena stok sulfametoksazol adalah 10 mg/ml dan bobot tikus yang digunakan adalah 98,85 gram, maka dosis yang diberikan ialah 4,9425 gram dengan volume larutan sebesar 0,49 ml. Kemudian, pemberian diberikan secara per oral sehingga dibutuhkan waktu tunggu sampai proses absorbsi terjadi. Pada percobaan ini, praktikan menunggu selama satu jam setelah pemberian dilakukan. Setelah satu jam, tikus diletakkan di dalam holder dimana seluruh bagian badan tikus kecuali ekor terperangkap di dalam holder . Penggunan holder bertujuan untuk membatasi pergerakan tikus sehingga mempermudah proses pengambilan darah. Pada proses pengambilan darah, volume darah tikus yang diambil sebanyak 1,5 ml per tikus pada dua tikus, darah pada tikus pertama digunakan untuk pembuatan kurva baku internal, sedangkan darah pada tikus kedua digunakan untuk pemrosesan sampel darah in vivo. Darah yang diambil diletakkan di dalam tabung eppendorf berukuran 2 ml yang telah diberikan heparin sebanyak 10 tetes untuk mencegah koagulasi darah. Pengambilan darah sebesar 1,5 ml ini sebenarnya kurang tepat karena melebihi nilai batas atas volume darah yang dapat diambil pada hewan uji dan tetap mempertahankan hidup hewan uji, yaitu 1% dari total bobot hewan uji. Pada tikus yang digunakan kali ini, volume darah maksimal yang seharusnya dapat diambil ialah 1% bobot tikus atau dengan kata lain 0,9885 gram atau 0,9414 ml ( p=1.05). Namun, dikarenakan keterbatasan waktu percobaan dan volume minimal untuk replikasi percobaan cukup tinggi, maka batas atas maksimal sekali pengambilan darah terpaksa dilewati. Metode pengambilan darah dilakukan dengan menyayat bagian ekor dengan menggunakan skalpel. Sebelum bagian ekor disayat, dilakukan pembersihan dari bulu-bulu halus tikus dengan tujuan agar darah tikus tidak tersangkut pada bulu ketika disayat, melainkan langsung dapat ditampung di dalam eppendorf . Penyayatan ekor dilakukan dengan melintang mengikuti ruas yang terdapat pada bagian ekor tikus dan tidak secara tegak lurus
untuk mencegah ekor tikus putus serta menyebakan darah menjadi tersendat keluar. Penyayatan dilakukan sedalam setengah hingga dua per tiga tebal ekor dan darah yang keluar segera ditampung dengan eppendorf . Apabila darah sulit keluar, dilakukan pemijatan perlahan dari pangkal ekor untuk mempercepat pengeluaran darah. Bagian yang disayat ialah vena lateralis yang keberadaanya dapat diketahui dengan memijat ekor tikus hingga terlihat pembuluh darah yang berwarna ungu. Alasan digunakannya vena lateralis adalah pada bagian itu merupakan tempat yang paling dekat dengan kulit sehingga pengambilannya dapat mencegah kematian. Apabila darah sudah membeku dan tidak keluar lagi, maka dapat dilakukan penyayatan pada bagian yang lebih atas dari ekor tikus tadi atau dapat pula luka goresan tadi digores kembali agar luka dapat terbuka kembali dan darah dapat mengalir keluar. Penampungan darah tikus pada eppendorf harus dilakukan secara hati-hati, agar tidak ada darah yang terbuang. Setiap melakukan penampungan beberapa tetes, sebaiknya eppendorf ditutup dan dilakukan penggojogan ringan. Hal ini bertujuan untuk meratakan heparin pada seluruh bagian darah, sehingga tidak ada darah yang terkoagulasi. Jika darah mengalami koagulasi, maka pada proses sentrifugasi akan diperoleh supernatan berupa serum sedangkan yang dibutuhkan dalam pemeriksaan adalah plasma darah sebagai cairan hayati. Plasma darah dibutuhkan karena nantinya sulfametoksazol akan berikatan dengan protein plasma dan membentuk kompleks obat makromolekul yang disebut kompleks protein-obat. Kompleks protein-obat bersifat tidak aktif sehingga tidak lagi dapat dibaca melalui absorbansi. Protein yang berperan dalam pengikatan obat di plasma darah antara lain ialah albumin dan globulin. Albumin bertangggung jawab terhadap ikatan obat, sedangkan globulin merupakan bagian terkecil dari keseluruhan protein plasma. Obat akan berikatan dengan protein plasma jika plasma darah memebentuk suatu agregat besar. Oleh karena itu, digunakan plasma darah yang tidak terkoagulasi. Kelompok praktikan melakukan penyayatan sebanyak dua kali dikarenakan pada lokasi pertama telah terjadi penjedalan yang tebal serta berkurangnya volume darah yang dapat diambil secara drastis, sehingga tidak memungkinkan lagi pengambilan darah kecuali dengan pergantian lokasi. Hal ini mungkin disebabkan oleh kurangnya pengalaman dari praktikan dalam menyayat hewan uji. Setelah itu, dibuat larutan baku dengan tujuan agar persamaan regresi linier hubungan kadar sulfametoksazol dengan absorbansi dapat dihitung sehingga praktikan dapat menentukan kadar sulfametoksazol dalam darah tikus. Untuk kurva baku, dibuat masingmasing seri kadar larutan baku dengan cara mengencerkan larutan sulfametoksazol dengan kadar 1 mg/ml menggunakan aquadest dengan cara mengambil larutan stok menggunakan
mikropipet ataupun pipet volume dengan nilai volume tertentu. Kemudian, larutan stok tersebut dimasukkan ke dalam labu takar dan ditambahkan aquadest hingga didapatkan konsentrasi yang sesuai, yaitu 25, 50, 100, 200, 400 µg/ml. Untuk blangko digunakan aquadest dengan tujuan untuk mengkoreksi absorbansi senyawa yang terbentuk. Pembuatan larutan stok dilakukan dengan rumus pengenceran yaitu: V1.M1=V2.M2
Dimana V1 menunjukan volume sulfametoksazol yang diambil dalam satuan mililiter, serta nilai V2 menunjukan nilai volume dari labu takar. Lalu, nilai M 1 menunjukan nilai kadar sulfametoksazol yang tersedia dengan M2 menunjukan konsentrasi yang kita inginkan. Dengan kadar sulfametoksazol sebesar 25 μg/ml didapatkan volume sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 250 μl. Dengan kadar sebesar 50 μg/ml, didapatkan kadar sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 500 μl. Berikutnya dengan kadar 100 μg/ml, didapatkan kadar yang harus diambil sebesar 1000 μl. Lalu dengan kadar sebesar 200 μg/ml, didapatkan jumlah volume sebesar 2000 μl. Serta yang terakhir dengan kadar sebesar 400mg/mL, didapatkan volume 4000 μl yang harus diambil. Lalu, dilakukan pembuatan kurva baku internal menggunakan darah pada sampel bukan aquadest. Caranya adalah menggunakan blanko (250 µl) yang mengandung koagulan dan ditambahkan 250 µl larutan stok sulfametoksazol sehingga kadarnya 0, 25, 50, 200, dan 400 µg/ml darah, setelah itu dicampur homogen dengan metode vortexing . Vortexing sendiri, adalah sebuah metode pencampuran dengan prinsip pemutaran aliran fluida secara turbulen sehingga seluruh bagian dapat tercampur homogen. Vortexing dilakukan menggunakan vortex mixer atau seringkali juga dapat disebut vortexer . Prinsip kerja vortexer ialah ketika tabung reaksi diletakkan pada bagian karet yang berosilasi dengan cepat , perputaran dari bagian karet tersebut akan berpindah ke dalam cairan di dalam tabung sehingga pada cairan terbentuk vortex. Berikutnya adalah pemrosesan sampel darah in vivo dengan cara memasukan 250 µl darah yang mengandung anti koagulan berupa heparin. Maksud penambahan heparin ini adalah agar darah tidak membeku. Campuran tersebut ditambahkan dengan 250 µl aquadest dan dihomogenkan. Setelah homogen, ditambahkan dengan 2,0 ml TCA 5% dengan vortexing . TCA ialah senyawa yang mampu memprespitasi makromolekul seperti protein, RNA, dan DNA. Pada percobaan kali ini, maksud dari penambahan TCA adalah agar protein terdenaturasi. Keberadaan protein pada supernatan akan mengganggu proses absorbansi sehingga perlu didenaturasi. Mekanisme denaturasi protein dilakukan melalui deprotonasi, yaitu TCA mendenaturasi struktur sekunder dan tersier protein melalui ikatan disulfida yang merupakan pembentuk kedua struktur tersebut sehingga bagian nonpolar dari protein akan
keluar serta protein mengendap. TCA juga berfungsi sebagai donor proton pada reaksi berikutnya. Selain itu, TCA juga berfungi sebagai pemberi suasana asam sehingga dapat berperan dalam menghentikan kerja enzim pemetabolisme obat sekaligus menyebabkan denaturasi protein plasma tanpa memecah protein menjadi asam amino penyusunnya. Pada reaksi diazotasi yang biasa, digunakan HCl (asam klorida) sebagai pemberi suasana asam. Tetapi pada percobaan ini tidak digunakan HCl karena HCl berefek memecah protein menjadi asam aminonya sehingga pada saat sentrifugasi asam amino tersebut tidak akan memisah dari plasmanya karena terlalu kecil untuk bisa diendapkan. Asam amino tertentu memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang akan memberikan serapan pada UV-Vis sehingga akan mengganggu pembacaan absorbansi. Sedangkan bila digunakan TCA, TCA akan mengikat protein sehingga protein dapat terdenaturasi dalam suasana asam tanpa terpecah menjadi fragmen-fragmennya. Berikut ini adalah proses denaturasi protein oleh TCA:
Kemudian, larutan kurva baku internal yang telah dibuat digabung dengan sampel darah in vivo yang telah di-vortexing, dicampur, dan di- sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Prinsip sentrifugasi ialah pemisahan suatu campuran dengan basis perbedaan bobot jenis. Pada percobaan ini, sentrifugasi dimaksudkan agar terjadi pemisahan antara padatan dengan cairan, dimana padatan akan terprespitasi di bawah tabung sementara cairan akan membentuk supernatan. Sentrifugasi juga menyempurnakan dan mempercepat pemisahan endapan protein dari supernatan yang mengandung sejumlah sulfametoksazol yang tidak ikut mengendap bersama protein. Sulfametoksazol yang berada pada supernatan merupakan obat bebas yang tidak terikat protein, sedangkan obat yang terikat dengan protein tidak aktif scara farmakologis dan tidak memberikan efek terapeutik. Setelah dipusingkan maka diambil beningan sebanyak 1,50 ml dengan menggunakan mikropipet secara hati-hati agar endapan protein tidak terambil, sehingga didapatkan obat bentuk bebas pada sampel. Selanjutnya, beningan tersebut dituang ke dalam tabung reaksi dan diencerkan dengan aquadest sebanyak 2,0 ml. Lalu, dalam setiap tabung reaksi ditambahkan larutan NaNO2 0,1% sebanyak sebanyak 0,1 mL dan diamkan selama 3 menit agar terjadi reaksi secara sempurna. Maksud dari penambahan natrium nitrit adalah agar terjadi reaksi diazotasi reaksi diazotasi merupakan reaksi antara amina aromatik primer dengan natrium nitrit akan menghasilkan garam diazonium. Kondisi yang paling baik untuk reaksi diazotasi pada pH sekitar 0-3. Suhu dalam reaksi diazotasi harus rendah, yaitu <15 0 C karena garam diazonium mudah terurai menjadi fenol dan nitrogen apabila suhu reaksi terlalu tinggi. Digunakan natrium nitrit sebab natrium nitrit lebih stabil dibandingkan asam nitrit yang mudah rusak. Setelah itu, ditambahkan larutan ammonium sulfamat 0,5% sebanyak 0,2 ml lalu didiamkan selama 2 menit agar proses reaksi berlangsung dengan sempurna. Maksud dari penambahan dari ammonium sulfamat agar sisa nitrit dari reaksi diazotasi dapat ditangkap oleh ammonium sulfamat. Asam nitrit yang bersifat sebagai oksidator dapat mengoksidasi senyawa hasil reaksi kopling diazo sehingga dapat lepas menjadi gas nitrogen dan fenol. Oleh karena itu, kelebihan asam nitrit harus dihilangkan. Pada saat penambahan ammonium sulfamat harus dilakukan secara hati-hati karena akan timbul gelembung gas nitrogen seperti reaksi berikut:
Selanjutnya, ditambahkan N(1-naftil)etilendiamin 0,1% sebanyak 0,2 mL campur baik baik lalu diamkan selama 5 menit ditempat gelap. Dengan waktu 5 menit, diperkirakan merupakan operating time untuk campuran tersebut dan kemungkinan reaksi kopling sudah berjalan dengan sempurna. Operating time merupakan waktu yang menunjukkan nilai absorbansi yang konstan terhadap larutan yang dianalisis. Hal ini perlu dilakukan karena pada percobaan ini terjadi suatu reaksi kopling dengan penambahan NED pada suatu senyawa berupa garam diazonium hasil reaksi diazotasi. Reaksi tersebut memerlukan waktu hingga terbentuk senyawa kopling yang stabil yang ditunjukkan dengan diperolehnya nilai atau angka yang konstan pada beberapa kali pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer. N(1naftil)etilendiamin sebagai pengkopling lebih disukai untuk analisis kuantitatif karena produk biasnya berupa larutan dalm air dan punya absorbansi yang tinggi. N(1-naftil)etilendiamin bekerja dalam suasana asam. Setelah itu, larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 545 nm menggunakan spektrofotometer visible terhadap blanko pereaksi yang telah dibuat. Digunakan panjang gelombang 545 nm karena merupakan panjang gelombang maksimum untuk senyawa yang terbentuk. Pada panjang gelombang maksimum absorbansi yang dihasilkan maksimal dan kesalahan pembacaan paling kecil. Hal ini disebabkan karena pada panjang gelombang maksimal terdapat keseimbangan antara energi yang dibutuhkan untuk eksitasi dengan energi yang diberikan untuk eksitasi. Absortivitas molar akan berkurang bila dalam larutan terdapat garam dengan konsentrasi tinggi dan hukum Lamber-Beer tidak terpenuhi bila larutan terlalu pekat. Sehingga sebelum dilakukan pengkuran absorbansi, harus terlebih dahulu dipersiapkan kurva baku sampel sebagai kalibrasi. Manfaatnya, praktikan dapat mengetahui kisaran absorbansi untuk sampel agar masuk dalam kisaran kurva baku. Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung kadar terukur obat dalam sampel, lalu dihitung beberapa paranmeter fisika: 1. Efisiensi Recovery merupakan tolak ukur efisiensi analisis. Analisis memenuhi syarat jika recovery berkisar antara 75-90%. Jika diluar rentang kadar tersebut maka percobaan dianggap kurang efisien. 2. Akurasi Akurasi dianggap baik jika kesalahan sistematik tidak lebih dari 10%. Harga kesalahan sistematik menunjukan kemampuan metode ini memberikan hasil pengukuran sedekat mungkin dengan nilai sebenarnya. 3. Presisi
Presisi dianggap baik jika kesalahan acak tidak lebih dari 10%. Ketepatan menunjukan hasil pengukuran yang berulang pada sediaan hayati yang sama. Setelah dilakukan pembacaan, didapatkan data berupa nilai absorbansi. Pada percobaan ini, didapat nilai absorbansi untuk kadar 20, 50, 100, 200, dan 400 μg/ml berturut-turut sebesar 0,006; 0,000; 0,036; 0,104; dan 0,211. Namun, nilai absorbansi untuk kadar 50 μg/ml terpaksa ditolak dari perhitungan sebab berupa pencilan dan tidak memenuhi teori yang berlaku. Hal ini mungkin disebabkan oleh kesalahan praktikan dalam pembuatan larutan stok 50 μg/ml. Data yang diperoleh kemudian dilakukan regresi linier, dimana kadar sulfametoksazol sebagai nilai X dan absorbansi yang diperoleh sebagai nilai Y, sehingga didapatkan persamaan kurva baku, yaitu y = 5,5850 . 10 -4 x – 0.0120. Lalu, dari data validasi percobaan didapatkan nilai absorbansi untuk kadar 50 μg/ml dengan 2 kali replikasi sebesar 0,104; 0,104; dan 0,100. Kemudian, nilai absorbansi tersebut dimasukan ke dalam persamaan kurva baku sehingga didapat nilai 207,6992 μg/ml untuk nilai absorban pertama sebesar 0,104. Nilai kadar kedua memiliki nilai absorbansi yang sama, sehingga nilai kadarnya pun sama. Kemudian, pada nilai absorbansi ketiga (0,100) didapatkan kadar sebesar 200,5372 μg/ml. Sehingga didapat nilai kadar rata rata sebesar 205,3119 µg/ml dan nilai SD (standar deviasi) didapatkan 4,1350. Setelah itu dicari nilai CV dengan memasukkan rumus :
Sehingga didapat angka 2,0140 %. Kesalahan acak yang ditunjukkan dengan besarnya nilai koefisien variansi (CV) merupakan suatu parameter presisi atau ketepatan pengukuran yang menunjukkan kedekatan hasil-hasil pengukuran secara berulang pada cuplikan hayati yang sama. Kemudian dilakukan perhitungan recovery (perolehan kembali) dengan rumus :
Recovery =
Dimana nilai kadar diketahui sebesar 50 μg/ml dan nilai kadar terukur merupakan besar dari kadar yang kita dapat berdasarkan data validasi dalam percobaan yaitu besar nilai X.
Recovery (perolehan kembali) merupakan parameter efisiensi dari suatu metode analisis. Nilai recovery yang dipersyaratkan adalah 75–90%. Dengan kadar terukur didapat nilai recovery sebesar 415,3384 %. Lalu dengan nilai kadar terukur sebesar didapat nilai recovery sebesar 401,0744 %. Sehingga rata rata dari nilai recovery sebesar 410,5837%. Berikutnya dilakukan perhitungan kesalahan sistematik dengan rumus :
Kesalahan Sistematik = 100% - Recovery
Kesalahan sistematik merupakan parameter akurasi dari suatu penetapan kadar. Harga ini menunjukkan kemampuan metode analisis untuk memberikan hasil pengukuran yang sesuai dengan nilai aslinya. Nilai kesalahan sistemik yang dipersyaratkan adalah kurang dari 10%. Pada nilai recovery 415,3384% didapatkan nilai kesalahan sistematik -315,3384%. Pada nilai recovery 410,0744% didapatkan nilai kesalahan sistematik sebesar -310,0744% sehingga didapatkan nilai rata rata kesalahan sistematik sebesar -313,5837%. Dengan cara yang sama juga dilakukan pada kadar sebesar 300 µg/ml yang mendapatkan angka absorbansi sebesar 0,182 ; 0,200 ; dan 0,198. Pada nilai absorbansi sebesar 0,182 didapatkan nilai x sebesar 347,3590 µg/ml. Lalu pada absorbansi 0,200 didapatkan nilai x sebesar 379,5882 µg/ml, serta yang terakhir pada nilai absorbansi 0,198 µg/ml
didapatkan nilai x sebesar 376,0072 µg/ml. Setelah itu dirata-rata dan didapatkan nilai
rata rata sebesar 367,6515 µg/ml dengan nilai SD sebesar 17,9177. Kemudian, dicari besarnya nilai CV sehingga didapat 4,8736% dan dicari nilai recovery sehingga didapat nilai berturut turut 115,7863 % ; 126,5294 % ; dan 125,3357 % dengan rata rata recovery 122,5505 %. Setelah mendapat nilai recovery, maka dihitung besarnya kesalahan sistematik sehingga didapat nilai kesalahan sistematik secara berturut-turut -15,7863% ; -26,5294 % ; dan -25,3357%. Dengan rata rata kesalahan sistematik sebesar -22,5505%. Nilai X yang didapatkan begitu besar sehingga berimbas kepada nilai recovery serta nilai kesalahan sistematik. Nilai recovery didapat jauh diatas nilai recovery yang ideal yaitu sebesar 75-90%. Sedangkan pada kesalahan sistematik memang nilainya di bawah 10% namun besarnya nilai pun kurang rasional yaitu mencapai minus ratusan. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa metode percobaan yang digunakan memiliki tingkat ketepatan yang tinggi tetapi juga dianggap kurang efisian dan kurang akurat. Selanjutnya dilakukan analisis data pada hasil percobaan dari sampel in vivo. Kelompok praktikan, kelompok B, melakukan percobaan dengan replikasi sebanyak empat kali sehingga didapatkan nilai seperti berikut: Replikasi
Absorbansi (y)
Kadar (X)
1
0,118
232,7663
2
0,102
204,1182
3
0,107
213,0707
4
0,122
239,9284
5
0,132
257,8335
Berdasarkan nilai percobaan, didapatkan nilai recovery berturut-turut sebesar dengan purata sebesar 38,5597 % sehingga didapat kesalahan sistematik sebesar 61,4403 %. Hal ini menunjukan tingkat akurasi sampel yang rendah karena memiliki nilai kesalahan sistematik jauh di atas ideal. Sementara itu, didapat nilai kesalahan acak sebesar 4,7164 % dan nilai ini cukup baik karena menunjukan tingkat presisi yang tinggi.
Tidak
tepatnya
hasil
dalam
percobaan
ini
kemungkinan
disebabkan
oleh
kekurangtelitian praktikan dalam pembuatan larutan stok maupun larutan baku, kesalahan pembacaan absorbansi akibat ketidaktepatan penjelasan asisten praktikum kepada praktikan, kurangnya pengalaman praktikan, dan alat yang digunakan (spektrofotometer) yang kurang akurat serta perlu perbaikan sehingga nilai yang diperoleh kurang tepat. VI. KESIMPULAN
1. Analisis obat dalam cairan hayati dapat diukur dengan parameter farmakokinetika. 2. Metode yang digunakan pada analisis obat dalam cairan hayati adalah metode Bratton-Marshall. 3. Obat yang dianalisis pada percobaan ini adalah sulfadiazin dan cairan hayati yang digunakan adalah darah tikus.
4. Parameter yang digunakan dalam percobaan ini adalah recovery, kesalahan sistemik, dan kesalahan acak. 5. Pada
percobaan
ini
didapat
nilai
recovery
sebesar dengan
purata
sebesar 38,5597 %, sehingga didapat kesalahan sistematik sebesar 61,4403 % serta nilai kesalahan acak sebesar 4,7164 %. 6. Dengan memperhatikan harga parameter yang didapat, hasil analisis dan metode kurang baik karena sensitivitas dan akurasi yang rendah. 7. Hasil yang kurang memuaskan bisa disebabkan oleh kurangnya pengalaman dari praktikan dan alat yang kurang tepat.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Anonim, 2012, Heparin, http://en.wikipedia.org/wiki/Heparin, diakses pada Senin, 6 Mei 2013 pukul 19.40 WIB. Anonim, 2012, Sulfamethoxazole, http://en.wikipedia.org/wiki/Sulfamethoxazole, diakses pada Senin, 6 Mei 2013 pukul 19.59 WIB. Katzung, Betram. 1997. Farmakologi Dasar dan Klinik. Jakarta: ECG. Neal, M.J. 2006. At a Glance Medical Pharmacology Edisi V. Jakarta: Erlangga. Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Ritschel, W. A. 1976. Handbook of Basic Pharmacokinetics, 1st Edition. USA: Drug Inteligence Publication Inc. Shargel, Leon. 1988. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan. Surabaya: Airlangga University Press. Siswandono. 2000. Kimia Medisinal . Surabaya: Airlangga University Press. Smith, R & Steavary. 1981. Text Book of Biopharmaceutics Analysis A Description of Methods for The Determination of Drug in Biological Fluid . Philadelphia: Les & Febiger.
Sudjadi. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Waldon, D.J. 2008. Pharmacokinetics and Drug Metabolism. Cambridge: Amgen, Inc., One Kendall Square. Windholtz, Marta. 1976. The Merck Index An Encyclopedia of Chemicals and Drugs. USA: Merck & Co, Inc.
Yogyakarta, 6 Mei 2013 Mengetahui,
Praktikan,
