EXTRACCION DE ADN EN SANGRE INTRODUCCIÓN: En la anterior practica se trabajó con el ADN extraído de la mucosa oral mediante un hisopado bucal, en esta oportunidad se procederá a extraer ADN de otra sustancia corporal de fácil obtención como viene a ser la sangre, tiene importancia debido a los usos que se le puede dar en el campo médico y policial. MATERIALES Y METODOS Para proseguir con la ext extracción racción se obtendrá la sangre con una lanceta (en el dedo) o con una venopunción(en el antebrazo). 1. En un tubo eppendorf colocar 200 ul de sangre y agregarle 600 ul de buffer de lisis de eritrocitos, agitar por inversión y dejar en reposo por 10 minutos 2. Llevar a vortex por 10 segundos, y centrifugar a 13 000 rpm por 1 minuto. 3. Se obtendrá dos fases, eliminar el sobrenadante (color rojizo) y quedarse con el pellet (blanco). 4. Agregar 300 ul de buffer de lisis al pellet y resuspender con la pipeta hasta que desaparezca el pellet. 5. Al mismo tubo agregarle 2 ul de Proteinasa K e incubar a 65°C por 10 minutos 6. Agregar 4 ul de RNAsa al tubo 7. Incubar a 37ºC por 30 minutos 8. Una vez terminada la incubación, agregar 160 ul de MPC (precipitante de proteínas), cerrar bien el tubo y llevarlo a vortex por 10 segundos (turbidez) 9. Centrifugar por 5 minutos a 13 000 rpm 10. Se debe obtener dos fases en el tubo 11. Retirar a un tubo nuevo el sobrenadante (transparente). 12. Agregar Isopropanol frio (aproximadamente 800 ul) y mezclar por inversión unos minutos 13. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 minutos (se observará un pellet) 14. Eliminar el isopropanol por decantación y proceder al lavado del ADN 15. Agregar 500 ul de Etanol 75º y centrifugar nuevamente a 13 000 rpm de 1 – 1 – 2 2 minutos 16. Eliminar el Etanol y dejar secar en un termoblock a 65º por unos minutos (tubo abierto) 17. Una vez que se evaporo todo el Etanol, resuspender en ADN en 100 ul de Agua ultrapura e incubar en calor de 3 – 3 – 4 4 minutos y congelar hasta su uso. 18. Rotular el tubo con la fecha y el nombre.
RESULTADOS: En esta práctica se decidió obtener la sangre por una venopunción en el antebrazo, la sangre obtenida fue colocada en un tubo eppendorf agregándose 600 ul de buffer de lisis para eritrocitos, se agito y se puso en hielo dejándose reposar por 10 minutos. Se llevó al vortex por 10 segundos y se centrifugo a 13 000 RPM por 1 minuto, con lo que se logró obtener 2 fases en el eppendorf, se retiró el sobrenadante al que se le agrego 300 ul de buffer de lisis y se resuspendio haciendo uso de la micropipeta, se le agrego 2 ul de proteinasa k para ser puesta en baño maría por 10 minutos a 65°C, se le agrego RNAasa (4 ul) para destruir el RNA que quedara en el tubo eppendorf y luego se puso en baño maría por unos 30 minutos a una temperatura de 37°C, a diferencia de los materiales y métodos propuestos, se procedió a agregar 500 ul de fenolcloroformo en ves de los 160 ul de MPC, y luego se llevó al vortex por 10 segundos. Se centrifugo por 5 minutos a 13 000 RPM para obtenerse 2 fases de las cuales se retiraría el sobrenadante transparente y luego agregar isopropanol frio con 800 ul para ser mezclada por inversión por unos minutos. CONCLUSION: Al término de la práctica se obtuvo ADN con isopropanol en un eppendorf, el cual fue almacenado para proseguirse con el lavado del ADN en la siguiente práctica. BIBLIOGRAFIA: Guía practica de Biología Genética y Molecular UCSM, Capitulo Extracción de ADN, 2017
CUESTIONARIO. Escriba la función de los siguientes reactivos utilizados en la extracción de ADN: RNasa. Cataliza la degradación del RNA, dejando al producto limpio de RNA. Proteinasa K, desnaturaliza las proteínas, obteniéndose de esta manera una muestra mas pura. Fenol rompe la pared celular, la membrana plasmática y la membrana nuclear de las células. Cloroformo precipita el ADN Alcohol isoamilico precipita el ADN Alcohol Isopropilico preecipita el ADN Alcohol Etilico al 75 % lavado de componentes de la extracción de ADN Buffer de lisis tiene 4 porciones el Fris que mantiene el pH, el NaCl que proporciona cargas
positivas que neutralizan la carga negativa del ADN, el EDTA que inhibe a las DNAsas secuestrando el magnesio y el SDS un detergente que rompe la membrana nuclear, es el elemento que le da un aspecto espumoso al buffer de lisis. Microperlas de vidrio sirven para la destrucción de las paredes celulares de las bacterias Como describe Pureza y calidad de ADN
la pureza que determina si esta contaminada con proteínas con el uso de un espectofotometro de UV sensible. Explique como se evalua la calidad de ADN extraido
Se usan 3 parametros, la pureza que determina si esta contaminada con proteínas con el uso de un espectofotometro de UV sensible; la concentración y la integridad; por electroforesis que nos da una lectura de bandas que debe coincidir con lo que extraimos. Explique como se mide la concentración de Una solución de ADN.
Comparando la absorbancia de 1 que es a 50 ug/ml a la absorbancia que se obtiene a 260, con una regla de tres simple Cual es la concentración de ADN aislado de una muestra de Isopado bucal. Cual es la concentración de ADN aislado de una muestra de bacterias. Cual es la concentración de ADN aislado de una muestra de Sangre.