Experimento 3 Determinación Determinación de albumina albumina en muestras muestras de suero: suero: método método de verde de bromocresol bromocresol
I.
Resumen: La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre, y una de las más abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. El objetivo del estudio fue determinar niveles de albúmina en muestras de suero y relacionar estos valores con posibles patologías. Este procedimiento fue basado en las propiedades de albúmina sérica de unirse con colorantes, en este caso con el verde de bromocresol a pH ácido. Las concentraciones de albúmina determinadas se encontraron dentro del rango normal, observándose un aumento en las concentraciones de proteínas en muestr as hemolizadas.
II.
Objetivos: Determinar la concentración de albumina en muestras de suero empleando el método verde de bromocresol. Calcular la concentración de globulinas y la relación A/G con los resultados obtenidos.
III.
Introducción:
La albumina es más abundante de la proteínas plasmáticas, su función principal es el mantenimiento de la presión osmótica entre los espacios vasculares y extravasculares. La albumina tiene capacidad de transportar una gran variedad de sustancias (ácidos grasos, fosfolípidos, iones metálicos, ácidos aminados, hormas, bilirrubina...) Un aumento medible de la tasa de albumina se encuentra en casos de deshidratación, una baja en la tasa de albumina puede ser encontrada en caso de defecto de síntesis, mal nutrición, eliminación excesiva (proteinuria) o en enfermedades hepáticas, siendo el defecto de síntesis primario o genético por ejemplo analbuminemia En 1964 se propuso un método con Verde de Bromocresol (BCG). Este procedimiento mostró mayor sensibilidad y menor
susceptibilidad a sustancias de interferencia. El método original ha sido optimizado para mejorar la correlación con métodos electroforéticos. El método está basado en la unión específica del verde de bromocresol (VBC), un colorante aniónico, y la proteína albumina albumina La intensidad del color es proporcional a la concentración de Albumina presente. La albúmina de las muestras de suero se puede determinar por el cambio de coloración del verde de bromocresol cuando se une selectivamente a esta a pH 4.3. El cambio de coloración se refleja en que se provoca un cambio en la absorbancia del verde de bromocresol que tiene un máximo de absorción a 440 nm y pasa a presentar su máximo a 630 nm. El verde de bromocresol es amarillo, mientras que el complejo colorante tiene un intenso color azul. (Laboratory Medical Scientific supply.Inc, 2009)
VALORES DE REFERENCIA (g/dL) Proteínas totales
6.4 - 8.3
Albumina
3.5 - 5.2
globulinas
2.7 - 3.8
A/G
1.2 - 2.2
IV. Materiales, reactivos y equipo: 4.1 materiales:
micropipeta LABMATE 100 µL y 1000 µL, puntillas para micropipeta, tubos de ensayo, vaso químico 100 m, 50 mL. 4.2 Reactivos:
Agua destilada, acido acético, acetato de sodio, verde de bromocresol, hidróxido de sodio.
Agua destilada: Líquido transparente, incoloro, inodoro. Punto de ebullición: 100°C. No toxico, soluble en etanol.
Acido acético: Líquido incoloro de olor acre. La sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Corrosivo por ingestión.
Acetato de sodio: Polvo cristalino higroscópico, blanco. La sustancia irrita levemente los ojos y la piel.
Verde de bromocresol: solido color crema blanquecina, oxidante fuerte, podría causar irritación de la piel, ojos y tracto respiratorio. Hidróxido de sodio: sólido blanco soluble en agua, higroscópico. Absorbe humedad y dióxido de carbono del aire y es corrosivo de metales y tejidos.
4.3 Equipo:
Espectrofotómetro SHIMADZU U-UV mini, gradillas. V.
Metodología:
- Previo a realizar la determinación de albumina en muestras de suero, se tomo una muestra de sangre (libre de hemolisis), se centrifugo y se separo el suero.
- Posteriormente se procedió a la preparación de los reactivos, para esto se realizaron los cálculos correspondiente, seguido de pesaje y dilución. - Etiquetamos los tubos como blanco, patrón, y muestras. - Seguido adicionamos a todos los tubos 1.0 ml. de reactivo verde de bromocresol en cada tubo, posterior a esto transferimos 0.01 ml. (10µl) de agua destilada al tubo blanco, 0.01 ml. (10µl) de suero patrón al tubo patrón y 0.01 ml. (10µ) de suero muestra en cada tubo restante y homogenizamos bien. - Incubamos los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, seguido pusimos en cero el espectrofotómetro con blanco a 630 nm y procedimos a la lectura de la absorbancia de los tubos. - Se realizaron los cálculos correspondientes para conocer la concentración de proteínas en cada muestra, albumina y globulinas y la relación albumina/globulina. VI.
Resultados:
Cuadro 1: Resumen de los cálculos para las concentraciones de proteínas totales, albumina, globulinas y relación albumina/globulina en muestras de suero de estudiantes de tecnología médica III año. UNACHI. FCNYE, agosto, 2015. MUESTRA
PROTEINAS ALBUMINA GLOBULINA TOTALES
A/G
1
8.28
5.26
3.02
1.74
2
7.72
5.35
2.37
2.26
3
7.6
6.39
1.21
5.2
VII.
Discusión:
Este procedimiento fue basado en las propiedades de albúmina sérica de unirse con colorantes, en este caso con el BCG. La
absorbancia de BCG a 630 nm incrementa al unirse con la albúmina y es proporcional a la concentración de albúmina presente en el suero. El contenido sérico de proteínas solubles, aquellas que circulan en fluidos extra e intracelulares, se emplea en clínica como un marcador de ayuda diagnóstica, siendo las principales pruebas analíticas las que están relacionadas con la medición de las proteínas totales y de la albúmina. Las proteínas plasmáticas y la albúmina se hallan mayoritariamente y en forma conjunta, implicadas en el mantenimiento de la normal distribución del agua entre los tejidos y la sangre siendo responsables de la regularización de la presión oncótica del plasma además del transporte de muchas sustancias, incluyendo macromoléculas. (Robles, 2013) En el cuadro 1 se muestran los resultados de las concentraciones de proteínas totales determinada por el método de biuret, concentraciones de albúmina determinada por el método de BCG y las concentraciones de globinas determinadas mediante diferencia entre las concentraciones de proteínas totales menos albúmina así como la relación albumina/globinas. En las muestras estudiadas se observa que las concentraciones de proteínas totales registradas se encuentran dentro del rango normal, al igual que las concentraciones de albúmina con excepción de la muestra 3 que presenta un valor mayor de albumina y un valor disminuido en la concentración de globinas, estando fuera de los intervalos de referencia, este aumento se puede atribuir a que se trataba de una muestra hemolizada dándose un falso aumento por la presencia de hemoglobina libre debido a esto se debe evitar excesos de hemolisis ya que 100 mg/dl de hemoglobina corresponden a cerca de 100
mg/dl de albúmina. Otro factor interferente pudo haber sido el uso prolongado de torniquete ya que aumenta las concentraciones de proteínas en la sangre. Niveles erróneamente altos pueden ser causados por la evaporación en las muestras de suero. Un factor a considerar en la determinación de proteínas es la inadecuada mezcla de las muestras congeladas ya puede ser causa de error del 10-200% de los valores verdaderos. (Arriaga Romero, 2010) Como se muestra en el cuadro 1, al dividir el valor de globulina entre el valor de albúmina se obtuvo la relación existente entre ambos tipos de proteínas, denominada relación A/G, la que es utilizada clínicamente para estimar el tipo y grado de desorden observado en relación al metabolismo de las proteínas. Los valores determinados para la relación A/G se encuentran igualmente dentro del intervalo para valores normales a excepción de la muestra 3 que presenta un valor elevado. La proporción A/G es el mejor indicador disponible para apreciar la relación entre los componentes de las proteínas séricas, que para un individuo cualquier es constante. En varios estados patológicos hay una relación constante entre el aumento de las globulinas y la reducción de las concentraciones de albúmina por ejemplo: Cirrosis, nefrosis, infecciones agudas, neumonía, fiebre reumática. (García & Serrano, 2003) Se puede decir que los valores determinados de proteínas y albúmina en esta experiencia de laboratorio se encuentran dentro del rango normal ya que se trataba de muestras de individuos sanos, en caso de muestras con significación clínica o sospecha de alguna patología un aumento en concentración de albumina indicaría una hiperalbuminemia y en el caso contrario una hipoalbuminemia. La hiperproteinemia o hiperalbuminemia por lo general ocurre en el mieloma múltiple,
causado por altos niveles de inmunoglobulinas monoclonales, deshidratación, excesiva pérdida de agua, como en vómitos severos, diarrea, enfermedad de Addison y diabetes acidósica. La hemoconcentración, descenso en el volumen de agua plasmática, se refleja como una hiperproteinemia relativa, al verse aumentadas en el mismo grado las concentraciones de todas las proteínas plasmáticas individuales. La hipoproteinemia o hipoalbuminemia se presenta en casos de malnutrición, edema, síndrome nefrótico, mala absorción y cirrosis hepática severa. Al estar la albúmina presente a tan alta concentración el simple descenso de esta proteína puede ser causa de hipoproteinemia. (Robles, 2013) VIII. Conclusiones:
Se determinó cuantitativamente las concentraciones de albúmina en muestras de estudiantes de tecnología médica.
La utilización de compuestos cromógenos como el verde de bromocresol y su unión específica a la albumina permitió cuantificar esta proteína por métodos fotocolorimétricos.
La relación albúmina/globulina es útil para indicar anomalías en ciertas estructuras como el hígado o los riñones.
Es imprescindible la toma de muestras libre de hemolisis, para evitar falsos aumentos en las concentraciones de proteínas.
IX. Bibliografía: 1. Arriaga Romero, J. M. (2010). Recuperado el 2 de septiembre de
2015, de http://es.scribd.com/doc/8740308/QcAlbumina-globulina#scribd 2. García, J., & Serrano-Gallardo, L. (31 de marzo de 2003). Recuperado el 2 de septiembre de 2015, de https://www.nlm.nih.gov%2Fmedlinep luspanishFarticle-3480.htm 3. Laboratory Medical Scientific supply.Inc, (2009). Recuperado el 30 de agosto de 2015, de www.mymsupply.com/albumina 4. Robles, M. (14 de julio de 2013). Recuperado el 2 de septiembre de 2015, de http://es.slideshare.net/aureuzz/determi nacin-cuantitativa-colorimetrica-dealbumina-en-suero
