UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE AGRONOMIA
EVALUACION EVAL UACION DE METODOS DE MICROPROPAGA MICROPROPAGACION CION VEGETATIVA VEGETATIVA DE AR ÁNDANOS in vitro ( vitro (Vaccinium Vaccinium corymbosum)
MEMORIA MEMORIA DE TITULO
MAR A ÍA DE LA PAZ TAPIA SA LA S
TALCA TA LCA – CHILE 2009
APROBACIÓN
Profesor Guía:
Ing. Agr., M.S., PhD. Jorge Retamales Aranda Profesor Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca
Profesor Informante: Ing. Agr., PhD. Rolando Rolando García González González Profesor Auxilia Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales Universidad Católica del Maule
RESUMEN
El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne, considerado dentro del grupo de los berries y que ha alcanzado una gran importancia para la agricultura de nuestro país. Los campos en Chile se han plantado principalmente con plantas de dudosa calidad genética y fitosanitaria lo que pudiera comprometer el futuro de este importante fruto de exportación. Las técnicas de cultivo de tejidos pueden contribuir al desarrollo de plantaciones más seguras tanto por su calidad genética como fitosanitaria. Los objetivos de este proyecto de tesis están enfocados en establecer una metodología de micropropagación in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum), para producir plantas de alta calidad genética y fitosanitaria mediante la evaluación de protocolos de desinfección y establecimiento al cultivo in vitro. Para desarrollar un protocolo de micropropagación homogéneo en variedades de arándanos se determinó que el mejor procedimiento para la desinfección y el establecimiento de arándano consistió en desinfectar brotes jóvenes con etanol al 70% por 30 segundos e Hipoclorito de Sodio al 0,1% más HgCl2 al 0,01%. -1
Los segmentos nodales establecidos sobre medio WPM suplementado con 2-iP a 4 mgL
produjeron los mayores niveles de brotación y calidad de los brotes. Se estableció que el cultivo de segmentos nodales de brotes in vitro en medio WPM generó los mayores porcentajes -1
de brotación en todas las variedades, suplementando con 4 mgL de 2-iP. La tasa máxima de multiplicación se obtuvo a las seis semanas. El procedimiento descrito permite propagar de manera eficiente esta especie y estará disponible para uso público y privado.
AB STRACT
Highbush blueberries (Vaccinium corymbosum) have become a very important horticultural species. In Chile, most of the current blueberry orchards have been planted with plants produced with low quality regulations for their genetic properties or under low phytosanitary standards. Tissue culture approaches can be useful to develop planting material with high genetic and phytosanitary quality by propagating selected plant material in relatively short period. In this study a protocol for plant micropropagation was established for different blueberry cultivars by testing several conditions for in vitro establishment and organogenesis from nodal explants. The highest efficiency for plant establishment and shoot formation into in vitro conditions was obtained by washing young shoots from nursery plants with ethanol 70% for 30 seconds, Sodium Chlorine 0,1%,
HgCl2 al 0,01%. Those explants cultivated on WPM
-1
suplemented with 2-iP a 4 mgL yielded the highest shoot emission and physiological quality of the shoots. For the micropropagation step it was determined that the best propagation rate was obtained when nodal segments from six weeks in vitro plants where cultivated on WPM -1
suplemented with 4 mgL of 2-iP. The propagation efficiency depended on the genotype but a standard protocolo was established by managing the interaction between basal medium and plant growth regulators. It was established that blueberry reach its highgest propagation rate in the six week after planting in the studied media.
INDICE
I. INTRODUCCION
1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
4
2.1. Descripción de la especie 2.1.1. Botánica 2.1.2. Propagación de arándanos
4 4 5
2.2. Cultivo de tejidos vegetales 2.2.1. Desinfección, introducción, establecimiento de material vegetal al cultivo in vitro.
6
2.3. Micropropagación vegetativa in Vitro 2.3.1. Ventajas 2.3.2. Desventajas
9 11 11
8
2.4. Efecto del medio de cultivo sobre la eficiencia en la micropropagación de plantas.
12
2.5. Rol de los reguladores del crecimiento en la micropropagación in vitro de especies vegetales.
14
2.6. Cultivo in vitro de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum).
16
III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Material vegetal 3.1.1. Material vegetal para ensayo de desinfección y brotación. 3.1.2. Material Vegetal para ensayo de multiplicación.
18 18 18 18
3.2. Desinfección, introducción y establecimiento in vitro del cv. Brigitta a partir de segmentos nodales.
18
3.3. Criterios de Evaluación y diseño del experimento de tratamientos desinfectantes. 3.4. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro. 3.4.1. Diseño experimental y criterios de evaluación. 3.5. Efecto de los medios basales y reguladores del crecimiento sobre la tasa de multiplicación de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum) cultivados in vitro . 3.5.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento de tratamiento de multiplicación.
20 20 21 21 22
3.6. Efecto de la posición de los explantes sobre la tasa de multiplicación en plantas in vitro de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum).
3.6.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento.
3.7. Análisis Estadístico.
23 23 23
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
24
4.1. Efecto de desinfectantes sobre el establecimiento al cultivo in vitro de segmentos nodales del cv. Brigitta.
24
4.2. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro.
26
4.3. Efecto de la interacción de dos medios basales (WPM y MS) y diferentes concentraciones de Citoquininas/Auxinas, sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum).
27
4.4. Efecto de la posición de explantes de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum) de los cv. Elliott y Bluecrop sobre medio basal WPM suplementado con 2-iP (5mg L-1).
33
4.5. Evolución temporal de la tasa de multiplicación en Vacciunium corymbosum cv. Bluecrop, O´Neal y Elliott.
34
V. CONCLUSIONES
38
VI. BIBLIOGRAFIA
39
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Tratamientos utilizados para la desinfección de explantes de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta.
19
Cuadro 2. Tratamientos con reguladores de crecimiento para establecimiento y brotación de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta.
21
Cuadro 3. Tratamientos de multiplicación para los cv. Elliot, Bluecrop y O´Neil.
22
Cuadro 4. Efecto de tratamientos desinfectantes sobre la tasa de desinfección, la tasa de oxidación y tasa de brotación en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 21 días desde introducción.
25
Cuadro 5. Efecto de reguladores del crecimiento sobre la tasa de brotación y aparición de hoja en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 14 días desde introducción.
27
Cuadro 6. Efecto de la interacción de dos medios de cultivo WPM y MS y 6 tratamientos con reguladores de crecimiento sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándano de arbusto alto in vitro, después de 6 semanas de cultivar las plantas.
28
Cuadro 7. Efecto de medios de cultivo basales sobre la tasa de multiplicación en arándanos de arbusto alto. (Vaccinium corymbosum) después de 6 semanas de cultivar las plantas.
32
Cuadro 8. Efecto de la posición horizontal y vertical de plantas de arándanos (Vaccinium corymbosum), después de 6 semanas de cultivar las plantas.
33
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. O´Neal en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento.
34
Figura 2. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. Elliott en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento.
35
Figura 3. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. Bluecrop en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento.
36
INDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Análisis
del efecto de la interacción entre medios de cultivo y variedades de arándanos de arbusto alto sobre la tasa de multiplicación in vitro. 28 Gráfico 2. .
Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y O´Neal en medio basal WPM . 29
Gráfico 3.
Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y O´Neal en medio basal MS . 30
I. INTRODUCCION
El arándano de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne de gran importancia comercial para Chile, considerado dentro del grupo de los berries (Buzeta, 1997). La mayoría de los países productores de este fruto se encuentran en el hemisferio norte. Estados Unidos, el principal mercado para la fruta producida en Chile, no solo es el mayor productor mundial sino que también consume el 50% de fruta fresca, congelada o procesada. Si bien Chile es una fuente de abastecimiento en contraestación de arándanos, es necesario destacar que Argentina, Nueva Zelanda, Australia, Perú y Sudáfrica aparecen como fuertes competidores para los exportadores chilenos en el corto y mediano plazo (Alcaíno, 2008). En Chile el cultivo del arándano a escala comercial comenzó alrededor del año 1985, fecha desde la cual el cultivo ha crecido en forma sostenida tanto en superficie como en volumen de producción. Este desarrollo ha sido impulsado tanto por la alta demanda en el mercado norteamericano como por la alta rentabilidad y difusión de su consumo en otros mercados del hemisferio norte (Dastres, 2008). En la actualidad la superficie nacional cultivada con arándanos se estima en 10.700 ha, con un volumen de exportación en la temporada 2007/08 cercana a las 30.195 T, observándose un crecimiento del 42% con respecto a la temporada 2006/07 (Alcaíno, 2008; Rosas, 2008). El crecimiento sostenido de la demanda no solo ha elevado las exportaciones, sino también ha incrementado las exigencias de calidad en los mercados de destino. Por esta razon, los productores han debido perfeccionar sus manejos agrícolas y prácticas productivas, lo que ha creado la necesidad de optimizar los procesos de producción con tecnologías de alto nivel que permitan solucionar problemas precisos de propagación y saneamiento de plantas. La biotecnología proporciona herramientas para hacer frente a dichas necesidades, a través de la micropropagación que es una de las técnicas de mayor desarrollo en la actualidad en el campo del cultivo de tejidos vegetales. El cultivo in vitro se ha convertido en un método práctico y rentable que resuelve muchos de los inconvenientes que presentan los productores de Chile, como por ejemplo: la escasez de material vegetal de ciertas variedades y su consecuente alto costo de adquisición, la alta probabilidad de
1
obtener material vegetal enfermo y la heterogeneidad de plantas. Se ha demostrado que plantas de arándanos de arbusto bajo ( Vaccinium angustifolium) propagadas in vitro tienen un crecimiento de tallos más largos y vigorosos con un mayor número de hojas que plantas multiplicadas por estacas (Debnath, 2005). En líneas generales, las aplicaciones del cultivo in vitro con fines de investigación o comerciales pueden concentrarse en tres ámbitos: mejoramiento genético, producción de plantas libres de enfermedades y propagación vegetativa (Gravina et al., 1995). La importancia del arándano como fruta de consumo en varios mercados ha impulsado el desarrollo de proyectos de investigación en el campo del cultivo in vitro, la micropropagación y la ingeniería genética (Rowland y Ogden, 1992; Cao et al., 1998; Cao et al., 2003). Se han establecido protocolos de multiplicación a partir de brotes vegetativos en medio basal Woody Plant (WPM) (Lloyd y McCown, 1980) con diferentes modificaciones en su composición nutricional (Cao et al., 2003). A su vez, se ha evaluado la respuesta morfogénica de la especie ante la presencia de diferentes tipos de citoquininas (Ostroloucká et al., 2004; Meiners et al., 2007). Estos estudios han concluido que en arándanos las citoquininas, especialmente la zeatina tiene un efecto fisiológico más importante que las auxinas para inducir la diferenciación de los brotes (Abdelnour-Esquivel, 1991; Ostroloucká et al., 2004). La influencia del genotipo en la respuesta morfogénica ha sido evidenciada para esta especie y se ha demostrado que existe interacción entre los reguladores del crecimiento y la variedad (Ostroloucká et al., 2004; Debnath, 2005). Estas evidencias indican que las tasas de multiplicación en condiciones in vitro pueden ser variables y dependientes de las condiciones de cultivo en las que se manejen las
diferentes variedades, lo que afectaría el de sarrollo comercial de estos protocolos. En Chile el estado de la tecnología para la propagación masiva de arándanos a escala comercial se encuentra aún en desarrollo y bajo la regulación de las empresas que la explotan, por lo que se hace necesario establecer protocolos eficientes y flexibles para el uso público. Por estas razones, y basados en la hipótesis de que ”la respuesta morfogénica en arándanos de arbusto alto podría ser inducida de manera homogénea en diferentes variedades para su uso público y comercial mediante el manejo de la composición nutritiva del medio basal y el uso de reguladores del crecimiento”, se han establecido los siguientes objetivos de trabajo.
2
OBJETIVO GENERAL
Establecer una metodología de micropropagación in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum), para producir plantas de alta calidad genética y fitosanitaria para uso público y comercial.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
•
Establecer un protocolo de desinfección y establecimiento al cultivo in vitro a partir de plantas de arándanos de arbusto alto.
•
Homogenizar la tasa de multiplicación en plantas de arándanos de arbusto alto micropropagadas, mediante el manejo de la composición del medio de cultivo basal, el tipo y las interacciones de los reguladores del crecimiento a diferentes concentraciones en el medio de cultivo.
3
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Descripción de la especie
El arándano de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum L.) pertenece a la familia Ericaceae, subfamilia Vacciniaceae, subgénero Cyanococcus (Pritts y Hancock, 1992). Fue introducido a Chile en la década de los 70 por el Istituto de Investigación Agropecuaria-INIA, pero su plantación a escala comercial con destino a la exportación comenzó alrededor del año 1985. Las mayores áreas de producción se encuentran entre la VII y la IX Región (Asoex, 2001). Existen dos tipos principales de arándanos de arbusto alto, los del Sur y Norte, y se clasifican de acuerdo a sus requerimientos específicos de horas de frío. Los del Sur requieren menos de 600 horas de frío y los del Norte de 750-1000 horas de frío a temperaturas menores de 7º C (Hancock, 1991).
2.1.1. Botáni ca
Es una planta de lento desarrollo vegetativo que crece naturalmente en el sotobosque de Norte América. Se desarrolla en zonas de veranos templados con suelos ricos en materia orgánica y pH baj o, entre 4,5 y 5,5 (Eck, 1988). Su sistema radical compuesto de finas raicillas, es superficial, fibroso y de poca extensión. Carece de pelos radicales, por lo que su capacidad de absorción es mucho menor que el de otras especies. La mayor parte de sus raíces se concentra dentro de los primeros 25 cm, en el área dentro de la línea de goteo del arbusto, aunque pueden extenderse hasta 2 m desde el tallo (Buzeta, 1997). Sus hojas son simples, de bordes aserrados y se distribuyen en forma alterna a lo largo de la ramilla. Su tamaño puede variar de 1 a 8 cm de largo y la forma varía de ovada a lanceolada. El arándano de arbusto alto presenta una pigmentación rojiza bien marcada en sus hojas durante el otoño. La floración es en racimos, generalmente axilares, pero pueden ser terminales en algunas ocasiones (Buzeta, 1997).
4
El fruto es una falsa baya esférica. Dependiendo del cultivar puede variar en tamaño (0,7 a 1,5 cm de diámetro) y en color (desde azul claro hasta azul oscuro). La epidermis del fruto del arándano alto es delgada, característica que probablemente le otorga una menor vida de poscosecha que la especie “ojo de conejo” ( Vaccinium ashei).
2.1.2. Propagaci ón de arándano s
La propagación de esta especie puede realizarse por semillas, hijuelos, enraizamiento de estacas o mediante cultivo de tejidos (Noé et al., 1998; Cao et al., 2003; Ostrolucká et al., 2004; Meiners et al., 2007). La propagación por semilla sólo se utiliza para mejoramiento genético, ya que los arándanos son especies altamente heterocigotas; por tanto, la descendencia no conserva las características de los padres (Buzeta, 1997). La propagación por estacas es una de las técnicas más utilizadas para la propagación comercial de arándanos en Estados Unidos (Buzeta, 1997). Esta es la técnica de propagación más fácil y económica de aplicar; sin embargo, en Chile ha tenido una serie de complicaciones que repercuten en un bajo y a veces nulo enraizamiento. Estos resultados negativos pueden tener relación con las distintas capacidades naturales de enraizamiento que presentan las variedades de arándanos. Pese a que se ha importado material para el enraizamiento, esta práctica ha presentado complicaciones técnicas debido a variaciones climáticas entre los sitios donde se originaron y desarrollaron las variedas importadas (Muñoz, 1991). Dado los reconocidos beneficios para la salud por su consumo, la demanda de arándano se mantiene en aumento no solo en el mercado norteamericano, sino también en mercados no tradicionales para este fruto, como el europeo y el chino (Alcaíno, 2008; Dastres, 2008), lo que ha estimulado a los productores agrícolas de Chile a mantener un ritmo creciente en el establecimiento de nuevas plantaciones, existiendo un recambio varietal y de especie, reduciendo la importancia relativa de ojo de conejo y aumentando la de arbusto alto. Dentro de arbusto alto se están incorporando nuevas variedades tanto de alto como bajo requerimiento de frío (Retamales, 2008 1).
5
La propagación de plantas es una actividad comercial interesante, sin embargo, los métodos convencionales de propagación vegetativa son incapaces de proporcionar las grandes cantidades necesarias de plantas requeridas por los actuales programas de desarrollo del cultivo de esta especie. Por ello se requieren alternativas de métodos de propagación que aseguren mayores volúmenes de plantas pero también una mayor calidad fitosanitaria y seguridad con los genotipos que se comercializan (Debnath, 2007). Debido a lo anterior se han buscado diversos mecanismos biotecnológicos para la obtención de material vegetal de forma rápida y eficiente, de manera de mejorar la disponibilidad de estos para los productores (Thorpe, 2007). Así se ha llegado a la masificación del cultivo de tejidos vegetales mediante la micropropagación in vitro.
2.2. Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales en condiciones de asepsia debe su origen a las ideas del científico alemán del siglo XX Haberlandt. El período entre los años cuarenta y los años sesenta fue marcado por el desarrollo de nuevas técnicas y la mejora de aquéllas que ya estaban en práctica (Thorpe, 2007). En los años noventa hubo una expansión continua en la aplicación de tecnologías in vitro, con el principal objetivo de aumentar el número de especies de plantas de interés comercial
posibles de someter a estas técnicas. Los diversos cultivos celulares han seguido siendo una herramienta importante en el estudio de áreas básicas de biología y bioquímica y han asumido la gran importancia en estudios de biología molecular y biotecnología agrícola (Thorpe, 2007).
1
6
Comunicación personal
El cultivo de tejidos vegetales comienza desde el momento mismo que se selecciona una especie, después de haber identificado el problema que se debe solucionar y los medios para hacerlo. Las técnicas de cultivo de tejidos destinadas a la micropropagación, descansan sobre dos procesos morfogénicos fundamentales: la organogénesis y la embriogénesis somática (García et al., 2007). La organogénesis es la formación de órganos vegetales a partir de un determinado tejido para formar plantas completas. Esta se caracteriza por ser polar, es decir sólo se emite un órgano aéreo o una raíz y a partir de ella se regenera la planta completa. A su vez, la organogénesis puede ser directa, si el brote organogénico se obtiene directamente a partir del explante, o indirecta, si el proceso organogénico ocurre a partir de callos formados previamente en el explante inicial (Sugiyama, 1999; Vijaya y Giri, 2003). La embriogénesis somática, no es más que la obtención de embriones a partir de tejido somático de la planta (cualquier tejido no sexual) para obtener una planta completa. A diferencia de la organogénesis, este es un proceso polar donde se obtienen las estructuras aéreas de la planta y las raíces a partir del embrión somático. También puede ser directa o indirecta, si el proceso ocurre a partir del explante inicial o a partir de callos previamente inducidos. Consta de cuatro etapas fundamentales: A) Inducción del callo; B) Formación y proliferación de embriones; C) Maduración de los embriones; D) Germinación de los embriones. A su vez los embriones pueden pasar por tres formas en su desarrollo: la globular, la de corazón y la de torpedo (Ammirato, 1983). Cada una de las etapas de la embriogénesis somática, así como las diferentes fases de los embriones varía según las especies y los genotipos con los que se trabaje (García, 2007). El desarrollo de las técnicas de regeneración de plantas mediante organogénesis o embriogénesis somática ha sido el pilar del desarrollo de las técnicas de propagación masiva de plantas. Usualmente, se dice que el Cultivo de Tejidos consta de cuatro fases, pero ese concepto limita el uso de esta técnica a la propagación masiva y hoy se sabe que el cultivo de tejidos tiene mucho más alcance como tecnología. Es por esto que se considera que es la propagación de plantas mediante cultivo in vitro la que tiene cuatro fases fundamentales (George y Debergh, 2008). Existen diversas
7
fases secuenciales características del cultivo
in
vitro.
Según Pierik (1990), estas son:
Acondicionamiento, establecimiento, multiplicación, enraizamiento y adaptación ex vitro.
2.2.1. Desinfección, intr oducci ón, establecimiento de material vegetal al c ulti vo in vitro .
La contaminación por hongos, bacterias y levaduras causa grandes pérdidas en la micropropagación comercial de especies vegetales y en los trabajos de investigación. El control de la contaminación in vitro es fundamental para aumentar la eficiencia de la micropropagación (Digonzelli et al., 2005).
La contaminación biótica en cultivo de tejidos es causada por la entrada de patógenos u otros microorganismos contaminantes sobre o al interior de los explantes utilizados para el cultivo in vitro. Estos pueden ser microorganismos presentes en el ambiente que causen contaminaciones en cualquiera de las etapas del cultivo de tejidos o microorganismos que se encuentren dentro de la planta (Loyola y Vásquez, 2006). Se habla de contaminación endógena, al existir infestación a nivel interno del explante y no poder ser eliminados por desinfección externa mientras que es exógena cuando la infestación ocurre a nivel externo del explante, lo que puede ser causado por contaminación ambiental, métodos de esterilización ineficientes o asociado a manejo humano (Loyola y Vásquez, 2006). Digonzelli et al. (2005) plantean que la contaminación microbiana puede tener dos orígenes: a) Microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófitos) y b) Fallas en los procedimientos de laboratorio. Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos, bacterias y levaduras, denominados “vitro patógenos”, que en muchos casos no son patógenos en condiciones de campo. Su efecto es muy dañino, ya que compiten con el explanto por los nutrientes del medio y les producen daños directos e indirectos por la colonización de sus tejidos o la eliminación al medio de metabolitos tóxicos (Digonzelli et al. 2005)
Las bacterias son los contaminantes más comunes y ocasionan serios problemas porque pueden ser sistémicas, así como difíciles de detectar y de eliminar. Estos microorganismos escapan a
8
los efectos de los esterilizantes superficiales y pueden ser inter o intracelulares. Entre los últimos, se encuentran virus, viroides y muchos géneros bacterianos como: Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Erwinia, Enterobacter. Su distribución puede ser localizada o sistémica,
por xilema o por floema (Leifert et al., 1994.) Con el objeto de disminuir la carga de microorganismos contaminantes tanto exógenos como endógenos del tejido que se utilizará para micropropagar, debiera iniciarse un adecuado programa de aplicación de fungicidas y bactericidas en plantas madres antes de la extracción de los explantes (Seemann y Barriga, 1993). Los contaminantes bacterianos no se manifiestan en los primeros subcultivos, ya que la alta presión osmótica, el pH y ciertas hormonas de los medios de cultivo, pueden inhibir su crecimiento. Debido a este efecto inhibitorio, muchos microorganismos requieren un periodo de adaptación a las nuevas condiciones antes de manifestar su presencia, esto se da por lo general en la fase de multiplicación.
2.3. Micropropagación vegetativa in vitro
La micropropagación in vitro es una técnica de multiplicación que consiste en un procedimiento aséptico en el cual se manipulan plantas, órganos, tejidos o células para originar poblaciones de plántulas. Este procedimiento implica que cada una de las plántulas que se producen pueda crecer y ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta de la cual procede. La micropropagación tiene la gran ventaja de obtener un gran número de plántulas, a partir de una planta madre, resultado que no se obtiene con los métodos clásicos de propagación vegetativa (Vidalic, 1992; George, 2008). Thorpe (2007) y George (2008) describen esta práctica especificando que es el cultivo sobre un medio nutritivo, totalmente aséptico de segmentos apicales y nodales en el que se encuentra su yema axilar. Por su parte, Pierik (1990) caracteriza esta técnica como un cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, explantes, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores. Este cultivo de material vegetal se realiza en tubos de ensayo o en
9
recipientes que puedan controlar de manera precisa, la asepsia, así como las condiciones ambientales y nutritivas (Hartmann y Kester, 1995). La micropropagación in vitro tiene la ventaja de multiplicar material libre de enfermedades, debido a la total asepsia con que se trabaja. Así al detectar la presencia de bacterias y hongos en el medio de cultivo, se excluye el material contaminado (Buzeta, 1997). Edwin et al. (2008), indican que no es correcto decir que mediante la micropropagación se obtienen plantas libres de virus y bacterias, ya que es imposible asegurar que una planta está libre de todas las enfermedades bacterianas o contaminaciones virosas. Sólo se puede demostrar que una planta está libre de una contaminación específica, siempre que estén disponibles las herramientas adecuadas de diagnóstico. Pierik (1990) asegura que las células vegetales poseen totipotencialidad, lo que permite el cultivo in vitro; es decir, cada célula vegetal viva con núcleo, es capaz de reproducirse de forma completa e idéntica a la planta madre de la cual proviene. Según Haberlandt (1921) y Takebe et al. (1971) la totipotencia celular es la capacidad heredable que tienen todas las células vivas de dar origen a una nueva célula genéticamente idéntica y a partir de procesos de división celular y diferenciación formar tejidos, órganos, sistemas y finalmente un ind ividuo completo. Desde el punto de vista práctico, los mecanismos que desencadenan la obtención de una planta a partir de una célula o una sección de tejido dependen de factores que varían según la especie, el tipo y la edad del tejido, las condiciones ambientales y la composición de los medios de cultivo (García et al., 2007). El cultivo in vitro presenta variados usos y utilidades, pues puede ser aplicado para estudios fisiológicos, genéticos y bioquímicos. Puede usarse entre otros para la obtención de plantas libres de patógenos, en la propagación masiva clones y en la conservación de germoplasma. (Hartmann y Kester, 1995). Thorpe (2007), define esta aplicación como ideal para la masificación de especies o genotipos con potencial comercial como son las flores de corte, las plantas ornamentales y los frutales. La respuesta del cultivo in vitro variará dependiendo de varios factores, tales como: los explantes que se utilicen, el medio de cultivo en el que se establecerá el material a propagar y la combinación apropiada de reguladores del crecimiento (Pierik, 1990; George, 2008; George y Debergh, 2008).
10
2.3.1. Ventajas
El uso de este método proporciona diversas ventajas, entre las cuales podemos mencionar:
a) Homogeneidad en la producción de plantas. b) Control de las condiciones ambientales. c) Propagar utilizando diferentes vías vegetativas y en variedades que pueden resultar difíciles de multiplicar por métodos tradicionales de propagación. d) Mejorar el proceso de enraizamiento en plantas difíciles de propagar. e) Obtener plantas de alta calidad sanitaria y seguridad en la identidad genética del producto final. (Edwin, et al., 2008). f)
Plantas con mayor vida productiva, mayor vigor y mejor homogeneidad en el establecimiento de plantas (Ozer, 2006).
g)
Edwin et al. (2008) señalan que el número de plantas es mucho mayor que en
macropropagación, debido a la gran cantidad de plantas que se obtienen en un tiempo dado. Es posible obtener además copias de plantas que son lentas y difíciles de propagar vegetativamente, pudiendo ser la producción continua durante el año independiente de las condiciones estacionales.
2.3.2. Desventajas
Sin embargo, a pesar de lo anterior, la micropropagación presenta algunas desventajas:
a) Es una técnica especializada y con un alto costo inicial de producción (Edwin et al. 2008). b) Podría existir variación genética respecto a la planta madre producida por la elevada tasa de proliferación y la rápida multiplicación (Ellena, 1998). c) Las plantas cultivadas in vitro no son capaces de satisfacer sus propios requerimientos de compuestos orgánicos mediante fotosíntesis (no son autótrofos), por lo que tienen que sufrir un período transitorio antes de crecer de forma inde pendiente (Kozai y Smith, 1995).
11
d) Debido a que las plantas realizan niveles reducidos de fotosíntesis y crecen dentro de recipientes cerrados con una alta humedad relativa, son altamente susceptibles a perder agua en ambientes externos, produciendo plantas fisiológicamente difíciles de adaptar a condiciones ex vitro (Edwin et al., 2008).
2.4. Efecto del medio d e cultivo sobre la eficiencia en la mic ropropagación de plantas.
Los medios de cultivo son la fuente de energía, el soporte físico y el sustrato para el explante. Su función principal es proporcionar l os nutrientes básicos para el crecimiento continuo de los explantes aislados y los propágulos subsiguientes, además de dirigir el crecimiento y desarrollo mediante el control fisiológico a través de reguladores del crecimiento (Hartmann y Kester, 1995). Por ser determinante en el crecimiento y desarrollo celular de la planta, en el sistema de propagación in vitro se requiere definir los medios de cultivo para sus diferentes etapas (Salisbury y Ross, 1994). Existe un conjunto de elementos minerales que son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas, los que se añaden de forma frecuente a los medios de cultivo. La preparación más difundida entre los laboratorios comprende una agrupación de elementos base y nutritivos para inducir el crecimiento y desarrollo (Edwin et al., 2008; García, 2007). Estos son: a) Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S). Son aquellos elementos inorgánicos que la planta consume en grandes cantidades y que intervienen en procesos vitales para la planta como la fotosíntesis, el crecimiento y el enraizamiento. b) Los microelementos (B, Co, Cu, Mn, I, Fe, Zn, Ni ). Corresponde a elementos químicos o iones que la planta consume en pequeñas cantidades, pero que son esenciales para el desarrollo de procesos metabólicos en la planta. (García et al., 2007; Edwin et al., 2008).
Es de vital importancia proporcionar compuestos orgánicos para favorecer el desarrollo morfogénico de plantas en cultivo in vitro. Estos pueden ser vitaminas, aminoácidos y sacarosa, entre otros. La cantidad específica necesaria dependerá de la especie y genotipo de la misma, pero en términos generales su proporción en el medio de cultivo debe ser baja (Edwin et al., 2008).
12
Las plantas en cultivo in vitro no fotosintetizan eficientemente, por lo que se necesita el suministro de carbono orgánico que garantice la energía necesaria para el metabolismo celular. La fuente de carbono más utilizada es la sacarosa, debido a su bajo costo y mayor disponibilidad comercial; además, garantiza que los dos monosacáridos que la componen (glucosa y fructosa) estén disponibles en el medio una vez hidrolizada. Así las células vegetales pueden hacer uso de ellas de acuerdo a sus necesidades (Thorpe et al., 2008). Las vitaminas facilitan la respuesta de los tejidos vegetales y permiten manejar la oxidación en algunos tipos de explantes. Dentro de las vitaminas más utilizadas se encuentran: Tiamina, Myoinositol, mesoinositol, piridoxina, ácido nicotínico y ácido ascórbico. A pesar de que no son esenciales en la composición de los medios de cultivos, los aminoácidos más utilizados, y que también permiten modular la respuesta oxidativa y las respuestas morfogénicas de los tejidos son: glicina (la más utilizada), arginina, aspargina, ácido aspártico, alanina, ácido glutámico, glutamina, prolina y L-cisteína (George y de Klerk, 2008). Para los medios de cultivo sólido se necesita de un material inerte que facilite la estructura física que soporte las plantas, permita la asimilación de los nutrientes y que a su vez mantenga los tropismos deseados en función del tipo de explante y la especie con la que se trabaje. Se utilizan los medios solidificados con agar, phytagel o almidones (Chiriqui, 2008). La preparación de los medios de cultivo es una fase crítica en los procedimientos de cultivo de tejidos, pues de ella depende la correcta ejecución de los experimentos y los resultados obtenidos (García et al., 2007). El pH del medio de cultivo juega un papel importante en la eficiencia de asimilación de los elementos nutritivos y también en la solidificación de los medios líquidos. Por lo general, y en dependencia de la especie con la que se trabaje, el rango de pH debe estar entre 5 y 6,5. Valores de pH por debajo de 5 en el medio de cultivo puede provocar la toxicidad de los iones Co 2+ y Cu2+, presentes en el medio de cultivo, y reducir la capacidad de polimerización de la mayoría de los agentes gelificantes. Por encima del pH 6,5 se afecta la solubilidad de las sales presentes en el medio de cultivo y la asimilación del nitrógeno que se encuentra en el medio en forma de NH 4 (George y de Klerk, 2008).
13
Ostrolucká et al. (2004) estudiaron el efecto de diferentes valores de pH (3,0; 3,5; 4,0; 4,5 y 5,0), sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos Vaccinium corymbosum cv. Duke, obteniendo resultados óptimos entre pH 4,0 y 5,0. Para la introducción de plantas de carácter leñoso se utilizan diferentes medios de cultivo, dependiendo de la especie vegetal que se trate. Generalmente para una especie leñosa como Vaccinium corymbosum se usa el medio Woody Plant Medium (McCown y Lloyd, 1983) suplementado
con 2-iP (citoquinina), regulador del crecimiento con que las plantas leñosas presentan una mejor respuesta en la estimulación del crecimiento y desarrollo debido a una mayor estimulación a la división celular (Muñoz, 1990).
2.5. Rol de los reguladores del crecimiento en la micropropagación in vitro de especies vegetales.
Las hormonas son compuestos orgánicos sintetizados por l as plantas superiores. Estos influyen en el crecimiento y desarrollo de la misma, actúan generalmente distante al l ugar donde son producidas y son activas en pequeñas cantidades. Existen productos de origen sintético que actúan de forma semejante a las hormonas. A este conjunto de productos sintéticos más las hormonas se les denominan reguladores del crecimiento. Estos intervienen en los procesos metabólicos y fisiológicos de las plantas y determinan el crecimiento relativo de todos sus órganos (Pierik, 1990; Chriqui, 2 008). La utilización de reguladores del crecimiento en el cultivo in vitro es muy importante, especialmente las auxinas y citoquininas, tanto así que un grupo importante de especies no podría cultivarse in vitro sin el uso de éstas (Thorpe, 2007). Además, cabe señalar que la respuesta al uso de auxinas y citoquininas dependerá del tipo de explante y de la especie vegetal (Pierik, 1990; Machakova et al., 2008; van Staden et al., 2008; Moshkov et al., 2008).
En los procesos de morfogénesis in vitro son elementales las auxinas y citoquininas, ya que estimulan la elongación y división celular, según la combinación y concentración de estas. La auxina juega un papel fundamental induciendo la elongación, o en algunos casos la división celular. Por otro
14
lado, frecuentemente las auxinas inducen la formación de raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios (Pierik, 1990). Klee y Estelle (1991) precisaron que en condiciones de propagación in vitro la respuesta del tejido depende del tipo de regulador de crecimiento y la respectiva dosis utilizada, la cual será diferente para cada especie vegetal. Por ello no existe una regla general en la respuesta morfogenética. Kogl et al., (1934) lograron identificar por primera vez el Ácido Indol-3-Acético (AIA), una auxina vegetal. El AIA se produce de forma natural en las plantas y es una de las responsables junto a otras auxinas (IBA, ANA) de la elongación celular, expansión de los tejidos, y división celular, entre otros. Una baja concentración de auxina promueve la formación de raíces adventicias, mientras que con altas concentraciones tiene lugar la formación de callo (Pierik, 1990). Las citoquininas se utilizan para estimular el crecimiento y el desarrollo, siendo las más comunes: Kinetina, BAP y 2-iP. Generalmente estimulan la división celul ar y más aún si van en conjunto con una auxina. En concentraciones altas promueven la formación de vástagos axilares; debido a que disminuyen la dominancia apical, uno de sus efectos es retardar el envejecimiento. Otro grupo de reguladores del crecimiento son las Giberelinas. Estas inducen la elongación de los entrenudos y el crecimiento de los meristemos e inhiben la formación de raíces adventicias (Pierik, 1990; Machakouva et al 2008; Van Staden, 2008). Existen otros compuestos como la Fenilurea y sus derivados. Se descubrió en diferentes bioensayos que el DPU (N, N-difenilurea) presenta actividad tipo citoquinina. Los compuestos más activos son las piridil ureas y las diazol ureas (Tidiazurón y derivados), que son hasta 10.000 veces más activas que el DPU, y más activas que las citoquininas naturales, tipo adenina como la zeatina (Pierik, 1990; Van Staden,2008). El Tidiazurón (TDZ) estimula la proliferación de los vástagos en algunas especies leñosas. Se ha encontrado que resulta activa en concentraciones de 0,05-0,1uM (Pierik, 1990). En arándanos de arbustoo alto (Vaccinium corymbosum) la 2-iP y zeatina, son más efectivas en la proliferación de brotes, que otras citoquininas (Eccher y Noe, 1989). La utilización de 2-iP es más común, debido a su menor costo, pero al combinar ambos compuestos se obtienen mejores resultados que al utilizar cualquier otro, o estos mismos de forma separada (Eccher y Noe, 1989).
15
2.6. Cultivo in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum )
La micropropagación de este grupo de especies de arándanos, está tomando mayor interés en países productores y con potencial exportador (Edwin et al., 2008). Diversos estudios se han realizado sobre la introducción, establecimiento y multiplicación de esta especie in vitro. Cao et al. (2003) investigaron los efectos de la concentración de sacarosa en el medio de cultivo para la micropropagación de Vaccinium corymbosum. En explantes de la variedad Bluecrop con brotes axilares de 0,5 cm, se les aumentó la concentración de sacarosa en el medio de 15 mM a 24, 44 ó 54 (µM) respectivamente. No hubo respuesta en el aumento de número de brotes. En cambio en cv.Duke, al aumentar las concentraciones de sacarosa de 15 a 48 µM y de 15 a 58 µM, hubo aumento en el número de brotes. Debnath (2007), estudió la influencia del Acido indol butírico (IBA) sobre la tasa de crecimiento. En este estudio se observó mayor crecimiento y desarrollo de brotes de arándanos de arbusto bajo (lowbush), Vaccinium angustifolium a concentraciones de 20 µM. Ostrolucká et al. (2004), estudiaron el efecto de distintas concentraciones de zeatina (0,5; 1,0; 2,0 mgL-1), en medio basal Anderson sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos Vaccinium corymbosum cv.Duke. Las evaluaciones fueron realizadas a las 5 semanas después del
cultivo de las mismas. Hubo mayor número de brotes por planta con una concentración de 2 mgL -1 de zeatina. Los mismos autores evaluaron el efecto de la zeatina (2,0 mgL -1) y 2-iP (15 mgL -1) sobre el número de brotes por planta en los cultivares de Vaccinium corymbosum; Blueray, Darrow, Berkeley, Bluecrop y Duke. Todos los cultivares respondieron positivamente a ambos compuestos, observándose un aumento en el número de brotes por planta en todos ellos, pero en todos los cultivares el aumento fue más significativo con zeatina. También se estudió el efecto de distintas concentraciones de citoquininas, zeatina (0.25; 0.50; 0.75 mgL -1) y 2iP (2.5; 5.0; 10 mgL -1) en combinación con IBA (0.5 mgL-1), en medio basal Anderson, sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos Vaccinium vitis-idaea cv. Red Pearl and Koralle. Hubo diferencias significativas en la intensidad de proliferación de
16
brotes entre el control (sin citoquininas) y el uso de zeatina y 2-iP. La excepción estuvo en Koralle, donde la proliferación de brotes fue similar en el control con el uso de 2-iP. Zeatina tuvo mayor efecto sobre la proliferación de brotes y también una mejor respuesta en Red Pearl (Ostrolucká et al., 2004). Ellos concluyeron que la intensidad de proliferación de brotes no solo depende de la concentración de citoquinina, sino también del tipo de citoquinina y de la variedad.
17
III. MATERIALES Y METODOS.
Los ensayos se realizaron durante el segundo semestre del 2007 (para ensayo de desinfección y brotación), y primer semestre del 2008 (para ensayo de multiplicación). Ambos fueron efectuados en el laboratorio de Cultivo de Tejidos, del Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología, de la Universidad de Talca.
3.1. Material vegetal
3.1.1. Material vegetal para ensayo de desinfección y brotación.
Se utilizaron plantas de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum), del cultivar Brigitta, seleccionadas en la localidad de Curicó, Rincón de Sarmiento, parcela 15, Lote BC (Sur 34º54’14’’, Oeste 71º10’54.4’’). Se utilizaron segmentos nodales de brotes jóvenes, no lignificados, específicamente de brotes laterales y apicales de aproximadamente 1 cm.
3.1.2. Material Vegetal para ensayo de multiplicación.
Se utilizaron plantas de arándano de tipo arbusto alto ( Vaccinium corymbosum) de los cultivares O´Neal, Elliott y Bluecrop.
3.2. Desinfección, introducción y establecimiento in vitro del cv. Brigi tta a partir de segmentos nodales.
Se evaluaron tres protocolos de desinfección mediante tres métodos en los cuales se manejó el tipo de desinfectante, su concentración y tiempos de acción sobre los explantes. Se recolectaron brotes de 10 cm a partir de plantas mantenidas en invernadero. Los brotes se trasladaron al laboratorio donde se prepararon explantes de 5 cm desde la yema apical hacia la base
18
con el objetivo de introducir material vegetal ligeramente desarrollado, evitando el uso de material lignificado o muy joven. Para eliminar partículas de polvo y suelo provenientes del campo, los explantes se lavaron con detergente comercial Quix y agua corriente, este lavado se desarrolló de manera contínua durante 10 minutos. Se cortó el brote en segmentos provistos de meristemas, de aproximadamente 3 cm de largo, con el objetivo de disminuir la superficie del explante. En la cabina de flujo laminar todo el material vegetal fue lavado con etanol al 70% como tratamiento previo a los diferentes protocolo de desinfección (Cuadro 1). Los explantes desinfectados se sembraron en medio basal WPM (Woody Plant Medium, por sus siglas en inglés) suplementado con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento,
combinados de acuerdo a los objetivos del proyecto (Cuadro 2). Además el medio de cultivo se suplementó con 30gL-1 de sacarosa y el pH se ajustó a 5,3 antes de esterilizar en el autoclave a 121ºC y 1 kPa de presión por 30 minutos. Se colocaron cuatro explantes en frascos de propagación con tapas herméticas de 7 cm de altura y 7 cm de diámetro y se cultivaron a 22° C, con una intensidad luminosa de 30 μmolm-2s-1 y fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
Cuadro 1: Tratamientos utilizados para la desinfección de explantes de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta. Tratamientos Concentración % Tiempo Etanol 70 30 seg Hipoclorito de Sodio 0,1 10 min HgCl2 0,01 15 min Etanol 70 30 seg Cloro comercial (clorox) 20 10 min Cloro comercial (Clorox) 10 15 min Etanol 70 30 seg Lysoform 20 30 min
Para el desarrollo de los protocolos de desinfección se siguió un procedimiento estándar. Los explantes preparados para la desinfección se trataron con sus respectivos procedimientos de desinfección y se realizaron tres lavados con agua estéril entre cada desinfectante incluido en el
19
tratamiento (Cuadro 1). Para eliminar el exceso de humedad los explantes se secaron ligeramente sobre placa Petri cerrada luego se cortaron en segmentos uninodales y se plantaron en el medio de cultivo en las condiciones descritas anteriormente.
3.3 Criterios de Evaluación y diseño d el experimento de tratamientos desinfectantes.
Para seleccionar el mejor protocolo de desinfección se evaluó la tasa de desinfección, la tasa de oxidación y la tasa de brotación de los explantes en cada tratamiento. La tasa de desinfección se calculó como el número de explantes desinfectados divididos por el número de explantes totales. La tasa de oxidación se calculó como el número de explantes oxidados (>50% del área del explante), dividido por el número total de explantes por réplica. La tasa de brotación se calculó como el número total de explantes que emitieron brotes, dividido por el número total de explantes por réplica. Se realizaron 3 evaluaciones a los 7, 14 y 21 días desde la introducción, para identificar adecuadamente el total de explantes contaminados con contaminaciones por bacteria o levaduras que aparecen en etapas tardías de la introducción al cultivo in vitro (Digonzelli et al. 2005). A los 21 días se evaluó el total de explantes oxidados y el total de explantes brotados. Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA), con tres tratamientos y 3 repeticiones por tratamiento; cada repetición estuvo constituida por 15 frascos de cultivo. La unidad experimental correspondió a un frasco de cultivo con 4 explantes en su interior para un total de 45 unidades experimentales y 180 explantes por tratamiento.
3.4. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de arbusto alto cv. Bri gitta durante el establecimiento in vitro.
Se evaluó el efecto del tipo de regulador de crecimiento y su concentración sobre la tasa de brotación y la formación de hojas de los explantes, que indican la inducción de respuesta morfogénica en explantes in vitro (Cuadro 2).
20
Cuadro 2. Tratamientos con reguladores de crecimiento para establecimiento y brotación de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta mg L -1 4 5 2,5
Regulador del crecimiento 2iP 2iP TDZ
3.4.1. Diseño experimental y criterios de evaluación.
Una vez conseguida la desinfección de los explantes, se evaluó la tasa de brotación y aparición de hojas en cada tratamiento. La tasa de brotación fue determinada dividiendo el número total de explantes que emitieron brotes sobre el número total de explantes por réplica, mientras que la tasa de aparición de hojas se definió como el número total de explantes con al menos una hoja visible por explante, dividido por el número total de explantes por réplica. Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) con tres tratamientos. Cada tratamiento contó con 3 repeticiones y cada repetición con 14 frascos. La unidad experimental correspondió a un frasco de cultivo con 4 explantes en su interior, dando totales de 42 unidades experimentales por tratamiento y 168 explantes por tratamiento. Se realizaron evaluaciones a los 7 y 14 días desde introducción.
3.5. Efecto de los medios basales y reguladores del crecimiento sobre la tasa de multiplicación de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) cultivados in vitro .
Se evaluó el efecto de la composición del medio de cultivo, y la combinación de diferentes tipos de reguladores del crecimiento a diferentes contraciones sobre la tasa de multiplicación in vitro para los cultivares O`Neil, Bluecrop y Elliott. Los medios basales WPM (Woody Plant Medium) y MS (Murashige y Skoog, 1962) se suplementaron con 2-isopentenil adenina con o sin la adición de ácido indolbutírico. Se evaluaron doce tratamientos (Cuadro 3). Ambos medios de cultivo basales, fueron suplementados con s acarosa al 3% y 7,5 gL -1 de agar para WPM y 8,0 gL-1 para MS a pH 5,3. Para todos los tratamientos se utilizaron frascos de propagación de 7 cm de altura y 7 cm de diámetro con tapas metálicas herméticas. Las plantas fueron sometidas a 21
luminosidad <30 μmolm-2s-1 utilizando lámparas fluorescentes con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 22 ºC.
Cuadro 3: Tratamientos de multiplicación para los cv. Elli ot, Bluecrop y O´Neil.
Medio basal WPM WPM WPM WPM WPM WPM MS MS MS MS MS MS
Reguladores del cr ecimiento (mg L -1) 2iP IBA 2 0 2 0,5 4 0 4 0,5 5 0 5 0,5 2 0 2 0,5 4 0 4 0,5 5 0 5 0,5
3.5.1 Criterios de evaluación y di seño del experimento de tratamiento de multip licación .
Se evaluó la tasa de multiplicación de cada tratamiento lo que corresponde a la relación entre el número final de segmentos nodales (NFSN) y el número inicial de los mismos (NISN). Para ello se contabilizó el número inicial de segmentos nodales al momento del montaje de cada ensayo, y a las 2, 4 y 6 semanas subsiguientes se contabilizó la cantidad de segmentos nodales. Para el experimento se usó un diseño completamente al azar (DCA), con un arreglo factorial de 2 x 3 x 2, dado por los siguientes factores: Medio de cultivo basal (WPM y MS), concentraciones de 2iP (2, 4, y 5 mg L -1) y presencia o ausencia de IBA (0,5 mg L -1). Dando un total de 12 tratamientos con 6 repeticiones por tratamiento. Una unidad experimental correspondió a un frasco de cultivo con 10-12 plantas por frasco; por planta se dejaron aproximadamente 1-3 segmentos nodales. El total de unidades experimentales por ensayo fue de 72 .
22
3.6 Efecto de la posición de los explantes sobre la tasa de multiplicación en plantas in vitro de arándanos d e arbusto alto ( Vaccinium corymbosum)
Se evaluó el efecto de la posición de los explantes (horizontal y/o vertical) sobre la tasa de multiplicación en dos cultivares de arándanos de arbusto alto: Elliott y Bluecrop.
3.6.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento
Se evaluó la tasa de multiplicación para cada tipo de posición del explante. Para ello se contabilizó el número inicial de segmentos nodales al momento del montaje de cada ensayo, mientras que a las 6 semanas desde inicio del cultivo se contabilizó la cantidad de segmentos nodales finales. La posición de las plantas se evaluó en ambos medios de cultivo basales (WPM y MS) y en cada tratamiento de reguladores de crecimiento. Para el experimento se usó un diseño completamente al azar (DCA), con dos tratamientos (horizontal y vertical) con 36 repeticiones por tratamiento. Una unidad experimental correspondió a un frasco de cultivo con 10-12 plantas por frasco y por planta se dejaron aproximadamente 1-3 segmentos nodales. El total de unidades experimentales por tratamiento fueron 36 frascos. Para el análisis estadístico de ambos tratamientos se consideró aquel medio basal y regulador del crecimiento significativo sobre la tasa de multiplicación para cada uno de los cultivares.
3.7. Análisis Estadístico.
Para todos los experimentos se realizó un análisis de Varianza (ANDEVA), a fin de determinar diferencias entre los tratamientos. La separación de medias para aquellas variables con diferencias significativas se hizo mediante el Test de Rangos Múltiples de Tukey (p<0,05). Se utilizó para tales análisis, el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1.
23
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1. Efecto de desinfectantes sobre el establecimiento al cultivo in vitro de segmentos nodales del cv. Brigitta.
Tasa de desinfección: Hubo diferencias altamente significativas en las medias de los tres tratamientos desinfectantes utilizados (Cuadro 4). Se observó que al usar Etanol al 70% más Clorox al 20% y 10% hubo un incremento significativo en la tasa de desinfección de explantes de arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta en relación al uso de los otros dos tratamientos desinfectantes. Con respecto a estos dos últimos la utilización de Etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al 0,1% y Bicloruro de mercurio al 0,01% generó una mayor tasa de desi nfección que al usar Etanol al 70% más Lysoform al 20%. La eficiencia en la desinfección de los explantes introducidos al cultivo in vitro depende de una serie de factores asociados a la calidad fisiológica y fitosanitaria de los explantes (Leifert et al. 1989; Leifert and Woodward 1998). Se ha observado, en explantes adultos que la tasa de contaminación tiende a ser superior que en explantes juveniles, especialmente yemas (Leifert et al., 1998). Por otra parte, las condiciones de cultivo de las plantas madres a partir de las que se toma el material vegetal pueden incidir en la tasa de contaminación de los explantes establecidos, como ha sido demostrado en vides (Iocco et al., 2001; Pinto-Sintra, 2007) y cerezos (Ružic et al., 2000). La eficiencia de desinfección documentadas para arándanos varía entre 40%-60% (Cohen, 1980; González et al., 2000; Meiners et al.; 2007) estos autores utilizaron hipoclorito de sodio para desinfectar tejidos de diferentes cultivares de arándanos y han determinado que los genotipos pueden responder de manera heterogénea ante los mismos protocolos de desinfección (González et al., 2000). Este comportamiento se puede deber a una mayor especificidad entre la interacción de microorganismos, superficiales y endógenos, y los diferentes genotipos.
Tasa de oxidación: Hubo diferencias altamente significativas en los tratamientos desinfectantes sobre la tasa de oxidación (Cuadro 4). El tratamiento en el cuál se usó Etanol al 70% más Clorox al 20% y 10%, presentó la mayor tasa oxidativa de explantes de arándano de arbusto al to del cv. Brigitta.
24
No se observaron diferencias estadísticas al usar Etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al 0,1% y luego Bicloruro de mercurio al 0,01% respecto al tratamiento con Etanol al 70% más Lysoform al 20% sobre la tasa de oxidación de explantes de arándano de arbusto alto del cv. Brigitta. Pérez et al. (2002) documentaron mejores resultados de desinfección cuando lavaron explantes tomados de árboles adultos leñosos de especies tropicales con concentraciones relativamente bajas de Hipoclorito de Sodio. Aparentemente, los iones Cloruro provocan respuesta hiperoxidativas en los explantes de plantas leñosas y esta respuesta es más marcada en explantes adultos, aunque debe haber una relación entre la edad del explante y la toxicidad del desinfectante.
Tasa de brotación: No hubo diferencias significativas en las medias de los tratamientos respecto a esta variable (Cuadro 4). Por lo tanto, no existe evidencia de que estos tratamientos desinfectantes afecten la tasa de brotación. Estos resultados coinciden por los documentados para vides (Thomas, 2006) y otros berries leñosos (Zimmermann, 1991). La respuesta morfogénica de las arándanos de la variedad Briggitta, parecen estar más asociada a la interacción de los explantes con el medio de cultivo de establecimiento que con el procedimiento de desinfección. No obstante, es necesario considerar que la exposición prolongada de explantes vegetales ante agentes desinfectantes puede provocar respuestas fitotóxicas que disminuyan su capacidad de división celular y diferenciación.
Cuadro 4. Efecto de tratamientos desinfectantes sobre la tasa de desinfección, la tasa de oxidación y tasa de brotación en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 21 días desde introducción. Comportamiento de explantes Tasa de Tasa de z desinfección oxidación Tasa de brotación Tratamientos y Etanol (70%); Clorox (20%-10%) 0,82 c 0,28 b 0,31 Etanol (70%); Hip.de Sodio (0,1%); HgCl2 (0,01%) 0,58 b 0,03 a 0,22 Etanol (70%); Lysoform (20%) 0,32 a 0,03 a 0,20 Significancia ** ** n.s. Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para cada z tasa específica (descrita en materiales y métodos) según test HSD de tukey (p<0,01). Nivel de significancia del 99%(**). n.s. = no significativo y valores promedios de tres repeticiones por tratamiento.
25
4.2. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de arbusto alto cv. Bri gitta durante el establecimiento in vitro.
Hubo diferencias altamente significativas sobre la tasa de brotación entre las medias de los tratamientos con reguladores de crecimiento. Se observó que no existieron diferencias estadísticas al utilizar 2-iP en cualquiera de sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL -1) sobre la tasa de brotación de explantes de arándano de arbusto alto del cv. Brigitta; sin embargo, si existieron diferencias al utilizar 2iP en cualquiera de sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL -1) y usar TDZ (2,5 mg L -1), este último presentó una baja tasa de brotación con respecto al uso de 2-iP a 4 ó 5 mgL -1 (Cuadro 5). Al utilizar 2-iP en sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL-1) no se afectó la tasa de aparición de hojas; sin embargo, sí lo hizo el uso de TDZ (2,5 mgL -1); observándose en este último niveles significativamente más bajos con respecto al uso de 2-iP en sus dos concentraciones. La respuesta morfogénica en las plantas introducidas al cultivo in vitro depende de las interacciones entre los genotipos, la manipulación del explante, las condiciones ambientales y la composición nutritiva del medio de cultivo (Thorpe, 2007). Esta serie de factores puede tener un efecto más o menos importante; así en arándanos se ha observado que la interacción genotipo-citoquínina en el medio determina la eficiencia de brotación y la calidad fisiológica de los brotes (Gajdošová et al., 2006). Los resultados obtenidos coinciden con los documentados por Meiners et al. (2007), quienes demostraron que el TDZ afecta la capacidad de elongación de las yemas y los brotes emitidos, generando alta formación de callos en los explantes establecidos. Por otra parte estos mismos investigadores informaron que el 2-iP es una citoquinina con un efecto relativamente débil para inducir diferenciación de brotes, por lo que no la recomiendan para esta etapa. Es probable que los resultados obtenidos en el presente ensayo se deban a una mejor selección y preparación de los explantes. En este caso, se introdujeron explantes de una zona relativamente estable del brote, eliminando la variabilidad de la brotación debido a diferencias en las edades fisiológicas de las yemas y su grado de diferenciación. Wolfe et al. (1983), determinaron que los segmentos nodales de la zona central de brotes jóvenes manifestaron la mejor respuesta organogénica en los experimentos de introducción al cultivo in vitro.
26
Cuadro 5. Efecto de reguladores del crecimiento sobre la tasa de brotación y aparición de hoja en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 14 días desde introducción. Brotación y aparición de hojas Tasa de brotación z Tasa de aparición de hojas Tratamientos -1 y 2iP - 4 mgL 0,30 b 0,35 b -1 2iP - 5 mgL 0,34 b 0,25 b -1 TDZ - 2,5 mgL 0,13 a 0,02 a Significancia ** **
Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para cada z tasa específica (descrito en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia del 95% (*), y (p<0,01) 99%(**). y Valores promedios de tres repeticiones por tratamiento.
4.3. Efecto de la interacción de dos medios basales (WPM y MS) y diferentes concentracion es de Citoquininas/Auxinas, sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum).
Se observaron diferencias altamente significativas entre las medias de los tratamientos producto de la interacción entre tipo de medio de cultivo (WPM y/o MS) y tratamientos con reguladores de crecimiento para plantas de arándano de arbusto alto del cv. O´Neal. Las plantas de la variedad O´Neal cultivadas en WPM suplementadas con 2iP a 2, 4 ó 5 mgL -1 más IBA (0,5 mgL -1), obtuvieron significativas disminuciones en sus tasas de multiplicación, respondiendo de forma negativa a la adición de IBA en dicho medio basal, situación que no se observa al cultivar las plantas en los mismos tratamientos de reguladores del crecimiento pero en medio basal MS, estos últimos presentaron evidentes incrementos en las tasas de multiplicación con respecto al medio basal WPM. Los seis tratamientos de reguladores del crecimiento en medio MS no mostraron diferencias estadísticas sobre la tasa de multiplicación. Se observó que al cultivar las plantas de la variedad O´Neal en WPM suplementado con 2iP (5 mg L -1) se obtuvo diferencias estadísticas en relación a todos los tratamientos de reguladores del crecimiento en medio MS, logrando niveles significativamente menores sobre la tasa de multiplicación que cualquiera de los tratamientos en medio de cultivo MS (Cuadro 6). No se observaron diferencias significativas entre las medias de los tratamientos al interactuar tipo de medio de cultivo (WPM y/o MS)
27
y tratamientos con reguladores de crecimiento, sobre la tasa de multiplicación en plantas de arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) del cv. Elliot y Bluecrop.
Cuadro 6. Efecto de la interacción de dos medios de cultivo WPM y MS y 6 tratamientos con reguladores de crecimiento sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándano de arbusto alto in vitro, después de 6 semanas de cultivar las plantas. Tratamientos Tasa de multiplicaciónz Regulador del crecimiento (mgL ) Medio basal Citoquin ina/Auxina O´Neal Elliott Bluecrop WPM 2iP (2) 4,91 bcd 1,98 6,03 WPM 2iP (2) + IBA (0,5) 1,21 a 1,13 5,11 WPM 2iP (4) 5,85 cd 2,8 6,43 WPM 2iP (4) + IBA (0,5) 1,50 a 1,12 6,08 WPM 2iP (5) 3,26 abc 4,2 7,15 WPM 2iP (5) + IBA (0,5) 1,93 ab 2,87 7,05 MS 2iP (2) 5,15 cd 2,37 3,53 MS 2iP (2) + IBA (0,5) 6,68 d 1,66 2,83 MS 2iP (4) 7,18 d 2,48 3,13 MS 2iP (4) + IBA (0,5) 5,41 cd 1,87 2,8 MS 2iP (5) 6,55 d 2,77 3,72 MS 2iP (5) + IBA (0,5) 7,75 d 3,05 2,97 Significancia ** n.s n.s Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para z tasa de multiplicación (descrita en materiales y métodos), según test HSD de Tukey (p<0,01). Nivel de significancia del 99%(**) n.s=no significativo. y Valores promedios de seis repeticiones por tratamiento.
Gráfico No 1. Análisis del efecto de la interacción entre medios de cultivo y variedades de arándanos de arbusto alto sobre la tasa de multiplicación in vitro.
n ó i c a c i l p i t l u M e d a s a T
Gráfico de Interacción 7,7
Variedad Bluecrop Elliot O´neal
6,7 5,7 4,7 3,7 2,7 MS
WPM
Medio de Cultivo
28
En Gráfico Nº1 se observa que el efecto de la interacción entre las variedades Bluecrop, Elliot y O´Neal y el medio de cultivo sobre la tasa de multiplicación in vitro es altamente significativa. Se observa que para las variedades Bluecrop y Elliot el cultivo sobre medio basal MS disminuye significativamente la tasa de multiplicación, mientras quel a variedad O´Neil aumenta su tasa. Entre la variedad Elliott y Bluecrop la interacción es leve ya que ambas variedades en los dos medios de cultivo se comportan de manera similar, ambas variedades en Medio basal MS tienden a bajar sus tasas de multiplicación, sin embargo, en WPM se observa un aumento de las tasas de multiplicación. La interacción entre los reguladores del crecimiento y la variedad en medio WPM fue significativa para algunas variedades. Se puede observar que la curva de interacciones muestra una tendencia similar en todas las variedades, aunque la magnitud del efecto es más pronunciada en la variedad O´Neil. La variedad Bluecrop muestra las tasas de multiplicación más elevadas.
Gráfico Nº 2. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y O´neal en medio basal WPM.
n ó i c a c i l p i t l u M e d a s a T
Gráfico de Interacción 8
Variedad Bluecrop Elliott O´neal
6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
Tratamientos
En gráfico Nº3 se observa el efecto de las interacciones entre los tratamientos con reguladores del crecimiento y las tasas de multiplicación sobre medio MS presentan de leve a nula interacción en las tres variedades de arándanos de arbusto alto. El tratamiento con 2 mg L -1 de 2i-P más 0,5 mg L -1 de
29
IBA muestra una leve interacción entre Bluecrop, Elliot y O´neal; en O´neal estimula un aumento de la tasa de multiplicación no asi en Elliott y Bluecrop donde la tasa de multiplicación disminuye. Gráfico Nº 3. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y O´Neal en medio basal MS.
n ó i c a c i l p i t l u M e d a s a T
Gráfico de Interacción 8
Variedad Bluecrop Elliott O´neal
6 4 2 0 1
2
3
4
5
6
Tratamientos
Sucede algo similiar para el tratamiento de 5 mg L -1 de 2i-P más 0,5 mg L-1 de IBA donde se observa que las plantas de la variedad O´neal y Elliot aumentan significativamente la tasa de multiplicación. La variedad Bluecrop disminuye sus tasas de multiplicación en estas condiciones. Vaccinum corymbosum es una especie altamente dependiente de los reguladores del
crecimiento para desarrollarse in vitro (Lyrene y Perry, 1988). Reed y Abdelnour-Esquivel (1991), encontraron que la respuesta morfogénica fue variable entre 12 genotipos tratados con diferentes concentraciones de 2-iP y zeatina y que la respuesta fue mejor en presencia de este último regulador. En un estudio con cuatro variedades diferentes, Ostrolucká et al. (2004) encontraron que todas las variedades respondían positivamente a la adición de reguladores del crecimiento del tipo citoquininas. Sin embargo, la respuesta dependió significativamente del tipo de citoquinina y de su concentración en el medio de cultivo. Ellos reportaron que las citoquininas tienen un efecto significativo en la emisión y desarrollo de los brotes, mientras que las auxinas incluidas de manera individual pueden deformar las yemas de segmentos nodales recién plantados o estimular la formación de raíces. Además, se documenta que la composición nutritiva y la disponibilidad de la sacarosa como fuente de energía en el 30
medio de cultivo pueden afectar significativamente la respuesta de las plantas de arándanos (Cao et al., 2003). Cuando en este ensayo se analizó el comportamiento de las plantas de arándanos cultivadas en la mejor concentración de citoquininas sobre la composición variable del medio de cultivo, se observó que existieron diferencias significativas en las tasas de multiplicación al utilizar WPM y MS suplementados con 2iP (5 mgL -1). Los resultados mostraron que al cultivar plantas del cv. O´Neal en medio MS, se obtuvo tasas de multiplicación significativamente más altas que al cultivarlas en medio WPM. Para el caso del cv. Elliott fue lo contrario pues se observó que la mayor tasa de multiplicación se obtuvo al cultivar las plantas en medio de cultivo basal WPM (Cuadro 7). Para Bluecrop la diferencia entre las medias fue altamente significativa, donde se observó que el medio basal WPM obtuvo un incremento en las tasas de multiplicación con respecto al cultivo de plantas de esta variedad en medio MS. El uso de citoquininas ha sido extendido en arándanos y varios autores han recurrido incluso a combinar más de una citoquinina para mejorar la respuesta morfogénica (Rowland y Olden 1992). Sin embargo, el uso de auxinas para mejorar la calidad de los brotes no ha sido tan estudiada y los resultados han demostrado ser consistentes en la mayoría de las variedades (Lyrene, 1981; Meiners et al., 2007). Las evidencias de estos experimentos demuestran que los brotes de arándanos pueden
alcanzar un mejor desarrollo y generar segmentos nodales con capacidad de mejorar una respuesta morfogénica homogénea en los siguientes subcultivos. Cuadro 7. Efecto de medios de cultivo basales sobre la tasa de multiplicación en arándanos de arbusto alto. (Vaccinium corymbosum) después de 6 semanas de cultivar las plantas. Efecto de medios de cultivo Tratamientos Tasa de Multiplicación z O´Neal Elliott Bluecrop -1 y WPM + 2iP 5mg L 3,27 a 4,20 b 7,15 b -1 MS + 2iP 5mg L 6,55 b 2,77 a 3,72 a Significancia * * **
Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para cada z tasa específica (descrita en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia del 95% (*), y (p<0,01) 99%(**). y Valores promedios de 6 repeticiones por tratamiento.
Los resultados informados en la literatura por diferentes grupos han limitado los estudios a las interacciones de los medios de cultivo y los tipos de reguladores del crecimiento. Los resultados (cuadro 31
7) evidencian que la respuesta de las plantas in vitro de arándanos ante la presencia de una citoquinina en el medio puede ser influida por la composición del medio de cultivo y por la interacción con auxinas suministradas como complemento. El medio MS generó una mejor respuesta morfogénica en plantas de las variedades O`Neil y Elliott ; en ese contexto las tasas de multiplicación fueron ligeramente superiores en presencia de auxinas a medida que se aumentó su concentración, especialmente marcada fue esa respuesta en la variedad O´Neil. El uso del medio MS para el cultivo in vitro de arándanos fue informado por (Cohen y Elliott 1979) para las variedades Atlantic, Jersey, Dixie, Stanley, Burlington, Darrow, Berkeley, Ivanhoe, Blueray, Bluecrop y Earliblue. Las tasas de multiplicación de esas variedades en el medio suplementado con 2 mgL-1 de 2-iP variaron de 2 a 8, en dependencia de la variedad. Sin embargo, otros autores han incluido cambios en el medio basal utilizando el medio de Anderson modificado (Zimmerman y Broome, 1980) y el Woody Pl ant Medium, WPM, (Grout et al., 1986). Los medios de cultivo presentan diferencias importantes en los tipos y concentraciones de sales de nitrógeno en su composición, lo que puede afectar la disponibilidad de ese ion ya sea por defecto o por exceso. Por otro lado, en el medio MS se produce una rápida caída del pH en los 10 primeros días (Ružic et al., 2000), lo que puede afectar la respuesta de algunos genotipos, como es el caso de la variedad Bluecrop. A pH bajos, la disponibilidad de iones N y P se limita en condiciones de cultivo de tejidos, por lo que para algunas especies se sugiere reforzar la concentración de estas sales en el medio. En cerezos, se encontró que las plantas cultivadas en medio MS al doble de su concentración salina absorbieron más N y P que las plantas cultivadas en medio normal o con menor concentración de sales. La mejor absorción de estos iones propició una mejor respuesta morfogénica y una mejor calidad de los brotes (Ružic et al., 2000). A pesar que la variedad O`Neil presenta una tasa ligeramente superior sobre todos los tratamientos de reguladores del crecimiento en el medio MS, es posible que esta variedad pueda ser cultivada sobre medio WPM. Cuando se añadieron 4 mgL -1 de 2-iP al medio de cultivo se obtuvo una tasa de multiplicación que no difirió significativamente del resto de los tratamientos en MS. (Cuadro 7).
32
4.4. Efecto de la posición de explantes de arándanos de arbusto alto ( Vaccinium corymbosum) de los c v. Elliott y Bluecrop sobre medio b asal WPM suplementado con 2-iP (5mg L -1). La posición del explante en el medio de cultivo no incidió significativamente en la tasa de multiplicación en la variedad Elliot cultivada en medio WPM suplementado con 2-iP a 5mgL -1 (Cuadro 8). Sin embargo, en el cv. Bluecrop hubo diferencias significativas en las medias de los tratamientos sobre la tasa de multiplicación; así, se observó que la posición vertical en WPM suplementado con 2-iP (5mgL-1) presentó tasas de multiplicación significativamente más altas con respecto a la posición horizontal de las mismas. González et al. (2000) desarrollaron un estudio para obtener un método uniforme de micropropagación mediante el uso de segmentos nodales a partir de plantas maduras obtenidos en campo. Ellos encontraron que la respuesta del explante a las diferentes posiciones en el medio de cultivo depende del genotipo.
Cuadro 8. Efecto de la posición horizontal y vertical de plantas de arándanos ( Vaccinium corymbosum), después de 6 semanas de cultivar las plantas. Tasa de multiplicación z Posición Elliott Bluecrop -1 y Vertical (WPM 2iP 5mg L ) 3,90 7,15 b -1 Horizontal (WPM 2iP 5mg L ) 3,85 5,61 a Significancia n.s * Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para z tasa de multiplicación (descrito en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia del 95%(*). y Valores promedios de 6 repeticiones por tratamiento.
4.5. Evolución temporal de la tasa de multiplicación en Vacciunium corymbosum cv. Bluecrop, O´Neal y Ellio tt. La variación de las tasas de multiplicación a partir de segmentos bi-nodales, dependió del genotipo. Para la variedad O´Neal, los tratamientos de reguladores del crecimiento en medio basal WPM (Figura 1) mostraron una disminución significativa en las tasas de multiplicación con respecto a los tratamientos de reguladores del crecimiento en medio MS. En general las tasas de multiplicación se incrementaron a partir de la segunda semana y alcanzaron el máximo punto a las seis semanas. Los tratamientos con 2-iP 2 mgL -1 + IBA 0,5 mgL-1; 2-iP 4mgL-1 + IBA 0,5 mgL-1 y 2-iP 5 mgL -1 + IBA 0,5 mgL1
mostraron una tasa de multiplicación estable y baja a lo largo del experimento que se debió a la altura
33
reducida de los brotes en esos medios. Claramente, la adición de IBA al medio de cultivo retardó el crecimiento cuando el medio basal era WPM, pues los tratamientos con 2-iP 2 mgL -1; 2-iP 4 mgL-1; 2-iP 5 mgL-1 mostraron incrementos en las tasas de propagación similares a los tratamientos en medio MS. Las tasas de multiplicación en MS no se afectaron con la adición de auxinas y los mejores resultados se alcanzaron en el tratamiento con 2-iP a 5 mgL -1+ IBA 0.5 mgL-1. Este tratamiento puede ser útil para adaptar las plantas en la fase ex vitro pues estimularía favorablemente la inducción de raíces. O´Neal en medio basal MS
O´Neal en medio basal WPM
8
8
a
7
a
a
a
a
a
6
n ó i c a c i l 5 p i t l u M e d 4 a s a T
a
a a
a
a
a
a a
a a a
3
7
a
6
d
n ó i c a c i l 5 p i t l u M e d 4 a s a T
c
c c
3
c
2
b
b
b
a a a
a
bc
2
1
0 0
2
Semanas
4
1
6
0 0
MS + 2iP (2) MS + 2iP (4) + IBA (0,5)
MS + 2iP (2) + IBA (0,5) MS + 2iP (5)
MS + 2iP (4) MS + 2iP (5) + IBA (0,5)
a a a 2
Semanas
4
a a 6
WPM + 2iP (2)
WPM + 2iP (2) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4)
WPM + 2iP (4) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (5)
WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Figura 1. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. O´Neal en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento.Letras minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre tratamientos para tasa de multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05). En la variedad Elliott (Figura 2) se observó que la tasa de multiplicación a las 2, 4 y 6 semanas disminuyó en todos los tratamientos con 2-iP e IBA (0,5 mgL -1) en medio de cultivo basal MS producto de la formación en la base del explante inicial que inhibió el desarrollo de las yemas. En los tratamientos con 2-iP (2 y 4 mgL -1) más IBA (0,5 mgL -1) en medio de cultivo basal WPM no existieron variaciones en las tasas de multiplicación entre la primera y tercera evaluación. El resto de los tratamientos mostraron incrementos en sus tasas de multiplicación en las tres evaluaciones y el tratamiento con 5 mgL -1 de 2-iP mostró diferencias significativas con el resto de los tratamientos a partir de la segunda semana, con la mayor tasa de multiplicación en la sexta semana.
34
Elliott en medio basal MS
Elliott en medio basal WPM 4
4
c
b
n ó 3 i c a c i l p i t l u m e d a s a T 2
n ó 3 i c a c i l p i t l u m e d a s a T 2
a a
ab
a
a
ab
a a a a
a
bc abc b
2
ab
ab
ab
a
ab ab
a 1
0 0
bc abc
ab
a
1
ab
a
c
Semanas
4
6
MS + 2iP (2)
MS + 2iP (2) + IBA (0,5)
MS + 2iP (4)
MS + 2iP (4) + IBA (0,5)
MS + 2iP (5)
MS + 2iP (5) + IBA (0,5)
0
2
ab a
a a
a a
0
Semanas
4
6
WPM + 2iP (2)
WPM + 2iP (2) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4)
WPM + 2iP (4) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (5)
WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Figura 2. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. Elliott en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento. Letras minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre tratamientos para tasa de multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05). Para la variedad Bluecrop (Figura 3), las tasas de multiplicación sobre WPM fue mayor que en medio MS. En medio MS, las tasas de multiplicación alcanzaron su máximo a las cuatro semanas, mientras que en medio WPM las plantas c ontinuaron creciendo. A pesar que los tratamientos mostraron diferencias leves en sus tasas de multiplicación, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos de reguladores del crecimiento en ninguna de las fechas y ninguno de los medios.
35
Bluecrop en medio basal MS
Bluecrop en medio b asal WPM
8
8
7
7
a a
6
6
n ó i c a c i l 5 p i t l u m e d 4 a s a T
a a
a
a a a a
3
2
aa a
a
a a a a a a
0
a a a aa
2
Semanas
a
a
2
1
0
a
a
3
a
1
a a a
n ó i c a c i l 5 p i t l u m e d 4 a s a T
a a a a
0 0
2
Semanas
4
6
4
6
MS + 2iP (2)
MS + 2iP (2) + IBA (0,5)
MS + 2iP (4)
WPM + 2iP (2)
WPM + 2iP (2) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4)
MS + 2iP (4) + IBA (0,5)
MS + 2iP (5)
MS + 2iP (5) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (5)
WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Figura 3. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv. Bluecrop en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento. Letras minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre tratamientos para tasa de multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05). El establecimiento de protocolos eficientes para el cultivo in vitro de arándanos ha sido desarrollado por varios autores a partir de meristemos axilares, organogénesis y discos de hojas (Callow et al. 1989; Rowland y Odgen 1992; Cao and Hammerschlag 2000; Debnath y McRae 2001; Debnath 2005 a, b). Las tasas de multiplicación han sido variables y afectadas por la concentración de citoquininas, mientras la zeatina ha estimulado la formación de brotes de manera más exitosa que el 2iP o el TDZ (Reed y Abdelnour-Esquivel 1991). Las tasas de mutiplicación informadas por varios autores han variado desde 1.5 hasta 8.6 (considerando brotes de más de 1 cm) (ver más información en Rowland y Hammerschlang, 2005). La variación en las tasas de multiplicación en las variedades incluidos en este estudio son similares con las documentadas por Cohen (1980) y Meiners et al. (2007), tanto por la alta variabilidad entre los diferentes genotipos como por la eficiencia en la tasa de multiplicación. El número máximo de brotes se obtiene a las seis semanas, lo que corresponde con los resultados mostrados por González et al. (2000) y Ostrolucká (2004). El cultivo de las plantas de arándanos por más de seis semanas puede mejorar la respuesta a la etapa de adaptación ex vitro (Debnath, 2007). Sin embargo, en las plantas in vitro puede provocar la disminución de la respuesta morfogénica para el siguiente subcultivo, debido al envejecimiento y la lignificación del tejido (Meiners et al., 2007).
36
El hecho que las tasas de multiplicación hayan sido homogéneas en las semanas donde se evaluó pudiera indicar que los medios de cultivo empleados otorgan condiciones nutricionales muy efectivas para el desarrollo normal de los brotes y que los reguladores del crecimiento tienen un efecto estimulador sobre esa respuesta morfogénica. Las principales variaciones en las condiciones de cultivo deben ser dirigidas entonces a mejorar el balance nutricional de los medios de cultivo, en lugar de focalizarse en manejar las concentraciones de reguladores del crecimiento.
37
V. CONCLUSIONES
Se estableció que es posible obtener altos porcentajes de respuesta morfogénica en explantes de arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta introducidos al cultivo in vitro mediante la desinfección con etanol al 70% por 30 segundos e Hipoclorito de Sodio al 0,1% más HgCl 2 al 0,01%. Las tasas de brotación de explantes vivos no fueron afectactadas al utilizar cualquiera de los tres tratamientos desinfectantes, por tanto, la acción desinfectante de tales tratamientos no es influyente en la respuesta morfogénica de expla ntes de arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta. En explantes del cv. Brigitta las tasas de oxidación más bajas se obtuvieron al desinfectar con etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al 0,1% y HgCl 2 al 0,01%. En la etapa de establecimiento y brotación del cv. Brigitta se determinó que utilizar TDZ (2,5 mgL-1) provocó bajas tasas de brotación y aparición de hojas, no así con el uso de 2iP en cualquiera de sus dos concentraciones (4 ó 5 mg L -1). La brotación de la variedad Brigitta fue más eficiente cuando los segmentos nodales de plantas provenientes de viveros se cultivaron en 2-iP (4 ó 5 mgL -1). La posición de los explantes no fue influyente en la tasa de multiplicación de los cultivares evaluados (Elliott y Bluecrop). Para ensayo de multiplicación se estableció un medio de cultivo basal estándar a base de las sales WPM para las variedades O´Neal, Elliott, y Blue Crop, suplementando con 4 mgL -1 de 2-iP. Se determinó que el manejo de la composición de sales del medio de cultivo puede tener un efecto importante para inducir mayores tasas de multiplicación en las variedades incluidas en el estudio. La tasa máxima de multiplicación se obtiene a las seis semanas y es afectada por la interacción entre los reguladores del crecimiento y la composición nutritiva del medio de cultivo.
38
VI. BIBLIOGRAFIA
1. ALCAINO, M. 2008. La situación actual de la fruta chilena de exportación: Tendencias oportunidades y competencia. “Reunión Nacional de Productores de Frutas”. Santiago de Chile, 2931 de Septiembre de 2008. 2. AMMIRATO, P.V. 1983. The regulation of somatic embryo development in plant cell culture: Suspension culture techniques and hormones requirement. Biotechnology 1: 68-74. 3. ASOEX, 2001. Perspectivas comerciales de los Berries, Asociación de Exportadores de Chile A.G. 15p. 4. BUZETA, A. 1997. Chile: Berries para el 2000. Santiago, Fundación Chile. 133p. 5. CAO, X., FORDHAM, I., DOUGLASS, L., HAMMERSCHLAG, F.A. 2003. Sucrose level influences micropropagation and gene delivery into leaves from in vitro propagated highbush blueberry shoots. Plant Cell Tiss Org Cult 75: 255–259. 6. CAO, X. y HAMMERSCHLAG,F.A. 2000. Improved shoot organogénesis from leaf explants of highbush blueberry. HortScience 35:945-947. 7. CHRIQUI, D. 2008. Developmental Biology. En: George, E.F., Hall, M.A. De Klerk, G-J. (Eds), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. Volume 1. The Background. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Pp:283-235. 8. COHEN, D. 1980. Application of micropropagatin methods to blueberries and tamarillos. Combined proceedings International Plant Propagator Society 30: 144-146. 9. COHEN, D. y ELLIOTT, D. 1979. Micropropagation methods for blueberries and tamarillos.Proc Intl Plant propagators Soc 29:177-179. 10. DASTRES, R. 2008. Arándano: Situación actual y perspectivas. “Reunión Nacional de Productores de Frutas”. Santiago de Chile, 29-31 de Septiembre de 2008. 11. DEBNATH, S. 2007. Influence of indole-3-butyric acid and propagation method on growth and development of in vitro and ex vitro-derived lowbush blueberry plants. Plant Growth Regul 51: 245– 253. 12. DEBNATH, S.C. 2005a. Micropropagation of lingonberry: influence of genotype, explant orientation, and overcoming TDZ- induced inhibition of shoot elongation using zeatin. HortScience 40: 185–188. 13. DEBNATH, S.C. 2005a. Morphological development of lingonberry as affected by in vitro and ex vitro propagation methods and source propagule. HortScience 4 0: 760–763. 14. DEBNATH, S.C., MCRAE, K.B. 2001. In vitro culture of lingonberry ( Vaccinium vitis-idaea L.): the influence of cytokinins and media types on propagation. Small Fruit Rev 1: 3–19.
39
15. DIGONZELLI, P., DÍAZ L., CARRIZO DE BELLONE, S., 2005. Uso de PPM (Plant Preservative Mixture) para controlar contaminantes bacterianos en la multiplicación in vitro de caña de azúcar.Rev. Fac. Agron. 22: 22-32 16. ECCHER, W., NOE, T., 1989 Comparison between 2iP and zeatin in the micropropagation of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum). Acta Hortic. 241, 185-190. 17. ECK, P. 1988. Blueberry science. Rutgers University Press.New Brunswich N. J. USA, 269p. 18. EDWIN, G., MICHAEL, A., GEERT-JAN, D. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture. Tercera edición. Volume 1. The Background. Wageningen, The Netherlands. 500pp. 19. ELLENA, M.1998. Aspetti fisiological e biochimici asociati al processo rizogenético del Castagno da frutto e Nocciolo. Universidad de Bologna. Departamento de Cultivos Arbóreos. Italia. 157p. 20. GAJDOŠOVÁ, A., OSTROLUCKÁ, M.G., LIBIAKOVÁ, G., ONDRUŠKOVÁ, E., ŠIMA, D. 2006. Microclonal propagation of Vaccinium sp. and Rubus sp. and detection of genetic variability in culture in vitro. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 14 (1): 207-212. 21. GARCIA, R., QUIROZ, K., CALIGARI, P., 2007 Cultivo de tejidos de plantas: Estado actual, oportunidades y desafíos. Manuscrito en preparación para publicar en Agrociencias, 32p 22. GEORGE, E.F. 2008. Plant Tissue Culture Procedure - Background 1. En: George, E.F., Hall, M.A. De Klerk, G-J. (Eds), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. Volume 1. The Background. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Pp: 1-29. 23. GEORGE, E.F., DEBERGH, P.C. 2008. Micropropagation: Uses and Methods. En: George, E.F., Hall, M.A. De Klerk, G-J. (Eds), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. Volume 1. The Background. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Pp: 29-65. 24. GONZÁLEZ, M.V. LÓPEZ, M., VALDÉS, A.E., ORDAZ, R.J. 2000. Micropropagation of three Berry fruit species using nodal segments from field grown plants. Annals of applied biology 137: 73-78. 25. GRAVINA, A., MAJOR, G. PIESTUN, D. 1995. Introducción al cultivo de tejidos vegetales in vitro. Primera edición. Montevideo, Facultad de Agronomía, Universidad de la Republica. 33p. 26. GROUT, J.M., READ, P.E., WILDUNG, D.K. 1986. Influence of tissue culture and leaf–bud propagation on the growth habit of ‘N orthblue’ blueberry. J Am Soc Hort Sci 111: 372–375. 27. HABERLANDT, G. 1921. Kulturversuche mit isolierten pflanzenzellen. Sitzungsber. Math. Naturwiss Kl Kais Akad Wiss Wien 111:69-92. 28. HANCOCK, J., 1991. Seminario Internacional Arándano, Producción Comercial y Perspectivas Económicas. Pp.30-43. 29. HARTMANN, H. y KESTER, D. 1995. Propagación de plantas. Cuarta edición. México, CECSA. 760 p. 30. HARTMANN, H.; KESTER, D; DAVIES, F. Jr. Y GENEVE, R. 1997. Plant Propagation, Sexta edición. New Jersey, Prentice Hall. 31. IOCCO, P., FRANKS, T. THOMAS, M.R. 2001. Genetic transformation of major wine grape cultivars of Vitis vinifera L. Transgenic Research 10: 105–112.
40
32. KLEE, H., ESTELLE, M. 1991. Molecular genetic approaches to plant hormona biology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol: 42: 529-551. 33. KOGL, F., A.J. HAAGEN-SMIT, H. ERXLEBEN. 1934. Uber ein neues auxin “heteroauxin”. Aus Harn Xi Z Physiol Chem 228: 90-103. 34. KOZAI, T., SMITH, M. 1995. Automation and Environmental Control in Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. pp. 301- 318. 35. LEIFERT, C., CASSELLS, A.C.2001. Microbial hazards in plant tissue and cell cultures. In Vitro Cell Dev Biol Plant 37: 133–138. 36. LEIFERT, C., MORRIS C., WAITES, W. 1994. Ecology of microbial saprophyte and pathogens in tissue culture and field grown plants: reason for contamination problems in vitro. Critical Reviewsin Plant Sciences 13: 139-183. 37. LEIFERT, C., WAITES, M.M., NICHOLAS, J.R. 1989. Bacterial contaminants of micropropagated plant cultures. J Appl Bacteriol 67: 353–361. 38. LEIFERT, C., WOODWARD, S. 1998. Laboratory contamination management: the requirement for microbiological quality assurance. Plant Cell Tiss Org Cult 52: 83–88. 39. LLOYD, G., MCCOWN, B. 1980. Commercially feasible micro- marker gene: splicing of the intron i n transgenic plants and its propagation of mountain laurel, Kalmia latifolia , by use of use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant shoot-tip culture. Proc. Intl. Plant Propagators Soc. 30: 420–427 40. LOYOLA, V., VÁSQUEZ, F. 2006. Plant Cell Culture Protocols. Second edition. Centro de Investigación Científica de Yucatán, México. Humana Press.pp 35-45. 41. LYRENE, P.M. 1981. Juvenility and production of fast-rooting cuttings from blueberry shoot cultures. J Am Soc Hort Sci 106:396–398. 42. LYRENE, P.M. 1981. Juvenility and production of fast-rooting cuttings from blueberry shoot cultures. J Am Soc Hort Sci 106:396–398. 43. LYRENE, P.M., PERRY, J.L . 1988. Blueberries ( Vaccinium spp.) In: Bajaj YPS (ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 6 Crops II. Springer-Verlag, Heidelberg, pp 181–198. 44. MACHAKOVA, I., ZAZIMALOVA, E. GEORGE, E.F. 2008. Plant Growth Regulators I: Introduction; Auxins, their Analogues and Inhibitors. En: George, E.F., Hall, M.A. De Klerk, G-J. (Eds), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. Volume 1. The Background. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Pp: 175-205. 45. MCCOWN, B., LLOYD, G. 1983. Rhododendron in vitro culture. Plant Cell Tiss. 2: 75–85 46. MEINERS, J., SCHWAB, M., SZANKOWSKI, I. 2007. Efficient in vitro regeneration systems for Vaccinium species. Plant Cell Tiss Organ Cult 89:169–176.
47. MOSHKOV, I.E., NOVIKOVA, G.V., HALL, M.A. GEORGE, E.F. 2008.Plant Growth Regulators III: Gibberellins, Ethylene, Abscisic Acid, their Analogues and Inhibitors; Miscellaneous Compounds.
41
En: George, E.F., Hall, M.A. De Klerk, G-J. (Eds), Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. Volume 1. The Background. Springer, Dordrecht, The N etherlands. Pp: 227-283. 48. MUÑOZ, C. 1990, Métodos de cultivo in vitro para arándano, Corporación de Fomento de la Producción, Chile. 96p. 49. MUÑOZ, C. 1991. Seminario Internacional Arándano, Producción Comercial y Perspectivas Económicas. pp. 44-58 50. MURASHIGE T. y F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant. 15: 473-497 51. NOÉ, N., ECCHER, T., DEL SIGNORE, E., MONTOLDI, A. 1998. Growth and proliferation in vitro of of Vaccinium corymbosum under different irradiance and radiation spectral composition. Biologia Plantarum 41 (2): 161-167. 52. OSTROLUCKÁ, M.G., LIBIAKOVÁ, G., ONDRUBKOVÁ, E., GAJDOBOVÁ, A. 2004. In vitro propagation of Vaccinium species. Acta Universitatis Latviensis Biology 676: 207–212. 53. OZER, H. 2006. Se exportaron a Chile cien mil plantas de arándanos, Disponible en: http://www.agroplant.com.uy/elpais.htm, Consultado el 7 de Diciembre de 2007. 54. PÉREZ, J., MESÉN F., AGUILAR M. Y HILJE L. 2002. Desarrollo de un método de micropropagación aplicable a genotipos selectos de Cedrela odorata L. Optimización de la fase de multiplicación. Revista Forestal Centroamericana. 38: 67-71. 55. PIERIK, R. 1990. El cultivo “in vitro” de las plantas superiores. Madrid. Ediciones Mundi Prensa. 326 p. 56. PINTO-SINTRA, A.L. 2007. Establishment of embryogenic cultures and plant regeneration in the Portuguese cultivar ‘Touriga Nacional’ of Vitis vinifera L. Plant Cell Tiss Organ Cult 88: 253–265. 57. POSPISILOVÁ, J., I. TICHÁ, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZÁKOVÁ. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia plantarum 42 (4): 481-497. 58. PRITTS, M; HANCOCK, J. 1992. Highbush Blueberry Production Guide. New York, Northeast Regional Agricultural Engieneering Service. 200p. 59. REED, B.M., ABDELNOUR-ESQUIVEL, A. 1991. The use of zeation to initiate in vitro cultures of Vaccinium species and cultivars. HortScience 26:1320–1322. 60. ROSAS, F. 2008. El Negocio de los Berries y Perspectivas Frescos y Procesados. II Seminario Internacional. Talca, Chile, Abril 2008. 61. ROWLAND, L. y OGDEN, E. 1992. Use od a cytokinin conjugate for efficient shoot regeneration from leaf sections of highbush blueberry. HortSciense 27;1127-1129 62. ROWLAND, L.J., HAMMERSCHLAND, F.A. 2005. Vaccinium spp. Blueberry. En: Richard E. Litz (Ed). Biotechnology of Fruit and Nut Crops. CABI Publishing: 723 pp. 63. RUŽIC, D., SARIC, M., CEROVIC, R., CULAFIC,L. 2000. Relationship between the concentration of macroelements, their uptake and multiplication of cherry rootstock Gisela 5 in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 9–14.
42
