ESTEQUIOMETRIA MICROBIANA (1)

Villanueva A. Carlos E.

Biotecnología Microbiana

ESTEQUIOMETRIA MICROBIANA

1. CONCEPTOS Y APLICACIÓN EN BIOPROCESOS Estudia las relaciones aritméticas entre las masas o volúmenes de los reactantes y los productos en productos en una reacción química llevada química llevada a cabo por los microorganismos. microorganismos. Los cálculos estequiométricos estequiométricos permiten permiten determinar las relaciones másicas y molares entre los reactantes y los productos finales en los procesos fermentativos. ¿Cual es la concentración final de microorganismos microorga nismos o productos obtenidos respecto de la concentración concentr ación de los componentes (sustratos) del medio de cultivo ? Esta información se deduce de las ecuaciones de reacción escrita y balanceadas correctamente y de los pesos atómicos pertinentes. pertinentes. Por ejemplo: Reactantes 1.

2 H2 4g

+

O2 32 g

Productos 2 H2 O 36 g

36 g 2.

C6H1206 + 6 O2 180 g 192 g 372 g

6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP 264 g 108 g 372 g

Durante las reacciones químicas o bioquímicas los átomos y moléculas se reordenan para formar nuevos grupos pero se conservan las cantidades siguientes: 1. La masa total de total de reactantes = masa total de total de productos; y 2. El numero de átomos átomos de cada elemento (C,H,O) en los reactantes = numero de átomos de cada elemento (C,H,O) en los productos. Sin embargo, no existe una ley correspondiente para la conservación de moles, es decir, moles de reactantes # moles de productos La estequiometría es estequiometría es de aplicación en bioprocesos porque bioprocesos porque permite: 1. El balance de balance de masa y energía 2. Determinar el rendimiento teórico teórico y compararlo con el rendimiento actual actual del producto. 3. Chequear la consistencia de datos de datos de la fermentación experimental 4. Formulación del medio de medio de nutrientes

El crecimiento microbiano (r x = dx /dt = µX) y la formación de productos (r p = dp/dt = qp . X) son procesos complejos que reflejan la cinética y estequiometría global de cientos de reacciones intracelulares. Villanueva A. Carlos E.


Discutiremos: ¿Como son formuladas las ecuaciones de reacción para el crecimiento microbiano y la síntesis de productos (metabolitos) ?

2. ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Cuando ocurre crecimiento celular (r x = dx /dt = µX), las células (biomasa, X) constituye un producto de la reacción y debe ser representada en la ecuación de reacción estequiométrica.

A. PLANTEAMIENTO DE LA ECUACION DE CRECIMIENTO CELULAR a. El crecimiento celular obedece a la ley de la conservación de la masa y podemos escribir la siguiente ecuación para expresar el crecimiento celular aerobio.

CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi Formula quimica sustrato

c CHαOβNγ



Formula quimica fuente N2

+ d CO2

+ e H2 O

Formula quimica biomasa seca

Glucosa: C6H1206 W=6 X =2 Y =6 Z = carece Donde:

a, b, c, d, e

son los coeficientes estequiométricos

b. La ecuación es escrita sobre la base de 1 mol de sustrato. Por lo tanto: a moles de O2 son consumidos y d moles de CO 2 son formados por mol de sustrato reactante. c. La figura representa esta conversión a nivel celular. Bioconversión del sustrato, oxigeno y fuente de nitrógeno para crecimiento celular

CwHxOyNz ----------- a O2 b HgOhNi

---------

c CHαOβNγ

----------

--------

d CO2

----------

---------

e H2 O

CELULA

d. No se incluye multitud de compuestos tales como ATP y NADH, no sujetos a intercambio neto con el ambiente. Las vitaminas y minerales podrían estar incluidos, pero se obvian por su consumo pequeño. Otras sustancias y productos podrían ser seleccionados si son apropiados. Villanueva A. Carlos E.


e. La biomasa es representada por la formula composición de la biomasa microbiana.

CHαOβNγ

que es una reflexión de la

Los microorganismos (por ej. E. coli ) contienen un amplio rango de elementos (Tabla 1). Sin embargo 90 – 95 % de la biomasa puede estar constituida por 4 elementos mayores: C, H, O, N. Tabla 1.

En la Tabla 2 son listadas la composición elemental de varias especies en términos de aquellos 4 elementos. Tabla 2 Composición elemental y grado de reducción para organismos seleccionados Organismo

Formula elemental

Grado de reducción γ (Relativo al NH 3)

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Candida utilis Candida utilis Candida utilis Candida utilis

C H 1.77 O 0.49 N 0.24 C H 1.83 O 0.56 N 0.17 C H 1.81 O 0.51 N 0.17 C H 1.83 O 0.54 N 0.10 C H 1.87 O 0.56 C H 1.83 O 0.46 C H 1.87 O 0.56

4.07 4.20 4.28 4.45

Promedio

C H 1.79 O

4.9

0.50

N

0.20

C H 1.8 O 0.5 N 0.2 puede ser usado como una formula general cuando el análisis de composición no es disponible.

El peso molecular promedio de biomasa basado sobre cantidades de C, H, O, N, es por lo tanto 24.6 aunque el 5-10 % de residuo mineral es a menudo adicionado para contar aquellos elementos no incluidos en la f ormula.



B. “FORMULA MINIMA” DE UN MICROORGANISMO PROMEDIO 1. Composición elemental de un microorganismo  

Es el porcentaje de cada elemento contenido en 100 partes de masa celular (tabla 1) Se puede definir un “microorganismo promedio“ como aquel cuya composición (% P/P) de elementos mayoritarios (C,H,O,N) es: C = 46.5 %

; H = 6.49 ;

O = 31.0 % ;

N = 10.85

Siendo el contenido de sales 5 % 



La composición elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, No se modifica mayormente durante un cultivo. Son semejantes para distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos). Sin embargo, la composición macromolecular (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) puede variar sensiblemente.

2. Determinación de “formula mínima” de un microorganismo promedio 

Teniendo en cuenta la composición elemental media anterior es posible escribir una “formula mínima” de un microorganismo promedio, como:

C H 1.67 O 0.5 N 0.2 Esta formula representa solo el 95 % p/p de la biomasa. Se calcula así: Cálculo de cocientes atómicos: Dividir composición centesimal de cada elemento por su peso atómico C = 46.5 / 12 = 3.88 H = 6.49 / 1 = 6.49 O = 31.0 / 16 = 1.94 N = 10.85 / 14 = 0.78 Obtener relación atómica: Dividir los cocientes atómicos por el menor de ellos C = 3.88 / 0.78 = 4.97 O = 1.94 / 0.78 = 2.49

H= N=

6.49 / 0.78 = 8.32 0.78 / 0.78 = 1

Relacionando al carbono Dividir relaciones atómicas entre 4.97 C = 1 Resulta la:

H = 1.67

0 = 0.5

N = 0.2

“Fórmula mínima” : C H 1.67 O 0.5 N 0.2

Definir 1- “C mol de biomasa ” Con fines netamente prácticos: “cantidad de biomasa que contiene un atomo gramo de carbono”

¿Qué peso de células ( o biomasa) corresponde “a un mol “ ? es decir, ¿Cuantos gramos de células ( o biomasa) corresponde “a un mol “ ?

12 (1) + 1 (1.67) + 16 (0.5) + 14 (0.2) 24.47 1C-mol de biomasa = ------------------------------------------------- = ------- = 25.8 g 0.95 Villanueva A. Carlos E.


Por tanto una concentración de biomasa ( X en gL-1) es equivalente a: X/25.8 C-mol de biomasa;

o bien: XGx /12 C-mol de biomasa L -1

Donde: Gx es la fracción de carbono de biomasa (0.465 para el “microorganismo promedio”) Esta última forma de calcular los C-moles de biomasa es ventajosa ya que solo requiere conocer Gx, un dato que se puede obtener fácilmente de la bibliografía. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer Gx = 0.465 sin temor a cometer errores graves. Definir 1-C mol de fuente de carbono y energía, y también 1 C mol de producto. Por ejemplo para : Glucosa (C6H1206) Etanol (C2H60)

1-C mol de glucosa será CH20 = 30 g 1-C mol de etanol será CH30 0.5 = 23 g

En general para un compuesto de la forma C n H LOq Nm 1-C mol estará representado por C HL/n Oq/n N m/n

C. DETERMINACION DE COEFICIENTES ESTEQUIOMETRICOS La ecuación de reacción planteada no es completa si no se conocen los coeficientes estequiométricos a, b, c, d, e CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi



c CHαOβNγ + d CO2

+ e H2 O

PROCEDIMIENTO: 1. Obtención de la formula para biomasa: una vez obtenida, los coeficientes son evaluados usando procedimientos normales para balances de ecuaciones. 2. Balance elemental y solución de ecuaciones simultaneas CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi



Balance de C: w Bañlance de H: x + bg Balance de O: y + 2a + bh Balance de N: z + bi

c CHαOβNγ + d CO2 = = = =

+ e H2 O

c+ d cα + 2e cβ + 2d + e cγ

Se tiene 5 coeficientes desconocidos y solo 4 ecuaciones de balance 3. Información adicional: esta es requerida antes que las ecuaciones puedan ser resueltas. Usualmente es obtenida de experimentos. Un parámetro medible útil es el: Moles CO2 producido

d

Coeficiente estequiométrico, RQ = ---------------------------------- = --moles O2 consumido a 4. Determinación de los coeficientes estequiométricos 5. Completar ecuación de reacción. 6. Determinar cantidades de S, N, O Villanueva A. Carlos E.


3. ESTEQUIOMETRIA DE LA FORMACION DE PRODUCTOS BALANCE QUIMICO: Los procesos microbianos en los cuales la biomasa microbiana (CHαO βNγ) es el único producto formado (ej. producción de levadura de panificación), son en la practica relativamente raros. Cuando el crecimiento microbiano es acompañado de la producción de uno o varios metabolitos (C jHkOlNm) la reacción global obedece al principio de la conservación de la materia y la ecuación estequiométrica del crecimiento puede extenderse para incluir la síntesis del metabolito de la sgte manera: CwHxOyNz + a O2 + b HgOhNi Donde: C jHkOlNm f



c CHαOβNγ

+ d CO2 + e H2 O + f C jHkOlNm

: fórmula

bruta del conjunto de productos del metabolismo diferentes a la biomasa, CO 2 y H2 O : coeficiente estequiométrico para el producto.

APLICACIONES DE LOS CÁLCULOS ESTEQUIOMÉTRICOS

1. Estequiometría de la producción de etanol 1.1.

Cálculo del coeficiente rendimiento teórico del etanol

Ejercicio: Determínese el c o e f i c i e n t e d e r e n d i m i e n t o d e et a n o l conociendo que la reacción global del proceso fermentativo obedece a la siguiente ecuación química: C6 H12 O6



2C2 H5OH

+

2CO2

Solución: La ecuación corresponde a la reacción principal de la fermentación de etanol: conversión de glucosa en etanol y dióxido de carbono Esta ecuación expresa que una molécula de glucosa se descompone para dar 2 moléculas de etanol y dos moléculas de dióxido de carbono Aplicando los pesos moleculares, la ecuación muestra que la reacción de 180 gramos de glucosa produce 92 gramos de etanol y 88 gramos de dióxido de carbono.

Y p/s

2 [ 12(2) + (6) + (16) ] 92 = ---------------------------------- = ------ = 0.51 gg-1 [ 12(6) + (12) + 16 (6) ] 180

Quiere decir: se formaron 0.51 g de etanol por gramo de glucosa consumida



2. Estequiometría de la producción de aminoácidos 2.1.

Cálculo del coeficiente rendimiento teórico del acido glutámico

Ejercicio: ¿Cual es el rendimiento teórico del acido glutámico a partir de la glucosa y del total de reactantes consumidos? La ecuación estequiométrica es: C6 H12 O6

+ NH3

180 g

17 g

+ 3/2 O2



48 g

C5 H9NO4

+ CO2 + 3H2O

147 g

Solución: Aplicando los pesos moleculares, la ecuación muestra que la reacción de 180 gramos de glucosa produce 147 gramos de acido glutámico .

Y p/s

147 g C5 H9NO4 147 = ------------------------------- = ------ = 0.81 gg-1 180 g C2 H12 O6 180

147 g C5 H9NO4 147g producto Y p/s = ------------------------------------------------- = ----------------------- = 0.6 gg-1 180 g C2 H12 O6 + 17 g NH3 + 48 O2 245 g reactantes Consumidos

El rendimiento es un término muy importante en el análisis bioquímico dada la complejidad del metabolismo y la existencia de frecuentes reacciones laterales.

2.2.

Cálculo de relaciones másicas en la producción de acido glutámico

Ejercicio: La reacción global para la conversión microbiana de glucosa a acido glutámico es:

C6 H12 O6

+ NH3

+ 3/2 O2



C5 H9NO4

+ CO2 + 3H2O

¿ Qué masa se O2 se necesita para producir 15 g de acido glutámico?

Solución:

Pesos moleculares: Oxigeno = 32 Acido glutámico: 147 En la ecuación, los gramos de acido glutámico se convierten en moles utilizando los corchetes unidad de pesos moleculares. Se aplica la ecuación estequiométrica para convertir los moles de acido glutámico en moles de oxigeno. Finalmente los moles de oxigeno se convierten en gramos 1 mol glutámico 3/2 mol O2 32 g O2 15 g. glutámico [ --------------------- ] [ -------------------- ] [ ----------- ] = 4.9 g O2 147 glutámico 1 mol glutámico 1 mol 02 Entonces se necesitan 4.9 g de oxigeno. Si existe también crecimiento microbiano se necesitará una cantidad de oxigeno mayor.

ESTEQUIOMETRIA EN LAS REACCIONES INDUSTRIALES La ecuación de la fermentación alcohólica: C 2 H12 O6  2C2 H5OH + 2CO2 . Sugiere que todos los reactantes (GLUCOSA) se convierten en los productos especificados (ETANOL y CO2) y que la reacción progresa hasta el final . Sin embargo, en los procesos industriales esto no es el caso. En las reacciones industriales la estequiometría puede no conocerse con exactitud y con el fin de manipular la reacción convenientemente, los reactantes no se alimentan en las proporciones exactas indicadas por la ecuación de la reacción. Normalmente se añaden cantidades de algunos reactantes en exceso, los cuales se encuentran mezclados con el producto una vez que la reacción ha finalizado. Además los reactantes se consumen en reacciones laterales para formar productos no descritos en la reacción principal; estos subproductos forman parte también de la mezcla final de la reacción. En estas circunstancias se necesita información adicional antes de calcular las cantidades de producto formado o de reactante consumido. Algunos términos utilizados para describir las reacciones parciales o laterales son: REACTANTE LIMITANTE Reactante que se encuentra presente en la menor cantidad estequiométrica. Mientras que los otros reactantes pueden estar presentes en menores cantidades absolutas al mismo tiempo que se consume la última molécula de reactante limitante, en la mezcla final de la reacción aparecerán cantidades residuales de todos los reactantes excepto del reactante limitante. Ejercicio: Para la reacción de producción del acido glutámico: C6 H12 O6 180 g

+ NH3 17 g

+ 3/2 O2 48 g



C5 H9NO4 147 g

+ CO2 + 3H2O

¿ Cual es el reactante limitante si se proporcionan 100 g de glucosa, 17 g de NH 3 y 48g de O2 ? Solución:

La glucosa será el reactante limitante, incluso aunque se disponga de la mayor cantidad de masa comparada con las demás sustancias.

REACTANTE EN EXCESO Reactante presente en una cantidad en exceso sobre la necesaria para combinar con aquel reactante limitante. Es aquel que permanece en la mezcla de reacción una vez que el reactante limitante se ha consumido totalmente. El porcentaje en exceso se calcula utilizando la relación entre la cantidad de material en exceso y la cantidad necesaria para el consumo completo de reactante limitante.

Moles (masa) presente – moles (masa) necesarios para reaccionar completamente con el reactante limitante % en exceso = ------------------------------------------------------------------------------ x 100 moles (masa) necesarios para reaccionar completamente con el reactante limitante

CANTIDAD REQUERIDA DE REACTANTE Es la cantidad estequiométrica necesaria para alcanzar la conversión completa del reactante limitante. Ejercicio: En el caso de la producción del acido glutámico: C6 H12 O6 180 g

+ NH3 17 g

+ 3/2 O2 48 g



C5 H9NO4 147 g

+ CO2 + 3H2O

a. ¿Cuál es la cantidad requerida del reactante NH 3 para alcanzar la conversión completa de 100 g de glucosa ? b. Si se añaden 17 g de NH3 ¿ Cuál es el % en exceso de NH3? Solución: a. Se requiere 17 g de NH3 para la conversión completa de 180 g de glucosa. Por lo tanto, la cantidad requerida de NH 3 para la conversión completa de 100 g de glucosa es:

17 g NH3 x 100 g glucosa Cantidad requerida de NH 3 = ___---------------------------------------------------------- = 9.4 g NH3 180 g glucosa

% en exceso de NH 3 =

17 g NH3 - 9.4 g NH3 --------------------------------- x 100 9.4 g NH3

=

0.80 x 100 = 80%

Las cantidades requeridas y en exceso se basan en la misma cantidad de reactante limitante incluso solo se produzca una parte de la reacción.

ESTEQUIOMETRIA MICROBIANA (1)

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