ENSAYOS EN BAÑO PARA ÓRGANO AISLADO: Los ensayos realizados en órgano aislado constituyen un modelo sencillo para demostrar la interacción fármaco-rece fármaco-receptor ptor eliminando factores farmacocinéticos. farmacocinéticos. Proporcionando Proporcionando datos acerca del mecanismo de acción de un fármaco, de los receptores que median dicha acción, la potencia relativa, concentraciones activas, interacciones con otros agonistas del mismo receptor, etc.
Ventajas de la utilización del órgano aislado: -
Cuantificación Cuantificación precisa de la respuesta ( se elimina la interacción con otros órganos y sistemas). no hay fenómenos reflejos reflejos No hay influencia de la farmacocinética (no obstante, el metabolismo de la droga puede estar presente).
Inconvenientes de la utilización de un órgano aislado: Aunque
se corresponde con la acción de un fármaco, la información no siempre se puede extrapolar al organismo entero.
Existe una gran variedad de órganos y tejidos que se pueden trabajar ³in vitro´, midiendo por ejemplo, la capacidad contráctil de éstos (útero, intestino delgado, músculo esquelético, conducto deferente, corazón y vasos sanguíneos, estómago, músculo liso de las vías aéreas).
Requisitos de una preparación de órgano aislado: El tejido u órgano requiere ser mantenido en condiciones fisiológicas para asegurar que las respuestas inducidas por el fármaco sean auténticas. Esto se consigue controlando diferentes parámetros. El tejido debe mantenerse en soluciones salinas fisiológicas, que son una mezcla de sales inorgánicas en agua destilada. La composición varía según los requerimientos del órgano con el que se vaya a trabajar. Sin embargo, siempre han de tenerse en cuenta los siguientes parámetros: composición electrolítica; osmolaridad y aporte de energía (glucosa). Estas soluciones requieren aireación constante, bien sea con 95%.0 2, 5% CO 2 o aire cuando se trabaja con el recto abdominal de sapo. Siempre que se trabaje con tejido de mamíferos la temperatura debe ser de 37°C. Oscilaciones de 1°C pueden afectar de manera importante a la respuesta. En algunos casos, determinados tejidos requieren temperaturas más bajas, con el fin de reducir los requerimientos de O 2 , o disminuir contracciones espontáneas.
TIPOS DE CURVA DE DOSIS-RESPUESTA: El incremento de la concentración de la droga, produce un aumento del efecto, pero la relación entre entre concentración concentración y efecto, no es lineal: por debajo debajo de un cierto umbral, no hay efecto, y por encima de una cierta concentración, el efecto ya no puede aumentar y permanece constante. Curvas acumulativas : las concentraciones sucesivas del agonista se añaden al baño para órgano aislado sin retirar previamente la concentración anterior. La adición se hace en concentraciones crecientes. La respuesta del órgano será equivalente a la concentración acumulada del fármaco.
Curvas no acumulativas: cada concentración se añade de manera independiente y aislada. Tras cuantificar la respuesta se realiza el lavado de la preparación y se añade otra concentración de fármaco. El montaje del órgano se realiza en un baño de órganos el cual está constituido por una cámara que contiene un volumen apropiado de solución buffer para la preparación. Este baño tiene una ³doble pared entre las cuales circula agua caliente procedente de un baño con temperatura controlada, con el fin de mantener la temperatura adecuada. Un termostato regula la temperatura del baño. El buffer llega desde un reservorio hasta la cámara a través de un serpentín que mantiene la temperatura. Para cambiar la solución en contacto con órgano, la cámara se vacía por una salida inferior. El tejido se sujeta por uno de sus extremos a un enganche que se encuentra fijo a la pared de la cámara. El otro extremo está unido a un transductor de registro. Este, a su vez, está conectado con un polígrafo en el cual se registran los cambios de tensión o de longitud. Para poder cuantificar correctamente la respuesta hay que realizar previamente el calibrado del polígrafo. Cuando se trabaja con tejidos biológicos, la metodología experimental debe ser regular y constante. Aún así, la variación biológica en la respuesta tisular oscila entre un más o menos, diez por ciento de la media.
El íleo como ejemplo de órgano aislado: El músculo intestinal está inervado por fibras nerviosas simpáticas y parasimpáticas. Las fibras nerviosas parasimpáticas tienen dos sinapsis ganglionares, una en el plexo mientérico y otra en el plexo submucoso. El plexo mientérico se encuentra situado entre dos capas musculares perpendiculares entre sí. La capa más externa está constituida por fibras longitudinales y la capa más interna está constituida por fibras circulares. Las fibras simpáticas son generalmente periarteriales. El reflejo peristáltico es miogénico y local, es decir independiente de toda inervación. Esta actividad miogénica espontánea varía a lo largo del intestino, por lo cual las respuestas serán diferentes en distintas porciones del órgano. La estimulación simpática inhibe los movimientos peristálticos, mientras que la estimulación parasimpática los aumenta. El incremento del peristaltismo está mediado por receptores muscarínicos. Los agonistas muscarinicos van a producir una contracción que será inhibida por antagonistas selectivos.
Condiciones Experimentales: El equipo de trabajo se describirá brevemente, dependiendo de las condiciones experimentales (in vitro o animal completo), cómo se realiza el experimento. Ej.: Se tomó una tira músculo de músculo liso intestinal, se suspendió en un baño de órganos,a 37°C, pH 7,4. Existe la posibilidad de añadir un rango de concentraciones de distintos fármacos al baño, por ejemplo, de acetilcolina ( Ach). La tensión (fuerza de contracción) resultante, se puede medir y representar gráficamente. Seleccionando el rango de concentraciones y representando la respuestas respectivas, se dibuja una curva dosis-respuesta.
Antagonismo competitivo y no competitivo: Competitivo: El antagonista compite con el agonista por el mismo sitio de unión al receptor. Predomina la unión de aquel que se encuentre en mayor concentración para afinidades similares. Por ello, al aumentar suficientemente la concentración de agonista se va a
desplazar el antagonista del receptor y se alcanza la respuesta máxima. La eficacia y la respuesta máxima al agonista es la misma, pero la potencia (DE 50) disminuye.
No competitivo: Agonista
y antagonista se van a unir al mismo receptor pero en sitios distintos. Por ello, por mucho que se incremente la concentración de agonista, éste nunca va a poder desplazar al antagonista del receptor y nunca se alcanzará la respuesta máxima. En este caso disminuye la eficacia y la respuesta máxima, pero ser mantiene la DE 50. La tarea del equipo consiste en representar las curvas de dosis-respuesta correspondientes a los datos experimentales de la droga agonista, en ausencia y presencia de antagonistas o potenciadores, y cuantificar el desplazamiento inducido por este (os) último (os). Dependiendo de la respuesta observada en la gráfica, el equipo discutirá lo concerniente con este último punto. RECTO ABDOMIN AL DE S APO: Para aislar el músculo recto abdominal de sapo se procede a descerebrar y desmedular al animal. Se secciona y se separa la piel del abdomen y se diseca uno de los músculos rectos desde la cintura pelviana hasta su inserción en la parrilla costal. Con hilo, se amarran los extremos del músculo y se fijan, por un lado al tapón del baño, y por el otro, al transductor. El órgano debe permanecer siempre en la solución Ringer sapo a temperatura ambiente y con burbujeo constante. Se deja estabilizar la preparación durante media hora antes de comenzar el experimento. Se debe hacer un registro ocasional del tono muscular con el polígrafo.
