Ensayo de Metodos Directos e Indirectos Para Calcular El Numero de Bacterias Individual

METODOS DIRECTOS E INDIRECTOS INTRODUCCIÓN El crecimiento bacteriano bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas es un proceso llamado fisión binaria. Suponiendo que no se produzca ningún caso de mutación las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la duplicación local! de la población población bacteriana. "as dos células hijas creadas tras la división no sobreviven necesariamente. Sin embarg embargo# o# si el númer número o de superv supervivi ivien entes tes super supera a la unida unidad# d# en prome promedio dio## la población bacteriana e$perimenta un crecimiento e$ponencial. "a medición de una curva del crecimiento e$ponencial de las bacterias en un cult cultiv ivo o ha sido sido trad tradic icio iona nalm lmen ente te una una part parte e de la form formac ació ión n de todo todos s los los micr microb obió iólo logo gos. s. "os "os proc proces esos os fund fundam amen enta tale les s empl emplea eado dos s para para ello ello son son la enumeración bacteriana por métodos directos e individuales# por métodos directos % masivos# por métodos indirectos e individuales# o por métodos indirectos % en bloque. "os modelos permiten conciliar la teor&a con las mediciones. El crecimiento bacteriano se define como un aumento en el número de células# en otras otras palabr palabras as## se refie refiere re al creci crecimie miento nto en pobla poblaci ción ón % no al creci crecimie miento nto en tama'o. E$isten diferentes diferentes métodos para medir el crecimiento bacteriano# en esta práct práctica ica solo solo nos nos enfo enfocam camos os a dos dos técnic técnicas as recue recuerd rdo o direc directo to del del núme número ro de células al microscopio % medida de la turbidez del cultivo.

FASES En estudios auto ecológicos# el crecimiento bacteriano en un cultivo de lotes se pueden modelar suponiendo cuatro fases( fase de adaptación# fase e$ponencial# fase estacionaria % fase de declive.

Fase de adaptación Dura Durant nte e la fase fase de adap adapta taci ción ón o reza rezago go## las las bact bacter eria ias s se adap adapta tan n a las las condiciones de crecimiento. Es el per&odo en el que las bacterias individuales están madurando % no tienen aún la posibilidad de dividirse. Durante la fase de adapt adaptaci ación ón del del ciclo ciclo de crecim crecimie iento nto de las bacter bacteria ias# s# se produ produce ce la s&nte s&ntesis sis de )*+ de )*+## enzimas enzimas %  % otras moléculas. )s& que en esta fase los microorganismos microorganismos no  no están latentes.

Fase exponencial

"a fase de liberación logar&tmica o e$ponencial es un per&odo caracterizado por la duplicación celular. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no se limita# la duplicación continuará a un ritmo constante# por lo tanto el número de células de la población se duplica con cada per&odo de tiempo consecutivo. ,ara este tipo de crecimiento e$ponencial# la representación gráfica del logaritmo del número de células frente al tiempo genera una l&nea recta. "a pendiente de la recta en la figura depende de la base del logaritmo utilizada# % dependiendo de esa base# en la literatura se han asignado diferentes nombres a la pendiente % se han aplicado diferentes fórmulas para su estudio.

Fase estacionaria Durante la fase estacionaria# la tasa de crecimiento disminu%e como consecuencia del agotamiento de nutrientes % la acumulación de productos tó$icos. Esta fase se alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que están disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un valor constante del número de bacterias a medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se iguala con la tasa de muerte bacteriana.

Fase de declive En la fase de declinación# las bacterias se quedan sin nutrientes % mueren. Esta modelo de crecimiento del cultivo básico en lotes se mantiene % pone su énfasis en los aspectos de la proliferación de bacterias que pueden diferir de las del crecimiento de la macrofauna. Se hace hincapié en clonalidad# división ase$ual binaria# el breve tiempo de desarrollo en relación con la replicación en s&# la tasa de mortalidad aparentemente baja# la necesidad de pasar de un estado inactivo a un estado reproductivo %# por último# la tendencia de cepas adaptadas de laboratorio para agotar sus nutrientes.

MEDIDA DE CRECIMIENTO DE UNA PO!ACIÓN MICROIANA

O"ETI#OS -. ompara las ventajas % desventajas de las técnicas de cuantificación directa e indirecta de microorganismos. /. *ealizar una curva de crecimiento de cada técnica % e$trapolar el número de células con los valores de D.0. 1. alcular el tiempo de generación del organismo bacteriano.

,ara ello recordemos que el tiempo de generación 2 g 3 es( el tiempo requerido para que una célula se divida dando lugar a dos células. Si consideramos que entre el tiempo inicial 2t 43 % otro final 2t f 3# ha transcurrido n generaciones# entonces(

g  5 tf 6to7n

Donde n es el número de generaciones# % viene dado por los ciclos de división ocurridos en la población en un tiempo dado.

8nóculo

- célula

/ 4

primera división

/ células

/

Segunda división

9 células

/

:ercera división

; células

/

n células

/

n divisiones

-

/

1

n

,or tanto el número de células final 2 N f 3 será +f5 número de células $ / n

 ) partir de esta fórmula obtendremos n % podremos sustituirla en g  5 tf 6to7n n5 log N f 
MATERIA! $ METODO Material de la%oratorio Espectrofotómetro 9 eldas para espectrofotómetro ,arrilla de agitación 9 =atraces de />44 ml con -44 ml "? 9 )gitadores magnético estéril -4 tubos con ; ml de agua destilada @ - ml de glicerol % una gota de azul de metileno - =icroscopio compuesto. - ámara de +eubauer  - =echero - ampana de e$tracción. ,reinóculo del microorganismo ,inzas de disección - vaso precipitado de />4 ml  )lcohol  )zul de metileno Alicerol Borte$

Actividad Pr&ctica En el matraz de />4 ml colocaremos el preinoculo. =ediremos por ambos métodos para observar el número inicial de células. C seguiremos las mediciones cada hora durante -- hrs % en alguno de estos puntos haremos diluciones para realizar las mediciones.

:écnica del turbidimétrica

-. omogenizar

la

muestra

cuidadosamente

agitando

el

matraz

e

inmediatamente tomar una muestra de - ml con una pipeta estéril % vaciarla

a una celda de espectrofotómetro a una absorbancia de 44 nm. Esta muestra corresponderá al tiempo cero 2t543. +o olvidar utilizar siempre una celda control 2mismo cultivo estéril sin inocular3 /. Se procederá a colocar el matraz en agitación 2parrilla de agitación con un agitador magnético estéril3 1. De la misma manera se repetirá el paso - % / cada hora# % al siguiente d&a tomar dos medidas más.

:écnica de cuenta directa en cámara de +eubauer.

-. "avar cuidadosamente la cámara de +eubauer sin frotar la zona brillante del centro. Secar con papel suave. omogenizar la muestra perfectamente en un vorte$# tomar inmediatamente una muestra con una pipeta ,asteur  de punto fino % depositar una gota entre la cámara % el cubreobjeto por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se distribu%a por capilaridad. olocar el cubreobjeto sobre la zona central limitada por dos e$cavaciones laterales# donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista. /. Dejar reposar durante > min. olocar la cámara en la platina del microscopio % localizar la zona cuadriculada con el objetivo -4F. 1. "ocalizar el cuadro central grande 2-3 que miden -.4 mm por lado# que se encuentra dividido en /> cuadros peque'os 2/3 limitados por triple l&nea que miden 4./ mm por lado. Estos cuadros peque'os a su vez se encuentran divididos en - cuadros más peque'os 213 de 4.4> mm de lado.

'( acer la cuantificación de células con el objetivo 94F contando el número de células que ha% en el último cuadro 213.

Se c)entan solo las c*l)las +)e to+)en la parte s)perior , el lado derec-o del c)adro. para evitar contar do%le/ente )na c*l)la( Ber ejemplo. +úmero de células

1.0mm

4./ mm

C1

1

C2

1

87

48

54

Guantas células ha% en el 1H ;I@9;@>95-;J 71 2K de cuadros contados3 5 1 2132- cuadros de 132/> cuadros de /324.- mm de la profundidad $ -4 93 5 K de células7ml En caso de dilución 2132- cuadros de 132/> cuadros de /324.- mm de la profundidad $ -4 932-4n el factor de dilución3 5 K de células7ml

RESU!TADOS 

*eportar los resultados de la cuantificación de los cultivos# aplicando las técnicas descritas.



8ndicar los cálculos hechos para cada metodolog&a.



Araficar la curva de crecimiento de ambas técnicas. C e$trapolar valores.



alcular el tiempo de generación.

:iempo de

:urbidez 2D.03

ámara de +eubauer  

muestreo

2K células totales7ml3 =atraz )

;(44 am J(44 am -4(44 am --(44 am -/(44 am -1(44am -9(44 am ->(44 am -(44 am -I(44 am -;(44 am

=atraz ?

=atraz 

=atraz )

=atraz ?

=atraz 

omo conclusión de la práctica a desarrollar. En nuestra práctica el preinoculo# se medirá por las dos formas para observar

el número inicial de células. Lue es por la técnica

de turbidimetria % por la cámara de neubauer. Se irán poniendo los resultados de cada hora por cada técnica en una tabla. Se compararan las ventajas % desventajas de las técnicas de cuantificación directa e indirecta de los microorganismos para saber cual nos conviene mejor % cual es más rápida. Se realizara la curva de crecimiento. alcularemos el tiempo de generación del organismo bacteriano mediante la siguiente formula( g 5 t f 6 to7n. omo el ejemplo anterior que nos da.

I!IO0RAFIA Aa%tha "anglois# *uth 8fcher % Man ogle. 2/ abril /4413. recimiento bacteriano. / de abril de /441# de NiOipedia Sitio Neb( https(77es.NiOipedia.org7NiOi7recimientoPbacteriano  )nónimo. 2/44; 6 /44J3. recimiento % muerte de microorganismos. /44J# de microbiolog&a

cl&nica

http(77NNN.unavarra.es7genmic7microclinica7tema4/.pdf 

Sitio

Neb(