Henry
Laboratorio en el
Diagnostico Clinico Homenaje a
Todd-Sanford & Davidsohn John Bernard Henry, M.D.
Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending Pathologist, University Hospital Siale University of New York Upstate Medical University Syracuse, New York
Frederick R. Davey, M.D. Prolessor and Chair. Department ot Pathology.
Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D. Prolessor ol Pathology. State University of New
State University ot New York Upstate Medical
York Downstate Medical Center; Chair.
University. Syracuse. New York
Department ot Pathology and Laboratory
Chester J. Herman, M . D , Ph.D. Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology. Grady Health System, Atlanta. Georgia
Richard A. McPherson, M.D. Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot
Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York
Gregory A.Threatte, M.D. Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medical University. Syracuse, New York
Clinical Pathology. Department ot Pathology. Medical College ot Virginia. Virginia
Gail L. Woods, M.D.
Commonwealth University; Director. Clinical
Prolessor ot Pathology; Director. Clinical
Pathology. Medical College ot Virginia
Microbiology. University of Texas Medical
Hospitals, Richmond. Virginia
Branch. Galveston. Texas
Contenido
Sección I. Patología clínica / Medicina de laboratorio Gregory A.
Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.
1. L a b o r a t o r i o clínico: o r g a n i z a c i ó n , objetivos y p r á c t i c a John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec,
M
S.HIASCPI
DiM.WiUam
2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m é d i c a
K
3
Dcnwyler.M.7
...
50
Gregory A. Threatte, M o
3. Principios de i n s t r u m e n t a c i ó n
. .
60
Andy N.D. Nguyen. MSMÍ. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.
4. A u t o m a t i z a c i ó n d e l l a b o r a t o r i o clínico
79
Rodney S. Markin, /no, cft.O.
5. I n t e r p r e t a c i ó n de los resultados de l a b o r a t o r i o
92
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. «i o.
6. I n f o r m á t i c a , t r a t a m i e n t o de i m á g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d
108
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD
7. Estadística e x p e r i m e n t a l
138
Gregory A. Tetrault. M.D.
8. G a r a n t í a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clínico
148
Gregory A. Tetrault, M.D.
Sección II. Química clínica Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.
9. Evaluación de la función r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r ó l i t o s , e q u i l i b r i o ácido-base y gases sanguíneos
159
D. Roben Dufour, M D
10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b ó l i c o s , ionesinorgánicos y m a r c a d o r e s b i o q u í m i c o s del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o
180
Elena Níkolova Hrístova, M D, John Bernard Henry. M D
21 I
11. H i d r a t o s de c a r b o n o Paul £. Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD
224
12. Lípidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . ¿van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP
249
13. P r o t e í n a s específicas Richard A. McPherson. M o
14. E v a l u a c i ó n de la f u n c i ó n y el d a ñ o h e p á t i c o
264
D. Roben Dufour. M D
281
/5. E n z i m o l o g í a clínica D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD
16. Evaluación de la f u n c i ó n e n d o c r i n a
304
Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o
17. Toxicología y m o n i t o r i z a c i ó n t e r a p é u t i c a de f á r m a c o s Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.
•••
III
335
Sección III. Orina y otros fluidos Gregory A.
Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.
18. E x a m e n básico de la o r i n a
367
Christine £ Füller, Mí), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D
19. L í q u i d o c e f a l o r r a q u í d e o , sinovial y líquidos serosos del o r g a n i s m o
403
Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D
20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g í a y la e v a l u a c i ó n de la f e r t i l i d a d
425
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D
21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologías de r e p r o d u c c i ó n asistida
432
AndréVan Steirteghem.MD.PhD.
22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestación
446
Robert £ Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi.ü.
23. D i a g n ó s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s gastrointestinales y pancreáticas
462
David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.
Frederick R. Davey, MD.,
John Bernard Henry, M.D.
24. E x a m e n básico de la sangre Michael W. Morris.
M S , DLMIASCPISH.,
479
Frederick R. Davey.
M D
25. H e m a t o p o y e s i s
520
Frederick R. Davey. Mo, Robert £. Hutchison. MD
26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s
542
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D
27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos
586
Robert £. Hutchíson, M D, Frederick R. Davey, M.D
28. P l a q u e t a s en sangre
623
Jonathan L Miller, MO.Ph.D.
29. C o a g u l a c i ó n , fibrinólisis e h i p e r c o a g u l a c i ó n
.
.
642
Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .
30. I n m u n o h e m a t o l o g í a
660
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,¡ohn Bernard Henry, Mo
31. M e d i c i n a transfusional
718
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO
32. H e m a f é r e s i s
. .
776
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D
33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y células m a d r e
806
Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISBÍ. John Bernard Henry, M D
Sección V. Inmunología e inmunopatología Richard A. McPherson, M.D.,
John Bernard Henry, M.D.
34. V i s i ó n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunológicos
817
Richard A. McPherson, M.D.
35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u í m i c a Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M
36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r
821 D
850
He/ene MA Paxton. M.S„MTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, гьв. Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc.РЛ.О.D/ABMUI
¡V
Contenido
37. E v a l u a c i ó n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s y la i n m u n i d a d h u m o r a l
878
Richard A. McPherson, MD
38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i ó n
892
Ene Wagner, pt¡o. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD
39. C i t o c i n a s y m o l é c u l a s de a d h e s i ó n
914
H Dons Massey, MD. FI¡ D. DO S . Richard A. McPherson, M D
40. A n t í g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r de histocompatibilidad del h o m b r e
927
Armead H. Johnson. «iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,¡udnh A.Wade. 8 k
41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d
949
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD
42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s
963
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.
43. Evaluación clínica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s r e u m á t i c a s sistémicas Carlos Alberto Yon Múhlen,
MO.F*D..
Roben M. Nakamura.
974
M O
44. Vasculitis
990
Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.
45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecíficas
1000
David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D
46. E n f e r m e d a d e s alérgicas
1016
Henry A. Homburger.MD.
47. D i a g n ó s t i c o y m a n e j o d e l c á n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s t u m o r a l e s serológicos
1028
Jomes T.Wu. rto
Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD
48. Infecciones víricas
1045
Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD
49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsías y m i c o p l a s m a s
1072
Gail L Woods, « D . David H. Walker, MD
50. B a c t e r i o l o g í a m é d i c a
1088
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O
51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s
1119
Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo
52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s
1131
Michael 8. Sm;(íi, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D
53. M i c o b a c t e r i a s
1144
Gail L Woods. MD
54. E n f e r m e d a d e s m i c ó t i c a s Washington C.Wmn.jr,
MD.MRA,
1158 Fred W.Westenfeld.
MIIASCPISM
55. P a r a s i t o l o g í a m é d i c a
1196
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,¡ames W. Smith, MD.
56. P a t o l o g í a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas
1241
Martín G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D
57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnóstico de las e n f e r m e d a d e s infecciosas Gail L. Woods, MD
V
1254
Contenido
Chester, J. Hermán. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.
58. I n t r o d u c c i ó n a la p a t o l o g í a m o l e c u l a r
1273
Chester / Hermán. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D
59. Diagnósticos m o l e c u l a r e s : técnicas y principios básicos Ehzabelli R. Unger.
PIo.
MD,
Margaret A. Piper.
1275
PhD.MP.H.
60. R e a c c i ó n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologías de amplificación
1287
james C. Zimring, MD. PI¡D. Frederick S. No/te, n¡o.
61. Tecnologías de la h i b r i d a c i ó n en serie
1296
jacques Scnrenzet. Mo Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.
62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n é t i c a en la p a t o l o g í a m o d e r n a
1304
Constance K. Stein, PhD.
63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnóstico m o l e c u l a r
1333
Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coríeton T. Garren, MD..PÍI.D.
64. O n c o p r o t e í n a s y d e t e c c i ó n t u m o r a l p r e c o z
.
1344
Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.
65. T é c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnóstico de neoplasias h e m a t o p o y é t i c a s
1355
David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD
66. D i a g n ó s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genéticas
1372
Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.
67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o y o t r o s m a r c a d o r e s genéticos
1390
Herbert F. Polesky, M D.
68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e análisis d e l A D N
1402
Víctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H
1. Soluciones fisiológicas, t a m p o n e s , indicadores ácido-base, m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t á n d a r y t a b l a de conversión de t e m p e r a t u r a s
1417
2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e índice de m a s a c o r p o r a l ( I M C )
1420
3 . C á l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguíneo t o t a l ( V S T )
1424
4. Tabla p e r i ó d i c a de los e l e m e n t o s
1425
5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I ) H. Peter Lehmann. Pít 0, jolin Bernard Henry, MD
VI
.. ...
1426
Autores
M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D. Professor of Bacteriology (Medical Microbiology). Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit, National University of Ireland, Galway; Consultant Microbiologist. University College Hospital Galway. Galway. Ireland
Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R a y m o n d D. Aller, M.D. Clinical Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services (United States). Nashville. Tennessee
M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D. Technical Director. Advocate Shared Services Laboratory. Park Ridge, Illinois C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D. Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine. New York. New York
W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New York Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. Incorporated. Tokyo. Japan
S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D. Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic Affairs, Department of Pediatrics; Director. The Immunology Research Laboratory, Weill Medical College of Cornell University, New York. New York
Fujirebio
Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins University School of Medicine. Baltimore. Maryland
F r e d e r i c k R. Davey, M.D. Professor and Chair, Department of Pathology. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York
Ulysses J . Balis, M O Instructor in Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. Massachusetts
J u l i o C. D e l g a d o , M.D. Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory. Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts
W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory Science, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York
M a r g o A . D e n k e , M.D. Associate Professor. University of Texas Southwestern Medical Center. Dallas. Texas
M i r i a m Blitzer, Ph.D. Professor and Chief, Division of Human Genetics. Department of Pediatrics. University of Maryland, Baltimore. Maryland
W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T. Senior Consultant. Health Systems Concepts. Incorporated. Longwood. Florida D. R o b e r t D u f o u r , M.D. Professor of Pathology. George Washington University Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of Pathology. Uniformed Services University of the Health Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical Center. Washington. DC.
L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A. Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine and Pathology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore Medical Center, Neptune. New Jersey Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H. Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons,
M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D Associate Professor and Vice Chairman. Department of Pathology. University of Texas Medical Branch, Galveston. Texas
New York, New York D a v i d J . B y l u n d , M.D. Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory. San Diego. California
A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D. Associate Professor. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth University; Technical Director of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia Hospitals, Virginia Commonwealth. University. Richmond. Virginia
Laura C o o l i n g , M . D . M.SC. Assistant Professor. Department of Pathology. University of Michigan Medical School; Assistant Director, Blood Bank and Transfusion Medicine, University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan
vii
M i c h a e l M. F r a n k , M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina
J o n a t h a n R. H i b b s , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, New York
T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D. Associate Professor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Clinical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. Washington
H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D. Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota J o a n H . H o w a n i t z , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State University of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital Center, Brooklyn. New York
C h r i s t i n e E. Fuller, M D . Fellow, Department of Pathology, Washington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri
E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D. Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York
C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D., Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia
C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S„ MT
W a y n e W . G r o d y , M.D., P h . D Professor. Divisions of Molecular Pathology and Medical Genetics, Departments of Pathology and Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology Laboratory, UCLA Medical Center, Los Angeles, California
C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D. Professor. Department of Microbiology. University Medical Center. Washington.
R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D. Professor of Pathology. Director of Clinical Pathology, and Director of Hematopathology, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York
R o b e r t J . H a r t z m a n , C A P T , M C , U S N , M.D. Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment Program and Research Program, Naval Medical and Research Insitute, Bethesda. Maryland R a n d a l l T. H a y d e n , M.D. Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's Research Hospital. Memphis, Tennessee
H a i x i a n g J i a n g , M . D , Ph.D. Assistant Research Professor. Department of Pediatrics. Duke University Medical Center, Durham, North Carolina
D a v i d G. H e i s i g , M.D. Associate Professor of Medicine. Department of Medicine, State Universit of New York Upstate Medical University Syracuse. New York J o h n B e r n a r d H e n r y , M.D. Director, Pathology 200, College of Medicine; Distinguished Service Professor; Director, Transfusion Medicine & Transfusion Medicine Fellowship; Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage Testing Laboratories; Attending Pathologist, University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D. Professor of Pathology, Emory University School of Medicine; Director. Pathology, Grady Health System, Atlanta. Georgia
Georgetown DC
A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D. Professor, Department of Pediatrics, Georgetown University Medical School, Washington. DC Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC Visiting Professor. Kyorin University School of Public Health: Research Fellow. Keio University of Medicine. Tokyo, Japan C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D. Professor and Chair. Department of Pathology, University of Utah: University Hospital (Laboratory Services) Chairman and Pediatric Pathology (Laboratory Services) Chairman. University of Utah Hospital and Primary Children s Medical Center. Salt Lake City, Utah
viii
Autores
R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D.
Paul E. K n u d s o n , M.D. Associate Professor of Medicine, Division of Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York
Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical Pathology,
Medical College
Virginia Commonwealth University; Director.
Clinical Pathology. Medical College of Virginia Hospitals. Richmond. Virginia
W i l l i a m K o s l o s k y , M.D. Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A n t h o n y S. K u r e c ,
Department of Pathology.
of Virginia.
J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D. Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs. Department of Pathology: Director of Special
M.S., H ( A S C P ) D L M
Hematology Laboratory.
Clinical Associate Professor. Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Professions: Administrator for Pathology Marketing and University Pathologists Laboratories, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York
University Hospital,
State
University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York M i c h a e l W. M o r r i s , Professor.
M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D. Professor. Department of Pathology: Director of Clinical Laboratories. Harvard Medical School. Boston, Massachusetts
M.S.. D L M I A S C P I S H
Department of Clinical Laboratory Science;
Manager. Department of Pathology. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R o b e r t M . N a k a m u r a , M.D.
R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Laboratory Director, University Hospital Rapid Response Laboratories. University Hospital. Albuquerque. New Mexico
Professor.
Departments of Immunology and
Experimental and Molecular Medicine.
The Scripps
Research Institute: Senior Consultant and Chairman Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla. California A n d y N.D. N g u y e n ,
H. Peter L e h m a n n , Ph.D. Professor Emeritus. Department of Pathology. Louisiana State University Medical Center. New Orleans. Louisiana
M S M E , M.D.
Associate Professor.
Department of Pathology.
University of Texas Medical School at Houston; Director.
Hematology Laboratory and Chemistry
Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director. J o h n A. Lott, Ph.D. Professor. Department of Pathology, The Ohio State University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio State University Hospitals, Columbus. Ohio
Coagulation Laboratory.
Memorial Hermann Hospital.
Houston, Texas W a l t e r W . N o l l , M.D Professor of Pathology.
R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D. Professor and Vice Chair, Department of Pathology and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs. College of Medicine, University of Nebraska Medical Center. Omaha. Nebraska
Dartmouth Medical School.
Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry and Molecular Genetics Dartmouth-Hitchcock Lebanon.
Diagnostic Laboratories,
Medical
Center,
New Hampshire
F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D.
H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S. Chief Resident in Pathology. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia
Associate Professor. Medicine,
Pathology and Laboratory
Emory University School of Medicine;
Laboratory Director,
Clinical Microbiology and
Molecular Diagnostic Laboratories. Rex M. M c C a l l u m , M.D. Associate Clinical Professor of Medicine. Division of Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke University School of Medicine; Vice Chair for Clinical Services. Department of Medicine. Duke University School of Medicine and Hospital. Durham. North Carolina
Laboratories, Atlanta.
Emory Medical
Georgia
M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi) Associate
Professor-Pediatrics.
Northwestern
University Medical School; Director.
Diagnostic
Immunology and Flow Cytometry Laboratories. Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois
ix
The
Autores
S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology: Director. Andrology Service. University Hospital, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York
H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P ) Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs and Research and Development, PanBio InDx, Incorporated. Baltimore. Maryland D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D. Medical Director. Infectious Disease Research Institute; Vice President, Diagnostics Research. Corixa Corporation, Seattle. Washington
Jacques Schrenzel, Assistant Professor. Consultant. Division University Hospital.
M i c h a e l A. Pfaller, M.D. Professor. Department of Pathology; Director, Molecular Epidemiology and Fungus Testing Laboratory, University of Iowa College of Medicine. Iowa City, Iowa
G r e g o r y P. S m i t h , M.D. Assistant Clinical Professor. Department of Pathology. University of Utah; Staff Pathologist, Department of Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah J a m e s W . S m i t h , M.D. Professor Emeritus. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana
M a t t h e w R. P i n c u s , M . D , Ph.D. Professor of Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York
M i c h a e l B. S m i t h , M.D. Assistant Professor; Associate Director, Clinical Microbiology and Laboratory Information System. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas
A l v a r o A . P i n e d a , M.D. Professor of Laboratory Medicine and Director of Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota
C o n s t a n c e K. S t e i n , Ph.D. Associate Professor of Pathology and Pediatrics; Director of Cytogenetics and Associate Director of Molecular Diagnostics. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York
M a r g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H . Senior Consultant. Technology Evaluation Center. BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois
E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P Voluntary Professor. Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio: President and Chief Executive Officer, Medical Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky
H e r b e r t F. Polesky, M.D. Professor (retired), Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director, Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, Minnesota
R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C Associate Professor in Clinical Laboratory Science. State University of New York Upsate Medical University, Syracuse, New York G r e g o r y A. Tetrault, M.D. Medical Director, Shared Laboratory Services. Chesapeake, Virginia
B a r b a r a S. R e i s n e r , Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology: Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory, University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P. Special Assistant for Clinical Studies,
M.D Geneva University Medical School: of Infectious Diseases, Geneva Geneva, Switzerland
L.C..
G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D. Professor of Pathology; Director of Core Laboratories and Outreach, Upstate Medical University, Syracuse, New York
National Institutes
of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute. Division of Heart and Vascular Diseases, Bethesda. Maryland
E l i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D. Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers for Disease Control and Prevention; Clinical Associate Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia
R h o n d a K. Roby, M . R H Senior Forensic Specialist, Human Identification, Applied Biosystems. Foster City, California x
Autores
E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D. Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Boston. Massachusetts A n d r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D. Full Professor, Medical School; Scientific and Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine, Medical School and University Hospital, DutchSpeaking Brussels Free University. Brussels. Belgium D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D Assistant Professor. Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Staff Hematopathologist. University of New Mexico Health Sciences Center. Albuquerque. New Mexico C a r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D. Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine, Pontifical Catholic University School of Medicine, Porto Alegre, RS, Brazil J u d i t h A. W a d e , B Sc. Professor, Department of Surgery, and Faculty of Medicine, University of Toronto; Formerly Head, Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital University Health Network, Toronto. Ontario. Canada Eric W a g n e r , Ph.D. Immunologist, Ste-Justine Hospital, Quebec, Canada
Montreal.
D a v i d H. W a l k e r , M.D. Professor and Chairman. Department of Pathology; Director, World Health Organization Center for Tropical Diseases. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Victor W . W e e d n , M . D , J.D. Principal Research Scientist and Director of Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon University, Pittsburgh. Pennsylvania R u t h S. W e i n s t o c k , M . D , Ph.D. Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs Medical Center, Syracuse, New York E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D. Attending Pathologist and Director, Transfusion Service, Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey
R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S. Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate Professor of Human Genetics, University of Maryland; Attending Pathologist, Division Head of Clinical Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland F r e d W. W e s t e n f e l d , M T ( A S C P > S M Clinical Faculty. University oí Vermont: Microbiology Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pathology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus. Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D. Assistant Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Director. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemapheresis Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas J a m e s T . W u , PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (ARUP). Salt Lake City. Utah M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D. Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: Staff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois E d m o n d J . Y u n i s , M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia
CAPÍTULO 33
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A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E
de la sangre periférica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de placenta o sangre de cordón.
Células madre de sangre periférica El impulso para el desarrollo de tecnologías que permitieran la recogida de CMH de sangre pentérica fue su uso potencial para trasplante autólogo, en que el riesgo de contaminación de la médula con células tumorales es alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de médula ósea por hemaféresis, las células madre obtenidas de sangre periférica se usan de forma creciente en el entorno alogénico. Un área de gran importancia puede ser la donación de no familiares o voluntarios, en la que más individuos pueden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donación de médula cuando la hemaféresis se ofrece como opción frente a la recogida tradicional de médula ósea. El procedimiento e instrumentación utilizados para la recogida de células madre de sangre periférica se describen el Capitulo 32. De forma clara, la mayor ventaja de las células madre obtenidas de sangre periférica frente a la médula ósea es el tiempo de injerto de neutrófilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 días para las células madre de sangre periférica frente a las dos a cuatro semanas de la médula ósea (Gianm, 1989). Esta rápida recuperación claramente reduce la morbimortalidad asociada por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y demás. Se sabía que las CMH estaban presentes en sangre periférica tras la recuperación de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de hemaféresis que permitieran una recogida segura de un adecuado número de estas células para proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de pacientes para trasplante autólogo. se ha establecido actualmente la recogida de un gran volumen de aféresis I14-201/ procedimiento) como un procedimiento eficaz para recoger un número adecuado de CMH en un razonable número de procedimientos para proporcionar una recuperación hematopoyética adecuada. Las CMH son morfológicamente indistinguibles de otras células mononucleares de la médula ósea o sangre periférica, por lo que resulta esencial la recogida de un número adecuado de células para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de médula ósea perseguía obtener un número suficiente de células nucleadas que permitiera asegurar un número mínimo de células madre. Los injertos de médula ósea pueden también ser evaluados para la actividad de células madre mediante el uso de técnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de células mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimiento hematopoyéticos y aminoácidos esenciales durante 10 a 14 días. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el número y características de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblásticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Unidades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen más de 50 células se valoran como una colonia. Las muestras con más de 1 x 10 UFC por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la recogida de células madre evolucionó hacia el uso de procedimientos de hemaféresis de sangre periférica, se hizo necesario desarrollar un método que se :
pudiera realizar en el mismo día y que determinara el número de muestras de hemaféresis necesarias. El método más aceptado para valorar las muestras de células madre de sangre periférica es la cuantificación del número de células con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las células primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemaféresis utilizando el recuento de células CD34como índice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hematopoyético (Berenson. 1991). La estandarización de la valoración de las células CD34 y la disponibilidad de los análisis de citometria de flujo han ocasionado que la medida de las células CD34+ se utilice por la mayor parte de los programas para determinar el número y adecuación de las muestras de células madre de sangre periférica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de células madre de sangre periférica con mas de 3 x 10 células CD34+ por kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrófilos entre 8 y 10 días. f
La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requeriría múltiples procedimientos de recogida y aféresis, dado que el número de CMH en sangre periférica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del número de células en la médula. En consecuencia, se requieren terapias de "movilización" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficiencia de la recogida por hemaféresis. Richman (1976) descubrió que mientras hay una caída en el número de células CD34+ circulantes después de la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de células CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrófilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 14 y 21 días después de la terapia. Este aumento en células CD34+ circulantes es mayor con agentes quimioterápicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por hemaféresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes números de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de células CD34+ circulante es breve (dos a tres días), son críticos un estrecho control del recuento de leucocitos y células CD34+ circulantes del paciente, así como el control de los tiempos de recogida por hemaféresis. Además, algunos investigadores han señalado que la recogida de CMH en la fase de recuperación tras quimioterapia reduce la probabilidad de contaminación por células tumorales en el producto de aféresis. El uso de factores de crecimiento hematopoyético como el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrófago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el número de células CD34+ en sangre periférica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 10 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 días causan un aumento de 5 a 10 veces en el número de CMH en sangre periférica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser más eficiente que el cebado con quimioterapia para la recogida de células CD34*. La combinación de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la máxima movilización de células madre pluripotenciales en sangre periférica, así como la necesidad de menor número de procedimientos de hemaféresis para recoger una dosis de CMH para trasplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de trasplante autogénico. Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alogénico sano para movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor óseo y cefalea, resulta bien tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes
Tabla 33-6 Comparación de las tuentes y productos de células madre hematopoyéticas. Lugar de recogida y complicaciones Sangre de cordón (CMSC) Tipo de donante Producto Lugar de recogida Complicación principal
Sangre de cordón umbilical Célula madre de sangre de cordón Cordón umbilical de placenta en el nacimiento Insuficiencia de células madre
Autólogas (CMMO + CMSP) Paciente Médula ósea o CMSP Médula intraoperatona o hemaféresis Recurrencia de la enfermedad original
Alogénicas (CMMO + CMSP) Donante compatible familiar o no Médula ósea o CMSP Médula intraoperatona o hemaféresis Enfermedad injerto contra huésped
CMSP= células madre en sangre periférica; CMMO= células madre en medula Osea; CMSC= c é l u l a s madre en sangre d e
cofdon
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H E M A T O L O G Í A , C O A G U L A C I Ó N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL
están utilizando sangre periférica como fuente de CMH en lugar de médula ósea, tanto para trasplantes alogénicos como autogénicos.
Sangre de cordón umbilical Durante muchos años, se sabía que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o células madre estaban presentes en la sangre del cordón umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar células recuperadas de cordón umbilical de placenta para el trasplante hematopoyético (Gluckman. 1989). El éxito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordón ha dado lugar a la organización de diferentes bancos de células de cordón en EE.UU. y en Europa en un intento por proporcionar otra fuente de células madre para los pacientes que necesitan un trasplante alogénico. Además, como las células madre se obtienen de sangre del cordón, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 ó 4 de la GVH. Como consecuencia, el trasplante podría estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las células madre de cordón umbilical se obtienen por canulación de los vasos placentarios, con la placenta todavía in útero o más frecuentemente, después del parto o por expresión directa de la sangre del cordón de la placenta después del mismo. El número de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordón recogido, lo que depende del tamaño del niño/placenta y también de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992). Volúmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto permitirá obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 células nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen descartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordón umbilical no se procesan para reducir el volumen, congelándose directamente en DMSO y almacenándose en nitrógeno líquido. Los trabajadores de banco con entrenamiento específico no sufren distracción por el cuidado de la madre y/o el niño en la sala de partos, y reducen el riesgo de contaminación bacteriana de la sangre del cordón. 6
Una cuidadosa selección de la historia médica y pruebas a la madre son esenciales para asegurar la calidad del producto de sangre de cordón, asi como la ausencia de enfermedad genética. Además de las pruebas de laboratorio habituales para enfermedades de transmisión serológica, se realizan más pruebas para enfermedades bacterianas y víricas. Mientras el almacenamiento de la sangre de cordón umbilical resulta una alternativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia, una oferta real para un mayor número de pacientes, presenta como limitación la necesidad de aumentar el número de CMH adecuadas para receptores de mayor tamaño, asi como la de optimizar los costes de inicio y mantenimiento de bancos de células de cordón.
Depuración Una vez recogidas las células madre hematopoyéticas. bien de médula o de sangre periférica, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado ulterior de las CMH recogidas con el objeto de reducir una posible contaminación por células tumorales o, en los trasplantes alogénicos. reducir el número de células T CD3+. Se han realizado dos aproximaciones no excluyentes entre sí. La primera desarrolla técnicas que persiguen eliminar las células tumorales, también llamadas técnicas de depuración o selección negativa. La segunda utiliza métodos para separar y recoger tan sólo las células madre hematopoyéticas CD34-. descartando la fracción celular restante que. presumiblemente, contiene células tumorales contaminantes: estos métodos se denominan habitualmente técnicas de selección positiva (Tabla 33-7). Las técnicas originales de depuración empleaban una variedad de métodos específicos e inespecílicos para eliminar la población celular no deseada En aquella época se utilizaban fármacos citotóxicos como la 4-hidroxiperoxiciclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las células tumorales contaminantes (Yeager, 1986). Estos métodos son los equivalentes in vitro de altas dosis de quimioterapia, por lo que el mayor efecto negativo es el daño a las CMH. Otras técnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-
mación de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en especial las células T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos monoclonales dirigidos a un receptor específico de célula junto con complemento o ligadas con inmunotoxmas como el ricino para producir una lisis de la población de células tumorales contaminantes. Ademas, con la llegada de la tecnología de esferas inmunomagnéticas (immunomagnetic bead technology). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de estas esteras. El complejo anticuerpo-esfera-célula tumoral se elimina al pasar la suspensión celular por un campo magnético donde la población de células no deseadas quedará retenida y las CMH son eluidas y recogidas. Las técnicas de selección positiva se dirigen a la presencia selectiva del marcador CD34 en las células madre hematopoyéticas y la disponibilidad de anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientras la tecnología original utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos monoclonales. en el momento actual se utilizan técnicas de esferas inmunomagnéticas. La fracción de células mononucleares obtenidas bien de la médula ósea, bien por hemaféresis de células madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u otros monoclonales de interés. Se añade una suspensión de esferas inmunomagnéticas marcadas con un segundo anticuerpo. Este último se liga al monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-célula diana marcado. Cuando la suspensión celular se somete a un campo magnético, el complejo célula CD34»-esfera magnética quedará retenido y la suspensión de células mononucleares que contiene tanto células tumorales no deseadas como células T CD3+ será desechada. Las células madre CD34+ son entonces liberadas de las esferas magnéticas mediante un agente liberador y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magnético, dejando una suspensión celular que contiene aproximadamente un 90% de células CD34-. La reducción del numero total de células T CD3+ llega hasta una reducción de 3.5 log,,. La mediana de recuperación para las células CD34+ es de aproximadamente el 50% de la cantidad inicial de células CD34+ presentes en el producto obtenido por hemaféresis. Aunque todavia está permitido el uso para la selección positiva de células CD34+. esta tecnología también se encuentra bajo activa investigación para aplicaciones de selección negativa.
Depleción de células T Las técnicas para reducir el número de linfocitos CD3+ en los injertos hematopoyéticos alogénicos, generalmente de médula, se han dirigido a reducir la incidencia y severidad de la reacción del injerto contra el huésped (GVH). Muchas de las técnicas descritas para depurar células tumorales, como la selección positiva de células CD34+, han sido también aplicadas para la reducción de células T en el injerto (Tabla 33-8). Otras técnicas específicamente dirigidas a las células T han incluido aglutinación con lectma de soja, formación de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a contracorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al receptor CD2 del linfocito. Añadiendo un paso de formación de rosetas con eritrocitos de oveja, se consiguen eliminar las células T restantes no aglutinadas por la lectina de soja Este método produce una depleción de células T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982).
Tabla 33-7 Métodos de depuración de células madre Selección positiva Selección de células CD34. Columnas en fase sólida Esteras magnéticas Selección negativa Farmacológicos 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC) Etopósido (VP-16) Inmunológicos Células tumorales + AcMo + toxina" Células tumorales + AcMo + lase sólida" • Toxina = complemento ricino, oíros '" Fase sólida = esleras magnéticas.
CAPÍTULO 33
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A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E
Tabla 33-8 Métodos de depleción de linfocitos Leclinas Lectina de soja con formación de rosetas E Centrifugado a contracorriente Inmunológicos Anticuerpos + complemento Anticuerpos + lase sólida Selección positiva
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dios más recientes también han demostrado un papel de las células asesinas naturales (NK) en la reacción "injerto contra leucemia". Otros han empleado combinaciones de técnicas como la selección de CD34+ y dilución a contracorriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en células CD34+ y otra rica células NK con depleción de células T, aprovechando el hecho de que las células NK parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la GVH (Skiera, 1999).
Criopreservación de injertos hematopoyéticos
La dilución a contracorriente es un método utilizado para la depleción de células T que utiliza la separación característica de células en un campo de centrifugado, de acuerdo con el tamaño y densidad de las diversas poblaciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se añaden agentes quimioterápicos o anticuerpos a la población de células madre hematopoyéticas, por lo que no se deteriora su función celular. Los concentrados de capa leucocítica a partir de médula ósea se introducen en la centrífuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fracciones celulares de diferentes tamaños y densidades. El sistema posee una alta eficiencia en la separación de la fracción rica en CFU-GM de la fracción de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las células, la fracción CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente añadida de nuevo a la facción CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de células CD3+. si se desea clínicamente (Noga, 1990). La recuperación celular es alta y. como los medios de dilución son biocompatibles. los productos se pueden redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del procedimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal experimentado. La introducción de técnicas con esferas inmunomagnéticas para la selección positiva de células CD34+ ha llevado al uso de estas técnicas en el trasplante alogénico para la depleción resultante de células T CD3+, en especial de muestras obtenidas de células madre de sangre periférica. La tecnología con esferas inmunomagnéticas se aplica con facilidad a las células madre obtenidas por hemaféresis así como a los productos de médula ósea de gran volumen. Muchos centros han comunicado éxitos con estos nuevos métodos en la reducción de células T CD3+ en trasplantes alogénicos. en especial cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (HensleeDowney, 1997). Otra ventaja adicional tanto de las técnicas de depuración como de selección positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior de células madre para congelación, recuperación y reinfusión al paciente. Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusión de productos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la congelación y almacenamiento para el laboratorio de células madre. En el momento actual, las técnicas autorizadas para la depuración y/o selección positiva para reducir la contaminación por células tumorales son costosas, y se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clínica de estos procedimientos en la reducción de células tumorales. Algunos centros han comunicado un mejor pronóstico mediante el empleo de una combinación de ambas, depuración y técnicas de selección positiva (Clarke, 1998). Las técnicas de selección tanto positiva como negativa producen una pérdida concomitante de hasta un 50% en el número original de células CD34+, tanto por toxicidad de diversos agentes (quimioterápicos, complemento), atrapamiento de complejos en esferas magnéticas, o pérdida durante etapas necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el número de células CD34+ recogidas en la hemaféresis inicial y en la extracción de médula ósea debe aumentarse para contrarrestar la pérdida posterior durante el procesado. Esto puede ser difícil de cumplir en pacientes que son difíciles de "movilizar". La principal desventaja de la depleción de células T es el aumento resultante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que no muestran GVH. La presencia de la población de células T del donante parece ser crítica en la reacción "injerto contra leucemia", en el reconocimiento de los antigenos del huésped por las células del donante que genera una respuesta inmune que elimina las células tumorales de huésped. Estu-
Los injertos de CMH de origen autogénico y muchas muestras alogénicas se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo más frecuente utiliza DMSO al 10% como agente protector, congelación a ritmo controlado y almacenamiento en nitrógeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descongelación frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad asociada con la infusión de productos de células madre con DMSO, otros investigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adición de hidroxietilalmidón u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayoría de los programas. Al intentar lavar los productos después de la descongelación para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una pérdida significativa de células madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a reducir el volumen del producto antes de su congelación, reduciendo de esta forma la cantidad necesaria de DMSO.
Reinfusión de productos de células madre Independientemente de la fuente del injerto de células madre, las CMH se infunden al paciente de forma similar a la transfusión de cualquier producto sanguíneo. Las células madre pluripotenciales. dotadas de un receptor de membrana único, se dirigirán al espacio medular, reinjertándose y replicándose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH recogidas por hemaféresis sin procesado ulterior pueden contener gran cantidad de eritrocitos. La criopreservación con DMSO no conserva la integridad de la membrana del glóbulo rojo, por lo que estos productos contienen una gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en el receptor oscilan desde leves caracterizadas por náusea, escalofríos o cefalea, hasta reacciones más graves, que pueden incluir hipotensión, sepsis, insuficiencia renal o incluso parada cardíaca (Stroncek, 1991). Estas reacciones se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de células madre criopreservadas generalmente reciben premedicación con antihistaminicos y/o antieméticos. También la hidratación y el uso de diuréticos están indicados para reducir los efectos secundarios producidos por la administración de hemoglobina libre y el volumen de líquido infundido.
Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes transfundidos con productos de células madre criopreservadas Frecuentes Escalofríos Náuseas Vómitos Fiebre Cefalea Disnea Inlrecucntes Insuficiencia renal Parada cardiaca Hipotensión Sepsis Factores asociados Volumen de tejido reinfundido Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alogénicos) Contaminación bacteriana
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SECCIÓN IV
•
HEMATOLOGÍA, COAGULACIÓN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL
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S E C C I Ó N
V
Inmunología e inmunopatología Richard A. McPherson, M.D. John Bernard Henry, M.D.
C A P Í T U L O
34
" Visión general del sistema inmune y de los trastornos ¡nmunológicos • RICHARD A. MCPHERSON, M.D.
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
820
Linfocitos T
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO
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Linfocitos B
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS
CÉLULAS LINFOIDES
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INMUNOLÓGICO
Células presentadoras de antígeno
BIBLIOGRAFÍA
Células NK CÉLULAS NO LINFOIDES
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Neutrófilos y eosinófilos Basófilos y mastocitos FACTORES HUMORALES
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Inmunoglobulinas Complemento Citocmas
El sistema inmunológico está estructurado para reconocer, responder y destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias, virus, hongos y parásitos, que de otro modo, serían capaces de promover infecciones dañinas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y de las reacciones específicas que emplea el cuerpo para combatir los organismos patógenos. En general, esta función inmunológica se puede resumir como la búsqueda de antigenos extraños que no pertenecen al cuerpo y su destrucción. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de la aparición de antígenos nuevos extraños en células tumorales y trata de destruirlas dejando ilesos los antígenos normales presentes en células sanas. Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de la función inmunológica se vean afectados. Éstos incluyen reacciones de hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alogénicos de órganos o tejidos, la enfermedad de injerto contra huésped: la búsqueda de la tolerancia en los trasplantes continúa. Este capitulo resalta los componentes del sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clínicas de la inmunidad mas significativas.
CÉLULAS LINFOIDES Las células linfoides del cuerpo incluyen las células de los ganglios linfáticos, bazo, células de las superficies mucosas y células circulantes de la sangre. Derivan de células madre hematopoyéticas multipotentes. que se producen progresivamente desde el saco vitelino en el embrión, al hígado en el feto, y la médula ósea en el niño y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las diferentes células linfoides se identifican por la presencia de marcadores proteicos únicos presentes en su superficie y que permiten a esas células desempeñar determinadas funciones.
Linfocitos T Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la médula ósea, pasan de la corteza a la médula timica y durante este proceso sufren la maduración. Este proceso implica una selección, de modo que las células que reaccionan con antígenos propios se eliminarán, mientras que se retienen otras células capaces de reconocer antígenos mediante interacciones con moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal. 1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfocitos en la sangre, y se encuentran también en zonas paracorticales de ganglios linfáticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su maduración, sufren una programación genética, en la cual el gen para el receptor de antígeno de la célula T (TCR) se reordena para dar receptores proteicos que son invariantes en su especificidad antigénica, durante toda la vida de ese linfocito y de sus células descendientes. La mayoría (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antígeno compuestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un heterodímero que se encuentra en la membrana exterior asociado al complejo molecular CD3 (CD3 es un marcador para células T). Las subunidades proteicas
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
génico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y como ocurre normalmente en una población linfocitaria heterogénea. El análisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de células CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la función de otras células del sistema inmune secretando citocinas que estimulan varias funciones. Existen dos subpoblaciones de células CD4+: T 1, que secreta interleucma 2 (IL-2) e interferón-y (IFN-y); y T„2. que secreta IL-4 e IL-5. Las células T„1 facilitan las actividades de los macrófagos como la hipersensibilidad y la producción de anticuerpos con acción opsonizante; las células T,,2 dirigen la síntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en un 30% délas células T (asi, la relación de células CD4 y CD8 en sangre es típicamente 2:1). Estas células T CD8+ presentan actividad citotóxica y supresora en la respuesta inmune.
células B se produce tanto en la médula ósea, donde tiene lugar una selección negativa y positiva, como en localizaciones periféricas. La estimulación antigénica de las células B desencadena la formación de células plasmáticas que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmunidad humoral. El complejo receptor de antigeno de la célula B utiliza la inmunoglobulina M (IgM) como componente de unión al antígeno. La especificidad antigénica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena pesada se divide en región variable, de diversidad, de unión y constante, mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unión y constantes. La maduración de la respuesta mediada por anticuerpos implica el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reordenamiento génico, aunque el tipo de cadena ligera de una célula B permanece fijado.
El mecanismo de reconocimiento antigénico es diferente entre los dos subtipos de linfocitos T. Las moléculas CD4 se unen a las moléculas de MHC de clase II presentes en las células presentadoras de antigeno, mientras que las moléculas de CD8 interaccionan con moléculas de MHC de clase I. De acuerdo con esto, las células CD4+ reconocen antigenos sólo en el contexto de MHC de clase II, y las células CD8+ los reconocen sólo a través de MHC de clase I.
Las células B también presentan en su superficie receptores para el complemento (CD21. que es también el receptor para el virus de Epstein-Barr [EBV] y hace que estas células sean susceptibles de una infección por EBV) y para la región Fe de las inmunoglobulinas: también presentan COI9 y CD20. que se usan a menudo para la identificación inmunológica de las células B.
H
Células presentadoras de antígeno Linfocitos B Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de los linfocitos periféricos en sangre, y además se pueden encontrar en la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros tejidos linfáticos. En el bazo y ganglios se agregan para formar los folículos Imfoides. La diferenciación de
Los macrófagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de inflamación, y también procesan los antígenos ingeridos y los presentan asociados a moléculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las células T no se activan con antígenos solubles y. por tanto, la presentación de antígenos de este modo es necesaria para la estimulación de células T y la inducción de la
Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las células presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o miemos y presentan los fragmentos peptídicos del antígeno, asociados a una molécula de MHC, a las células T. En la célula T, un TCR específico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activación celular tiene lugar a través del complejo CD3 y la activación de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la célula B está compuesto por una molécula de Ig unida a la membrana que se encuentra formando un complejo con otras proteínas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antigénico. las TK celulares también se activan. La activación coeslimuladora de células T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligandos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulación de la célula T a través de las moléculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molécula CD40 de la célula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. Littman D: Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994; 76:263, con permiso).
CAPÍTULO 34
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VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L Ó G I C O S
inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrófagos también secretan citocinas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar directamente células tumorales en su papel de inmunovigilancia. y además, son también células efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej. la hipersensibilidad retardada). Las células dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones intersticiales de otros órganos) y las células de Langerhans (presentes en la epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmáticas enriquecidas en moléculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presentación antigénica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran muy importantes para esta función en todo el sistema inmune.
Células NK Las células NK (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los linfocitos en sangre periférica. No son células T ni B y anteriormente se las llamaba células nulas. Las células NK tienen la función de lisar otras células sin necesidad de una previa sensibilización. Pueden atacar células tumorales. infectas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a células aberrantes. Las células NK se caracterizan por los marcadores de superficie CD16 y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificación. CD16 es el receptor para la región Fe de la IgG y por tanto las células NK son capaces de lisar selectivamente aquellas células que se encuentran recubiertas de anticuerpos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensibilidad). Las células NK también secretan cilocinas como el IFN-y. Curiosamente, las células NK se pueden reconocer en una preparación de un frotis de sangre tenido, como linfocitos grandes y granulosos.
CÉLULAS NO LINFOIDES Estas células no están programadas genéticamente para reconocer antígenos específicos o interaccionar con células linfoides en la inducción de una respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desencadenadas por diversos factores.
819
linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la exposición continuada a multitud de antígenos extraños y pueden permanecer durante años mediante una secreción continuada para sustituir a aquellas moléculas que se pierden mediante la limpieza normal de proteínas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo es la IgA en una forma dimérica especial que resulta de su secreción a ese lugar (véase Capítulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que reside en la superficie de células B donde puede estar involucrada en la transducción de la señal inmunológica. pero no adquiere concentraciones importantes como moléculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a través de su unión a la superficie de basófilos y estimula la secreción de sustancias vasoactivas de esas células en presencia de alérgenos específicos). Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan uniéndose a los antigenos invasores en la superficie de células extrañas, bacterias, virus, etc. y facilitando su destrucción mediante efectores inespecíficos como el complemento y las células NK. La monitonzación de enfermedades mediante el análisis de inmunoglobulinas incluye un análisis cualitativo para la detección clonal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnóstico de mieloma múltiple) y análisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA (para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobreproducción de tipos de inmunoglobulinas) y para títulos de anticuerpos específicos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumococos, Haemophilus. tétano, difteria u otros microorganismos)
Complemento Este conjunto de proteínas que interaccionan entre si tiene el papel de destruir enzimáticamente las dianas (p. ej.. células, bacterias) a las que les dirigen los anticuerpos u otros medios (véase Capítulo 38). La medida de los componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diagnóstico clínico: detectar deficiencias congénitas (que son relativamente infrecuentes) que pueden suponer una predisposición a ciertas enfermedades como infecciones o la progresión hacia enfermedades autoinmunes) y para detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de análisis de una enfermedad autoinmune sistémica como puede ser el lupus eritematoso sistémico.
Neutrófilos y eosinófilos Los neutrófilos llegan a las regiones de inflamación por la acción de quimioatrayentes; entonces vierten sustancias tóxicas y enzimas de sus granulos que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrófilos también ingieren restos celulares al igual que los eosinófilos. retirándolos de los tejidos.
Basófilos y mastocitos Los basófilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en su superficie receptores que se unen a IgE. La unión de IgE en la membrana de los basófilos no es específica del antígeno que reconoce la IgE. sino que es el resultado de la suma de la acción de la cantidad total de IgE y los basófilos disponibles. Cuando el antígeno (o alérgeno) entra en contacto con su IgE especifica presente en la superficie del basófilo. la célula se activa y secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilidades. Asi, la especificidad de un basófilo está dirigida por la IgE que tiene unida a su superficie desde la sangre; teóricamente, un basófilo podría tener múltiples moléculas de IgE diferentes en su superficie y podría, por tanto, reaccionar con muchos alérgenos diferentes.
FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas Las moléculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de células B para estimular la secreción de más inmunoglobulinas: también pueden circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en contacto con microorganismos patogénicos. Las principales inmunoglobu-
Citocinas Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las respuestas inmunes celulares; son mediadores que actúan a corto plazo y que son elaborados por algunas células y difunden a otras células donde actúan (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrópicas en el sentido de que pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de forma endocrina estimulando células a una cierta distancia; pueden actuar sobre células que se encuentran en el espacio inmediato (estimulación paracrina); también pueden estimular a las propias células que las han secretado (autocrina). Las acciones específicas de las citocinas incluyen la hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que inducen la producción de granulocitos y macrófagos. respuestas de inmunidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], interferones e IL-8), estimulación de la multiplicación y activación de linfocitos (mediante IL-2 y otros), y la activación inespecifica de células inflamatorias (véase Capítulo 39). Todavía se están descubriendo nuevas citocinas a medida que van apareciendo más detalles sobre la comunicación célulacélula. El uso clínico de las citocinas incluye tanto la supresión de la respuesta inmune en el trasplante de órganos alogénico mediante fármacos como la ciclosponna que inhibe la producción de IL-2, y la estimulación de la respuesta inmune en terapias frente al cáncer o a infecciones. Estos últimos tratamientos son en su mayoría experimentales, aunque trabajos recientes han demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con antibióticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996). Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias mediante las cuales las respuestas inmunes se estimularán o inhibirán selectivamente de acuerdo con las necesidades clínicas concretas.
820
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD El MHC (también denominado complejo antigénico leucocitario humano. HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye moléculas de la Clase I (HLA A, B y C). moléculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las moléculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del complemento y el TNF-u y TNF-|i (véase Capítulo 40). Las funciones de los antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su participación en la presentación antigénica a células T. Estos antígenos fueron descubiertos y su naturaleza altamente polimórfica fue descrita en esludios de tolerancia inmunológica y en el rechazo de trasplantes de órganos alogénicos. En consecuencia, una de las utilidades clínicas más importantes del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de órganos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicación clínica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis anquilosante con HLA B27) (véase Capítulo 41). Otra aplicación más del tipo HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formación de anticuerpos anti-HLA tras ser expuestos a múltiples donantes (p. ej., tras las transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplantes de células progenituras hematopoyéticas (HPC) (véase Capítulo 31).
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO
te a virus, hongos, protozoos, parásitos y también microbios intracelulares como mycobacterias. Los pacientes con el síndrome de la mmunodeficiencia adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes oportunistas cuando pierden sus células T CD4+.
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS INMUNOLÓGICO Las principales áreas de aplicación clínica de los ensayos inmunológicos son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de órganos/tejidos y su rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias La enfermedad autoinmune puede ser sistémica (véase Capitulo 43), estar restringida a órganos específicos (véase Capítulo 45) o puede implicar vasculitis (véase Capítulo 44). Muchos de los ensayos se basan en técnicas que emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con autoantigenos específicos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta que emplean secciones de órganos para identificar autoanticuerpos específicos como aquellos que se dirigen frente al músculo liso, mitocondnas. células parietales y demás. Los avances tecnológicos han proporcionado fuentes purificadas de muchos autoantígenos importantes que formarán parte de ensayos futuros para autoanticuerpos más específicos y que permitan una automatización más eficaz. La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alogénicos y las mmunodeficiencias se basan en la búsqueda de subpoblaciones linfocitarias con una particular importancia de las células T y de las CD4+. Ademas, los estados de inmunodeficiencia congénita requieren un análisis más detallado de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando generalmente con una batería de ensayos convencionales para analizar la presencia y (unción de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasando, cuando es necesario, a ensayos muy esotéricos en la búsqueda de desórdenes menos frecuentes (véanse Capítulos 36 y 42).
Las respuestas inmunologías pueden dañar tejidos normales además de los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas respuestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de naturaleza anafiláctica o alérgica: está mediada por la IgE unida a la superficie de basófilos y mastocitos. Cuando antígenos específicos (o alérgenos) se unen a la IgE de superficie, los basófilos se estimulan y liberan la histamina y otras Los trastornos alérgicos se evalúan típicamente a través de ensayos en la sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones piel, medida de la concentración total de IgE en suero, y la cuantificaaon de alérgicas. Estrategias clínicas para el tratamiento de asma y alergias han la reactividad específica de la IgE en suero con alérgenos comunes de la empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar comida, el polen y otros factores ambientales (véase Capitulo 46). los efectos de la histamina hasta la desensibilización. Un estudio reciente A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmunoempleó con éxito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para lógicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnóstico clínico el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podría, en el probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentración de IgE en factores y actividades, para establecer diagnósticos correctos y monitorizar y suero. ajustar los tratamientos. El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antígenos presentes en la superficie celular; el daño puede ocurrir mediante la unión y activación del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicídad BIBLIOGRAFÍA celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de células tumorales o de parásitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los antiFekade D. Knox K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy treatment with antibodies against tumor necrosis lactor c«. N Engl J Med 1996: cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la 335:311. miastenia gravis). Germain R: MHC-dependent antigen processing and peptide presentation ProviEl tipo III resulta de la formación de inmunocomplejos, entre antígenos exóding ligands for T lymphocyte activation. Cell 1994. 76:287. Janeway C. Bottomly K: Signáis and signs for lymphocytic responses. Cell 1994: genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantígenos endóge76:275. nos y autoanticuerpos. El daño tisular típico ocurre en órganos que contienen Milgrom H. Fick RB. Su JO, et al. Treatment of allergic asthma with monoclonal antinumerosos vasos sanguíneos pequeños donde los inmunocomplejos circuIgE antibody N Engl J Med 1999. 341:1966 lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229 Paul W, Seder R. Lymphocyte responses and cytokines. Cell 1994; 76:241 genos endógenos. von Boehmer H: Positive selection of lymphocytes Cell 1994: 76:219. El tipo IV está mediado por células, también se denomina hipersensibilidad Weiss A. Littman D: Signal Iransduction by lymphocyte anligen receptors. Cell 1994; retardada, y depende del funcionamiento de las células T CD4+ o de la cito76:263. toxicidad de células T CD8+. El tipo IV es la base de la reacción inmune frenWeissman I: Developmental switches in the immune system Cell 1994; 76:207.
CAPÍTULO
35
Inmunoensayos e inmunoquímica • Yoshihiro Ashihara, Ph.D. • Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc. • Robert M. Nakamura, M.D. INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
821
Ensayo inmunofluorométrico por partición radial Fluoroinmunoensayo en tiempo real
Características generales de la reacción
Inmunoensayo fluorescente homogéneo
antígeno-anticuerpo Características de los antígenos
Ensayo de polarización de la fluorescencia
Características de los anticuerpos
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitación
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo
Inmunoensayo de fluorescencia protegida
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS
823
INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE
Tipos de inmunoensayos
Origen
Química de conjugación
Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres
Características de la fase sólida
de acridinio como marcadores
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMÉTRICOS
Inmunoensayo electroquimioluminiscente 824
Origen y principios de la reacción de precipitina INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS
825
AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO
Sistemas de inmunoensayo heterogéneos
Resumen
Secuencia práctica del inmunoensayo 830
Origen
en el sistema analítico Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo heterogéneo
Principios y métodos del ensayo
Nuevos sistemas para la próxima generación
Resumen INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
(sistemas modulares) 833
Origen y clasificación
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE 845
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos
Origen
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de
Resumen INMUNOENSAYO FLUORESCENTE
842
Sistemas de ensayo homogéneos
Principio de aglutinación de partículas
RADIOINMUNOENSAYO
841
ensayo por inmunofiltración) 839
Origen y clasificación Inmunoensayo fluorescente heterogéneo Método fluoroinmunométhco
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA Características generales de la reacción antígeno-anticuerpo Los ligandos inmunológicos se basan en la afinidad entre moléculas, como la enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antígeno y el anticuerpo, y juegan un papel importante en los seres vivos. Las características de reconocimiento específico de los inmunoensayos (reacciones antígeno-anticuerpo) han pasado a ser ampliamente utilizadas como herramientas analíticas, a pesar de la amplia gama de métodos disponibles para el análisis clinico en un laboratorio.
Tiras reactivas Instrumentos inmunocromatográficos Resumen BIBLIOGRAFÍA
848
Los inmunoensayos se pueden utilizar para la detección tanto de antigeno como de anticuerpos. Para la delección de antigenos, el anticuerpo específico correspondiente debe prepararse como uno de los reactivos. Lo contrario se aplica para la detección de anticuerpos. La sensibilidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de nuevos tipos de sistemas para la detección de la señal y la tecnología de fase sólida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar menos de 0,1 pg.'ml de antígeno presente en la sangre. Se pueden aplicar a la detección de haptenos como moléculas pequeñas: proteínas y complejos proteicos como las macromoléculas: y también para cualquiera de los anticuerpos frente a alérgenos, agentes infecciosos y antigenos autólogos.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
Características de los antigenos Los antígenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede representar sitios antigénicos (epítopos) para producir los correspondientes anticuerpos, desde moléculas pequeñas como los haptenos y hormonas, hasta macromoléculas como proteínas, glícoproteínas, glicolipidos y otros productos naturales. Algunos compuestos químicos artificiales también pueden ser antígenos actuando como haptenos. Los antígenos deben tener al menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos incluyen secuencias de aminoácidos de peptidos presentes en proteínas y estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.
Características de los anticuerpos La inmunoglobulma. una proteína plasmática importante, se refiere a anticuerpos en el contexto de funciones biológicas de inmunoglobulmas específicas de antígeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a estimulaciones antigénicas. Los anticuerpos se componen de moléculas funcionales y heterogéneas que unen antígenos mediante un dominio de unión al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM presentan dos subgrupos. Todas las moléculas de anticuerpo conocidas presentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura molecular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones variables. El dominio hipervaríable (sitio de unión al epitopo) puede ensamblarse para interaccionar con una amplia variedad de epítopos (determinantes antigénicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos categorías de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como analitos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de antisueros obtenidos a través de la inmunización con un antígeno purificado.
Anticuerpos
2. La producción de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad ilimitada de reactivo homogéneo con una afinidad y especificidad muy constante. 3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmunización con un antígeno sin purificar. Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso. que son las siguientes: 1. Reactividad insuficiente para la precipitación o aglutinación debido a que la formación del entramado del inmunocomplejo es débil o no ocurre cuando se emplean anticuerpos monoclonales. 2. Los antigenos con múltiples epítopos heterogéneos son más difíciles de caracterizar inmunoquímicamente con un solo anticuerpo monoclonal.
Producción de anticuerpos mediante tecnología recombinante Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresión para el fragmento F de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosforilcolina empleando tecnología recombinante en Escherichia colí. Esta técnica hace posible producir un anticuerpo quimérico fusionado con una enzima. Ha aparecido una técnica lamada phage display (una traducción podría ser muestra de fagos) para la producción de anticuerpos (Wmter. 1994). En este método fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unión previamente determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, eliminando asi la necesidad de inmunización y generación de hibridomas. Los genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por unión al antígeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias infectadas Además, la afinidad de la unión de los anticuerpos se mejora mediante mutación. En un futuro próximo esta técnica permitirá el uso de anticuerpos específicos de alia avidez. v
policlonales
Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunización con un antígeno, que presenta varios epítopos. En otras palabras, se generan anticuerpos específicos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo policlonal por un antígeno complejo generalmente es mayor que la de un simple anticuerpo monoclonal. Para la inmunización con moléculas relativamente pequeñas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias proteínas transportadoras o carner.
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de acción de masas de la química se pueden aplicar a la reacción antígeno-anticuerpo. La cinética de una reacción Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986): K Ag + Ab AgAb K 2
Anticuerpos
monoclonales
Los anticuerpos monoclonales (Kóehler. 1975) se han desarrollado empleando las siguientes biotecnologías: fusión somática de células, selección del hibridoma resultante y dilución límite para obtener monoclonales. Se definen como anticuerpos homogéneos uniformes dirigidos a epitopos específicos. Una linea celular establecida permite la secreción de todas las inmunoglobulinas especificas que reaccionan frente a un solo antígeno. Los anticuerpos monoclonales han permitido el análisis de moléculas, epitopo por epitopo. gracias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales no tienen la habilidad de reconocer la molécula completa, en comparación con los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos antígenos con un epitopo común parecen el mismo antígeno. El anticuerpo CA199 (Magnaní, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas y tamaños moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohidratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificación de isoenzimas. subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las moléculas, puesto que pueden distinguir la mínima diferencia entre moléculas.
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anticuerpo libres. AgAb representa la concentración del complejo antigeno-anticuerpo, y K' y K son las constantes de asociación y disociación, respectivamente. El ritmo de formación del complejo antigeno-anlicuerpo se representa de la siguiente forma: K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|
y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi. *' _ [AgAb] ?
K ~[Ag][Ab]~
11
(constante de asociación en el equilibrio o constante de afinidad). K es el parámetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de que los antígenos y los anticuerpos a menudo poseen múltiples dominios de unión en la molécula. La constante de asociación para múltiples reacciones antígeno-antícuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El valor de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos experimentales: a
Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distintos antígenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable existencia de la misma secuencia de aminoácidos, hidratos de carbono o lípidos en distintas moléculas. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo muy útiles y prácticamente ideales para un laboratorio de diagnóstico clínico. Los métodos de producción y las aplicaciones de los anticuerpos monoclonales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes: 1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo muy bien definido.
a
[Ab] = [Ab],-[AgAb] donde [Ab] es la concentración del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. representa la concentración total de anticuerpo inicial.
CAPÍTULO 35
a
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
puestos cromóforos, fluoróforos. y más tarde, compuestos quimioluminiscentes. Dependiendo del sustrato elegido, el método de ensayo se puede definir como un inmunoensayo enzimático fluorescente o quimioluminiscente (Thorpe. 1984). Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluoróforos como sondas. Los fluoróforos requieren de una longitud de onda óptima para que su excitación produzca una emisión de luz detectable. La sensibilidad del FIA normalmente desciende debido al fondo inespecífico presente en las muestras biológicas. Existen fluoróforos que poseen un retraso en la emisión de fluorescencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un FIA en tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha resultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminación del ruido de fondo. Se han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden detectar concentraciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
"([Ab],-B)F
donde F es el anlígeno libre o analito, y B es el antígeno unido o analito. Una representación de Scatchard se produce cuando la cantidad de antígeno unido (B) se representa en eje el X y la relación de los analitos B/F se representa en el eje Y. Dos parámetros que se pueden determinar de una representación de Scatchard son la constante de disociación o afinidad, de la pendiente de la línea, y la concentración de los sitios de unión al anticuerpo por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).
15
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS
Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimioluminiscentes como sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales como la aequorina. A diferencia de los fluoróforos. la mayoría de los compuestos quimioluminiscentes requieren una estimulación química, en lugar de energía lumínica, para generar la emisión de luz. La reacción de reducción-oxidación es un proceso común a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificación de la señal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las moléculas quimioluminiscentes generan un solo fotón por descomposición molecular. Han aparecido una serie de compuestos innovadores para la quimioluminiscencia que han resultado útiles para su aplicación en inmunoensayos. Un metal quelado con grupos tri-bifenilo emite luz a través de una reacción continua de reducción-oxidación en la superficie de los electrodos (Blackburn, 1991).
Tipos de inmunoensayos Una breve clasificación y una lista de las características de vanos inmunoensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitación proporcionan el método más sencillo por el que los antígenos y anticuerpos reaccionan entre ellos sin necesidad de una señal de detección. El complejo antigeno-anticuerpo en un gel o en fase líquida puede observarse cualitativamente como un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector. El inmunoensayo de aglutinación de partículas (Kasahara, 1992b) emplea partículas inertes como sonda, en lugar de la precipitación directa de los complejos antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antígenos unidos a partículas como eritrocitos, látex o un sol metálico reaccionan con el analito de la muestra. Como resultado de esta reacción inmune, las partículas grandes presentan un patrón de aglutinación significativo que puede verse a simple vista. Yalow (1959) describió el desarrollo de un RÍA empleando isótopos radiactivos como sonda. Este avance permitió la detección cuantitativa de niveles residuales de analitos y contribuyó al avance de la investigación básica y la medicina clínica. La insulina, por ejemplo, se cuantificó mediante un RÍA, y sustituyó al inmunoensayo de la insulina. El RÍA se puede preparar como un procedimiento en fase sólida para una separación fácil de la sonda libre de la unida. Desde el desarrollo de los RÍA, la búsqueda de sondas alternativas a los isótopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar inmunoensayos no isotópicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y otros grupos de respuesta.
En los diversos tipos de ensayos mencionados anteriormente, los principales factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son la constante de asociación (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la señal de las sondas y la relación señal/fondo de la señal de detección reducida por el fondo de la propia reacción o por una reacción inespecifica. Los isótopos de yodo 125 ( l) requieren unos 7 millones de moléculas para generar 1 fotón/segundo, basado en el cálculo de la vida media de isótopos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos quimioluminiscentes de enzimas pueden incrementar el número de eventos en una orden de magnitud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplificación catalítica que poseen las enzimas. ,25
l2S
El inmunoensayo enzimático (EIA), que emplea enzimas como sondas, se desarrolló al principio de la década 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y rápidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las señales dependiendo de la actividad catalítica de la enzima. En un intento de mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-
Química de conjugación En función del ensayo elegido, el método de conjugación que une una molécula con otras, como enzimas (o cofactores) a antígenos (o anticuerpos) o antígenos (anticuerpos) a una fase sólida puede variar. La reacción de acopla-
Tabla 35-1 Clasificación de los inmunoensayos y sus características Señal de detección
Separación B/F*
Detección de la señal
Inmunoensayos de precipitación
No necesarias
No necesaria
Inmunoensayos de partículas
Células sanguíneas. partículas artificiales (gelatina. partículas de látex, etc.) Radioisótopos ('»1, H) Enzimas
No necesaria
Fluoróforos
Necesaria
A simple vista, turbidez. nefelometría A simple vista, analizador de patrones, espectrofotometría. cómputo de de partículas Cómputo de fotones Espectrofotometría. fluorimetria. cómputo de fotones Cómputo de fotones
Compuestos quimioluminiscentes
Necesaria
Cómputo de fotones
Radiommunoensayos Inmunoensayos enzimáticos Inmunoensayos fluorescentes Inmunoensayos quimioluminiscentes
3
Necesaria Necesaria
Sensibilidad ~10|jg/m|t -5 ng/mM
-5 pg/ml -0,1 pg/m|6(CL-EIA) 11
-5 pg/ml
1
-5 pg/ml
libre Los ensayos homogéneos que se incluyen no requieren la 'Paso de lavado para la separación do la sonda unida en el inmunocomple¡o de la sonda que queda separación B/F. Dalos de Ritchie (1978) Datos de Aux (1988). 'Oatos de Isomura (1994) 'Datos de Sgoulas (1989) :
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pueden causar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distintas cinéticas de la reacción inmune o la actividad enzimática con las vanado nes de la temperatura. Puede existir una diferencia en la temperatura entre los pocilios que se encuentran en el borde de la placa y los que se encuentran en el centro. Una diferencia de unos 2 C puede observarse con un termómetro infrarrojo entre los pocilios del borde y los centrales a temperatura ambiente. La forma y tamaño de la fase sólida son factores críticos que afectan a la cinética de la inmunorreacción y a la capacidad de unión del anticuerpo o antígeno de la fase sólida. Partículas esféricas magnéticas o de látex de 3.000 A de diámetro, poseen una superficie total mayor para la inmunoabsorción de lo que se obtiene normalmente con otras lases sólidas. La mayor superficie total ayuda a reducir la duración de la reacción inmunológica (Nishizono. 1991). miento aplicada se debería llevar a cabo en condiciones que eviten la reducción de las propiedades biológicas de la proteína. En el método del glutarakJehido (Avrameas, 1978). el glutaraldehido, con dos (o posiblemente más) grupos aldehido como agente de acoplamiento, se ha empleado para la conjugación de grupos amino proteicos. Este método se basa en reacciones mixtas, incluida la condensación aldólica a elevado pH (la pKa del residuo NH es de 8.6 a 10.8). En este método, mostrado en la Figura 35-1. el conjugado resultante presenta formas diferentes por la existencia de múltiples dianas de unión. El método de la oxidación con periodato (Nakane. 1966) para la conjugación de anticuerpos, emplea la peroxidasa de rábano, que contiene grupos de hidratos de carbono en su molécula. Los métodos mencionados anteriormente no son apropiados para la regulación de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se requiere la estereoespecificidad configuracional del conjugado. Como se muestra en la Figura 35-2, se han desarrollado métodos de conjugación nuevos (Kato. 1975; Kitagawa. 1978) empleando un reactivo de conjugación sofisticado, el éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimída (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en un éster activo y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo SH, respectivamente. El grupo carboxilo también puede ser utilizado como una diana específica para la conjugación con un residuo a- o i-NH presentes en una proteina empleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de conjugación. El reactivo NHS también conjuga proteínas o el grupo carboxilo introducido en una fase sólida.
Características de la fase sólida Todos los inmunoensayos heterogéneos que emplean conjugados con sondas, incluidos los radioisótopos, requieren al menos un paso para diferenciar el anligeno que ha reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del que permanece sin reaccionar (libre). La inmovilización de antigenos o anticuerpos en una fase sólida se realiza mediante uniones covalentes o mediante adsorción tísica a través de interacciones no covalentes. Se han empleado como lase sólida, partículas de gel hechas de agarosa. poliacrilamida. cuentas de plástico o placas de poliestireno. y también partículas recubiertas de oxido de hierro que pueden separarse en un campo magnético. A menudo se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter. como fase sólida. Con estas fases sólidas relativamente grandes, puede ser necesaria la agitación de la mezcla de reacción para acortar el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción inmune. El fenómeno prozonal o efecto de gancho, se debe a una elevada concentración de analito, y es probable que se observe en un inmunoensayo de un solo paso cuando se emplean cantidades limitadas de anticuerpo en fase sólida, o cuando se usan anti-
Las partículas que se emplean en los ensayos de aglutinación de partículas se enumeran en la Tabla 35-2 El fenómeno de la aglutinación de partículas (aglutinación directa) causado por una reacción inmune, se observó por primera vez en un ensayo para detectar la presencia de antigeno tras la incubación con el suero de un paciente infectado. La aglutinación de eritrocitos tras la incubación con el suero dio lugar al descubrimiento de los grupos sanguíneos ABO. Los inmunoensayos de partícula se basan en el principio de aglutinación y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a una partícula inerte, en lugar de la precipitación directa de un complejo antigeno-anticuerpo. Como sonda, la partícula puede aumentar significativamente la sensibilidad del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinación resultante se detecta a simple vista o mediante instrumentos espectrofotométricos para su cuantificación. Los entreoíos, partículas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos de partículas de látex, incluyendo el látex modificado con óxido de nierro o tintes, funcionan como fases sólidas útiles en estos ensayos. El diámetro de las partículas empleadas en reacciones de aglutinación varía entre 7 pm y 0,01 pm. No existe una única teoría que explique las reacciones de aglutinación (Kasahara, 1992a) debido a la gran variedad de lamaño de las partículas empleadas. Para partículas mayores de 3 pm a 5 pm de diámetro, no se observa a temperatura ambiente el movimiento browniano de partículas dispersas actuando de acuerdo con el coeficiente de difusión. Sin embargo, la teoría de la energía potencial de la interacción entre partículas, o la teoria de la reacción de coagulación de coloides, se pueden aplicar a partículas pequeñas como pueden ser las micropartículas de látex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es unas 750 veces más eficiente en una reacción de aglutinación que una molécula bivalente de IgG. La distancia entre partículas en una floculación debe ser menor o igual a 120 Adebido a la longitud de la molécula de anticuerpo. En resumen, los factores importantes a tener en cuenta en una inmunorreacción de fase sólida son las propiedades de la superficie de las partículas, como su carga e hidrofobicídad, y la estabilidad de la dispersión.
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMÉTRICOS Origen y principios de la reacción de precipitina El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se combinan con anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utilizado ampliamente en la identificación y cuantificación de las reacciones de precipitina. La aplicación de las técnicas de precipitina posee las ventajas de la sensibilidad, especificidad y sencillez. La limitación que supone la sensibilidao de estos ensayos requiere de una importante consideración. Incluso en las
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INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
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Tabla 35-2 Partículas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinación de partículas Método de ensayo Eritrocitos humanos humana (VIH) Eritrocitos de ave Mezcla de eritrocitos animales (HBV) Látex Látex (color) Microcápsulas Parliculas de gelatina Parliculas pohpeptídicas Partículas de silicato Partículas de oro Soles de metal
Suministro
Hemaglutinación directa (Landsteiner) I lemaglutinación eritrocito-anticuerpo:
Grupo sanguíneo ABO Anticuerpo para el virus de la
placa de microtiter/portaobietos Hemaglutinación directa Hemaglutinación pasiva: placa de microtitor Hemaglutinación pasiva indirecta: placa de microtiter
Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano Anticuerpos de T allldum Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I
Aglutinación pasiva indirecta: portaobjetos Aglutinación pasiva indirecta: turbidimetría Aglutinación pasiva indirecta Inmunocromatografía Aglutinación pasiva: placa de microtiter Aglutinación pasiva: placa de microtiter Aglutinación pasiva indirecta: cámara CCD Aglutinación pasiva e indirecta Aglutinación pasiva: placa de microtiter/cámara CCD Fotometria mejorada con aglutinación indirecta Aglutinación indirecta
Gonadotropma coriónica Ferriti na Gonadotropma coriónica humana (hCG) Anticuerpo para T pallidum Anticuerpos para HIV. T. pallidum Hemoglobina humana (hHb) Anticuerpo para T pallidum, y para HBs Anticuerpo para T pallidum Estrògeno total hCG. hHb
De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu Technology lor the 1990s Washington DC American Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso
mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas técnicas de difusión de luz. el límite inferior de sensibilidad de ensayos de inmunoprecipitina se mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sensibilidad es suficiente para la cuantificación de las principales proteínas séricas. La reacción de precipitma forma la base de muchas técnicas inmunoquimicas cuantitativas y cualitativas que se emplean en los laboratorios clínicos (Kabat. 1961). Los factores que afectan a la reacción de precipitina fueron investigados detalladamente por Heidelberg en 1935, quien encontró que las proporciones relativas entre reactivos, condiciones de temperatura, pH y fuerza iónica del medio, y las características de avidez y afinidad del anticuerpo, son todas de igual importancia para la formación del precipitado inmune. En cuanto al patrón de formación de precipitma cabe notar que existe un punto en que la precipitación es máxima u óptima, denominado punto de equivalencia. La adición continuada de antígeno una vez que se ha alcanzado el punto de equivalencia produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apropiado para la determinación de analitos debería de llegar hasta la zona de equivalencia. La optimización de la concentración del anticuerpo que se va a emplear como reactivo es necesaria, al igual que la optimización de las soluciones tamponadas. Los métodos de precipitación más típicos son los siguientes:
Métodos cualitativos del ensayo de precipitación Inmunodifusión sencilla (Williams. 1970) Inmunodifusión doble (Garvey, 1977) Inmunodifusión doble en dos dimensiones (Williams, 1970) Reacción de electroinmunodifusión (Ritzmann, 1975) Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)
Métodos semicuantitativos del ensayo de precipitación Inmunodifusión radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965) Electroinmunodifusión en una sola dimensión (Axelsen. 1975) (electroforesis 'cohete")
Inmunoensayos
nefelométricos
Se han desarrollado vanas técnicas de análisis por inmunoprecipitina que emplean sistemas de dispersión de la luz (Ritchie. 1978). La formación de los complejos inmunológicos se ha asociado a la cantidad de dispersión de luz y se ha empleado como la base para la cuantificaoón del antígeno Se han diseñado instrumentos sofisticados que rápidamente miden la dispersión de la luz. Las medidas de dispersión de la luz generalmente se denominan turbidimetrias o nefelometrías.
id Biosensor
INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS Principio de aglutinación de partículas La reacción de aglutinación se puede emplear para detectar anticuerpos presentes en individuos que han sido sensibilizados con antigenos específicos (aglutinación directa o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinación inversa emplea un anticuerpo específico que se emplea para detectar antígenos solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un dominio de unión a haptenos (para drogas, hormonas o partículas pequeñas) no forma una estructura entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice en una fase sólida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuando se emplea una partícula o un transportador inmovilizado con un hapteno como reactivos, puede darse una inhibición de la reacción de aglutinación que permite la detección del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de competitividad, en el que la aglutinación de partículas de hapteno con una cantidad limitada de anticuerpo, libre o unido a partículas, se inhibe debido a la presencia de hapteno libre presente en la muestra. Además, partículas marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados a una fase sólida de la membrana. Este tipo de ensayo ha sido muy popular como un método sencillo para la detección cualitativa de gonadotropma coriónica humana (hCG) y otros analitos.
Hemaglutinación Las pruebas de hemaglutinación (Boyden, 1951) son sencillas en su realización y no requieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los países desarrollados como los que se encuentran en vías de desarrollo, han adoptado una variedad de ensayos de hemaglutinación. Una de las pruebas de hemaglutinación más extendidas es la que se emplea para la detección de anticuerpos contra Treponema pallidum. comercializado como Serodia-TP por Fujirebio, Inc (Tokio. Japón). En Estados Unidos, el ensayo de hemaglutinación para Treponema pallidum se aprobó en 1981 por el Center for Disease Control (CDC). También fue recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuanto a su especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b). En el ensayo de aglutinación de Treponema pallidum. el reactivo consiste en eritrocitos sensibilizados y desensibihzados de oveja, y una solución diluyeme del suero para la reconstitución de células sensibilizadas liofilizadas como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos y semicuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dilución del suero, empleando una placa de titer como recipiente de la reacción: empleando una
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SECCIÓN V
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A n t í g e n o o haptcno conjugado en una p a r t í c u l a
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Anticuerpo en la muestra
Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinación pasiva de partículas para la detección de antígenos de múltiples epítopos [A) o de anticuerpos (B). (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.)
pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el pocilio 1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los pocilios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de aglutinación resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos, que indican que la reacción inmune no ha tenido lugar, muestran partículas en floculación condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del pocilio. Por el otro lado, los patrones positivos indican que la reacción inmune ha tenido lugar, y muestran un patrón de aglutinación de partículas extendido. Las partículas aglutinadas no se pueden sedimentar más para obtener una condensación como en los patrones negativos, porque se pierde su forma global en la aglutinación. En las filas primera y segunda, se emplearon el suero y las células no sensibilizadas (control negativo), respectivamente. Los individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuos 3 a 8 muestran resultados negativos o positivos, dependiendo de la dilución de la muestra. Se obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una dilución de 1:2.560 (filas 3 a 8). Existen tote de hemaglutinación para la detección de anticuerpos frente al virus de la hepatitis В (HBV), hepatitis tipo С (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroideos y otras sus tancias. Ensayos de hemaglutinación inversa se emplean para la detección del antígeno de superficie de HBV. la a-fetoproteína (AFP), hemoglobina humana, etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinación es de aproximadamente 50 ng/ml para la detección de antígeno (analito). Kemp (1988) desarrolló un nuevo ensayo de hemaglutinación que emplea un anticuerpo monoclonal específico para el antígeno de superficie de los eritrocitos humanos. Este anticuerpo puede reconocer un epítopo común a diferentes tipos de eritrocitos y a células anormales, como las que se encuentran en casos de anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los eritrocitos de las muestras se emplean como partículas de fase sólida, y la aglutinación resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se
conjugan químicamente para que un anticuerpo reaccione específicamente con los epítopos de superficie del eritrocito, y el otro es específico para el antigeno diana o analito. El ensayo se aplica para la detección de anticuerpos frente a VIH, además de para la detección de varios antigenos. A diferencia de otras formas de aglutinación convencionales, no requiere la separación de plasma o suero. Este ensayo es simple y ahorra tiempo, y además, presenta ventajas en cuanto a la seguridad, porque elimina la necesidad de la separación del suero en el caso de muestras peligrosas positivas para VIH o HBV.
Aglutinación de partículas de gelatina El desarrollo de una partícula especial de gelatina con una superficie muy hidrofílica que es capaz de evitar la unión inespecífica de materiales presentes en la muestra ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984). La partícula se prepara por separación de fases y entrecruzamiento tridimensional a 40'C y pH óptimo. La partícula resultante se tija con formaldehído o glutaraldehido, y su diámetro es de unas 3 um. Las propiedades físicas de las partículas de gelatina en comparación con las de los eritrocitos se muestran en la Figura 35-8. Una partícula de gelatina carece de antigenicidad y está, por tanto, libre de los problemas asociados con el empleo de anticuerpos heterofílicos cuando se emplean eritrocitos como partículas. Este tipo de partícula artificial requiere una menor dilución del suero para evitar las uniones inespecificas y garantiza una detección más sensible que en el caso de los glóbulos rojos. Otras partículas sintéticas (Hirayama, 1991) compuestas de ácido L-glutámico y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama (1991) como alternativa a las partículas de gelatina. Estas partículas sintéticas se pueden teñir de cualquier color porque las partículas son incoloras, al igual que las de gelatina. El ensayo de aglutinación de partículas de gelatina se empleó inicialmente para la detección de anticuerpos frente al virus linfotrópico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubrió inicialmente como un f
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Menos agregados y de menor tamaño
Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibición de partículas para la detección de antígenos con un solo epitopo (haptenos), empleando partículas de antigeno con anticuerpos libres (A) o fijados (8). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA |eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. pallidum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos semicuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington. DC. American Society for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)
retrovirus humano. Este ensayo de aglutinación (Ikeda, 1984) rápidamente se hizo muy popular para la detección de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sensibilidad y especificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control muy estricto de la temperatura. La aglutinación de partículas de gelatina puede sustituir cualquier ensayo basado en la hemaglulmación, con la excepción de ensayos que emplean los eritrocitos de la muestra como partículas.
Aglutinación con látex La aglutinación con látex (Galvin. 1984). utilizando partículas de látex, se ha utilizado para la detección de vanos analitos. como la hCG para las pruebas de embarazo, y la detección cuantitativa de otras proteínas plasmáticas con o sin instrumentación. El procedimiento de este ensayo cualitativo es sencillo. Por ejemplo, es posible que uno solo tenga que mezclar unas gotas del látex sensibilizado con el reactivo y la muestra empleando un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos más larde, se puede detectar a simple vista la aglutinación de fase invertida, como resultado de la inmunoreacción. La aglutinación con látex se adaptó para ensayos cuantitativos empleando métodos de detección lumínica basados en la turbidimetria (absorción de la luz) o nefelometría (dispersión de la luz). Con eslas técnicas, la aglutinación de látex adquiere una mayor sensibilidad de subnanogramos por mililitro, mientras que la sensibilidad del ensayo midiendo la precipitación intacta del complejo antígeno-anticuerpo es menor de 0.5 ug'ml.
Ensayo de turbidimetha con látex La absorción de luz (pérdida de luz mediante su dispersion en la superficie de una partícula) es proporcional al diámetro de la partícula y depende de la
longitud de onda empleada. La mayoría de los reactivos de látex disponibles de forma comercial con un diámetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores químicos automáticos empleando principios de medida fotométncos. Para mejorar todavía más la sensibilidad, se trató de mejorar los reactivos y la instrumentación, así como optimizar el tamaño de la partícula, seleccionar la longitud de onda apropiada, y mejorar el software del sistema informático que integra los datos. Ahora existen sistemas automatizados que emplean partículas de látex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora con una sensibilidad de subnanogramos por mililitro.
Inmunoensayo por contaje de partículas El inmunoensayo por cómputo de partículas (PACÍA: paríde-counting immunoassay) (Masson. 1986) emplea el contaje celular óptico para obtener el descenso en partículas libres después de la inmunoreacción. En el formato PACÍA, se puede medir tanto el ritmo del ensayo, es decir, el ritmo en el que decrece el número de partículas libres, o el valor final cuando ha finalizado la reacción. La medida del ensayo al final de la reacción puede emplearse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por mililitro; sin embargo, se requiere un mayor tiempo de incubación.
Inmunoensayos con otras partículas Se han desarrollado inmunoensayos de dispersión cuasi-elástica empleando la medida del cambio en la respuesta a la distribución del tamaño de la partícula (Yarmush. 1987). Esla técnica utiliza un haz de láser para medir la reducción en la media del coeficiente de difusión de las partículas como resultado de la reacción inmune. Otros métodos miden la variación de anisotropía angular de la luz dispersada con el incremento del tamaño medio de la partícula.
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Figura 35-6. Patrones de hemaglutinación para detectar anticuerpos anti-I pallidum (A) e interpretación como positivo o negativo a la dilución linal del suero (6). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC. American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.]
Glóbulos rojos del dolíanle
Reactivos bivalentes
Unión pero un aglutinación
Figura 35-7. Representación esquemática de un ensayo basado en la aglutinación autóloga de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes en la muestra como partículas. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
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SECCIÓN V
Panículas ,ic
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
inirocitosdco\cia
Las partículas con diámetros parecidos a la longitud de onda consiguen una variación angular de la dispersión de la luz dependiente del tamaño.
Figura 35-8. Microgratía electrónica (x25.000) y propiedades tísicas de las partículas de gelatina en comparación con los eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington. DC. American Society (or Microbiology. ASM Press. 1992. pág. 139, con permiso. |
se ha descrito en el apartado Cinética de la reacción de antigeno-anticuerpo, de la siguiente ecuación.
Resumen La hemaglutinación indirecta y la aglutinación de partículas de gelatina son ensayos que, realizados en placas de microtiter, han sido muy populares en procesos de determinación cuantitativa y cualitativa de diversos analitos. Estos ensayos no requieren instrumentos adicionales ni un control estricto de la temperatura. Lo más importante es que estos ensayos garantizan una sensibilidad igual o mayor que la del inmunoensayo enzimático convencional en lo que se reliere a la detección de anticuerpos frente a agentes infecciosos. El látex como fase sólida proporciona unas importantes ventajas cinéticas, como un menor tiempo de ¡nmunorreacción. Por este motivo, ha sido posible adaptar el látex para su uso en instrumentos sofisticados, aplicando principios diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad de unos 3 órdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitación convencionales. El látex es susceptible de presentar interferencias de factores desconocidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado varios absorbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubación. La gran ventaja del inmunoensayo de partículas es su simplicidad, ya que no requiere la separación de los reactivos libres de los unidos.
B/F = K([Ab].-B) a
el eje Y es la relación B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libre [Abj de [Ab],-B, igual al antígeno libre [Ag). Así. la K, representa la pendiente de la representación. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10 L'M para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiactivas, como los rayos gamma del l, se pueden medir en términos de cuentas por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioisótopos más frecuentes y sus propiedades se muestran en la Tabla 35-3. La elección de la sonda afecta considerablemente al protocolo del ensayo. Por ejemplo, una de las sondas más utilizadas, el l , necesita un tiempo relativamente corto para el conteo. pero no puede almacenarse mucho tiempo debido a que tiene una vida media corta. Sin embargo, el tritio ( H) requiere un tiempo mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duración del ensayo. La mayo9
;:
Ia
1
RADIOINMUNOENSAYO Origen Desde que apareció la técnica del RÍA. el uso de radioisótopos como sonda, que se desarrolló en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha mejorado de una forma espectacular en cuanto a sensibilidad y precisión. Se han introducido diversas variaciones del método en el laboratorio clínico. Hay dos tipos principales de RIAs, competitivos y no-competitivos, que requieren pasos de lavado para separar la sonda unida de la que permanece libre (conjugados). El ensayo competitivo sigue la ley de acción de masas, que especifica la reacción entre analitos y proteínas de unión, receptores y anticuerpo. El tactor clave en la optimización del ensayo es la afinidad de unión del anticuerpo. La representación de Scatchard de la relación entre anticuerpo unido y libre, frente a la concentración del analito, se emplea frecuentemente para evaluar la función del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la representación de Scatchard para la determinación de la ciclosponna. Tal y como
Ciclosponna (pg/ml) Figura 35-9. Representación de Scatchard de las características de unión de anticuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M). a
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CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Tabla 35-3 Propiedades de los radioisótopos empleados como sonda en los radioinmunoensayos Actividad especifica
l25
da de los RÍA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjugación y mantener la actividad biológica de los reactivos. Un método muy utilizado de conjugación de proteínas con l es el método de la cloramma-T (Hunter. 1962). La lirosina. en particular, posee una mayor reactividad con el yodato debido a la presencia de un grupo hidroxi en la posición para del anillo aromático. La señal puede medirse en términos de CPM como emisiones de radiación gamma. A diferencia de las enzimas, el empleo de isótopos como sonda, con un radio de Stokes pequeño, no suele afectar a la actividad antigénica, debido a la falta de alteraciones alostéricas cuando se conjugan isótopos con antígenos pequeños (haptenos). l?5
Principios y métodos del ensayo Se han desarrollado varios métodos (exceso de antigeno) basados en la unión competitiva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antígenos con y sin sonda (analitos presentes en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un método competitivo convencional se muestra en la Figura 35-10. En un principio, una cantidad conocida de antigeno acoplado a una sonda y el antígeno de la muestra se mezclan y reaccionan con una cantidad constante de anticuerpo unido a una fase sólida, como puede ser partículas de sefarosa o la cara interna de tubos de plástico. Después de que la reacción inmune alcance el equilibrio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que no han reaccionado y se separan los antígenos del complejo inmunológico que permanece atrapado en la fase sólida. El paso de lavado aparece como separación B/F {bound: unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representación del porcentaje de antigeno unido frente a la concentración logarítmica del analito produce la curva estándar que muestra la Figura 35-10. La representación de CPM sobre la curva estándar nos da la concentración del analito. Otro método que emplea anticuerpos se muestra en la Figura 35-11. El primer anticuerpo es específico para un determinado antígeno (analito) y reaccio-
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na competitivamente tanto con el conjugado como con el antigeno. Entonces, el complejo inmunológico es capturado por un segundo anticuerpo específico para el primer anticuerpo, asociado a una fase sólida. Cuando el segundo anticuerpo se asocia a una fase sólida fina, el complejo inmunológico de la segunda reacción puede separarse como un precipitado, del resto de las moléculas que no han reaccionado. Para la determinación de un anticuerpo, el anticuerpo unido a una sonda y el anticuerpo de la muestra reaccionan competitivamente con el antígeno (analito) fijado a la fase sólida. Cuanto mayor sea la pendiente de la curva estándar, más precisos son los datos que aporta. Los métodos competitivos requieren cantidades menores de anticuerpo o antígeno (analito) que los ensayos de tipo sandwich descritos más adelante. Los ensayos no competitivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado mayor popularidad en los últimos tiempos. Los ensayos radioinmunométricos (IRMA) o ensayos de sandwich (Fig. 35-12), tienen una relación alternativa entre el analito y el anticuerpo. El ensayo competitivo clásico consigue una respuesta inmunológica con una mínima cantidad de anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran cantidad de anticuerpo en la fase sólida. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha hecho posible la elaboración de grandes cantidades de anticuerpos específicos a un coste moderado, permitiendo la explotación del ensayo de sandwich. El ensayo de sandwich emplea un exceso estequiométrico de anticuerpo y es más sensible que un ensayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sensibilidad teórica última del ensayo de sandwich es de una molécula de analito, lo cual es posible cuando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se acerca al infinito. Como se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase sólida primero se une al antígeno (analito) de la muestra. Después de la separación B'F, el conjugado reacciona con el antígeno (analito) fijado a la fase sólida, y la señal se puede medir después de la eliminación de los conjugados libres mediante un paso de lavado. Este ensayo requiere antígenos con más de dos determinantes antigénicos. Cuando se emplean dos anticuerpos diferentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase sólida específico para un determinante antigéníco, y un anticuerpo conjugado específico para otro determinante antigénico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el sandwich en un solo paso. Así, la fase sólida puede mezclarse con el antígeno de la muestra y con el conjugado simultáneamente. No se produce interferencia porque ambos anticuerpos, tanto el de la fase sólida como el conjugado, son capaces de reconocer distintos determinantes antigénicos. En este ensayo la señal generada es proporcional a la concentración del analito presente en la muestra, al igual que en el ensayo de sandwich en dos pasos. Este método de ensayo se puede aplicar a la detección de anticuerpos con un formato de ensayo que emplea antígeno en la fase sólida y antígeno aco-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
->Conccnir;icit>ii de analto
Figura 35-11. Principio de un ensayo de RÍA competitivo empleando un segundo anticuerpo para la separación B'F (unido/libre). piado a una sonda. Para un formato en dos pasos, se puede emplear el antígeno en la fase sólida y un anticuerpo específico para el anticuerpo diana acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich, la sensibilidad del ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar IRMA para la determinación de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel de sensibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparación con unas 0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antígeno asociado a una sonda.
Resumen Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos por varios motivos: 1) precisión y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjugación del isótopo, 3) detección de la señal sin optimización y 4) estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del RÍA son la corta vida en almacén de los reactivos y la necesidad de protección frente a la radiactividad nociva. Además, como se discute más adelante,
Figura 35-12. Principio de un ensayo de RÍA de tipo sandwich empleando la fase sólida, también conocido como ensayo inmunorradiométrico (IRMA).
CAPÍTULO 35
Tabla 35-4
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Comparación del radioinmunoensayo. el ¡nmunoensayo enzimàtico heterogéneo y el inmunoensayo enzimàtico homogéneo
Ensayo
Pasos de la reacción enzimàtica
Pasos de la reacción inmune
Pasos para la detección de la señal
Radioinmunoensayo Muestra* Analito o Ab marcado Inmunoensayo enzimàtico heterogéneo Muestra+ Analito o Ab -Enzima marcado Inmunoensayo enzimatico homogéneo Muestra* Analito o Ab —Enzima o coladores marcado
Reacción inmune con pasos de lavado para la separación
No necesarios
Emisión radiactiva (rayos y)
Reacción inmune con pasos de lavado para la separación
Reacción enzimàtica con reactivos adiciónalos
Densidad óptica Fluorescencia Luminiscencia
La reacción inmune y/o sistèmica se desarrolla en una sola solución, que incluye el reactivo para el revelado de la serial enzimàtica
La reacción inmune y/o sistémica se desarrolla en una única solución que incluye el reactivo para el revelado de la señal enzimática
Densidad óptica Fluorescencia Luminiscencia
los RÍA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogéneos, debido a que las señales de los isótopos no pueden modular las reacciones antígeno-anticuerpo.
INMUNOENSAYO ENZIMÀTICO Origen y clasificación Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se desarrollaron como una alternativa a los radioisótopos (Engvall. 1971: Van Weeman. 1971; Avrameas. 1971). Los más utilizados son el ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), el EIA y la técnica del inmunoensayo de multiplicación enzimática (EMIT: enzyme-multiplied immunoassay technique), que es una marca registrada de SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Esencialmente, los EIA heterogéneos son similares a los RÍA, excepto que emplean enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogéneos, eliminando los pasos de lavado para la separación B/F que de otro modo son necesarios. La Tabla 35-4 compara las características de los EIA homo y heterogéneos con los RÍA. Mejoras en los EIA han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplicidad y precisión. Las ventajas y desventajas de los EIA se listan en la Tabla 35-5 (Nakamura, 1992).
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos El principio de los ensayos de EIA heterogéneos es similar al de los RÍA. excepto que es la actividad enzimática, no la radiactividad, la que se mide. Los EIA requieren un proceso secundario para obtener señales mediante la reacción catalítica de las enzimas. Como fase sólida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microliter, partículas de plástico, tubos de plástico, partículas magnéticas y látex con filtros, entre otros. El uso de pequeñas partículas magnéticas y de látex permite acortar el tiempo de mmunorreacción, reduciendo asi el tiempo total que requiere el ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introducción de sustratos colorimétricos y fluorométncos, y más tarde de suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la señal. Algunas de las enzimas más utilizadas en vanos EIA heterogéneos son la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa oxidasa. la ureasa y la catalasa. Las enzimas más utilizadas junto con sus características aparecen en la Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzi-
ma y por la selección de la medida de la señal, entre los que la quimioluminiscencia es el método más sensible. El lormato del ensayo de los EIA heterogéneos, al igual que los RÍA. se puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (véase Fig. 35-14). Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigenoenzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de reactivo) incluyen los ensayos inmunométricos de sandwich de dos dianas y los ensayos indirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos inmunométricos de sandwich han aumentado su popularidad para la determinación de antigenos como hormonas, marcadores tumorales. proteínas plasmáticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para la medida de anticuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la detección de anticuerpos frente a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y autoanticuerpos
Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimático A. Ventajas t Se pueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de amplificación de las enzimas. 2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una larga vida de almacenaje 3. Se pueden desarrollar múltiples ensayos simultáneamente. 4 Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones del ensayo 5. El equipamiento no es necesariamente caro y está ampliamente disponible. 6 No existen riesgos radiactivos durante el mareaje ni el desecho de los residuos. B. Desventajas 1. La medida de la actividad enzimática puede ser más compleja que la medida de la actividad de algunos tipos de radioisótopos 2. La actividad enzimática se puede ver afectada por algunos componentes del plasma 3. Los ensayos homogéneos, actualmente, poseen una sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los radiommunoensayos. 4. Los EIA homogéneos para moléculas proteicas grandes se han desarrollado, pero requieren reaclivos inmunoquímicos compiojos J
EIA = inmunoensayo enzimático De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor Microbiology. 199?. pags 149-167, con permiso
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 35-6 Características de las enzimas típicas empleadas como sonda en los inmunoensayos enzimáticos Características Fuente Tamaño molecular (daltons) Actividad específica Tasa de renovación" Medida de la enzima Medida de alta sensibilidad Método de mareaje de la enzima
Peroxidasa (EC 1.11.1.7)
Enzima f5-galactosidasa (EC 3.2.1.23)
Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1)
Rábano ca. 40.000 250 U/mg 10 000 Colorimetria, fluorimetria. luminometria Luminometría Oxidación del periodato (método de Nakane)
E. coli ca. 530.000 600 U/mg 318000 Colorimetria, fluorimetria, luminometría Fluorimetria Método de la dimaleimida, reactivo de entrecruzamiento'
Intestino bovino 140 000 1.000 U/mg 250 000 Colorimetria, fluorimetria, luminomelria Luminometria Método del glutaraldohído, reactivo de enlrecruzamiento
' Número de moléculas del sustrato producidas por una molécula de enzima en una reacción de un minuto; número de moléculas/MUÍ El reactivo contiene grupos químicamente reactivos como el maleimida y el succinimida. 1
¿
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Un EIA heterogéneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos: 1. La fase sólida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Después de la adición del conjugado y la incubación, hay unos pasos de lavado con una solución tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos después de la inmunorreacción. La reacción inmunológica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.
3. La fase sólida, con el complejo inmune que contiene el antígeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solución de sustrato enzimático. 4. La reacción enzimática se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas) y el producto de la reacción se mide con varios detectores dependiendo del sustrato empleado.
Ensayo
enzimático
colorimétrico
En este ensayo, la reacción enzimática se realiza utilizando sustratos cromogénicos para desarrollar un color mediante la reacción catalítica principal. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos más utilizados en los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos. Un espectrofotómetro se utiliza para medir la densidad óptima del cromógeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad óptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresión de los resultados, hasta instrumentos manuales más sencillos. Cuando la reacción EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (método de transferencia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado de color que se acumula en la fase sólida por la acción de la enzima puede detectarse a simple vista. Teóricamente, la medida de la densidad óptima está limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinación de la densidad óptica de analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemática, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado y fase sólida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sandwich. 2
2
Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos no isotópicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs, como son los residuos radiactivos, radiólisis de los analitos marcados, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarrolló un EIA ultrasensible que puede detectar 3 fmoles de una IgG específica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, como la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase sólida a otra distinta para reducir las señales de fondo. l25
Inmunoensayo
L-
ENSAYO de anticuerpo
Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimático (EIA) empleando la fase sólida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.
enzimático
fluorescente
Los EIA fluorescentes son idénticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluoróforo se genera por la reacción enzimática. Después de la excitación del fluoróforo a su longitud de onda de excitación óptima, se emite luz a una longitud de onda característica. Instrumentos como un fluorímetro requieren una fuente de suministro de la luz de excitación y un fotomultiplicador como detector de la emisión de flúores-
CAPÍTULO
AMI'I'I)
35
AMIM)
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Interim diario ( I
ESTADIO SI
Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la detección de la fosfatasa alcalina (ALP). La eliminación hidrolítica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrónico iniciada químicamente (CIEFL: chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposición del AMPPD mediante la liberación de dioxetano fenolato (AMPD) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formación del intermediario de transferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del peróxido cíclico. Tiene lugar una liberación de energía con emisión de luz.
cencía. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en la muestra. Estas sustancias aumentarían la señal de fondo, lo cual puede interferir en la sensibilidad del ensayo. Así. se debe prestar atención a la elección de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los EIA colorimétricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de señal que es al menos de un orden de magnitud mayor.
intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically ¡nitiated electrón exchange luminiscence). mediante la liberación del grupo dioxetano rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda máxima de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la concentración de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de 10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991). El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se usa como sonda enzimática. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partículas férricas de 0.3 pm de diámetro como tase sólida para acortar el tiempo de mmunorreacción a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsorcíon. La relación entre la señal quimioluminiscente y la concentración de analitos es lineal hasta unos siete órdenes de rango dinámico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era 10 veces mayor que la de un RÍA convencional cuando se ensayó la AFP; se detectó un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos. Así. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre los RÍA en términos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza del proceso y están ganando en popularidad en el mercado. 2
Inmunoensayo
enzimático
quimioluminiscente
Los inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se emplean como sonda La reacción enzimática quimioluminiscente genera luz. similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los últimos 20 años, se ha prestado mucha atención a la aplicación de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos muy sensibles. Estos ensayos son efectivos como herramientas en el diagnóstico práctico. La reacción de oxidación enzimática de análogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un método frecuente que se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe (1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y compuestos aromáticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol como potenciador consigue un incremento de la emisión de luz de unas 2.800 veces en una mezcla de reacción optimizada. Este ensayo puede detectar la TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reacciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por múltiples factores que causan un aumento de las señales inespecíficas de fondo (ruido). Bronstein (1989a) desarrolló un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de adamantilo. No requiere moléculas adicionales para la emisión de luz quimioluminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos externos a las moléculas de luminol. AMPPD es una molécula nueva que constituye un sustrato completo porque está compuesta por un grupo adamantilo como estabilizador de toda la molécula, la unión de dioxetano como fuente de energía, el éster de fosfonlo como diana de escisión para la enzima, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola molécula. La estructura de la molécula y el proceso de reacción para la generación de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisión del enlace fosfoestérico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos Origen Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es diseñar instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogéneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA heterogéneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los EIA homogéneos porque la actividad enzimática se puede modular fácilmente cambiando los factores presentes en el microambiente de la reacción Ag-Ab. Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioisótopo como señal. Actualmente, los EIA homogéneos son menos sensibles que sus equivalentes heterogéneos. Los EIA heterogéneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RÍA en muchas aplicaciones, mientras que los EIA homogéneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o dos órdenes de magnitud inferior. Los EIA homogéneos pueden necesitar reactivos inmunoquímicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rápidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. Hay varios tipos de EIA homogéneos En cada uno de estos ensayos, la interacción antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulación de la actividad enzimática refleja el grado de reacción inmunoquímica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de las características de los EIA homogéneos típicos. Los EIA homogéneos se pueden clasificar en ensayos de unión competitivos o no
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Tabla 35-7 Clasificación y características de un inmunoensayo enzimàtico homogéneo típico Nombre y tipo de ensayo Competitivo' EMIT SLFIA ARIS Inmunoensayo de canalización enzimàtica Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina CEDÍA No competitivo' Inmunoensayo de anticuerpo híbrido
s
Conjugado Antigeno con hsozima. G6PD Antigeno con sustrato Aniígeno con grupo prostético Antigeno con G6PD y hexocinasa Antigeno con avidina Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa
Tipo de modulación Inhibición alosténca Inhibición alosténca Inhibición alosténca Facilitación mediante proximidad Inhibición alostérica Inhibición aloslérica
Anticuerpos híbridos específicos para el Inhibición alostérica antígeno y el inhibidor Inmunoensayo de unión proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos por proximidad Anticuerpo con amilasa Inhibición alostérica EIHIA Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo Electo de cargas Inmunoensayo enzimàtico mejorado frente al succinil Anticuerpo con peroxidasa Estabilización AEST • La negrita indica que el nombre de la enzima está escrito y la enzima descrita en detalle en el texto G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.
competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin embargo, la unión de anticuerpos específicos para haptenos a su ligando acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibición de la actividad enzimática. Los haptenos libres presentes matos de ensayo, el antígeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estándar liberan esta inhibición compitiendo por la unión grupo prostético de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unión no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimática es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una ción de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima enzima. De entre los distintos tipos de métodos mencionados, se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activicial atención a cinco EIA homogéneos. dad enzimática (Rowley, 1975). La excepción al mecanismo de inhibición es el ensayo EMIT para la tíroxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enziInmunoensayo de multiplicación enzimática máticamente, pero pasa a una conformación activa cuando se une al anticuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe EMIT, el primer EIA homogéneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972). la enzima mediante su unión al dominio catalítico, aumentando asi la K„ "apaEl sistema de EMIT está esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del conjugación de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimática;
Forma inactiva del compi ej o enzimàtico
Enzima
Forma activa del con jugado enzima-analito Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT) La actividad de una enzima que actúa como sonda está inhibida por la unión del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno. Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimática es proporcional a la concentración de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Haz de excitación Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona con un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisión del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentración del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology ASM Press, 1992. con permiso.)
dominio catalítico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las más útiles porque tienen menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad muy inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.
Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un sustrato fluorogénico característico, el umbeliferil (i-galactósido, unido a un antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la acción de la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunología) (Fig. 35-16). La concentración del antigeno en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y también para proteínas como la IgG y la IgM. Una desventaja de este método es que no se utilizan las propiedades de amplificación de la enzima, y por tanto, el sistema de ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentración molar de analito de 10"' a 10 . ,c
Inmunoensayo de reactivación de la apoenzima El inmunoensayo de reactivación de la apoenzima (ARIS) es un ensayo homogéneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prostético, que consiste en un dinucleótido de flavm adenína (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17, el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-
piten por una cantidad limitada del anticuerpo específico. En el equilibrio, el nivel de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero no con la que está unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La enzima activa se genera en este proceso, y además, se ha incluido un mecanismo de amplificación dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rápidamente a la medida de proteínas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985). y para otros haptenos como la fenitoma o diversas hormonas.
Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática El inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). desarrollado por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un sustrato insoluole. Este ensayo es el más apropiado para la determinación de antígenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogéneo porque el complejo inmunológico del conjugado con un antígeno grande bloquea la reacción enzimática con el sustrato sólido (Fig. 35-18). La u-amilasa se ha utilizado como sonda enzimática para la detección de ferritína y AFP. La reacción inmune del analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su máximo en unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unión no competitiva requiere un tiempo de incubación menor para alcanzar un nivel de detección sensible. Empleando este método, el rango de medida de la femtina en suero es de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). También se ha aplicado el EIHIA en un formato sobre película seca (Ashihara. 1991). La película seca consiste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para la reacción inmunológica y enzimática. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa humana presente
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Forma activa Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivación apoenzimática (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucleótido de tlavin adenina (FAD). La apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD como cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentración de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimática generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.) en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la detección de la proteína C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental químico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada para su aplicación en analitos como pueden ser los marcadores tumorales.
Inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas El inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas (CEDÍA: cloned enzyme donor immunoassay) se consiguió por primera vez mediante la
aplicación de la tecnología de ADN recombinante a los inmunoensayos homogéneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de sintetizar una proteína de p-galactosidasa dentro de un polipéptido de gran tamaño (una enzima aceptora [EA]) y de un polipéptido pequeño (una enzima donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrámeros con actividad enzimática. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antígeno (analito) está unido a la ED. y el anticuerpo específico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontáneo de la enzima activa. Los antígenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de analito-ED por la unión al anticuerpo, modulando la cantidad de |í-galactosidasa activa que se forma. La señal generada por los sustratos de la enzima es
Forma activa
Forma inactiva Figura 35-18. Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo específico para un antígeno de alto peso molecular. El antígeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado con el antígeno especifico. La forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentración de antigeno es directamente proporcional a la actividad enzimática de la reacción del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press. 1992, con permiso.)
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
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Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimáticos clonados (CEDÍA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrámero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociación del aceptor enzimático con el conjugado de antigeno-donador enzimático. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)
directamente proporcional a la concentración de analito presente en el suero del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimétrico que no requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es apropiado para su uso en analizadores químicos automatizados.
Resumen Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antígeno-anticuerpo, incluyendo aquellos que implican a proteínas séricas, hormonas, drogas, otros antígenos y anticuerpos dirigidos frente a patógenos. Los EIA heterogéneos que emplean sustratos cromogénicos pueden tener una sensibilidad comparable a la de los RÍA, y han ganado en aceptación para su aplicación en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogéneos emplean sustratos sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeñas partículas como fase sólida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los RÍA. Además, la manipulación del ensayo se encuentra muy simplificada en los instrumentos totalmente automatizados. En comparación con los EIA heterogéneos, los EIA homogéneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a sensibilidad, rango de aplicación y su aplicación en analitos de gran tamaño. Además, la elevada señal de fondo (ruido) y la relativamente baja señal del ensayo son inevitables debido a la eliminación de los pasos de lavado para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogéneos son ventajosos porque están basados en un formato sencillo de ensayo y se pueden adaptar a la instrumentación automática preexistente. En este momento, los EIA heterogéneos con instrumentos totalmente automatizados, siguen siendo la mejor elección en cuanto a sensibilidad y simplicidad, y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de radioisótopos.
tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatomía patológica. Durante los últimos años, se han desarrollados muchos procedimientos de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia variedad de proteínas y polipéptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su desarrollo, los FIAs analíticos se vieron dificultados por el descenso de la sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras biológicas. Gradualmente, la sensibilidad de los métodos fluorimétricos fue mejorando, y se hizo posible la detección de analitos a concentraciones de 10 M. También se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentación y la introducción de sustratos únicos con unas reacciones inmunoquímicas y enzimáticas más óptimas. 15
La selección del fluorocromo que se va a emplear como sonda es importante. La sonda debería ser estable y debería poseer un coeficiente de extinción molar y rendimiento cuántico elevados. También debería emitir en longitudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su anticuerpo. Cuando se irradian la mayoría de los fluoróforos o moléculas fluorescentes con una longitud de onda apropiada, un electrón de la molécula sulre una transición al estado excitado. A medida que el electrón vuelve a su situación inicial, se libera energía física en forma de un fotón de menor energía (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de máxima emisión, característica de un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas típicas, el isotiocianato de fluoresceína (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns entre excitación y emisión, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio) presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogéneos y homogéneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase sólida o no sólida. Se discutirán los métodos más empleados.
INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Inmunoensayo fluorescente heterogéneo Origen y clasificación Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes como sondas inmunoquímicas para detectar antigenos en secciones
Los protocolos de FIA heterogéneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimáticos heterogéneos y los
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
radioinmunoensayos. La mayoría de los ensayos comerciales disponibles emplean un sistema con el antígeno unido a una lase sólida o un anticuerpo. El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los RIAylosEIA.
Método fluoroinmunométrico El analito reacciona en solución con un exceso de anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antígeno unido a una tase sólida. La matriz de tase sólida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentración de analito. Este método es adaptable para el ensayo de haptenos y proteínas complejas. El FIA en fase sólida se desarrolló para el análisis serológico de anticuerpos trente a la rubéola, toxoplasmosis, antígenos víricos y anticuerpos antinucleares. Los métodos de FIA heterogéneos para la determinación de antigeno se desarrollaron para proteínas séricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortisol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogéneos es la reducción significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminación física de los tactores de interferencia en el paso de separación.
Ensayo inmunofluorimétrico por partición radial En los mmunoensayos por partición radial, se emplea una cromatografía radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982). El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).
de excitación de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solución emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarización de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada que se transmite a través de la muestra puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unión al anticuerpo. Sin embargo, como se muestra en la Figura 35-20. el movimiento térmico aleatorio da lugar a que pequeñas moléculas que contienen un hapteno se muevan libremente en la solución perdiendo su orientación polarizada. Cuando el antígeno sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los 160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para aumentar la señal polarizada. Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en la polarización al mezclar antígeno y anticuerpo marcado, aunque la reacción inmune hubiese tenido lugar. Este método es el más útil para la medida de antigenos pequeños y haptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de muchas drogas y fármacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL). Desarrollaron un analizador de nueva generación, el IMx. para medir moléculas de gran tamaño molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antígenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988). Combinaron dos principios en el ensayo, la polarización de la fluorescencia y el inmunoensayo enzimálico con microparticulas (MEIA). La demanda de capacidades de acceso directo impulsó a Abbott a desarrollar un analizador de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clínicos (Smith, 1993).
Fluoroinmunoensayo en tiempo real Esta metodología hace uso de una instrumentación especial y de sondas fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con un período de tiempo de unos 100 ns o más entre la excitación y la emisión. Debido a que la mayoría de las sustancias responsables de la fluorescencia de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento especial que produce pulsos rápidos de luz que excitan al fluoróforo. La fluorescencia se mide un poco después de la excitación. Así, el efecto del fondo inespecífico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluoróforos que presentan fluorescencia retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los siguientes: 1. Derivados pirénicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns. 2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento muy largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario (Sm ') y terbio (Tb ). 3
1
3
Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.
Inmunoensayo fluorescente homogéneo Por definición, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogéneas. No requieren la separación de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA homogéneos también poseen la ventaja de ser rápidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogéneos, presentan ciertas desventajas. Los FIA homogéneos tienen una sensibilidad limitada de aproximadamente 10 molar con una instrumentación estándar. Pueden existir impurezas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros, y una instrumentación especial para alcanzar una mayor sensibilidad. 10
Ensayo de polarización de la fluorescencia Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo plano. Cuando se observa desde un ángulo recto con respecto al haz
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitación El método de transferencia de la fluorescencia de excitación (FETI) (UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluoresceína como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor. El ¡sotiocianato de fluoresceína (FITC) tiene un máximo de emisión de 525 nm y la tetraetilrodamma posee un fuerte pico de absorción a 525 nm. Asi. cuando el antigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce un apagamiento (quenching) de la lluorescencía del FITC. Este fenómeno implica una transferencia de energía de una sonda electrónicamente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre las moléculas donadora y aceptora. Para que se produzca una reducción apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este método resulta útil para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan con fluoresceína y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con fluoresceína y rodamina reduce la intensidad de señal de la fluoresceína ajustando la proporción y la cantidad de donador y aceptor para que puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energía. Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han conseguido mejoras en el método FETI usando un marcador fluorescente como el criptato trisbipiridínico de europio (III) [Eu ] como donador y un fluoróforo como la aloficocianina como aceptor (Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm transfiere energía a través de una molécula aceptora a una excitación de 620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energía mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal quelante de criptatos y lo ha aplicado a la detección de AFP y del antígeno carcinoembriónico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox. Francia) desarrolló un inmunoensayo homogéneo automatizado, KRYPTOR. para la detección de marcadores tumorales como el CEA. CA 19-9. CA 125 y AFP empleando la emisión del criptato amplificada en tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con nueve minutos de incubación 3
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Baja p o l a r i z a c i ó n Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlígeno, el conjugado marcado con una molécula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamaño molecular de más de 160 kDa. la rotación molecular del F unido se ve reducida y se mantiene la polarización 8. en la presencia de antígeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de modo que puede rotar libremente en la solución, dando lugar a una disminución de la señal polarizada.
Inmunoensayo de fluorescencia protegida En este ensayo (Nargessi. 1979). el antígeno proteico se marca con fluoresceína y a continuación se hace reaccionar con un anticuerpo específico para el antígeno. El anticuerpo especifico inhibirá estéricamente la reacción de un segundo anticuerpo específico para la fluoresceína. que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluoresceína cuando se une al fluoróforo. La habilidad del anticuerpo específico para la fluoresceína de interaccionar con la fluoresceina cuando está unida a la superficie del antigeno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentración de anticuerpos o de antígenos (analtos) en un sistema homogéneo.
INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda moléculas que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol. esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio [Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscencía. Básicamente, el método del ensayo no difiere del de los inmunoensayos heterogéneos. RÍA y FIA. La generación de luz por derivados del luminol requiere OH iHfi. como iniciador químico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados químicamente con OH H O muestran un rendimiento cuántico quimioluminiscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras moléculas quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998). Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicamente en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogéneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec;
;
tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnóstico práctico, y sus características se describen a continuación
Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores En este método (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan directamente con moléculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios muy energéticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisión de luz por parte de los esteres de acridinio es muy rápida, en unos 5 a 10 segundos después del inicio de la reacción de oxidación. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proceso, posee una relación entre el espectro de emisión y el tiempo de reacción con una pendiente mucho más acusada que la quimioluminiscencia de tipo resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es mayor que la de un RÍA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres de acridinio y la estabilidad de los conjugados con proteínas durante periodos de almacenaje se han mejorado mediante la modificación de la molécula y la química de la conjugación. Esta tecnología probablemente aporte mejoras para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas. ¿
Inmunoensayo electroquimioluminiscente El ECLIA emplea compuestos electroquímicos como sondas que generan luz electroquímicamente, asociada al ciclo reactivo de la reacción de oxidación-reducción. Con la optimización de las soluciones de reacción, la selección del método de conjugación apropiado y el desarrollo de compuestos como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnología quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991). 2-
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Proteína Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un éster de acridinio basado en la descomposición oxidativa.
2
El Ru(bpy), * tiene un sitio de reacción para la conjugación de analitos usando un reactivo de activación como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para moléculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos de oro. El Ru(bpy), - en una fase sólida y el TPA se oxidan en la superficie de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-' pierde electrones de forma espontánea. El Ru(bpy) - puede generar una emisión de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal a través de una reducción con TPA'. La eficacia de generación de la luz (rendimiento cuántico) depende de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, y por tanto, de la difusión del conjugado. Los conjugados libres pueden generar más luz que los conjugados fijados a una fase sólida como resultado de una reacción inmune. Esto permite un acceso fácil al formato de ensayo homogéneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogéneos. El protocolo de ensayo para la determinación de analitos es el siguiente: microparticulas magnéticas cubiertas de anticuerpo como fase sólida se mezclan con la muestra para permitir la reacción inmune. Después de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una solución con la fase sólida se introduce en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de detección de un ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la detección de la señal que los FIA y otros CLIA. 2
3
1
3
3
2
AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogéneos A pesar de que muchos inmunoensayos homogéneos se han desarrollado para protocolos manuales descritos en este capítulo, la mayoría de ellos no han sido automatizados todavía. Para el método EMIT, se pueden adaptar analizadores químicos genéricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos están disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogéneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre sí. El sistema CIS Bio KRYPTOR se ha desarrollado con características especiales, incluyendo el uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un método de dos longitudes de onda para la corrección interna del estándar de intensidad de fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del límite de detección.
Sistemas de inmunoensayo heterogéneos Hasta el principio de los años 80, la mayoría de los inmunoensayos heterogéneos se hacian de forma manual. Entonces Boehñnger-Mannheim (que se fusionó con Roche Diagnostics en 1998) desarrolló un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos que empleaban la peroxídasa de rábano como enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compañías trataron de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimático totalmente automatizados, que
eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antígenos asociados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento como la calcitonina, existen en concentraciones muy bajas en el suero, necesitando así un sistema de detección muy sensible para poder medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los muchos métodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo más sensibles capaces de detectar analitos presentes en concentraciones muy bajas. Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora son también capaces de utilizar inmunoensayos enzimáticos fluorescentes. Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basándose en la generación y detección de las señales y el tipo de fase sólida. Con respecto a la detección de la señal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japón) y el AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un método de fluorescencia del inmunoensayo enzimático que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayos enzimáticos de quimioluminiscencia. Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japón). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur. Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994: Babson, 1991). El éster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics. Indianapolís. IN), se usa el Rufbpy)/' como sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).
Secuencia práctica del inmunoensayo en el sistema analítico La demanda de mercado esperaba una instrumentación capaz de realizar un gran número de ensayos con capacidad de acceso directo. Para cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el tedio que implican los inmunoensayos heterogéneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicación en un sistema de ensayo totalmente automatizado, se diseñaron cartuchos individuales de reactivos previamente empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reacción. Un sistema genérico para los inmunoensayos con sondas heterogéneas está esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reacción se introducen de forma automática en el instrumento. Las muestras se transportan a la posición apropiada para la dispensación. El ensayo está diseñado para emplear bandejas de reacción o rotores que automatizan los pasos de mezclado y separación, que dependen del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreacción, y la reacción de generación de la señal. Todos los pasos de la reacción tienen lugar de forma secuencial en la línea de reacción y las señales generadas se miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los siguientes 20 a 40 minutos y se envían automáticamente a través de la red al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de acceso directo.
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo heterogéneo Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separación BF, el arrastre, flujo de los desechos y demás. Asi. debemos prestar atención a lo bien que funciona el instrumento después de su puesta en marcha.
Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de inmunoensayo totalmente automatizado en un laboratorio clinico de automatización.
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Cubeta de reacción En un sistema de inmunoensayo. es muy importante diseñar las características de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducíbles. Los fabricantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rápido de los reactivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso que contiene los reactivos y la unidad de reacción en el sistema Lumipulse. El sistema Immulite emplea una unidad de reacción para la separación B.'F. El
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 35-8 Nueva generación de sistemas de inmunoensayo heterogéneos AIA-21 (TOSOH)
ACS:CENTAUR ARCHITECT (ABBOTT) (BAYER DIAGNOSTIC)
Sustancia marcada Sustrato enzimático Detector de la señal Formato del ensayo Pretratamiento Flujo de la reacción Duración del ciclo (seg) Duración de la reacción (min) Temperatura de la reacción Numero máximo de analitos Capacidad (ensayos/hora) Fase sóhda Tiempo del primer resultado (min) Separación B/F Método de muestreo
Liotilizado y empaquetado en porciones Recipiente de reacción Inmunoensayo enzimático fluorescente Fosfatasa alcalina 4-metilumbeliter¡l tosíalo Fluorescencia S-1. S-2, competitivo Si Rotatoria 30 10 o 40 min 37°C 20 120 Partícula magnética (bcad> 50 Campo magnético Pipeteando la sonda
Paquete de reactivos (en solución) Cubeta desechable Inmunoensayo quimioluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo Sí Rotalona 15 7 5-36 37"C 30 240 Partícula magnética 8-40 Campo magnético Chip desechable
Cubeta desechable Inmunoensayo quimoluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo Sí Rotalona 18 29 37"C 25 200 Partícula magnética 30? Campo magnético Sonda fija
Aulodilución de la muestra
Sí
Si
Si
Paquele de reactivos Cubeta de reacción Principio de la reacción
AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reacción única que consiste en pocilios para el reactivo, la incubación y para la muestra dentro de una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una unidad rnatricial. Esta última puede emplearse para captar la fase sólida de látex, seguida de una separación B'F y de una segunda reacción inmune de anticuerpo marcado con la fase sólida.
Tipo de toma de muestra y dispensación de fluido En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminación entrecruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en varias alícuotas pequeñas, la contaminación entrecruzada sigue ocurriendo. Así, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contaminación y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija. También deben tomarse en consideración las consecuencias medioambientales de los chips desechables.
Arrastre El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentración extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnósticos clínicos erróneos. Un tubo de plástico desechable para la muestra es la forma más sencilla de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias ventajas económicas como se ha mencionado antes. Asi, la mayoría de las técnicas que conciernen a la ingeniería de las muestras se han concentrado en minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras todavía crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un antígeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para comprobar dicho resultado, mediante un reanálisis automático de los valores positivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.
Separación B/F y sistemas de lavado En un inmunoensayo heterogéneo, el conjugado unido debe separarse de la sonda libre. Esta separación B'F depende de las características de la
Solución en una botella
ADVIA IMS (BAYER DIAGNOSTICS) Particulas secas en la cubeta de reacción Recipiente de reacción Inmunoensayo quimioluminiscente Fosfatasa alcalina? Foslato de dioxelano? Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo ? Rotatoria 36 20 37"C 36 100 Partícula magnética ?
Campo magnético Pipeteando la sonda (técnica del aceite) Si
fase sólida. Los sistemas IMx y AxSYM emplean micropartículas de látex como fase sólida y emplean una membrana porosa para atrapar el látex para la separación de particulas de la fase sólida de la líquida. Diagnostics Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los sistemas de separación B/F, en la que la solución de reacción sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida permanece en un lecho de fase sólida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos, es que evitan la contaminación entrecruzada y el arrastre de una mezcla de reacción a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado. Todos los demás sistemas emplean particulas magnéticas (magnette partióles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separación rápida y fácil, mediante la aplicación de un campo magnético.
Nuevos sistemas para la próxima generación (sistemas modulares) La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comercial que se han introducido en los últimos años. Muestra las especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubación y de reacción, se puede obtener un resultado rápido en unos 10 a 25 minutos. Así, es posible una máquina de alto rendimiento que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Además, varios fabricantes han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos sistemas analíticos que se necesitan en un laboratorio clínico. Muchos laboratorios clínicos han introducido un sistema de transporte de muestras que se conecta con distintos instrumentos analíticos controlados de forma independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a este sistema porque la velocidad del instrumento o la duración de su ciclo no se puede armonizar fácilmente con el resto de software y hardware. Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es un ejemplo de una máquina de nuevo concepto, en el que un sistema de ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo conectados a un analizador químico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY), que puede realizar química clínica e inmunoensayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todavía en desarrollo, que harán posible la simplificación del laboratorio clínico a un coste final inferior.
CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE Origen Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej., hCG para el diagnóstico del embarazo) ha simplificado el formato de los inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rápido y reproducible. Teniendo en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto ha dado como resultado una primera generación de formato de ensayo de inmunoensayo enzimático de flujo.
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltración) La Figura 35-23 ilustra esquemáticamente un instrumento típico de inmunoensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo y el procedimiento se describen a continuación. Varias gotas de la muestra de orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y entonces se añade el tampón de lavado por goteo y a continuación una solución con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.
Tiras reactivas También se ha desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el coste de los materiales en comparación con el formato del ensayo de flujo En este formato, la tira del ensayo contiene un área con un punteado de anticuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuación se introduce la tira en una solución de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un revelador de color si es necesario.
Instrumentos inmunocromatográficos Con el fin de eliminar pasos de adición de reactivos en estos dos formatos, se han conseguido importantes mejoras empleando técnicas inmunocromatográficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rápido.
Membrana de nylon
c
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La inmunocromatografía consiste en la separación B. F y generación de la señal simultáneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso, como una membrana de nitrocelulosa o una lámina de libra de vidrio. A través de la acción capilar de la membrana, el analito de la muestra puede migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga de muestra, la de mareaje y la de detección se encuentran entre los dos extremos. El método inmunocromatográfico se clasifica en varios formatos. La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatográficos típicos El extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y está conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado, debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de detección. El extremo distal de la membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o látex coloreado, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este complejo migra a la zona de detección. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de detección puede captar el complejo y formar una linea roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase móvil en una migración es la propia muestra. Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentración de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resultados a simple vista. En este formato, la señal que debe detectarse se produce en la zona de detección con una zona donde se concentran partículas coloreadas. Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automática, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma esquemática en la Figura 35-25. En este formato, la posición de cada una de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocromalografías mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una solución de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de lavado espontáneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica sobre un parche que está en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se añaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con el conjugado después de su reconstitución. La mezcla de reacción que contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que contiene la solución de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de detección. En este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarán hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo inmovilizado captura el complejo en la zona de detección para formar una linea coloreada. Este método presenta algunas ventajas que difieren de otros instrumentos inmunocromatográficos que se revelan con la muestra. En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipémico puede interferir en la evaluación del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este instrumento ha sido útil en la detección de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayoría de los componentes, como la membrana, el parche absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un molde de plástico.
Resumen Los instrumentos de inmunoensayo rápidos y sencillos se resumen en la Tabla 35-9. Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo, Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Sección transversal de un Hybritech ICÓN de impregnación o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captación se encuentran inmovilizados en el centro de una membrana de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayoría de los instrumentos inmunocromatográficos te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o látex coloreado. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migración del inmunocado y el tampón de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial. complejo, junto con la migración de la solución de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimático en dos pasos.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatográfico típico mediante adición de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona como porción de carga de la muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antígeno marcado con látex coloreado o coloides de oro. El analíto de la muestra forma un complejo con el conjugado y migra a la zona de detección, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.
chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, 25 ul. La corriente actual de ensayos rápidos para POCT se orienta hacia ensa-
yos que emplean instrumentos de inmunocromatografía porque una persona con práctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).
Figura 35-25. Instrumento inmunocromatográfico que emplea EIA. Se aplica un método de amplificación sensible a la inmunocromatografía empleando una enzima. La muestra se añade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este método, se emplea una solución de revelado como fase móvil, que puede servir como tampón de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plástico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.
Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rápidas para los instrumentos de inmunoensayo Principio del ensayo
Nombre del kit ... . (analito)
Formato inmunocromatográfico Un paso Helisal One Step (Helicobacter pylori) (todo en uno) Biocard Troponin I test Clearview hCG II QuickVue One-Step hCG CARD-I-KIT Troponin I TROPT Troponin T Determine HBsAg BioSign Tumor
_. Tipo de muestra
Sangre
Volumen de muestra (ul) 5C 150-200
Fase móvil
Tiempo de reacción (min)
Sensiblilidad
Alojamiento
Plasma
5
Igual que ELISA
MP"'
15 5 3
0.1 ng/ml 25 mlU/ml 25 mlU/ml
MP MP MP
Cortecs Diagnostics Ltd. ANI Biotech oy Unipath Limited QU1DEL AboaTech Ltd.
Suero Orina Orina
3 gotas (75?)
Suero Orina Orina
Suero
4 gotas (100?)
Suero
5-10
0,1 ng/ml
MP
?
Sangre Sangre/suero Sangre/suero
150 50 50
Plasma Plasma/suero Revelador
5-15 15 5-10
0.1 ng/ml 1 ng/ml?
MP TS' '••IF
HBs Insta test
Sangre/suero
200
Plasma/suero
15-20
0.5 ng/ml
MF
EASY-SURE HBsAg
Suero
Suero
5-20
1 ng/ml
TC'
Revelador
-15
>4 ng/ml
MP
?
MP
2 ng/ml
ccMP MP CC
100-150
Fabricante
Roche Diagnostics' Abbott Princeton BioMeditech Corp. Morningstar Diagnostics West Wind Plus, Inc.
?
1
Toot
Dos pasos
PSA RapidScreen Test
Sangre
1 gota colgante
Triage Cardiac (Myoglobin CK-MB Troponin-I) AMRAD ICT Hepatitis B Espline HBs-Ag TestPack PLUS hcG EASY-SURE HIV 1/2
Sangre
?
Plasma
Sangre/suero
?
Sangre/suero
Plasma/suero Suero/orina Plasma/suero
25 25 40
Revelador Suero/orina Revelador
15 5 10
0.5 ng/ml 50 mlU/ml —
Orina
3
20 mlU/ml
22
Plasma/suero + solución del conjugado
15
3,1 ng/ml
rs
Distribution Dainabot
50
Tampón, etc.
2
10 ug/'ml
TC
Hybritech, Inc. Nyco Diagnostic
1 gota
Tampón, etc.
10
1
MP
Morningstar Diagnostic
?
Tampón. etc.
15
2 ng/ml
MP
Orgenics
Método inmunocromatográfico de tiras reactivas AimStick PBD Orina
Dainascreen HBsAg
Plasma/suero
ICON-II hCG NycoCard CRP
Suero Plasma de sangre completa Suero/plasma
Volumen de la inmersión
Formato de flujo
Chagas dobule-spot test Combinación de inmunocromatografia y flujo DoubleCheck HBsAg
Suero/plasma
15
5-15
Craig Medical Distribution. Inc. Biosite Diagnosticst
j
Amrad Corporation Ltd. Fujirebio Inc. Abbott West Wind Plus. Inc.
Craig Medical
MP = représense moldes de plástico (molóing plástic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reacción ((esí cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case) •Datos de Towt (1995) t Datos de Bruni (1999)
j
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SECCIÔN V
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INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA
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CAPÍTULO 35
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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
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C A P Í T U L O
36
Examen de laboratorio del sistema inmune celular • Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP) • Susana Cunningham-Rundles, Ph.D. • Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI) CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIÓN
851
Decisión de analizar Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
FUNCIÓN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS
859
METODOLOGÍA: CITOMETRIA DE FLUJO Y DE IMAGEN
859
Hardware y otras herramientas
Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia RECEPCIÓN Y ANÁLISIS
Efecto de la edad en la respuesta inmune
865
Inmunofenotipificación: aplicación a las muestras
Malnutrición y respuesta inmune
de rutina y leucémicas
Cáncer APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR 853 Fases de estudio: fase de exploración Fases de estudio: fase de confirmación Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO
Análisis del ADN Citometría de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR
874
BIBLIOGRAFÍA
874
IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR
855
Inmunología celular Metodología: determinación de la activación y la proliferación linfocítica en la evaluación de la inmunodeficiencia celular El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a la detección de determinadas anomalías en pacientes con sospecha de déficit inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciación y función de las células inmunes normales, de la deleción experimental de genes, y de análisis detallados de síndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las bases funcionales de la desregulación inmune en pacientes con mutaciones genéticas primarias (congénitas) del sistema inmune o de infecciones congénitas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no se pueden distinguir por la presentación clínica de las infecciones: la información genética está convirtiéndose en un importante componente para las pruebas e interpretación diagnóstica. La misión de la inmunología clínica de laboratorio es transformar las nuevas líneas de investigación en pruebas altamente estandarizadas y clínicamente relevantes para cada paciente en concreto. Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado principalmente en tres áreas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el impacto de los defectos congénitos inmunes sobre la defensa del huésped; 2) enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunológicas adquiridas, en las cuales la infección daña directamente el sistema inmune, como en la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además, los defectos inmunes celulares de enfermedades con características de mala función inmunológica, como las infecciones crónicas, el cáncer, la malnutrición o las lesiones traumáticas, proporcionan información esencial en la defensa del huésped mediada por la inmunidad.
El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una infección natural o por una inmunización. Debido a que la inmunología, como actualmente se utiliza en un laboratorio clínico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin. 1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la inmunidad humoral, la función inmune celular es fundamentalmente compleja y difícil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral básicas miden la producción de anticuerpos específicos elaborados en cierto momento como respuesta a una infección por un virus o microbio específico; en contraste, los análisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales. En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el síndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tourame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia de la evaluación estandarizada en el laboratorio clínico de las deficiencias inmunes. El descubrimiento y el estudio de niños con trastornos relativamente raros pero muy importantes, como el déficit de adhesión leucocitario (LAD) (Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodológicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cómo se presentan estos defectos de adhesión (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificación de la enfermedad granulomatosa crónica (CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades heterogéneas con alteración en la actividad de la cadena respiratoria fagoci-
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han sido útiles en la identificación del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997). Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congénitos pueden ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999) o, en el futuro, a la terapia génica (Malech, 1999). Como la mayoría de los linfocitos en sangre periférica son células en reposo, la reacción inmune celular debe reproducirse o generarse en el sistema de análisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, mantener la reacción proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi como de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunología clínica cambió radicalmente durante los años 80, debido al impacto de los importantes esfuerzos de investigación, incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales para identificar células inmunes, el descubrimiento de la regulación de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda necesidad de comprender y controlar la aparición epidémica del VIH. La aparición del VIH ocurrió casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las células T CD4+. Los primeros análisis de la inmunodeficiencía funcional celular en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados inicialmente en el análisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Siegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo se presentan las pruebas inmunológicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. La evaluación de la inmunidad celular está cambiando desde los análisis simples y puntos finales fijos hacia un análisis integrado de la función celular en varios niveles que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinámico.
CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIÓN Decisión de analizar Aunque en teoría la interpretación de las pruebas inmunológicas comprende desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en términos prácticos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presentación clínica. Sin embargo, como las pruebas inmunológicas pueden ser caras y lentas, la elección de la prueba a menudo depende de la sospecha clínica. Como hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que sean total y específicamente diagnósticas, la interpretación debería realizarse con precaución. La responsabilidad del laboratorio de inmunología clínica es establecer un número suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para conocer la naturaleza y la extensión de la alteración inmune y considerar un rango de posibles causas cuando se realice su interpretación. Normalmente, la decisión de analizar la respuesta inmune en un paciente surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la inexplicable susceptibilidad a la infección, el aumento de la gravedad de infecciones habituales, o la reacción inusual a la inmunización son motivos para realizar una valoración inmune. Las infecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden al tratamiento, y ciertos estados alérgicos o atópicos también pueden requerir un análisis inmunológico. En estos últimos años, la posibilidad de la infección por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria como principal diagnóstico de presunción. Sin embargo, como se tratará pos-
Tabla 36-1 Presentación de una posible inmunodeficiencia Infecciones bacterianas frecuentes Reacción sistèmica a virus inusualmente grave Desarrollo de la infección debida a un organismo inusual como hongos o protozoos Reacción sistèmica después de la vacunación con virus vivos Historia familiar de infecciones recurrentes Exposición al virus de la inmunodeficiencia humana
851
teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnóstico de una enfermedad inmune primaria. Los cambios inmunológicos pueden acompañar a muchas entidades clínicas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, de enfermedades hematológicas como la anemia de Fanconi, la hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos como la histiocitosis, y las hemoglobinopatías como la anemia de células falciformes. la talasemia, además de un amplio grupo de anomalías cromosómicas como el síndrome de DiGeorge. el síndrome de Down, el síndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermólisis ampollosa, y el síndrome de Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumáticas, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple y la miastenia gravis pueden asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan más adelante en los Capítulos 43 y 45.
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria Las características principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficiencia supuestamente adquirida por infección con VIH. debe distinguirse de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clínicas descritas. Incluso a menudo las lesiones traumáticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran pérdida de sangre o un daño visceral producen un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Además, otras situaciones como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipicamente idénticos a la inmunodeficiencia primaria. Mientras que la infección por el VIH puede diagnosticarse rápidamente mediante una determinación directa, el laboratorio de inmunología clínica se emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el análisis del VIH. Esto se basa en la observación de que entre los adultos VIH-positivos. casi siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, como resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado a considerarse como un marcador de la infección por el VIH. Sin embargo, hay un cierto número de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un número de células CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. Éstas incluyen, aunque no sólo están limitadas a estos, al síndrome de DiGeorge, el timoma benigno, el comienzo de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutrición calórico-proteica y las neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversión del cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un número bajo de CD4. El lactante del caso n." 3 presentaba múltiples abscesos sépticos del tracto gastrointestinal (Gl) y se creía que tenía un trastorno de la inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, esta evaluación se hizo después de un episodio de casi ahogamiento en una bañera en la que se encontraron indicios de un destapacaños. Las lesiones del tracto Gl por cáusticos produjeron lesiones múltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos. El desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos, pero no el daño del tracto Gl. se resolvió rápidamente. Esle caso también muestra la necesidad de llevar a cabo una prueba de confirmación tan pronto como sea posible cuando el paciente esté estable. Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el contexto de una infección o de cambios hematológicos. Los trastornos por inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Capítulo 42. La evaluación de laboratorio a menudo requiere de una valoración por etapas, no solo para minimizar la extracción de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las pruebas disponibles con vistas a un diagnóstico diferencial. Puede parecer que determinados diagnósticos de presunción se sospechan con demasiada frecuencia, por ejemplo, el síndrome de Wiskott-Aldrich, aunque éste necesita descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un síndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si sólo se valora la respuesta a mitógenos en lugar de la respuesta frente a antígenos. y con el tiempo el defecto inmune puede llegar a ser más importante, de forma que sean necesarias pruebas de seguimiento.
852
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH Conjunto de linfocitos Caso estudio 1. Inicial 2. Inicial 3. Inicial 1 semana 4. Inicial 3 anos 5. Inicial a los 5 meses 6. Inicial al año 7. Inicial 8. Inicial 9. Inicial 10. Inicial al día
Edad
%CD3
%CD4
%CD8
56 73 29 43 89 93 83 76 36 51 0 64 65
26 18 15 25 62 36 51 18 25 42 0 20 26 18 45
29
3 años 6 años 3 meses
—
6 años 3 meses 4 meses 1 semana 12 años 8 años 50 años
—
72
L'-
IO 15 32 57 31 48 7 12 24 33 47 51 35
ABS # 209 330 762 2.846 B74 272 2.734 96 304 2.794 0 No hay dalos No hay datos No hay datos No hay datos
Diagnóstico Deficiencia idiopatica de CD4 Disqueratosis Inmunodeficiencia congènita R/0 Lesión caustica gastrointestinal Aplasia de glóbulos rojos Síndrome de Noonan Sindrome de Williams Sindrome de DiGeorge Talasemia Neutropenia inmune Melanoma uveal Posthipertermia
ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.
Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clínico es cómo evaluar el significado clínico potencial de la respuesta inmune alterada in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clínico. Sin embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificación de los pacientes según el nivel y extensión del defecto. Por ejemplo, los estudios del síndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clásicamente una tríada de aplasia tímica y paratiroidea y defectos conotruncales. mostraban que existían diferencias importantes en la gravedad de las infecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reducción del número de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitógenos originada por la hipoplasia tímica. Inicialmente. se observó un alto grado de muertes asociadas a este síndrome, pero con las nuevas técnicas quirúrgicas y métodos anestésicos, se ha visto que un número significativo de niños parecen desarrollarse normalmente sin infecciones graves (Bastían, 1989). Sin embargo, algunos niños desarrollaron infecciones que no respondían al tratamiento y, finalmente, mortales y no hubo ningún modo de predecir la evolución. Recientemente, ha sido posible utilizar análisis del fenotipo linfocítico más exacto y analizar los niveles de los defectos inmunes en el síndrome de DiGeorge. Utilizando análisis longitudinales durante muchos meses y una aproximación paramétrica múltiple, parece que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente número de células T CD4, por la inversión del cociente CD4/CD8, y por la producción disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La investigación del significado de las deleciones monosómicas del cromosoma 22q11.2, que son la principal causa del síndrome de DiGeorge, del síndrome velocardiofacial y del síndrome de la anomalía conotruncal de la cara, ilustran la importancia de la nueva información genética. Sólo el síndrome de DiGeorge fue descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros síndromes clínicos asociados con la microdeleción del cromosoma 22q 11.2 han mostrado que en más del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune (Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con ninguna caracteristica fenotípica particular. La función de las células T puede ser tan importante o más importante en la infección por el VIH que la pérdida de las células CD4^ o la tasa de pérdida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociación entre el délicit inmune detectado ex vivo y la función inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992). Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortostática alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del síndrome de fatiga crónica o que un aumento de las concentraciones plasmáticas del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss. 1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.
Efecto de la edad en la respuesta inmune Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan. 1994). Aunque hay una considerable variación en esto y muchas veces es una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clínico proporcione resultados considerando distintos grupos de edad. El estudio de pacientes pediátricos presenta hallazgos particulares para el diagnóstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema inmune en el niño no está completo al nacer y, además, los niños no han estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposición congénita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalías inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune pediátrica incluyen una marcada linfocitosis al nacimiento, una elevación de las células B, un aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas células asesinas naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993). Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). También, hay una importante diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La respuesta neonatal de los niños prematuros a ciertos activadores microbianos puede ser más potente que la de los adultos o que la de los niños nacidos a término debido a los rápidos cambios en la regulación inmune (Veber, 1991: Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la programación perinatal (Prescott, 1998).
Malnutrición y respuesta inmune Aunque generalmente se cree que la malnutrición es relativamente rara en los países desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutrición es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad (Pennington. 1996). La malnutrición se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el déficit de zinc puede presentarse como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el déficit primario de la captación de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis enteropática o con un déficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963). Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorción asociada que alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cunningham-Rundles, 1981). Esto está asociado con el hecho de que el zinc es necesario para la actividad biológica de la hormona tímica, necesaria en la producción de las células T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para la activación de las células T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una
CAPÍTULO 36
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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos específicos en la respuesta inmune. La malnutrición puede ser un factor que aumente la complejidad de muchos casos clínicos. La interacción de las infecciones con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la supresión transitoria de la respuesta inmune. El estrés físico puede tener efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones en el contexto de la inmunosupresión (Cunningham-Rundles, 1999). Ésle es un proceso bidireccional. La alteración del crecimienlo puede ser el primer signo de la infección por el VIH en un niño VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como por otras razones, la evaluación inmune debe ser un proceso continuo en el contexto del tratamiento o de otros análisis.
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un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferación reducida capaz de ayudar a la célula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto los linfocitos T de la lámina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma diferente a las células T de sangre periférica en el uso de la vía de transducción del CD2 en lugar de la vía del receptor de células T/CD3. Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitualmente en los laboratorios de inmunología clínica y. con raras excepciones, las células inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre periférica. Por esta razón, el uso de pruebas cutáneas in vivo y el examen de la respuesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es útil para el inmunólogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluación. En cualquier caso, la utilización de aproximaciones sucesivas y la repetición de análisis son muy informativas.
Cáncer La inmunodeficiencia primaria está asociada con el aumento de la incidencia de cáncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez está más claro que hay tumores que se desarrollan asociados a la infección por VIH (Davis. 1984; Chintu, 1995; Krown. 1996). En el paciente con cáncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reducción en la respuesta ante un estímulo antigéníco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metástasis o estar causada por los efectos secundarios del tratamiento. La reducción en la respuesta inmune frente a los activadores no específicos estudiados ex vivo en ensayos de proliferación se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un significado pronóstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se observa en los pacientes con cáncer no tratado un cociente CD4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse inmunológicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta no protectora (Lee. 1997). El desarrollo de nuevos métodos ¡nmunoterapeúticos está aumentando, sugiriendo que la respuesta a antígenos específicos del tumor será más utilizada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune también pueden utilizarse en el seguimiento y evaluación de la respuesta a los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cáncer (Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producirá una supresión transitoria de la respuesta inmune que se resolverá en un corto periodo de tiempo, mientras que la radiación puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La evaluación de la respuesta inmune en el paciente con cáncer requiere de la utilización de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas y activadores, que refleje los procesos relevantes, así como especificidad en la respuesta.
APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR Los estudios en humanos se han basado en la observación de las células inmunes de sangre periférica ya que el compartimento periférico es más accesible y más fácil de medir, pero esta aproximación puede no reflejar los sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre las diferencias entre la respuesta inmune sistémica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del huésped in vivo (Xu-Amano, 1993). La función de la inmunidad sistémica celular parece estar regulada a través de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interferón-y (IFN-y). se favorece la defensa inmune celular del huésped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991). En contraste con la inmunidad sistémica, la actividad primaria de la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de microorganismos, toxinas y antigenos a través de la secreción y el transporte de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por
Fases de estudio: fase de exploración La evaluación de la función inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una exploración de las posibles áreas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3. Estos estudios de exploración deben acompañarse de un análisis de citometria de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en niños, debe incluir del uso de marcadores de células B para evaluar posibles cambios en estas, que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja población de células T. También se recomienda el empleo de un marcador de células NK en niños de más de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta población pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983). Como existe frecuentemente una limitación en la sangre que va a ser extraída para estos estudios es esencial que la primera evaluación incluya paralelamente un recuento sanguíneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial. La etapa de exploración incluirá un panel de pruebas para evaluar la respuesta mitogénica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores continúa siendo una de las herramientas más sensibles para evaluar la función normal, y cuando esta incluye un activador apropiado de células T y B puede ser utilizado específicamente para definir las áreas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre, se recomienda la utilización de distintas concenlraciones de cada activador. Además, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El uso de tubos que contienen heparina de litio o ácido etilenediamintetraacético (EDTA) no se recomienda para ningún estudio de funcionalidad de linfocitos. Deben utilizarse tubos con heparina sódica (sin conservante) o con citrato dextrosa (ACD). La sangre extraída en tubos heparinizados también puede emplearse para el análisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la preparación de la muestra y su análisis es critico (Nicholson, 1993). La pregunta sobre cuándo debe extraerse la sangre es importante. En general, la mayoría de los datos se han obtenido con sangre extraída por la mañana y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no puede hacerse, es muy útil continuar manteniendo la uniformidad del tiempo de extracción para cada paciente individual. Este hecho es más crítico cuando se mide el número absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzación de la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clínico (Malone. 1990). Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las células Tabla 36-3 Exploración básica en los estudios inmunológicos Recuento sanguíneo completo y análisis dilerencial Análisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de células B y T) por citometria de flujo Activación de linfocitos in vitro frente a mitógenos y activadores microbianos Inmunoglobulinas séricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas si hay evidencia de infecciones clínicas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogéneos, por tanto, se necesitan estudios adicionales
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se envía por avión u otro transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir un control paralelo de la muestra extraída de una persona sana que sirva como un estándar interno en el proceso de evaluación.
Fases de estudio: fase de confirmación Aspectos
generales
Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas sobre aspectos específicos de las primeras series. Como poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango anormal). Pueden añadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de partida de estudios analíticos. Es importante organizar apropiadamente la extracción de sangre cuando el paciente se encuentre en el estado más estable clínicamente. Se recomienda realizar por duplicado los estudios básales antes de llevar a cabo una intervención, o incluso en la fase de confirmación. En algunos casos de posible inmunodeficiencia puede haber un secuestro de células inmunes, que se refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento periférico, como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmación también debe incluir una cuidadosa reevaluación de la historia médica de los pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta etapa de confirmación se muestran en la tabla 36-4.
Persistencia
timica
El roentgenograma de la silueta tírmca puede no ser suficiente, ya que el timo tiende a la depleción por estrés (Haynes, 1998). Aunque es difícil determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamaño real del timo evaluado por resonancia magnética nuclear (MRI) se correlaciona con el número de linfocitos CD4+ en la infección por VIH (Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un órgano compuesto por tejido linfoide central y periférico. Haynes (1998) ha postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las atocinas o de otros tactores producidos por las células inmunes periféricas del espacio tímico penvascular. Como se describe en la sección específica sobre la evaluación por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresión de antígenos de maduración normales adquiridos durante el desarrollo tímico será suficiente para identificar la presencia de un timo funcionante.
Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutánea Falta de historia antigénica apropiada cuando el panel no incluye activadores ubicuos Inmunodeficiencia primaria inlecciones víricas Malnutrición Enfermedades granulomatosas Neoplasias
».
neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlación global entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia (Mass. 1998) pero no ha sido útil como herramienta analítica para determinar la razón de la falta de respuesta. La prueba cutánea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutánea con derivados proteicos purificados (PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es una excepción, aunque los individuos anérgicos no responden y. además, hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Las causas de falta de respuesta en la prueba cutánea se muestran en la Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutánea con inmunización de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se llegó a utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigüedad del mecanismo de respuesta subyacente. La introducción del prueba de la ventana cutánea" proporciona una medida más cuantitativa e informativa de la respuesta inmune in vivo debido a que la reacción puede emplearse para determinar una respuesta tumoral autóloga (Black. 1998). Sin embargo, aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutáneas como demostración convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro pueden tener un significado pronóstico in vivo, no debe ser infravalorada.
Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad Los estudios analíticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6. Aunque la descripción completa de estos abordajes no se encuentra entre los objetivos de este análisis, en general estos estudios son válidos para definir el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen método es evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la vista de las áreas de función general disminuida y entonces poner en marcha los estudios de la función efectora.
Pruebas cutáneas En este momento puede ser importante la utilización de un panel de pruebas cutáneas. Este abordaje en la evaluación de la inmunidad celular sirvió en un principio como punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cutá-
Tabla 36-4 Estudios analíticos de confirmación y de primera etapa Roentgenograma de la sombra timica Prueba cutánea Actividad de las células asesinas naturales (si el niño tiene 6 meses 0 más) Producción de citocinas en respuesta a la activación con T-coadyuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interferón-y, IL-4 y otros) Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el paciente como respondedor Respuesta a la inmunización Prueba para la presencia de anticuerpos específicos según la edad Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas (sustancias de grupo sanguíneo anti-A y anti-B) si el paciente es del grupo sanguíneo A, B o O Prueba para el déficit de actividad de las enzimas adenosín deaminasa y purma nucleótico fosforilasa
Función inmune diferencial Hay dos tipos principales de células implicados en la inmunidad (Haynes, 1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (células T) y 2) linfocitos B (células B). Los linfocitos T se definen por la expresión del receptor del linfocito T el cual se une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de células T que es esencial para su activación
Tabla 36-6 Estudios analíticos e inmunorreguladores Desarrollo de los antígenos de la activación durante la respuesta a la estimulación, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina, regulación del MHC de clase II sobre las células T, receptores solubles y otros Respuesta do activación precoz (p. ej, canales de calcio) Inmunorregulación Respuesta a IL-1, IL-2, interferones Desarrollo de funciones efectoras Síntesis de inmunoglobulinas in vitro Actividad citotoxica de las células T Análisis de células supresoras/factores de supresión Activación de genes, análisis del ciclo celular Respuesta a la inmunización: inmunización de novo
CAPÍTULO 36
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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Tabla 36-7 Fenotipificación inmunológica de las subpoblaciones de linlocilos Panel básico de sangre periférica (sangre, glóbulos rojos Usados*) CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isofipo de ratón CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3-/CD56 y 16 Células mononucleares aisladas, panel de activación' CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isotipo de ratón CD3/CD25 (IL-2R) CD3/HLA-DR ' Si el CD3 está bajo, entonces repetir y añadir CD2. Posteriormente, pueden añadirse monoclonales trente al receptor de las células T acoplado con CD3. También pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto también puede realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como iniciador ' Después de 2 días de cultivo, extraer las células y lavarlas antes de teñirlas con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las células control que no contienen activador, después analizar las células activadas. Los activadores pueden incluir mitógenos. IL-2 y/o mleilerón-y.
Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un amplio grupo de antígenos, requieren la maduración tímica para su función normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD20) y tras una activación adecuada se diferencian en células plasmáticas que secretan anticuerpos específicos, mediando, de este modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometerá la función de los linfocitos T y afectará a la activación de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la médula ósea puede afectar tanto a la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con más detalle posteriormente en la Proliferación linfocítica como método In Vitro de evaluación de la inmunidad celular. La distinción entre respuesta inmune específica y no especifica es una necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser capaz de distinguir entre lo propio y lo extraño. En general, esto se logra medíanle la incorporación del sistema de autoantigenos del complejo molecular MHC en la fase de reconocimiento antigénico. El antigeno debe ser procesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al desarrollo de la memoria inmune. La función del procesamiento antigénico se lleva a cabo por las células presentadoras de antígeno (APCs), siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activación y la proliferación de los linfocitos. y puede incluir la producción de células electoras y la activación de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como "memoria" y se desencadena típicamente después de inmunizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresión del antígeno MHC de clase II puede detectarse en los linfocitos por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcador de déficit de MHC de clase II (Tabla 36-7). Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repetidos. Esta inmunidad está mediada por las células fagociticas. algunas de las cuales, como el monocito. también pueden procesar y presentar antígenos, y las células NK. A diferencia de las células fagociticas. las células NK no están desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduración de este sistema, está también disminuida al nacer. Esta tercera rama está representada por las células NK. que no son ni célula B ni exactamente células T por no tener ni inmunoglobulinas de superficie ni el receptor de células T. Estas células, antes llamadas células "K", células "nulas" o "tercera población", ha eludido la clasificación convencional por análisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador más definitivo de la célula NK (Trinchieri. 1998). Las células NK han sido más
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conocidas como células que pueden matar inespecíficamente (naturalmente) a las células infectadas por virus y bacterias y que evitan las metástasis de las células tumorales. Sin embargo, las células NK también regulan funciones de las células T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las células NK son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas, particularmente IFN-y. Las células NK son importantes para la activación de las células fagociticas independientes de antígeno durante las fases precoces de la infección y para favorecer el desarrollo de las células Th1 específicas de antígeno. El sistema NK está por naturaleza activado y no tiene que ser inducido por antígenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anticuerpos específicos, estas células pueden matar específicamente. La evaluación funcional de esta población celular puede llevarse a cabo de forma adecuada utilizando un análisis rápido de liberación de cromo ¡conocido como un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante citometría de flujo. Los estudios futuros estarán encaminados a detectar cómo las células NK ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).
Desarrollo de la respuesta inmune Si se ha determinado que la población de células está esencialmente intacta en ausencia de activación, la cuestión de un fallo intrínseco puede estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el análisis expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antigénico de las células T (TCR) y los antígenos de activación como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de regulación del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque las poblaciones celulares pueden expresar un antígeno de diferenciación normal de referencia, también pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las células T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las células CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresión de ciertas moléculas, como el CD28. también es un indicador importante. En algunos síndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulación del receptor de IL-2 en respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematuramente (Cunningham-Rundles. 1990). El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinéticamente, debido al retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificación. Esto debe ser comprobado mediante estudios periódicos. En algunos casos, no pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluación puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta añadiendo citocinas pueden ser útiles, aunque pueden no mostrar la lesión al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias de análisis pueden utilizar sangre en lugar de células mononucleares aisladas (Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualización, ex vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las células no se alteran. Además, este sistema puede utilizarse para medir la producción de citocinas (Petrovsky, 1995; De Groóte, 1998; Suni, 1998). Se aconseja al laboratorio de inmunología clínica elegir estudios analíticos básicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base para la comparación. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de estas pruebas.
PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunología celular Activación
y proliferación
linfocítica
Aunque el sistema inmune se divide clásicamente en componentes humoral y celular, esta separación no es absoluta, ya que hay una considerable interdependencia entre las células B y las células T.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA Í INMUNOPATOIOGÍA
El parámetro funcional de la inmunidad celular más frecuentemente medido es la proliferación linfocitaria. La medida de la activación/proliferación de los linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los años 50 e inicio de los 60. cuando la división celular se determinaba por el recuento del número de linfocitos que se habían transformado en blastos. Estos métodos fueron reemplazados por la cuantificación de la incorporación de precursores marcados de los ácidos nucleicos (timidma tritiada) en el ácido desoxirribonucleico (ADN) recién sintetizado. Aunque este "análisis en masa' permanece como el procedimiento de laboratorio más frecuentemente utilizado para medir la proliferación celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos y nuevos procedimientos para evaluar la activación y proliferación linfocitaria. Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferación de la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de células en fases especificas del ciclo celular, la cuantificación de citocinas y de receptores de citocínas asociados a células y la posibilidad de evaluar el número de divisiones celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta sección se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activación y en la proliferación de los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos métodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema inmune celular.
Determinación de las vías bioquímicas de la activación linfocitaria Tras la interacción específica del mitógeno o el antigeno/MHC con los receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribución del sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activación de múltiples vías de señalización. Estos cambios conducen finalmente a la diferenciación de la célula T. a la secreción de citocinas. a la proliferación, a la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales están desvelando las complejas rutas moleculares y bioquímicas que conducen a la célula T activada por estas rutas. Constantemente se están descubriendo alteraciones especificas en estas vías y subyacen en muchas de las enfermedades de la inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los análisis de proliferación en masa indican solo que no hay división celular o que esta es limitada y no proporcionan información sobre las alteraciones subyacentes de la activación del linfocito. Se requieren ensayos más sofisticados para investigar las alteraciones subyacentes de las células T.
Activación de los linfocitos T inducida por antigenos La activación de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre la activación de una célula T nativa frente a la activación de una célula T de memoria. El antigeno es procesado por las células B o por los monocilos provocando el ensamblaje de péptidos inmunogénicos en los productos de los genes del MHC de clase I o II El complejo péptidoMHC es presentado a las células T que portan el receptor apropiado de esa célula T. Además, la APC expresa una serie de moléculas de adhesión y coestimulación que interactúan con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la célula T. La unión aislada del receptor de la célula T no es suficiente para la activación de la célula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 señales" para la activación de la célula T (Brestcher, 1992). La primera señal que ocurre por la vía TCR/CD4/CD8 modula la transición de la célula T en las primeras etapas de la activación (p ej.. de G a G.). La 2- señal se produce por la via de los coestimuladores. más concretamente por el CD28 y en menor medida por LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la inducción de la IL-2 y de otros genes de citocinas requeridos para la proliferación y diferenciación de la célula T hacia células efectoras. 0
Reconocimiento de las células T, activación y transducción de la señal El complejo TCR está compuesto por una estructura de reconocimiento del antígeno heterodimérica (esto es. el TCR) y un complejo de transducción no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la
superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de señalización por si mismo. La estructura de reconocimiento antigénico está compuesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6) y el complejo de transducción CD3 está formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dímero de cadena zeta. Cada una de las proteínas del CD3 contienen un residuo llamado residuo inmune de activación de la tirosina (ITAM). que se une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f¡ (que existe como un homodímero f¿ una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y) contiene 3 ITAM y es el componente más significativo del complejo TCR. estando implicado en la transducción de la señal desde el TCR (Weiss 1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activación de las células Tflrving. 1991). Las moléculas CD4y CD8 de la superficie de las células T también están unidas de forma no covalente al complejo TCR Se unen a las moléculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y también están implicadas en la transducción de las señales de activación Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las células T en el contexto de los antigenos del MHC. En general, las células T CD4+ responden a antígenos exógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase II y las células T CD8+ responden a antigenos endógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 también están asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos precoces tras la activación de las células T. Además de estas interacciones y las interacciones de las moléculas «estimuladoras, otro grupo de moléculas (moléculas de adhesión), presentes tanto en la APC como en las células T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de la unión. Las moléculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7 (CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor (HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las células T. la CD28 es la principal molécula «estimuladora y se une al B7: la CTLA-4. por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y está implicada en la disminución de modulación de la activación de las células T (Linsley, 1991b). El receptor en las células T para el HSA no ha sido identilicado. La presentación del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las moléculas coestimuladoras lleva a una respuesta anérgica (tolerancia) en posteriores exposiciones a ese antígeno especifico pero no afecta a las respuestas a otros antígenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunogénicos a tumores inmunogénicos transplantados transfiriéndoles el gen 87 (Townsend. 1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las moléculas coestimuladoras juegan un papel importante en la activación de las células T in vivo.
Transducción de señales después de la estimulación antigeno-específica La presentación del antigeno a las células T conduce a la agregación del complejo del TCR-CD3 y a la activación de la proteína tirosina cinasa (PTK), El TCR por si mismo tiene un pequeño dominio ciloplasmático sin actividad de transducción conocida. Es la cadena asociada ¡¡ del complejo CD3, que contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad de la proteína tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplasmáticas de PTK están implicadas en las etapas mas precoces que siguen a la agregación del receptor de células T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de señalización que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la vía de la coestimulación por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activación de las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activación de tres vías. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La activación del p21"» activa las proleína cinasas activadas por mitógenos (MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripción regulando de este modo la expresión genética. La activación de la tirosina cinasa también activa a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generación de los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rápido y sustancial aumento del calcio ciloplasmático. El aumento del calcio libre activa la fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma. 1-
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CAPÍTULO 36
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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
Estos procesos también conducen a la inducción de proteínas de unión al ADN y a la transcripción de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor de IL-2 requeridos para la proliferación de la célula T. Para más información sobre las vías de transducción molecular tras la activación del TCP. y el CD28, consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999). La comprensión de las vías que conducen a la activación de la célula T ha llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar estrategias terapéuticas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y están asociadas con la forma autosómica del síndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena común y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalías de la transducción y están asociadas con la forma ligada al cromosoma X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de SCI adquiridas autosómicamente están asociadas con las mutaciones en la proteína tirosina Jak3 de la familia de proteínas Jano. la única molécula de señalización asociada con la cadena común y (Russell. 1995). A medida que se van descubriendo más anomalías subyacentes que conducen a la inmunodeficiencia de células T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse empleando un extenso sistema que identificará los trastornos de acuerdo con las alteraciones en la diferenciación, la maduración y la función (Gelfand. 1993). Estas designaciones podrían comenzar a enfocarse en los defectos fisiológicos o bioquímicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones terapéuticas. Para una revisión de las alteraciones moleculares específicas que originan alteraciones en la activación y proliferación de la célula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).
Respuestas de la célula T Recientemente, se ha preterido la designación de la respuesta de la célula T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de la célula T que originan unos patrones de secreción de citocinas que se sabe que están implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secreción de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las respuestas tipo I se caracterizan por la secreción de citocinas que se sabe que aumentan la inflamación (promflamatorias) e inducen la activación y la proliferación de las células T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las respuestas tipo II se caracterizan por la secreción de citocinas que suprimen la inflamación (antiinflamatorias) y estimulan a las células B a dividirse y diferenciarse en células secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secreción de las citocinas del tipo I regulan la secreción de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Châtelain, 1992) como ih vitro (Seder, 1992:1993). las células T no se diferencian en células secretoras de IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 presentes durante la estimulación de las células T nativas dirigirán la respuesta hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994). Muchos factores están implicados en la regulación del tipo de respuesta de la célula T que sigue a la estimulación antigénica. Además del ambiente de citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antígeno influye en el tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreñas, 1995). La respuesta predominante que se desarrolla Iras la activación de la célula T tiene implicaciones clínicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de tipo I a la infección por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora (Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la mayoría de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen por intensa inmunodepresión. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que la exposición repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre el 39% y el 75% de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga vía intravenosa y niños nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para VIH-1 y negativos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secretan IL-2 en respuesta a la proteína env in vitro. Estos científicos proponen que
estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad protectora mediada por células como resultado de una baja dosis de inmunización o de infección.
Metodología: determinación de la activación y la proliferación linfocitica en la evaluación de la inmunodeficiencia celular Los defectos del desarrollo, las alteraciones genéticas congénitas y las infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Además, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones terapéuticas también originan mmunodeficiencias. Los análisis en masa pueden emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminución de la respuesta proliferativa de las células T y han estado disponible durante algún tiempo pero están limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada información que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologías ha permitido la producción de una variedad de reactivos que pueden emplearse para evaluar múltiples actividades a lo largo de la via de activación de la célula T. Estos reactantes incluyen anticuerpos monoclonales específicos como marcadores de la activación de la célula T. reactivos y sistemas para la detección de citocinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferación linfocitica.
Procedimientos empleados para evaluar la activación y la proliferación de la célula T El procedimiento más frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celular es una simple prueba cutánea. Una prueba cutánea positiva para la delección de una respuesta de hípersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las pruebas cutáneas se llevan a cabo fácilmente, los resultados negativos son difíciles de interpretar, especialmente en niños pequeños, y las pruebas cutáneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulación de linfocitos in vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por células son la sensibilidad por contacto, la formación de granulomas y el rechazo alogénico. Los linfocitos son los únicos en los que se expresan receptores de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molécula o sustancia extraña (antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la célula T. En general, solo hay un número limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extraño, las células proliferan rápidamente de forma clonal para generar un gran número de células tanto efectoras como de memoria. Los primeros métodos empleados para evaluar la proliferación linfocitica incluían el recuento manual del número de células antes y después de la estimulación. Desgraciadamente, estas técnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos problemas técnicos. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la división celular. Hay que subrayar que los métodos que miden los sucesos iniciales en la activación del linfocito T pueden o no correlacionarse con la división celular. 3
Ensayo de incorporación de timidina tritiada H (ensayo TdR) Muchos laboratorios evalúan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculando el grado de incorporación de nucleósidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubación prolongada de cultivos celulares de mononucleares de sangre periférica con mítógenos (tres a cuatro días) o con antígenos (5 a 10 días). En general, solo un número limitado de células T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las células deben cultivarse durante 5 a 10 días para detectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirán la rápida proliferación de hasta el 100% de las células T. Por esta razón, la proliferación puede detectarse en tres o cualro dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La transformación linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtógeno fue descrita por pri-
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
mera vez por Nowell (1960). Los mitógenos son, en general, los estimuladores más potentes, ya que activan una gran proporción de linfocitos en relación con los aloantigenos y los antigenos.
Citometria de flujo en la evaluación de la activación y la proliferación linfocitaria Los análisis en masa, además de sus inherentes problemas técnicos, no proporcionan información sobre las subpoblaciones celulares específicas que están respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multiparamétrico inherente se ha convertido en el instrumento de elección para el análisis de la inmunología celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activación/proliferación de la célula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una revisión extensa de la citometria de llujo y de los métodos empleados para evaluar la activación y la proliferación linfocítica. véase Bauer (1993) y Shapiro (1995). Otro método basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso importante en los laboratorios clínicos es la medida de los linfocitos en varías fases del ciclo celular. En general, los análisis del ciclo celular se llevan a cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de ADN. El marcador empleado más frecuentemente es el yoduro de propidio. que interacciona estequiométricamente con el ADN (esto es. la cantidad o intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la célula). Utilizando complejos modelos matemáticos, es posible medir el porcentaje de células con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona con el porcentaje de células en fase "S" del ciclo celular. En general, los linfocitos de sangre periférica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celular, con menos del 5% de las células en la fase "S" C
Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporación de timidina tritíada por análisis de inducción de marcadores de superficie celular combinados con una medida del porcentaje de células en vanas fases del ciclo celular tras la activación (Cost. 1993). Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de marcador, se estimula la división de los linfocitos. Con cada división sucesiva la cantidad de marcador por célula se reduce a la mitad. La fluorescencia emitida por las células tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimación del número de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodología se ha estandarizado recientemente en un equipo analítico que incluye el soft-
Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activación de los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397 Copyright
FLUORESCENCIA
I.OÍÍ
l»KH26
Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos periféricos estimulados y no estimulados por mitógenos tras cinco dias en cultivo. La proliferación celular se indica por la dilución de la intensidad fluorescente en cada generación sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Citometry. 3* ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pág. 3 1 3 . Copyright í Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.) ware necesario para el análisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma Immunochemicals. St. Louis. MO). Una evaluación de 14 de los marcadores utilizados más frecuentemente informó que dos de los marcadores. PKH26 y el ester succinimidilíco del diacetato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los más adecuados por su capacidad para cuantificar la proliferación de los linfocitos (Parish, 1999). Este ensayo puede proporcionar la evaluación más fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas de cultivo in vitro con ventajas importantes sobre los análisis en masa habituales, permitiendo la medición de subpoblaciones específicas de linfocitos. Los indices de CSFE parecen correlacionarse más estrechamente con los análisis con TdR que la medida de las células CD69* (Ángulo. 1998). La medida de la proliferación linfocitaria empleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido desarrollada, optimizada y analizada para su empleo en aplicaciones clínicas (Allsopp, 1998; Ángulo. 1998). La posibilidad recientemente desarrollada de medir la producción de atocinas asociadas a las células a nivel de una sola célula tiene un importante potencial como herramienta clínica en la evaluación de la respuesta celular inmune. Básicamente, las células son estimuladas, ya sea como PBMC o como sangre completa, durante cuatro a seis horas en presencia de reactivos que bloquean el transporte de membrana (breleldina A o monensma) para evitar la secreción de atocinas. Entonces, se marcan las células con anticuerpos monoclonales específicos de cada subpoblación, se fijan, se permeabilízan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes específicos para el estudio de la citocina de interés (Jung, 1993; Prussia 1995). El ensayo se ha desarrollado en presencia de anticuerpos «estimuladores para la detección sensible de respuestas antigénicas en cultivos de sangre tras periodos relativamente cortos de incubación (Suni, 1998). Se ha prestado especial atención al desarrollo de anticuerpos que reconozcan las formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato de Golgí) y la optimización del tiempo de cultivo para detectar la máxima respuesta de las atocinas (Mascher, 1999). Los estudios clínicos han comenzado a demostrar la utilidad potencial de esta técnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren quemaduras muy graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de citocinas Th2 pueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multíorgánico (Zedler. 1999). Esto puede ser muy ventajoso, ya que no hay pruebas actuales que indiquen qué pacientes sufrirán esta complicación potencialmente
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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
mortal. Se están realizando actualmente muchos estudios que evalúan la utilidad clínica de esta prometedora nueva tecnología. Se ha informado la expansión de esta técnica para incorporar la capacidad de medir simultáneamente la proliferación y la síntesis específica de citocinas a nivel de una sola célula pero todavía no ha sido evaluada en un marco clínico (Mehta, 1997). Ciertamente, se están desarrollando nuevas técnicas que miden los diferentes acontecimientos implicados en la activación de la célula T. Hay métodos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fosforilación/desfosforilación hasta la transducción de señales, la transcripción de los genes y la división celular. Según se adapten estos métodos a la actividad clínica diaria, podremos disponer de un arsenal de estos para evaluar muchos de los procesos implicados en la activación y proliferación de los linfocitos. Aunque un elevado número de estas nuevas tecnologías todavía están en manos de los laboratorios de investigación, los métodos se están simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluación en los laboratorios clínicos.
FUNCIÓN GRANULOCÍTICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor común. Los granulocitos son extremadamente importantes en la respuesta inflamatoria precoz, y las alteraciones en sus funciones conducen a deficiencias importantes en la inmunidad celular. Estas suceden en cualquier punto de una serie de procesos necesarios para la función de los granulocitos, incluyendo la dificultad en abandonar la vasculatura (diapédesis), el movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimioquinesia). la opsonización del agente agresor (fagocitosis) y la destrucción por la vía de la generación de radicales tóxicos del oxígeno.
METODOLOGÍA: CITOMETRÍA DE FLUJO Y DE IMAGEN El empleo de la citometria de flujo (análisis celular basado en el láser) se ha convertido en el estándar de la práctica del laboratorio clínico en el estudio de respuesta inmune celular, como se indicó previamente (Kamientsky. 1969; Hertzenber, 1976). Las determinaciones de la inmunocompetencia e ¡nmunomodulacíón de los marcadores y receptores de superficie específicos, la caracterización de la línea por medio de la fenotipificación inmune de los linfomas y de las leucemias, la definición de malignidad empleando sondas específicas de cromosomas, así como el estudio de la heterogeneidad tumoral por las mediciones multiparamétricas del ADN son estudios frecuentemente realizados en muchos laboratorios, como se estableció previamente, y se detallan en Keren (1989a. 1989b), así como en muchas otras referencias mencionadas a lo largo de este texto. La clasificación de los tipos celulares por estos medios significa la posibilidad de definir las funciones biológicas y efectoras en las bases moleculares y permite establecer las relaciones de estas mediciones con procesos y definiciones de enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son posibles empleando las tecnologías basadas en el láser. Se utilizan dos tecnologías principales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabilizan las partículas y se determinan las características físicas y químicas de las partículas que pasan a través de un flujo de líquido en una suspensión de células aisladas. En la segunda, conocida como análisis estático, las partículas son estacionarias y la plataforma o el láser se mueven como en un análisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnología del análisis de imagen se está haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la evaluación de citospines preparaciones de contacto {louch preparations). en preparaciones cromosómicas. y en secciones titulares para ciertas aplicaciones, como la hibridación ¡n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los avances en la disponibilidad de las sondas fluorescentes para la FISH y la representación cromosómica en los años recientes hará que estos análisis
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sean más relevantes y útiles en el laboratorio clínico (Weinberg. 1993). Recientemente, la FDA aprobó el anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniería genética trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan el gen HER2meu y al mismo tiempo aprobó una prueba diagnóstica en la que se usan métodos de inmunohístoquímica (IHC) para la detección de la proteina HER2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la FISH para detectar la amplificación de la expresión génica de la proteina HER2/neu se está utilizando en laboratorios especialmente entrenados. Cada prueba complementa a la otra, poseyendo cada una distintas dificultades técnicas y sensibilidad. El IHC suele producir falsos negativos debido a la existencia de artefactos y necesita ser revisado por otro método. Con el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la expresión génica no tiene por qué equipararse necesariamente con la amplificación génica). Como sucede en muchas técnicas, incluyendo el análisis del ciclo celular en el ADN. cada uno de los nuevos marcadores y de las nuevas técnicas deben ser definidos, evaluados y correlacionados con los resultados del paciente antes de otorgarle o no una utilidad clínica absoluta. Se ha introducido el desarrollo de instrumentación que combina la fuerza de la citometria de flujo y las ventajas estáticas del análisis de imagen. Esos instrumentos, conocidos como citómetros de exploración por láser, realizan las mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia adelante, dispersiones laterales y fluorescencia en las células en suspensión o fijadas en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinará si este abordaje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria de flujo actual y con las configuraciones de sistemas de imagen (MartinReay, 1994) (Fig. 36-3). Los citómetros de exploración por láser y los análisis de imagen no se desarrollan en este capítulo. Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrónicos, ópticos y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnología de los ordenadores y del software han permitido que la tecnología de la citometria de flujo llegue a ser una rutina en el laboratorio. Además, la amplia posibilidad de anticuerpos monoclonales agrupados, que incluyen más de 150 (Kishimoto, 1998), marcados con muchos colores, directamente conjugados y en formato preformado ha permitido la detección simultánea de múltiples antigenos de superficie así como de constituyentes citopiasmáticos y nucleares. La posibilidad de desarrollar análisis multiparamétricos es la mayor fuerza de la citometria de tiujo. Actualmente, la determinación tanto de los marcadores fenotípicos como de los intracelulares es una rutina en muchos laboratorios. Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citometria de flujo convirtiéndolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia de "caja negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenómeno es el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificación de las poblaciones de las células T para la monitorización de los pacientes con VIH (Shapiro, 1993: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de la aparición de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el laboratorio lúe principalmente para la caracterización de las leucemias y de otras enfermedades hematológicas malignas y para el análisis del ADN de tumores en la fase de síntesis (fase S) y el índice de ADN (DI). Aunque la tecnología de la citometria de flujo puede ser más "caja negra", la epidemia de VIH ha aportado la citometria de flujo a un número mucho mayor de instituciones y laboratorios [College of American Pathology [CAP]. 1990-2000). Esto ha permitido a esta tecnología ser una parte integral de muchos diagnósticos y un importante complemento en el tratamiento de los pacientes. A pesar de su simplificación, persisten muchas cuestiones relacionadas con la regulación de la FDA, la competencia de los análisis y la gestión y reproducibilidad de los datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al análisis del ADN (CAP, 1990-2000). No es el propósito de este capítulo describir todos los matices de la citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometrías de flujo actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipificación y análisis del ADN. La mayoría de los problemas de los laboratorios son la imposibilidad de estandarizar los reactivos de control de calidad y los calibradores y la pérdida de métodos rápidos y fiables para la transferencia y almacenaje de datos, compatibles con los sistemas de información del laboratorio. Se insta a los lectores a que consulten las numerosas referencias para una selección apropiada del citómetro de flujo o de imagen referente en cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (Shapiro, 1993, 1995).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 36-3. El empleo de citómetro de exploración por láser (LSC) produce dalos que son comparables a los datos de la citomelría de flujo: sin embargo, debido a que la máquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la citomelría de flujo, en la que toda la información de cada célula se encuentra en un solo pulso electrónico para cada parámetro, la LSC emplea cientos de mediciones para calcular y extraer los parámetros para cada célula. También es posible obtener parámetros derivados. El valor celular es la cantidad total de fluorescencia por célula, pero los parámetros derivados, como el área celular y el valor pico, son también importantes. La figura muestra los datos de una preparación con cytospin de células HL-60 que fueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo parámetro del valor rojo, así como las tres posibles combinaciones de los parámetros rojos derivados. De particular interés es la agrupación de células localizada debajo de la letra c. La muestra tue teñida con hematoxilina y eosina. y las células de las áreas marcadas (videsupca) fueron trasladadas. Se muestran las lotos digitales de las primeras 20 células trasladadas a cada región. Las células en la región c están en mitosis. mientras que las células en la región d, b. y a se corresponden a células a través de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular. (Cortesía de CompuCyte. Cambridge, MA.)
Más importante para los médicos es la comprensión de la tecnología, las fortalezas y las debilidades en el control y garantía de la calidad, en la preparación de la muestra y en la interpretación de los datos.
Hardware y otras herramientas Fuente luminosa y procesamiento de la señal La citomelría de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasificación, y esta propiedad persiste con los elementos de investigación en los laboratorios altamente especializados. La citometría de flujo clínica emplea
ahora helio-neón o diodos láser y láser de ion de argón refrigerados por aire o un único ion de argón refrigerado por aire con emisión a 488 nm (Bogh. 1993). El láser actual tiene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW, y dura más de 6.000 horas. Esos láseres, comparados con los previos refrigerados por agua, son fáciles de mantener, no requieren precauciones especiales de seguridad y son más baratos de sustituir. Si un laboratorio está interesado en desarrollar cinco o más colores de análisis empleando sondas de Hoescht estimuladas con radiación ultravioleta, entonces es necesario emplear grandes láseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los láseres refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos láser están eliminando la necesidad de los láseres relrigerados por agua. La
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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
mayoría de los citómetros de ílujo multifacéticos clínicos utilizan un láser simple de ion argón refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomultíplicadores. Las configuraciones instrumentales más Irecuentes incluyen el Becton-Dickmson FACScan que está siendo reemplazado por el FACS-Calibur (tiene un módulo de clasificación con capacidades limitadas) y el FACS Vantage para ocho o más parámetros y categonzación de alta velocidad. El Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laboratorio habituales, ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulter XLs o el FACSCalibur. Beckman Coulter continúa con el Coulter XL y software mejorado para el tratamiento de datos. Además, el ASTRA de Beckman Coulter añade a la categonzación de alta velocidad, ocho parámetros adicionales para el laboratorio de investigación. La introducción del XL como última tecnología en citometría de flujo con el empleo de señales de procesamiento de pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995). con convertidores de analogía digital de alta resolución (ADCs). invalida el uso de los amplificadores logarítmicos (log amps). Este es un importante avance ya que elimina cuestiones de alineación y baja sensibilidad en los límites bajos (umbral) en la medición de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicional, las mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero tienen que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para colocar todos los puntos de interés). Este proceso en los instrumentos no digitales se lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logarítmicos. Desgraciadamente, esta conversión de la señal lineal por medio del ADC a los amplificadores logarítmicos ocasiona un ruido que origina un aumento de los coeficientes de variación de procesamiento de la señal (CV) al aumentar la señal fluorescente Esto hace que cada medición tenga diferente sensibilidad ya que el CV de la señal de conversión aumenta con un mayor número de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos técnicos que utilizan una citometria de flujo clínica realmente no entienden la causa de la sensibilidad variable de los amplificadores logarítmicos en sus instrumentos, se enfrentan a los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de su escala logarítmica. La linealidad es particularmente importante en la medición del contenido del ADN (como las mediciones del ADN se hacen en una escala lineal, los problemas de la amplificación logarítmica se eliminan pero entran en juego otros factores electrónicos similares) ya que el valor DI depende de su exactitud. Ademas, la alineación se está haciendo cada vez más importante en la medida cuantitativa de la fluorescencia de la proliferación y la activación (Auer. 1994; Shapiro, 1995) así como está afectando al valor pronóstico de los valores de la fase S en ciertos cánceres. El laboratorio debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolución, y controles de calidad antes de desarrollar trabajos clínicos. Los controles de calidad diarios se definen posteriormente en este capítulo. Se remite de nuevo a los lectores a revisar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer. 1993: Shapiro, 1995).
Flujo celular En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la mayoría de los instrumentos clínicos se utilizan en la medición de las células CD4 en la monitonzación de la enfermedad por VIH, la mayoría de los sistemas clínicos utilizan un sistema cerrado como precaución de riesgo biológico. El primero, conocido como un flujo celular de corriente en aire o de flujo en aire, permite que el punto de medida óptico se encuentre directamente sobre la corriente de muestra. Este tipo de flujo celular minimiza la distancia entre la cámara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra necesario entre las mismas. Esta cámara permite una mayor variabilidad del grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 1993: Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son importantes en la clasificación celular y no se consideran aquí. En el sistema cerrado, a menudo referido como punta de cuarzo o célula de flujo, el punto focal está dentro de la cámara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo son la fineza del cuarzo y por ello la difracción del haz del láser o la dispersión de la señal. Adicionalmente. la sección cuadrada tan relativamente amplia (200/ pm) hace que sea más difícil controlar el flujo. El éxito de estas células de flujo de cuarzo en el sistema clínico depende de la iluminación y de las ópticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avanzado mucho
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en estos sistemas para proporcionar seguridad y una máxima sensibilidad con el uso de sistemas basados en láser de baja potencia iBogh. "993). Todos los términos empleados en la definición de estos sistemas son confusos, incluyendo la tasa del flujo, la cubierta de presión, el tamaño de la parte central, la velocidad resultante de la partícula, el CV resultante, etc El factor más importante que ha de comprender un trabajador de laboratorio es que en el análisis del ADN, las células son analizadas con un flujo bajo para aumentar el tiempo que permanece la partícula en el haz, lo que permite una mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificación. la sensibilidad no es un problema especial, y el flujo de la partícula puede aumentarse. Muchos sistemas clínicos están comprometidos en acomodar las dos aplicaciones más frecuentes: la inmunotipificación y el análisis del ADN (Shapiro, 1993, 1995a: Goetzman. 1993). Los citómetros de flujo de investigación tienen mucha mayor flexibilidad y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la presión diferencial y el tiempo
Colores y más colores: aplicaciones de los fluorocromos Muchos laboratorios todavía emplean los fluorocromos más frecuentes, el isotiocianato de fluoresceína (FITC: 530 nm de emisión) y el ficoeritrin (PE; 575 nm de emisión) en la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC se conjugan directamente por el anticuerpo de interés y simultáneamente se añaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo secundario como una IgG de carnero antirratón (GAM) marcada con fluoresceína para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluorescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados en la clínica en el estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo con sangre completa. El Pl puede utilizarse simultáneamente con el análisis de superficie realizado en el análisis multiparamétrico del ADN, aunque esto requiere la conservación de la membrana celular (Clevenger, 1993). Existen más tinciones disponibles en el laboratorio clínico que permiten mediciones simultáneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales marcados directamente y excitados en un láser a 488 nm. Esta disponibilidad está revolucionando el desarrollo actual de la citometria de flujo en la práctica de laboratorio Estas tinciones con una emisión roja o roja lejana incluyen el tándem PE Texas Red (625 nm de emisión), el tándem PE-Cy-5 (675 nm de emisión) y la alolicocianina (675 nm de emisión), por nombrar unos pocos (Fig. 36-4). Los primeros tándem eran problemáticos ya que el exceso de PE libre en la solución conducía a un exceso de fluorescencia de fondo. Están surgiendo nuevas tecnologías para la síntesis de estas tinciones, resolviendo muchos de los problemas técnicos, y constantemente se están añadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clínico (Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas, se puede desarrollar un análisis de la población de VIH en un único tubo con gran seguridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se liñe simultáneamente con CD45, PE-Cy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con el nuevo procesamiento de señal digitalizado. la compensación (wde inlral se lleva a cabo fácilmente, y se realiza el análisis empleando el CD45 como un agente iniciador mediante dispersión lateral (SSC) y el análisis simultáneo de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenómeno interesante es que estas nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia como un iniciador en lugar de los parámetros habituales de dispersión de luz. Esto es posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes de la mayoría de las células o no tienen competición autofluoresceme en estado natural como se encuentra con el FITC. Además, pueden excitarse a una longitud de onda que minimiza la autofluorescencia de los constituyentes celulares como la riboflavina. Por tanto, cuando ocurre un suceso raro (presencia celular <0.1% de la población total) empleando un iniciador fluorescente, se pueden analizar muchas células rápidamente Este método también se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el núcleo o el citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los métodos de evaluación de sucesos raros son cada vez más frecuentes y más fiables para el laboratorio clínico. Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En la evaluación de la enfermedad residual mínima (MRD) incluyen la PCR. la citometria de flujo combinada con sondas nucleares, la citometria de flujo
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometría de flujo multicolor multiparamétrica (De Shapiro HM: Practical Flow Cytometry. 3- ed. Nueva Cork, Wiley-Liss, 1995. pág. 245. Copyright © Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)
con la utilización de múltiples marcadores que delinen el fenotipo leucémico y varias aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisión real de la médula ósea en la leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha demostrado en el análisis de citometría de flujo; simplemente es un tema de nivel de sensibilidad y de detección del suceso (Campana. 1995.1999). Esto
obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resultados de la citometría de flujo frente a los criterios morfológicos de remisión y predicción de recidivas. Sigue evaluándose cómo afectará esto a las estrategias de tratamiento en varias enfermedades hematológicas malignas. Además, el empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es más habi-
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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tual. La detección de las señales de RT-PCR en pacientes que se encuentran en remisión clínica todavía no está clara, mientras que la detección del MRD por amplificación de la PCR de los genes del receptor antigénico se ha correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento (Campana, 1999). El empleo de fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del análisis mulliparamétrico llegue a ser una realidad en muchos laboratorios. Los parámetros pueden evaluar 1) diferentes poblaciones funcionales de una población celular particular empleando unas sondas fluorescentes mtracelulares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeños grupos de
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otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el estatus de activación celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificación del VIH empleando un abordaje en ancla): (4) asi como observar la expresión de la superficie celular y el DI o fase S de una población particular de células al igual que definir la fase S CD19 en la leucemia aguda. Obviamente, las posibles combinaciones son casi infinitas y su sofisticación está aumentada por la disponibilidad de marcadores específicos y sondas de ADNARN (Fig. 36-6). A continuación se expone un análisis sobre algunas de esas investigaciones y técnicas.
4 C O L O R (1)45/4/3/8
Figura 36-5. A. Empleo de la atometría de flujo de cuatro colores en el desarrollo del panel de moni tonzación del VIH. El método demuestra el empleo del CD45 como estrategia de comienzo y el empleo del CD45 y la dispersión de luz en el desarrollo de una diferenciación en tres partes (H-6). El empleo de la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de células T sean medidas en el mismo tubo y que todas las células sean contadas. El histograma 7 se incorpora en la región F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SSC). En el histograma 1. el empleo de la región Q define los desechos. Si estos son mayores del 15% del total de sucesos, normalmente se toma como una muestra inaceptable. Esta investigación permite analizar todos los parámetros y compararlos entre si. (Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados fueron de clones Coulter o (SectorDickinson para el FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.) La ilustración continúa en página siguiente
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 36-5. Continuación. B. panel de monilorización del VIH como en A, excepto que en este caso los paneles incorporan el empleo de un parámetro de recuperación lintocítico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, en H:2 se demuestra el empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepción permiten calcular y comparar múltiples valores del CD3 trente a otros.
ID Pcnt 11 1.7 12 71.2 13 1.4 14 25.6
Figura 36-6. El empleo de la citometría de flujo multiparamétrica permite la detección simultánea de una superficie fluorescente (CD20 positiva) y por lo tanto la definición de la linea celular y después la posibilidad simultánea de medir la intensidad de yoduro de propidio y así la medición del contenido total de ADN. para identificar las células leucémicas específicas marcadas como CD20. Esta técnica evita la necesidad de aislar la población de interés antes de la tinción del ADN y puede hacerse simultáneamente con la tinción de la médula ósea para la evaluación leucémica. Otras poblaciones, como las citoqueratinas y otros marcadores de estirpe celular, pueden ser identificadas en tubos adicionales. La muestra de médula ósea fue teñida con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y después fijada empleando metanol, permeabilizada usando Tritón X al 0.1%, y teñida con solución de yoduro de propidio (Pl) y ARNasa estándar. Los linfocitos de sangre periférica fueron utilizados como control normal no ciclico (no se muestran los dalos).
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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
RECEPCIÓN Y ANÁLISIS Inmunofenotipificacion: aplicación a las muestras habituales y leucémicas El análisis de las poblaciones celulares con la citometría de flujo emplea una combinación de parámetros que. cuando se aplican, definen una población especifica de células. La citometria de flujo emplea parámetros similares a aquellos que se han empleado durante muchos años en hematología, incluyendo el tamaño (por dispersión de luz hacia delante), la granulación citoplasmática (dispersión lateral), las afinidades por marcadores específicos y otros, y las combina con las herramientas inmunológicas ya mencionadas. Estas incluyen múltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la detección simultánea de estos parámetros por los sistemas analíticos actuales. Durante muchos años, la citometria de flujo del laboratorio clínico sólo podía emplear tres mediciones simultáneas incluyendo la dispersión de luz hacia adelante (FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE. La tinción de las poblaciones celulares estaba limitada por la no disponibilidad de anticuerpos monoclonales conjugados directamente, necesitándose la utilización de un reactante GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con bíotina. La definición de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo necesario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo positivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la población celular tiene un límite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cursor de modo que no más del 2% de los acontecimientos considerados como negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos positivos empleando un control isotípico emparejado. Aunque esta investigación parecía razonable en aquel momento (Lewis, 1993) y funcionó bien con grupos celulares brillantes, se ha hecho bastante incómoda a la hora de identificar células leucémicas o de desarrollar análisis de marcadores de activación celular. Las células leucémicas eran particularmente problemáticas, porque cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los controles isotópicos pueden tener poca relevancia. La aplicación de reglas estrictas y rápidas a los cursores de posición conducía a una infraestimación de los grupos positivos. El fallo de esta lorma de actuación se hace especialmente dramático en el análisis de la monoclonalidad de la expresión de cadenas ligeras K y A. A menudo se perdían diferencias pequeñas pero significativas. Se ha cuestionado en muchos casos el empleo de isotipos de control en ciertas situaciones, tanto por las aberraciones técnicas asociadas con su utilización como por los costes añadidos al laboratorio. Los nuevos algoritmos de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de definición de grupos basándose en los significados de las intensidades de las poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como la cuantilicación del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la necesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biología de la población de interés cuando se diseña un protocolo de análisis. Afortunadamente, algunos software sofisticados y los mejores reactantes nos han permitido utilizar entradas multiparamétncas para identificar las poblaciones, antes que intentar hacer estimaciones de la expresión fluorescente empleando valores cursor. Muchos investigadores han empleado la investigación mulliparamétrica para definir grupos u otras poblaciones de interés (Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Porter, 1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se revisan aquí. Con la llegada de la florescencia multicolor surgió la necesidad de analizar el número de células que expresaban uno o más colores al mismo tiempo en una población celular particular identificada por las regiones FALS y SSC. Cuando se desarrolló este método por primera vez. los científicos estaban pensando básicamente en cálculos matemáticos y recuento de todas las células y en el número de estas células que expresaban uno o más colores. Se desarrolló una investigación binaria para este análisis, conocida como prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de análisis tenían una entrada difícil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones no se podían redefínir posteriormente utilizando listas de análisis de modos,
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provocando una frustración importante. La técnica fue modificada con posterioridad para permitir más recepciones, y otros fabricantes con el software realizaron esta aproximación binaria con base postanalílica Loken entonces identificó las poblaciones de la médula ósea empleando el CD45 frente al SSC. una investigación única para identificar las poblaciones heterogéneas presentes en la médula ósea (Fig. 36-7). Estos y otros iBorowitz. 1992) desarrollaron el concepto de patrones que identifican estados leucémicos específicos. Shapiro empleó una vía de estimulación para definir la evolución de este concepto (Shapiro, 1995c). Después Loken promocionó el empleo del análisis de entrada dual-paramétrico con CD45 y CD14 en la región linloci tica del FALS frente al SSC en sangre periférica (Loken, 1990). Muchas agencias aceptaron y promovieron esta investigación en la mayoria de los paneles de citometria de flujo para el VIH para minimizar el efecto de los monocitos contaminantes en la población Imfocítica ya que podrían interferir con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocitos tienen receptores CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que iniciaron este tipo de análisis incluían los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e Infecciosas, la División de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de Nueva Cork, el Comité Nacional para la Estandarización del Laboratorio Clínico (NCCLS. 1992) y el CAP (1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta investigación solucionó muchos problemas, no asegura que cada tubo en el panel tenga los mismos contenidos que el tubo que contiene el CD45 y el CD14, y la corrección purificada corregida puede ser sobreestimada, conduciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisados durante una conferencia convocada por el CDC. un año después de que se publicaran las líneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer. 1993; CDC. 1993). Otros análisis de esta investigación se han desarrollado por el ACTG Flow Advisory Comittee en el programa DAIDS Proficiency CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1993) y por el CAP en su programa de análisis de competencia (Homberger, 1993). Una nueva investigación de recepción fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron a la investigación original de Loken para identificar los grupos de la médula ósea (Loken. 1990). El empleo del CD45 como parámetro de entrada ha simplificado el análisis de la médula ósea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revisiones de médula ósea y leucemia, el CD45 normalmente se establece como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersión luminosa anterior o la dispersión lateral; esto permite la identificación de una pobla ción potencial de blastos (malignos) La población de blastos entonces se identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los tres parámetros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el método de CD45 en tubo, con cuatro colores, permite la identificación de una región grande de linfocitos iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto también puede hacerse sin la utilización de los parámetros de dispersión luminosa, como se describió previamente (también puede hacerse empleando un panel de dos tubos, tres colores). Recientemente, nuevos productos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) añaden gotas precontadas ai tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto de irfo citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo que la fenotipificación. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hematología) cuando se desarrollan las enumeraciones de célula T y elimina los problemas del deterioro de los glóbulos blancos al empaquetarse y permite un diferencial exacto para obtener el número de células T exacto. Estos métodos están siendo incorporados en los ensayos ACTG VIH y en oros laboratorios. Otra estrategia de recepción es el empleo de dos o tres identilicadores de una población particular de interés. Esta investigación, frecuentemente conocida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza las propiedades particulares de algunas células para investigar otro tipo de parámetros. Cuando se aplican específicamente a linfocitos T, se considera como una puerta-T (Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de especial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las poblaciones de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar la expresión de CD45Ra y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja de este método es que es intuitivo y que cada color actúa como un control de calidad para la otra población (Fig. 36-8). Además, tenemos la posibilidad de identificar la expresión de marcadores biológicamente relevantes en relación
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA 3: P
4:
k ENTRADA Bl ÁSTIC A
ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45 (1)34 C"D33 (1)45
Figura 36-7. Médula ósea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada de imagen luminosa: (paneles H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linfática. FTIC frente a PE, identificando la población de blastos CD34/CD33 doble positiva (61,1% de todos los linfocitos se identifican como blastos). H3: Entrada total. CD34/CD33 doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados como blastos). H4: Blastos identificados por el CD45 frente al FALS son iguales a 46,5% (letra región k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6, H7: Dispersión lateral identificada por marcador fluorescente de interés (PE-CD33, FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45). (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente fueron obtenidos tanto de Coulter como de Becton-Dickmson para los clones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S. San Francisco, CA] para los clones Cy-5 marcados.)
con las poblaciones funcional o biológicamente relevantes. Esta evaluación es buena por si misma para cuantificar la fluorescencia (véanse histogramas 2 y 3. respectivamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no es nuevo, sí lo son las técnicas para medir los equivalentes de fluorescencia o los umbrales de fluorescencia u otros similares. Las mediciones cuantitativas de la fluorescencia se describirán tras el análisis y entrada del ADN. Otra investigación para la puerta de entrada se encuentra en la recogida de CD34, que emplea el CD34 y el CD45 teñidos con o sin ADD como una evaluación de viabilidad en la identificación y enumeración de los progenitores celulares CD34. Estos métodos también utilizan gotas para enumerar el número de células recubiertas. Estos métodos tienen gran utilidad en los protocolos de trasplante de médula ósea en los que los progenitores celulares se extraen de la sangre del cordón, de la médula ósea o de sangre periférica y, posteriormente, se reinfunden (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and Graft Engineering [ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigación se ha convertido en el patrón para muchos laboratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9 delinea dos métodos estándar, el ISHAGE y el protocolo Milán para desarro-
llar la enumeración de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Becton-Dickinson) utiliza una investigación similar y reactivos para automatizar el proceso. Adicionalmente. se ha diseñado un método capilar llamado ensayo Steller, un procedimiento sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (BectonDickinson).
Análisis del ADN Generalidades Conceptualmente, la realización del análisis del ADN debería ser más simple que el análisis de inmunotipificación, pero la revisión de los datos publicados y sus capacidades pronosticas asi como los progresos por los laboratorios sobre las pruebas de competencia indican otra cosa (Nicholson, 1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997). Se convocó una conferencia de consenso de ADN y los resultados se publicaron en Cytometry (Shankey. 1993). Esta publicación fue una revisión histórica de los principales tipos de
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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clínico de la medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parámetros fueron analizados en términos de efectividad como marcadores pronósticos. La conferencia CAP #26 de 1994 se basó en los marcadores previos y en marcadores indirectos de algunos tumores potenciales adicionales. En cada caso, el DI y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronósticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido a la variabilidad en la realización técnica y al análisis de estos ensayos (tanto en la preparación de instrumentos como de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realizaron recomendaciones específicas en cada tipo de tumor para las medidas apropiadas de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de «involución apropiada de los histogramas.
Preparación de la muestra Los métodos de preparación del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar. Existen muchas referencias para los métodos originales, asi
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como muchas modificaciones. Los métodos más frecuentes, desarrollados por Krishan. Vmdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vindelov, 1994), son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En cada caso, ya estén las células enucleadas o conservada la membrana celular, el marcador Pl de ADN es el que más frecuentemente se utiliza en la mayoría de los laboratorios clínicos y ya se ha descrito. La tinción Pl es directa a condición de que se sigan el tiempo, la saturación y los parámetros de extracción del ARN Las medidas de las alteraciones macroscópicas del cariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captación de Pl) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta medición incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor, el índice GyG, o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el paquete de software de deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del tumor presente (muestreado) en la muestra. Es frecuente ver que los laboratorios publican el resultado de un tumor diploide en una muestra que "no" contiene tumor. Los tumores con valores casi diploides necesitan reglas de interpretación estrictas, como la definición de tetraploidia. Surgen más pro-
Figura 36-8, La citometría de flujo con cuatro colores para realizar estudios funcionales permite el estudio recíproco de poblaciones celulares, como sucede con el estudio CD45Ro (definido como memoria) y el CD45Ra (definido funcionalmente como nave) en un determinado subgrupo de células T. Esta figura demuestra la definición de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (región E) evaluada en los histogramas 5. 6 y 7 para la expresión de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y las células no CD4. Esto se puede utilizar como una determinación comparativa de los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo. La fluorescencia en cinco colores debería permitir el uso simultáneo de CD8. que debería medirse y compararse con los CD4. Obsérvese la ausencia clara de tinción no específica actualmente disponible utilizando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la cuantificación directa de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la comparación de un punto y otro en el tiempo en un estudio longitudinal mediante histogramas simples con parámetros, como es el caso de los histogramas 2, 3, 6 y 7. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a través de CD45Ra y CD45Ro se obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron utilizando los métodos de lisado de sangre completa estándares).
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Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Milán para la enumeración del CD34. Arriba, la enumeración de las células CD34+ en sangre del cordón por análisis de citometria de flujo utilizando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Milán (fila de abajo). Se define la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia utiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la región celular dim CD45 y para excluir las células muertas empleando 7AAD (no mostrado) (fila superior). La fila del medio muestra el protocolo ISHAGE con un isotipo control. • El protocolo Milán utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del centro, abajo) para establecer los cuadrantes, el inferior derecho se usa para excluir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, Keeney M, y cois: The ISHAGE guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996; 3:213, con permiso.)
blemas en la definición de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de cortes y restos de núcleo y la población en fase S. La sigla, descriptiva y semicuantitativa, de BAD se utiliza en el paquete de software de análisis para moldear los efectos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994) (Figs. 36-10 y 36-11). El impacto de este parámetro en el análisis es controvertido.
Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de análisis paramétrico simple (sólo Pl) están sujetas a estos algoritmos de deconvolución. llevando a una gran variabilidad entre los laboratorios (Coon, 1994). Los algoritmos de deconvolución para el ADN se han estu diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilch. 1993. 1994. 1999: Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos modelos
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empleados para el análisis necesitan un mayor estudio. El documento de consenso del ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen análisis en concordancia, pero incluso con estas pautas existe un nivel de ambigüedad en la interpretación y rendimiento en el laboratorio clinico. Estas ambigüedades contribuyen a la discordancia de los resultados en estudios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 1988, 1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la interpretación de los resultados sea más difícil para los laboratorios nuevos y para ios el nicos que están intentando comparar los resultados de su laboratorio con la bibliografía reciente en el tratamiento de sus pacientes Esto es especialmente cierto en la clasificación de los valores de la fase S. Las medidas de la (ase S están sujetas a los efectos de los restos y modelación de los agregados como describieron Rabinovitch (1993. 1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (1988), Wheeless, (1991) y otros. El área entre 2C y 4C está sujeta a interferencias por artefactos. Además, es de importancia clave que la decisión con res-
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pecto al modelo matemático usado para un tumor determinado se mantenga constante y que los datos del modo de lista se conserven sin cambios por si se necesitan más análisis. Debido a la dificultad en el análisis del histograma del ADN. algunos han propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios expertos. La actualización de la FDA no ha aclarado ningún método y todavía se considera como una prueba en investigación. Desgraciadamente, durante muchos años la práctica clínica sugería otra cosa. Múltiples artículos proponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente debido al alto grado de variabilidad y de pérdida de significado pronóstico (ASCO. 1996). Poste riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para resolver algunos de los temas en el análisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y 36-13). Está en desarrollo un patrón o guía de la NCCLS para su emplee por los laboratorios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronósticos y como medidas de la actuación y práctica médica.
Figura 36-10. Empleo de diferentes técnicas de entrada para el análisis del ADN A. Pico tradicional frente a su integración con la correspondiente excusión de dobletes. El histograma de un parámetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro de propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G con el correspondiente G..M. B. Nuevo método de entrada (K.D. Bauer. comunicaciones personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la medición integral y al FL3 (área) Este método está siendo evaluado para mayor consistencia en la eva luación de los valores de la fase S C. Pico frente a integral demostrando que el 66.8% de los acontecimientos se encuentran en la puerta de la población (pico frente a integral, puerta b).
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80818589.H83 FL3 HP's "A"
DIPLOID CVCLE
Figura 36-11. A y 8, El empleo de técnicas con modelado informático en dos tipos diferentes de muestras. En A. se demuestra una linea celular fijada. Esta preparación muestra pequeños restos y una buena recuperación de la población aneuploide. Ambas poblaciones demuestran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una linea celular de la muestra. En B. se demuestra una sección de una muestra en parafina con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno, y los restos son minimos. La muestra demuestra una fase S del 9%. (Cortesía de Multicycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)
Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un modelo estático o un dibujo en el tiempo de todas las células analizadas. La integración del área para el número de células entre 2C y 4C en el histovados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y grama del ADN no es capaz de dar ninguna información respecto a las céluotros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN) para mejorar la calidad de los las "detenidas" en S (las células en realidad detienen la síntesis de ADN) o modelos en la estimación de las propiedades proliferativas y cinéticas de un de medir el número de células normales infiltrantes que pueden estar también determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la proliferaproliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capacición no son iguales que las medidas de la cuantificación de la fase S, que son c
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Contenido de A D N / D A P 1 Figura 36-12. Representación mulliparamétrica del contenido de ADN (escala vertical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (escala horizontal) que muestra una población celular citoqueratina-positiva con menos de 2N de contenido de ADN El estroma celular citoqueratina negativo se emplea para establecer la referencia 2N. permitiendo esto la identificación de las células hipodiploides. El histograma sin entrada convencional en el panel inferior demuestra la imposibilidad de asignar un contenido de ADN a la población celular mixta del tumor y de células estromales (Glogovac, 1999).
dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El histograma de un parámetro proyecta resultados razonables cuando se trata de una población celular asincrónica, relativamente homogénea. El mareaje por pulsos se utiliza más frecuentemente en grandes entornos académicos y más a menudo para medir la efectividad de la irradiación y quimioterapia obteniendo medidas reales de las células G,. G.. así como de los compartimentos G + M. lo que no es posible empleando medidas paramétricas simples de la fase S. Pueden utilizarse otras técnicas con sondas nucleares y citoplasmáticas asi como marcadores de superficie para separar la población de interés de la mezcla de tipos celulares. Este tipo de análisis multiparamétrico es muy útil para medir la lase S en las neoplasias hematológicas malignas (Fig. 36-6). Puede identificarse la población especifica de blastos por el FITC fluorescente y por el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de ADN y de la lase S empleando el Pl. Los métodos de tinción están alterados para conservar las propiedades de la superficie nuclear o las propiedades nucleares (Clevenger. 1993: Ramaekers, 1993: Carothers, 1994; Bauer, 1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos métodos normalmente incluyen la tinción del marcador de superficie de interés (p. ej.. KI-67. ciclina B1. citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijación en alcohol (o fijación comercial y permeabilización reaclante) y tratamiento con un detergente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los métodos de tinción se modifican selectivamente para conservar las propiedades de membrana y núcleo especificas de la sonda de interés (Bauer, 1994).
Esludios de interés del ADN Se ha publicado mucho en la bibliografía sobre la apoptosis (a menudo definida como muerte celular programada) y su relevancia en los parámetros tradicionales del ADN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el propó-
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sito de este capítulo desarrollar este tema. Aunque se están realizando muchos estudios, las mediciones de la apoptosis todavía no son parte de la rutina del laboratorio clínico. Como se mencionó anteriormente, el análisis de laboratorio del ADN se ha controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembolsan. Muchos investigadores de este campo han votado por la exclusión sistemática de esta prueba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos tumores. Bagwell y otros, están estudiando retrospectivamente la reevaluación de un grupo de casos de cáncer de mama para tratar de desarrollar un modelo pronóstico unificado para los pacientes con cáncer de mama con ganglios negativos En el análisis se incluyen un total de 350 histogramas de ADN unívariantes de tres centros de cáncer de Suecia (Bagwell, 2000). El estudio está tratando de identificar y corregir los factores que pueden haber disminuido la utilidad de la fracción de la fase S como describieron las recomendaciones de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO), para desarrollar un modelo pronóstico para el cáncer de mama ganglio-negativo, para identificar posibles avances en los métodos de la citometría de ¡lujo y para demostrar la utilidad de estas técnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comunicación personal. 2000) y col. se ha publicado recientemente sobre 630 muestras de tumores de mama fijadas con formol de mujeres menores de 45 años empleando un análisis bivariante de citoqueratina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13). Este análisis se desarrolló para aumentar la capacidad de detectar poolaciones tumorales mezcladas donde los índices de supervivencia pueden disminuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdido en el análisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnóstica útil que previamente quizá fue infravalorada por su complejidad.
Citometría de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia La definición de los tipos celulares en términos mmunológicos como las células efectoras implica la propiedad de estas células de regular, ya sea aumentado o disminuyendo, las funciones moleculares especificas a través de receptores de superficie. Conocidas como fenotipos inmunológicos (Poncelet, 1993). estas células necesitan otras propiedades medióles para definir sus papeles biológicos en la maduración y en los procesos de enfermedad. Uno de los fenómenos observados es la diferente expresión de antígenos de superficie celular (CD) en términos cuantitativos relativos y absolutos. Antes de la disponibilidad de las medidas absolutas, los términos descriptivos como brillante u oscuro, bimodal. y demás, eran utilizados en la bibliografía para describir un fenómeno visual de diferentes densidades antigénicas. Aunque descriptivos, estos términos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorios y entre los pacientes. También pueden perder precisión a la hora de definir un hecho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento de los pacientes o la definición (tipo celular) mediante la medida de la expresión de CD y el solapamiento de la expresión. La evidencia sugiere que las diferencias cuantitativas en la expresión antigénica en la leucemia linfocítica crónica y en otras leucemias puede ser importante para determinar el pronóstico (Poncelet. 1985). Estas medidas también se emplean en la definición del MRD y en la investigación del efecto o activación viral en la enfermedad por VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de células específicas presentes a menudo no aporta una imagen clínica real. Esto es particularmente cierto en los casos de leucopenia y cuando la población de blastos es un porcentaje relativamente pequeño del total de células presentes. La citometría de flujo cuantitativa (QFCM) se define como la cuantificación de la intensidad fluorescente (Fl) determinada por la capacidad de unión del anticuerpo de un anticuerpo conjugado con un fluorocromo. y es una medida indirecta de la cantidad de antígeno celular de superficie por cada célula individual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet. 1985, 1986; Schwartz, 1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos de polieslireno o líneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticuerpo para determinar el número de absoluto de receptores o de determinantes amígameos por célula, también denominados densidad antigénica (Poncelet. 1993). Las unidades ABC se definen como la medida de la capacidad retal/va de unión del anticuerpo.
Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de células de tumores tijados en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tinción de citoqueratina (FITC). Al Una población aneuploide de CK+ de cáncer de mama: A2, Un cáncer de mama mulliploide con una población hipodiploide y casi Iriploide aneuploide. Véase que el contenido diploide de ADN se identifica por la localización de la población celular CK. A3. Un ganglio lintático axilar con metástasis de adenocarcinoma de mama. La presencia de la población celular muy pequeña ce células aneuploides (2%) es ambigua en los datos no metidos (véase Fig. 36-128): sin embargo, en la presentación bivariabte. las células CK+ aneuploides son claramente evidentes. A4, Tinción con citoqueratina de células de tumor prostátíco extraídas de biopsias fijadas en parafina. La exclusión de las células CK del estroma en el análisis del ciclo celular del ADN incluye la medición del 2,6% a 3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un ganglio axilar con metástasis de adenocarcinoma de mama mostrando un dato sin entrada (línea gruesa y línea de puntos mostrando 10x en la escala vertical) y el dato de la citoqueratina del ADN introducido (línea de guiones) La presencia de células aneuploides es ambigua en los datos no metidos: si se reconocen como una población aneuploide, representan solo el 2% de las células, concordando con la abundancia histológica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. Palanca BJA. Rabinovitch PS: Cytokeratin Immunofluorescence in DNA analysis of paraffin extracted cells. Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. con permiso.)
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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Este método no necesita igualar los Índices de fluoresceinaproteína (F P). ya que las células y el modelo se han teñido con el mismo anticuerpo. El empleo de mediciones de intensidad fluorescente debería proporcionar al usuario un medio para evitar esta situación. El empleo de lineas celulares o microgránulos para construir una curva de calibración estándar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986): 1. Los anticuerpos en condiciones de saturación deben unirse a la super ticie celular a través de una interacción monovalente. 2 El número de lugares antigénicos por célula puede inferirse de la cantidad de anticuerpo unido. 3. La intensidad fluorescente puede determinarse utilizando una curva de calibración con células de diferente expresión antígénica o con gra-
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nulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de ratón a las concentraciones de saturación del anticuerpo. Estas medidas están sujetas a la variación de la capacidad de unión de los anticuerpos monoclonales específicos con la inmunoglobulina de ratón, asi como a las interacciones del poliestireno con los clones específicos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un laboratorio a otro y pueden no ser las mismas para los diferentes monoclonales fabricados de la misma especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon. 1995). 4. Se puede utilizar la intensidad de fluorescencia media del canal de estas partículas, determinada por citometría de flujo, para estimar la molécula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de una determinada célula.
Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del análisis multiparamétrico del ADN empleando BrdU como sonda nuclear. Fue realizado empleando una línea celular CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y después con un anticuerpo FITC anti-BrdU y teñida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl). La figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o linlocitos de sangre periférica |PBL|) utilizados para validar la unción con BrdU. Los controles negativos son obligados para el éxito de la interpretación de estos análisis Estos estudios proporcionan una mejor comprensión de las células que están en el ciclo y en qué fase del ciclo celular están.
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5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una fuente constante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM). son independientes de las subclases de anticuerpo empleado para detmir el antigeno. 6. Estas determinaciones pueden realizarse empleando monoclonales conjugados directamente a saturación utilizando patrones de granulos apropiados. Debe tenerse más cuidado para evitar problemas espaciales relativos al tamaño de la molécula de tluorocromo y los Índices de fluoresceína'proteína. Se puede obtener más información recurriendo al documento consensuado de 1997 de U.S.-Canadá que revisa los parámetros necesarios para la estandarización (Stelzer. 1997). Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantitativos nos ayudarán a definir programas de software de análisis de grupos para la cuantificación e identificación celular estableciendo la intensidad fluorescente media de los canales como medida de separación de células con diferentes fenotipos tuncionales.
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR En este capítulo, se han tratado de resaltar las áreas donde los médicos asi como los laboratorios deben prestar particular atención a los métodos utilizados y a las interpretaciones realizadas en la evaluación de la respuesta celular. La garantía de la calidad y el control de calidad de los parámetros no están bien definidos en esta área del laboratorio, y existen pocos estándares absolutos cuando se compara con los análisis químicos o las determinaciones de anticuerpos humorales. El éxito del laboratorio celular reside en su aproximación al problema y en la evaluación longitudinal de la condición que va a ser diagnosticada. Se señaló claramente que los estudios de base necesitan repetirse si la evaluación original se lleva a cabo en un momento de estrés inmunológico. Los parámetros básicos de las variaciones diurnas en las poblaciones de linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone (1990) concluyó que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuentos absolutos se debe en un 50% a la biología y en otro 50% se debe a otros problemas técnicos. Los factores que afectan la evaluación longitudinal de las cantidades absolutas de CD4 en un ensayo clínico han sido revisadas por Fei (1993). Además. Fahey (1990) revisó el valor pronóstico tanto humoral como celular de los análisis en VIH. En otros ensayos clínicos celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la falta de formatos y métodos estandarizados asi como a los reactivos. Además, la calibración de los instrumentos y la sensibilidad no están bien monitorizados. Los ensayos con linfocitos T citotóxicos son particularmente difíciles de estandarizar. Los ensayos históricos como la proliferación mitogénica son también difíciles, con variabilidad entre los laboratorios. Por lo tanto, los laboratorios que ofrecen estas pruebas inmunologías deben tener una amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpretar el resultado individual del paciente. Los laboratorios celulares deben establecer rangos normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normales de adultos no se apliquen en los ensayos pediátricos. Esto es particularmente problemático porque los rangos normales pediátricos son difíciles de determinar debido a la falta de niños disponibles en el primer año de vida, y la correcta interpretación de los resultados del laboratorio depende de ellos. Deben hacerse cuidadosamente las comparaciones de los datos entre los laboratorios. Siempre que esté disponible, un laboratorio de inmunología celular debe utilizar los estándares adecuados en el desarrollo de la citometría de flujo y en el análisis del ADN y tener presentes las regulaciones federales y estatales con respecto al laboratorio, incluyendo la Ley de 1988 (Human Health and Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Además, deben participar en pruebas de capacidad, cuando estén disponibles, y estar incluidos en programas de formación incluyendo evaluaciones de competencia para todo el personal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labora-
torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante el proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas deben ser cuidadosamente controladas en cuanto a la exposición al calor y al frío y el tiempo desde que se extraen al paciente Debe acompañar a las muestras una historia clínica para que se puedan realizar estudios particulares de modo que el director del laboratorio pueda realizar la correcta aproximación a la prueba. Se ha publicado un documento de consenso con recomendaciones sobre el análisis inmunofenotipico de las neoplasias hematológicas por citometría de flujo (Braylan, 1997). Este documento fue minuciosamente desarrollado por los proveedores de la comunidad médica interesados en cubrir los procedimientos de laboratorio, la selección de anticuerpos para la identificación de neoplasias, el análisis de datos y la interpretación, informes médicos e indicaciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. La FDA ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF¡. 1998). que elimina reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigación. Esta regla no permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cómo emplear sus reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La regla ASR proporciona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en buenas condiciones. Todos los laboratorios que utilizan estos reactivos como una prueba de fabricación casera" deben desarrollar sus propios ensayos clínicos y estudios de validación y deben emplear una declaración de descargo de responsabilidad en su informe final. El documento de consenso permite al laboratorio desarrollar sus análisis de un modo consistente y la definición del significado clínico a un gran número de laboratorios e instituciones. El documento no es un patrón pero concuerda con otro estándar NCCLS que está actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor dificultad de trabajo de interpretación ya que los datos no son fácilmente estandarizabas. Además, la garantía de la calidad de la muestra y la evaluación realizada dependen de la cuidadosa documentación de los parámetros biológicos y logisticos que pueden influir en el resultado. El futuro de las pruebas utilizadas en la evaluación de los componentes celulares de la respuesta inmune residen en el desarrollo de nuevos métodos que conduzcan a una mejor estandarización. BIBLIOGRAFÍA Allsopp СЕМ, Nicholls SJ. Langhorne J: A flow cytometric method to assess anti gen-specific proliferative responses of difterent subpopulations of fresh and cryo preserved human peripheral blood mononuclear cells J Immunol Methods 1998: 214:175-186. Analyte Specific Regulation. Medical Devices: Classificalionreclassification: restric ted devices: analyste specific reagents. Fed Reg Nov. 21,1997; 66243-62260. Anderson DC. 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CAPÍTULO 36
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C A P Í T U L O
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37
S Evaluación del funcionamiento de las > inmunoglobulinas y la inmunidad humoral
• Richard A. McPherson, M.D. PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS
Inmunoglobulina D 878
Moléculas de anticuerpo
Resumen
Interacción antígeno-anticuerpo
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
BASE GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS
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Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A
Los anticuerpos son las moléculas electoras de la inmunidad humoral (mediada por células B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen específicamente a los antigenos que estimularon su producción. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las proteínas plasmáticas de un individuo sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las proteínas con menor velocidad de migración en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo se centra en la discusión de las propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, su evaluación en el laboratorio y su importancia clínica.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Moléculas de anticuerpo Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford, 1991). Una molécula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de "Y". Presenta dos dominios de unión al antigeno en las puntas de la "Y" (región Fab) y zonas de unión para componentes del sistema del complemento y/o varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (región Fe). Cada molécula de inmunoglobulina está compuesta por 2 cadenas pesadas (H: heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idénticas entre si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interacción con el antigeno están compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una región variable de unos 110 residuos de aminoácidos en el extremo amino-terminal (las puntas de la "Y"), que forma el dominio de interacción con el anligeno, unido a una región constante. La región conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces más grande que en la cadena L. Cada cadena está compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un dominio de región variable (V ) y un dominio de región constante (CJ. mientras que la cadena H tiene un dominio de región variable (V,.) y 3 ó 4 dominios de región constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminoácidos en H
886
Patogénesis 880
PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Inmunoglobulina E
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
888
Inmunoelectroforesis Inmunofijación Prevención de las enfermedades y terapia BIBLIOGRAFÍA
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las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3 pequeñas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de la molécula para formar el sitio de unión al antigeno. Cada dominio de unión al antígeno tiene sólo el tamaño suficiente para unir un determinante antigénico del tamaño de cinco o seis residuos de azúcar. Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e) y las cadenas ligeras de dos (•,- y X), donde algunos de los isotipos presentan subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y„ y , y y y.. Los isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada por sí sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denominan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE). 2
3
Los anticuerpos tienen dos dominios idénticos de interacción con el antigeno. El dominio de interacción con el antigeno está compuesto por los aminoácidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molécula monomérica compuesta por 4 cadenas (véase Fig. 37-1) posee dos sitios idénticos de asociación con el antígeno, y se dice que son moléculas bivalentes. Estas moléculas son capaces de entrecruzar moléculas de antigeno, si cada una de ellas presenta 3 o más determinantes antigénicos, formando un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado tamaño, precipitará (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiológicamente porque facilita ia internalización del antígeno. como puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. También interviene en la activación del sistema del complemento. Además, este entrecruzamiento puede ser necesario para desencadenar la producción de anticuerpos (por la acción de linfocitos B) por parte del antígeno. La eficiencia con la que el anticuerpo se une al antígeno y produce entrecruzamiento se ve aumentada gracias a una región muy flexible (región de bisagra) que se encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que varíe la distancia que separa los dos dominios de unión al antígeno. La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antígeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un virus) presenta repeticiones de determinantes antigénicos en su superficie.
CAPÍTULO 37
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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
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(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco más grande que un fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molécula está cortada en fragmentos más pequeños de varios tamaños (Fig. 37-1). Como los fragmentos F(ab'),son bivalentes, todavía pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subunídades de anticuerpos) tiene las demás propiedades biológicas de las moléculas intactas de anticuerpos puesto que carecen de la cola (la región Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea terapéuticamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles tóxicos y facilitando la eliminación de la sustancia del cuerpo.
IKKK'
OKIH
Cada clon de células B produce moléculas de anticuerpo con un único dominio de unión al antígeno. Inicialmente, las moléculas se insertan en la membrana plasmática, donde funcionan como receptores de superficie para el antígeno. Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a las células B, las cuales se multiplican, diferencian en una célula plasmática, y sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de interacción con el antígeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y diversas células para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante sus dominios C en la región Fe de la molécula. Las propiedades biológicas de los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1. t
Figura 37-1. Representación esquemática de la molécula de inmunoglobulina G. Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e intracalenarios que determinan los lazos Cada uno de los lazos determina un dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones de corte enzimàtico más probables en la región "bisagra" por parte de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la acción de la papaina se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2 fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestión de Fab con pepsina en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma no covalente). La porción de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab se denomina Fd. v
H
L
Una molécula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partícula de tal forma que ambos dominios de interacción antigénica se encuentren unidos a determinantes antigénicos de esa misma partícula, en lugar de encontrarse en dos partículas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unión, la energía efectiva de la interacción o avidez, es mucho mayor que la que presenta una unión monovalente a dos partículas. Se ha demostrado que este mecanismo es muy importante desde un punto de vista fisiológico, en la neutralización de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unión. El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su habilidad para unir antígenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biológicas mediadas por la cola de la "Y", la región Fe de la molécula. Esta parte de la molécula de anticuerpo determina lo que ocurrirá con el antígeno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad de interacción con el anlígeno pueden presentar una variedad de regiones Fe distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la superficie de macrófagos, facilitando asi la fagocitosis de antígenos.
L
Interacción antígeno-anticuerpo La unión de un antígeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el número de sitios de unión contribuyen a la fuerza de la interacción antígeno-anticuerpo. Esta unión reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente débiles, incluyendo uniones hidrofóbicas y de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones iónicas. Estas fuerzas débiles son efectivas sólo cuando la molécula del antigeno está lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus átomos puedan insertarse en las regiones complementarias de la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos dominios de interacción con el antígeno idénticos entre sí, mientras que la región correspondiente del antígeno es lo que se denomina el determinante antigénico (epitopo). La mayoría de las macromoleculas antígénicas presentan vanos determinantes antigénicos distintos; si dos 3 más de ellos son idénticos, se dice que el antigeno es multivalente. La afinidad de una molécula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antigénico se inserta en un solo sitio de unión al antigeno, y es independiente del número de determinantes antigénicos. Sin embargo, la avidez total de un anticuerpo por un antígeno multivalente. como un polímero con
Tabla 37-1
Propiedades biológicas de los dominios de inmunoglobulina (IgG)
Dominio
Función conocida o probable
C„3
1. Reacciones citotrópicas que implican (a) Macrófagos y monocitos (b) Mastocitos heterólogos (c) Células citotóxicas (K) (d) Células B 2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras 1. Unión al complemento (C1q) 2. Control del ritmo catabòlico 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas 2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas. 3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que conllevan unión del antígeno y funciones electoras 1. Unión al antígeno 2. Formación de enlaces no covalentes entre cadenas pesadas y ligeras
Debido a que posee una localización expuesta y una estructura flexible, la región bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre indica, esta región confiere una cierta flexibilidad a la molécula, permitiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a una sola partícula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos regiones de unión al antígeno o. alternativamente, puede estirarse al máximo para unir dos partículas. Las propiedades que aporta la región bisagra a las moléculas de inmunoglobulina están relacionadas con su alto contenido en prolina y residuos de aminoácidos hidrofílicos. Los puentes disulfuro que se establecen entre las cadenas H en moléculas de IgG. IgA y en IgD se encuentran en la región bisagra (Fig. 37-1).
VHTV,
Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las moléculas de anticuerpo en diferentes fragmentos característicos que permiten un entendimiento de la relación estructura-función de la proteina. El corte con papaina produce dos fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unión al antígeno) idénticos, cada uno de ellos con un dominio de unión al antigeno, y un fragmento Fe
De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso
C,,2 C..1/C
880
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unión de todos los sitios de unión juntos. Una molécula de IgG típica se une con al menos 10.000 veces mayor fuerza a un antígeno multivalente si ambos dominios de interacción con el antigeno están implicados, que si sólo interviene uno de ellos. Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interacción con el antígeno entre moléculas de IgG e IgM es la misma, la molécula de IgM (debido a que es un pentámero y por tanto posee 10 dominios de interacción con el antígeno) poseerá una avidez mucho mayor por un antígeno mullivalente que una molécula de IgG (que posee dos dominios de interacción con el antígeno). Esta diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades mucho menores que los que se producirán más adelante. El aumento en la afinidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la inmunización se denomina maduración de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral frente a un antígeno es heterogénea, esto es, se producen anticuerpos con distintos dominios de unión al antígeno por parte de los clones de linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso cuando cada uno de sus dominios de interacción sólo tiene una baja afinidad. El tamaño del complejo antígeno-anticuerpo se determina por la valencia del antígeno y las concentraciones relativas del antígeno y el anticuerpo. La reacción de precipitación de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruzamiento de antígenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si sólo está presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), moléculas con un solo determinante antigénico no pueden entrecruzarse. Si un antígeno es bivalente, puede formar pequeños complejos cíclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que un antígeno con tres o más determinantes antigénicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad. Sin embargo, la mayoría de los antisueros producidos frente a un antígeno contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal) que reaccionan con diferentes determinantes del antígeno y pueden cooperar en el entrecruzamiento del antígeno. Por el contrario, anticuerpos homogéneos (monoclonales) sólo pueden precipitar moléculas que presentan repeticiones idénticas de determinantes antigénicos.
Dadas las condiciones de valencia que permiten la formación de grandes agregados, el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos reactivos. Si hay un exceso de antígeno o de anticuerpo es poco probable que se formen grandes complejos (Fig. 37-2). El tamaño y composición de los complejos antígeno-anticuerpo no sólo son importantes para las reacciones de precipitación in vilro. también son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los complejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan múltiples regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los receptores Fe de los macrófagos, los cuales los ingieren y degradan. Los complejos pequeños, formados en exceso de antígeno, sólo presentan una región Fe por complejo. Así, se unen pobremente a los receptores Fe de los macrófagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos se pueden depositar en pequeños vasos sanguíneos de la piel, ríñones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, causando inflamación y destrucción del tejido. Aunque parece que los complejos antígeno-anticuerpo tienen una apariencia muy rígida, los anticuerpos son entidades dinámicas que sufren fluctuaciones estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unión. Estos ajustes incluyen desplazamientos laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromáticos, cambios conformacionales e incluso pequeñas rotaciones entre dominios V y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrón, 1991). H
L
BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS 6
9
Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 moléculas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genéticos especiales para producir una gran cantidad de moléculas de inmunoglobulina, que se desarrollan durante la respuesta a un antígeno sin la necesidad de involucrar un número excesivo de genes (Edward, 1993).
Figura 37-2. Las concentraciones del antígeno y del anticuerpo influencian el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman. Los complejos de mayor tamaño se forman cuando ambas moléculas están presentes en aproximadamente la misma concentración molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos más pequeños se forman cuando existe un gran exceso de antigeno. Nótese que los pequeños complejos formados en exceso de antigeno presentan pocas moléculas de anticuerpo por complejo: por este motivo, no son eliminados eficientemente por los macrófagos de los fluidos extracelulares.
CAPÍTULO 37
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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
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Figura 37-3. Organización y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el cromosoma 12 de ratón. Cada gen V„ tiene también una secuencia líder que no aparece en la representación Los genes de la región constante se identifican mediante el isolipo de la cadena pesada, y existe más de un gen para los isotipos C, y C„ A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C están compuestos por múltiples exones, tal y como se ilustra para el gen C„ (dominios C„,-C,„...). Los sitios de recombmación se encuentran en el extremo 5' de cada uno de los genes C„ y tampoco se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o segmentos génicos. Cada cadena pesada está codificada por cuatro segmentos génicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de Marcu KB: Immunoglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright © de Cell Press). M
Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas diferentes. En cada grupo, distintos segmentos génicos que codifican para diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se pueden poner en contacto mediante procesos de recombinación específicos que tienen lugar durante la diferenciación de células B. Los grupos de genes de cadenas ligeras contienen uno o más genes constantes (C) y juegos de segmentos variables (V) y de genes de unión (J). El grupo de genes de la cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversidad (D) y segmentos J. Para generar una molécula de anticuerpo, un segmento génico V se recombina con otro segmento génico J , dando lugar a un gen V para la cadena ligera; y un segmento V„ se recombina con un segmento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3). Cada uno de los segmentos génicos generados se cotranscribirá con el segmento de la región constante correspondiente para producir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combinación de los diferentes segmentos génicos que codifican para las regiones V, y V.„ los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de moléculas de anticuerpo diferentes. H
Este repertorio inicial de moléculas de anticuerpo se puede expandir incluso más mediante la hipermutación somática, la cual se activa mediante la exposición al antígeno. Así, el papel que juega el antígeno en presencia de la mutación somática parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune y a una diversidad prácticamente ilimitada de moléculas de anticuerpo. Mutaciones somáticas puntuales tienen lugar en células B (no en células germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las hipermutaciones somáticas se encuentran, en su mayoría, confinadas a los genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contiguos. Se estima que tendrá lugar, aproximadamente, una mutación en la región V de la cadena H o L. en cada célula individual con cada división celular. Esto no sólo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que también puede causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas células B resultantes que puedan unir al antígeno con mayor avidez presentan una ventaja sobre otras células B que no son capaces de unir al antígeno con tanta avidez. A medida que decae la concentración de antígeno, aquellas células B que presentan receptores con mayor avidez dominan la población de células involucradas en la respuesta. Esto origina
una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutación somática puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho más efectivos. Todas las células B producen inicialmente anticuerpos IgM. Más adelante algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el mismo dominio de unión al antígeno (idiotipo) que la IgM original (exclusión alélica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinación con la exclusión alélica permite que los mismos dominios de unión al antígeno (la misma cadena V„ y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades biológicas (funciones efectoras secundarias). Así. este mecanismo de organización gémea permite la construcción de moléculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de múltiples segmentos génicos, su reagrupación en diferentes secuencias, la combinación de distintas cadenas pesadas y ligeras en la construcción de moléculas de inmunoglobulina, y de mutaciones somáticas.
PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS (Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993) Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades están resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina M Esta glucoproteína es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la IgM se secreta en forma de pentámero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimentación de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistémico (SLE), la forma monomérica de 7S se puede detectar en cantidades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\ (denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V„ (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminoácidos se enumeran empezando por el extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una región hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama también se ilustra la región donde pueden encontrarse la mayoría de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los dominios V, y V„. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. Los marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.
Debido a que la forma pentamérica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unión al antigeno, resulla más eficiente que su forma monomérica 7S o la IgG en el entrecruzamiento del antígeno y en la activación del sistema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unión y activación del complemento, unido a su temprana
aparición durante el transcurso de una infección, hace de la IgM un agente especialmente potente para combatir las invasiones microbianas. Cada pentámero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptídica. denominada cadena J (del inglés joming). con un tamaño molecular de 15 kDa. Este polipéptido accesorio se produce por parte de las células secretoras de
CAPÍTULO 37
Tabla 37-4
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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
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P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s IgM
IgG
IgA
IgD
A Fisiológicas Concentración mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4-2.2 0.03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <100 • Porcentaie de la inmunoglobulina total 13 80 6 0.002 Porcentaje de distribución intravascular 41 48 76 75 51 Ritmo de sintesis mg/kg/dia 2,2 35 24 0.4 0,003 Ritmo de catálisis en suero, %/día 10,6 6 24 37 90 (o vida media/dia) (5-6) (18-23) (5-6.5) (2.8) (2,3) Biológicas • Capacidad de aglutinación +4 +2 + Capacidad de fijación del complemento por la vía clásica •4 Hipersensibilidad anafiláctica homologa +4 + Anafilaxis heleróloga en conejillo de Indias — — ± Fijación a basólilos y mastocitos homólogos +4 — + Unión citolilica a macrófagos 1 + Transporte Iransplacentario — + Unión al tactor reumatoide Presencia en secreciones externas ± + +4 +2 Otras propiedades características: IgM - Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva frente a la bacteremia. IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los fluidos extravasculares IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo. IgD -Presente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activación de células B y/o la inmunorregulación
—
—
IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en residuos de cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo carboxilo-terminal de dos regiones Fe de moléculas monoméricas de IgM adyacentes. Se cree que la oligomerización se inicia en este punto. La IgM es además, el primer tipo de anticuerpo secretado por las células B durante su desarrollo. Los precursores inmediatos de las células B. llamadas células pre-B. sintetizan cadenas u., pero no cadenas ligeras, que acumulan en el interior de las células. A continuación las células pre-B empiezan a sintetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para formar moléculas de IgM monoméricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmática, donde funciona como receptor para el antigeno. En este momento, las células se han convertido en linfocitos B y pueden responder al antígeno. Quizás debido a su gran tamaño, el pentámero de IgM secretado no se encuentra de modo significativo en los espacios intersticiales; se encuentra confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es un componente minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies mucosas y en la leche materna. Filogenéticamente, la IgM es la inmunoglobulina más primitiva, y la mayoría de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evolucionado para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas. Otras propiedades físicas y biológicas de la IgM y de otros tipos de inmunoglobulinas se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina G La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional (Burton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglobulina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune secundaria. La región Fe de las moléculas de IgG se une a receptores específicos de células lagocíficas, como macrófagos y leucocitos polimorfonucleares. incrementando asi la eficiencia con que las células fagociticas pueden ingerir y destruir microorganismos infecciosos que se han recubierto con anticuerpos de IgG en respuesta a la infección. Estos anticuerpos unidos a células diana también pueden guiar a linfocitos NK (Natural Killer) a destruirlos mediante un proceso de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC del inglés antibody-dependenl cell-mediated cytotoxic¡ty¡. La función mejor conocida de la IgG es la activación del complemento por la vía clásica. La región Fe de la IgG puede unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema del complemento, que desencadena un ataque bioquímico que mata a los micoorganismos Se
—
necesitan al menos dos moléculas de IgG para la activación del complemento, en comparación con una sola molécula de IgM, que contiene cinco regiones Fe Las moléculas de IgG son los únicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto. Células placentarias que se encuentran en contacto con la sangre materna poseen receptores que se unen a la región Fe de la IgG y median su paso hasta el feto. Los anticuerpos primero penetran por un proceso de endocitosis mediada por receptores y después se transportan a través de la célula para liberarse posteriormente por exocitosis a la sangre fetal. Otros tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. por tanto, no pueden atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la placenta confiere una linea de defensa fundamental frente a la infección durante las primeras semanas de vida del niño. Normalmente, el embrión humano empieza a recibir cantidades significativas de IgG materna por vía transplacentaria a las 12 semanas de gestación. La cantidad aumenta de forma constante hasta que, al nacer, el suero del cordón contiene una concentración de IgG comparable a la del suero materno. Salvo que existan trastornos inmunológicos. los niveles de IgG de un adulto se alcanzan en el séptimo año de vida y a partir de este momento permanecen constantes. Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusión que les permite difundir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros tipos de Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espacios, es la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a microorganismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG que se encuentran recubriendo células diana, como pueden ser células tumorales, pueden desencadenar su muerte extracelular mediante ADCC; las células NK responsables de la ADCC presentan receptores para Fe de IgG. Existen cuatro subtipos de IgG humana, de 1 a 4. Las cuatro subclases reflejan la existencia de cuatro cadenas H distintas no genéticamente (y1 a y4). que son similares pero no idénticas en cuanto a su secuencia de aminoácidos y propiedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dominante en adultos humanos. La lgG3 es la más efectiva en su unión al complemento, seguida de lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al complemento por la vía clásica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atravesar la placenta. Un resumen de las propiedades físicas y biológicas de la IgG se encuentra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.
Inmunoglobulina A Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo presente en las secreciones (leche, saliva, lágrimas y secreciones respiratorias
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G
A. Fisiológicas Porcentaje de IgG total en suero Ritmo de síntesis, mg/kg/dia en suero Ritmo de catálisis en suero, %/día (vida media, día) Relación K/X Marcadores alotípicos (tipo de Gm) B. Biológicas Capacidad de fijación del complemento por la via clásica Capacidad de adhesión a piel heteróloga Transporte transplacentario Receptor en macrófagos Capacidad de reacción con proteína A Actividades dominantes: Toxoide antitetáníco Toxoíde antidiftérico Antitiroglobulma Anti-ADN Anti-Fth Anli-lactor VIII Anlidextrano Anlilevano Anti-ácido teicoico Número de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la región de bisagra Posición de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas pesadas
e intestinales). Existe en forma de un monómero de cuatro cadenas (como la IgG) o formando un dímero de dos unidades monoméricas. Las moléculas de IgA presentes en las secreciones son dímeros que llevan una sola cadena J. similar a la asociada con la IgM pentaméríca, con una cadena adicional glicopolipeptídica llamada el componente secretor (SC) de 70 kDa. Los dímeros de IgA recogen el SC de la superficie de células epiteliales que recubren el intestino, tos bronquios o los conductos galactóforos, salivares o lacrimales. El componente secretor se sintetiza en las células epiteliales e inicialmenle se expone en la superficie extema de estas células, donde actúa con un receptor que une los dímeros de IgA. El complejo resultante de la unión del dímero a su receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se transfiere a través del citoplasma de la célula epitelial en forma de vesícula membranosa, la cual se fusiona con la membrana plasmática en el lado luminal de la célula
IgGI
igG2
igG3
lgG4
66*8 25 8 (23) 1,4-2,4 a, z, f, x
23 ± 8 ? 6,9 (23) 1,0-1,1 n
7,3 ± 3.8 3,4 16.8 (7) 1.1-1,3 bo, bi, bz. g. st. etc
4.2 ± 2.6 ? 6.9 (23) 5,0-7,0
+2
±
+3
+ +
±
+ + +
+
+
+2 +2 +2 +2 +2
+
+
+ +
+ +
+2
±
+
—
— — 2 N214
+
+ -
± ± ± ± ±
+
•
-
—
+ 4 N131
— 5 N131
— — 2 N131
epitelial. La porción extramembranal del receptor se escinde por acción enzimática y se secreta como parte de la molécula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.) al lumen. El extremo amino-terminal del receptor del dímero de IgA que permanece unido a este dímero es el SC (Fig. 37-5). Así, la molécula secretora completa de IgA es un producto sintético de dos tipos celulares, células plasmáticas y células epiteliales. Además de su papel en el transporte, el SC también puede proteger las moléculas diméricas de IgA de la digestión por parte de enzimas proteolíticas presentes en las secreciones. En los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos, lgA1 e lgA2, en función de la estructura antigénica y la variación en la disposición de los puentes disulfuro intercatenarios. Así como la lgA2 es un componente menor del suero, este subtipo es la forma dominante en las secreciones. Además, la IgA secretada alcanza los niveles de un adulto antes que ?
Figura 37-5. Mecanismo por el cual el componente secretor media el transporte de la molécula dimérica de IgA a través de una célula epitelial. Todo el complejo se transporta desde el fluido extracelular al interior del lumen del tubo epitelial. El componente secretor se sintetiza en la célula epitelial como una glucoproteína transmembranal y funciona como un receptor en su superficie basolaleral para unir el dímero de IgA. El complejo IgA-receptor penetra en la célula en una vesícula endocíticá que cruza la célula y es exocitada en la superficie apical La escisión del receptor libera el dímero de IgA para su secreción a la superficie exterior (luminal). La porción del receptor que permanece unida al dímero de IgA se denomina el componente secretor. Este mecanismo de transporte es responsable de la deposición de IgA en diversas secreciones exocrinas (p. ej., saliva, leche, bilis, lágrimas y sudor) y en capas mucosas que protegen el revestimiento de los conductos nasofaríngeos, intestinales y del tracto genitourinario.
CAPÍTULO 37
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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo, puede estar plenamente desarrollado a los dos años de edad, mientras que los niveles de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto hasta los 12 años de edad. Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada constituye una primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesión de microorganismos a la superficie de las células mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una propiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multivalencia. que se asocia a una gran avidez por la unión de antígenos; esto puede resultar especialmente relevante en la neutralización de virus. La actividad antiviral de anticuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha suministrado cualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada también puede combinarse con determinados antígenos de la comida, impidiendo su absorción al torrente sanguíneo y reduciendo asi la incidencia de reacciones alérgicas. Por eiemplo. las inmunodeficiencias de IgA pueden desencadenar incrementos en tos niveles e incidencias de anticuerpos humorales dirigidos contra antígenos derivados de la comida y microorganismos intestinales. La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija el complemento mediante la vía alternativa; a través de un receptor específico de Fe presente en macrófagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y puede inducir la degranulación de eosinófilos mediante un receptor especifico, que ha implicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades físicas y biológicas de la IgA están enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4.
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Inmunoglobulina E De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE está presente en la menor concentración en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel humana (anticuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reacción alérgica (anticuerpo reagénico) La actividad biológica de la IgE se basa en su propiedad de unirse mediante su región Fe a basófilos y a su equivalente en los tejidos, los mastocitos La IgE puede ser importante también en la respuesta inmune humoral durante enfermedades parasitarias, ya que a menudo se encuentran elevados los niveles de esta inmunoglobulina en suero de pacientes que presentan una infección por helmintos. La IgE puede jugar un papel en el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del complemento a los locos de inflamación desencadenando una reacción de hipersensibilidad inmediala. Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza biluncional de las moléculas de anticuerpo Su porción Fe se une a las células diana mientras que su porción Fab se une al alérgeno (véase Capitulo 46 para el papel de la IgE en enfermedades alérgicas y ensayos relacionados) Los niveles de IgE en suero en determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6. Al igual que la IgA, la IgE se produce principalmente en el revestimiento de los tractos respiratorios e intestinales y forma parte del sistema secretor externo de anticuerpos. Una deficiencia de IgE se ha asociado de forma poco consistente con la deficiencia de IgA en individuos inmunodeficienles que presentan una excesiva susceptibilidad frente a infecciones. La IgE no atraviesa la placenta y los complejos de IgE-antigeno no se unen al complemento por la vía clásica (Tabla 37-4).
Inmunoglobulina D A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las principales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una proporción elevada de linfocitos B, especialmente en recién nacidos. Durante el transcurso de la diferenciación de las células B. estas células sintetizan y presentan en superficie tanto moléculas de IgD como de IgM. Aunque esto aparentemente contradice la regla de "una célula, una inmunoglobulina", los dominios de unión al antígeno (idiotipos) de ambas moléculas y de sus cadenas ligeras son idénticos. Sólo difieren en sus regiones C„. La IgD asociada a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con que las células B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferación clonal. Existen evidencias que sugieren que las células B que presentan IgM pueden responder a ciertos antígenos T-independientes y que la adquisición de IgD se requiere por parte de las células B para poder responder a la ayuda de células T necesaria para las respuestas a antigenos T-dependientes. Además, si las moléculas de IgD se eliminan selectivamente de células B que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que la cadena 8 es mucho más sensible a la acción de la papaina, estas células pasan a ser susceptibles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una respuesta inmune sigue sin conocerse, pero la opinión general es que enciende, apaga o modula la división o la diferenciación de células B. La IgD generalmente se detecta en suero a los seis meses de edad, y su concentración a lo largo de toda la vida es muy baja. Sin embargo, en estados de enfermedad la concentración de IgD puede variar enormemente. En infecciones crónicas, los niveles en suero de IgD se elevan, al igual que los del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha asociado un incremento específico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes con alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las concentraciones normales de IgD. Generalmente, la IgD está ausente en individuos con hipogammaglobulinemia. Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biológico específico como anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un cierto número de antigenos. La IgD de superficie, que tiene proteínas semejantes a las de la IgM de superficie, es un marcador de células B maduras, y su papel como receptor está aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la señal que Iransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes. 1993). La IgD no une al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a células a través de su región Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la del resto de las inmunoglobulinas. carece del péptido transmembranal en la región carboxi-terminal que ancla la molécula en la superficie de las células B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propiedades de la IgD.
Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas afecciones Elevado
Dermatitis atópica Mieloma de IgE Hiper-lgE e inlecciones recurrentes Síndrome de Wiskott-Aldrich Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardías) Aspergilosis broncopulmonar Pénfigo Parásitos (como la ascariasis) Lepra Sida De normal a elevado
Rinitis alérgica Asma alérgica Alveolitis extrínseca alérgica Fibrosis quistica Aspergiloma Alergias a medicamentos Enfermedad hepática grave Urticaria alérgica Enfermedad de Kawasaki Periarteritis nodulosa Normal
Linfangiectasia intestinal Bronquiolitis Pénligo Tiroiditis Fallo renal crónico De normal a disminuido
Leucemias Mieloma múltiple Deficiencia de IgA Disminuido
Ataxia-telangiectasia Hipogammaglobulinemia ligada al sexo Hipogammaglobulinemia congenita Hipogammaglobulinemia adquirida Deficiencia de IgE Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishizaka K Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E System. Washington DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman CA tvi Ishi/aka K. Daylon DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglobulin E System, Washington. DC. U S. Government Printing Ottice, 1975
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAKXOGI'A
Hiperinmunoglobulinemia
Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero Edad (Años)
Media de IgG (mg/ml)
Media de IgA (mg/ml)
NIVELES DE INMUNOGLOBULINAS EN SUERO
Varón blanco Mujer blanca Varón blanco Mujer blanca
5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75+
10,28 10.41 10,55 10,69 10.83 10.98 11.12 11.27 11,42 11,57 11,72 11.88 12,04 12.20 12.36
11.05 11.13 11 20 11 28 11.35 11.43 11.50 11.58 11,66 11,74 11,81 11.89 11,97 12.05 12.13
1.09 1,16 1,23 1,32 1.40 1,50 1.59 1.70 1.81 1.93 2.06 220 2.34 2.49 2.66
Una interpretación válida de los niveles de inmunoglobulinas en suero requiere un reconocimiento de las variaciones biológicas que existen a lo largo de la vida de los individuos. Las vanables más importantes son la edad, sexo y raza. Estudios en un grupo de individuos sanos de raza blanca (3.212) de una sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que la concentración media de IgG e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeñas pero significativas entre sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero de IgG y menores de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias entre sexos para la IgG y la IgA son estadísticamente significativas, su significado biológico no resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron relativamente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenían niveles medios de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml).
1,10 1.15 1.21 I.28 1.35 1.42 1,49 1.57 1,65 1,74 1,83 1.93 2.03 2.14 2.26
Vanos estudios han descrito que los niveles de inmunoglobulinas son mas elevados en personas con pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran los resultados obtenidos en una población birracial de individuos sanos del condado de Evans. Georgia. Los individuos de color tenían niveles mayores de las tres inmunoglobulinas principales (IgM. IgG e IgA) que los blancos. La mayor diferencia se encontró en la IgG. No se detectaron diferencias entre individuos urbanos y rurales en este estudio. Individuos blancos de Rochester, Nueva York, tenían niveles en suero de IgG e IgM similares a los de individuos blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durban, Natal, Sudáfrica, demostró que varones adultos bantúes tenían niveles significativamente mayores de IgM (32% más), IgG (40% más) e IgA (32% más) en suero que individuos blancos de esta comunidad que nacieron en el mismo año y pertenecían al mismo grupo sanguíneo ABO. Varones asiáticos sanos mostraban aproximadamente un 20% más de IgG. un 23% más de IgA. y un 7% más de IgM que individuos comparables de raza blanca. Un estudio de individuos del área metropolitana de Washington, D.C. demostró que individuos de color tenían niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos pero niveles similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control empleados en estos estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y también a diversos factores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '/-globulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de proteínas del suero, una medida de las proteínas totales o de albúmina y fracciones de y-globulinas. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas varían con la edad, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8).
Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de sujetos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI) (Cassidy. 1974).
Resumen En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA, IgD e IgE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y dos subtipos de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo posee una determinada cadena H (n, y, a. 8, e, y„ y¡, y . y¿ y n, a¿. respectivamente). Las cadenas H contienen la región Fe del anticuerpo, que determina qué otras proteínas se unirán al anticuerpo y por tanto, las propiedades biológicas del tipo y subtipo. Cualquiera de las cadenas L (K- O X) pueden asociarse con cualquiera de las cadenas H. 3
Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas corresponden a las diferencias funcionales en sus lugares de producción y acción, sus niveles relativos de síntesis en respuestas inmunes primarias y secundarias, y sus papeles como efectores fisiológicos. Por ejemplo, la IgG predomina tanto en sangre como en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM está principalmente confinada a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fundamentalmente en superficies epiteliales. La IgD e IgE se encuentran principalmente unidas a células, la IgD en células B. y la IgE en basófilos y mastocitos.
Los incrementos de inmunoglobulinas pueden ser monoclonales o policlonales. Las inmunoglobulinas monoclonales de un único individuo son idénticas estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expansión clonal de una sola célula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto, son específicas para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un mismo individuo son estructuralmente diferentes entre ellas en una o más características importantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera; o por su especificidad antigénica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de la expansión clonal de varias células linfoides productoras de distintas inmunoglobulinas.
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patogénesis, diagnosis, prevención y terapia de las enfermedades.
Patogénesis La hiperinmunoglobulinemia es una destacada característica del mieloma múltiple y de la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antígenos nativos pueden aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se describe en los Capítulos 43 y 45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menudo una de las características más destacadas de algunas inmunodeficiencias (véase Capítulo 42).
Tabla 37-8
INMUNOGLOBULINAS POLICLONALES Los aumentos policlonales de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patológicos (Tabla 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973). La electroforesis de proteínas séricas es a menudo suficiente para estable-
Concentración de le G en suero en una población birracial Media de la raza negra (± SE) (mg/ml)
Sexo
Edad (Años)
N. de muestras
Media de la raza blanca (± SE) (mg/ml)
Hombres
15-34 35-54 55-74
17 17 20
11.2(7.3) 10.8 (5.9) 10,9(7.4)
21 20
13.4 (6.5) 13,5 (9,0) 13,3 (5.8)
15-34 35-54 55-74
19 19 20
10,6 (6,3) 12,3(3.4) 10,9 (6.1)
I8 15 16
15,6 (8.0) 15,4 (6,4) 14.2 (9,6)
Mujeres
Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman. 1967)
N. de muestras
•"•
CAPÍTULO 37
Tabla 37-9
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas enfermedades asociadas Tipo de inmunoglobulina
Afección Inmunodeliaenaas Hiperinmunoglobulina E e infecciones recurrentes Síndrome de Wiskott-Aldrich Disgammaglobulinemia tipo 1 Hiperinmunoglobulina A e infecciones recurrentes Sida Infecciones Infecciones congénitas (sífilis. toxoplasmosis, rubéola, citomegalovirus) Mononucleosis infecciosa Tripanosomiasis Parasitismo intestinal Varias infecciones helmínticas Larva migrans visceral Granulomatosis crónica infantil Lepra Infecciones crónicas en general Enfermedades hepáticas Hepatitis crónica activa Hepatitis aguda Cirrosis biliar Hepatitis lupoide Trastornos pulmonares Síndrome de hipersensibilidad pulmonar Sarcoidosis Beryliosis Trastornos autommunes Lupus eritematoso sistémico Artritis reumatoide Muchos estados autoinmunes como la tiroiditis Escleroderma Enfermedad de la aglutinina fría Púrpura anafiláctica Otras Síndrome do Down Amiloidosis Adicción a narcóticos Enfermedad de los lúbulos renales
igE igA, igE IgM igA Todos los tipos IgM IgM o todas IgM o todas Todos los tipos igE Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos, con preferencia de IgG Predomina IgG Predomina IgG Predomina IgM Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos igA o todos Todos los tipos Todos los tipos IgM IgA Todos los tipos Todos los tipos IgM Todos los tipos
cer esta condición. La inmunoelectroforesis, inmunofijación y determinación de las inmunoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden ayudar a confirmar una distribución policlonal o un aumento de uno o más tipos de inmunoglobulina. El aumento de las inmunoglobulms séricas puede deberse a un descenso del catabolismo y un aumento de la síntesis. Los mecanismos de control de estos sucesos no se conocen bien. Las consecuencias de una elevación de inmunoglobulinas son desconocidas. La mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas frente a un solo determinante antigénico o grupo de ellos. Además, la mayoría de los autoanticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los incrementos persistentes de carácter policlonal en y-globulinas, se relacionan con una estimulación antigénica de naturaleza crónica, o con una pérdida de la regulación de las inmunoglobulinas.
Inmunoglobulinas
monoclonales
Las inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patológicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977; Benbassat, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobulinas también se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.
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La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en estudios de una población no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman. 1965: Axelsson. 1968; Cohén 1985). En labóratenos clínicos se encuentra una incidencia mucho mayor de resultados positivos, puesto que los sueros son preseleccionados. El mieloma múltiple, la macroglobulmemia de Waldenstróm y neoplasias de células B son algunas de las enfermedades asociadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. Antes se creía que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos de leucemia linfocítica crónica o de linterna Imfocitico bien diferenciado. Actualmente se ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijación y la electroforesis de alta resolución para estudiar muestras de estos pacientes, la mayoria de ellos presentan una gammapatía monoclonal (Keren. 1988). También se ha demostrado la existencia de gammapatias en pacientes con linterna de Burkitt y leucemia linfocítica aguda de células B. Aunque generalmente se desconocen las especificidades antigénicas de las gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatías paraproteinémicas. Este síndrome clínico generalmente se debe a la interacción de una paraproteina de IgM con una glucoproleina asociada a la mielina (MAG), gangliósidos (por ej. GM. en la neuropatía motora y GD„, en la neuropatía sensorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 1998). El término de gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS: monoclonal gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuñado por Kyle para categorizar individuos en los que se ha demostrado un componente monoclonal en el suero pero que carecen de otras características que permitan el diagnóstico de un cáncer (Kyle. 1982). Individuos con MGUS pueden tener hasta un 10% de sus células plasmáticas en la médula ósea. Esto es considerablemente menos que la plasmacitosis de médula ósea que se asocia con el mieloma múltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con MGUS desarrollarán un trastorno linfoproliferativo de células B, siendo el más común de ellos el mieloma múltiple, en un periodo de 10 años. Algunos de los otros casos pueden desarrollar leucemia linfocítica crónica, amiloidosis. linterna linfocítico diferenciado y otras patologías que afectan a la proliferación de células B. La mayoria de los casos de MGUS no progresan hacia ninguna otra patología clínica. Pacientes con MGUS poseen cantidades del componente M de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no presentan la protema de Bence Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes tengan un seguimiento mediante electroforesis de proteínas séricas cada 6 a 12 meses para determinar si el proceso progresa o retrocede. Una consideración especial es el MGUS que se observa en pacientes Irasplantados que han recibido inmunosupresores que afectan a las funciones de células T incluyendo la modulación de la respuesta B. Estas gammapatias monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los casos (Radl, 1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (Stanko, 1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el virus de Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresión probablemente se estimula por los elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).
Tabla 37-10
Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas monoclonadas
Mieloma múltiple Macroglobulinemia de Waldenstrom Leucemia linfocítica crónica Otras leucemias : Linfomas I Gammapatía monoclonal "benigna" j Síndrome de escape capilar sistémico Amiloidosis i Enfermedad hepática crónica como la hepatitis activa, o la cirrosis biliar primaria Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. el lupus eritematoso sistémico. la tiroiditis. la anemia perniciosa, la poliarteritis nodulosa o el síndrome de Sjogren Enfermedad de Gaucher | Varios tipos de cáncer ¡ Esferocitosis hereditaria I Infección por VIH, incluido el sida
888
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES La evaluación en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobulinas puede ayudar en el diagnóstico y tratamiento de las patologías. El empleo de pruebas de fijación del complemento, de hemaglutinación y otros inmunoensayos pueden detectar un aumento o cambio en la titración de anticuerpos frente a determinados antigenos, como los que están presentes en microorganismos. Las peticiones de examinar un suero para la presencia de proteína monoclonal generalmente vienen de un médico que reconoce en un paciente los síntomas clínicos y signos de este tipo de trastorno, o del examen clínico de una electroforesis de proteina sérica que sugiere la presencia de una proteína monoclonal. A menudo la sospecha del médico de la existencia de una discrasia de células plasmáticas viene con la detección de anemia (con una o más citopenias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumento de las globulinas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuricemía, hipercalcemia, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor óseo o lesiones líticas del tejido óseo en radiografías. Si efectivamente existe un componente M en la electroforesis de proteínas séricas, una medida cuantitativa de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial, nefelometría u otra técnica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especifica si sólo se encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobulina. Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina monoclonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatías biclonales pueden ser confusas. El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta útil en la monitorización del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a distinguir la condición benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de 2 g/100 mi o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una condición maligna. En muchas inmunocítopatías malignas, la concentración de inmunoglobulinas no monoclonales se encuentra reducida. Asi, una deficiencia de inmunoglobulinas policlonales sugiere la malignidad. Paradójicamente el paciente que posee una inmunocitopatía maligna es inmunodeficiente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobulinas "sin sentido" producidas por un clon de células linfoides mal controlado.
Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijación (IFE) son muy útiles en la detección de proteínas monoclonales. Asi, en pacientes que presentan signos sospechosos, síntomas o especialmente cuando se detectan signos hematopatológicos en sangre periférica, médula ósea o ganglios linfáticos, un IEP puede dar un diagnóstico. El que una electroforesis de proteina sérica deba preceder a una IEP o IFE depende de la disponibilidad relativa de estas técnicas y de la sofisticación de cada laboratorio. Por ejemplo, una electroforesis en agarosa de proteínas séricas detecta la mayoría de los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato de celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE es revisando las determinaciones electroforéticas de las proteínas séricas. Otra manera de abordar el análisis sugerida por Keren y sus colaboradores (Keren, 1988) consiste en determinar los valores del suero y la relación K/X conjuntamente con una electroforesis de alta resolución. La inmunofijación del suero se realiza si no se detectan anomalías en la electroforesis, ni hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobulinemia. y si la relación K/X no se encuentra dentro de los valores de referencia. También se recomienda la inmunofijación del suero cuando la relación K/X es normal pero aparece una banda no identificada en la electroforesis. La IEP es una técnica sensible y relativamente sencilla empleada para detectar componentes M y sus cadenas pesadas y ligeras. Permite una semicuantificación de la concentración de las inmunoglobulinas. El suero de pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un grupo •normal". Por ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se hacen porciones de 1 mi que se congelan rápidamente en hielo seco y acetona y se conservan a -70 °C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a congelar sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 °C.
Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: antisuero completo humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K y anti-A (Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros son semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un componente M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrarse con un segundo antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe compararse con un suero control para su actividad mediante una difusión en gel, y para su especificidad con suero humano completo mediante IEP. La interpretación de una IEP puede requerir una considerable experiencia, pero generalmente uno busca una variación de una linea normalmente uniforme, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene diferente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es una técnica útil pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia de cadenas pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectivamente una molécula de inmunoglobulina compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras. También es posible, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos monoclonales por debajo del límite de detección del sistema empleado. El umbral de detección puede determinarse diluyendo un anticuerpo monoclonal conocido y probándolo en IEP. Debido a que proteínas monoclonales pertenecientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en cantidades relativamente pequeñas en comparación con la IgG, la cadena ligera de la inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapacidad para detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en menor concentración en presencia de una mayor concentración de IgG, se denomina efecto sombra (umbrella eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios otros procedimientos para descartar la enfermedad de Franklin o de cadena pesada. Es posible que el suero que se está testando y el anticuerpo que se está utilizando no estén a la concentración adecuada y que no se detecte el componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que se está usando no detecte los determinantes disponibles de un componente M concreto. Si uno tiene una importante sospecha, puede ser útil utilizar un segundo antisuero de distinto origen.
Inmunofijación La IFE prácticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clínico debido a su rapidez, sensibilidad y facilidad en la interpretación; ambos procedimientos son comparables en cuanto a sensibilidad. La IFE además posee la ventaja de dar un resultado más rápido ya que no requiere la difusión a través de gel. Muestras de suero del paciente se someten por duplicado a una electroforesis en gel de alta resolución antes de añadir un antisuero monoespecífico directamente sobre las proteínas separadas. Se lava el gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tiñen y miden directamente (Fig. 37-7). De vez en cuando, la concentración de una proteína monoclonal en el suero de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para lormar complejos que precipiten por IFE. Este fenómeno se corresponde con la zona de exceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un halo de complejos precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la equivalencia) con una zona central clara donde existe el exceso de antígeno. Aunque este resultado parece atípico, se puede interpretar y comprobar de forma directa repitiendo el IFE con una mayor dilución del suero del páctenle (Keren, 1999). Cualquiera de las dos técnicas puede aplicarse a otros fluidos corporales, siendo la orina el más común. Se pueden detectar cadenas ligeras monoclonales en la orina (proteína de Bence Jones) de más de la mitad de los pacientes con mieloma múltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974). Cadenas ligeras policlonales pueden detectarse en pacientes con otros trastornos, normalmente formando parte de moléculas de inmunoglobulina completas. La detección de la proteína de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. La IEP/IEF de orina es más específica y más sensible que otros ensayos de Bence Jones más antiguos. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con suficiente proteina o tras concentración por liofilización o mediante membranas selectivas (Minicon, Amicon). La medida de la viscosidad del suero se estudia en el Capítulo 27.
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL •I
v
Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijación del suero Se sometieron por duplicado muestras de suero de un paciente a una electroloresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las proteínas separadas reaccionan con un antisuero monoespecilico, los geles se lavaron, fijaron y tiñeron. SP o SPE = muestra que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reacción con el antisuero: G o IgG = muestra que ha reaccionado con anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha reaccionado con IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reaccionado con anli-IgM. K o anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccionado con anti- . A. "normar. B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente M de cadena .
Prevención de las enfermedades y terapia La inmunización pasiva es la administración de anticuerpos preformados obtenidos de otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o de una especie diferente ( -globulinas heterólogas); proporciona una protección inmediata frente a la infección. La inmunidad dura poco y decae a medida que los anticuerpos se utilizan y catabolizan. La protección pasiva durante el periodo neonatal se basa en la transferencia de anticuerpos maternos a través de la placenta o el calostro (Pennington. 1991). Grupos de -globulinas humanas son útiles para la protección temporal frente a varias infecciones víricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstróm, 1990; Desai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de administración, la enfermedad puede modificarse a una forma más suave o puede prevenirse por completo. El efecto es más completo y predecible si se usan preparaciones hiperinmunes preparadas a partir del plasma de individuos que están convaleciendo de la enfermedad en cuestión o que se han inmunizado
frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentración más elevada de anticuerpos específicos. También se pueden producir anticuerpos en animales, como pueden ser los caballos, y en el pasado han tenido una importante aplicación. Sin embargo, la sensibilización a proteínas externas puede desencadenar reacciones clínicas como la anafilaxis, enfermedad del suero, pirexia y reacciones de Arthus locales. Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas áreas de la medicina, incluyendo la investigación, diagnóstico y terapia. Se han desarrollado anticuerpos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Mountain, 1992: Morrison, 1992; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos monoclonales. que a menudo reemplazan a los antisueros policlonales. se usan con fines diagnósticos (Véase Cap. 35). Quizás las aplicaciones terapéuticas más importantes se ven en el campo del trasplante y la oncología (Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo monoclonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea como terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotóxicos en
CAPÍTULO 37
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
891
Isobe T. Osserman EF: Pathologic conditions associated with plasma cell dyspasias: A study of 806 cases. Ann N Y Acad Sci 1971. 190 507 Karplus M. McCammon JA: Dynamics of proteins: Elements and function. Annu Rev Biochem 1983; 53:263 Kelly RH, Tardy TJ, Shah PM. Benign monoclonal gammopathy A reassessment of the problem. Immunol Invest 1985; 14:193. Keren DF: Procedures for the evaluation of monoclonal immunoglobulins Arch Pathol Lab Med 1999:123:126. Keren DF, Warren JS. Lowe JB: Strategy to diagnose monoclonal gammopathies in serum: High-resolution electrophoresis, immunofixation and kappa/lambda quantification Clin Chem 1988: 34:2196. Kyle RA: Monoclonal gammopathy ol undetermined significance (MGUS): A review. Clin Haematol 1982:11:123. Lefrano G. Lefrano MP: Antibody engineering and perspectives in therapy Biochemie 1990: 72:639. Lichtman MA, Vanghan JH. 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Fekade D, Knox K, Hussein K, et al: Prevention of Jarisch-Herxheimer reactions by treatment with antibodies against tumor necrosis factor
C A P Í T U L O
1
38
Complemento y cininas: mediadores de la inflamación
Eric Wagner, PhD. Haixiang Jiang, M.D., PhD Michael M. Frank, M.D. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO
Enfermedades dermatológicas 892
Enfermedades hematológicas
Nomenclatura
Enfermedades neurológicas
C3: molécula central de las vías de activación
Enfermedades cardiovasculares
del complemento
Biocompatibilidad
Vía clásica
Trasplante de órganos
Vía alternativa
UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES
Vía de la lectma fijada a mañosa
DEL COMPLEMENTO
Componentes finales del complemento
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
Anafilotoxinas
Evaluación funcional de la vía clásica
Receptores del complemento
Manejo de las muestras
Biosíntesis del complemento
Preparación de eritrocitos Preparación de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos
Genética del complemento Complemento e inmunidad adquirida 902
COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD
Ensayo del complemento hemolítico total Ensayo de la vía alterna
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD
906
Principios generales
Regulación de la activación del complemento
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO
906
903 903
Enfermedades reumatológicas
Niveles del complemento mediante ensayos antigénicos Prueba de fijación del complemento CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN DE CININAS
910
BIBLIOGRAFÍA
910
Enfermedades infecciosas Enfermedades renales
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO El término "complemento" se refiere a un grupo de glicoproteínas circulantes que funcionan facilitando la inflamación y realizan un importante papel en la defensa del huésped. El daño tisular incontrolado es una posible complicación de la activación del complemento, y existen una gran variedad de glicoproteinas circulantes así como proteínas tisulares de unión a membrana que funcionan regulando la actividad del complemento y disminuyen la agresión del complemento. La existencia de este sistema de proteínas fue inferido en los últimos años del siglo xix cuando quedó claro que el suero fresco tenía la posibilidad de lisar bacterias Gram negativas y vibriones cólera en presencia de anticuerpos específicos. A medida que las técnicas para la purificación y la identificación de proteínas se hicieron más sofisticadas con los años, quedó claro que había un sistema muy complejo con muchas proteínas interaccionando. En general, el sistema funciona identificando células y microorganismos extraños y destruyéndolos Esto ocurre por lisis directa, por opsonización (el proceso de cubrirlos con péptidos específicos del complemento reconocidos por receptores específicos de los fagocitos para producir su ingestión) o provocando infla-
mación con la atracción de células fagocitos. También ha quedado claro que el complemento juega un papel para facilitar la respuesta inmune. El sistema de proteínas del complemento es más antiguo filogenèticamente que la inmunidad adquirida (anticuerpo) y está presente en muchos organismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un nivel de inmunidad natural y defensa del huésped incluso en ausencia de anticuerpos. Esto lo hace a través de la vía de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la vía alternativa del complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporcionan un nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defensa del huésped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del descubrimiento del complemento y de las diferentes vias del complemento (Frank. 1998).
Nomenclatura Hay tres vias pnncipales de activación del complemento en el suero humano: la vía clásica, la vía alternativa y la via de la MBL (o vía de la MBLectina). La Figura 38-1 muestra la secuencia de reacción de cada vía. La Tabla 38-1 proporciona información especifica sobre cada proteina del complemento plasmática La nomenclatura para las proteínas del sistema del complemento
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
C5b678(9)n
893
Complejo de alague de membrana
Figura 38-1. Los componentes de las vías clásica, MBIecitina y alternativa convergen para formar una convertasa que degrada al C3. En la via clásica, el complejo antigeno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la vía de la MBIectina, la interacción de la MBL con un carbohidrato en la superficie de un microorganismo origina la formación de un complejo enzimático (MBL-MASP-l-MASP-2, llamado M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C3 sufre la hidrólisis de su enlace tiol-ésler. lo que induce un cambio en su conformación. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para formar una convertasa que es estabilizada por la properdina (P). El C3b, el producto de degradación del C3, también tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz de activar la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vías continúa secuencialmente mediante la unión con los componentes de aparición final hasta que la secuencia de activación se completa.
generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por razones históricas, las nueve proteínas de la vía clásica se nombran por la letra C seguida del número que cuenta su orden de aparición en la secuencia de reacción. Una excepción importante es C4, que aparece antes que C2. Las moléculas que son parte del complejo C1 se denominan Clq, Clr y Cls. Las proteínas que reaccionan únicamente en la vía alternativa son llamadas factores y se denominan con una letra mayúscula (p. ej., factor B. factor D). Además, los fragmentos de las proteínas del complemento resultantes de la ruptura proteolítica se denominan con una letra en minúscula (p. ej.. C4a, C4b) donde a representa el fragmento pequeño y b representa el fragmento grande. La excepción a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande y C2b es el fragmento pequeño. Los posteriores fragmentos degradantes de los fragmentos grandes del complemento en un componente son denomina-
dos con una letra en minúscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han perdido su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minúscula (p. ej.. iC3b, iC4b). Las cadenas polipeptídicas de la proteína nativa del complemento se denominan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq, cuyas cadenas son denominadas A, B y C. Los componentes simples o complejos multicomponentes que tienen actividad enzimática se denominan con una barra sobre el componente o los componentes. Las proteínas de la recientemente descrita vía MBLectina son denominados con las abreviaturas de los nombres de las proteínas (p. ej., MBL para lectina lijada a mañosa, MASP para la proteinasa sérica asociada a la MBL). Las proteínas reguladoras son denominadas con un lítulo o una letra descriptiva (p. ej.. proteína unida a C4, factor H). Las proteínas reguladoras de unión a la membrana han sido denominadas con números CD y títulos descriptivos (p. ej., proteína
894
SECCIÓN V
Tabla 37-8
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Proteínas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o
Proteina Común a todas las vias C3 Via clásica C1q Cir C1S C4 C2 Via alternativa Factor B Factor D Properdina Vía MBLecitina MBL MASP-1 MASP-2 Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7 C8 C9 Proteínas de control C1inh C4bp Factor I Factor H Proteina S Clusterin Factor J
P e s o molecular (kDa)
Localización c r o m o s o m i c a
185
19p13.3-p132
1 200-1.300
460 85 85 205 102
1p34.1-36.3 12p13 12p13 6p21.3 6p21 3
150 50 50 300-600 20
93 24 55 (monomoro)
6p2t 3 Desconocido Xpl 1 4-p 11 2
200 2 25
200-400 93 7C
10p11 2-q21 3q27-28 1p36 3-36.2
0.002-10 1,5-13 Desconocida
190 110 too 150 70
9q33 5p13 5p13 1p32 (cadenas u y ß) 9q22 3-q32 (cadena y) 5p13
80 45 90 55 60
105 550 88 150 84 70 20
11q11-q13.1 1q32 4q25 1q32 17q11 Desconocido Desconocido
240 250 35 300-450 500 50 -5,4
cofactor de membrana. CD46) y los receptores del complemento son denominadas con números que siguen al pretijo CR (para los receptores del complemento 1 a 4). Los otros receptores del complemento se denominan con símbolos del complemento seguidos por la letra mayúscula R.
Concentración (mg'ml)
En presencia de un aceptor adecuado, el tiol-éster interno puede no sufrir la hidrólisis y degradarse, pero puede reaccionar con un nucleófilo en una célula diana para formar una unión amida o éster con el sustrato diana del complemento de ataque. De este modo, la activación del C3 con la consiguiente degradación del tiol-éster puede originar una unión covalente de la molécula de C3 a ia superficie de la célula diana. C3: molécula central de las vías de activación Así queda cubierta una diana con C3b. pudiendo interaccionar con las céludel complemento las que expresan receptores de C3b. Estas incluyen todos los fagocitos, los La proteína lamada C3 es fundamental para la función de las tres vias de linfocitos B y una población de linfocilos T, activación del complemento (la via de la MBLectina, la via alternativa y la vía El C3, con su cadena a' unida covalentemente a la diana y la cadena \i clásica) y la comprensión del C3, su mecanismo de acción y sus funciones es unida debido a la unión disulfuro intracatenaria. se denomina C3b (Fig. 38-2). esencial para comprender la activación y la función de todas las vias del comEs la forma en la que el C3 continúa la cascada del complemento conducienplemento. do a la lisis. Además, de esta forma, la molécula puede interaccionar con las El C3 es una molécula de dos cadenas sintetizada en muchas células, pardos glicoproteinas circulantes, los factores H e I. siendo la segunda una enziticularmente en los hepatocitos. formada a partir de una molécula de cadena ma proteolítica que degrada el C3 de la sangre. En la interacción con los facúnica, el pro-C3, y liberado a la circulación. Las dos cadenas (a y p) están tores H e I. un pequeño fragmento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, siguiendo estabilizadas por puentes disulfuro mtracatenario, y hay un puente disulfuro dos degradaciones adicionales de la cadena a en una curva disulfuro dentro intercatenario estabilizando la interacción de la cadena a y la p (Fig. 38-2). de la cadena que conecta las porciones amino y carboxi-terminal de la cadeLas interacciones hidrofóbicas son también importantes, y la reducción de los na a' (Fig. 38-2). Debido a las diferentes uniones disulfuro, la mayoría del puentes disulfuro intracatenano no origina la separación de las cadenas en C3b permanece unido a la diana del complemento. ausencia de agentes que rompan la interacción hidrofóbica. Una vez realizada la degradación del C3b por los factores H e I. todavía En la cadena a del C3. hay un tiol-éster uniendo el sulfhídrilo de la cisterna ocurre otro cambio conformacional. Esta molécula, ahora lamada iC3b. interen la posición 988 con un residuo de glutamina de 3 aminoácidos. Este tiol-éster acciona pobremente con el CR1. el receptor C3bC4b. pero interacciona con interno confiere una estructura inestable a la molécula de C3 El tiol-éster interla integrina p\, CR3 (CDl1b CD18). El iC3b ya no puede interaccionar con las no está oculto en el centro hidrofóbico de la molécula. Puede ser degradado por proteínas de la parte final del complemento para inducir la lisis. la hidrólisis gradual a medida que el agua penetra en la molécula. Es degradaIgual que con el C3b. el iC3b facilita la fagocitosis uniendo la diana del comdo mucho más rápidamente una vez degradada la cadena alfa del C3 con libeplemento a los fagocitos mediante los receptores de iC3b. Estos incluyen ración del C3a (fragmento de 9 kDa) en el extremo amino-terminal de la cadetodos los lagocilos y los macrófagos, pero no incluyen los linfocilos B o las na a. La cadena restante se lama a'. El C3 nativo, presente en 1,2 mg'ml en células T. En presencia de CR1, el C3b y el iC3b pueden sufrir posteriores el plasma normal, no interacciona con las células que expresan receptores de degradaciones por el factor I. En ese caso, una degradación adicional se proC3. Sufre una gran alteración conformacional con la degradación del tiol-éster duce en la porción amino-terminal de la cadena (/.. Una porción de 41-kDa de interno. El C3 con el tiol-éster hidrolizado interactúa con las células que exprela cadena a unida por enlaces amino o éster a la diana permanece detrás, y san receptores de C3b. especialmente CR1 (receptor C3b C4b, CD35). es liberado el C3c. que contiene las porciones amino-terminal y carboxi-ter
CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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mínal del C3b. unidas por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro a convertasa de la vía alternativa descrita antes, degrada las moléculas adiciola cadena |5 (Fíg. 38-2). La porción restante unida covalentemente a la diana nales del C3 continuando la cascada del complemento {vide mira). se denomina C3dg y puede sufrir una posterior degradación a C3d. De nueDatos recientes sugieren que existe una vía MBLecitina que actúa via MBL vo, existe un receptor específico para el C3d y para el C3dg (CR2, CD21). y serin proteasas lamadas MASP-1 y MASP-2 ya sea para la degradación Este receptor está presente en todos los Imfocitos B, en algunos linfocitos T directa del C3 por una de las enzimas MASP o para la activación de la vía cláy en algunas células epiteliales, pero no está presente en los fagocitos. Se sica para formar la C3 convertasa de la vía clásica. En cualquier caso, el C3a analiza con más detalle posteriormente. se degrada de C3. El tioléster es degradado y la molécula entonces es capaz de unirse a las dianas. Debe quedar claro que el C3 sufre una hidrólisis o la El C3 en su configuración nativa no activa la via alternativa. Sin embargo, escisión a C3b, una posterior degradación a iC3b, y después la posterior el C3 (H 0) (también lamado iC3) y el C3b interaccionan con los factores proteicos D, B y properdina de la via alternativa para formar una nueva enzi- degradación a 3dg y a C3d. Los diferentes receptores celulares interaccionan ma, el C3bBb. la convertasa da la vía alternativa. Esta enzima es capaz de con el C3 en etapas específicas en la vía de degradación. degradar posteriormente el C3 separando la cadena a de las moléculas adiDe este modo, el C3 representa la proteina central de las tres vias del comcionales del C3 nativo. La hidrólisis interna gradual del C3 a C3(H-,0). por lo plemento. La proteina no interaccíona con ningún receptor en su lorma natitanto, puede mediar la activación de la vía alternativa activando el C3 a una va. Debe ser hidrolizada para activar la vía alternativa e mteraccionar con los configuración hidrolizada de C3. uniendo los factores B. D y properdina y receptores de C3b. La separación del C3a de su cadena a produce el mismo degradando moléculas adicionales de C3. Esto se denomina "señal" interna efecto. Esto puede ocurrir a través de la activación de cualquiera de las tres y se cree que es bastante importante en la activación inicial del C3 por la vía vías del complemento. La posterior degradación, como se describió, conlleva alternativa. a una progresiva interacción con los receptores en diferentes etapas de las células presumiblemente mediando la fagocitosis por un lado y la regulación El anticuerpo y los componentes de la vía clásica originan la producción de de la respuesta inmune por el otro. una vía clásica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, como la C3 2
Figura 38-2. Secuencia de degradación del C3 e inactivación del C3b. El peso molecular aproximado de cada cadena o fragmento se da en kilodaltons. Las enzimas y cofactores responsables de cada degradación (designados en letras mayúsculas) son: A. C3 convertasa: B, factor H o CR1 + factor I; C. CR1 + factor I; D, tripsina, elastasa o plasmma.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
al anticuerpo Ig G cuando esta inmunoglobulina es la iniciadora de la activación de la vía clásica del complemento (Brown. 1983). El nuevo complejo generado (C4b2a3b) representa la C5 convertasa de la vía clásica y dispara la sedimentación de los componentes finales del complemento en la superficie diana. La IgM y la IgG difieren en su capacidad para activar la vía clásica del complemento. Parece que una molécula simple sobre todo de anticuerpos Ig M unida por múltiples lugares del anticuerpo a un antígeno puede unir una molécula de C1 y disparar una secuencia completa de activación del complemento. La Ig M. con sus cinco sitios de unión antigénicos, adopta una conformación "básica" en la superficie antigénica para permitir múltiples interacciones con los antígenos. En contraste, la unión del C1 a la Ig G requiere dos moléculas de Ig G una al lado de la otra en la mayoría de los estudios experimentales (Borsos, 1965). Ya que los anticuerpos Ig G se unen a una superficie diana de forma aleatoria y ya que los antígenos pueden no ser distribuidos de forma uniforme en un organismo diana, puede ser necesaria la unión de cientos o miles de Ig Gs para generar un lugar de unión para el C1. La activación de la vía clásica por el complejo Ig G-antígeno también parece facilitar la vía alternativa (véase siguiente sección) sobre la superficie del activador (Moore, 1981).
Vía clásica
La activación de la via clásica del complemento, descrita alrededor del año 1900. fue la primera en ser estudiada. Esta via es responsable de la activación del complemento en la mayoría de las células sensibilizadas con anticuerpos. Los detalles de esta vía están publicados en otras obras (Volanakis. 1998: Fries, 1987). Nueve proteínas numeradas componen la vía clásica. La activación de la via clásica normalmente requiere la interacción entre un antígeno y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglobulina M (Ig M) y la Ig G son efectivas en activar la via clásica. La eficacia de la activación de la vía clásica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig G3>lg G1>lg G2; la Ig G4 no es capaz de activar el complemento. Interesantemente, un número de moléculas, diferentes de las inmunoglobulinas. tiene la capacidad de activar la via clásica a través de la interacción directa con el C1q. Estas incluyen la proleína C reactiva, el componente sérico del amiloide P, el fi-amiloide. algunas bacterias gram negativas, ciertos virus, el micoplasma, protozoos y componentes intracelulares como el ADN, las membranas mitocondriales y los filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesantemente, las células apoptóticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capaLa capacidad de las inmunoglobulinas agregadas para unir el Ciq ha procidad de activar la vía clásica. Esto puede ser de importancia crítica en la eliporcionado las bases para un número de pruebas diseñadas para detectar la minación de las células apoptóticas de la circulación. presencia de complejos inmunes solubles en las muestras de sangre de los pacientes. El C1q radiomarcado se añade a la muestra de suero o de plasma, Nos centraremos en la activación del complemento como sucede en las dianas sensibilizadas a anticuerpos. Una vez unida la inmunoglobulina al objetivo, y se usa una de las técnicas existentes para separar el Ciq libre del unido a los componentes proteicos del suero. El Ciq unido sugiere la presencia de comel C1 se une a la inmunoglobulina y se activa. La naturaleza precisa de la interplejos de inmunoglobulinas en la muestra de suero o de plasma (Zubler. 1976). acción antígeno-anticuerpo-C1 no está clara. El C1 es una macromolécula de 740 kDa que consta de una molécula simple de C1q compleja con dos cadenas C1r y dos cadenas C1S unidas todas en presencia de iones calcio. El C1q está Vía alternativa formado por seis subunidades, cada una conteniendo tres cadenas polipeptídicas (designadas A. B y C). Las tres cadenas forman una triple hélice parecida al La presencia de una segunda vía de activación del complemento fue colágeno con regiones globulares que constituyen la porción carboxi-terminal de propuesta por primera vez por Piilemer (1954) pero fue aceptada por la la molécula. El C1q se une a las inmunoglobulinas a través de sus cabezas glo- comunidad científica dos décadas después. Esta vía de activación del combulares, mientras que se une a otros activadores de la vía clásica como la proplemento parece ser importante en la defensa precoz contra los microorteina C reactiva y el ADN a través de su región parecida al colágeno. Las cadeganismos patógenos (Pangburn. 1984). Los anticuerpos pueden activar la nas C1r y C1S se unen a la región similar al colágeno del C1q. Se sabe que el via pero normalmente no son necesarios. El comienzo de la via alternativa primer componente de la via clásica, el Ciq. se une al dominio Cy2 de la Ig G o en la superficie de un aceptor depende de la capacidad del grupo carbonil al dominio Cu3 de la Ig M. Una vez unido a la inmunoglobulina, el C1q adopta del grupo tioléster expuesto del C3b de interaccionar ya sea con un grupo un cambio conformacional que conlleva la autoactivación de las dos cadenas amida o con uno hidroxilo de la proteína o del carbohidrato presente en la C1r. Se cree que esto origina la degradación de las dos cadenas C1r para crear superficie del objetivo (Law, 1979). La generación del C3b se consigue por un sitio activo enzimáticamente en cada cadena. El C1r activado se escinde la denominada C3 convertasa de iniciación. En el suero, el C3 es hidrolientonces en dos cadenas C1s. Este C1 "activado" es una proteasa y tiene ade-zado a un índice de 0,2% a 0,4% del depósito plasmático por hora (Pangmás, en algunos sistemas modelo, actividad estearasa. El C1s aclivado degra- burn, 1981). El C3 con un tioléster hidrolizado sufre un cambio conformada el siguiente componente de la cascada, el C4. El fragmento mayor, C4b, se cional que le permite interaccionar con las proteínas que no interaccionan une a la superficie del activador, mientras que el fragmento pequeño, el C4a, es con el C3 nativo y se denomina C3(H,0) (también lamado iC3). El 03(^0) liberado en la fase de fluido. El C4a es una anafilotoxina y se describe en otra entonces tiene la capacidad de interaccionar con el factor B en presencia sección de este capítulo. El C4b es altamentente reactivo químicamente durande iones magnesio. El factor B. una vez unido al C3(H,0), puede interacte unos momentos después de la degradación del C4 y puede unirse a la super- cionar con el factor D y es degradado para generar la convertasa de inificie del activador. La unión a la superficie del activador es relativamente ineficaz. ciación C3(H;0)Bb y liberar un pequeño fragmento, el Ba. Esta degradaPor lo tanto, la mayoría del C4b generado es hidrolizado y permanece en la fase ción es mediada por el factor D, una proteasa sérica que adopta una de fluido. De cualquier manera, algunas de las moléculas de C4b generadas se configuración activa una vez reconocido su sustrato y vuelve a una conforunen a la superficie del activador como un grupo alrededor del lugar antígenomación inactiva una vez que se produce la degradación proteolítica (Volaanticuerpo-Cl. Un lugar simple antígeno-anticuerpo-C1 puede entonces condunakis, 1996). La convertasa de iniciación C3 degrada el C3 para generar cir a la sedimentación de muchas moléculas de C4b. un C3b metaestable a un índice constantemente bajo en la circulación. El C3b metaestable puede unirse covalentemente a la superficie del activador En presencia de iones magnesio, el C4b actúa como un lugar para la unión y entonces, como el C3(H 0). unirse al factor B. Se ha propuesto que la y posterior degradación del C2. El C1s, en asociación con el C4b. degrada el presencia de ácido siálico en las glicoproteínas y glicolípidos asociados a C2 en dos fragmentos. El fragmento mayor. C2a, permanece unido al C4b, la membrana previene la formación de una C3 convertasa de la vía altermientras que el pequeño, el C2b. se libera en la fase liquida. Esle complejo nativa aumentando la afinidad del factor H (véase después en Regulación molecular (C4b2a) es inestable y tiene una vida media relativamente corta debide la activación del complemento) para el C3b (Kazatchkine, 1979). Como do a la desintegración que resulta de la disociación de C2a en una forma inacen la C3 convertasa de iniciación, el factor D degrada al factor B para tiva. Este complejo (C4b2a) representa la convertasa C3 de la vía clásica requegenerar la C3 convertasa de unión celular C3bBb. Este complejo se desinrida para la unión y degradación del C3. El C2a en el complejo C4b2a es la tegra rápidamente pero es estable una vez unido a la properdina. que proenzima que degrada el C3 en la siguiente etapa de la cascada de activación y longa la vida media de la C3 convertasa de uno a dos minutos a 18 minudel C5 en una etapa posterior. El C2a degrada el C3 en un fragmento grande, tos (Fearon, 1975). Esta C3 convertasa estabilizada rápidamente degrada el C3b, que se une a la superficie del activador, y un fragmento pequeño, el más C3, que puede unirse a la superficie del activador y entonces se conC3a. que es liberado en la fase de fluido y sirve como una anafilotoxina. Como sidera como la amplificación de la C3 convertasa de la vía alternativa. Esta en el caso del C4. no todo el C3b se une a la superficie del antigeno objetivo. amplificación del C3b depositado en la superficie del activador permite la En algunos sistemas modelo, alrededor del 5% del C3 activado se une al objeformación de una C5 convertasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la tivo. Además, en algunos modelos, un alto porcentaje del C3 del objetivo se une 2
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CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
capacidad de disparar la activación de los componentes terminales del sistema del complemento.
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embrago, es necesaria la inserción de múltiples copias de C9 a través de la bicapa lipídica a través de la interacción inicial con la cadena a del C8 para producir la completa actividad citolítica del MAC (Plumb. 1998). Se cree que el complejo C5b-8 sirve como un iniciador para la polimerización del C9 en Vía de la lectina fijada a mañosa la membrana celular. El MAC, por microscopía electrónica, muestra una estructura parecida a un cilindro hueco formada por el ensamblaje de sus Recientemente se ha descrito una tercera via de activación del complecomponentes en presencia de un exceso de C9 (Podack. 1984). El mecamento que utiliza una proteina sérica, presente en alrededor de 1.5 ug mi. nismo por el que el MAC rompe la membrana celular todavía es controverla MBL (también lamada lectina unida a mañosa o proteína fijadora de tido y puede incluir la distorsión de la bicapa lipídica para formar parches mañosa). La MBL está presente en todos los mamíferos y pájaros, y peragujereados" (Esser, 1991) o, más probablemente, la lormaaón de un poro tenece a la familia de moléculas lamadas colectmas (Turner, 1996: Epstransmembrana con un centro hidrofílico a través del que los iones pueden tein, 1996). La familia de las colectinas incluye, además de la MBL, las propasar libremente (Bhakdi. 1991). La formación del MAC induce la lisis de teínas del surfactante pulmonar A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina ciertas bacterias y virus, y de eritrocitos heterólogos. La mayoría de las y la CL-43 bovina (Epstein. 1996). La MBL está estructuralmente relaciocélulas nucleadas resisten la citotoxicidad inducida por el MAC. Esta pronada con el C1q. Su estructura primaria es una cadena polipeptidica fortección, especialmente del ataque del complemento por las proteínas del mada por un núcleo colágeno y un dominio globular carboxi-termmal (Hancomplemento propias, es mediada por las moléculas reguladores asociadas sen, 1998). Tres de las cadenas se asocian para formar la subunidad de la a la membrana que previenen la formación del MAC (véase después Regumolécula. En el suero, la MBL se encuentra como una mezcla de dímeros lación de la activación del complemento) asi como por la liberación de proy hexámeros de su subunidad primaria. La MBL reconoce ciertos carbohiteínas del complemento activadas por la sangre de la superficie celular. La dratos expresados en la superficie de los microorganismos (es decir, no lisis de las células nucleadas mediada por el MAC puede ocurrir pero reconoce carbohidratos como la galactosa y el ácido siálico que son los requiere múltiples lesiones por el MAC para producirse (Koski, 1983). Se na azúcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamíferos) propuesto que la pérdida de cantidades subliticas de MAC puede proteger (Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la MBL son: a la célula del consiguiente ataque del complemento (Reiter, 1992). Las mañosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa células nucleadas están protegidas en parte de los efectos del MAC debido (Hansen, 1998). Esto permite a la MBL discriminar entre lo propio y lo a la eliminación activa de la superficie celular a través de la reparación de extraño. Se informó que la MBL reaccionaba con un amplio numero de bacla membrana unida al recambio lipidico (Mold, 1998). La formación del MAC terias no capsuladas Gram positivas y Gram negativas, con virus, levadu- tiene un efecto estimulante sobre muchos tipos de células nucleadas. Entre ras, micobactenas. parásitos y protozoos (Epstein, 1996). Una vez reconootros, estos efectos incluyen la producción de radicales reactivos del oxígecido su carbohidrato ligando, la MBL adopta un cambio conformacional que no por los neutrófilos y los macrófagos, la liberación de eícosanoides por las conleva la activación de dos proteasas séricas asociadas a la MBL, la células tagociticas. la inducción de actividad procoagulante por las plaqueMASP-1 y la MASP-2 (Thiel, 1997). Tanto la MASP-1 como la MASP-2 tas y las células endoteliales. la actividad proinflamatoria en las células muestran homología estructural con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes endoteliales y las células del músculo liso, la proliferación de células del con el complejo C1 (C1qrs). Una vez activada, la MASP-2 degrada el C4 músculo liso y de células endoteliales. y la iniciación de las vias de transpara generar la C3 convertasa C4b2a (Vorup-Jensen. 1998). La MASP-1 ducción de señales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen. tiene la capacidad de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo que 1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993). esto puede desencadenar directamente la activación de la vía alternativa (Schweinle, 1989). Después de la generación de la C3 convertasa de la vía clásica, la C4b2a, por el complejo MBL-MARSP-1-MASP-2, la activación Anafilotoxinas del complemento se produce como en la vía clásica con el posible reclutamiento de la vía alternativa también (Suankratay. 1998). La via de la MBLeLa activación de la vía clásica, alternativa o de la MBLectina del complecitina también puede dispararse por un complejo antígeno-anticuerpo Se mento origina la generación de los fragmentos proteicos de! complemento demostró que una fracción de las moléculas de Ig G que carecen de resique tienen importantes papeles en diferentes funciones biológicas como la duos galactosa terminal (llamados Ig G-GO), tal y como se encuentran en opsonización. la fagocitosis, la inmunomodulación y la generación de reacel plasma de pacientes con condiciones patológicas como la artritis reuciones inflamatorias. La opsonización, la fagocitosis y la inmunomodulación matoide. tienen la capacidad de interaccionar con la MBL y activar la vía dependen en su mayor pane de los receptores del complemento expresados clásica (Malhotra, 1995). La MBL puede jugar un papel en la eliminación de en las diferentes células del cuerpo, y se discuten en una sección posterior. organismos diana por los fagocitos a través de la interacción con un recepComo se discutió previamente, la activación del complemento origina una tor específico presente en estas células (Hansen. 1998: Tenner. 1995). La degradación proteolitica de muchas proteínas del complemento con la consiregulación de la vía de la MBLecitina parece ser mediada por el Cl inhibiguiente liberación en la fase de fluido de pequeños fragmentos que tienen dor (Matsushita. 1996) y por la cx-macroglobulina (Terai. 1995). efectos biológicos. Tres de estos fragmentos liberados se laman anafilotoxinas. Son el C4a. el C3a y el C5a. Las caraclerislicas estructurales y funcionales de estas moléculas se describen en un mlorme excelente sobre el tema (Ember. 1998). El C4a es un péptido de 8.7 kDa liberado del C4 una vez Componentes finales del complemento degradado por el Cls . El C3a es un fragmento peplidico de 9 kDa liberado durante la degradación proteolitica selectiva de la cadena C3r/ por el C2a en Las tres vías principales de activación del complemento convergen en la la vía de activación de la C3 convertasa clásica y MBLectina. También es libeactivación del C3 y en el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana (MAC), que está formado por los componentes C5 a C9, Una vez forma- rado por la degradación proteolitica del C3 por el péptido enzimáticamente activo, Bb, en la via de la C3 convertasa alternativa. El C5a es un péptido de das las convertasas de la via clásica, de la MBLecitina (C4b2a3b) y de la 11 kDa liberado de la cadena a del C5 por la degradación inducida por el C2a alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El fragmento grande (C5b) puede asociarse con la membrana celular e interaccionar con el C6. La siguien- en la vía de la C5 convertasa clásica o MBLectina o por el Bb (y quizás en la MBLectina) en la vía de la C5 convertasa alternativa. En general, las anafilote etapa incluye la interacción del complejo C5b-6 con un fluido fase C7 forloxinas se definen por sus efectos biológicos sobre las células del músculo mando un complejo triménco con propiedades anfifílicas (alta afinidad por liso, los maslocitos, los pequeños vasos sanguíneos y los leucocitos de sanlos constituyentes lipidíeos de la membrana celular) (Podack, 1979). El C5bgre periférica. Los efectos específicos mediados por estos péptidos incluyen 7 se inserta en la bicapa lipídica de la membrana celular pero no es suficiente para que ocurra la lisis celular. El C8 se asocia con este complejo tri- la degranulación de los mastocitos y los basófilos con la consiguiente liberación de diferentes mediadores como la histamina o la serotomna. Además, molecular a través de la interacción con el C5b expuesto. El complejo C5b-8 inducen la agregación neulrofílica humana, la contracción del músculo liso, el penetra a través de la bicapa lipídica para formar un pequeño poro transmembrana y puede originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin aumento de la permeabilidad vascular, la inducción de la liberación de tromL
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boxano de los macrólagos del conejilo de Indias, y la estimulación de la Reguladores del fluido sanguíneo secrección de moco por las células caliciformes (Marón, 1985). Un efecto importante de las anafilotoxinas sobre los basófilos es originar vasodilatación El control del primer componente de la via clásica, el C1. está mediado a través de la liberación de histamina, conduciendo a un aumento del flujo sanpor el C1 inhibidor (C1inh). El Clinh es una proteína altamente glicosilada guíneo en el lugar de la inflamación. La función del C4a generalmente es simide 105 kDa que tiene la capacidad de disociar el C1 activado (Davis. 1989). lar a la del C3a. Sin embargo, el C4a es mucho menos efectivo en sus efectosEl Clinh inhibe la autoactivación del C1. la activación del C1 en el fluido sanbiológicos sobre una base molecular. El C5a es sin duda la más potente de las guíneo, y la activación del C1 en la superficie de los activadores de la vía cláanafilotoxinas humanas. Por ejemplo, el efecto del C5a es 200 veces mayor sica pero no en la mayoria de los complejos inmunes (Doekes. 1983). El Clinh que el del C3a y 3.000 veces mayor que el del C4a originando la contracción es un inhibidor serín proteasa (serpin) que disocia el complejo C1 activado del músculo liso del Íleon del conejilo de Indias Debe observarse, sin embaruniéndose a las subunidades de C1r y C1s del complejo. Mientras el C1q per go, que la relativa efectividad de estos péptidos es tanto específica de tejido manece en la superficie del activador, el C1r y el C1s son liberados al fluido como de especie. Se ha sugerido que el C3a es efectivo selectivamente sobre sanguineo en forma de dos complejos de Ciinh-Clr-Cls-Clmh (Ziccardi. los eosinófilos localizados en los lugares alérgicos, mientras que el C5a tiene 1979). Recientemente, se propuso que el Clinh tiene la capacidad de separar efecto en muchos otros tipos celulares (DiScipio. 1999). el complejo Clqr s entero de las inmunoglobulinas que tienen una baja afinidad por el Clq (Chen, 1998b) o de objetivos sensibilizados con dosis bajas de Además de este papel como anafilotoxina. el C5a tiene otras muchas proIg G humana (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh inactiva la manosa fijadora de piedades biológicas importantes. La unión del C5a a los neutrólilos origina un lectina asociada a serín proteasas (MASP) (Matsushita. 1996). El Clinh tamaumento de la adhesión, la agregación y la inducción de una respuesta oxibién inhibe al factor Xlla y a la calicreína del sistema de contacto. Este tema dativa, y la liberación de enzimas lisosómicas. Además, el C5a es fuertemenserá tratado en la sección Cinmas y el sistema de generación de Cinmas. Intete quimiotáctico para los monocitos y los neutrófilos. induciendo la migración resantemente, el Clinh demostró interferir con la proliferación in vitro de los linde las células hacia la fuente de activación del complemento. De este modo, focitos T y con el desarrollo de linfocitos T citotóxicos bloqueando la degradauna reacción inflamatoria de activación del complemento local puede por tanción de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina por los linfocitos T to inducir un aumento del flujo sanguíneo al tejido, la adherencia de los neuactivados y por el C1r (Nissen. 1998). Sin embargo, la relevancia in vivo de trófilos al endotelio local, y la migración directa de los fagocitos a los lugares estos hallazgos no está aún clara. Se ha informado una proteina de 20 kDa inflamatorios. Los neutrófilos agregados por el C5a pueden embolizar al pulcon actividad inhibitoria sobre la función C1. lamada factor J (Lopez-Trascasa. món, originando cambios en el intercambio gaseoso pulmonar e incluso la 1989). Se informó que inhibía la formación del complejo C1 (Lopez-Trascasa. muerte. Se cree que mucha de la inflamación de los pulmones causada por 1989) y después actuaba sobre la vía alternativa inhibiendo la degradación del la formación del complejo inmune está mediada por el C5a (Ward, 1997). En un modelo experimental de sepsis en ratas, se ha demostrado recientemente C3 por el factor B (González- Rubio. 1994) La defensina, péptido-1 neulrofílico humano (HNP-1 ). también puede inhibir al C1 en los lugares de inflamación. que el C5a puede bloquear las funciones bactericidas de los neulrófilos si se Se demostró que se unía al C1q en el fluido sanguíneo y bloqueaba la activaproduce en cantidades suficientes, sugiriendo un papel para la activación del ción del complemento mediada por la via clásica (van den Berg. 1998). complemento en los altos índices de mortalidad observados en la sepsis (Czermak. 1999). La actividad del C4b es regulada por el factor I (antes denominado inactivaLos efectos biológicos de las anafilotoxinas están mediados por los recepdor del C3b'4b) (Fries. 1987). El factor I degrada la cadena a del C4b para tores específicos expresados por los dilerentes tipos celulares. Estos recepgenerar dos Iragmentos. el C4c y el C4d; el último fragmento permanece unido tores se describen en la sección de los receptores del complemento. a la célula. Para la proteóhsis se necesita un cofactor. la proteína fijadora de C4 (C4BP). El C4BP es una proteina de 570 kDa que también puede unirse al C4b unido a partículas y sanguíneo, y desplazar al C2a de la via clásica de la C3 Regulación de la activación del complemento convertasa C4bza (Gilgli, 1979). Además, el C4BP circula en asociación con aproximadamente el 60% de la proteina S, un cofactor dependiente de la vitaLos graves efectos de la activación del complemento para inducir el daño tisular requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- mina K para la proteina C mediando la degradación de los factores de la coagulación Va y Villa. Esta asociación inhibe la actividad del cofactor de la proteición diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activación, y (3) proteger las na S (Dahlbáck, 1986) y parece inhibir la activación del factor X a través de las células huésped de la lesión inadvertida. Se ha implicado un potente sistema interacciones del C4BP tanto con la proteína S como con el factor VIII (Koppelde regulación para controlar la activación del complemento en cualquier etaman. 1995). Una proteína de 120 kDa con similitudes estructurales con el C2 pa de la cascada de la activación. Asi existen proteínas sanguíneas o asopero funcionalmente distinta del C2 fue aislada, y puede tener actividad regulaciadas a membrana que desarrollan una acción reguladora en la activación dora sobre el sistema del complemento uniéndose al C4b (Hammer, 1989). del complemento (Tabla 38-2). ?
Tabla 38-2 Proteínas reguladoras del complemento Proteínas
Peso molecular (kDa)
Objetivo
Fases del fluido Cl inhibidor Factor H Proteína fijada a C4 Proteína S (vilronectina) Clusterin Factor J Célula asociada
105 150 550 84 70 20
C1 C3b C4 C5b-7 C5b-7
Disocia el complejo C1 uniéndose al C1r y C1s Colador para la inactivación del C3b por el (actor I Cofactor para la inactivación del C4b por el factor I Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares
C1. C3. B
CR1
190"
C3b. C4b
70 45-70 18-20 65
C3bBb. C4b?a C3b (C4b) C8, C9 C8, C9
Inhibe la formación del complejo C1 inhibe la degradación de C3 por el Bb Disociación de las C3/C5 convertasas cofactor par la inactivación del C3b y el C4b por el factor I Disociación de las convertasas C3/C5 Cofactor para la inactivación del C3b por el factor I Inhibición de la formación del MAC Inhibición de la formación del MAC
DAF (CD55) MCP (CD46) CD59 (protectina) HRF
Mecanismo de acción
•Isoterma más frecuente del CRI CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor acelerador de la degradación, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de restricción homologo
CAPITULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Debido a su papel crucial en las tres vías de activación del complemento, el C3 está bajo un control rígido. El C3b sanguíneo y el C3(H 0) son rápidamente inactivados por el factor I que degrada los tres péptidos unidos de la cadena a' del C3b (Davis. 1982]. generando entonces una lorma inactiva de la molécula, la iC3b. que es incapaz de atraer al C5 o al factor B. Esta degradación mediada por el factor I requiere al tactor H como cofactor. El factor H es una proteína de 150 kDa que se une al C3b y tienen actividad aceleradora de la desintegración a través de la vía alternativa de la C3 convertasa además de su actividad de cofactor para la degradación del C3b mediada por el factor I. Además de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor H se une al C3b unido a la célula y dispara la degradación por el factor I. limitando asi la activación por la vía clásica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degradado en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede ínteraccionar con el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las células fagocíticas y promover la fagocitosis (véase después en Receptores del complemento). ?
Hay un número de inhibidores sanguíneos de los componentes terminales del complemento que previenen la inserción del complejo de ataque a la membrana en las membranas celulares. La proteína S [S-protein). también llamada vitronectina, se une al complejo C5b-7. previniendo así su inserción en la membrana celular (Podack. 1977) e inhibiendo la polimerización del C9 (Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado que la proteína S se une al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al receptor de la cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la proteina S en la regulación de la activación del complemento in vivo es incierta. Peake y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuando el complemento es activado en conejos y que este complejo todavía tiene la capacidad de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de oveja sensibilizados llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Peake. 1996). Clusterin (también llamado Sp-40.40 o apolipoproteína J) es otro inhibidor sanguineo de los componentes finales del complemento. Como la vitronectina. clusterin previene la inserción del complejo C5b-7 en la membrana celular (Choi, 1989) y regula el complejo de ataque a la membrana en los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todavía se desconoce el papel in vivo del clusterin. aunque recientemente se publicó que el clusterin se deposita en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer iVerbeek. 1998). También, se ha publicado recientemente una asociación significativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clínicos del lupus eritematoso sistémico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la inflamación mediada por anticuerpos (Newkirk, 1999).
Proteínas reguladoras asociadas a las células Además de estar regulado en la lase liquida, la activación del complemento también está regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la lesión inadvetida a las células huésped. Algunas de estas proteínas no solo se unen a las proteínas del complemento sino que actúan como receptores. Una de estas proteínas es el receptor del complemento tipo 1 (CR1). La estructura del CR1 se describe con más detalle en la sección Receptores del complemento. La función del CR1 es unirse al C4b y C3b activado y servir como cofactor para la degradación mediada por el (actor I de estos componentes en sus productos de degradación inactivos. Además de servir como colador para la degradación mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 también promueve la degradación posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser degradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la tripsina y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 también tiene una actividad aceleradora de la desintegración hacia las convertasas C3 y C5 de la vía alternativa y la clásica de la activación del complemento. Al unirse a C4b o C3b. el CR1 también desplaza al C2a (vía clásica) o al Bb (vía alternativa), acelerando entonces la eliminación de las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1 promueve la eliminación acelerada de la C3 convertasa unida a la superficie de la vía alternativa mucho más eficientemente que de la vía clásica (Ross. 1982; Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expresa en los eritrocitos, más que sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al trasporte de los complejos inmunes que llevan el C3b a los lugares de degradación de las células de Kupffer del hígado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del complemento, el CR2,
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también tiene la capacidad de servir como colador para la degradación mediada por el factor I de iC3b en fragmentos pequeños (Mitomo. 1987). El control del C4b y C3b depositado en la membrana celular se lleva acabo posteriormente por la proteina cofadora de membrana íMCP, CD46). Esta proteína es expresada en casi todas las células, con la importante excepción de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degradación del C4b y el C3b en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el factor I (Seya. 1986. 1989) pero es incapaz de promover la posterior degradación del iC3b Se informó que el MCP protege a la célula de la activación de la vía alternativa más eficazmente que de la activación de la vía clásica (Kojima, 1993). Se ha sugerido que esta proteína de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en prevenir el daño celular mediado por el complemento en aquellas células en las que se expresa (Liszweski, 1992). A diferencia del DAF. no protege a las células vecinas (viúeintra). Otra proteina asociada a la membrana celular que controla la activación del complemento a nivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la eliminación (DAF. CD55). El DAF es expresado por todas las células de la circulación, las células endoteliales y un número de células epiteliales iMorgan. 1994b). Esta proteína de 70 kDa lunciona. como su nombre implica, acelerando la eliminación de las C3 y C5 convertasas tanto de la via clásica como de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor capacidad de afectar a la C3 convertasa de la vía clásica que a su contrapartida de la vía alternativa (Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociación del C2a y el Bb de las C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que tienen la capacidad de bloquear la unión de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF está unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol más que por un dominio hidrofóbico transmembrana, que ofrece a la molécula una gran mobilidad y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del complemento (Davitz. 1987). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para la degradación del C3b y C4b mediada por el fador I. El control de los componentes finales del complemento en la superficie celular se lleva a cabo por dos proteínas unidas al glicosil fosfatidilinositol. llamadas factores de restricción homólogos (HRF) o proteina fijadora de C8 y CD59 (también llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la lisis reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritro citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrófilos y los monocitos (Morgan. 1994b). El HRF funciona uniéndose al C8. inhibiendo la polimerización del C9 (Morgan, 1994b). Otra proteína que inhibe el complejo de ataque a la membrana es el CD59, El CD59 es una proteína de 20 kDa que se encuentra en una amplia variedad de células incluyendo todas las células circulantes, las células endoteliales, las células epiteliales, los espermatozoides, los podocitos glomerulares. numerosas líneas celulares (Morgan. 1994b) e incluso las células del cerebro (Morgan. 1996). Se demostró que se unía tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del C9 (Chang. 1994). Inhibe la formación del MAC sobre las células huésped y actúa de un modo intrínseco, esto es, proteger a la célula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y CD59 están ausentes en las células de los pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). debido a la unión de su glicosil fosfatidilinositol a la membrana celular (Volanakis. 1998).
Receptores del complemento Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento han sido descritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efectos biológicos de los péptidos de activación del complemento y están unidos a muchas otras funciones celulares (Tabla 38-3). Esto será descrito para cada receptor del complemento. Los receptores del complemento que han sido mejor estudiados son aquellos que se unen a los fragmentos de degradación del C3. El receptor del complemento tipo 1 (CR1. CD35, receptor de C3b'C4b) es una glicoproteína de cadena simple de 190 kDa (isoforma más frecuente). En humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucleares. eosinófilos. linfocitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerulares, células dendríticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este receptor del complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, al iC3b. Se informó recientemente que el CR1 se unía también al Clq (Klickstein. 1997). Existen cuatro formas alélicas diferentes del CRl que difieren en tama-
900 Tabla 38-3 Receptor CR1 CR2 CR3 CR4 C1qRp' C3aR C5aR
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m e n t o Peso molecular (kDa)
Ligando
190 (isoforma más frecuente) 140 165 (cadena u) 95 (cadena (5) 150 (cadena a) 95 (cadena |5) 126 48
C3b, C4b. iC3b C3d. C3dg, iC3b iC3b C3d. C3b
Papel fisiológico
43
C5a C5a desArg
Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune Activación de las células B Fagocitosis, adhesión celular
iC3b. C3b
Adhesión celular
C1q. MBL. SP-A C3a
Fagocitosis Quimiotaxis, degranulación de los mastocitos del suero, aumento de la permeabilidad vascular Quimiotaxis. degranulación de los mastocitos del suero. aumento de la permeabilidad vascular
' También han sido descritos otros receptores del Ctq. CR1 = receptor del complemento tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complemento tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4; C1qRp = receptor para la región del colágeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = mañosa fijadora de lectma: SP-A = proteina surfactante A; C5a desArg = pérdida del residuo argiruna terminal del C5a tras la inactivación por la carboxipeptidasa-N.
ño y número de lugares de unión. La forma alélica más frecuente (llamada alotipo A o F) está formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminoácidos, la mayoría de las cuales están altamente conservadas. Estas unidades repetidas son llamadas repeticiones consensuadas cortas (SCR). De estos 30 SCR, 28 están agrupados en cuatro parejas de repetición de siete SCR cada uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones homologas largas (LHR). Como se señaló en la sección Regulación de la activación del complemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradación del C3b mediada por el factor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminación tanto sobre la via de la C3 y C5 convertasa clásica y alternativa. Un papel fisiológico más importante del CR1 está relacionado con la fagocitosis de las partículas envueltas por el complemento (partículas opsonizadas). El CR1 puede aumentar la unión de las partículas envueltas con Ig G y C3b o iC3b a los monocitos o los neutrófilos, aumentando entonces la eficacia de la fagocitosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1985; Sengelov. 1995). El CR1 también puede disparar la fagocitosis de los objetivos envueltos por el C3b en ausencia de IgG en los macrólagos activados por varios estimuladores como la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interferón-y y la anafilotoxina C5a. El CR1 sobre los eritrocitos regula la función C3b sirviendo como cofactor para la degradación del C3b mediada por el factor I y aumentando la eliminación de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel importante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacándolos del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradación en el higado y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que la captación dependiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritrocitos de la circulación puede servir como mecanismo de inhibición de la activación excesiva de las células fagocíticas o las células B (Nielsen, 1997). El CR1 también es expresado en las células B humanas y en las células dendríticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmunorregulador en estas células. Este tema se analiza con más detalle después, en la sección Complemento e inmunidad adquirida. Un receptor para el fragmento C3d del C3 se encuentra en las células humanas |i las lineas celulares B, las células dendriticas foliculares, algunas células T periféricas, algunas lineas celulares T, timocitos (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es una glicoproteina transmembrana tipo I, de 140 kDa, que sirve como receptor para el C3d. el C3dg, y se une débilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de servir como cofactor para la degradación de iC3b unido a los objetivos mediada por el factor I (Mitomo. 1987). El CR2 también es el receptor o sitio de unión a través del cual el virus de Epstein-Barr entra en las células B, en la sangre, modalidad independiente del complemento, para causar la mononucleosis infecciosa (Fingeroth. 1984). Se cree que la principal función del CR2 es la regulación de la respuesta inmune de las células B ante el antigeno (Carroll, 1998b). Este tema se discute con más detalle después, en la sección Complemento e inmunidad adquirida. Un tercer receptor del complemento, el CR3 (también denominado Mac-1, Cd11b'CDi8) es un miembro de la familia de moléculas de sdhesión de la |3 2
integnna leucocítica. Está formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos moleculares de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998). Otros dos miembros de la familia de moléculas de adhesión de la |i, integrina (LFA-1 y CR4) comparten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se expresa en los fagocitos mononucleares, granulocitos y células asesinas naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las células microgliales (Morgan. 1996). El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con menor afinidad (Brown. 1991). En las células fagocíticas, el CR3 dispara el proceso fagocitico de un modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partículas recubiertas con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante del CR3 es la adhesión de los monocitos y los neutrófilos a las células endoteliales a través de la interacción con su contraligando, molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1). Esto permite la acumulación de los fagocitos en los lugares de daño tisular donde las células endoteliales son activadas. El receptor del complemento tipo 4 (CR4. CD11c/CD18) es una glicoproteína que comparte características con el CR3. También es un miembro de la familia de moléculas de adhesión de las miegrinas con una única cadena a de 150 kDa. Se expresa en las células mieloides. células dendriticas. células NK. células B activadas, algunas células T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y células microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en menor medida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en términos de activación del complemento es desconocido y, como esta glicoproteína es una molécula de adhesión, puede servir para ayudar" a la adhesión de los neutrófilos al endotelio durante el proceso inflamatorio (Sengelov, 1995). Se han descrito varias moléculas de superficie celular con actividad receptora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, modificadores de la respuesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado de las células B). y proteínas de unión (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una glicoproteína de 126 kDa expresada en las células de origen mieloide. en las células endoteliales, en las plaquetas y en las células microgliales (Nepomucenc, 1998). Se ha mostrado que se une a la región tipo colágeno del C1q (tenner,1998) y a las colectinas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostró que este receptor aumenta la fagocitosis de partículas subóptimamente recubiertas con complemento o Ig G mediada por el CR1 y por el receptor Fe. Un segundo receptor, todavía pobremente caracterizado, es denominado C1qR , se une al C1q e inicia la generación de radicales tóxicos del oxígeno por los neutrófilos, los eosinófilos y las células del músculo liso vascular (Tenner. 1998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es una proteina de 33 kDa expresada en las células B, en los fagocitos mononucleares, en los neutrófilos, en las plaquetas y en las células endoteliales. Se ha informado que induce la quimiotaxis de neutrófilos humanos (Nepomuceno, 1998). También se ha informado que otra molécula de superficie celular se une a la región tipo colágeno del C1q (cClqR). Esta proteína de 56 kDa se expresa en una variedad de células, se une la Clq, a la MBL y a la SP-A (Hansen, 1998) y tiene homología con la calreticulma. Puede inducir la fagocitosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxicidad, la producción de anticuerpos y la secreción de citocinas. El papel del CR1 una 3
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CAPITUIO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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vez unido al C1q es totalmente desconocido. Es importante realzar que el zados por los hepatocitos o por las células extrahepálicas a menudo requiere papel exacto que juegan in vivo estas proteínas unidas al C1 q asociadas a las un estímulo generado en las respuestas inflamatorias como la interleucina-lu, células sigue estando poco claro. la interleucma-6 o el interferón-y. En oirás obras se puede ver una mejor desComo se trató anteriormente en la sección Anafilotoxinas, los fragmentos pepcripción de la regulación de la síntesis de las proteínas del complemento por las tídícos pequeños liberados tras la degradación proteolitica del C4. C3 y C5 tiediferentes células (Collen. 1998) Interesantemente los datos del higado y la nen profundos efectos en la respuesta inflamatoria. Esto incluye el aumento de médula ósea humana (Naughton. 1996) y el trasplante renal (Tang, 1999) la permeabilidad vascular, la degranulación de los mastocitos y la inducción de demostraron que. aunque el higado es el lugar más importante de la síntesis del la quimiotaxis. El receptor del C3a humano (C3aR) ha sido clonado recientecomplemento, los lugares extrahepáticos pueden contribuir a ios niveles de los mente. Es una proteina transmembrana unida a la proteína G. de cadena única componentes del complemento en el plasma. de 48 kDa (Ember, 1998). El C3aR se expresa en las plaquetas del conejilo de Indias, en los mastocitos de rata, en los macrófagos alveolares humanos, en los neutrófilos. en los basófilos y en los eosinófilos (Ember, 1998). Recientemente, Genética del complemento se ha demostrado que se expresan en las células B de las amígdalas humanas Muchos de los genes que codifican las proteínas, los receptores y las molé(Fisher, 1997) y en varias células del cerebro humano inflamado (Gasque. 1998). c u l a s reguladoras del complemento han sido clonados y se les ha asignado Se ha informado que el C3a unido a su receptor origina quimiotaxis eosinofilica: una localización cromosómica (Tabla 38-1). Interesantemente, existe una la degranulación de los eosinófilos. los mastocitos y las plaquetas: la adheson unión para un número de genes que codifican las moléculas relacionadas con de los eosinófilos y las plaquetas; y la supresión de las funciones de las células B amigdalares incluyendo la producción de inmunoglobulinas. Debido a las el complemento. Estos grupos de unión incluyen los genes del MHC clase III (C2. factor B y C4), los genes de los reguladores de la activación del complesimilitudes estructurales entre el C3 y el C4, se pensó que el C4a era capaz de interaccionar con el C3aR. Sin embargo, parece que no es así y el C4a humanomento (proteína fijadora de C4. CR1. CR2, DAF, MCP y factor H). y los genes no puede interaccionar con el C3aR humano (Ames. 1997). aunque parece que de las proteínas del complejo de ataque a la membrana (C6. C7 y C9) (Schneider, 1999). Las moléculas de cada uno de estos tres grupos muestran homo interacciona con el C3aR del conejilo de Indias (Lienenklaus. 1998). logia estructural, lo que sugiriere que las proteínas del complemento pueden Un receptor para la analilotoxma C5a (C5aR) se expresa en los neutrófilos. derivar de una duplicación genética de un número limitado de genes ancestralos monocitos, los basófilos, los eosinófilos, las plaquetas, los mastocitos, las les. Es de interés que existen dos genes para el C4. Originan dos isolipos de células del parénquima hepático, las células del músculo liso vascular del pulC4 lamados C4A y C4B, los cuales son producidos con frecuencia (O'Neill. món, las células endoteliales vasculares del pulmón y umbilicales, las células 1978a: Awdeh, 1980). Estos dos productos génicos difieren funcionaimente y epiteliales bronquiales y alveolares, los astrocitos, las células microgliales tienen diferente eficacia hemolitica. Una vez expuestos al grupo tíoléster de la (Ember. 1998) y las células T humanas (Nataf. 1999). El C5aR es una proteímolécula. C4A forma un enlace amida con un aceptor de la molécula en su na transmembrana asociada la proteina G de 43 kDa El C5a unido al C5aR microambiente. mientras que la forma C4B forma un enlace áster. Además, se induce una amplia variedad de efectos dependiendo del tipo de célula diana. descubrió que el C4A se une al CR1 con mayor afinidad que el C4B (Reily. Estos incluyen las quimiotaxis de neutrófilos. eosinófilos. basófilos y fagocitos 1997). También todas las proteínas relacionadas con el complemento muesmononucleares; la degranulación de los mastocitos de las serosas; la protran polimorfismo (es decir, existen múltiples alelos con variables frecuencias ducción de radicales del oxigeno: facilitar la adhesión celular; y la producción en humanos). El componente más polimórfico del complemento es el C4, con de leucotrienos y prostaglandinas en los neutrófilos y los eosinófilos. En más de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). La degradación de los Itagvarios estudios el C5a también demostró inducir la producción de proteínas mentos del C4A y C4B y su unión a los eritrocitos origina a los antigenos de de fase aguda, citocinas y anticuerpos (Ember, 1998). grupo sanguíneo Rodgerds y Chido. respectivamente (O'Neill. 1978b). Las Los receptores de los factores H y B se han descrito en muchos tipos de variaciones alélicas del factor acelerador de la degradación (DAF) originan el leucocitos y están descritos en otras obras (Fríes. 1987). Sin embargo, el sigsistema de grupo sanguíneo Cromer con el fenotipo Inab que carece de DAF. nificado fisiológico de estos receptores todavía no está claro. Las mutaciones puntuales, las inserciones o las deleciones de los ácidos nucleicos normalmente van unidas con defectos de las proteínas del complemento (Schneider, 1997). Como se discute después en la sección Defectos Biosintesis del complemento genéticos del complemento, estas son normalmente poco frecuentes entre la Se calcula que el 90% de los componentes del complemento del plasma sonpoblación. El polimorfismo de las proteínas del complemento se evalúa tanto por los análisis fenotipicos como por los genotipicos. Los detales de estos sintetizados en el hígado y son proteínas de fase aguda (es decir, su síntesis por el higado aumenta en la respuesta inflamatoria para aumentar los niveles métodos no serán discutidos en este capítulo y el lector es remitido al Capitulo 41 y otros capítulos sobre el tema (Schneider. 1997; Mauff. 1997). del plasma). El hepatocito produce la gran mayoría de los componentes del complemento, con la excepción del C1q. el factor D, la properdina y el C7 (Morgan, 1997a). El C1q parece que es sintetizado por las células epiteliales, los monocitos 'macrófagos y los fibroblastos. El principal productor de factor D es el adiposito. La properdina es sintetizada mayontariamente por los monocitos y los macrófagos ocurriendo algo de la síntesis en los linfocitos y en los granulootos. La mayoría del C7 del plasma también parece originarse por los monocitos y los macrófagos. aunque los leucocitos polimorfonucleares parece que almacenan C7. Es de interés que muchos otros tipos celulares han sido descritos como sintetizadores de los componentes del complemento in vitro. Se ha publicado una exhaustiva lista de células que producen componentes del complemento (Morgan, 1997a). Brevemente, se ha informado que los linfocitos B y T, los monocitos, las plaquetas, los neutrófilos. los macrófagos. los fibroblastos, las células endoteliales. las células epiteliales, los queratinootos. los mioblastos. las células del músculo liso, los adipocitos y las células de la sinovial. cerebro y tracto genital sintetizan uno o más componentes del complemento. Interesantemente, los monocitos. los macrófagos. las células del tejido sinovial y los astrocitos del cerebro tienen la capacidad de sintetizar todos los componentes de las vías clásica y alternativa. Esto puede tener importantes implicaciones en la inflamación especifica de tejido, donde debe estar presente un mecanismo localizado de defensa del huésped para eliminar las partículas extrañas eficazmente. La producción de componentes del complemento normalmente sinteti-
Complemento e inmunidad adquirida Está quedando claro que el sistema del complemento juega un papel importante en el establecimiento de las respuestas inmunes adquiridas. La depresión de las respuestas de anticuerpos a la estimulación anligénica se demostró en animales deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys, 1974), en animales con defectos genéticos en el C2. C4 o C3 (Bötger, 1985; Ochs, 1983; O'Neil, 1988), y en pacientes con defectos genéticos en C2, C4, C3 o CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo reciente de ratones knockout sin C4, C3. o receptores del complemento tipos 1 y 2 (CR1 y CR2 son productos de la división de un mismo gen en el ratón en oposición a los humanos) ha permitido un mejor conocimiento del papel del complemento en las respuestas de anticuerpos al antigeno. Este efecto ha sido revisado recientemente (Carroll. 1998a: 1998b: Fearon, 1998). El complemento puede influir en la respuesta de anticuerpos al antígeno de muchas maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son expresados en las células B y en las células dendriticas foliculares (que están presentes en el bazo). EL CR2 está presente en la superticie de las células B en asociación con el CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el receptor de la célula B para el antigeno y para el CR2 (como ocurrirá cuando el antí-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
geno eslé unido al C3d), disminuye drásticamente el umbral para la activación de la célula B. También, el complemento ayuda en el atrapamiento de los complejos inmunes por las células dendriticas foliculares en el bazo. Esto facilita la formación de centros germinales donde las células B adquieren el fenotipo memoria. Por lo tanto, la pérdida de uno de los componentes iniciales de la via clásica de la activación del complemento o la pérdida del CR1 y/o el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropiada al antígeno y, en algunos casos, puede conducir a la incapacidad para producir una respuesta de anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en la generación de células B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales" (Carroll. 1998a). La activación adecuada de las células B en respuesta a antigenos parece depender, en algunos casos, de la activación de los anticuerpos "naturales" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemente, el complemento parece importante en el mantenimiento de la tolerancia de las células B a los antígenos propios. Esto parece depender del componente del complemento C4, y del CR1 y del CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el complemento (especialmente el C3) ayuda a la generación de una respuesta inmune adquirida al antígeno a través de las células presentadoras de antígeno (APCs). La presencia de productos de degradación de C3 sobre los antígenos aumenta la captación del anligeno por las APCs (células B y otras APCs profesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la eficacia de la presenlación antígénica a las células T con la consiguiente respuesta mediada por las células T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO Los pacientes con deficiencias del complemento genéticamente controlados son muy raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel de los componentes del complemento en distintos fenómenos biológicos y en diferentes estados de enfermedad. En general, la ausencia de un componente sigue los principios de la genética mendeliana simple y es heredada como un rasgo autosómico recesivo. Por ello, los pacientes heterocígóticos tienden a tener la mitad de los niveles normales o menos, y los pacientes con defectos homocigóticos tienen poca o indelectable actividad del complemento. El gen de la properdina está en el cromosoma X. Se conocen deficiencias para todas las proteínas ligadas a la activación del complemento (Tabla 38-4). Con el descubrimiento reciente de la vía de la MBL de la activación del complemento llegó el sorprendente hallazgo de que el déficit en suero de MBL es bastante frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la población tiene una de las tres mutaciones genéticas reconocidas que conducen a la deficiencia de MBL (Sumiya. 1997). Se ha descrito una correlación entre la deficiencia de MBL y las infecciones del tracto respiratorio superior, especialmente entre los 6 y 18 meses de edad, demostrando la importancia de la vía de la MBLecitina en la primera infancia (Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la variación de genes de la MBL puede estar asociada con al menos un tercio de las inlecciones meningocócicas en la infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa-
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Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las proteínas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o Patrón de herencia Principal correlación clinica' Proteina Común a todas las vías C3 Vía clásica C1q C1r C1S C4> C2t Vía alternativa Factor B Factor D Properdina Via de la MBLectina MBL Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7
Autosómica recesiva
Infecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis
Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica
Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES LES LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis
recesiva recesiva recesiva recesiva recesiva
Autosómica recesiva Autosómica recesiva Ligada al X
Infecciones por Neisseria meningitidis Infecciones piógenas recurrentes Infecciones piógenas recurrentes, meningococcemia fulminante
Autosómica dominante
Infecciones recurrentes
Autosómica recesiva Autosómica recesiva Autosómica recesiva
Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad de Raynaud Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Nada
C8 (cadenas ß y a-y) Autosómica recesiva C9 Autosómica recesiva Proleinas de control del fluido sanguineo C1inh Autosómica dominante o adquirida C4bp Autosómica recesiva Factor I Autosómica recesiva Factor H Autosómica recesiva Proteínas unidas a células CR1 Autosómica recesiva ' CR3 Autosómica recesiva" DAF/CD59/HRF Adquirida 1
Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes' Angioedema, síndrome semejante al Behcet Inlecciones piógenas recurrentes Inlecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis Asociación entre la expresión baja en eritrocitos y el LES Infecciones piógenas recurrentes, leucocitosis Hemoglobinuria paroxística nocturna
* Véase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, están clínicamente bien. Un número sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 están asociadas con un CH50 de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 están asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 eslán asociadas con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 está asociada con la ausencia o disminución de la actividad quimiotáctica en suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucocítica a la infección. i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigóticos para la deficiencia de C2 también tienen un aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes. Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 está siempre normal, y el nivel de C4 eslá disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 están disminuidos, el nivel del antigénico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido. La homocigosis para la expresión numérica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES También puedo detectarse un defecto adquirido en el número de CRI Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayoría de los niños con delicit de CR3. LES = lupus eritemaloso sislémico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de mañosa 1
CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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do que las infusiones de MBL purificada corrigen el defecto y la susceptibilidad Es importante reconocer que la medición de los niveles del complemento a las infecciones en los niños con deficiencias del MBL (Valdimarsson, 1998). sérico representa los niveles estáticos de proteínas que se recambian rápiAdemás, se ha sugerido que la deficiencia de MBL conduce a enfermedades damente. Incluso en los individuos normales, el Índice fraccional catabólico autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (Turner. 1996) y que es un de la mayoría de los componentes que han sido medidos está alrededor del factor de riesgo para el aborto recurrente (Christiansen. 1999). 2% por hora. Muchas de estas proteínas se comportan como reactantes de La deficiencia en cualquiera de los componentes de la cascada del com- fase aguda, y sus niveles en suero pueden aumentar drásticamente en los estados inflamatorios. Sus índices de catabolismo pueden aumentar en plemento tiene alguna asociación con la susceptibilidad a infecciones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). Debido al papel central que el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminución del nivel del complemento puede avalar la sospecha de que el sistema del complenización, la deficiencia de C3. de otros componentes de la vía alternativa, o mento participa en el daño tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel de las moléculas reguladoras como los factores H e I está asociada con un normal de complemento en el suero no excluye la participación del compleaumento de la incidencia de infecciones. Interesantemente, las deficiencias mento en el daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con cirrosis biliar tienen de los componentes del complejo de ataque a la membrana (C5-C9) están un aumento del Índice catabólico de C3, y se ha sugerido que el C3 puede altamente asociadas con un aumento de la incidencia de infecciones por jugar un papel en el desarrollo de esta enfermedad. No obstante, el nivel de Neisseria meningitidis, sugiriendo la importancia de la lisis mediada por el C3 en el suero de los pacientes con cirrosis biliar está casi siempre elevado. complemento en el control del meningococo La vacunación empleando un En este caso, el aumento de la síntesis encubre el catabolismo aumentado. polisacárido capsular multivalente para Neisseria meningitidis demostró ofreTambién debe reconocerse que la función del complemento en los diversos cer alguna protección frente a la infección menmgocócica en los pacientes compartimentos del cuerpo puede ser diferente. La actividad del complecon deficiencia del complemento (Fijen. 1998). mento en la sangre de pacientes con artritis reumatoide seroposítiva puede Otra característica de la deficiencia del complemento, especialmente en los ser normal o elevada; sin embargo, la actividad del complemento del liquido componentes iniciales de la via clásica (C1. C4, C2). es la asociación con enfermedades autoinmunes como el LES. Ya que el complemento es impor- sinovial puede eslar severamente disminuida. tante en el aclaramiento de los complejos inmunes de la circulación, puede ser Muchos investigadores han intentado identificar qué vía de activación del que la deficiencia de los componentes iniciales del complemento conduzca a complemento predomina en la mediación del daño tisular o en los niveles disuna degradación inadecuada de los complejos inmunes con su acumulación minuidos del complemento en una y otra enfermedad estableciendo el" perfil en los tejidos como el riñon. Recientes datos experimentales que emplean del complemento". La aproximación más simple a este problema examina los ratones transgénicos sugieren que la autommumdad asociada con la deficienniveles de varios componentes y da por hecho que los niveles disminuidos de cia de Clq origina un aclaramiento inadecuado de las células apopléticas que. un complemento dado de una de las vias de activación del componente es a su vez. conduce al desarrollo de anticuerpos autorreactivos (Bofto. 1998). más frecuente que ocurra cuando la vía está activada. Por lo tanto, si un Como se discutió previamente en la sección Complemento e inmunidad adqui- paciente tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles normales de factor B, rida, la deficiencia del complemento (especialmente de C4 o CR1 CR2) tam- seguramente estará implicada la vía clásica. Si un paciente tiene niveles disbién puede alterar el mecanismo por el que las células B se hacen tolerantes minuidos de C3, factor B y properdina, y niveles normales de C4, probablea los antígenos propios, conduciendo por ello a una autoinmunidad (Prodeus, mente estara activada la vía alternativa. De esta manera, la determinación de 1998). Existen deficiencias en las moléculas reguladoras del complemento los niveles de un número limitado de componentes puede proporcionar unidas a la membrana. La deficiencia de CR3 origina severas infecciones pió- mucha información. Exceptuando el caso de alteraciones conlroladas genétigenas y defectos en la adhesión leucocitana (Fríes. 1986; Morgan. 1991). La camente del complemento, uno nunca necesita conocer los niveles de todos deficiencia en la capacidad para generar el enlace glicosil fosfatidilinositol que los componentes excepto para objetivos de investigación. une algunas proteínas de control del complemento a la membrana celular oriUn importante avance en este área es el empleo de ensayos de enzimas gina HPN. Los pacientes con tal enfermedad no tienen DAF. CD59 y HRF en fijadoras inmunoabsorbentes (ELISAj para detectar los complejos estables la superficie de sus células y sufren una hemolisis intravascular crónica, tromformados en el suero durante la activación del complemento. Estos ensayos bocilopenia y disminución de la hematopoyesis (Jarva, 1999). La deficiencia son muy sensibles y pueden demostrar rápidamente que vía del complemendel C1 inhibidor origina el angioedema hereditario, una enfermedad caracteri- to está activada en varios estados de enfermedad (Morgan. 1994a). zada por episodios recurrentes de edema subcutáneo y submucoso. Esta defiEn la activación, muchas proteínas del complemento expresan nuevos ciencia puede heredarse o adquirirse tras el desarrollo de autoanticuerpos conantigenos (neoantígenos) que no son expuestos en la proteína nativa plastra el C1 inhibidor. Los pacientes con deficiencia del C1 inhibidor a menudo mática. El neoantígeno presente en el MAC pero no presente en los compomuestran niveles bajos de C4 y C2. demostrando una activación incontrolada nentes nativos termínales es quizás el más interesante. El anticuerpo para del C1. Se cree que el angioedema hereditario es causado principalmente por este neoantígeno existe y se ha utilizado para estudiar el nivel de neoantíla pérdida de la regulación del sistema generador de cininas por el C1 inhibigeno por inmunofluorescencia así como por ELISA (Falk. 1983; Sanders. dor (Cugno. 1998; Davis. 1998). 1985). El nivel de neoantígeno está elevado en sangre y en líquido cefaloLos pacientes con hypogammaglobulinemia o inmunodeficiencia combinada rraquídeo en muchos pacientes con activación consiguiente del complemensevera a menudo tienen disminuidos los niveles de Clq. En parte, estos nive- to (Sanders. 1986). Además, está presente en los tejidos en los lugares de les disminuidos de C1q se relacionan con los niveles bajos de IgG en la circu- depósito del complejo terminal. Por ejemplo, está presente en el tejido lesionado en los glomérulos de los pacientes con glomerulonefritis (Falk. 1983) y lación. Parece que el Clq interacciona con la IgG en la circulación y que esta en la piel lesionada en los lugares de LES activo (Biesecker. 1982). A queinteracción conduce, a su vez. a una disminución del catabolismo del Clq. rencia del C3 depositado en la piel normal de pacientes con LES y con test de banda para el lupus positivo, el neoantígeno MAC solo se encuentra en las lesiones. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD En muchos contextos de enfermedad, las funciones del complemento son normalmente producir inflamación o daño tisular. Cuando el complemento juega un papel en el desanollo de la enfermedad, a menudo es activado por un Enfermedades reumatológicas anticuerpo anormal, un complejo inmune o por material extraño. FrecuenteLa enfermedad reumatológica que ha sido evaluada más extensamente mente es importante evaluar el nivel de uno y otro componente del comple- en cuanto a la contribución del complemento a la actividad de la enlermedad mento como medida de la actividad de un proceso de enfermedad. Por ello, loses el LES (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta enfermedad se forman pacientes con LES activo pueden tener disminuidos los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades de complejos inmunes. Se encuentran inmunocomplejos estos niveles disminuidos del complemento pueden seguirse como un marca- circulantes y unidos a tejidos. Estos inmunocomplejos activan el compledor aproximado de la actividad de la enfermedad. mento, y los productos de activación del complemento contribuyen a que
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
matismo severo o sepsis incontenible. Hay evidencia de activación masiva continúe la inflamación. A menudo están disminuidos los niveles de C3 y C4 en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes condel complemento en estos pacientes, lo que sugiere que las bacterias y los productos bacterianos activan el complemento (Hammerschmidt, 1980). enfermedad activa. Algunos sugieren que un nivel bajo de C4 es el mejor Parece que se activan la vía clásica y la vía alternativa (Langlois. 1988). Se indicador de que la enfermedad continúa activa. Sin embargo, hay pacientes forman factores inflamatorios como el factor activador de neutrófilos y el C5a. con enfermedad activa que muestran niveles normales de C4. De acuerdo Hay evidencia de que los neutrófilos infiltran el pulmón, y se cree que los procon otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantígeno del MAC puede ser ductos oxidativos neutrofílicos y las proteasas son responsables de mucho un indicador mejor de enfermedad activa (Gawryl, 1987). Como se trató previamente, el complemento parece jugar un papel esencial en el aclaramien- del daño pulmonar que ocurre. to de los inmunocomplejos circulantes, particularmente de aquellos que contienen isotipos activantes del complemento IgM o IgG. El depósito de C3b sobre el inmunocomplejo procede de la activación del complemento, que Enfermedades renales permite la interacción con células que poseen el receptor de C3b (CR1). Con la unión a los eritrocitos a través del CR1. se impide que los complejos inmuEl complemento parece ser una clave importante en el daño glomerular en nes se difundan del plasma a los tejidos donde pueden originar daño. Los erimuchas de las glomerulonefritis (West, 1998). Esto se demuestra a menudo trocitos que unen a inmunocomplejos circulan hacia el hígado, donde los por el depósito de C3 y otros componentes, en o cerca de la membrana basal inmunocomplejos son eliminados por un proceso que no disminuye la vida glomerular. Además, el MAC ha sido reconocido en el daño glomerular en media de los hematíes (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). En las enferpacientes con glomerulonelritis y LES. Se ha demostrado que los pacientes medades en las que el complemento es activado y estos productos inmuno- con enfermedad del suero debida a inmunocomplejos circulantes tienen lógicamente activados se forman en la circulación, el número de CR1 por erilesión glomerular. En el análisis del suero, estos pacientes mueslran la actitrocito está disminuido. Esto puede resultar de la eliminación de algunos de vación de las vías clásica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se ha los CR1 cuando el complejo inmune es retirado del eritrocito en el hígado creído que los complejos son depositados en los glomerulus a medida que (Ross, 1985). Además del LES, se ha publicado que los eritrocitos de paciense filtra el plasma que contiene los inmunocomplejos. Una vez depositados, tes con enfermedad crónica por aglutininas frías. HPN, anemia hemolíhca estos complejos activan el complemento. Un punto de vista alternativo es autoinmune. síndrome de Sjogren y neumonía por Mycoplasma pneumoniae que los anticuerpos contra las estructuras glomerulares forman inmunocomtienen reducido el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depósitos inmunes plejos en el riñon que luego activan el complemento para causar daño local han sido eliminados de los eritrocitos en estas enfermedades (Atkinson, (Daha, 1979). Aunque los anticuerpos frente a las estructuras de la mem1986: Ross, 1985). brana basal glomerular son claramente importantes en el síndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es más cuestionable. El Las proteínas del complemento actúan como reactantes de fase aguda y papel del complemento en la enfermedad intersticial y tubular está menos los niveles pueden no estar disminuidos incluso en situaciones en las que claro; sin embargo, hay quienes creen que el complemento también funcioocurre la activación del complemento. Se encuentran niveles séricos del complemento normales o aumentados en la artritis reumatoide juvenil, en el reu- na en estos trastornos. Interesantemente, en algunos pacientes con glomerulonefritis con niveles muy bajos de C3. una proteina lamada factor nefrítimatismo palindrómico. en la seudogota. en la gota, en el síndrome de Reiter co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la vía de la C3 convertasa alternativa. Este y en la artritis gonocócica. AI mismo tiempo, parecen existir niveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb que aumenta la vida media dos del complemento en el líquido sinovial en un número de otras enfermede la C3 convertasa de la via alternativa en más de 10 veces (Daha. 1979. dades reumatológicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se cree que la dis1976). El C3NeF parece proteger a la C3 convertasa de la vía alternativa de minución de la actividad hemolitica total del complemento (CH50; véase l a eliminación por la disociación por el factor H (Fearon, 1980). Se cree que después en Ensayos del complemento) y la presencia de productos de degrael C3NeF es responsable de los niveles tan bajos de C3 presentes en estos dación del C3 y del factor B representan la activación intraarticular en el líquipacientes pero no se cree que juegue un papel central en el desarrollo de la do sinovial de muchos pacientes con artritis reumatoide seronegativa. LES, nefritis. seudogota, gota, síndrome de Reiter y artritis gonocócica. Esto no es cierto a
en fluidos obtenidos de pacientes con artritis degenerativa. Enfermedades dermatológicas Enfermedades infecciosas Como en los otros grupos de enfermedades señalados, se cree que el complemento toma parte en el daño tisular en una variedad de enfermedaComo se mencionó anteriormente y como se evidenció en hallazgos clínides dermatológicas. Estas incluyen el penfigoide ampollóse el penfigoide cos en pacientes con deliciencias genéticamente controladas del complemento, el sistema del complemento juega un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermólisis ampolosa adquirida, la tra los microorganismos. Los pacientes con septicemia por Gram negativos dermatitis herpetiforme y el pénfigo vulgar (Yancey, 1998). Es importante a menudo tienen niveles disminuidos de C3 y de componentes de la vía alter-saber que los niveles séricos del complemento suelen estar normales o elevados en estos estados inflamatorios, y de que la importancia del complenativa, al igual que pacientes con ciertas enfermedades fúngicas como la mento es estimada por análisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisusepticemia criptocócica. El complemento puede estar implicado en el daño lares y por estudios del liquido de la ampolla. Además. Gammon y cois. tisular asociado con la infección crónica. Se sabe que los pacientes con (1984) han desarrollado un modelo in vilro útil para el estudio de enfermehepatitis infecciosa HbsAg positiva tienen una caída precoz en el C3 sérico, que posteriormente vuelve a la normalidad. Esto puede estar asociado con dades cutáneas mediadas por anticuerpos anli-membrana basal. Estos autores han mostrado concluyentemente que el C5a es un elemento clave signos de enfermedad por inmunocomplejos (esto es, la artralgia). De una forma similar, el complemento parece jugar un papel importante en muchas en la patogénesis del penfigoide ampolloso y de la epidermólisis ampollosa adquirida. El C5a actúa como un quimioatrayente necesario para el aflujo de infecciones parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la leucocitos polimorfonucleares a los lugares de daño tisular en estas enfergiardiasis y la malaria. La discusión detallada de las interacciones entre el medades. sistema del complemento y los parásitos, las bacterias y los virus no se encuentra dentro de los objetivos de este capitulo y el lector debe remitirse a revisiones sobre el tema (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt, 1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante reconocer que los nive- Enfermedades hematológicas les del complemento sérico en general no son un índice fiable de actividad de enfermedad en estas condiciones. En muchos tipos de anemia hemolitica autoinmune, el complemento juega un papel importante en la opsonización de los eritrocitos, conduciendo a su Se ha estudiado el papel del complemento en el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), un proceso frecuente en pacientes con trau- aclaramiento por las células del sistema reticuloendotelial.
CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento está claramente implicado, los niveles séricos del complemento suelen ser normales. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de células recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos autoanticuerpos (aglutininas frias) están asociados con trastornos linfoprolíferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas frías generalmente se unen óptimamente a temperaturas subfisiológicas, que se encuentran en algunas áreas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas frías son anticuerpos IgM. El síndrome de la hemoglobinuria paroxistica fría (HPF), por ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen a las células a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatológicos son similares. Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen más eficazmente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolíferativas y con infecciones virales. La mayoría de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres activadores del complemento en contraposición con las aglutininas frías y con los anticuerpos frente a los grupos sanguíneos anti-A y anti-B. Sin embargo, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la lisis. En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se lleva a cabo por la vía alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los niveles séricos del complemento siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una pérdida de proteínas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las células de los pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A). Entre otras proteínas de unión a través de este enlace de membrana están el DAF y el CD59. dos moléculas que controlan la activación del complemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (véase anteriormente en Regulación de la activación del complemento). Se cree que la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activación incontrolada del complemento en la superficie de estas células. Recientemente, se informó de que, aunque la pérdida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima, 1999).
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temente, el tipo de célula glial más abundante, el astrocito, demostró sintetizar in vitro todas las proteínas del complemento en condiciones inflamatorias (Morgan. 1996). Además, los astrocitos y las células microgliales expresan receptores del complemento ¡n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar de la barrera hematoencefálica. el cerebro tiene la capacidad de preparar una reacción inflamatoria dependiente del complemento como mecanismo de defensa.
Enfermedades cardiovasculares Se admite la implicación del sistema del complemento en la lesión por isquemia'reperfusión miocárdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi. 1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo de miocardio en los pacientes todavía no está claro. Sin embargo, se han demostrado los depósitos de los componentes de las vías clásica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La producción de analilotoxmas que acompañan a la activación del complemento parece ser responsable de la reacción inflamatoria local. La demostración más clara del efecto del complemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del modelo animal de oclusión de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficiencia genéticamente controlada de C6 muestran una significativa reducción del tamaño del infarto en comparación con los conejos normales. Además, la infiltración neutrofilica se redujo significativamente en los conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componentes finales del complemento en la generación de inflamación local. El complemento también parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arterioscleróticas no está claro. Sin embargo, el depósito de los componentes finales del complemento (C5b-9) ha sido demostrado en las íntimas adelgazadas y en las placas fibrosas. La activación del sistema del complemento está asociada con etapas prelesionales y con la progresión de lesiones arterioscleróticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con déficit de C6 demostraron ser menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arterioscleróticas inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).
Biocompatibilidad Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, particularmente la vía alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En contacto con la sangre o con los líquidos tisulares. estos materiales pueden activar el complemento y producir inflamación local o daño tisular. Los materiales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.
Trasplante de órganos Enfermedades neurológicas El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema nervioso se ha hecho evidente en los años recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la barrera hemaloencefálica bloquea eficazmente la penetración del complemento en el liquido cefalorraquídeo. La activación del complemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la esclerosis múltiple, el lupus cerebral, el síndrome de Guillain-Barré y la enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depósito de proteínas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y se demostró la activación del complemento en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente, la inflamación origina una ruptura de la barrera hematoencefálica con la penetración local de proteínas del complemento. Además, algunas células sintetizan proteínas del complemento. Hay evidencia de que la activación del complemento puede estar implicada en el daño a la mielina, originando de este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del periférico. También se demostró que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un péptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. Interesan-
El éxito del trasplante de órganos ha creado un gran problema, la escasez de órganos humanos para satisfacer las demandas para un número de pacientes que no deja de crecer que lo están esperando como técnica quirúrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el cerdo en este campo como una lógica alternativa a los órganos humanos. Sin embargo, los órganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reacción de rechazo, denominada rechazo hiperagudo. cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso, 1992). Esta reacción es mediada por anticuerpos que se unen a las células endoteliales y la activación del complemento. Se demostró que la activación del complemento era crucial en el daño tisular en la reacción hiperaguda de los xenotransplantes. La activación del complemento en las células endoteliales xenogénicas origina su activación (es decir, las células endoteliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reacción se debe a la incapacidad de las moléculas reguladoras del complemento asociadas a las células porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activación del complemento humano. Por lo tanto, el éxito de esta prometedora intervención terapéutica recae en la capacidad de controlar la activación del complemento. El papel del complemento en el rechazo de órganos huma-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activación del complemento contribuye de algún modo a los episodios de rechazo agudo y crónico (Baldwin, 1995).
UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO La activación del complemento contribuye indudablemente al daño lisular observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el empleo de agentes que bloquean la activación del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el daño tisular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la práctica clínica. Se están realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control de la infección, un inhibidor del complemento adecuado no debería interferir con esta función del complemento. También se sabe que el C3a y el C5a son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el inhibidor deseable deberá actuar a nivel de la C3 convertasa clásica y alternativa para evitar la producción de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemente y están siendo desarrollados actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se muestran como promesas en el área clínica. Para una descripción más completa de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998; Wagner, 1998). Como se discutió previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la via clásica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegración de las C3 y C5 convertasas de ambas vías y sirve como cofactor para la degradación del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta molécula representa un excelente candidato para la inhibición terapéutica del sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostró mantener todas las propiedades de la proteína nativa unida a la membrana. En una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe que la activación del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros: xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveolítis en un modelo de reacción pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesión tisular de isquemia/reperfusión miocárdica (Weisman, 1990), desmielinización en un modelo experimental de encefalomielitis alérgica en ratas (Piddlesden, 1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase I de los ensayos clínicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras. Otro inhibidor del complemento que ha entrado también en la fase I de los ensayos clínicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la activación del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe que promueve el potente daño tisular debido a la inflamación y a la activación celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostró en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los órganos porcinos en sistemas de perfusión in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de artritis en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Wang. 1995), para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratón de LES (Wang, 1996) y para disminuir el tamaño del infarto en un modelo de rata con un modelo de lesión de isquemia/reperfusión miocárdica (Vakeva. 1999). EL anticuerpo anti-C5 humanizado demostró ser un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos clínicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el daño al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirúrgico cardiopulmonar ¡Rollins, 1998). Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso (IVIG) se han empleado en un número de enfermedades autoinmunes e inflamatorias como la púrpura trombocitopénica idiopática, la enfermedad de Kawasaki, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia gravís (Dwyer. 1992). Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su acción bene-
ficiosa no está claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a través de las interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en las células lagocíticas, la modulación de las funciones de las células T y B y la selección de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demostrado interferir en la reacción de shock dependiente de la via clásica de Frossman en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Además, el tratamiento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibió el depósito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activación del complemento a través de su porción Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG bloquea la activación del complemento en la superficie del objetivo todavía no se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede prevenir el daño tisular mediado por el complemento interactuando directamente con el C 1 o previniendo la unión del C4 con la célula diana (Mollnes, 1995; Miletic, 1996).
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales Están disponibles los métodos que permiten asegurar la determinación de los niveles de cualquiera de los componentes de las vías clásica, alternativa y de la MBLectma, así como muchas enzimas y reguladores del sistema del complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no están disponibles en los laboratorios clínicos de rutina y están restringidos los laboratorios de investigación. Centraremos nuestra atención sobre las técnicas que no requieren para su realización un laboratorio especializado en la investigación del complemento. Para más detalles relativos a métodos que requieren técnicas más especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley, 1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Würzner, 1997). Los ensayos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que miden las proteínas del complemento como antigenos en los líquidos biológicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado. Ambos tipos de técnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los métodos de análisis antigénico (inmunoquimicos) generalmente son fáciles de realizar. Estos ensayos antigénicos con altamente específicos, requieren menos reactantes especializados, son más baratos y se realizan en una cantidad de tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las proteínas del complemento humano y para las proteínas purificadas del complemento humano están comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es una guía útil para conocer los reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos, en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los métodos comunes de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razón, los ensayos antigénicos son fácilmente adaptables al laboratorio clínico. Por otra parte, los ensayos antigénicos no proporcionan información sobre la actividad de un componente ya que pueden detectar los productos de degradación asi como los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de pequeños fragmentos de una proteina con actividad antigénica puede confundir los resultados. Algunos ensayos antigénicos emplean inmunodifusión radial. En estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir más rápidamente que la molécula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados. Como ejemplo, el ensayo antigénico más frecuentemente empleado para el C3 mide su principal producto de degradación, el C3c. por inmunodifusión radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C durante un número de días para permitir la completa conversión de C3 en C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeño y normalmente no tiene consecuencias clínicas. En general, los ensayos antigénicos no son tan sensibles como los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un componente presente en ciertos líquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos antigénicos en cierto grado de la concentración del anticuerpo empleado, y con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antigénica tan pequeña como 10 pg/ml.
CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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Hay kits disponibles que emplean la inhibición de la unión de un sustraTabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los to radiomarcado para detectar varios péptidos del complemento. Estos e n s a y o s del complemento equipos están disponibles para la medición del C3a. C4a y C5a. La utilidad Soluciones stock* de estas mediciones todavía está debatiéndose. Está disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS) me detallado sobre los procedimientos de medida de la actividad lítica funDisolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1.5 I de cional y sobre los niveles antigénicos de los componentes de la vía alteragua destilada. Ajustar el pH a 7.35±0.05 con CIH IN y llevar hasta 2 l de volumen con aguda destilada Esta solución es cinco veces la nativa (Minta, 1985). También se han descrito ensayos diseñados para concentración de una solución isotómca y puede almacenarse a 4"C medir la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el durante al menos un mes. suero humano pero requieren reactantes especializados que pueden no 2. Ácido disodio etilendiaminetertetr acético 0.01 M (stock EDTA) estar disponibles comercialmente (Gaither. 1979). Han sido desarrollados Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila ensayos con ELISA para la medición de productos de degradación de las da. Ajustar el pH a 7.65±0.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluproteínas del complemento o para los complejos formados tras la activamen con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al menos tres semanas con almacenaje a 4"C. ción del complemento. Hay equipos comercialmente disponibles (Quidel. San Diego. CA). Estos miden los productos de degradación de las proteí3. Dextrosa con CaMg •' y gelatina (D5wg++) Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepanas del complemento a medida que se generan tras la activación del comrado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentánplemento empleando anticuerpos monoclonales específicos. La activación dolo hasta que los granulos de gelatina estén disueltos Añadir la del complemento por la vía clásica puede medirse siguiendo los niveles de solución de gelatina a la solución de dextrosa Añadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. También, la medición por ELISA de los ción stock 4 y 2 mi de la solución stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a 7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solución complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona una medida de la activación del puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C complemento a través de la via clásica. La activación de la vía alternativa 4. MgCI. 1 M puede medirse por ELISA evaluando los niveles de los complejos Bb, o Preparar 100 mi de solución que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulación (Mayes, 1984). Se informó de que las mente. Medir la gravedad especilica de la solución y determinar la mediciones de dichos complejos cuantifican tan poco como 10 a 20 ng/ml concentración de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics' de C3bP en suero. Este ensayo puede también emplearse para medir los (tablas de conversión para valores concentrados de soluciones acuocomplejos de activación unidos a la superficie. La activación a través de sas) A|ustar la concentración a 1 M añadiendo agua destilada Almacenar a 4°C. cualquier via puede monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M ma soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Además, los Se preparan 100 mi de una solución de CaCK.3 M aproximadamente kits de ELISA están disponibles para medir la generación de anafilotoxmas Medir la gravedad especilica de esta solución y determinar el CaCl, en sueroplasma. Ya que el C3a y el C5a son rápidamente convertidos en como se describe arriba Ajustar a 0 15 M añadiendo agua destilada sus fragmentos desArg inactivos por carboxipeptidasa-N en el suero, estos Almacenar a 4"C. ensayos emplean anticuerpos monoclonales específicos para el C3a-desSoluciones de trabajo Arg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI¡ 1. VBS isolónico con gelatina y metales (GVBS++) SA proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activación del Añadir 200 mi de la solución stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destilacomplemento en los líquidos biológicos a través lanto de la via clásica da en un malraz alorado de 1 I de volumen Añadir 1 mi de la solución como de la vía alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente son stock 4 y 1ml de la solución stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentando como se describió en la solución stock caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilución están3. Añadir la solución de gelatina y ajustar el pH a 7.35±0.05 Llevar dar. Por lo tanto, en un solo kit se puede incluir una cantidad limitada de hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe prepararmuestras. se en Iresco una vez cada semana 2. Dextrosa-VBS Daß en iones con metales y gelatina (DGVBStt)
Evaluación funcional de la vía clásica Los ensayos funcionales del complemento son herramientas sensibles y precisas para proporcionar información sobre la actividad de un componente. Algunos de estos métodos pueden utilizarse para cuantificar la actividad del nivel molecular, y otros para expresar la función del complemento en unidades arbitrarias. Los reactantes comerciales están disponibles para valorar cada componente de las vias clásica y alternativa. Sin embargo, para la mayor parte, estos ensayos son desarrollados en un limitado número de centros de investigación. Muchos ensayos funcionales requieren procedimientos que requieren tiempo y componentes del complemento relativamente muy purificados, que son más caros que aquellos requeridos por los ensayos antigénicos. Por lo tanto, se limitará la descripción de los ensayos del complemento a los métodos de referencia para la evaluación de la activación tanto de la via clásica como de la alternativa. Los amortiguadores que se emplean frecuentemente en la mayoría de los laboratorios donde se desarrollan los ensayos del complemento se describen en la Tabla 38-5. Uno debe darse cuenta de que la preparación precisa de estos amortiguadores es crítica ya que cambios en la molaridad y en la concentración del ion metal pueden afeelar a los títulos obtenidos.
Los amortiguadores de diferentes potencias iónicas son preparados mezclando la solución stock 3 con la solución de trabaio 1. El DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solución citada primero con dos partes de la segunda solución. El DGVBS+t debe prepararse en Iresco. 3. EDTA-VBS isotómco (EDTA-GVBS—)
Preparar el GVBS como en la solución de trabajo 1 con la excepción de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las soluciones 4 y 5 no se añaden a esta solución. Añadir 100 mi de la solución stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de 1 i con agua destilada Esta solución es estable durante al menos una semana a 4°C 4. VBS isotónico con glicol etilen bis (b-aminoetil éter) N. N N. N • acido tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)
Añadir 50 mi de la solución stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un matraz aforado de 250 mi de volumen Añadir 1.25 mi de la solución stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calentando como se describió en la solución de Irabaio 1 y añadir a la solución. Preparar una solución stock EGTA añadiendo 0.761 g de EGTA a 5 mi de agua destilada Disolver EGTA con NaOH 5 NI A|ustar el pH a 7,35±0.05 con acido acético al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con agua destilada Añadir esa solución stock de EGTA a la solución de trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco. I " Las soluciones stock 1. ? y 3 deben almacenarse de 20"C a -50"C durante un
Los ensayos que miden la actividad hemolitica total en una muestra (CH50) periodo de lempo indefinido * De West RC (ed) CRC Handbook Ol Chemistry and F-hysics Boca Ratón FL. CRC o la actividad funcional de los componentes del complemento aislados en Press 1985-t986. con permiso general emplean eritrocitos de oveja como objetivos de la lisis mediada por el complemento. Los eritrocitos de oveja son más sensibles a la lisis por anticuerpos y mediada por el complemento que los eritrocitos de otras especies. adecuados están comercialmente disponibles. La activación de la via alternaAdemás, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolípido (antígeno de Forsstiva del complemento se mide fácilmente empleando eritrocitos de conejo. man) que provoca una respuesta potente de los anticuerpos en conejos una Estas células son particularmente sensibles a la lisis independiente de antivez inmunizados estos animales con eritrocitos de oveja. Los anticuerpos cuerpos mediada por el suero humano.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Manejo de las muestras
tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo. Como se describió anteriormente, este antígeno es altamente inmunógenc e induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmunizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detalle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antisuero es destruida por la inactivación con calor a 56 C durante 30 minutos. Los métodos para la titulación del anticuerpo y para la preparación de las células óptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither, 1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los eritrocitos de oveja de modo que pequeñas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpo se denominan EA Los componentes intermediarios de la célula con componentes del complemento unidos a la membrana, que se utilizan en la titulación funcional individualizada de los componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento purificados Los métodos para la preparación de estos intermediarios celulares ya se han descrito (Gaither, 1984).
El correcto manejo de las muestras es crítico para el correcto análisis funcional del sistema del complemento. Par la mayoría de los ensayos funcionales, se prefiere el suero al plasma para el análisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las muestras son diluidas más de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del plasma puede emplearse ya que la dilución sobrepasa el electo quelante. Para obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y después en hielo durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso, la polimerización completa del coágulo parece facilitar la precisión del ensayo. Para separar el suero, se recoge el coágulo y se centrifuga de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la centrifugación y formación del coágulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya que puede ocurrir la fijación del complemento si la muestra se enfría. En ciertos casos, la congelación disminuirá los títulos de complemento considerablemente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del complemento hemolítico total te que un título considerablemente disminuido de complemento sólo puede reflejar un artefacto de una preparación sérica inadecuada. Si se sospecha El ensayo más simple sobre la vía clásica mide el complemento hemolítico esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activación total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios los pacientes con déficit genético homocigotos. generalmente origina un títuvolúmenes pequeños y almacenarse inmediatamente a una temperatura de lo de complemento hemolítico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor -40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales. dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin pérdida de la Cuando la historia y los síntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes ciencia, deben pedirse los títulos hemolitico y anligénico de los componentes de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco. individuales. A menudo, el título de CH50 será una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.
Preparación de eritrocitos La sangre de oveja estéril se obtiene de una solución estéril de Alserver. La sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede emplearse durante un máximo de seis semanas si se mantiene estéril. La edad de las células afecta mucho a los títulos de la mayoría de los componentes del complemento, y los títulos pueden ser falsamente bajos si se utilizan células frescas. En condiciones estériles, se extrae asépticamente y se centrifuga a 4 C un volumen de células. Se extraen el sobrenadante y la capa leucocitaria. y se remtroducen las células en una solución tampón adecuada. Los detalles del lavado y sensibilización de las células con anticuerpos se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa, se extrae asépticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa como la sangre de oveja.
Preparación de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individuales o el título de complemento hemolítico total emplean eritroci-
El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la dilución de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan diluciones seriadas de la muestra y se añaden al EA (Tabla 38-6). En este caso, el punto linal del 50% se determina por la transformación de los datos de Von Krogh. Esta fórmula derivada empíricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una función lineal. Se calculan los valores de / / 1 - / donde Yes la fracción de glóbulos rojos usados en el test de dilución. Se construye una gráfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se obtiene una línea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide por el reciproco de la dilución sérica original (1:60 para el suero humanoi para calcular la concentración de complemento sérico que lisa el 50% de las células El título de complemento representa el número de unidades hemoliticas 50% que están presentes en 1.0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970). El suero de los conejillos de Indias con déficit de C4 está disponible comercialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una muestra. El método se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un número limitado de laboratorios está disponible el suero de humanos y conejillos de
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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Tabla 38-7 Titulación funcional de la vía alterna (ensayo AH50)
'Si una muestra se suero muestra algún grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que están mezclados con E EGTA GVBS+ = salmo isotónico tamponado con Veronal con gelatina, EGTA y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS— = salino isotónico tamponado con Veronal con EDTA; CB = E solo con lampón; CL = E con agua destilada (lisis completa). :
Indias con délicil de C2 y el de conejos con déficit de C6. Estos sueros son una aceptable alternativa al empleo de intermediarios celulares para titular los componentes individuales, ya que solo tienen la pérdida de una proteína del complemento, Ensayo de la vía alterna
inmunodifusión. Existen disponibles equipos de inmunodifusión radial para todos los componentes de la vía clásica y alternativa. Estos equipos consisten en cristales cubiertos de una tina capa de agarosa al 2% que contienen anticuerpos monoespecíficos. El suero proteico estándar (un pool estabilizado de suero humano normal) se suministra, normalmente, en soluciones prediluidas. Cada solución estándar contiene una cantidad específica de la proteína que se está midiendo para su uso en la construcción de la curva de referencia.
En este ensayo, el suero humano (normalmente diluido primero a 1:5) se diluye seriadamente y se añade a eritrocitos de conejo que no están sensibilizados con un anticuerpo específico en un tampón que contiene iones magPrueba de fijación del complemento nesio y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para quelar los iones calcio (los Se dispone de una descripción detallada de este ensayo (Mayer. 1961), y iones calcio son necesarios para la activación de la via clásica, no para la actiaquí no se detallará. Sin embargo, ya que las reacciones de fijación del comvación de la via alternativa) (Pangburn, 1988) (Tabla 38-7). El título de la vía alternativa se denomina AH50 y representa la dilución final del suero humano plemento son de gran importancia en el diagnóstico clínico, se tratarán brevemente. La técnica de la prueba depende de la capacidad del complemento en el ensayo que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una gráfica del suero fresco de interaccionar con complejos antígeno-anticuerpo. En la similar a la descrita para la litulación del complemento hemolítico total para primera etapa de la reacción, el complemento es incubado con los materiales determinar el AH50. El suero humano puede poseer a veces anticuerpos que pueden contener el antigeno y el anticuerpo. Si se forman complejos antí"naturales" para un carbohidrato expresado ampliamente en las células de otras especies diferentes de los humanos y de los primates. Si se mezcla una geno-anticuerpo, interaccionan con el complemento del mismo modo que los complejos de anticuerpo sobre el antigeno de superficie celular interaccionan alta concentración de suero con los eritrocitos de conejo se puede inducir la con el complemento. El complemento es activado, los componentes son fragaglutinación, que puede alterar la interpretación del titulo de AH50 (Tomlinson, mentados, y el complemento es "utilizado" o "fijado". En la segunda etapa, se 1997). Por lo tanto, puede ser útil absorber el suero con concentrado de eritrocitos de conejo lavados en hielo durante 15 a 30 minutos para extraer una añaden las células de oveja sensibilizadas (EA). y la mezcla se incuba a 37 C durante una hora. Si el suero de la prueba contiene el anticuerpo contra el cierta proporción de anticuerpos naturales, disminuyendo asi la aglutinación antígeno utilizado, el complemento se lija y por lo tanto no está disponible pacelular en el ensayo. ra lisar el EA. Por ello, la ausencia de lisis indica una reacción positiva, y la lisis completa indica un resultado negativo. Niveles del complemento mediante Hay dos aproximaciones generales de las pruebas de fijación del compleensayos antigénicos mento. En la primera, el suero concentrado es el que proporciona el complemento, y la cantidad de complemento fijado se determina por la titulación del Para utilizarla en ensayos antigénico, la muestra (ya sea suero o plasma) suero antes y después de la fijación. En la segunda, se emplea una dilución se almacena congelada (20°C o menos). La contaminación bacteriana puede suero que proporciona suficiente complemento para la lisis de EA o poco de originar la desnaturalización o la fragmentación de las proteínas, mientras que el hielo y el deshielo no tienen un electo adverso importante sobre los más del suficiente (tres a cinco unidades CH50) En este caso, se añaden las células sensibilizadas sin dilución posterior de la cantidad de complemento. niveles antigénicos. En ciertos ensayos del complemento, la muestra se diluLa incubación del material del test con el complemento puede hacerse a 37 C ye en salino para obtener el índice corréelo de concenlración para la adecuadurante una hora o toda la noche en frió. En general, la incubación en frió orida cuantificación. gina títulos mayores. El complemento puede activarse por un número de Los análisis antigénicos de las proteinas del complemento hacen uso de agentes diferentes de los complejos antígeno-anticuerpo como las bacterias, una de las muchas técnicas de precipitación inmune. La inmunodifusión radial endotoxinas y y-globulinas agregadas. Por lo tanto, son necesarios los consimple (RID) utilizando el método ya sea de Fahey o de Mancini es el métotroles pata demostrar que ni el suero ni el antígeno aislados fijarán el comdo empleado más frecuentemente para calcular una cuantificación específica plemento. El test de fijación del complemento es de particular valor en tanto de una proteína. En ambos métodos, el antígeno se añade a los pocilios en que no necesita que los antigenos o los anticuerpos estén presentes en su un gel que contiene anticuerpo, y se forman anilos de precipitación. El métoforma altamente purificada. Pueden utilizarse tanto antígenos solubles como do de Fahey emplea un anticuerpo que no está en exceso. El tiempo de difuparticulados, y se pueden medir tanto los antígenos como los anticuerpos. sión al que los resultados son leídos es por ello crítico. Los puntos de difusión finales no se alcanzan y pueden levar a mediciones inadecuadas de los nive-Una aproximación alternativa al test de fijación del complemento es el empleo de ensayos con ELISA que miden los productos de fragmentación de las proles del complemento antigénico. El método de Mancini utiliza un exceso de teínas del complemento o de los complejos formados tras la activación del anticuerpo en un gel y es más sensible y exacto. El método de Mancini se uticomplemento, como se discutió previamente. De cualquier modo, estos ensaliza por muchas firmas comerciales para la preparación de los cristales de
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados con la prueba de fijación estándar.
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN DE CININAS El sistema de generación de cininas es una vía mediadora secundaria presente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la generación de péptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aquí será descrito brevemente. Para más detalles, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius. 1995). El péptido biológicamente activo más importante generado por este sistema parece ser la bradicinina, un nonapéptido con potente actividad en muchos sistemas biológicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascular, vasodilatación, hipotensión, inducción del dolor, contracción de muchos tipos de células musculares lisas, y activación del sistema de la fosfolipasa A, con su función de activación del metabolismo del ácido araquidónico celular. Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema de generación de cininas del plasma es más simple debido a que está compuesto solo por cuatro proteínas plasmáticas. Los elementos tisulares también generan cininas. Las principales proteínas del sistema de generación de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulación XI, la precalicreína y el quininógeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el plasma como un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 2:1. La precalicreína también circula en un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 1:1. En contraste, el factor de Hageman circula como una proteína plasmática de cadena simple, no formando complejos. Al igual que en la secuencia de activación del complemento, la secuencia de generación de cininas sigue una vía específica. Interaccionando con superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biológicamente como el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa) tiene actividad proteolítica y después activa y degrada las moléculas del tactor de Hageman adicionales para generar más aHFa. La degradación de la cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimático activo del factor de Hageman reside en la cadena ligera. Muchas enzimas proteolíticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y activar al factor de Hageman. El «HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quininógeno de alto peso molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activación de la cascada intrínseca de la coagulación. El «HFa también interacciona con el complejo quininógeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicreína en una molécula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes disulfuro. La precalicreína degradada tiene actividad enzimática proteolítica localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones ocurren mucho más eficazmente cuando las proteínas se unen a superficies cargadas negativamente, las cuales son críticas para la activación de la cascada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular en muchos lugares, liberando bradicinina. La calicreina activa, generada por la degradación de la precalicreína, también es capaz de degradar posteriormente el «HFa a un producto de menor peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede degradar y activar al complejo quininógeno de alio peso molecular- precalicreína pero no permanece en la superficie de unión y no interacciona eficazmente con el complejo quininógeno de alto peso molecular-factor XI. La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rápidamente por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molécula ya no tiene la actividad de la bradicinina de contraer el músculo liso y no puede inducir la salida de líquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus
efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar péptidos de bajo peso molecular que pierden su actividad biológica. Los inhibidores del sistema de generación de cininas incluyen el C1 inhibidor, la «,-macroglobulina, y el «.-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la «¿-macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa, ejerciendo el C1 inhibidor la influencia más potente. El C1 inhibidor y la «,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo. El angioedema hereditario resulta de la deficiencia genética o adquirida del C1 inhibidor. Se cree que las características clínicas asociadas con esta enfermedad surgen de la pérdida del control adecuado del sistema de generación de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998) También existen en el plasma los quminógenos de bajo peso molecular y pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los quminógenos no son fáciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares presentes en las células pueden degradar el quininógeno de ba|0 peso molecular a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradicinína sufre la misma vía de degradación que la bradicinina, Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el fluido nasal en la rinitis. También se ha sugerido un papel patogénico para la bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la inflamación. Está claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados con la inflamación.
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CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
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SECCIÖN V
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INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOIOGIA
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CAPÍTULO 38
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C A P Í T U L O
39
Gtocinas y moléculas de adhesión • H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S. • Richard A. McPherson, M.D.
CITOCINAS
914
lnterleucina-14
lnterleucina-1
lnterleucina-15
lnterleucina-2
lnterleucina-16
lnterleucina-3
lnterleucina-17
lnterleucina-4
lnterleucina-18
lnterleucina-5
Factor transformante del crecimiento |i
lnterleucina-6
Factor de necrosis tumoral
lnterleucina-7
Interferón-y
lnterleucina-8 y las quimiocínas
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR
lnterleucina-9
Integrinas
lnterleucina-10
Selectinas
922
lnterleucina-11 lnterleucina-12 lnterleucina-13
CITOCINAS La secreción y la unión de las citocinas es el equivalente celular a estar "en línea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un Internet" de comunicación entre las células. Las señales de las citocinas son recibidas sobre la superficie celular y no sólo como simples mensajes, sino también como combinaciones complejas e imperceptibles sinérgicas y antagónicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migración celular y la cicatrización de las heridas. Para responder a los mensajes específicos de las citocinas, las células despliegan miles de receptores de superficie de citocinas, presentados como múltiples antenas. Utilizando estos receptores, las células seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citocinas solubles y de unión a sustratos de manera dependiente de la densidad y el estado de activación de los receptores de superficie. El término "citocina" se refiere a los productos solubles de las "células" en senlido genérico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas, pero para la mayor parte son la célula T y el macrófago las factorías virtuales de citocinas. y por esta razón muchas familias de citocinas se conocen como interleucinas (IL).
PERSPECTIVAS
924
BIBLIOGRAFÍA
924
lnterleucina-1 La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres proteínas: la IL-1r/. y la IL-1|3 (los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA), un antagonista específico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello, 1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la IL-115 son sintetizadas como proteínas precursoras intracitoplasmáticas de 31 kDa que son degradadas para generar las formas biológicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a través de la acción de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los queratinocitos, por las células T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timocitos. La pro-IL-l f5 se convierte intracelularmente en su forma biológicamente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la apoptosis.
Aunque los bioanálisis son a veces el método de referencia para la detección de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son difíciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) están ampliamente disponibles para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las técnicas moleculares (reacción en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridación ¡n situ) se emplean en laboratorios más modernos para identificar la presencia de citocinas con alta sensibilidad y para localizar más precisamente una citocina de un tipo celular particular.
Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 kDa ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la señal cuando se une tanto a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa más restringido (para neutrófilos, monocitos y células B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la señal intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo tanto se ha descrito como un receptor "señuelo" que actúa como un "escondite" para las moléculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos señalizan el núcleo a través de muchas vías de cinasas de proteínas asociadas a macrotúbulos (MAP) que activan los factores de transcripción nuclear incluyendo el factor nuclear (NF) K(Í. entre otros (O'Neill, 1996). La molécula antagonista IL-IRA es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la señal de transducción intracelular.
En los años recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero sólo se presentan aquellas para las que se conoce suficiente información.
Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la IL-1 exhibe miles de efectos biológicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el
CAPÍTULO 39
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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
complejo mayor de histocompatibilidad antígeno.'receptor de células T (MHC/TCR) mediando la activación de las células T como un componente importante de señal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la célula T como la IL-2 a través de la regulación a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la proliferación de la célula progenitora hematopoyética (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias hematopoyéticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia derivadas de la médula ósea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en promover el crecimiento y proliferación de algunas lineas celulares leucémicas, pero es citotóxica directamente para algunas células mlecladas por virus y para algunas células tumorales. La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del ácido araquidónico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos como intermediarios, y su capacidad para inducir la producción y liberación de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los lugares de inflamación, la IL-1 origina una regulación a la alta de los receptores de moléculas de adhesión sobre el endotelio vascular y estimula la producción de quimiocinas conduciendo a la acumulación local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1, la IL-1 puede aumentar la liberación de histamina de los basófilos y eosinófilos, contribuyendo esto a la broncoconstricción al estimular al músculo liso vascular. La IL-1 es responsable de la producción de reactantes de fase agua por el hígado (p. ej.. complemento, péplido C reactivo) a expensas de proteínas transportadoras como la albúmina. Para pagar el coste de los aminoácidos de la síntesis masiva de péptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular, acontecimiento que explica la mialgia que acompaña a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la dilatación vascular y a la hipotensión en el choque séptico a través de la inducción de óxido nítrico (NO) en las células endoteliales. y también puede ser un significativo mediador del choque cardiogénico. En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la añorexia, el sueño de ondas lentas y la letargia, así como la liberación de corticoïdes del hipolálamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la proliferación de células sinoviales. el depósito de colágeno, la resorción del cartílago y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide (AR). Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompañante de la hematopoyesis, que puede disminuir el punto más bajo y acortar el periodo de supresión medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991). Sin embargo, el efecto beneticioso de la administración de IL-1 está limitado por su profunda toxicidad. Un nivel elevado de IL-IRA puede ser más sensible como marcador de actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1. El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio, los procedimientos de cirugía general, y en personas asintomáticas que tienen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Además, la severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades del hígado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998). La elevación del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para minimizar los intensos efectos tóxicos de los niveles sistémicos aumentados de IL-1: la inyección de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina intravenosa aumentó la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes con choque séptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente medida al día 28, pero este efecto no se observó uniformemente en ensayos posteriores más grandes (Fisher, 1994). El mejor éxito con la terapia con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reducción dependiente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reducción significativa en las nuevas erosiones óseas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clínicos que evaluaban la eficacia de la administración de IL-1 RA en la enfermedad injerto contra huésped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).
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lnterleucina-2 La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminoácidos, miembro de la familia de las citocinas de cuatro hélices-!/ (Bazam, 1990), con dos puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido secuenciado en el cromosoma 4. La activación de las células T y la liberación de la IL-2 resulta de la interacción entre el TCR y el anligeno presentado en asociación con las moléculas de MHC sobre las células presentadoras de antigeno (APCs) (Fraser, 1991). El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 kDa y una cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja afinidad hecho solo de IL-2Ru. Solo el IL-2R
lnterleuc¡na-3 La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfocitos espíemeos de ratón, donde inducía a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide deshidrogenasa (Ihle, 1981). Es una proteína de 26 kDa sometida a un estricto control regulador y expresada en una población de células restringida que incluye las células T activadas, las células NK. los mastocitos y algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La síntesis adecuada de IL-3 requiere la activación de las células T a través del complejo TCR'CD3 Esto inicia las vías mtracelulares conduciendo a la activación del NF-KB, que se introduce en el núcleo para transactivar la expresión del gen IL-3 (Park, 1993: Link, 1992). El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia génica de los receptores de citocinas y tiene una cadena |5 específica de ligando asociada no covalentemente con una cadena de transducción de señal |i. El gen que la codifica ha sido secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Las células diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las células T y células B. La administración in vivo de IL-3 a dosis farmacológica origina un aumento de la producción de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones, mientras que la sobreexpresión de IL-3 mediada por retrovirus en las células medulares conlleva el desarrollo de un síndrome míeloproliferativo no neoplásico (Metcalf. 1986; Chang, 1989). Se ha sugerido un papel para la IL-3 en el desarrollo de la hipersensibilidad por contacto, ya que los ratones con déficit de IL-3 muestran un desarrollo escaso de la hipersensibilidad retardada del tipo hapteno específico (Mach. 1998). Además, evidencias muestran un papel para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chiang. 1996).
lnterleucina-4 La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulación de la producción de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamación y en el desarrollo de las respuestas T celulares efectoras. Es una proteína compleja con muchos puentes disulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosilación cuyo gen ha sido secuenciado en el cromosoma 5. La producción de IL-4 está altamente regulada y se restringe a las poblaciones de células T activadas, mastocitos, basótilos y eosinófilos. Los efectos biológicos de la IL-4 están mediados a través de receptores de IL-4 de alta afinidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. específica de ligando, y una cadena y de señal de transducción compartida por muchas otras citocinas incluyendo la IL-7 y la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R tiene homología con el IL-5Ra y con el IL-6R. La IL-4 activa las células B y promueve su diferenciación, reflejando el hecho de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de cultivos de células T activadas y factor de crecimiento de célula B duplicado. Además de inducir la expresión de CD23 y moléculas de MHC en las células B, regula la apoptosis de las células B y el cambio de isotipo. particularmente de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4 estimula la formación de colonias por los precursores eritroides, megacariocíticos. mastociticos y granulocito/monocíticos, mientras promueve el desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Erard, 1993). En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferación de células endoteliales, y origina una regulación a la alta de las moléculas de adhesión celular del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el aumento de la adhesión leucocítica a la superficie de los vasos de modo que las células inflamatorias migran a los lugares de inflamación local. Además, la IL-4 es quimiotáctica para los eosinófilos y facilita la citotoxicidad de los monocitos y de las células T (Tepper, 1989; Crawford. 1993). Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 en enfermedades alérgicas como la dermatitis atópica y en la fiebre del heno, y los ratones transgénicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alérgico en el párpado (Tepper, 1989). La IL-4 también puede conferir un grado de protección ante algunos parásitos extracelulares, y disminuir el daño de las respuestas autoinmunes inhibiendo las respuestas prolongadas de células T (Finkelman, 1986; Rapoport, 1993). La IL-4 participa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las células NK efectoras o la actividad tumorícida de los macrófagos (Bosco, 1990). Al mismo tiempo, la IL-4 está implicada en el crecimiento de las leucemias de células T humanas in vilro. Como está asociada con un cambio de las células efectoras CD8+ a células no citotóxicas, la IL-4 puede jugar un papel en la progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Erard, 1993). Los niveles elevados de IL-4 en las lágrimas y en la sangre de pacientes atópicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la enfermedad alérgica y puede servir como marcador de severidad de la enfermedad (Páranos, 1998: Fujishima, 1995).
lnterleucina-5 La IL-5 es un homodímero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminoácidos, que juega un papel central en la maduración, activación y supervivencia de los eosinófilos, y en el desarrollo de enfermedad atópica y eosinofilia. El gen IL-5 reside en el cromosoma 5 en un grupo de genes que codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF). Estructuralmente, está relacionado con el grupo de citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL-5 (IL-5R) consis-
te en una cadena u específica de ligando y una cadena |5 de transducción de señal común a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 1991). Los dominios intracitoplasmáticos de las subunidades
lnterleucina-6 La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de células T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferación de una inmunoglobulína secretada por las poblaciones de células B. Sin embargo, sus acciones se extienden a muchas células diana y ahora se reconoce como una citocina importante inmune, hematopoyética y proinflamatoria (Hirano. 1998). La IL-6 es secretada como un péptido de 184 aminoácidos de alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosilación. El gen que codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano, 1986). La molécula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conectadas por asas de péptidos interpuestas (Bazan, 1990). El complejo del receptor de la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un miembro de la supertamilia de receptores de citocinas y está compuesto de una cadena de unión a específica de ligando de 80 kDa (IL-6R«) y una cadena de señalización |i no asociada covalentemente. la gp130. La subunidad (i es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-11 y del GM-CSF, y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un dominio triptófano-serina-X-triptófano-serina en su región amino-terminal. Esto puede explicar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas citocinas. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad para la IL-6. permitiendo la señal de transducción a través de las vías de la JAK/STAT. Una variedad de células producen IL-6, incluyendo las células T y las células B, los monocitos y macrólagos, los fibroblastos, los queratinocitos, los sinoviocitos, los condrocitos y las células endoteliales. La IL-6 actúa sobre las células T, los hepatocitos, los progenitores hematopoyéticos y las neuronas. Es un potente factor de crecimiento para las líneas celulares del míeloma y el plasmocitoma humano, y tienen una acción autoenna y paracrina sobre los mielomas humanos trasplantados al ratón. En los hepatocitos. la IL-6 estimula la producción de varios reactantes de fase aguda, y en los ratones knockout por IL-6. están muy disminuidas la liberación de reactantes de la lase aguda y de Ig.
CAPÍTULO 39
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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
En las células hemalopoyéticas, la IL-6 origina la proliferación y diferenciación de células T, aumenta la formación de colonias de progenitores hematopoyéticos multipotenciales e induce la maduración de los megacanocitos. Estimula la formación de osteoclastos, la proliferación de las células del músculo liso vascular, e induce la producción del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 permite la supervivencia de las neuronas colinérgicas, mientras que en el sistema reproductor induce la secreción de gonadotropina coriónica humana (hCG) por el trofoblaslo. Han sido observadas alteraciones en la producción de IL-6 en pacientes con AR, y se ha demostrado una significativa correlación entre las concentraciones de IL-6 e IgG en el líquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988; Hermana 1989). En los modelos animales, la administración de IL-6 parece participar en el desarrollo de la glomerulonelritis membranosa proliferatíva acelerada, simulando cambios encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) (Rytfel. 1994). Otros estudios en ratones transgénicos sugieren un papel para la IL-6 en la aparición de la diabetes tipo I y en la generación de los plasmocitomas monoclonales malignos (Suematsu, 1989; Hirano, 1991). La evidencia clínica sugiere que la determinación de los niveles séricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cáncer en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neonatos con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios febriles se deben a la quimioterapia más que a la sepsis.
lnterleucina-7 La IL-7 se identificó por primera vez como una glicoproteína murina de 25 kDa que mostraba electos poliferativos in vilro en las células pre-B (Ñamen, 1988). Aunque inicialmente se describió como un factor de crecimiento de las células B, después se encontró que la IL-7 era crítica tanto para la linfopoyesis de las células T como B, así como para movilizar las células progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En humanos, el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en órganos inmunes y hematopoyéticos, como el timo, el bazo, la médula ósea y el hígado fetal (Komschhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epidérmicos, las células epiteliales intestinales y las células estromales de la médula ósea y el timo. El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamilía de receptores de la hematopoyetina, teniendo una cadena y en común con los receptores de las interleucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efectos solapados y redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de células T. El IL-7R ha sido identificad tanto en células mieloides como linfoides (Foxwell. 1992) Los ratones transgénicos para la IL-7 desarrollan un aumento del número de células B y T y de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-7R administrados a ratones originan una gran disminución del número de timocitos, y células de linaje B medulares, con disminución del número de células B y T en el bazo y en los ganglios linfáticos (Peschon, 1994). Los ratones knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran aún mayores reducciones de las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importante función linfopoyética, la IL-7 acelera la reconstitución de las células T y B en los ratones irradiados letalmente. con mínimos efectos en el compartimento mieloide. La IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotóxica sobre las células T maduras y las células T citotóxicas, respectivamente. In vitro. las células T aisladas de la lámina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exógena y muestran un aumento de la capacidad de responder a anticuerpos anti-CD3 y a IL-2, sugiriendo un papel para esta citocina en el aumento de las respuestas inmunes mediadas por células (Watanabe, 1995). Se han sugerido papeles clínicos para la IL-7. Estos van desde aumentar los compartimentos de las células T de aquellos que padecen SIDA, hasta el tratamiento de cánceres a través del aumento de la actividad LAK.
lnterleucina-8 y las quimiocinas La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable de la acumulación de neutrófilos en los lugares de inflamación (Hoch. 1996) Induce la traslocación del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polimerización de la actma. y posiblemente también la actividad de 'a cadena respi-
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ratoria en los macrófagos También es quimiotáctica para los basófilos y para un subgrupo de células T CD4/CD8+. Muchos tipos de células producen el pequeño peptido IL-8 incluyendo las células endoteliales, las células epiteliales, los fibroblastos, los neutrófilos. los monocitos. los macrófagos y las células T y. dependiendo de la célula de origen, la IL-8 variará en la longitud de aminoácidos. Tras la degradación proteolitica de su secuencia precursora de 99 aminoácidos, la IL-8 es secretada por las células endoteliales existentes predominantemente como una proteina de 77 aminoácidos y como una proteina de 79 aminoácidos cuando es producida por los leucocitos mononucleares. La IL-8 es liberada en respuesta a varios estímulos como los lipopoiisacandos (LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero unido no covalentemente, tiene su gran actividad quimiotáctica como un monomero (Paohni. 1994). Dos receptores con significativa homología en los aminoácidos median los electos biológicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL8RA) y el receptor B de IL-8 (IL-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando. El IL-8RA aparentemente tiene mayor afinidad y especificidad por el ligando, mientras que IL-8RB muestra menor afinidad y especificidad por el ligando y es capaz de unirse a otras proteínas quimioatrayentes relacionadas con la IL-8. La inyección intradérmica de IL-8 origina una intensa e inmediata infiltración de neutrófilos alrededor de las venas con un exudado de plasma local. Para alcanzar las áreas de inflamación, sin embargo, los leucocitos deben primero atravesar el endotelio local. Esto está en parte facilitado por la IL-8. que altera la expresión de integrinas neutrofilicas activando el CD11Ó/CD18 a su conformación de alta afinidad, y dispara la expresión de la L-selectina. La IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta unido a la superficie celular de las células endoteliales vecinas a la inflamación que siguen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 forma un gradiente quimiotáclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extravasados a los lugares de inflamación. Además de la secreción de IL-8 inmediatamente tras su producción, la IL-8 puede ser almacenada en los cuerpos de Weibel-Palade. donde está disponible para la liberación inmediata independíente de su síntesis (Rot, 1996). Interesantemente, aunque actúa predominantemente como quimiotáctica. el aumento de los niveles de IL-8 en el sistema circulatorio está asociado con la disminución de la acumulación de neutrófilos en los lugares de inflamación, aunque se observa una neutroM ¡a sistémica (Hechtman. 1991). Esto también sugiere una (unción antiinflamatoria para la IL-8. Los estudios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflamatorios desde la artritis crónica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los niveles de IL-8 en orina como medida para monitonzar la severidad de la enfermedad glomerular (Wada. 1994). Desde la identificación de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la superfamilia de las quimiocinas ha sido una colección de pequeñas moléculas solubles siempre en aumento importantes para la migración de los leucocitos a los lugares de inflamación. Las quimiocinas desarrollan su papel eficazmente y con gran especificidad por medio de la activación de integrinas leucocitarias, particularmente la LFA-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el ICAM-1 y el VCAM-1 de las células endoteliales. Las quimiocinas son críticas en la hematopoyesis, en la angiogénesis, en la activación de las células T y las células NK, en la patogénesis del VIH y en el desarrollo del SNC La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la posición de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de aminoácidos. La lamilia CXC (familia u) tiene un aminoácido que separa las primeras dos cisteinas: la familia CC (familia |i) no tiene aminoácidos intercalados; en la familia C (y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y la familia de quimiocinas CX3C (6) tiene tres aminoácidos intercalados. La familia CXC se divide posteriormente en miembros que tienen un residuo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y que poseen actividad angiogémca y actividad quimiotáctica neutrofílica. La familia de quimiocinas CC contiene miembros quimiotácticos para los monocitos, los linfocitos, los eosinófilos, los basófilos, los mastocitos y las células NK. Sus miembros pueden también regular la hematopoyesis en la cavidad medular, e inducir la degranulación de los mastocitos y los eosinófilos. La linfotactina es el único miembro de la familia de quimiocinas C. Tiene su mayor expresión en el timo, donde sirve para reclutar precursores de células T inmaduros de la médula ósea. Aún no se ha definido otras funciones para esta qui-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
miocína. La familia de quimiocinas CX3C también tiene un solo miembro en la actualidad, la fractalcina (la neurotactína). Es diferente de las otras quimiocinas en que es relativamente grande, con 373 aminoácidos, con el dominio quimiocina encontrado en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celulares por un tallo tipo-mucina, la porción extracelular puede ser liberada de la superficie celular para actuar como quimiotáctica para los monocitos, las células T y las células NK in vitro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el proceso inflamatorio debido a su regulación a la alta del endotelio en el SNC de ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en presencia de factor de necrosis tumoral (TNF). Ya que la fractalcina también se expresa en el cerebro normal, también puede jugar aquí un papel no patológico. La mayoría de las quimiocinas se encuentran en la familia CC, mientras que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las quimiocinas ejercen sus efectos a través de la unión a miembros de la superfamilia de receptores de siete dominios transmembrana, una familia de moléculas acopladas a la proteína G que crece rápidamente. Las células no inmunes como los fibroblastos y las células del músculo liso vascular pueden también producir y liberar quimiocinas para dirigir a las células inflamatorias a los lugares de inflamación, y pueden responder ellas mismas a las quimiocinas. Las quimiocinas pueden promover la progresión de enfermedades. En la sepsis, la IL-8 es central en la acumulación de neutrófilos en varios órganos, y en la progresión del desarrollo del estado final de enfermedad. Otras quimiocinas incluyendo RANTES (reguladas en activación células T, normales expresadas y secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque séptico, y puede proporcionar dianas para la intervención terapéutica. En las respuestas granulomalosas, la presencia de MIP-1« se correlaciona con la formación de granulomas. Del mismo modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis múltiple, la progresión y la recaída de la enfermedad está afectada positivamente por la administración de anticuerpos neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.
lnterleucina-9 La proteína IL-9 humana todavía no ha sido purificada, pero a través de la expresión del ADNc (Renauld, 1990) se cree que la proteína madura contiene 144 aminoácidos con cuatro lugares de glicosilación potencial. Su gen se ha secuenciado en el cromosoma 5, donde los genes de otros factores de crecimiento y de los receptores de los factores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF y CSF-1R) se agrupan. El ADNc para el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522 aminoácidos especifica de ligando miembro de la superfamilia de receptores hematopoyéticos, que se asocia con una cadena y de señalización de transducción que es compartida con la IL-2, IL-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que haya una subunidad del receptor común utilizada por estas citocinas puede explicar algunas de las redundancias de la actividad observadas entre ellas. Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la actividad de la tirosina cinasa JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras que la IL-9Roc se asocia con la JAK-1. También puede presentar un papel para la proteina de adaptación 4PS/IRS2 (Yin, 1995). En humanos, la expresión de IL-9 está aparentemente limitada a las poblaciones de células T CD4+ CD45 RO positiva (células T memoria), y a las células T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se requiere una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para mediar su expresión. Además, el virus tipo 1 linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) transformante de células T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una ruta de inducción aún desconocida. El papel fisiológico de la IL-9 en las células normales lodavía no es conocido, pero las células T aisladas en fresco en cultivos a largo plazo responden a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y en cultivos de células T murinas sufren transformación tumoral (Uyttenhove, 1988). Interesantemente, del 5% al 10% de los ratones transgénicos que sobreproducen IL-9 desarrollan espontáneamente linfomas linfoblásticos (Renauld, 1994). y la IL-9 es producida en las células tumorales de la enfermedad de Hodgkin y del linfoma anaplásico (Merz, 1991). Lo último muestra la posibilidad de una curva de respuesta autocrina de la IL-9 (Demoulin. 1998). En el sistema hematopoyético. la IL-9 y la eritropoyetina parecen reforzar la maduración de los progenitores entroides in vitro, y pueden promover el crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/macrófagos
(CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerce su actividad de promover el crecimiento sobre las líneas de mastocitos, y también puede regular la diferenciación de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido que la IL9 induce la resistencia a parásitos in vitro de las células dependientes de los mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la producción de IgE e IgG (Louahed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad de mantener el aumento de la extensión neuronal y promover la excitabilidad sobre cultivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones inmortalizados (Mehler, 1993).
lnterleucina-10 La IL-10 es una potente atocina antiínflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una proteína de 160 aminoácidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim, 1992), que contiene cuatro residuos cisteína y dos puentes disulfuro que mantienen su estructura helicoidal y su actividad biológica. La codifica un gen secuenciado en el cromosoma 1. El receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado sobre todo en las células hematopoyéticas, y es una proteina de 90 a 110 kDa cuyo dominio extracelular se une a las moléculas dimerizadas de IL-10 (Tan. 1995). La transduccíón de señales de la IL-10 está mediada a través de la vía de la JAK/'STAT (Lalani. 1997). Aunque muchos tipos de célula, incluyendo las células Th2. las células T CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrófagos, los mastocitos, los queratinocitos, los eosinófilos, las células epiteliales y muchas células tumorales son capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la mayor cantidad de IL-10 en la mayoría de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997). Ya que puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia producción a través de mecanismos de retroalimentación negativos, la IL-10 regula la respuesta inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10 actúa Inhibiendo la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la IL-íB, la IL-6, la IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas incluyendo la IL-8 y la MIP-1u, suprimiendo la transcripción de sus genes correspondientes (Goldman, 1997). La IL-10 también suprime la liberación de los radicales libres del oxígeno e inhibe la actividad microbicida dependiente del óxido nítrico en los macrófagos (Fleming, 1996). En situaciones alérgicas como el asma, la producción de IL-5 es crucial en la iniciación del evento. In vitro, la IL-10 previene la producción de IL-5 en las células T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresión de MHC de Clase II sobre las APCs. También inhibe la expresión de MIP-1u en los neutrófilos, monocitos y macrófagos humanos; inhibe la producción de químiotácticos activos en los lugares de inflamación crónica; y puede ¡nactívar directamente la función de los eosinófilos y causar la muerte del eosinófilo. Estos hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la inllamación aérea crónica (Petrolaní, 1999). Los estudios con animales también han sugerido un papel terapéutico para la IL-10 en proporcionar una protección mucosa en la enfermedad inflamatoria intestinal, y en disminuir los niveles séricos de IL-8 en los animales con pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los ratones inyectados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneales de endotoxina que. de otro modo, serían letales. La IL-10 puede servir como factor de crecimiento para muchas líneas celulares malignas como los linfomas de células B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las células del mieloma maligno. La producción de IL-10 en otras enfermedades malignas puede proporcionar una forma de eludir las respuestas locales de las células T. Sin embargo, los estudios también demuestran la capacidad de la IL-10 de inhibir el crecimiento de las células de la leucemia mieloide crónica in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995). La IL-10 puede participar en la inducción y perpetuación del LES y la actividad de la enfermedad se correlaciona con los títulos de IL-10 (Houssiau, 1995). Está implicada en otras enfermedades autoinmunes incluyendo la miastenia gravis, la enfermedad de Graves, el síndrome de Sjógren, la polimiositis, la psoriasis, la esclerosis sistémica, el pénfigo vulgar, el penfigoide ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani, 1997). Además, la detección de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en pacientes con carcinoma de células pequeñas de pulmón y adenocarcinoma de colon puede ser un predictor útil de la progresión de la enfermedad clínicamente indetectable (De Vita. 1999, 2000).
CAPÍTUIO 39
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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
lnterleucina-11 La IL-11 es una citocma pleotrópica con numerosos efectos en muchos tejidos incluyendo la médula ósea, el cerebro, el intestino y los testículos. El ADNc de la IL-11 codifica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminoácidos, con una secuencia líder de 21 aminoácidos que parecer carecer de lugares potenciales de glicosilación y de residuos cisteina. El gen codificante se ha secuenciado en el cromosoma 19, y su estructura tridimensional contiene probablemente cuatro residuos (5-hélíce (Czupryn, 1995). El receptor de la IL-11 (IL-11 R) está formado por una asociación no covalente de una cadena i/, específica de ligando y una cadena p de transducción de señal, la gpl30. El complejo IL-6R también utiliza la subunidad gp130 como cadena de señalización, explicando algunos de los solapamientos en las acciones de estas cilocinas (Cherel, 1996). Cuando se asocia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unión para la IL-11 es mayor y se genera una señal biológica a través de la formación de homodímeros de gp130. Se cree que estos activan las vías de transducción incluyendo las cinasas JAK. las cinasas MAPK. las proteínas cinasa ribosomales S6, y la familia de cinasas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detectado en muchos tejidos estimulados incluyendo los fibroblastos, las células epiteliales, los condrocitos. los sinoviocitos, los osteoblastos y las células del glioblastoma. Las evidencias indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria (Trepicchio. 1998: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la baja la función efectora macrofágica inhibiendo la expresión de los genes del TNF-a, la IL-1p. la IL-12 y el óxido nítrico, a través de la prevención de la translocación nuclear del factor de la transcripción nuclear NF-Kp" (Trepicchio. 1998). Sus efectos hematopoyéticos (Du. 1995) incluyen un papel en la megacariocitopoyesis, y la estimulación de la eritropoyesis, la proliferación y diferenciación macrofágica, y la producción de inmunoglobulinas por las células B. Además, regula la diferenciación y maduración de los progenitores de células mieloides en combinación con el factor de células madre (SCF), y puede participar en la linfopoyesis. En cultivos de médula ósea a largo plazo (LTBNMCs). la IL-11 aumenta la celularidad de las células estromales adherentes y promueve la hematopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en quimioterapia, la terapia con IL-11 mejora la recuperación de la hematopoyesis y de la función inmune, y disminuye la morbilidad de la supresión de la médula ósea por la quimioterapia. La IL-11 tiene también extensos efectos no hematopoyéticos (Du. 1995). La IL-11 puede funcionar en la inflamación pulmonar y es producida por la estimulación alveolar y por las células pulmonares epiteliales en grandes cantidades. Los virus respiratorios son potentes estimuladores de la síntesis de IL-11 en el pulmón, y la IL-11 es detectada en las secreciones nasales de niños con infecciones del tracto respiratorio superior (Einarsson, 1996). La IL-11 también está implicada en el control del crecimiento de las células epiteliales gastrointestinales, ya que muestra una inhibición reversible de la proliferación de las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vitro. La IL-11 también puede ser capaz de conferir protección mucosa al epitelio gastrointestinal tras la radiación y la quimioterapia (Keith. 1994). Otras actividades de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in vilro. un papel en la supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como motoras, la estimulación de la liberación in vivo e in vitro de reactantes de lase aguda y la regulación del metabolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la biología lumoral, la IL-11 actúa sinérgicamente con otras citocinas para promover el crecimiento de las lineas celulares de la leucemia humana y estimula la formación de la colonia de blastos leucémicos (Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se ha detectado un efecto trombootopoyético beneficioso en pacientes con enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999).
Interleucina-12 La IL-12 es una citocina heterodimérica de 70 kDa formada por dos cadenas unidas covalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes separados (Trinchieri. 1994). La IL-12 promueve la diferenciación de las células humanas tipo Th1, preparándolas para incrementar la producción de interferón-y (IFN-y). y aumenta las capacidades citolíticas de las NK y de las células T (Heufler. 1996). Estudiado inicialmente en las células T activadas y en
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las células NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la superfamilia de receptores hematopoyéticos y tiene una homología significativa con la gpl 30 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leucemia (LIF). La IL-12 es producida principalmente por los monocitos y los macrófagos, por las células dendriticas (APC profesionales) y, en una pequeña cantidad, por los neutrófilos y los queratinocitos. Su producción está regulada a la baja por la IL-10 y el TGF-p. y su síntesis esta aumentada por el IFN-y. La síntesis de IL-12 es inducida rápidamente en las células fagociticas por ciertos tipos de bacterias, patógenos intracelulares incluyendo los protozoos y los hongos, y en menor medida los virus. También puede producirse con la interacción homotipica del antigeno CD40 en las células T activadas y en los fagocitos (Trinchieri, 1997). La IL-12 tiene un papel vital como citocina proinflamatoria. En modelos de choque séptico implicando inyecciones intraperitoneales de endotoxina en ratones, se encontró que la IL-12 promueve la sobreproducción de IFN-y. que por un mecanismo de relroalimentación positivo induce la liberación de más IL-12. Finalmente, la sobreproducción de IFN-y origina la muerte del animal. El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la observación de que la inyección de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en ratones rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994). Las evidencias sugieren que la IL-10 inhibe la producción de IL-12 por los fagocitos, y que la IL-12 por si misma estimula la producción de IL-10, sirviendo por ello como regulador negativo de su propia producción (Meyaard, 1996). Las evidencias experimentales en animales sugieren un papel exacerbante para la IL-12 en ciertas enfermedades autoinmunes incluyendo la diabetes autoinmune. la artritis, el modelo animal de la esclerosis múltiple (EAE) y la colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones alérgicas, la IL-12 juega un papel paliativo a través de su capacidad de regular a la baja la producción de IL-4, IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespuesta de la vía aérea inducida por antigeno en modelos de ratón (Gavett. 1995). La IL-12 tiene significativos efectos antitumorales y antimetastásicos en modelos de ratón in vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la producción de IFN-y y por otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se ha notado toxicidad gastrointestinal, hepática y hematológica en ensayos clínicos con rlL-12 sobre pacientes con carcinoma de células renales. Debido a su papel en promover las respuestas de memoria de Th1 a las vacunas, la IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacunas.
lnterleucina-13 La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminoácidos, clonada por primera vez de linfocitos T activados y clones de células T en 1993, con cuatro lugares de N-glicosilación y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuenciado en el cromosoma 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-9 y el GM-CSF. Se cree que posee una estructura («-helicoidal, con cuatro hélices r* y dos cadenas plegadas p, El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las células B. monocitos, basófilos. eosinófilos. mastocilos. células endoleliales, fibroblastos, queratinocitos y ciertas células tumorales. Aparentemente, no se expresa en linlocitos T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor común, el gp140, una proteína de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de baja afinidad (IL-13Ra) para la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru). No es sorprendente, entonces, que la IL-13 simula muchas de las acciones biológicas de la IL-4. Cuando se une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R inducen la fosforilación de la tirosina del JAK-1 en las células hematopoyéticas. y del JAK-2 en las células no hematopoyéticas. seguido por la activación del STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995). La IL-13 es liberada por las poblaciones clónales de células T CD4CD8+ ThO, Th1 y Th2 en respuesta a la estimulación antigénica específica o a la activación policlonal, y por los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos tras la estimulación a través de sus receptores de alta afinidad para la IgE (CD23) (Keegan. 1996). El ARNm de la IL-13 es inducido en las células B normales tras la correcta estimulación, y la proteína IL-13 y su ARNm han sido detectados en enfermedades malignas y en células B transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la IL-13 en el desarrollo de enfermedades malignas de las células B (de Vnes, 1998).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrófagos, la IL-13 induce una aumento significativo de la expresión de moléculas de MHC Clase II y CD23, sugiriendo un papel para la IL-13 en facilitar la capacidad de presentación de antigenos de estas células a las células T. Es quimiotáctica para los monocitos. y promueve la proliferación de las células B activadas, e in vitro parece promover la formación de colonias de megacariocitos y aumentar la proliferación de células progenitoras murinas en la médula ósea. La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado un importante papel para ella en la respuesta alérgica. La IL-13 es capaz de inducir la secreción de IgE de cultivos de células B humanas y de aumentar la expresión de la molécula de adhesión proinflamatona VCAM-1 en las células endoteliales. Este hecho y la observación de que la síntesis de IL-13 está aumentada en situaciones atópicas en el pulmón en los asmáticos y en pacientes con sinusitis crónica mientras que está disminuida en respuesta a la administración de corticoesteroides pone de relieve la importancia de la IL-13 en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo, la IL-13 parece atenuar la respuesta alérgica regulando a la baja la capacidad de las células endoteliales y de las células del músculo liso de la vía aérea de liberar el quimiotáctico RANTES de los linfocitos T y de las células inflamatorias (Tony. 1994).
El pretratamiento con IL-13 inhibe la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos activados por LPS. Su regulación a la baja de la producción de factor tisular y su regulación a la alta de la producción de trombomodulina pone de relieve también su naturaleza antiinflamatoria.
estimula la proliferación de mastocitos in vitro e m vivo. La IL-15 es quimiotáctica para las células T, recatándolas a los lugares de inflamación, y se ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnnes, 1996). Otras evidencias indican un papel para la producción de IL-15 en las situaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoidosis. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfocitos activados hacia áreas de inflamación donde serán capaces de liberar citocinas adicionales proínflamatorias y ejercer sus efectos citotóxicos (Kirman. 1998).
Interleucina-16 Reconocida inicialmente como un factor quimiotáctico en cultivos de células mononucleares de sangre humana periférica estimuladas con mitógenos (Center, 1982), la IL-16 está reconocida como un quimiotáctico promflamatorio de células T. Los linfocitos estimulados con mitógenos producen IL-16 como una molécula precursora que es degradada y secretada como una proteína de 17 kDa, 130 aminoácidos. Solo tras la agregación en homotetrámeros la IL-16 parece poseer actividad biológica (Bazan, 1996). Se cree que la IL-16 contiene seis láminas de pliegues (i incluyendo la secuencia de aminoácidos, glicina-leucina-glicína-fenilalanma. que se cree que facilita las interacciones proteina-proteína como la autoagregación. El gen que codifica la IL-16 ha sido secuenciado en el cromosoma 15. La superficie de las células CD4 parece servir como receptor de superficie para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la señalización biológica (Cruikshank, 1994) a través de vías que pueden incluir la fosforilación del p56 . w
Interleuc¡na-14 La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser una molécula distintiva.
Interleucina-15 La IL-15 es una proteína de 14 a 15 kDa, 114 aminoácidos, identificada por primera vez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de las lineas celulares epiteliales de ríñones de mono (Grabstem. 1994). Aunque su secuencia de aminoácidos primaria es única, su estructura tridimensional contiene dos puentes disulfuro y se parece bastante a la de otros miembros de la familia de citocinas de cuatro u hélices de unión, que incluye a la IL-2. citocina con una actividad funcional similar. El gen que codifica la IL-15 se ha secuenciado en el cromosoma 4. cerca del gen de la IL-2 (Anderson. 1995a). El receptor de la IL-15 (IL-15R) está compuesto de tres subunidades proteicas: una cadena IL-15Ra específica de ligando, y unas cadenas p y y idénticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las actividades similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homología con la IL-2Ra, aunque su distribución tisular es diferente, y al igual que la IL-2R«, es incapaz de transducir una señal a menos que esté asociada con las cadenas de Iransducción de señal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R en las células T utiliza al JAK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la vía JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995). Los macrófagos. los fibroblastos, los queratinocítos. las células epiteliales y otros tejidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por los linfocitos. De cualquier modo, la distribución tisular de la IL-15 es amplia, identificándose también transcripción de ARNm en monocitos y macrófagos, células de Langerhans. células dendritas y células endoteliales. El ARNm de la IL-15 parece almacenarse en una muestra translacionalmente inactiva que está disponible para la traslocación precoz en la respuesta innata a la infección. La producción de IL-15 por los macrófagos en la fase inicial de la infección microbiana puede servir para activar a las células NK como parte de la respuesta a la infección (Cosman. 1995). Al igual que la IL-2, se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimulación de las células T en proliferación, en la inducción de la actividad de citocinas en las células T. en la proliferación de las células NK. y en la activación de la proliferación de las células B y liberación de mmunoglobulinas (Kirman, 1998). Los modelos murinos sugieren un papel esencial para la IL-15 en el desarrollo de las células NK. A diferencia de la IL-2. la IL-15 puede aumentar anabólicamente la masa muscular esquelética, y se ha demostrado que
La IL-16 es liberada por las células T tras la estimulación con mitógenos. antígenos, histamina y serotonina. Los cultivos de eosinófilos y mastocitos también liberan IL-16 en presencia de GM-CSF. y también PMA e ionóforos de calcio, respectivamente. La IL-16 también ha sido identificada en los sobrenadantes de cultivos de células epiteliales respiratorias extraídas de asmáticos. La IL-16 sirve como quimioláclico para las células T CD4+ y otras células periféricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los monocitos y eosinófilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y estimula la progresión del ciclo celular en células CD4+ humanas (Cruikshank. 1994). Además, la IL-16 promueve el aumento de la adhesión al ECM por los eosinófilos, y regula a la alza la expresión de HLA-DR sobre los monocitos (Wan, 1995). Sobre los cultivos de células T, la IL-16 inhibe la expresión del IL-2R mediado por el TCR y la producción de IL-2, y puede hacer a estas células insensibles al AICD. El resultado in vivo puede ser el aumento de la acumulación de células T CD4+ cebadas que responden a citocinas en los lugares de inflamación, que están protegidas de la AICD mediada por TCR (Cruikshank, 1994). Se ha informado que los asmáticos tienen IL-16 constantemente presente en el epitelio de su vía aérea con células T CD4+, sugiriendo un papel para la IL-16 en el reclutamiento de estas células en el asma. Los modelos murinos sugieren un papel para la IL-16 en la inflamación granulomatosa. La IL-16 también parece suprimir la transcripción del VIH en las células T infectadas por el VIH a través de la activación de un factor represor no identificado.
Interleucina-17 Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-8), la IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada como homodímeros unidos covalentemente por un restringido grupo de células T memoria activadas (Yao, 1995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta citocina descrita recientemente ha sido mapeado en el cromosoma 2 y su expresión parece estar estrechamente regulada. La IL-17 se expresa predominantemente por las células T CD4+ CD45-RO en respuesta a una variedad de señales de activación incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 mAb, el antiCD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996). Los estudios en ratones sugieren que. en contraste con la expresión restringida de la IL-17. el receptor de la IL-17 (IL-17R) es una proteína novel ampliamente distribuida especialmente abundante en el bazo y el riñór
CAPÍTULO 39
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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
Evidencias recientes implican la vía de señalización JAK/STAT en la transducción de señales por el IL-17R (Subramaniam. 1999). Algunas evidencias parecen sugerir un papel para la IL-17 como inhibidora del crecimiento de las células T activadas en ratones (Yao. 1995a). Esto mismo aún no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-17 también parece regular al alza la producción de IL-6. IL-8. PGE y óxido nítrico, y su secreción por los fibroblastos cutáneos, los sinoviocitos. las células endoteliales, las células del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma de riñon. La IL-17 induce indirectamente la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente promueve la diferenciación de estas células a neulrófilos (Yao, 1995b). La IL17 también induce la expresión de ICAM-1 sobre los fibroblastos in vitro (Fossiez, 1996). ;
Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la protección frente a la infección bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la producción de altos niveles de citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede servir para regular el proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recientes sugieren la posibilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los tumores de cuello uterino en humanos (Tartour, 1999).
lnterleucina-18 Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una proleina de aproximadamente 18 kDa producida por los macrólagos activados, las células de Kupffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Torigoe, 1997). La formación de la IL-18 biológicamente activa requiere el procesamiento del precursor de 24 kDa por la caspasa-1 (ICE) en las células de Kuplfer. El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idéntico a la proteína relacionada con el IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando se une a su ligando el IL-18R induce la unión del ADN NF-vp. Se han identificado IL-18Rs de alta y baja afinidad, pero sus papeles en la transducción de señal no están claros. La función primaria de la IL-18 parece ser la inducción del IFN-y en las células Th1 activadas y en las células B anti-CD40 activadas (en presencia de IL-12). La IL-18 también induce la síntesis por las células T de CM-CSF e IL6. y promueve la cilotoxicidad sobre las células NK permitiendo la exocilosis de perforinas y granzima A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un papel para la IL-18 fuera del sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997; Conti. 1997). Los papeles fisiológicos de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la infección, y un papel en el rechazo de tumores. A través de la supresión de la producción de IgE. la IL-18 puede abortar la respuesta alérgica (Yoshimoto, 1997), pero la producción no regulada de IL-18 está asociada con el daño del parénquima hepático en modelos animales. La IL-18 puede participar en la patogénesis de la linlohistiocitosis hemolagocítica (HL) a través de la inducción de células Th1. La medición de los niveles de IL-18 en la sangre perilérica de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorización de la actividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).
Factor transformante del crecimiento [i El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capacidad para mantener la formación de colonias por los fibroblastos del riñon de ralas normales (NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidérmico (Clark, 1998). En mamíferos, son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11. TGF-|12 y TGF-P3) (McCartney-Francis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un homo- o heterodimero del péptido TGF-p de 12.5 kDa degradado por endopeptidasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secreción, el dimero TGF-p de 25 kDa se une al péptido de unión latente del TGF-p de 75 kDa (TGF-(3-lpb), y juntos se unen al péptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa (TGF-(i-lap) formando el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc). El TGF-p-lc se encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las plaquetas. Una vez liberado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de superficie celulares para el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM y permanecer latente. Alternativamente, puede degradarse a su forma activa una vez secretado a través de las serín proteasas liberadas ya sea por la misma célula o por células vecinas. EL péptido de degradación bioactivo se
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asocia después con los componentes o transportadores de ECM como la a -macroglobulma. la albúmina o la IgG. lo que facilita la captación y el metabolismo del TGF-p. El TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y diferenciación de células epiteliales: en la carcinogénesis. y en la inflamación, la reparación y la angiogénesis. Sus efectos biológicos son transducidos a través de cualquiera de los seis receptores descritos incluyendo las tres clases de receptores transmembrana y muchos receptores solubles. De estos, los receptores del TGF-p" tipo I y tipo II son capaces de transducir señales biológicas, mientras que los receptores tipo III carecen de residuos de señalización y sirven sobre todo para almacenar y presentar el TGF-|5 a los receptores de señalización. La señal biológica es transducida al núcleo añadiendo proteínas Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermediarios (Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996). El TGF-jJ es producido por cualquier linaje de linfocitos desde linfocitos hasta macrófagos y células dendríticas. y actúa tanto en la respuesta autocnna como paracrina. Sus actividades biológicas son muchas y bien equilibradas, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la insuficiencia (McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoutóe TGF-p, el 30% al 60% de los embriones demostraron fallo en la angiogénesis y en la hematopoyesis, y abortos espontáneos, mientras que en ratones transgénicos con sobreexpresión de TGF-p. la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la pérdida de la diferenciación epitelial respiratoria originando la muerte perinatal. El TGF-|i funciona tanto como laclor de proliferación como inhibidor del crecimiento. Inhibe el producto del gen del retmoblastoma (Rb) e inhibe la expresión del protooncogén c-myc, provocando una alteración del equilibrio de las proteínas reguladoras positivas y negativas que controlan el ciclo celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresión de TGF-|4 origina hipo o hiperproliferación de células epiteliales, en donde la hiperproliferación está asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la agresividad de las líneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon aumenta con el aumento de la pérdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|! también puede servir como supresor de tumores, ya que los anticuerpos contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de las células del carcinoma de colon in vitro. En el compartimento hematopoyético (McCarteny-Francis, 1998), el TGF-p controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la supervivencia de las células dendríticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TGF-J5 mantiene el proceso inflamatorio a través del aumento de la adhesión de las células inflamatorias a través de la regulación a la alta de las integrinas. y quimiotácticamente reclutando y activando linfocítos nativos. Interesantemente, los ratones knockout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las células B parecida a la autoinmunidad, con infiltración por un número considerable de macrólagos y linfocítos de órganos incluyendo el corazón, el pulmón y el hígado (Kulkarni, 1993). El TGF-p puede promover normalmente la tolerancia a lo propio regulando la maduración de los limocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones aulorreactivos sufren apoptosis. En la periferia, una población de TGF-|i producidos por las células Th2 mantienen la tolerancia periférica promoviendo la anergia clonal. El TGF-p suprime la respuesta inflamatoria y promueve la curación a través de la inhibición de la proliferación de células T y B. la inhibición de la función de las células NK, la inducción de los antagonistas de citocinas, la regulación a la baja de la expresión de integrinas, y la inhibición de la liberación de IgG. Sin embargo, la sobreproducción de TGF-p no solo acaba con la respuesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curación, provocando una fibrosis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994). Se ha propuesto un papel para el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el TGF-ji insuficiente puede permitir la formación de la placa arteriosclerólica. En esta via, la formación de la placa en algunos ratones seleccionados es inhibida por la administración de tamoxifeno, que aumenta el TGF-p circulante.
Factor de necrosis tumoral El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que puede existir como forma transmembrana de 26 kDa, o como péptido soluble que se homotrimenza para formar la citocina fisiológicamente activa de
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar células tumorales y para inducir la necrosis hemorrágica en tumores trasplantados a ratones. Es un miembro de la familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos por tres cadenas polipeptídicas y capaces lodos de unirse a miembros de una lamilia de receptores de TNF relacionados estructuralmente (Beutler, 1994). La mayoría de los efectos del TNF están mediados a través de dos receptores de superficie celular de alta afinidad: el TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando son ligados, estos receptores median señales para la proliferación y muerte celular programada (apoptosis), con evidencias que muestran que esto último está mediado a través de la inducción de la pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la liberación de proteínas del especio intermembrana. En relación con esto, el TNFR-I tiene en su dominio mtracelular un residuo denominado "dominio mortal" que es necesario para la transducción de la señal apoptótica. Principalmente, producen TNF los macrófagos y los monocitos. pero otras células incluyendo los linfocitos, los mastocitos, los neutrófilos, los queratinocitos. los astrocitos, las células microgliales, las células del músculo liso y las células tumorales también lo producen. El TNF puede actuar localmente en una función paracrina, pero también actúa en lugares distantes a modo de hormona. Los efectos biológicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e incluyen un efecto citotóxico directo, la modulación del crecimiento y diferenciación tisular, y un papel en las situaciones de inflamación e infección crónica. Además, el TNF-a es responsable del síndrome de caquexia tumoral y de la mayoría de las infecciones parasitarias. A través de la estimulación de los neutrófilos. el TNF-a aumenta la fagocitosis, la degranulación y la actividad de la cadena respiratoria. Los efectos proinflamatorios adicionales incluyen la inducción del aumento de la formación del factor activador de plaquetas (PAF) en los neutrófilos, la estimulación de la secreción de ácido araquidónico, el aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada por células, y el aumento de la adherencia de los neutrófilos al endotelio activado por TNF a través de la regulación a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el papel proinflamatorio del TNF. Los modelos animales implican al TNF en la AF¡ y en la enfermedad inflamatoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflamatorio a través de la activación de las células endoteliales y de la inducción de las quimiocinas quimíotácticas de neutrófilos. Además, se ha propuesto un papel para el TNF en las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de múltiples estudios de esclerosis múltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999). En pacientes que sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infección por Borrelia recurrenlis), la administración de anticuerpos bloqueantes anli-TNF ha demostrado suprimir la reacción de Jarisch-Hexheimer (hipotensión persistente) que acompaña a la administración del antibiótico (Fekade, 1996).
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multicelulares está compuesto en parte de moléculas de adhesión que se describen a continuación. Estas compleías glicoproteinas permiten la migración celular durante la embriogénesis y cicatrización de heridas, y gobiernan el tráfico de leucocitos, que es de importancia clave en la linfopoyesis y en la respuesta inmune. Las moléculas de adhesión se dividen convencionalmente en cinco grupos basados en su homología estructural: cadherinas, mucinas, integrinas, selectinas y moléculas de la superfamilia de inmunoglobulmas. Las cadherinas son expresadas en su mayoría en las células epiteliales e interaccionan con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son proteínas muy glicosiladas que interactúan principalmente con las selectinas. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las mmunoglobulínas e interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con la otra. Las integrinas y las selectinas se discuten ahora.
Integrinas La familia de moléculas de adhesión de las integrinas (revisadas en Gonzalez-Amaro. 1999) proporciona una unión física crítica entre los elementos externos a la célula (otras células y el ECM) y los elementos del interior de la célula (el citoesqueleto, las moléculas intracitosólicas y el núcleo). Cada miembro de la familia de las integrinas está compuesto de un heterodimero de subunidades a y p unidas no covalentemente (Tabla 39-1). Actualmente, están completamente descritas las 16 subunidades a y las ocho |1 pudiendo originar más de 22 combinaciones de heterodímeros. Las 14 principales integrinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de expresión y en la especificidad de ligando. Las integrinas (i, (las integrinas de la activación final [VLAsJ) se crean por la asociación de una subunidad de cadena |i, (CD29) con cualquiera de las subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son expresadas en todas las células que requieren un firme anclaje al ECM, y en los leucocitos, plaquetas y algunas células tumorales circulantes. Las integrinas p , que tienden a ser expresadas principalmente por los leucocitos y las células mieloides, resultan de la asociación de la subunidad de la cadena p (CD18) con cualquiera de las múltiples subunidades rx Cuando se combinan con la subunidad a, (CD11a), se forma la integrina p LFA-1 (CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la adhesión leucocitana al endotelio vascular durante la migración transendotelial. La subunidad de ?
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Tabla 39-1
Principales integrinas: estructura molecular e interacción
Interferón-y El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143 aminoácidos, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las células T de la replicación viral en cultivos de fibroblastos. Está codificado por una gen simple que está mapeado en el cromosoma 12. La células T y las células NK son las únicas fuentes conocidas de IFN. Las células T lo producen en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica, y las células NK lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16, o en presencia de macrófagos activados (Carson, 1995). In vilro, el IFN es un potente estimulador de los macrófagos y aumenta fuertemente su actividad tumoricida. Origina una regulación a la alta de las moléculas MHC en muchos tipos celulares incluyendo las APCs. Además, regula la producción de anticuerpos por las células B (Snapper, 1987). y estimula a las células Thl. En respuesta a la infección, el IFN induce a los macrófagos a matar a los microorganismos intracelulares a través de la producción de metabolitos oxidativos y proteasas. Clínicamente, el IFN se ha empleado para aumentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que tienen enfermedades granulomatosas crónicas (Bolinger, 1992). Se ha mostrado poco prometedor como agente antitumoral.
LMN = laminina FBN = tibronectma FBGN • librinogeno. VN = vitronectina. vWF = factor de von Willebrand. VCAM = molécula de adhesión celular, LFA = antigeno linfocitico funcional: ICAM= molécula de adhesión mtracelular
CAPÍTULO 39
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la cadena p en asociación con la subunidad « (CD11b) forma el Mac-1 (CD11b/CD18), una integrina expresada en las células mieloides y en los fagocitos mononucleares. Las subunidades a. de las integrinas son proteínas de membrana con 120 a 180 kDa con dominios intracitoplasmáticos cortos, un fragmento extracelular largo con siete dominios homólogos, y muchos residuos de unión para iones metales (lugares de adhesión dependientes de iones metales [MIDAS]) que se cree que funcionan convirtiendo la integrina de una conformación inactiva a una activa. Tanto la subunidad a como la |i se unen a un ligando, pero se cree que generalmente la subunidad a proporciona especificidad de ligando. ?
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Los tallos intracitoplasmáticos de las subunidades de las integrinas a y p se asocian con los componentes del citoesqueleto para transducir señales mtracitoplásmicas. En el proceso de transducción de la señal, las integrinas se asocian e interaccionan con las otras proteínas asociadas a la membrana, con los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplásmicos no citoesqueléticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) designada como CD47, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de las proteínas asociadas a la membrana que a través, sobre todo, de su asociación con las integrinas (5-, puede funcionar como un transductor de señal. Otras proteínas asociadas a la membrana implicadas en la señalización de integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que están implicados en la formación de picnosomas de la membrana celular y en la agregación plaquetaria. respectivamente. Las moléculas citosólicas incluyendo la proteína asociada a dominios citoplasmáticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la compleja actividad de la migración de célula mediada por integrina p,. Quizás las asociaciones intracítoplasmáticas de las moléculas de integrinas mejor estudiadas son aquellas asociadas con las proteínas del citoesqueleto rx-actinina, talina filamina, vinculina, tensina y paxilina. Estas proteínas del citoesqueleto a través de su asociación con las subunidades de las integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesqueleto y dirigen la migración celular, la fagocitosis, la formación de fibras de estrés en los lugares de contacto, la transducción de señal intracelular, y unen las proteínas del citoesqueleto separadas. 2
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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
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El patrón de distribución de las integrinas es amplio, especialmente entre aquellas integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las células a los componentes del ECM general como el colágeno y la laminina. Para estas
integrinas que median la unión a los componentes menos ampliamente distribuidos, la distribución tisular está más restringida. La expresión de las moléculas de integrina depende de la activación celular, y puede estar regulada a la alta o a la baja en respuesta a estímulos específicos del ambiente externo, incluyendo la estimulación local por citocinas o la interacción inmune. La interacción de las integrinas leucocitarias con las células endoteliales es crítica para la evolución de las respuestas inflamatoria e inmune. Además, el trasporte de las células linfoides a sus lugares de residencia y la diseminación intravascular de las metástasis implican similares interacciones endoteliales mediadas a través de las integrinas de superficie y otras poblaciones de moléculas de adhesión, las selectinas y sus ligandos. La extravasación de leucocitos ocurre durante el transporte celular como el tráfico de las células T y/6 a las placas de Peyer, y como parte de la respuesta inflamatoria. Ambos procesos implican etapas similares, empleando diferentes moléculas de adhesión. En la inflamación el proceso comienza con la liberación local de citocinas proinflamatorias como el TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y, que activan el endotelio local para aumentar la expresión en su superficie de moléculas de adhesión incluyendo miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Además, las células endoteliales liberan agentes quimiotácticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unión y un gradiente quimiotáctico soluble reconocible por la transmigración de células inflamatorias, que las localiza en los focos inflamatorios. Este proceso para los linfocitos y los eosinófilos (Fig. 39-1) implica: (1) unión de los leucocitos circulantes a la superficie endotelial principalmente por las selectinas endoteliles (selectinas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y (2) movimiento leucocitario {rolling), en donde a través de la expresión rápida secuencial, principalmente de la integrina leucocitaria VLA-4 y u p , la fuerza de cizallamiento (shean forcé) proporcionada por el torrente sanguíneo mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endotelial, permitiendo poner estas integrinas en contacto con sus ligandos endoteliales, el VCAM-1 y el MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrófilos, el movimiento o rodamiento está mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, las moléculas de adhesión celular leucocitarias desencadenan acontecimientos bioquímicos conduciendo a (3) la activación leucocitaria y a la conversión de sus integrinas en estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad de, principalmente, LFA-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesión celular 4
5. M i g r a c i ó n quimiotáctica Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del torrente sanguíneo hacia los tejidos está regulado por la interacción de la adhesina de la superficie del leucocito y de la superficie de la célula endotelial a través de un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, laminación, aplanamiento y transmigración (o diapédesis) cuya dirección la proporciona el gradiente quimiotáctico.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario, y (5) la transmigración leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gradiente quimiotáclico. Es todavía tema de debate si los leucocitos pasan directamente a través de las células endoteliales individuales, o simplemente pasan entre las células endoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endotelio, la migración celular mediada por integnnas a través de la matriz extracelular por medio de un gradiente quimiotáctico completa el viaje de los leucocitos a los focos de inflamación. Los estados de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesión leucocita tipo I) y los defectos congénitos en la expresión de las selectmas y de los ligandos demuestra el papel indispensable que juegan estos receptores en producir la respuesta inflamatoria y en el tráfico linfocita. En estos pacientes los neutrófilos son incapaces de salir del torrente sanguíneo y de migrar a los lugares de inflamación o infección, creando en efecto un estado de supresión inmune con aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y un neutrofilia periférica paradójica (Bullard, 1996). Los eventos que acontecen en el choque séptico, en la trombosis, en la lesión de reperfusión y en las metástasis también requieren la actividad de las integrinas y las selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo terapéutico de anticuerpos monoclonales, ligandos de moléculas de adhesión solubles y otras intervenciones, incluyendo los oligonucleóticos antisensibilizantes para superar la enfermedad mediada por las moléculas de adhesión (Gonzalez-Amaro. 1998: Buckley. 1997).
Selectinas La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres proteínas homologas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayoría de los leucocitos y se cree que juega un importante papel en el transporte o tráfico de los linfocitos nativos y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacenada en los granulos
PERSPECTIVAS Claramente, muchas de las citoemas y moléculas de adhesión presentadas aquí juegan un papel en los estados de enfermedad. Los médicos esperan que un día se estimule la remisión de las lesiones patológicas mediadas por citocinas a través de la manipulación tn vivo de los niveles y proporciones de las citocinas pro y antiinflamatorias. Antes de que esto se pueda considerar seriamente, los investigadores y los laboratorios deben continuar descifrando el lenguaje de las citocinas en las células, y desanoliando y retinando los ensayos significativos de éstas. De momento es posible monitorizar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo para la sepsis (IL-6). predecir la progresión de la enfermedad (IL-10) y disminuir los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a través de la monitorización
de los niveles de citocinas seleccionadas y administrando las citocinas apropiadas. En la actualidad, mientras no esté claro, los ensayos clínicos continuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarán finalmente qué intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente útiles en la práctica clínica. BIBLIOGRAFÍA Alexandrow MG. Moses HL: Transforming growth lactor-beta and cell cycle regulation. Cancer Res 1995; 55 1452-1457. Anderson DM. Johnson L, Glaccum MB, et al: Chromosomal assignment and genomic structure of 1115 Genomics 1995a; 25:701-706. Anderson DM. Kumaki S. AhOieh M. et al: Functional characterization of the human interteukin-15 receptor alpha chain and close linkage ol IL15RA and IL2RA genes. J Biol Chem 1995b 270:29862-29869 Antin JH, Weinstein HJ, Guiñan EC. et al: Recombinant human interieukin-1 receptor antagonist in the treatment of steroid-resistant grafl-versus-host disease Blood 1994: 84:1342-1348. 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CAPÍTULO 39
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SECCION V
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C A P Í T U L O
40
Antigene leucocitario humano: compie о mayor de h istocompatibiIidad del hom зге • Armead H. Johnson, Ph.D. • Carolyn Kafovich Hurley, Ph.D. • Robert J. Harfzman, Capt, MC, USN, M.D. • Judith A. Wade, B.Sc. GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD
928
Genética básica Composición del MHC
RECONOCIMIENTO DE LAS MOLÉCULAS MHC EXTRAÑAS
936
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC
936
MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR
936
NOMENCLATURA HLA
937
Localización de los genes del MHC Herencia Desequilibrio de unión Variación étnica MOLÉCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A. -B. -C
Especificidades serológicas y celulares 930
Estructura de las moléculas de clase I
TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
Organización de los genes de clase I
DEL POLIMORFISMO DEL HLA
Regulación de la expresión de los genes de clase I Función de las moléculas de clase I
de clase I y clase II Detección serológica de las moléculas de clase I y clase II 934
Estructura de las moléculas de clase II
Detección celular de las moléculas de clase II TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS
Organización de los genes de clase II
Bases genéticas del trasplante
Desequilibrio de unión de los genes en la
Concordancia de histocompatibilidad
región de la clase II
941
Trasplante renal
Regulación de la expresión de los genes de clase II
Trasplante de órganos no renales
Función de las moléculas de clase II
Trasplante alogénico de células
Otros genes de clase II CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II
938
Tipificación basada en el ADN de los alelos
Otros genes de clase I MOLÉCULAS DE CLASE II: SUBREGIONES HLA-DR. -DQ, -DP
Designaciones alélicas basadas en el ADN
progenitoras hematopoyélicas
936
La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de reconocer y responder a una multitud de sustancias extrañas (antígenos). Aunque este mecanismo de defensa es básico para la supervivencia en un mundo de microorganismos hostiles, este mismo sistema de defensa tiene un impacto negativo cuando se trasplantan tejidos de uno a otro individuo o cuando su mal funcionamiento dispara las reacciones autoagresivas. Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codifican proteínas esenciales en el reconocimiento inmune: las moléculas de clase I y clase II (Fig 40-1). En el hombre, las moléculas de clase I incluyen el antigeno leucocitario común (HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las moléculas de clase II incluyen el HLADR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas moléculas son los clásicos antigenos del trasplante. Otras moléculas codificadas en el MHC son las moléculas de clase III (véase Cap. 41). Estas incluyen los componentes del complemento ligados al MHC (C2, C4 y Bl), la 21-hidroxilasa (CYP21), la proteína 70 del golpe de calor (Hsp70) y el factor de necrosis tumoral (TNF).
RESUMEN
946
BIBLIOGRAFÍA
946
Durante una infección, los microorganismos invasores pueden tanto infectar como ser ingeridos por las células y entonces ser degradados a fragmentos peptidicos. Dentro de la célula, las moléculas del MHC de clase I o de clase II se unen a los fragmentos antigénicos derivados de los microorganismos. Una vez que los fragmentos antigénicos se han unido a las moléculas del MHC y han sido translocados a la superficie celular, los receptores de los linfocitos T interaccionan con el complejo fragmento antigenico-molécula de MHC, disparando tanto la respuesta inmune humoral como la celular (Fig. 40-2). Las moléculas de superficie celular específicas de las células T, CD4 y CD8. actúan para potenciar esta interacción celular y para transmitir las señales de activación. Otras moléculas de superficie celular actúan para aumentar la afinidad de las interacciones celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir las señales coestimuladoras (p. ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y el CD40 y su ligando, el CD154) (véase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que especifican las moléculas
928
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Región HLA clase II
Figura 40-1. Mapa del compiejo de genes del MHC en el cromosoma 6. El HLA-DPB2 en la región HLA clase II está localizado cerca del centrómero. El HLA-F es el más leioménco. La región entre el HLA-DRA y el HLA-B no se muestra. (De The Anthony Nolan Bone Marrow Trust: www.anthonynolanorg.uk/HlG. con permiso.)
MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unión al antigeno de las moléculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miembros de las especies. El mismo patrón de interacciones entre el exterior celular y el complejo MHC clase I o clase ll-antígeno y un linfocito T ocurre no solo en el reconocimiento de los patógenos invasores, sino también en el reconocimiento de las moléculas extrañas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconocimiento de los antigenos propios (autoantígenos) (véase Cap. 41). Ya que las moléculas MHC extrañas de clase I y clase II son reconocidas como antigenos "de trasplante", es beneficioso garantizar que el donante y el receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles (es decir. HLA emparejado). Las moléculas de clase I y clase II tienen múltiples alelos posibles en la población. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo una tarea difícil, que requiere la colaboración del personal médico, del personal clínico que tipifica el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes de donantes de órganos y registros o bancos de donantes de células hematopoyéticas).
cromosomas (es decir, un número haploide) se transmite por cualquiera de los gametos dados. El doble, o número diploide de cromosomas, se restablece cuando se fusionan los gametos masculino y femenino para formar el cigoto. De este modo, para un rasgo determinado por un gen, siempre habrá cuatro combinaciones genéticas posibles en la descendencia, cada una con una probabilidad de incidencia igual. Estas leyes de la segregación y de división aleatoria se aplican a los genes del sistema MHC. Las definiciones para términos genéticos que serán empleados este capítulo se dan a continuación (Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).
En este capítulo se trata la genética, estructura, lunción, nomenclatura y las técnicas de detección de los productos génicos del MHC humano, el HLAA, -B y -C (clase I) y el HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). También se discute la importancia de la concordancia del HLA en el trasplante. Además de las listas de referencia del final del capitulo, en la Tabla 40-1 se nombran páginas web útiles que proporcionan tanto material de referencia como actualizaciones de resúmenes clínicos.
GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Genética básica La primera ley de Mendel, la ley de la segregación, eslá basada en el principio de que los rasgos hereditarios están determinados por factores que están distribuidos en la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o genes como ahora se llaman, están presentes en los cromosomas (véase Cap. 62). Cada gen tiene múltiples formas (esto es. alelos). Como los humanos son diploides. hay dos genes por cada par de cromosomas homólogos. En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante la formación de los gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cada par de
Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconocimiento antigénico.
CAPÍTULO 40
Tabla 40-1
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...
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Sitios web sobre HLA y trasplante Dirección
Información
www swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm www wbi.ac.uk/imgi/hla/
Sociedad Amencada para la Histocompatibilidad e inmunogenética. tipificación estándar del HLA Base de datos de la secuencia HLA, herramientas para la presentación de alelos y para la manipulación de secuencias Información de nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud Taller Internacional de Histocompatibilidad Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea Información para el Trasplante de Médula Ósea Banco de Donantes de Médula Ósea Asociación Mundial de Donantes de Médula Registro Internacional de Trasplante de Medula Ósea Estudio Colaborador de Trasplante United Network lor Organ Sharing Instituto de Investigación Nacional del Genoma Humano
www anlhonynolan org uk/hig www ihwc org o ww ihwg.org www marrow.org www.bml.org wwwbmdw.org www worldmarrow org www.ibmtr.org www.ctstransplant.org wwwunos.org www nhgn.nih.gov
Gen El factor unitario de la herencia. Cromosoma Transportador de los factores unitarios de la herencia. Locus Posición de un gen en un cromosoma. Alelo Forma alternativa de un gen en un locus único. Homocigoto Tener idénticos alelos en un locus, uno en cada cromosoma.
decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por técnicas de biología molecular incluyendo la clonación génica. la secuenciación de ADN y elecIroforesis en gel con campo pulsátil. La última técnica detecta la presencia de genes en grandes fragmentos simples de ADN El orden de mapeo de los genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. -DO. -DP. siendo el HLA-A distal al centrómero (Fig. 40-1).
Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en cada cromosoma. Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su efecto característico igualmente en el heterocigoto. Genotipo Composición genética de un organismo o individuo. Fenotipo Características observables producidas por los genes. Polimórfico Tener dos o más genotipos frecuentes distintos mantenidos en la población. Cromosomas homólogos Los dos miembros de un par de cromosomas que tienen su correspondiente locus génico, uno derivado de cada progenitor. Entrecruzamiento Cambio de segmentos entre cromosomas homólogos. Este proceso también puede llamarse recombinación. Alo- (antígeno. injerto) Se refiere a diferencias antigénicas entre individuos de la misma especie. Auto- (antígeno, injerto) Se refiere a tejidos o antigenos del mismo individuo (es decir, propios).
Composición del MHC El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos está localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb (kilobases) e incluye 224 locus génicos identificados, de los que 128 está previsto que se expresen. Se estima que aproximadamente el 40% de los genes expresados tienen una función en el sistema inmune (Aguado. 1999). Los genes HLA del MHC están localizados en seis subregiones: HLA-A. HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada subregíón codifica un mínimo de una glucoproteína de superficie celular. Con una única excepción, los genes del HLA son altamente polimórficos. esto es, cada uno de los genes del HLA tiene múltiples alelos en la población humana. De hecho, los genes del HLA son los locus más polimórficos conocidos en el hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.anthonynolan.org/uk/hig). Debido a que los genes del HLA especifican moléculas que tienen un papel importante en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo es esencial para la supervivencia de las especies y para mantenerse en la población por la selección.
Localización de los genes del MHC Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p) sobre la base de estudios citogenéticos de cromosomas aberrantes (esto es, cromosomas que han sufrido una traslocación). El orden y la posición de mapeo de los genes del MHC fue determinada por análisis de unión meiótica (es
Herencia Los genes del MHC están muy ligados, esto es, se segregan en bloque a la descendencia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de cromosomas homólogos y que se segrega en bloque a la descendencia se denomina "haplotipo". Cada individuo hereda dos haplotipos MHC (uno de cada progenitor) y por ello tiene dos alelos para cada uno de los genes. Esos alelos se expresan codominantemente. La herencia de los genes del MHC sigue las reglas de la segregación definidas por Mendel. En una familia, cada niño hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro del padre. Por convención, los haplotipos paternos se designan como a y ó y los haplotipos maternos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el descendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo determinado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los cuatro genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una familia con cinco hijos, al menos dos de los niños tendrán un HLA idéntico (asumiendo que no hay entrecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de emparejamiento y de los cuatro posibles genotipos. Aunque los genes del MHC están muy ligados, hay casos de familias en las que se ha producido un entrecruzamiento (Fig. 40-4). Se pensó en la frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes ligados como medida de la distancia de separación entre los genes; sin embargo, los datos moleculares han sugerido la existencia de puntos calientes de recombinación en el ADN implicado que puede aumenlar o disminuir la probabilidad de recombinación durante la meiosis (Uematsu, 1988)
Desequilibrio de unión La observación de que alelos en diferentes locus genéticos ocurren en la población en el mismo haplotipo significativamente más frecuentemente de lo que cabria esperar sobre la base de la posibilidad aislada se denomina desequilibrio de unión. La frecuencia esperada de que ocurran a la vez dos alelos (f 1. f2) es el producto de la frecuencia génica de cada alelo en dicha población ([Lj—u, = f1 x f2]). La frecuencia observada se determina por estudios familiares en la misma población. El desequilibrio de unión es una caraclerís-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El ejemplo mejor conocido de desequilibrio de unión es el haplotipo A1, Cw7. B8, DR17(3), DR52, DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente cuatro veces más frecuentemente de lo esperado. El significado del desequilibrio de unión como aplicación a la competencia inmune y a la enfermedad se discute posteriormente en el Capítulo 41 en el apartado Haplotipos extendidos.
Variación étnica Los datos acumulados del estudio de los grupos de población mundial (Dausset. 1973; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran que las frecuencias de los alelos del HLA difieren significativamente entre los grupos de población étnica. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de unión de los alelos también difieren. Estas observaciones deben tenerse en cuenta cuando se desarrollan alotrasplantes de células progenitoras hematopoyéticas de registros y bancos de donantes no relacionados como en el Programa Nacional de Donantes de Médula de los Estados Unidos (NMDP) (Perkins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos dictan el número de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idéntico no emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con tipos raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idénticos no emparentados de entre más de 6 millones de voluntarios listados en todos los registros de donantes mundiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los métodos para el injerto de células progenitoras de donantes parcialmente HLA-idénticos puede permitir el trasplante en pacientes para los que no se pueden encontrar combinaciones cercanas (véase Cap. 33).
cación de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series alélicas. Estas dos series alélicas fueron llamadas la primera o LA (ahora HLA-A) y la segunda, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres derivaban de la descripción de las series alélicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en 1967 y de las series alélicas 4a, 4b de van Rood en 1969. Un tercer locus fue propuesto por primera vez en 1970; sin embargo, no se confirmó hasta 1975, cuando se identificó una familia con recombinación entre el HLA-B y el nuevo locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibió el Premio Nobel de Medicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA humano.
Estructura de las moléculas de clase I Las moléculas clásicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en el hombre, son heterodímeros formados de un polipéptido glicosilado transmembrana (cadena pesada, 44 kDa) asociado no covalentemente con la |3microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5) (Bjorkman, 1990). La cadena pesada de la molécula de clase I se ancla a la membrana celular y está orientada con sus aminos terminales en el exterior celular. La p^microglobulina está asociada con la región extracelular de la cadena pesada y es necesaria para la expresión de la superficie celular. ;
MOLÉCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A, -B, -C Las moléculas HLA-A y -B fueron las primeras moléculas del MHC descritas en humanos (Dausset, 1981; van Rood, 1993). Ya que estas moléculas fueron definidas por respuestas de anticuerpos frente a los glóbulos blancos (WBCs), son denominadas "antígenos" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocitarios fueron observados en humanos muy pronto, en los años 20, pero no fue hasta los años 50 cuando comenzó el estudio sistemático. En 1952, Dausset demostró convincentemente la existencia de los anticuerpos leucocitarios (leucoaglutininas). Ya que estas leucoaglutíninas no reaccionan con los leucocitos del anticuerpo productor pero reaccionan con un porcentaje de leucocitos del grupo de O de los eritrocitos de individuos no emparentados, sugirió que estas leucoaglutíninas eran aloantjcuerpos. Poco después, Payne (1964) informó de que el suero de pacientes que tenían reacciones febriles no hemolíticas a la transfusión de sangre contenia frecuentemente leucoaglutíninas que demostraban la aloespecificidad. En 1958, Dausset describió el primer aloantígeno HLA "MAC* (ahora HLA-A2+HLA-28) y mostró que estaba genéticamente determinado. Originalmente, se pensó que las especificidades de leucocito eran producto de un locus simple. Se estableció un modelo de dos locus, cada locus con múltiples alelos, a través de los estudios HLA en familias mediante la identifi-
Figura 40-5. Modelo esquemático de la estructura de las moléculas de clase I y clase II.
CAPÍTULO 40
Tabla 40-2
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...
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Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades) definidos por tipificación serológlca y alelos HLA definidos por secuenciación d e A D N ' '
A n t í g e n o s HLA-A
A n t í g e n o s HLA-DQ
A1 A2 A203' A2I0 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9)' A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(I0) AG8(?8) A69(28) A74(19) A80
DOI DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(I) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3)
Alelos' HLA-A A0101-0I04N A 02011-0230 A 03011-0304 A1101-1105 A2301 A2402101-2420 A2501-2502 A2601-2612 A 2901-2904 A 3001-3007 A 31012-3104 A3201-3203 A3301-3304 A3401-3402 A3601 A4301 AGG01--6603 A68011-'6809 A6901 A7401-7403 A 8001
Alelos* HLA-DQ A1 DOA1
0101-0105
DOA 10201 DOAI03011-0303 DQA 10401 DQA1 05011 - 0505 DOAI06011-06012
Alelos HLA-DBQI DOB 10501-0504 DOB 1 06011-0615 DQB1 0201-0203 DOB 1 03011-0309 DOB 1'0401-0402
Adoptado de www anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh Cada columna de la tabla es independiente. Lósatelos HLA-A especilican los antígenos HLA-A. El antigeno A1 se especilica por lósatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfOíNesun alelo nulo o no expresado • Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLA-DQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por múltiples combinaciones diferentes del DOAI y el DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y DOB10502 En el pasado las designaciones de la división seroiógica eran dadas a especificidades que parecían identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simple (p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B3901 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros átelos pueden también codificar anli genos que llevan estas especificidades serctógicas y Comité de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que se desechen estas divisiones Los números entre paréntesis indican la vieía especificidad seroiógica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja especificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como A23 son designaciones correctas !
1
La región extracelular de la cadena pesada de clase I está dividida en tres dominios llamados (/.,, u¡ y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos de aminoácidos. El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosilación en el residuo asparragina en la posición 86. El segmento transmembrana (TM) de aproximadamente 24 aminoácidos es el más hidrofóbico. mientras que el segmento intracelular carboxiterminal de la molécula está formado principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de residuos básicos adyacentes a la superficie citoplásmica (CY) de la membrana celular. El polimorfismo de las moléculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997. 1999) se define por el empleo de (1) anticuerpos específicos de clase I (anticuerpos aloantisuero y monoclonales) que se unen a las moléculas del HLA: (2) línfocitos T citotóxícos (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la estimulación in vitro por moléculas de clase I extrañas o alogenicas; (3) imagen isoeléctrica de las moléculas de clase I aisladas: (4) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la tipificación del ADN de los alelos de clase I; y (5) secuenciación de los nucleótidos de los alelos de clase I. La mayor parte del polimorfismo de la clase I proviene de las diferencias en las secuencias de aminoácidos encontradas en los dominios ot, y ce, de la cadena pesada. El dominio («,es altamente conservado entre las moléculas HLA de clase I. 3
otro a través de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desenta para el dominio de la región constante de la inmunoglobulina. Los dominios a, y a¡ están unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detiene por dos hélices ct formando una ranura en la parte alta de la molécula. Esta ranura es el sito para la unión de los fragmentos peptidicos antigénicos por la molécula de clase I (Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura están formados por cadenas laterales de aminoácidos que componen las hélices y las hojas plegadas |i Muchos de los aminoácidos que alinean esta ranura son polimórficos. creando diferencias alelo-específicas en la especificidad de unión al antígeno entre los diferentes productos alélicos de clase I (Stern, 1994). Otros residuos en las regiones helicoidales de la ranura interaccionan con el receptor de células T durante el reconocimiento del complejo clase l-fragmento antigénico por el linfocito T (véase Fig. 40-2).
Organización de los genes de clase I
Las cadenas pesadas del HLA están codificadas en el MHC en el cromosoma 6 (Fig. 40-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimórficas. mientras que la IVmicroglobulina está codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que sea polimórfica en humanos. El gen típico de clase I está codificado por ocho Nuevas perspectivas en la estructura de la molécula del HLA llegan cuando exones que corresponden a los segmentos de la molécula recién descrita se define la estructura tridimensional de la molécula de clase I utilizando crista(Fig. 40-7). El primer exón codifica la región 5 no traducida y el péptido hidrolografía con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porción extracelular se fóbico líder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelulares: el muestra en la Figura 40-6A La molécula está formada por dos pares de domiexón 5 codifica la región transmembrana. Los exones sexto y séptimo codifinios estructuralmente similares: el u, tienen la misma conformación terciaria que can la región citoplasmálica y el exón octavo codifica la región 3' no traduciel it¡, mientras que el u- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones da incluyendo el lugar de adición poly(A). Las secuencias intermedias (llamaterciarias. Los dominios a, y [5,-microglobulina están formados cada uno por dos hojas 3 plegadas antiparalelas. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones son transcritas a ácido ribonucleico (ARN) pero son eliminadas durante el corte y empalme del mensajero (ARNm). conectadas por un puente disulfuro. Los dominios (t, y ix¡ interaocionan uno con
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porción extracelular de la molécula de clase I. B. Vista superior de la misma molécula mostrando la ranura de unión al péptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class I histocompatibility antigen, HLAA2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)
antigénicos en los linlocilos T (véase Cap. 36). La presentación del antígeno por las moléculas de clase I permite a las células T detectar y crear una Las moléculas HLA de clase I son expresadas como glucoproteínas transrespuesta citotóxica contra el material extraño (p. ej., un virus o proteínas membrana en la superficie de muchos tipos celulares. Sin embrago, el nivel de anormales de células malignas). En el citosol. los antigenos mtracelulares expresión de superficie puede variar importantemente (Singer, 1990). El nivel (incluyendo las proteínas propias y las proteínas virales o anormales) son basal de moléculas de clase I es mayor en las células linfoides; las moléculas degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptídide clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las cos son transportados al retículo endoplasmático donde se unen a la ranura células del cerebro, las células musculares y los espermatozoides. La secuende la parle alta de las recientemente sintetizadas moléculas de clase I y cia de elementos localizados por encima de los genes de clase I se unen a facentonces son transportadas a la superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen, tores reguladores que controlan la expresión en la superficie celular de las 1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localizados en la región de clase II del MHC moléculas de clase I. Durante una respuesta inmune, la expresión en la super(Figs. 40-1 y 40-8), están implicados en este proceso. Dos de estos genes ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al alza por las citocinas (LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del proteosoma. una (p. ej., el interferón-Y y el TNF) uniéndose a los elementos reguladores supeestructura macromolecular que degrada las proteínas en el cilosol (Tanaka, riores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana 1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los [VIH]) pueden suprimir la expresión de clase I (Brodsky, 1999). transportadores peptidicos que mueven los péptidos del citosol al retículo endoplasmático (Momburg, 1998).
Regulación de la expresión de los genes de clase I
Función de las moléculas de clase I Las moléculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmune. Primero, en la respuesta inmune adaptaliva, las moléculas de clase I se unen a péptidos derivados de proteínas sintetizadas en el citosol y las presenta en la superficie celular para que sean reconocidas por los receptores
Los LTC CD8+ reconocen el péptido procesado en conjunto con la molécula de clase I (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para determinar este mecanismo, los LTCs fueron generados por la estimulación in vitro con células autólogas infectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de la célula diana fue específica para cada cepa de virus preparada. El recono-
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Figura 40-8. Mapa de la región de clase II del MHC humano. Los producios génicos codificados por cada región se nombran debajo No están incluidos lodos los genes.
cimiento también estaba afectado por el polimorfismo alélico de las moléculas de clase I. ya que sólo las células diana infectadas viralmente que compartían el producto(s) alélico de clase I apropiado con el que respondía fueron Usadas (Zmkemagel. 1997a. 1997b). El último requerimiento se denomina "restricción MHC". Znkernagel y su colaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1996 en reconocimiento a la importancia del concepto de la restricción MHC en la inmunología. Segundo, la molécula de clase I tiene una función protectora en la respuesta inmune innata previniendo la lisis de la célula diana efectuada por las células asesinas naturales (NK). A diferencia de los LTC. las células NK no requieren la activación a través del reconocimiento de péptidos unidos a la molécula de clase I sino que pueden lisar y destruir las células diana que han perdido la expresión de la molécula del HLA clase I clásica en la superficie celular. A través de este mecanismo innato, las células NK juegan un importante papel en la supervivencia frente a los virus y a las células tumorales quo regulan a la baja la expresión de la molécula de clase I para evitar el reconocimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).
taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homólogos a los genes de la clase I clásica en estructura y los polipéplidos codificados por estos locus también se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual que un nivel alto de polimorfismo alélico es un marcador de los locus del HLAA, HLA-B y HLA-C, un nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F y HLA-G es una característica definitoria de estos genes. Además, en comparación con las moléculas de clase I clásicas, la expresión en la superficie celular de moléculas de clase I no clásicas es baja y la distribución de estas moléculas de clase Ib en los tipos celulares especilicos varia.
HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las células extravellositarias del citotrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega un papel en la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como ligando para al menos tres NK y otros receptores de inhibición celular, protege el tejido placentano de la acción citolitica de las células NK. Aunque el HLA-G tiene la capacidad de unirse y presentar el antígeno procesado (es decir, péptidos) a las células T, la diversidad de péptidos unidos parece ser menor que la diversidad de péptidos unidos por las moléculas de clase I clásica. La reguHay dos grupos de receptores de NK: (1) el receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lación de la expresión del HLA-G también difiere de la de los genes de clase I cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los receptores de célula aseclasicos, ya que el gen no contiene una señal de respuesta al interierón; por sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del cromosoma ello, no es interierón mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA-G son 19. La función de las células NK parece ser regulada por un equilibrio entre los unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unión a la receptores de señal positivos que inician y los receptores inhibidores que membrana y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las forsuprimen la activación celular. Ambos grupos de receptores reconocen los mas solubles pueden actuar como inmunosupresores específicos durante el ligandos HLA de clase I. Por ejemplo, los receptores KIR2D diferencian entre embarazo (Le Bouteiller, 1999). los ligandos del HLA-C basándose en la presencia de residuos de aminoácidos específicos en los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80). HLA-E. El HLA-E puede jugar un papel en la protección de la célula diana Otro receptor de NK. el KIR3D. reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6 de la lisis mediada por la célula NK. Las moléculas de HLA-E se unen a un (Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2. reconoce la molécula de grupo de péptidos hidrolóbicos bastante idénticos derivados de las secuencias HLA-E en complejo con el péptido líder HLA de algunos de los productos alélider de las cadenas pesadas de la clase I clásica y del HLA-G. El HLA-E prelieos de las moléculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999). Las células NK pueden reconocer específicamente y lisar células alogénicas que no expresan las moléculas específicas de clase I expresadas por la célula efeclora (i.e.. "pérdida de lo propio") (Valíante, 1997). Esto puede ocurrir potencialmente incluso en pares de trasplantes aparentemente HLA idénticos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es heterocigótico (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las células NK Bw4 específicas del donante pueden lisar las células sin Bw4 del receptor en un injerto de progenitor celular hematopoyético. Esta respuesta puede ser unidireccional en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna molécula HLA presente en el receptor, por ello, las células NK del receptor no detectan ninguna pérdida de lo propio. Ya que las células NK son relativamente radiorresistentes y comprenden una subpoblación de alrededor del 10% al 15% de los lintocitos de sangre periférica, la respuesta NK puede ser sustancial: sin embargo, no se conoce hasta el momento el papel absoluto de la actividad NK en la alectación al trasplante (Ruggeri, 1999).
A2 + B17
A2 - A69
Otros genes de clase I Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clásicos o de clase Ib en la región de clase I del cromosoma 6p por clonación de genes (Aguado. 1999) Muchos de estos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y expresan ARNm de tipo clase I y/o moléculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas moléculas pueden ser mediadores clave tanto en la respues'a inmune adap-
Figura 40-9. Vista superior de la molécula de clase I con sus residuos aminoácidos polimórticos indicados por las especificidades Bw4 y Bw6 y las especificidades de reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 + B17. (Modificado de Parham P. y col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m peplide-bindmg. proteins. En Dupont B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 New York. Springer-Verag. 1989, pág. 17. con permiso.)
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SeccióN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
senta estos péptidos de unión a la superficie celular para el reconocimiento por las células NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la vía de presentación antígénica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos cutáneos en modelos de ratones transgénicos sugieren que el HLA-E puede ser reconocido como un antígeno de trasplante (Pacasova. 1999). HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelos por ordenador predicen que ciertos residuos de aminoácidos del HLA-F pueden contribuir a una unión del péptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en la presentación antigénica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresión del HLA-F en la superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.
MOLÉCULAS DE CLASE il: SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP Las moléculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez por su capacidad para estimular a las células T alogénicas en los cultivos mixtos de leucocitos (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975, los CML fueron empleados para definir las series alélicas del HLA-D (Thorsby, 1975). Ya que los cullivos mixtos de leucocitos requieren siete días antes de que se puedan obtener los resultados, se buscó una detección serológica rápida del HLA-D. En 1975, se determinó que el aloantisuero contenía anticuerpos reactivos con las moléculas muy asociadas con las especificidades previamente identificadas como HLA-D por técnicas celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1977, estas especificidades serológicas fueron denominadas DR, de especificidades D relacionadas, ya que se observó que el HLA-D y el HLA-DR estaban asociados pero no eran idénticos el uno al otro. Los test serológicos desarrollados con estudios genéticos e inmunoquimicos identificaron moléculas adicionales de clase II. el DR52, el DR53, el DR51 y el DQ. Las técnicas celulares identificaron aún otra molécula de clase II a finales de los años 70 (Shaw, 1981). Esta molécula (ahora llamada HLA-DP) fue descrita inicialmente como un antígeno secundario de la célula B (SB) ya que normalmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requería una segunda fase de estimulación en el cultivo para la detección. Posteriormente, se siguió con la caracterización de las secuencias codificantes del ADN y las localizaciones de estos genes en el MHC empleando técnicas de biología molecular (Beck, 1999).
Estructura de las moléculas de clase II Las moléculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodímeros formados por dos glicoproteínas transmembrana no asociadas covalentemente, la cadena a (33 a 35 kDa) y la cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5) (Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptídicas atraviesan la membrana celular y están orientadas con sus amino-terminales hacia el exterior celular. Las regiones extracelulares de los polipéptidos u y |3 están divididas cada una en dos dominios, denominados a, y a¡ y P, y P , y cada dominio contiene aproximadamente 90 residuos aminoácidos. La cadena a tiene dos grupos carbohidrato, uno rico en mañosa y un complejo tipo glicano, en los aminoácidos 78 y 118, respectivamente. Las cadenas p tienen un complejo tipo oligosacárido en el aminoácido 19. Los dominios amino-terminales (/., y p, de las cadenas a y p contienen los residuos polimórficos, mientras que los dominios de membrana proximales a¡ y p son altamente conservados y son homólogos a los dominios de la región constante de la inmunoglobulina. Una región de aproximadamente 12 aminoácidos de tamaño conecta el segundo dominio extracelular a la región hidrofóbica transmembrana (23 aminoácidos) y al pequeño dominio intracitoplasmático (8 a 15 aminoácidos). 2
2
Basándose en la cristalografía, la molécula de clase II es similar en estructura a la molécula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molécula de clase II, los dominios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 plegada de ocho filamentos unida a dos hélices u para formar la ranura de unión al antígeno en la parte alta de la molécula. Los dominios a? y p forman cada uno dos cadenas p plegadas antiparalelas que soportan la ranura en la parte ?
alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminoácidos que alinean la ranura de unión al péptido antigénico son polimórficos, creando diferentes especificidades de unión al péptido para los diferentes productos alélicos de clase II. Al igual que las moléculas de clase I, las moléculas de clase II son altamente polimórficas (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de clase II está definido por 1) anticuerpos especificos de clase II (anticuerpos aloantisuero y monoclonales), que se unen a las moléculas de clase II; 2) células T aloproliferativas que reconocen y proliferan in vitro en respuesta a moléculas extrañas de clase II; 3) electroforesis en gel bidimensional de moléculas de clase II aisladas; 4) hibridación por endonucleasa que difiere el ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas especificas de locus (una técnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos de restricción [RFLPIJ; 5) tipificación del ADN basada en PCR de los alelos de clase II: y 6) secuenciación de nucleótidos de los genes de clase II. La mayor parte del polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de aminoácidos localizados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptídicas.
Organización de los genes de clase II En contraste con las moléculas de clase I, tanto la cadena u como la P de las moléculas de clase II están codificadas en una sección de 1100-kb de la región MHC (Figs. 40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La región de clase II incluye tres subregiones -DR, DQ y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen expresado A (codificando una cadena «) y uno B (codificando una cadena [}). Las comparaciones de secuencias sugieren que ambos genes de clase I y de clase II surgen de sucesivas seríes de duplicaciones génicas durante la evolución de este complejo génico. La duplicación original en la región de clase II origina con mayor probabilidad los genes A y B primordiales. Duplicaciones génicas más recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que contienen múltiples genes. Un gen A típico contiene cinco exones codificando: 1) la región 5' aminoterminal no traducida y la secuencia líder; 2) el dominio a,; 3) el dominio tt¿ 4) el péptido de conexión, la región transmembrana, el residuo citoplasmático, y una porción de la región 3' no traducida; y 5) el resto de la región 3' no traducida incluyendo la señal de adición poly(A). Un gen típico de cadena |3 es similar al gen de la cadena a pero tiene un exón extra para el residuo citoplasmático. Subregión DR La subregión DR codifica una o dos moléculas DR. dependiendo del haplotipo (Bodmer. 1997. 1999). La subregión contiene un gen simple expresado DRA que es similar en diferentes haplotipos difiriendo solo en la sustitución de un aminoácido simple conservativo en el dominio citoplasmático. El gen más centromérico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), codifica una cadena p altamente polimórfica que, cuando se asocia con la cadena a, exhibe especificidades serológicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molécula es la molécula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al menos más de la mitad de la superficie celular total de las moléculas de clase II. Hay múltiples ácidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los alelos DRB1. El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplotipos de clase II, está localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8). En
CAPÍTULO 40
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ANTÍGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..
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Desequilibrio de unión de los genes de la región de clase II Las combinaciones específicas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4. DRB1/DRB5y DOA1/DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas del DQA1/DQB1 pueden controlarse en parte por la capacidad de las cadenas a y |i de aparearse (Kwok. 1993). Además, ciertos alelos DR y DQ son heredados conjuntamente más frecuentemente de lo esperado, originando un desequilibrio de unión en la población. La frecuencia de estas combinaciones difiere importantemente entre los diferentes grupos étnicos de la población. Por ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1¡yel DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las poblaciones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combinaciones DR-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de caucásicos. El entrecruzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente. Por ello, hay un mínimo desequilibrio de unión entre los alelos DR/DO y los DP. Se han publicado las listas de los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuentes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)
Regulación de la expresión de los genes de clase II
Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\
las células que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el segundo gen DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a continuación). El gen DRB3 es polimórfico, aunque hasta el momento el número de alelos identificados es aproximadamente 10 veces menor que el número de alelos DRB1. El producto del DRB3 se combina con el producto DRA para formar la molécula DR, que transporta la especificidad serológica del DR52 (Tabla 40-3). En las células que expresan los alelos DRB1 •4, 7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4 combinado con el producto DRA forma la molécula que trasporta la especificidad serológica del Df?53 (Tabla 40-3). Finalmente, en las células que expresan los alelos DRBV15 y '16. el segundo gen DRB es denominado DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto DRA transporta la especificidad serológica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos que expresan los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segundo locus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por ejemplo, se ha descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus DRB5 (Wade. 1993). Subregión DO. Un grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el heterodímero DO que transporta la especificidad serológica DQ1-9 (Tablas 40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodmer, 1997, 1999). Las moléculas DO representan aproximadamente del 15% al 20% del total de moléculas de clase II expresadas en la superficie celular. Los locus del DOAJ y del DQB1 son polimórficos y debido a que sus productos proteicos pueden asociarse tanto en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente cuatro moléculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oíros genes A y B tipo DQ en la subregión DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy similares a los genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna proteína funcional. Subregión DP. La subregión DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla 40-3 y Fig. 40-8). Un grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico DP; el otro grupo está constituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como el DPB1 son altamente polimórficos (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresión del DP en la superficie celular es muy pequeño.
Las moléculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutivamente en las células presentadoras de antígenos (APCs) del sistema inmune incluyendo los monocitos, los macrófagos, las células dendrilicas y los linlocitos B. Las secuencias de ADN encontradas por encima de las secuencias codificantes de los genes de clase II son criticas para la expresión. La unión de las proteínas a estas regiones regula la expresión de los genes de clase II. Las alteraciones en la capacidad de las proteínas de unión al ADN de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que eliminan la expresión de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denominada "síndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes de clase II son inducibles por el interferón-y (IFN-y) en muchos tipos de células (Mach, 1996; Glimcher, 1992) y la expresión puede afectarse por otras citocinas (véase Cap. 39) (Guardiola, 1993). La expresión de moléculas de clase II en las APCs puede modularse, particularmente en las células dendríticas, tras el depósito antigénico y la inflamación. El nivel de expresión del complejo antígeno peptídico-clase II asi como la presencia de una señal coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel en el trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau. 1998) (véase Cap. 41).
Función de las moléculas de clase II Las moléculas de clase II actúan como receptores antigénicos en la respuesta inmune (Fig. 40-2), uniéndose a fragmentos peptidicos antigénicos procesados de antígenos exógenos como las bacterias. Los antígenos exógenos entran en la células a través de la vía de endocitosis y son degradados en fragmentos peptidicos en los últimos endosomas donde se encuentran y se unen a las nuevas moléculas de clase II ensambladas (Watts, 1997). La unión de los fragmentos proteicos procesados a las moléculas de clase II se facilita por dos proteínas codificadas en la región de clase II del MHC. la DM y la DO (Fig. 40-8). El péptido de unión está afectado por residuos polimórficos localizados en la ranura de la molécula de clase II. El complejo del fragmento antigénico unido a la molécula de clase II es transportado entonces a la superficie celular para su presentación y reconocimiento por las células T circulantes. Los receptores antigénicos de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el complejo clase ll-fragmento antigénico disparando la activación de la células (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para dilucidar este mecanismo, los linlocitos T electores fueron estimulados in vitro con APCs autólogas previamente incubadas con el antígeno. Como se observó para la clase I, el reconocimiento del fragmento antigénico por las células T electoras está influenciado por el polimorfismo alélico del MHC. La célula T efectora es especifica para el péptido antigénico promotor en conjunción con el producto alélico particular de clase II que originalmente presentó el antigeno (restricción MHC) (Rosenthal. 1973).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Cada célula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento antigénico unido a la molécula de clase II puede desenpeñar una o varias funciones (Paul, 1994), La célula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a diferenciarse a células plasmáticas productoras de anticuerpo, o puede ayudar a otros linfocitos T a diferenciarse a células citotóxicas o células con función supresora. Además, la célula T puede por sí misma funcionar como célula citotóxica, matando directamente células con la diana apropiada (p.ej.. células que expresan complejos de moléculas de MHC de clase II con el antígeno específico), o como célula con función supresora, originando un debilitamiento de la respuesta inmune. Las células T también producen un número de moléculas biológicamente importantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmune e incrementan la expresión de moléculas de MHC en las células diana. Además, las células T producen factores de crecimiento como la interleucina-2 (IL2). Estos factores de crecimiento afectan a un amplio rango de células de las células progenitoras hematopoyéticas para madurar a linfocitos.
Otros genes de clase II
motivo peptídico se unen a la molécula de MHC en los bolsillos que se encuentran en la ranura de unión al antígeno (Stern. 1994). Los aminoácidos polimórficos de las moléculas de MHC rodean esta ranura y crean asi diferencias en las especificidades de unión a los péptidos para las diferentes moléculas del MHC. Los péptidos unidos a las moléculas de clase I tienen una longitud de 9 a 10 aminoácidos. Tanto los extremos carboxi- como aminoterminal del péptidos son atrapados en la ranura de unión de clase I formando un complejo péptido-MHC "cerrado". Los péptidos unidos a las moléculas de clase II varían en longitud de 12 a 30 aminoácidos. A la vez que mantienen requerimiento para los residuos específicos que se encuentran la porción central del péptido. tanto los extremos carboxi- como amino-terminal del péptido se extienden fuera de la ranura de unión de clase II formando un complejo péptidoMHC "abierto" (Stern, 1994).
RECONOCIMIENTO DE LAS MOLÉCULAS MHC EXTRAÑAS
Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB. DMA y DMB. que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las proteínas codificadas por los genes DMA y DMB forman el heterodímero DM. Las proteínas codificada por los genes DOA y DOB forman el heterodímero DO. Estos productos génicos no son detectados en la superficie celular pero son expresados posteriormente dentro de la célula, localizados en compartimentos intracelulares especializados donde las nuevas moléculas de clase II sintetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus péptidos antigénicos. La molécula DM regula la unión al péptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una lunción de tipo acompañante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentación de los péptidos estables unidos. La molécula DO regula negativamente la función del DM (van Ham, 1997).
CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II La función de las moléculas de clase I y clase II como receptores de unión a antigenos es similar; sin embargo, los péptidos que unen tienen diferentes caracteristicas (Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los péptidos derivados de las proteínas sintetizadas de novo en la célula (antigenos endógenos como los antígenos virales), se asocian con las moléculas de clase I en el retículo endoplasmático. En contraste, los péptidos de los antígenos solubles y particulados captados por la célula por la vía de la endocitosis (antigenos exógenos) se unen con las moléculas de clase II en el compartimento endosomal. Tanto las moléculas de clase I como las de clase II pueden unirse alternativamente a péptidos propios encontrados en estos compartimentos. Los péptidos surgen de la degradación normal de las proteínas celulares. Algunos de estos péptidos propios son fragmentos de las propias moléculas de histocompatibilidad. Normalmente, los péptidos propios unidos a las moléculas del MHC no activan a los linfocitos T. ya que son moléculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Esos péptidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando un proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 ) (véanse Caps. 43-45). La unión del péptido a las moléculas del MHC ocurre solo cuando el fragmento peptídico es de un tamaño adecuado y contiene una secuencia particular de aminoácidos o un motivo que le permite unirse a una o más moléculas del MHC expresadas en dicho individuo. Un ejemplo de un motivo para un péptido que se une a la molécula del HLA codificada por el A'0201 es la leucina (o metionina o isoleucina) en el residuo 2 del péptido. un aminoácido hidrofílico en el residuo 3, y una valina (o leucina o isoleucina o alanina) en el residuo 9. Los aminoácidos que forman el motivo se denominan residuos de "anclaje" del péptido. Las diferentes moléculas del HLA. ya sean las moléculas codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '0211. o '0301) o las moléculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406) se unen a péptidos con diferentes motivos. Los aminoácidos que forman el
El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una molécula de MHC extraña en una célula por un segundo individuo (alogénico). Una vez reconocido, la interacción dispara una serie de acontecimientos originando la activación de la células T y la iniciación de una respuesta inmune no muy diferente al reconocimiento de los patógenos (véase Cap. 36). Basándose en los datos de los modelos de trasplante de órganos vascularizados, se han propuesto dos vías de alo-reconocimiento (Sayegh. 1996). La vía directa para el alo-reconocimiento implica la estimulación de las células T receptoras por un complejo MHC-péptido del donante (es decir, reconocimiento directo de las moléculas MHC extrañas intactas). La segunda ruta de alo-reconocimiento, la vía indirecta, implica la estimulación de las células T receptoras por las moléculas de MHC propias a través de la presentación de los fragmentos peptídicos de las células donante. La presentación indirecta ocurre cuando las células presentadoras de antigenos del receptor ingieren material celular del tejido injertado, degradan el material intracelularmente. y presentan el péptido(s) alogénico en complejo con las moléculas de MHC propias. Los péptidos derivados de las regiones polimórficas de las moléculas MHC del donante son los principales candidatos para la estimulación de la respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC Más de 300 repeticiones en tándem cortas (STRs) han sido identificadas en la región MHC humana (Foissac, 1997). También están presentes múltiples polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs). Un estudio de Abbal (1997) examinó seis locus STR en el MHC en una población de individuos no relacionados y encontró un fuerte desequilibrio de unión entre los haplotipos HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcadores cubren una región del MHC mayor que los marcadores del HLA clásico empleados ahora, pueden proporcionar una aproximación más amplia para identificar a los individuos MHC idénticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser utilizados para identificar un haplotipo MHC recombinante en una familia (Carrington, 1996) y aumentar la probabilidad de encontrar genes de histocompatibilidad del MHC apareados. Se han desarrollado métodos moleculares seguros y reproducibles para identificar tanto las STR como las SNP (Carrington, 1998).
MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR Los antígenos de histocompatibilidad menor (mHag) son péptidos inmunogenéticos que se unen a las moléculas de MHC y pueden ser reconocidos por las células T. En las células progenitoras de injertos MHC idénticos, se puede inducir una enfermedad injerto contra huésped (EICH) por las diferencias
CAPÍTULO 40
Tabla 40-4
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G e n e s H menores y sus epítopos e n las células T
M o l é c u l a s de r e s t r i c c i ó n HLA-B7 HLA-A2.1 HLA-A1 HLA-B60 HLA-A2.1 HLA-A2.1
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
mHag
Secuencia p e p t í d i c a
H-Y H-Y H-Y H-Y H-A-2 H-A-1" H-A-1"
SPSVDKAPAEL" FIDSYICQV IVDCLTEMY Desconocido YIGEVSVSV VLHDDLEA VLRDDLLEA
" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el cromosoma Y • Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fila mentos Tres ag menores están en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero esta tabla completa nos la proporcionó Els Goulmy No esta publicada y fue usada por la autora en su charla en el ASHI. Comunicación personal de Goulmy (2000)
entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser cualquier producto génico polimórfico codificado fuera del MHC que difiriera entre el donante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy, 1997; Simpson, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como otras proteínas antigénicas, las proteínas polimórficas deben ser procesadas en fragmentos antigénicos y el fragmento(s) peptidico polimórfico debe unirse con la ranura de las moléculas del MHC. Debido al requerimiento para la presentación antigémca por las moléculas del MHC, cualquier péptido polimódico debe transportar un motivo apropiado de unión específica al MHC. Por ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las mHag incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor. Muchas mHag son presentadas a las células T CD8+ por las moléculas MHC de clase I. Las respuestas de las células T son iniciadas cuando el receptor de célula T reconoce los complejos formados por los péptidos polímórticos de las mHag unidos a las moléculas de MHC expresadas en las APC. Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de injerto cutáneo y por ensayos citotóxícos con clones de células T. Estos péptidos polimórficos tienen una unión restringida a las moléculas MHC de clase I, de modo que la definición bioquímica de los componentes del péptido antigénico de histocompatibilidad menor fue determinada por la elución, purificación y secuenciación del péptido del mHag unido a una molécula del MHC especifica (den Haan 1995). Estudios recientes han demostrado el significado potencial de las mHag en el trasplante clínico (Goulmy, 1997.1996; Martin. 1997: Dupont. 1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad específica para las mHag en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del receptor para una mHag (HA-1) se asoció con un aumento del riesgo de EICH tras el trasplante de médula ósea empleando donantes hermanos genotípicamenle HLA idénticos La importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3. HA-4, HA-5, H- Y) está menos clara. Se han desarrollado técnicas basadas en el ADN para detectar diferencias en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998) y se han empleado en estudios para medir el impacto de estas disparidades en los resultados del trasplante.
NOMENCLATURA HLA Especificidades serológicas y celulares La terminología HLA está designada por el Comité de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999. 1997). Históricamente, las especificidades serológicas y celulares definidas localizadas en las moléculas proteicas del HLA fueron asignadas en base a los resultados de los talleres internacionales durante los cuales los reactivos de tipificación fueron intercambiados entre los laboratorios participantes (sitio web del Taller Internacional de Histocompatibilidad. 13 edición, Tabla 40-1). Las asignaciones incluyen el nombre de la molécula de HLA y una designación numérica basada en el orden en que su especificidad serológica fue definida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especificidad HLA-A asignada y el HLA-A80 fue la más reciente. A lo largo del tiempo las especificidades definidas serológicamente lueron "divididas" a medida que la defini4
ción se hizo más discriminatoria. La definición más corta de la especificidad es llamada la especificidad subtípica o privada. Las especificidades extensas y compartidas se denominan especificidades supertípicas. Por ejemplo, el B44 y el B45 son especificidades subtipicas de la especificidad supertipica B12 Por ello, una célula que es tanto B44+ como B45+ también debería ser positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera ejemplos de los equivalentes supertipicos para las "divisiones" En los tests serológicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un producto alélico del HLA. un fenómeno denominado reactividad cruzada. Esta reactividad cruzada serológica entre los productos alélicos de los locus HLA-A y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se ha empleado para agrupar moléculas en grupos antigénicos de reactividad cruzada (CREG) (Rodey, 1987). Las moléculas de clase I en un CREG comparten uno o más determinantes que no son compartidos por moléculas de otro CREG En la Tabla 40-6 se enumeran ejemplos de CREG. Un determinante antigénico (epítopo) compartido entre los miembros de un CREG se denomina especificidad pública. Parte de la reactividad del CREG puede explicarse porque se comparten secuencias de aminoácidos entre las moléculas HLA en un CREG (Terasaki. 1992) La inclusión de especificidades HLA en un CREG no está estandarizada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un único patrón de reacción y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes pueden identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los grupos CREG se solapan considerablemente (Ellison. 1994). Las especificidades HLA-Bw4 y Bw6 son epitopos amplios, públicos, que residen en la misma molécula como las especificidades subtipicas del locus HLA-B. pero están en lugares diferentes. Por ello el Bw4 y el Bw6 son un sistema dialélico. y todas las moléculas del locus В (y algunas del locus A) trans portan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La región de la molécula del HLA que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en la hélice (/.. entre los residuos aminoácidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Parham. 1991). Las especificidades serológicas designadas por la OMS. localizadas en las moléculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas como se describió para las moléculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Originalmente se definieron por técnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las moléculas HLA-DP de clase II no se delinen adecuadamente por serologia. Hay 26 especificidades del HLA-D que fueron identificadas en cultivos mixtos de leucocitos. Todas las especificidades HLA-D mantienen la designación
Tabla 40-5
Ejemplos de divisiones* serológicas
Especificidades originales amplias
Divisiones
A9 A10 A19 A28 B5 B12 B14 B15 B16 B17 B21 B22 B40 B70 DR2 DR3 DR5 DR6 DQ1 DQ3
A23.A24 A25.A26,A34,A66 A29.A30.A31. A32. A33. A74 A68.A69 B51.B52 B44.B45
B64.B65 B62.B63.B75.B76.B77 B38.B39 B57.B58 B49.B50.B4005 B54.B55.B56 B60.B61 B71.B72 DR15.DR16 DR17.DR18 DR11.DR12 DR13.DR14 DQ5.DQ6 D07.D08.D09
• En el pasado, las designaciones de divisiones serológicas eran dadas a especilicidades que parecían idcnlilicar el antígeno especilico por un alelo HLA simple (p ei. A2 se dividía en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en B390I y B3902) Ahora se reconoce que otros alelos también pueden codilicar antigenos que llevan estas especificidades serológicas y el Comité de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que no se hagan estas divisiones Datos de Bodmer (1997)
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SECCIÓN V
Tabla 40-6
B5C B07C B08C B12C B21C Bw4 Bw6
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
C R E G y antígenos a s o c i a d o s Antígenos asociados
Creg A01C A10C A02C
•
Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80 A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A43, A66, A74 A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403, B17, B57. B58 B5. B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103 B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42. B47, B48, B54, B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703 B8, B14. BI6, B18, B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901. B3902 B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45, B47, B49. B50. B60. B61. B400b B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52. B53. B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77. B78, B4005, B5102. B5103 A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38. B44, B47, B49, B51. B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77 A2403. B5102, B5103 B7. B8. B14, B18. B22. B35 B39. B40, B41. B42, B45. B48. B50, B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B70, B71, B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902. B4005
Datos de Ellison (1994).
V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medición de la estimulación de la célula que responde. La estimulación se genera por diferencias en las moléculas DR expresadas en las células estimuladoras y. en menor medida, por estimulación adicional por las moléculas DQ y DP.
tificó una única especificidad serológica, al antígeno DR determinado por el DRBV10103 se le dio la designación serológica DR103. El tercer y cuarto número en la designación alélica se refieren al orden en que el alelo fue descrito. Por ejemplo, el A'0201 fue el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203 fue el tercero. Algunos alelos pueden diferir en la secuencia de ADN de sus regiones codificantes pero su secuencia de aminoácidos predecida no difiere (a menudo llamada sustitución imperceptible o sinonímica). Estas combinaciones de alelos son identificadas por designaciones de cinco dígitos. Los primeros cuatro números son compartidos, mientras que el quinto dígito se utiliza para distinguir las secuencias de ácido nucleico únicas de los alelos (p. ej., B'27051 y B'27052). Además, dos o más alelos pueden tener un nombre de siete dígitos en el que se comparten los primeros cuatro dígitos (p. ej., DRB4'0103101 y DRB4'0103102). Los dígitos cinco a siete indican que los dos alelos difieren sólo fuera de la región codificante de la proteina. En el ejemplo nombrado aquí, la diferencia afecta al lugar del empalme del ARN del DRB4'0103102 originando la pérdida de la expresión del alelo (Sutton, 1989). Finalmente, los alelos que no son expresados como proteínas en la superficie celular pueden tener añadida una Na sus nombres (p. ej„ A'0215N, DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Ya que cada alelo tiene una única designación numérica, la designación N no se escribe siempre (i.e., A'0215 y A'0215N son el mismo alelo). Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituales del Comité de Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/ nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucleótidos de todos los alelos están depositadas en un banco de datos computerizado (bases de datos GenBank. EMBL, IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, más de 140 alelos HLA-A designados. Continuamente se están identificando nuevos alelos y puede accederse a ellos a través del sitio web.
Designaciones alélicas basadas en el ADN Se ha utilizado la secuenciación de nucleótidos para identificar los muchos alelos diferentes que codifican las moléculas HLA. Actualmente, la especificidad simple serológicamente definida puede residir en dos o más de 25 productos alélicos diferentes (Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el nombre del locus génico seguido por un asterisco y un número de cuatro a siete dígitos que indica el alelo. Por ejemplo, el A"0221 es un alelo del gen HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el DPBV0101 es un alelo del gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA1. Los primeros dos números en la designación numérica de cada alelo se basan frecuentemente en el tipo serológico de la molécula resultante y/o de la secuencia nucleotídíca similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la molécula de HLA-A expresada por el alelo A'0201 porta la especificidad serológica A2 definiendo el antígeno HLA-A2. Sin embargo, la molécula de HLA-B expresada por el alelo B'1510 no tiene la especificidad serológica asociada al B15 pero porta la especificidad serológica que define al antígeno B71. Se designó B'1510 por su secuencia de aminoácidos prevista similar a los antigenos B15. Las células que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serológicamente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciación de nucleótidos identificó un alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan la especificidad serológica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de este alelo se basó en su similitud estructural. Cuando posteriormente se ¡den-
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——————
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*
Tabla 40-7 Secuencias d e aminoácidos q u e definen los epítopos Bw4 y Bw6 y ejemplos de alelos q u e especifican estas secuencias Bw4 Secuencia* NLARIALR NLRTALR DLRTLLR SLRTLLR SLRIALR
Bw6 Alelo' B'5301 B'2701 B-2705 B"2704 A'2501
' Codones 77-83. véase Figura 40-9. Solo se da un ejemplo de cada alelo
Secuencia'
Alelo'
SLRNLRG GLRNLRG
В-3501 B'7301
TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL POLIMORFISMO DEL HLA Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificación del HLA o la tipificación tisular se desarrolla en un número limitado de laboratorios ya que utiliza técnicas y reactantes especializados. Existen disponibles en el mercado equipos para las pruebas basadas en ADN y serológicas; sin embargo, la interpretación de los resultados de la prueba requiere una considerable experiencia y conocimiento. Los laboratorios de histocompatibilidad normalmente se encuentran en centros médicos que tienen programas de trasplantes de órganos y/o de células progenituras hematopoyéticas. En esta sección las técnicas de identificación del HLA se tratan de forma general. Para técnicas detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética (ASHI) (en la Tabla 40-1 se incluye la página web de la ASHI). Los laboratorios de identificación del HLA están acreditados por la ASHI, por la Fundación Europea de Inmunogenética (EFI) y por otras organizaciones.
Tipificación basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II Aunque la tipificación serológica y celular de los antígenos HLA ha sido muy útil, hay un número de inconvenientes en estas técnicas. Con la llegada de los métodos rápidos y fiables del aislamiento y caracterización de los genes de clase I y II y la determinación de las secuencias de nucleótidos de los alelos de clase I y II, ha surgido la posibilidad de utilizar métodos basados en el ADN para la tipificación del HLA. La tipificación basada en el ADN de los alelos HLA es ahora una técnica utilizada Irecuentemente en los laboratorios de tipificación del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 1997a). 1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN (p. ej.. sondas y cebadores de oligonucleótídos sintéticos) se define claramente y está basada en una secuencia de nucleótidos específica conocida. Como los oligonucleótídos empleados como reactantes en la tipificación del ADN son sintéticos, los reactantes no están limitados y no debería existir variación entre lotes en la especificidad.
CAPÍTULO 40
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se descubran los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucleótidos únicas. Las pruebas pueden llevarse a cabo en muchos niveles de resolución dependiendo de los requerimientos de tipificación y del tiempo disponible para hacer las pruebas. 3. Es más robusta que otras técnicas. La tipificación del ADN no requiere linfocitos viables y no está influenciada por la salud del paciente. Además, las pruebas basadas en el ADN son altamente reproducibles cuando se usan metodologías estandarizadas como el test con una secuencia específica de una sonda oligonucleotídica (SSOP) usan en conjunto un protocolo de test estándar (Ng, 1996; Hurley. 2000a). 4. Puede utilizarse para grandes escalas de tipificación. La cantidad de muestras facilitada por las metodologías automáticas y computerizadas reduce el coste y los errores. Los métodos basados en el ADN son particularmente aplicables a la tipificación HLA de grandes números de voluntarios para los registros de donantes. 5. Puede ser discriminativa detectando toda la diversidad del HLA. Los alelos del HLA pueden especificar proteínas HLA que son indistinguibles empleando tipificación serológica. Por ejemplo, un individuo que transporte el alelo DRBV0401 tendrá el mismo tipo serológico (DR4) que un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello, DRBt'0401 y DRBV0402 son divisiones de la amplia especificidad DR4. Estas divisiones son identificadas por la tipificación del ADN. No están disponibles reactantes serológicos suficientemente específicos para definir esta división. Hasta ahora, se han definido 30 subdivisiones del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utilizando tipificación del ADN que no pueden identificarse empleando tipificación serológica; algunas se enumeran en la Tabla 40-2. Los problemas de la tipificación serológica son particularmente agudos cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones. Por ejemplo, las poblaciones de origen directamente africano pueden expresar antígenos de clase I y clase II que son difíciles de identificar con los reactantes serológicos disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La tipificación del HLA basada en el ADN ha mejora muchísimo la capacidad de definir los tipos de HLA en estas poblaciones. Preparación y amplificación del ADN. Cualquier célula con núcleo puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos (RBC) no tienen núcleo, otras células de la sangre como los linfocitos son bunas fuentes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el virus de Epstein Barr también son buenas fuentes de ADN. A medida que las células transformadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, proporcionan un suplemento de ADN que se puede reponer y son empleadas para proporcionar un ADN de referencia para el control de calidad de las técnicas de tipificación, El ADN normalmente se prepara de una pequeña cantidad (0,2 mi a 1 mi) de sangre total. Se puede emplear muchos protocolos diferentes para aislar el ADN de las células, y también hay equipos disponibles en el mercado para la preparación del ADN. La sensibilidad de la detección de los tipos del HLA aumenta considerablemente con la amplificación del ADN que codifica los genes HLA utilizando la técnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe complementar con un par de oligonucleótidos sintéticos (cebadores) a las secuencias alrededor de un gen específico HLA para generar millones de copias de dicho gen para su uso en la reacción de tipificación del ADN. Algunas reacciones de tipificación emplean secuencias promotoras que son compartidas por todos los alelos de un locus HLA: otras técnicas de tipificación emplean grupos de promotores que son compartidos sólo por un grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra de ADN durante la reacción PCR usa las condiciones de la reacción que garantizan que los promotores se unirán a las secuencias perfectamente apareadas (secuencias diana) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que no están apareadas. Ajustando la temperatura del componente de fijado de la reacción PCR, el laboratorio de tipificación puede controlar la especificidad de la amplificación. Promotor específico de secuencia. Un método de identificación de los alelos HLA utiliza promotores específicos de secuencia (SSP) en la reacción PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los promotores se añaden para desnatu-
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ralizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuencias promotoras. En ia subsiguiente reacción PCR. solo estos alelos seleccionados son amplitícados. El ADN amplificado por los promotores es identificado por electroforesis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante durante la amplificación, por fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad en la tipificación de un pequeño número de muestras en un corto periodo de tiempo. Hay equipos disponibles en el mercado. Hibridación oligonucleotídica específica de secuencia. Ha sido posible el empleo de la hibridación de SSOPs con ADN amplificado para identificar alelos (Gao, 1991; Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el empleo de múltiples sondas de oligonucleótidos diferentes para definir un alelo HLA específico o el empleo de un promotor especifico de secuencia unido con hibridación con paneles de sondas. Un grupo de oligonucleótidos capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificado desnaturalizado por PCR unido a un soporte sólido. Las condiciones de hibridación se ajustan de modo que las sondas se añadan al ADN desnaturalizado que contenga los alelos HLA de los que derivó la secuencia del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se encuentran marcados con una terminación para detectar la hibridación. Por ejemplo, el oligonucleótido puede asociarse a una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras la adición de un sustrato, la losfatasa alcalina degrada el sustrato para producir un componente coloreado o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la visualización. puede leerse el patrón de hibridación para determinar los alelos presentes. La Figura 40-11 ilustra la aproximación con el empleo de una sonda de oligonucleótido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabetes dependiente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El método SSOP es muy exacto, específico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A menudo es utilizado en situaciones donde se tipifican muchas muestras en grandes grupos. Están disponibles kits comerciales que utilizan este método. En una técnica relacionada, llamada el formato reverso, las sondas de oligonucleótidos se unen a un soporte sólido (Bugawan, 1994). El ADN de las muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciadores marcados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se híbrida a sondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los alelos presentes en el ADN. Tras la visualización (empleando un sistema de detección unido a la avidína), se puede leer el patrón de hibridación para determinar los alelos presentes. Esta técnica es útil para la tipificación tanto de un número de muestras pequeño como grande. Hay equipos disponibles en el mercado que utilizan este método. Polimorfismo conformacional de secuencia específica (SSCP) o análisis heterodoble. Otro método, aunque poco usado, de identificación de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN amplificado, ya sea desnaturalizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (análisis heterodoble), tras la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN es comparada con la movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir un alelo HLA. Esta técnica es útil en la tipificación de un pequeño número de muestras y particularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una familia. Secuenciacíón del ácido nucleico. Un método final de identificación de alelos HLA implica la determinación directa de las secuencias de ADN de los alelos HLA transportados por un individuo (tipificación basada en la secuencia [SBT]). Los alelos son identificados ya sea tras la amplificación PCR para separar los alelos basados en SSP o como una mezcla de dos alelos. La secuenciacíón es una labor intensa y altamente compleja pero puede usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en un nivel alélico entre los pacientes de trasplantes de células progenituras hematopoyéticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltinga. 1997). Resolución de la tipificación basada en el ADN. El nivel de resolución (i.e., la capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los métodos de tipificación de ADN eslá controlado por la elección y el número de iniciadores y/o sondas empleados en el ensayo y por el método de tipificación. Esta elección puede depender del tiempo disponible para el desarrollo de la tipificación, del coste de la tipificación, de la experiencia del personal de laboratorio y del pro-
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Figura 40-11. 4, Secuencias de nucleólidos de múltiples aletas D0B1. Las secuencias presentadas cubren los codones para los aminoácidos 50 a 60. Una raya indica que el nucleó2 3 4 5 7 9 10 tido es idéntico a la secuencia de la pade superior. En un rectángulo está un oligonucleotide que es especifico para la se• U I I H I I I I M B M W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U cuencia DQBI'0302. B. Análisis de transferencia en mancha (oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DMI19) y un control. BML. El ADN amplificado que contiene secuencias DQBf de clase II de los pacientes lúe unido a la membrana e hibridado para el oligonucleotide específico marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamente). Las señales de hibridación positiva indican los pacientes que tienen esta secuencia génica DQB! (pacientes DM1. 2. 4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB gene contributes to susceptibility and resistance to insulindependent diabetes mellilus. Nature 1987; 329-599. con perII 12 13 14 15 16 17 IS 1') UML
pósito de la tipificación. Normalmente la tipificación para registros de donantes a gran escala se lleva a cabo con una resolución baja-intermedia, mientras que la tipificación de un posible donante de células progenituras hematopoyéticas para un paciente específico se realiza a un nivel de resolución alélica. A menudo se utiliza un abordaje con múltiples pasos para identificar los alelos HLA por tipificación basada en el ADN. Por esta razón, los tipos de HLA definidos por la tipificación basada en el ADN pueden mostrarse con diferentes niveles de resolución. El nivel de resolución bajo (o genérico o seroiógico) de tipificación basada en el ADN produce un resultado similar en apariencia y en detalle a un tipo seroiógico. Por ejemplo, un tipo definido por ADN. el DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroiógico DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolución, no es posible determinar cuál de los más de 30 alelos DRBI'11 tiene el individuo que está siendo analizado. Aunque la tipificación serológica pues ser tan informativa como la tipificación de baja resolución, los resultados son más fiables con el análisis basado en el ADN. El nivel intermedio de resolución de tipificación basada en el ADN puede reducir las opciones enumerando múltiples posibilidades diferentes para el tipo de un individuo, (p. ej., DRBV1101 o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de resolución alto (o a nivel alélico) de la tipificación basada en el ADN identifica el alelo especifico que transporta un individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identificación de los alelos HLA puede basarse en la secuencia de información parcial, es posible que la interpretación de los resultados pase por alto alelos que eran desconocidos en el momento de la tipificación (Hurley. 1997b). Por esta razón, los laboratorios tienen cuidado de mantener sus datos de tipificación brutos (p. ej., qué promotores y qué sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieotidos de los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a mediada que se describan los nuevos alelos.
Detección serológica de las moléculas de clase I y clase II El análisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongínalmente se utilizo en el sistema del ratón por Gorer y Amos y después fue modificado por Terasaki y McClelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado para la tipificación del HLA desde los años 60. El análisis seroiógico del HLAA, -B, puede reproducirse en condiciones controladas y estandarizadas; sin embargo, los análisis a gran escala (p, ej., para registros), pueden aumentar
los índices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para especificidades determinadas serológicamente del HLA-C y clase II es mucho menor. El HLA-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo seroiógico de microcitotoxicidad todavía se utiliza ampliamente para las especificidades de clase I (HLA-A, -B) pero ha sido sustituido por el análisis basado en el ADN para las especificidades HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj en muchos laboratorios de tipificación. El análisis basado en el ADN con su mayor resolución se utiliza para determinar el tipo de HLA de individuos no emparentados y de miembros de una familia especialmente si la segregación del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (p ej.. familias donde los padres no están disponibles o familias donde los padres comparten un antígeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada pariente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin embargo, la tipificación del ADN de alta resolución puede identificar dos alelos distintos del antígeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigótico para el alelo DRBV04), proporcionando datos informativos para los análisis de segregación del haplotipo. Preparación de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en los ensayos de tipificación serológica del HLA se obtienen rápidamente de la sangre total periférica sedimentándola con un gradiente de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos por densidad de centrifugación. Los linfocitos de sangre periférica separados (PBLs) pueden emplearse para la tipificación del HLA-A. -B. -C. Para analizar las especificidades serologicas del HLA-DR. DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B o utilizar una técnica de fluorescencia de dos colores especial para diferenciar simultáneamente las células B y las células T no separadas. Ensayo de microcitotoxicidad linfocitica. El fenotipo HLA se determina analizando la preparación de linlocilos no separados (PBL) o los linfocitos T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ) frente a un panel de aloantisuero HLA bien caracterizado. El ensayo es un test de dos etapas. Durante la etapa de de sensibilización, los linfocitos son incubados con el antisuero. Se añade suero de conejo en exceso preanalizado y estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se incuba durante un periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molécula de superficie celular reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloantisuero, los anticuerpos se unen a las células y las células son usadas subsiguientemente tras la adición del complemento. El ensayo termina con la adición diacetato de fluoresceina y de bromato de elidió para las técnicas de detección
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y ácido acético etilendiamineter (EDTA) para las técnicas de visualización de colorantes. Las reacciones se leen en porcentaje de lisis y se gradúan numéricamente. Cubetas de suero para tipificación del HLA. Los reactantes de tipificación del HLA derivan del suero de individuos aloinmunizados (mujeres multíparas, receptores de trasplantes, pacientes multitransfundidos e inmunización planificada en humanos). Las placas con múltiples pocilios de aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificación del HLA) están disponibles en el mercado. Debido a la complejidad antigénica de los anlígenos HLA. deben utilizarse múltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos de los laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o pueden utilizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisueros no son verdaderamente monoespecílicos y muchos presentan alguna reactividad cruzada, la reactividad de cada antisuero debe analizarse cuidadosamente y conocerse para la interpretación de los resultados. Esto requiere un estrecho control de calidad de cada nuevo lote de cubetas de tipificación con células de referencia bien caracterizadas. Como el titulo y la especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibilizado puede no ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son limitados. En un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de reactantes, algunas compañías han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactantes monoclonales no están disponibles para todas las especificidades HLA. Reactividad cruzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con más de un producto alélico HLA. Este fenómeno puede proceder de la poliespecificidad del antisuero y/o de la reactividad cruzada y es responsable de los complejos patrones de reactividad de algunos aloantisueros. El suero poliespecífico contiene dos o más anticuerpos, que pueden ser adsorbidos para retirar uno, con pequeño efecto sobre la reactividad del otro(s). El antisuero con reactividad cruzada contiene, más frecuentemente, un anticuerpo simple que reacciona con un determinante antigénico compartido entre múltiples productos alélicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se trató previamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren más frecuentemente entre los productos alélicos codificados por el mismo locus pero pueden ocurrir entre productos alélicos codificados por locus diferentes (p. ej., A2 + B17). En la Figura 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la localización de los determinantes de la reactividad cruzada.
Detección celular de las moléculas de clase II
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con los subsiguientes acontecimientos, como la extensión de la EICH. todavía son controvertidas.
TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS La supervivencia a largo plazo de órganos sólidos y de los injertos de células progenitoras hematopoyéticas representa uno de los retos más importantes de la ciencia médica. El trasplante renal es la terapia de elección para la mayoría de los pacientes con enlermedad renal en fase terminal. El trasplante de progenitores celulares hematopoyétícos, de corazón, de pulmón, de higado y de páncreas está ganando una amplia aceptación como técnicas terapéuticas con resultados satisfactorios. El principal obstáculo al trasplante de órganos sólidos y de progenitores de células hematopoyéticas es el rechazo mediado inmunológicamente al tejido extraño. Por lo tanto, el éxito de un aloinjerto depende de la capacidad para detener la reacción inmune, lo cual puede realizarse por: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor; 2) terapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996); y 3) lograr que el receptor no responda al aloantígeno o aloantigenos del donante (esto es, tolerancia) (Remuzzi, 1995).
Bases genéticas del trasplante Las bases genéticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en 1916 como resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y posteriormente se extendió a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se demostró que los injertos cutáneos en linajes nativos que eran homocigotos en el locus de histocompatibilidad (esto es, injertos singénicos) tenían éxito, pero los injertos entre dos linajes nativos diferentes (alotrasplantes) eran rechazados. Además, los aloinjertos de cualquier linaje nativo emparentado (dos copias de los mismos genes MHC; homocigotos) o de la primera generación (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos grupos diferentes de genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivían en animales; mientras tanto, los injertos de descendientes F1 híbridos de cualquier progenitor (un haplotipo no emparentado) no sobrevivían. Estas observaciones establecieron las leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delinió el locus de histocompatibilidad mayor en el ratón, el H-2. Hay otros antigenos de histocompatibilidad o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados menores, la discordancia para estos antígenos puede tener efectos importantes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).
A medida que existían evidencias convincentes en modelos animales experimentales de que las moléculas codificadas por el MHC representan la mayor barrera genética del éxilo del aloinjerto. la tipificación del HLA fue utilizada en humanos para determinar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto del donante y el receptor. Inicialmente, la influencia de los antígenos HLA en la supervivencia del injerto fue investigada injertando piel no vascularizada entre miembros de una familia. Como en los estudios de ratones hijos, los injertos cutáneos entre hermanos HLA idénticos sobrevivieron significativamente más que los injertos entre hermanos padres o donantes no relacionados con un haplotipo emparentado. Estas observaciones se extendieron al trasplante renal durante los últimos años de la década de los 60 y los primeros de la de los 70. Los datos más recientes del Estudio Colaborador Internacional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ Sharing (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confirEl empleo del CLM en los laboratorios clínicos para determinar la histoman que el MHC es la principal barrera genética en el trasplante de injertos compatibilidad ha declinado debido a las limitaciones inherentes a la técnica. El CLM puede estar influenciado por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1999) (Fig. 40-12; para datos actuales véanse las páginas web señaladas en la Tabla 40-1). Los datos para el trasplante de medad y por la historia de una transfusión previa (Mickelson, 1996). Por estas células progenitoras hematopoyéticas también reafirma el papel del MHC en razones el ensayo CLM se ha reemplazado por métodos de tipificación basala evolución del trasplante determinado por la supervivencia del paciente y por dos en el ADN, más precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplanla EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13). tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea para identificar receptores de aloinjerto renal con hiporreactividad especifica a las moléculas HLA del donante tras el trasplante como una guia para reducir la inmunosupresión Concordancia de histocompatibilidad (Reinsmoen, 1993).
La respuesta de una célula en el cultivo tisular a los aloantígenos en la superficie de una segunda célula se denomina cultivo mixto de leucocitos (CML) o reacción linfocitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es considerado una medida in vitro de la disparidad de clase II entre individuos que reconocen determinantes encontrados en las moléculas de clase II. que son conocidos colectivamente como HLA-D. La respuesta de las células T se produce unidireccionalmente impidiendo que se dupliquen las células de uno de los dos individuos tratando dichas células con radiación o mitomicina-C antes de su adición al cultivo. El CLM representa una respuesta sumatoria de una célula respondedora a las diferencias en los múltiples determinantes en las moléculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de células estimuladoras irradiadas. La respuesta a las moléculas DR parece predominar.
Se ha utilizado el análisis de dilución limitada para definir la frecuencia de los linfocitos T citotóxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la extensión del alorreconocimiento en trasplantes de células progenitoras hematopoyéticas (Madrigal, 1997). Las correlaciones de estas frecuencias P
p
Concordancia de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un elemento importante en el resultado del trasplante, la concordancia de la histocompatibilidad significa diferentes cosas en diferentes situaciones y las estrategias para determinar esto varían. Los criterios difieren con variables
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
100,
Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA y sus tipos serológicos Alelos HLA
Antigenos HLA
A'0201 A '2603 A-660V B'2702 B'2708' B'1502 B-1503 B' 1536' DRBV0301 DRB1V404
A2 A26 A26 о A66 B27 B7 о B27 B75(15) B72 (70) No definido DR17(3) DR4 ' El laboratorio puede asignar A66. o más recuentemente. А26 a las células que transportan este alelo. ' Muchos laboratorios tipan serologicamente una células con este alelo como B7: sin embargo, la reactividad serológica sugiere que la tipificación difiere levemente del B7 "estándar' Las células que transportan este alelo no han sido carácter i/adas soioiogí camenle 1
dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordancias. Las diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a causa de la metodología de tipificación empleada para asignar los tipos de HLA (p. ej„ tipificación serológica frente a basada en el ADN). Las nomenclaturas serológicas y ADN, aunque están relacionadas, pueden diferir. En la Figura 40-12. Supervivencia a cinco años de aloinjerto renal (primer trasplante) de Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas relaciones y se ha publicado una lista tres categorías de histocompalibilidad: hermanos HLA idénticos; un haplolipo de vida relacionado: donante de cadáver, llenos de hermanos donantes HLA idénticompleta (Schreuder. 1999). La definición de una concordancia también puede cos (ambos con cromosomas HLA concordantes) tienen los mejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolución. Un paciente y un donante pueden indica el numero de trasplantes estudiados (regresión p < 0.0001) (De Opelz G, parecer ser concordantes en el nivel serológico (p. ej.. receptor: A2. A26: Wujoak T, Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el nivel de Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso) alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201. A'260l: donante: A'0205. A'6601). El nivel de concordancia alélico para las moléculas de HLA clásicas puede optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de órganos vasculares como de células progenituras hematopoyéticas (Opelz, 1999; Petersdori, 1998). Sin que incluyen el tipo de injerto (p. ej., órgano sólido vascularizado frente a proembargo, debido al gran número de alelos HLA, el nivel de concordancia alégenitor de célula hematopoyética), la enfermedad (p. ej.. leucemia mieloíde lico es difícil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que crónica (rente a anemia aplásica), la edad del paciente y el protocolo clínico garantice un buen resultado para el máximo número de pacientes de todas las (p. ej., sangre de médula frente a sangre de cordón umbilical: depleción poblaciones étnicas. medular de células T frente a no depleción de células T) (véase Cap. 33). La concordancia normalmente incluye la evaluación de al menos tres locus, Tras el trasplante de células progenitoras hematopoyélicas, los determiel HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier nantes subtipicos o las diferencias alélicas inician una importante respuesta resolución, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 discorcitotóxica de células T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De dancias. Cero discordancias (un término empleado en el trasplante de órganos hecho, los estudios han mostrado que la concordancia de alta resolución para sólidos) también puede referirse a pares de donante/receptor, donde el donanlos alelos de clase I y clase II del donanle y el receptor puede mejorar el resulte no tiene diferencias HLA detectables con el receptor, esto es, donde el tado tras el trasplante de médula no emparentado. Los datos recientes sugiedonante es homocigoto para los alelos en uno o más de los locus (p. ej., donan- ren que múltiples discordancias son malas para el resultado; sin embargo, el te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: receptor heterocigoto: A'0101: impacto tanto de las discordancias simples como del locus especifico todavía A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individuos concorno está bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999). Solo HLA-ID III RMANO
n
4.343
1 -IIAPI. PARIATI-.se» n- 18.071 CADÁVER n 105.360
Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a IV en hermanos HLA idénticos (concordancia genotípica HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes medulares haploidénticos emparentados con concordancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordancia HLA: 3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia para el HLA-A, -B y -DR fue definida por seroiogia. y la concordancia para el HLA-Dw fue definida por CML o por tipificación de los alelos HLA-DRBl con SSOP. Todos los pacientes recibieron médula no modificada (sin depleción de células T) tras un régimen de preparación que incluyó la irradiación corporal total. Se dieron ciclosporina y metotrexato para la profilaxis de la EICH (De Hansen JA. Yamamoto K. Petersdori E. y col: The role of HLA matching in hematopoietic cell transplantation. Rev Immunogenet 1999; 1:359, copyright © 1999 Munksgaard International Publishers Ltd. Copenhagen. Denmark, con permiso.)
CAPÍTULO 40
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ANTIGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD.
una minoría de pacientes que están esperando el trasplante recibirán injertos de donantes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos los pacientes beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificación de los alelos no emparentados que son bien tolerados permitirá la selección de donantes no emparentados estableciendo prioridades de acuerdo con el riesgo biológico de los HLA específicos no concordantes. La concordancia óptima para los injertos de órganos sólidos puede diferir de los requerimientos de concordancia para el trasplante de células progenituras hematopoyélicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA emparentado como el nivel de resolución del análisis del HLA contribuyen al resultado del injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la comparación de ríñones de cadáveres basándose en las especificidades subtipicas. Ya que las concordancias subtipicas se identifican infrecuentemente, se ha propuesto que las moléculas HLA de clase I sean emparentadas para los amplios determinantes CREG. El CREG puede definir los determinantes mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humoral. Rodey (1994) mostró que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por el receptor tras el trasplante de riñon están dirigidos contra los determinantes CREG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes moléculas HLA de clase I y. en contraste con las especificidades subtípicas. tienen una distribución similar entre los grupos de población étnica. En el CREG se incluyen especificidades subtípicas raras. Ya que el número de CREGs es menor que el número de especificidades subtípicas. la probabilidad de emparentar un nivel CREG es mayor que para un nivel subtípico o alélico de HLA clase I. Por lo tanto, la distribución de órganos basándose en la concordancia CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan equitativamente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones étnicas. Un análisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas predicciones sobre la distribución (Ellison, 1994), aunque los estudios todavía están en progreso. El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es desconocido, pero se está evolucionando. En Europa, una estrategia para eliminar el excesivo tiempo de espera de los receptores con fenotipos HLA raros se implantó en 1996 mientras se mantenía la distribución de los injertos bien emparentados (Opelz. 1999). Otras estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biológicamente relevantes de las moléculas del MHC (p. e|„ concordancia de epítopo) (Suciu-Foca, 1998; Harris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento directo de los aloantígenos se pensó que era la principal via de respuestas de los injertos. Sin embargo, los estudios sugieren que la respuesta indirecta juega un papel significativo en el rechazo del injerto, al menos en los injertos de órganos sólidos (Sayegh, 1996). Si se activa la via indirecta, entonces los epitopos peptidicos generados por la ruptura proteolitica de la molécula HLA y no por la molécula HLA en si misma serán el estímulo inmunogénico. Por ello pueden diseñarse nuevas estrategias innovadoras para la definición de las discordancias deducíbles basándose en el reconocimiento de los fragmentos peptidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las moléculas HLA del donante no emparentado serán interpretadas como inmunogénicas en el receptor (es decir, si las moléculas HLA del receptor se unirán y presentarán estos epitopos). Teóricamente, uno puede identificar secuencias peptídicas de HLA extraño no presentado por las moléculas HLA específicas del receptor y por ello definir las discordancias deducíbles para las moléculas HLA dadas. La complejidad inherente en la interpretación de los resultados de la tipificación del HLA y en la selección de un donante hace crítico incluir un experto en los análisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipificación del HLA conocerán las ventajas y las limitaciones de cada método de tipificación asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la población, información importante tanto en la búsqueda como en la selección de un donante adecuado. Detección de anticuerpos específicos del HLA en el suero del receptor. Los pacientes pueden sensibilizarse a moléculas HLA extrañas específicas a través de una transfusión, el embarazo, o trasplantes anteriores. La evaluación de la compatibilidad entre el receptor y el posible donante incluye el análisis para esta sensibilización. El suero del receptor es analizado antes del trasplante en un panel (linfocitos o moléculas de HLA solubles inmovilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad anticuerpo panel (PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es analizado con
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los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad específica para el donante potencial en la prueba cruzada específica de donante. Aunque las técnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unión pueden diferir entre los laboratorios, los propósitos siguen siendo obtener un perfil de factores de riesgo inmunológico del receptor en la lista de espera, que será de ayuda al equipo médico tanto en las decisiones pretrasplante como en las postrasplante. La unión del anticuerpo en el suero actual del receptor a los linfocitos Tdel donante es una contraindicación para el trasplante renal Análisis del suero (PRA). La caracterización cuidadosa del perfil de anticuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de ayuda en la interpretación de las concordancias cruzadas especificas de donante pretrasplante. Los objetivos del análisis PRA son: 1. Identificar el nivel de presensibilización del paciente a los antígenos HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 60% (i.e., el suero del paciente reacciona con especificidades encontradas en al menos el 60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada donante-específica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un trasplante no emparentado. 2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predecir el antigeno(s) HLA que serán evitados cuando se seleccionen los donantes. 3 Identificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanticuerpos) de modo que se puedan seleccionar las técnicas apropiadas para evitar falsos positivos en la lectura en el momento de la concordancia cruzada donante-específica. La caracterización del anticuerpo HLA específico presente en el suero del receptor requiere un análisis en un panel seleccionado de especificidades HLA bien definidas. Se deben incluir en el panel de control los linfocitos o los antígenos solubles de un número suficiente de individuos para asegurarse de que se detectarán todos los anticuerpos dirigidos contra el HLA salvo los más raros. En la medida de lo posible, el panel de control debe permanecer igual de modo que los resultados sean comparables en el tiempo. El receptor de un trasplante renal forma frecuentemente anticuerpos frente a CREGs más que frente a especificidades subtípicas (Rodey. 1994,1997) de modo que el análisis de la reactividad del panel debe considerar la identificación de CREG asi como la de especificidades subtípicas. La identificación de especificidades de anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la preselección de un donante potencial del que el receptor tendrá una concordancia cruzada final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la selección (Claas, 1999: Duquesnoy, 1999). La frecuencia del control y la selección de los ensayos empleados para el control son decisiones basadas en el perfil inmunológico del individuo receptor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguíneas ha hecho innecesaria la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos los pacientes (página web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuerpos específicos HLA de clase I como de clase II es detectada por el análisis del suero en un panel de linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependiente del complemento o por ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglobulina) o en un panel de moléculas HLA soluble inmovilizadas con placas (es decir, ensayo con enzima unida mmunoabsorbente [ELISA]) o en gotas (es decir citometría de flujo). (Los ensayos se describen con detalle en el manual ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno soluble de fase sólida es que puede ser diseñado para detectar solo IgG. anticuerpos especílicos frente al HLA de clase I. Las muestras de suero de los receptores potenciales deben almacenarse a -70 C y protegerse del dióxido de carbono y de la evaporación Las muestras de suero caracterizadas almacenadas serán utilizadas en la prueba cruzada especifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante prospectivo. Prueba cruzada específica de donante. La concordancia cruzada de linfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un receptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante específico. En el test de reactividad cruzada, el linfocito es la célula diana de elección, ya que expresa altos niveles de moléculas HLA y es fácil de aislar. Este test es probablemente la contribución más importante de los laboratorios de tipificación de tejido HLA al trasplante renal. El propósito de la reactividad cruzada es prevenir el rechazo hiperagudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
lores de riesgo inmunológico en pacientes que esperan un trasplante. La aparición del rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reactividad cruzada de la citotoxicidad directa dependiente del complemento positiva (CDC) entre los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el momento del trasplante. La reactividad del suero válido actual del receptor a los linfocitos T del donante es una contraindicación para el trasplante de injerto renal. La detección de anticuerpos reactivos al donante en muestras anteriores de suero de receptores no es una contraindicación pero puede representar un nesgo para la pérdida del injerto distinto del rechazo hiperagudo inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reactividad cruzada especifica de donante también se utiliza en algunos centros para predecir el fallo del injerto de células progenitoras hematopoyéticas (Hansen, 1997). Los requerimientos u métodos para la reactividad cruzada especifica de donante están determinados en los estándar de la Sociedad Americana de Histocompatiblidad e Inmunogenética (Tabla 40-1) y en el manual de técnicas ASHI (2000). Las técnicas aceptadas hasta el momento incluyen el Amos modificado CDC, la extensión del tiempo de incubación de la CDC. la CDC aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo. Técnicas de detección de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden utilizar diferentes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El nivel de sensibilización detectado variará con el ensayo. El anticuerpo especifico detectado variará con la célula diana. Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC directa incluye todos los ensayos que utilizan la adición de complemento para detectar la unión directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijación del complemento por los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las células originará la muerte celular o la citotoxicidad. Los métodos de CDC incluyen la técnica básica (no hay periodo de lavado antes de añadir el complemento), la técnica Amos modificada (etapa de lavado añadida antes de la adición del complemento) y técnicas de aumento del tiempo de incubación La etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustancias que dificultan la activación del complemento. Las ventajas de las técnicas de CDC directa son que son reproducibles y que la correlación con la incidencia de rechazo hiperagudo es excelente. Técnicas de reactividad cruzada indirecta. Las técnicas indirectas incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la citometria de flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina humana para aumentar la detección de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las técnicas indirectas detectan la presencia de anticuerpos específicos frente a antigenos de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados en los ensayos CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen la discriminación de las subclases de células unidas a las inmunoglobulinas (IgG frente a IgM) y la caracterización de la célula diana que se une al aloanlicuerpo (linfocito T frente a linfocito B frente a monocito). Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de autoanticuerpos circulantes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a cabo una autorreactividad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye en la lista de espera del trasplante. Si están presentes autoanticuerpos. el suero utilizado para la reacción cruzada con el donante debe tener la autorreactividad eliminada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA específicos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivación con calor a 63° ± 1° C o la reducción con los agentes químicos ditioeritrítol (DTE) o ditiotreitol (DTT) de cualquiera de los anticuerpos IgM potencíales se utiliza para diferenciar entre anticuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la muestra de suero inactivada con calor o tratada con DTT es negativa, aun cuando la muestra no tratada sea positiva, la mayoría de los centros seguirán adelante con el trasplante. Sin embargo, el DTT o la inactivación con calor deben emplearse con precaución, ya que no todos los anticuerpos HLA específicos son IgG y por ello, si no se controla correctamente, ambas técnicas pueden eliminar la actividad IgG y la IgM. Anticuerpos frente a las células B. En algunos centros puede llevarse a cabo una reactividad cruzada utilizando linfocitos B del donante (reactividad cruzada de célula B) en los pacientes sensibilizados. Una prueba de reactividad cruzada positiva frente a células B específicas del donante no es una contraindicación para el trasplante. El significado clínico todavía no se
ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particularmente en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anticuerpos detectados en la reactividad cruzada de célula B pueden ser (1) específicos de clase II, HLA-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad para el HLA-A. -B. -C (las células B tienen una alta densidad de moléculas de clase l y son más sensibles a los ensayos dependientes del complemento que las células T). y/o (3) anticuerpos no específicos del HLA (p. ej., autoanticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada de célula B positiva, puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaquetas antes de desarrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas expresan moléculas de clase I pero no de clase II.) Las dos técnicas de reactividad cruzada de célula B utilizadas más frecuentemente son el CDC y los ensayos de citometria de flujo. Selección de las muestras de suero del receptor para la reactividad cruzada con el donante. En pacientes con sensibilización no detectable (es decir. 0% PRA). puede usarse la muestra de suero disponible más reciente para la reactividad cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anticuerpos preexistentes o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente, debe recogerse una muestra de suero en el momento (Le., en las 48 horas antes del trasplante). En receptores sensibilizados, las muestras representativas, incluyendo la más reactiva o muestra de suero "pico", son analizadas en muchos centros ya que una muestra positiva de donante anterior puede ser considerada un factor de riesgo particularmente en el paciente que rechazó precozmente un injerto anterior en el periodo postrasplante (Mahoney, 1996).
Trasplante renal La práctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO compatibles, tienen reactividad cruzada específica de donante de células T negativa con un suero receptor adecuado y la mejor concordancia HLA disponible. El hallazgo original de que los injertos de riñon entre hermanos HLA idénticos sobrevivían significativamente más que los injertos transplantados entre hermanos HLA no emparentados o combinaciones de hermanos-parientes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-12 muestra el análisis más reciente de supervivencia a cinco años de aloinjertos renales del registro internacional CTS entre tres categorías de donantes: (1) hermano HLA idéntico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de supervivencia; (3) todos de cadáver. 66% de supervivencia. El impacto de la concordancia para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa claramente comparando las categorías 1 y 2. Resultados similares se observan en la base de datos de la UNOS (Cecka, 1999). Aunque los resultados de los análisis sobre injertos de parientes vivos confirman el papel del MHC como la mayor barrera genética en el éxito del resultado del injerto, la demostración y la aceptación de la influencia positiva de la concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadáver no emparentados ha sido más controvertida. Sin embargo, los datos de la supervivencia a largo plazo de estudios multicéntncos colectivos son consistentes a la hora de mostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del HLA en la supervivencia del trasplante renal de cadáver (Fig. 40-14) (Opelz. 1999; Cecka. 1999). Más aún, dos estudios de centros independientes, uno de Europa (Oslo) y otro del norte de América (Toronto) han informado de una mejora significativa en la supervivencia del injerto como una función de la concordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad, 1999: Geddes, 1999). Un centro aislado puede requerir la priorización basada en la concordancia HLA para trasplantar a suficientes receptores con injertos bien emparentados para mejorar la significación estadística en el resultado de los análisis. Aunque los números son pequeños, se ha observado una influencia altamente significativa de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de riñon de donantes vivos no emparentados (Opelz, 1999). Los injertos con cero discordancias (0 MM) de donantes cadáver sobreviven significativamente mejor y aproximadamente tan bien como los injertos de hermanos HLA idénticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello, la UNOS ordena compartir de 0 MM ríñones La supervivencia del injerto en pacientes tras los primeros trasplantes de riñon disminuye proporcionalmente a medida que aumenta el número de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka, 1999; Opelz, 1999). Sin embargo, para asegurar la distribución equitativa de
CAPITULO 40
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
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órganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA raros, se han adoptado por los programas de distribución de órganos nuevos algoritmos para la priorización de receptores en lista de espera (Opelz, 1999). Los resultados de los datos más recientes tanto de supervivencia de injerto como de paciente pueden verse a través de página web de la CTS (Tabla 40-1). La concordancia del injerto inicial no solo aumenta el tiempo de supervivencia del injerto, sino que disminuye la probabilidad de sensibilización del receptor y facilita el retrasplante. La acumulación de pacientes altamente sensibilizados en la lista de espera es un problema significativo en muchos centros, ya que los pacientes esperan durante largos períodos de tiempo y pueden presentar problemas clínicos de difícil tratamiento (Sanfilippo, 1992).
Trasplante de órganos no renales La supervivencias de los injertos de corazón, hígado, pulmón y páncreas es buena, con entre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injertos en cinco años (Fig. 40-16). Los donantes normalmente no tienen concordancia en el tipo de HLA. y no se hace rutinariamente una reactividad cruzada pretrasplante con el donante. Se recomiendan los controles de anticuerpos séricos para identificar el estado de sensibilización como un factor de riesgo inmunológico para el receptor. Si es posible, los receptores de injerto y los donantes cadáveres de injertos vascularizados no renales deben ser clasificados para el HLA para permitir análisis retrospectivos. Los datos recientes de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordancia HLA en el resultado del trasplante de hígado: sin embargo, los datos de la CTS muestran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el resultado de los primeros trasplantes de corazón (Opelz, 1999). El período aceptable para la preservación de la isquemia fría puede limitar la extensión de la posible concordancia HLA en el trasplante cardíaco.
Figura 40-15. Supervivencia a cinco años de injerto cadavérico como una (unción del número de antigenos HLA discordantes. El análisis Kaplan-Meier de la supervivencia del injerto con respecto a los antigenos discordantes HLA no se muestra pero fue estadísticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. Wade J. y col: Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transplantation-importance of functional renal mass versus avoid-ance of acute rejections- the Toronto Hospita experience 1985-1997. En Cecka M, Terasaki P [eds]:Clinical Trasplants 1998. Copyright © UCLA Tissue Typing Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. con permiso.)
Trasplante alogénico de células progenituras hematopoyéticas El trasplante de células progenituras hematopoyéticas alogénicas se lleva a cabo en neoplasias malignas y trastornos hematológicos, en el fallo de la medula ósea, en ciertos trastornos metabólicos heredados, como las enfermedades de depósitos de lípidos. y en el síndrome de inmunodeficiencia congènita. A partir de una histocompatibilidad inicial, el mejor donante es o uno mismo (trasplante autólogo) si la neoplasia maligna no implica a la médula ósea o si la
Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serológicas para el HLA-A. HLA-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de riñon de cadáver. (MM = discordante). La asociación de la concordancia con el resultado del injerto fue estadísticamente signilicativa (regresión p < 0. 0001). El análisis fue restringido a los trasplantes para los que se informó la división de especificidades HLA-A y HLA-B al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T. Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev Immunogenet 1999; 1:334. con permiso.)
Figura 40-16. Supervivencia a cinco años del injerto de los primeros trasplantes para el trasplante de órganos vascularizados en injertos de corazón, riñon de cadáver, hígado, páncreas, pulmón y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant Study, proporcionado por y con permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz, 1999.)
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
enfermedad no es genética, o un gemelo idéntico (trasplante smgénico). Las células progenitoras de donantes hermanos HLA idénticos son una fuente frecuente. Estas células donantes normalmente serán genéticamente idénticas a las del paciente a lo largo de toda la región MHC. El empleo de un hermano donante también aumenta la probabilidad de que los genes no HLA que pueden afectar el éxito del trasplante y que no están bien definidos (i.e., genes de histocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1997). Los miembros de una familia haploidénticos también pueden ser elegidos como donantes (Aversa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los donantes HLA no emparentados. Basándose en los datos del Registro Internacional de Trasplantes de Médula Ósea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron a cabo más de 16.000 trasplantes alogénicos de médula osea desde 1996 hasta 1997: el 75% utilizaron donantes emparentados. Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concordantes y se puede considerar el trasplante con células de un HLA concordante, de donante no emparentado. Para facilitar la búsqueda de un donante concordante, se han desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrededor del mundo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de estos registros y contiene más de 3,9 millones de donantes HLA tipados, siendo el mayor registro de donantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994; véase Tabla 40-1; www.marrow.org). Aproximadamente, el NMDP ha facilitado 8.100 (en el año 2000) trasplantes de donantes no emparentados desde que el registro comenzó en 1987. Los injertos de células progenitoras hematopoyéticas están entre los más difíciles de todas las técnicas clínicas por varias razones (Madrigal. 1997; Hansen. 1997). Primero, en el momento del trasplante, los receptores están casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a la deficiencia heredada (inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del acondicionamiento pretrasplante (quimioterapia citotóxica y radiación). El acondicionamiento se requiere para eliminar las células malignas y para prevenir al sistema inmune del receptor del rechazo de las células progenitoras del donante que son infundidas muchos días después del acondicionamiento. La cantidad de pretratamiento citotóxico es suficiente para eliminar los leucocitos circulantes, casi eliminar las plaquetas, y abrogar la producción de nuevos eritrocitos. Por ello, el receptor es profundamente susceptible a todo tipo de infecciones y ciertamente morirá si no se le rescata con cuidados médicos extraordinarios y con translusión de células progenitoras. El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunológíco del receptor por las células progenitoras alogénicas trasplantadas originando una EICH. La EICH tiene muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algunos centros de trasplantes han obtenido un éxito excepcional. Los recientes informes de instituciones determinadas y la IBMTR sugieren una supervivencia libre de leucemia del 40% al 60% a los cinco años tras el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas no emparentadas a pacientes con leucemia mieloide crónica en fase crónica (Tabla 40-1, www.ibmtr.org) (Hansen. 1998). La supervivencia de los pacientes con anemia aplásica severa trasplantados con células de donantes no emparentados varía de un 30% a un 50% a los cinco años dependiendo de la edad del paciente (véase Tabla 40-1, NMDP en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos centros de índices de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998). Además de médula como fuente de células progenitoras hematopoyéticas. la obtención de células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de células progenitoras de sangre de cordón umbilical (Cairo, 1997) aumenta la disponibilidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmunosupresión. incluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos (p. ej., "minitrasplantes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad del trasplante de células progenitoras como técnica terapéutica en pacientes actualmente excluidos por su edad o por su disfunción orgánica. El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas puede usarse también para generar respuestas inmunes dirigidas contra las células tumorales. La recaída de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han recibido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algún grado de discordancia puede ser beneficioso en la estimulación de la respuesta inmune contra las células tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resolviendo los problemas de esta técnica tan difícil, el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas puede convertirse en uno de los métodos más
ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades (véase Cap. 33). Tipificación HLA para el trasplante de células progenitoras. Muchos factores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado del trasplante de células progenitoras hematopoyéticas (Madrigal. 1997). El trabajo pretrasplante incluye la tipificación del HLA-A. -B y -DR de todos los miembros disponibles de los familiares más cercanos para identificar un donante concordante relacionado y para establecer la herencia de los haplolipos. También puede ser apropiada la tipificación basada en el ADN de los genes de dase II. que se ha convertido en un estándar, y la tipificación basada en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado en muchos centros. La tipificación de la familia completa, la tipificación del nivel alélico (i.e.. alta resolución) de los locus específicos HLA de clase I y II. la tipificación de otros locus en el MHC (repeticiones en tándem cortas o locus complementario), o el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de precursores de células T citotóxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999) también puede ser adecuado. El nivel de resolución de la tipificación del HLA requerido difiere para el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas y renal. Parece que para el trasplante de células progenitoras se necesita una alta resolución de tipificación HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a que el trasplante de células progenitoras incluye la transferencia de un sistema inmune completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en definir los locus que deben considerarse en la selección del donante, el nivel de resolución que debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de las múltiples discordancias. El nivel de concordancia requerido puede variar en cada enfermedad o protocolo. Las evidencias sugieren que la concordancia de un donante y un receptor no emparentados para los alelos HLA-A. -B y -DRB1 está relacionada con una mejora del resultado. El impacto de la concordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C y HLA-DQ) está bajo estudio. Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin embargo, las discordancias múltiples parecen tener un impacto negativo en el resultado (Sasazuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Además, el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la enfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervivencia tras el trasplante está reducida a medida que avanzan las lases de la enfermedad (dalos en las páginas web señaladas en la Tabla 40-1).
RESUMEN Las moléculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor de histocompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el carácter de las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas moléculas proporciona la diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en un ambiente de patógenos hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta capacidad del sistema inmune de distinguir lo propio de lo extraño se extiende al reconocimiento de las moléculas de HLA extrañas tras el trasplante tísular. La definición y la caracterización de los alelos y las moléculas del HLA se han combinado con los protocolos clínicos para maximizar la compatibilidad y minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejido extraño. Estos avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una modalidad de tratamiento con éxito en la sustitución del tejido enfermo.
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CAPÍTULO 40
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ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..
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4 1
CAP
Complejo mayor de histocompatibilidad y enfermedad Julio C. Delgado, M.D. Edmond J. Yunis, M.D.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III
949
Genes BF. C2y C4 Factor de necrosis tumoral de linfotoxina
(y ) y genes
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENÉTICOS
959
Polimorfismo genético
y
Fuerza de la asociación
Genes de la proteína 70 del golpe de calor COMPLOTIPOS
952
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
952
TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO
953
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
954
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
955
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de defectos en genes de MHC
Análisis del modelo de herencia basado en parejas de hermanos Análisis del modelo de herencia basado en estudios de población Método de cálculo de probabilidades (Lod
Score
Method)
RESUMEN
964
BIBLIOGRAFÍA
961
Enfermedades de etiología y patogénesis desconocidas
Para comprender el papel del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las respuestas inmunes y en la patogénesis de la enfermedad se requiere la definición de polimorfismo en la Clase I y Clase II, y los genes en la región central del MHC. algunas veces llamada región no-HLA o región Clase III. Debe mencionarse desde el principio que existen regiones del ADN donde aparecen recombmaciones con más frecuencia de lo esperado (esto es, en el intervalo de HLA-DR a HLA-DP). Pero tiene particular importancia el hecho de que hay zonas del ADN, o ADN fijado, donde raramente se observan recombinaciones. Las dos mayores constelaciones son la región del complemento en la región central, y HLA-DR. DO en la región Clase II Además, el análisis de los haplotipos MHC en muchas poblaciones ha permitido reconocer que una proporción considerable de individuos tienen haplotipos específicos del grupo familiar que tienen un intervalo de HLA-B a HLA-DR. DQ idéntico. Eslos haplotipos. llamados haplotipos extendidos se deberían considerar como unidades genéticas fijadas que. estudiadas junto con variantes MHC que no forman parte de estos haplotipos. sirven para ayudar a comprender las respuestas inmunes y la asociación con la enfermedad. Las variantes de los genes clase I y clase II se describen en el Capítulo 40. Aquí se tratarán los genes y alelos de la región no-HLA, haplotipos extendidos, asociaciones con la enfermedad y los métodos para detectar la asociación de las enfermedades con los marcadores genéticos.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III Existen alrededor de 1.100 kilobases (kb) de ADN entre la región clase I y Clase II. generalmente llamada región no-HLA o clase III. Esta región
contiene genes que codifican proteínas de diversa función. Aunque las moléculas clase I y clase II se distinguen por parecidos estructurales y funcionales compartidos con los miembros de cada clase, las moléculas de clase III pueden definirse sólo como no-I y no-ll. porque sus genes y sus productos no tienen rasgos comunes y no son reconocidos por las células T. Incluye genes que codifican las proteínas del complemento C2 (C2). factor B {BF). C4 (C4A y C4S), el esteroide microsomal enzimático P-450 21hidroxilasa (CYP21). las citocinas como lactor de necrosis tumoral (TNF). linfotoxina- (LT ). linfotoxina . (LF- ). tres miembros de la mayor familia de la proteína 70 del golpe de calor (HSP70-1. -2, -Hom) y varios genes más (Trowsdale. 1995). Se ha analizado toda la región clase III mediante electroforesis en gel con campo pulsátil o clonando cromosomas artificiales de levaduras y vectores cósmidos (Dunham, 1987; Kendall, 1990; Ragoussis, 1991; Sargent, 1989; Spies. 1989). Se piensa que esta es una de las regiones con más genes del genoma humano, con aproximadamente un gen por 15 kb (Fig. 41-1). Se han secuenciado varios genes entre los genes C4A y HLA-B Algunos de ellos se han llamado G, genes localizados en bandas Giemsa-negativas (G1-G11) o BAT. trascripciones asociadas a HLA-B (BAT 1-9) (Sargenl, 1989; Spies. 1989). Gf codifica el factor 1 inflamatorio de alomjerto, y la transcripción del interterón- (INF- ) (Utans. 1995) Los genes G6 a G7 codifican proteínas putativas que pertenecen a la superfamiha Ly-6. que se sabe son importantes en la maduración de los leucocitos (Ribas, 1999). El transcriptor-1 específico de leucocitos representa el homólogo humano del transcriptor del ratón B144 y codifica un transcriptor inducible de IFN- . que existe en los tejidos linfáticos, células T. macrólagos y lineas celulares histocitarias (Holzinger, 1995). IKBL codilica un miembro putativo de la familia
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
de proteínas ikB involucradas en la regulación de la expresión de los genes de citocinas (Albertella. 1994). La secuencia completa de 1C7 ha revelado que este gen codifica un nuevo miembro putativo de la superfamilia Ig (Neville, 1999). RD. SK12W, DOM3Zy RP1 son cuatro nuevos genes encontrados entre Bf y C4. Las proteínas RD y Ski2w pueden estar relacionadas a empalmes del ARN, renovación del ARN y la regulación de la traducción. Las funciones de Dom3z y RP1 están siendo investigadas (Yu. 1998). La región entre los genes C4A y HLA-DR se ha estudiado con los mismos métodos. Se han identificado vanos genes, incluyendo NOTCH-4, G18. PBX-2 (G17), RAGE. G16, G15, G14. G13 (Creb-rp). GI2y TNX, en un segmento de 160 kb del ADN centromérico al gen C4A (Aguado, 1996). Alguno de ellos (G13-G15). expresa proteínas involucradas en el metabolismo lipidico (Aguado, 1998. 1999). Un par de genes, TNXA y TNXB. organizados en la orientación transcripcional opuesta a otros genes en esta agrupación, codifican proteínas extracelulares similares a tenascina y restrictina, que están presentes en el sistema nervioso central y periférico y en el músculo liso (Yang, 1999).
Genes BF, C2 y C4 Los C2 y C4 de la via clásica y el factor B de la vía alternativa del complemento son codificados por una región 120 kb del ADN genómico de unos 300 kb de HLA-DR y 650 kb de HLA-B (Carrol. 1984). C2 y BF muestran una semejanza considerable en la secuencia de aminoácidos y comparten un número de características físico-químicas y funcionales, lo que sugiere que ambos genes surgieron por duplicación en tándem de un gen ancestral similar al factor B. Ambos son serín-proteasas (de la familia SERPIN de proteínas del plasma) y median la escisión de C3 durante la activación de las respectivas rutas. C4, por otra parte, está relacionada estructural y funcionalmente con C3 y C5 y como contiene un tioléster interno muy reactivo, se relaciona con C3 y el inhibidor de la proteasa « -macroglobulina. Aunque el gen para C3 está ligado ligeramente al MHC en el ratón, en el hombre está en un cromosoma completamente diferente. Junto a 3' en cada locus C4 hay dos locus para el enzima adrenocorticoideo 21-hidroxilasa (CYP21A y CYPB). (Carroll, 1985: Higashi. 1986: White. 1986). Los dos genes tienen aproximadamente 3.4 kb de longitud y se dividen en 10 exones. En cierto modo son homólogos, pero tres mutaciones causan una terminación prematura de la transcripción del gen CYP21A. conviniéndolo en unseudogen (White. 1988).
951
Hay un alelo no expresado (C2'QO) que se encuentra en el 2% de la población caucásica europea. C4 se sintetiza como un único gran polipéptido de unos 200 kDa que sufre un proceso postsintético que incluye la proleólisis de una estructura de tres cadenas unidas por enlace disulfuro. La cadena más larga, de unos 87 kDa. es la cadena a y transporta el tioléster interno. Durante la activación de la vía clásica del sistema de complemento. Cls activado escinde un pequeño péptido con propiedades de analilotoxina por el extremo ammo de la cadena (/. C4. Hay dos locus distintos C4A y C4B que codifican dos formas de C4. C4A y C4B se diferencian sólo por cuatro residuos aminoácidos en la cadena a. entre las posiciones 1101 y 1106. Asombrosamente, C4A acetila preferentemente grupos ammo, mientras que C4B acetila preferentemente grupos hidroxilo. Así, C4B es hemolíticamente más activo, pero C4A es más activo que C4B inhibiendo la formación y disolviendo inmunocomplejos. Las variantes de C4 generalmente transportan determinantes antigénicos Rodgers (un epitopo Val-Asp-Leu-Leu de la cadena C4A), y variantes de C4B transportan determinantes Chido (un epitopo Ala-AspLeu-Arg de la cadena o. de C4B). Hay un polimorfismo genético amplio, detectable por electroforesis de gel de agarosa en proteínas C4A y C4B en todas las poblaciones examinadas (Awdeh, 1980). Se han reconocido al menos 18 alelos C4A. 21 alelos C4B y un gen no expresado (C4'Q0) de cada locus C4 (Mauff.1990). Se han identificado producios genéticos aberrantes o híbridos con características en parte C4Ay en parte C4B Más sorprendente es la variación en el número de genes C4 en algún haplotipo individual. Aunque es más habitual tener un C4A expresado y un C4B expresado, la homoduplicación y la heteroduplicación son habituales, como son los haplotipos con un solo gen C4 expresado. C4A'3y C4B'1 son los alelos más comunes en casi todas las poblaciones. C4A'4. C4A'2. C4B'2y C4B'5 muestran una distribución universal. C4A'6 también se observa en muchas poblaciones excepto en algunos grupos mongoloides. C4B'3 se identifica principalmente en grupos caucásicos y africanos.
¿
El factor B es sintetizado por el gen BF. Durante la activación de la vía alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en un fragmento aminoterminal Ba de 30 kDa y un fragmento Bb de 60 kDa. Mediante electroforesis con gel de agarosa. la proteína muestra un moderado polimorfismo con dos alelos muy comunes, BF'F (rápido) y BF'S (lento), dos alelos menos comunes, BF'F1 (más rápido) y BF'SÍ. también llamado BF'S07. (más lento), y un huésped de alelos raros. Con electroforesis, BF'F puede subdividirse en dos subtipos, BF'FA y BF'FB. BF'FB tiene dos variantes, FB1 y FB2. Hay variantes de BF'S. llamados SSf, 2y 3. La sustitución del aminoácido responsable de las variantes comunes de BF'FA. BF'FB y BF'S viene determinado por los residuos encontrados en el Iragmento Ba. mientras que los de BF'F1 y BF'Sí están localizados en el fragmento Bb. En las poblaciones caucásicas europeas, BF'F tiene una frecuencia de 0,2, BF'S 0,77. SF'Ff 0,01. BF'Sí 0,01, y un recuento de alelos raros sólo un 0,002. BF'S es el más común en las poblaciones caucásicas, mongoloides y australoides, mientras que BF'F es la más común en las poblaciones negroides. BF'F1 se observa en grupos africanos asi como en algunas poblaciones caucásicas. El gen C2 tiene 18 kb de longitud. Durante la activación de la vía alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en los aminoácidos 223 y 224, un enlace arginina-lisina, en dos fragmentos. C2a y C2b. C2a es hemolíticamente activa. A nivel proteico, C2 muestra por electroforesis un polimorfismo menor. Los alelos son C (común), un alelo 6 (básico) menos común con tres variantes básicas raras y cuatro variantes A (acidícas) raras. La localización polimórfica para el alelo C2'B es transportada por el fragmento C2A. C2'C supone más del 95% de los genes C2 en la mayoria de las poblaciones. C2'B supone del 3% al 4% de los genes C2.
Factor de necrosis tumoral a (y |5) y genes de linfotoxina a y p Los genes TNF y LTA o TNFB codifican potentes citocinas inmunomoduladoras que son producidas en respuesta a varios estímulos inflamatorios. El TNF-rx se produce en una variedad de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, y LT-a específicamente por linfocitos (Carroll. 1987). TNFo. y LT-a forman trímeros biológicamente activos y ambos se unen a los mismos receptores de 55 kDa y 75 kDa (Bazzoni. 1995).TNF-
952
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
cinco microsatélites: los microsatélites TNFa y TNFb están localizados en la región telomérica 3.5 kb al gen TNFB y se han identificado 7 y 13 alelos, respectivamente. El microsatelite TNFc está localizado en el intrón 1 del gen TNFB y tiene dos alelos. TNFdy TNFe, que tienen siete y tres alelos, respectivamente (Jongeenel. 1991).
Genes de la proteína 70 del golpe de calor Las proteínas de estrés o proteínas de goipe de calor se expresan en respuesta a una variedad de estímulos de estrés a las células. Esta respuesta se ha observado en todas las especies examinadas hasta la fecha. La familia de las proteínas de estrés de 70 kDa tiene una alta identidad de secuencia de aminoácidos desde los primitivos eucanotas hasta los humanos. Varios estudios han demostrado el locus para la proteína 70 del golpe de calor (HSP70) en los cromosomas 6. 14, 21 y al menos en otro cromosoma autosómico (Hunt. 1985: Sargent, 1989). Tres genes que codifican a los miembros de la familia HSP70 están localizados en la telomérica 92 kb al locus C2 {HSP701, HSP70-2 y HSP70- Hom). Los análisis secuenciales de genes HSP70-1 y -2 han mostrado que hay genes carentes de intrón que codifican un compuesto proteico idéntico de 641 aminoácidos. HSP70-Hom también es un gen carente de intrón que codifica una proteina de 641 aminoácidos y tiene un 90% de identidad de secuencia con HSP70-1 (Milner. 1990). Debido al alto grado de similitud de secuencias entre las regiones codificadoras de los genes HSP70. las sondas de ADN que corresponden a las regiones codificadoras tienden a la hibridación cruzada. Sin embargo, hay suficiente diferencia de secuencias entre las regiones no traducidas 5' y 3' del HSP70-1. -2 y -Hom para designar cebadores de oligonucleótido y sondas que permitan la ampliación específica e hibridación de los tres genes (Milner. 1992). Se han detectado tres sustituciones de nucleótidos en las regiones 5' flanqueadoras y no traducidas de HSP70-1: una transversión A-*C en la posición -110, una transición T-»C en la posición +120, y una transversión G->C en la posición +190. Se ha demostrado que variaciones en la posición -110 y +120 influyen en la movilidad en la electroforesis en gel de políacrilamida. Se han reconocido tres formas alélicas: HSP70-1 A (lenta), 8 (rápida) y C (intermedia). Las sondas de oligonucleótidos que contienen variaciones de secuencia en la posición -110 y +120 pueden también detectar los tres alelos. después de una reacción de ampliación en cadena de la polimerasa específica (PCR) del gen HSP70-1. En HPS70-2. una transición G->A en la posición 1267 provoca la pérdida de un lugar de restricción Psl-I. La hibridación de ADN digerido genómico Psl-I con una sonda HSP70 provoca un fragmento polimórfico de ADN. de 8,5 kb o 9 kb de longitud. En el gen HSP70-Hom. hay una transición T~*C en la posición 2437 que se encuentra dentro de un lugar de restricción Nco-I y produce dos fragmentos alélicos de 1.5 kb y 0,5 kb, respectivamente.
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS Del estudio de la distribución de los complotipos según las especificidades HLA-B y HLA-DR en haplotipos normales caucásicos determinados por estudios de familias, se hizo evidente que existia un notable desequilibrio de ligamiento que afectaba a toda la región. Se podía fácilmente reconocer el HLAB. complotipo, grupos de alelos DR que mostraban tres puntos de desequilibrio de ligamiento estadísticamente significativos (Fig. 41-2) y que definían los que se denominan haplotipos extendidos (Awdeh. 1983). Estos haplotipos extendidos, que suponen al menos un 30% de los haplotipos normales caucásicos, tienen una estructura voluminosa y una secuencia de ADN relativamente fija y transportan alelos si no idénticos, muy parecidos, incluso cuando se encuentran en individuos sin relación aparente. Otro rasgo importante de los haplotipos extendidos es su asociación con ciertos grupos raciales. En su mayoría, son muy característicos de un subgrupo étnico y tienen frecuencias más bajas o no existen en absoluto en otros grupos étnicos. Tienen presumiblemente su origen en el grupo donde su frecuencia como haplotipos intactos es la más alta. Hay más de una docena de haplotipos extendidos comunes en los caucásicos (Alper. 1992). Se han descrito diferentes haplotipos extendidos para diferentes razas (p. ej. afroamericanos) (Fraser, 1990). Estudios iniciales definieron los haplotipos extendidos como el intervalo entre HLA-B y DR. Entonces se observó que otros alelos del MHC no caracterizados en el intervalo probablemente estaban incluidos. Al contrario, a pesar de que los alelos HLA-A han mostrado una variación limitada para los haplotipos extendidos, sólo la mitad de estos haplotipos muestran asociaciones únicas significativas de alelos HLA-A (Alper. 1982). El gen HLA-Olue el último en ser determinado. Según la distancia genética y los datos de identificación previamente incompletos de los pares HLA-B/Cw. era evidente que los haplotipos conservados también incluirían la región genética HLA-Cvt. Recientemente, se han asociado diferentes alelos HLA-Cw con diferentes haplotipos extendidos (Tabla 41-2) (Clavijo, 1998). El autor ha desarrollado el concepto de que los haplotipos extendidos poseen una fijación al ADN al menos en el intervalo HLA-B/DR y. por lo tanto, si transportan un gen de susceptibilidad para una enfermedad, implícitamente todos los eiemplos independientes de ese haplotipo mostrarán asociación con esa enfermedad. Y al contrario, si el haplotipo extendido no tiene un gen de susceptibilidad para una enfermedad, entonces él y los alelos que lo constituyen protegerán frente a la enfermedad. Es esencial conocer la distribución étnica de un haplotipo extendido para evaluar si el haplotipo extendido en pacientes está aumentado comparado con una población control étnicamente equivalente o es realmente de hecho un marcador para la distribución étnica de la enfermedad.
COMPLOTIPOS Tabla 41-1 En humanos, los genes C2 y BF están muy cercanos el uno al otro, separados por menos de 2 kb. pero BF y C4A están separados por unos 30 kb. C4A y C4B están separados por unos 10 kb. Los cuatro genes complementarios muestran un notable desequilibrio de ligamiento en haplotipos determinados por estudios de familias. Es decir, aparecen en poblaciones juntas como grupos y en el mismo cromosoma con más frecuencia de la esperada a la de sus alelos individuales más o menos de la misma manera que los alelos en los sistemas de grupos sanguíneos Rh y MNS. No se han documentado recombinaciones entre los genes complementarios. Por estas razones, se consideran de forma correcta como unidades genéticas únicas, o complotipos. arbitrariamente designados por sus alelos BF. C2. C4A y C4B. Asi, BFS. C2'C. C4A'00. C4B 1 es un complotipo que en forma abreviada es SC01. Hay más de una docena de complotipos en caucásicos que tienen frecuencias de casi un 0,01 o más (Tabla 41-1). El complotipo SC31 es el más común en la mayoría de las poblaciones. En las poblaciones negroides, FC31 es común, como lo es SC42 en los mongoloides asiáticos. ¡
Complotipos comunes e n cromosomas normales d e poblaciones caucasoides* Complotipo
Frecuencia
SC31 0,43 SC01 FC31 0.096 SC30 0.053 SC42 0,04 SC61 0.034 FC30 0,031 FC01 0.029 SC02 0.029 SC21 0.022 SB42 0.019 SC33 0,014 SC2(1, 2)0.013 SC32 0.011 "Los complotipos so dan como letras abreviadis y números, con cuatro alelos en orden arbitrario: BF. C2. C4A. C4B - El locus C4B esta heleroduplicado
CAPÍTULO 41
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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
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Figura 41-2. La distribución de haplotipo de los complotipos (haplotipos de los alelos complementarios) SC01 {BF'S. C2'C. C4A'00. C4B'1) y SC21 (BF'S. C2'C. C4A'2. C4B'/)en relación con los alelos HLA-B en ordenadas y los alelos HLA-DR en abcisas. Las alturas y anchuras que representan cada especificidad HLA son proporcionales a las frecuencias de los alelos para las respectivas poblaciones. Los racimos representan los desequilibrios de ligamiento y los círculos los haplotipos extendidos (HLA-B16(38). SC21. DR4) en los judíos asquenazies y [HLA-B8. SC01. DR3) en los ingleses y. con un alcance mucho menor, en los judíos. (De Alper CA. Awdeh Z. Yunis EJ: Conserved. extended MHC haplotypes. Exp Clin lmmunogen1992; 9:58; con permiso de S. Karger)
TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO El sistema complemento está dividido en dos vías: la vía clásica que contiene nueve diferentes componentes totalizando al menos 12 proteínas, y la vía alterna que contiene cuatro. Tres de las 16 proteínas están codificadas dentro del MHC y manifiestan variantes estructurales heredadas que pueden estudiarse por técnicas que detectan diferencias en la carga superficial neta debidas a diferencias en los aminoácidos. Se utilizan dos métodos para separar las proteínas (1) electroforesis en gel de agarosa de alto voltaje para detectar variaciones de movilidad entre proteínas a un pH determinado y (2) electroforesis en geles de poliacrilamida de capa fina, que demuestra diferencias en puntos isoeléctricos. Las proteínas pueden obser-
Tabla 41 -2 Distribución d e l alelo HLA-Cw e n relación c o n haplotipos extendidos c o m u n e s * Haplotipo extendido [HIA-R8. SCOI. DR3¡ ¡HLA-B7. SC31. DR2¡ [HLA- B44. FC31. DR7] [HLA-B44. SC30. DR4] (HLA-B57, SC6I. DR7¡ [HLA-B14. SC22. DR1] [HLA-B35. SC31. DR5] ¡HLA-B38, SC21. DR4] ¡HLA-B 15. SC33. DR4) [HLA-B 18. F1C30. DR3I [HLA-B 18. S042. DR2]' [HLA-B42. FC(1.90) 0. DR3f
Alelo HLA-Cw 0701 0702 1601 0501 0602 0802 0401 1203 0304 0501 1203 1701
'Dalos Oe cromosomas de población normal caucasoide de Boston. •Datos de pacientes con deficiencia de C2 De Clavijo OP. Delgado JC. Awdeh ZL. y col: Tissue Antigens 1998. 52 282 Datos de cromosomas de población normal negra que vive en Boston De ClaVIJO OP, Delgado JC. Yu N. y col Tissue Antigens 1999: 54 303 :
varse por electroforesis de inmunofijación usando la insolubilidad de los complejos antígeno-anticuerpo o por la detección de actividad hemolítica funcional con geles sobrepuestos donde los hematíes de oveja sensibilizados con anticuerpos se combinan con suero deficiente en complemento (Awdeh. 1983) (véase Cap. 38). Las proteínas de la vía clásica |C2. C4A y C4B) y una de la vía alterna (BF) están codificadas dentro del MHC. son polimórficas. y por lo tanto útiles para la misión de los haplotipos del MHC. Para la tipificación de C2. las proteínas se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se visualizan por hemolisis C2-inducida en geles superpuestos. El suero humano normal diluido puede reemplazar el suero deficiente en C2 como un reactivo porque C2 es el factor limitante en la vía clásica (Fig. 41-3). La tipificación de C4 requiere tres técnicas diferentes: 1. Electroforesis de inmunofijación tras el tratamiento con neuramimdasa. Los patrones producidos muestran tres bandas para cada variante con alguna coincidencia entre ciertas variantes. Un tratamiento adicional de la muestra con carboxipeptidasa reduce cada variante a una sola banda. 2. Detección de C4A frente a C4B mediante un ensayo funcional hemolitico. Este método distingue C4A o patrones sobrepuestos de C4B porque las variantes de C4B tienen de 5 a 10 veces la actividad hemolítica de las variantes de C4A. 3. Reactividad serológica Rodgers (C4A) o Chido (C4B). El suero se incuba bien con anti-Rodgers humanos o con anti-Chido humanos para probar la inhibición de la aglutinación con eritrocitos positivos apropiados.
Alternativamente, las variantes de C4 pueden tipificarse por reactividad Chido o Rodgers mediante inmunotransferencia. Hay dos formas de detectar alelos nulos de heterocigotos C4. La electroforesis de muestras de C4 nulos (C4AVO y C4B'QO) demuestra ausencia de bandas en homocigotos pero en heterocigotos requiere la cuantificación por inspección visual, por inmunoelectroforesis cruzada o por barrido densitométnco de los patrones de inmunofijación. Un método alternativo consiste en determinar la presencia y las relaciones de las cadenas (/ de C4A y C4B tras la electroforesis de inmunoprecipitados en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato sódico.
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SECCIÓN V
Hl
1)2 B3 B4 »5
B6 1)7
Al
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
A7 A2 A3 A4 A3
A6
C4
Figura 41-3. Posiciones electroloréticas de vanantes de C4 relacionadas unas con otras (diagrama) Las variantes del locus C4B (Chido) se muestran a la izquierda, y las del locus C4A (Rodgers) se muestran a la derecha Cada gen consta de tres Bandas. Se observará que alguna de las variantes de C4B corresponden exactamente a la posición de las variantes de C4A (B7 y A2. por ejemplo) La distinción entre ellas se hace mediante un gel de agarosa superpuesto sensible a C4 donde sólo las variantes de C4B tienen una actividad hemolítica activa C4 (Awdeh, 1980). El BQOy AQO (alelos nulos) no muestran bandas. En la posición más baja (lado izquierdo) de la figura, se muestran ejemplos del tipo común C2 (C) y un heteroogoto (BC) mediante electroloresis en gel de poliacrilamida con gel de agarosa superpuesto, conteniendo hematíes de oveja sensibilizados con anticuerpos y una dilución 1/90 de suero humano normal. En la porción más baja (lado derecho) de la figura, se muestran ejemplos de patrones electroloréticos de vanantes BF tras eleclroforesis con gel de agarosa e inmunofi|ación con antisueros anti-lactor B Cada gen consta de una banda mayor y otras dos menores. El ánodo estaba a la derecha.
La tipificación del factor B se realiza después de una electroforesis prolongada en gel de agarosa e inmunofi|ación. Los modelos homocigóticos constan de una banda mayor y unas bandas menores rodeando, y los patrones heterocigóticos son la suma de dos patrones homocigóticos.
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE Los genes que controlan la respuesta inmune a antígenos extraños fueron descritos inicialmente en modelos animales. Se demostró que estaban localizados dentro de la región de la clase II del MHC. Se ha demostrado que las células presentadoras de antigenos (APC) procesan fragmentos de antígeno y presentan a estos péptídos como complejos con las moléculas clase I y clase II, iniciándose así la respuesta inmune. En los últimos años, se han producido avances significativos en la comprensión de la base molecular de la presentación del antígeno MHC, básicamente como resultado de la determinación de la estructura tridimensional de
las moléculas de clase I (Bjorkman. 1987). y clase II (Brown. 1993). y la caracterización de la unión de los péptídos a las moléculas MHC (Jardetzky, 1991; Stem. 1994). La estructura cristalina del péptido ligado a las moléculas Clase II ha demostrado que las cadenas laterales del péptido están localizadas en pequeñas cavidades, llamadas bolsillos, en el lugar de unión. Estos bolsillos varían de acuerdo a los aminoácidos codificados por cada alelo HLA. Las mutaciones puntuales en los genes clase II son criticas para la unión del péptido y la presentación y ocurre normalmente dentro o cerca de los bolsillos de unión al péptido. Así, la diferenciación de los alelos HLA es crucial para la interpretación de HLA y asociaciones con la enfermedad. Los métodos para la caracterización de los alelos clase I y clase II se han descrito en el Capítulo 40. Parece que algunos bolsillos juegan un papel en algunas enfermedades. Por ejemplo, ciertos alelos que codifican el bolsillo de unión al péptido. P4 o la cadena DRp\ están asociados con artritis reumatoide (Hammer. 1995) y lepra tuberculoide (Zerva. 1996), mientras que otras que codifican el bolsillo P9 o la cadena DQ|i están relacionadas con la tuberculosis clínica (Goldfeld, 1998), pénfigo vulgar (Delgado, 1997) y protección frente a diabetes insulino-dependiente (Todd, 1987).
CAPÍTULO 41
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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC Hay un número notable de enfermedades que muestran asociación con HLA. La mayoría, aunque no todas, son autoinmunes y no muestran una herencia mendeliana bien definida. El gran número de enfermedades asociadas con HLA se debe al hecho de que el MHC contiene muchos genes importantes y porque los genes de la región, incluso los genes no-HLA, son extraordinariamente polimórficos. En una región donde la densidad de genes se muestra anormalmente alta, esto provoca un gran número de genes de potencial susceptibilidad. Un problema importante con los genes de susceptibilidad de MHC es su penetrancia incompleta, haciendo muy difícil, sino imposible, la segregación formal habitual y los estudios de ligamiento. Además parece probable que muchas enfermedades asociadas a MHC sean poligénicas. Debido a estos problemas, el autor comenzará su exposición con las alteraciones determinadas por MHC que muestran herencia mendeliana y un 100% de penetrancia, al menos para el defecto bioquímico primario.
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de defectos en genes de MHC Las variaciones frecuentes de los componentes del complemento humano y la cantidad de genes, junto al amplio polimorfismo de las proteínas, hace que los genes de complemento sean excelentes marcadores de asociaciones de enfermedad con el complejo de histocompatibilidad (Yang, 1999).
Deficiencia de C2 La deficiencia del segundo componente del complemento se ha descrito sólo en caucásicos y es el estado deficitario de proteína del complemento más común en esa población. Aproximadamente la mitad de los pacientes son asintomáticos. Sin embargo, la deficiencia de C2 se ha asociado con polimiositis, infecciones piogénicas recurrentes, púrpura Henoch-Schónlein y vasculitis. El cuarenta por ciento de los casos descritos tienen una enfermedad sistémica tipo lupus; sin embargo, sólo el 16% de los hermanos homocigóticos deficientes en C2 han tenido alteraciones tipo lupus. Esto aconseja con firmeza la investigación de errores sistemáticos. No obstante, existe una clara tendencia aumentada de los sujetos homocigóticos deficientes en C2 a tener alteraciones tipo lupus, quizá relacionado con una depuración o desagregación defectuosas de los inmunocomplejos. La deficiencia de C2 tipo I resulta de la homocigosidad del alelo nulo. C2"QO, que tiene una frecuencia de gen de un poco menos de 0,01. Hay aproximadamente 1 homocigoto por cada 10.000 individuos. Casi todos los pacientes tienen elementos de un haplotipo extendido [HLA-A25. Cw'1203, B18. S042. DRBV1501. DQBI'0601. DQAV0102] que contiene un gen de deficiencia en C2 (Awdeh, 1980; Clavijo, 1998; Truedsson, 1993). Las asociaciones de complotipo son más frecuentes, seguidas por las asociaciones del DR, HLA-B, HLA-CW y HLA-A, de acuerdo con el orden de gen conocido. C2"Q0 resulta de la deleción de un gen de 28 pb que genera un marco de lectura y un codón finalizador de 14 pb distal al final del exón 5. La deficiencia de C2 tipo II (no asociada con ningún elemento de los haplotipos tipo I) es muy rara y produce un bloqueo selectivo de la secreción de C2. El motivo del bloqueo de esta secreción no se conoce (Colten, 1992; Zhu, 1998).
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y otras mutaciones que producen fallos en la transcripción (Braun, 1990; Lokki, 1999). El alelo C4A'O0. particularmente en individuos homocigóticos o en aquellos con deficiencia completa de C4, se ha asociado con lupus eritematoso discoide y sistémico (Dunckley, 1987; Nousari, 1999). Esta susceptibilidad probablemente se relaciona también con un manejo defectuoso de inmunocomplejos, como en la deficiencia de C2 y otras deficiencias del primer componente del complemento (Fielder, 1983). Los homocigóticos C4B'Q0se han asociado con nefropatia de inmunoglobulina A (IgA). Además, hay una incidencia 3.5 veces mayor de homocigóticos C4B'Q0 en niños con meningitis bacteriana (Colten, 1992). El nivel de C4 en suero en pacientes con alelos C4 nulos es extremadamente variable y no puede utilizarse con fiabilidad para detectar heterocigotos para una deficiencia completa, incluso aunque haya una correlación aproximada entre el nivel de C4 y el número de genes C4 expresados.
Hiperplasia suprarrenal congénita por deficiencia de 21-Hidroxilasa Esta alteración es clínicamente heterogénea, con una forma grave con depleción salina, una forma más leve tardía manifestada en gran parte por masculinización en las chicas, y una forma leve oculta. El vínculo con el MHC de esta alteración lúe descubierto antes de que tuese detectada ninguna asociación de MHC y antes de que se supiera que los locus CYP21 estaban localizados en el MHC. Posteriormente se encontró que en los caucásicos europeos estudiados en el noreste de Estados Unidos y en Inglaterra, el 20% o más de los haplotipos en los pacientes con la forma con depleción de sales tenían el haplotipo extendido raro [HLA-A1. Cw6, B47, FC (91)0. DRB1 '07. DRB4'0101. DQAV0201. DQBV0201] (Fleischnick, 1983). Se ha demostrado que este haplotipo tiene una deleción tanto de C4B como de CYP21B. explicándose asi la gravedad de los síntomas y la deficiencia completa del enzima en homocigotos para este haplotipo. Entre los pacientes con la enfermedad más leve y oculta, es común un haplotipo extendido diferente; [HLA-B65. SC2(1.2>, DR1] (Sinnot, 1991). Este haplotipo es común, particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia en caucásicos de Boston por encima de 0,01. En todas las formas de deficiencia de 21-hidroxilasa, la mayoría de haplotipos de MHC no están extendidos y hay una gran variedad de complotipos, lo que sugiere que muchas mutaciones independientes han provocado una deleción o una alteración del gen CYP21B. De estas observaciones, se pueden extraer algunos principios generales para la posible aplicación a estas enfermedades de herencia y patogénesis desconocidas que presentan asociación o ligamiento con MHC. Primero, si un gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán asociaciones positivas con la enfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán una asociación negativa con la enfermedad. Como los haplotipos extendidos tienen fijación al ADN en eiemplos independientes de haplotipo extendido asociado a enfermedad, y son comunes, las personas sanas deben transportar genes de susceptibilidad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC, y particularmente los haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especificidad en la población, Es por tanto particularmente importante en estudios de marcadores de MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los de pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados étnicamente. Idealmente, el apareamiento étnico debería incluir regiones específicas de origen o subgrupos étnicos.
Deficiencia de C4 Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la población general. El treinta y cinco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A o C4B (esto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos nulos, y menos del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de haplotipos C4 (Irans C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden detectarse en heterocigotos sólo con estudios de familia. En contraste con la deficiencia de C2, la deficiencia de C4 se ha descrito en al menos nueve haplotipos MHC diferentes, incluyendo aquellos con tipos BF diferentes, lo que sugiere que la deficiencia surge de un número de mutaciones diferentes. C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes, codones finalizadores
Enfermedades de etiología y patogénesis desconocidas Se han descrito un gran número de enfermedades que muestran asociaciones con MHC. Estas alteraciones son muy diferentes de unas a otras y, aunque la mayoría tienen al menos algún aspecto inmunológico, otras pocas no. Hay muchos problemas que impiden comprender los mecanismos por los que se producen estas enfermedades, y los análisis de marcadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panorama sólo secundariamente. El origen más importante de confusión es un fenó-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado más claramente en gemelos homocigóticos que presumiblemente tienen genes idénticos. Si uno de estos gemelos tiene una de estas enfermedades (p. ej., diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo no tiene necesariamente la enfermedad. Para la diabetes tipo I. la relación de concordancia no es superior al 50°c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetrancia de una enfermedad en un huésped completamente susceptible es incompleta: aunque hay una importante razón para considerar a los genes en el MHC como determinantes de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. sólo el 15% de los hermanos con MHC idéntico de los pacientes tienen diabetes insulinodependiente. La diferencia entre el 50% y el 15% muestra la influencia de los genes en un segundo locus (o locu) no ligado a MHC, y también sugiere un factor o factores ambientales en la susceptibilidad determinante. La penetrancia incompleta hace difícil la asignación de una forma especifica de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar familias con más de un miembro afectado en una o más generaciones sea ba]a. Normalmente se utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros factores que complican la situación son la incapacidad para determinar si se está estudiando un grupo de pacientes homogéneos en términos de determinación genética. Casi el 5% al 6% de las familias seleccionadas al azar con un miembro diabético tipo I tendrá un segundo niño afectado. De estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendrá un MHC idéntico, el 35% serán haploidénticos, y un pequeño porcentaje no compartirá haplotipos MHC. Este patrón sugiere una herencia recesiva de un gen de susceptibilidad ligado a MHC para la enfermedad. Esta conclusión también se basa en los resultados de los análisis de distribución de homocigotos y heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabéticos tipo I (Raum. 1981). Sin embargo, todavia se ha de explicar la desviación del 100% de identidad MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan están el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impenetrantes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia, incluyendo penetrancia variable en homocigotos comparado con heterocigotos. Esto ha conducido a un vasto número de modelos de enfermedad sin encontrar una manera de hacer distinción entre ellos. Al menos, sin embargo, los estudios de familia proporcionan datos de haplotipos muy útiles y generalmente permiten la asignación de homocigosidad para un marcador HLA en los individuos de prueba. También se ha establecido que la asociación MHC está basada en un ligamiento entre un gen de susceptibilidad y el MHC. Se desconoce todavia el número de alelos de susceptibilidad diferentes para una enfermedad en una población específica. Con respecto a esto, los haplotipos extendidos pueden ser útiles porque, si están aumentados en los pacientes, probablemente representan un alelo único de susceptibilidad que pudiera estar en cualquier lugar en la región de fijación. Sin embargo, algunos pacientes presentan sólo porciones de esos haplotipos y esto proporciona indicios para localizar la participación de los alelos específicos. Otro indicio puede ser el reparto de alelos específicos por dos o más haplotipos extendidos diferentes.
Enfermedades especificas sin evidencia de herencia mendeliana y con asociaciones MHC La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus marcadores. Esta lista no es exhaustiva y sólo se tratarán algunas de ellas. La aplicación de los métodos de análisis ya citados sólo ha permitido entender unas pocas de estas alteraciones. Existe una asociación marcadamente potente entre HLA-S27 y espondilitis anquilosante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas (Khan, 1992). Entre los pacientes con EA, artropatías reactivas y uveitis aguda anterior, alrededor del 90% de los pacientes caucásicos, comparado con un 5% o 10% de los controles sanos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La asociación de B27 con estos síndromes en cuatro grupos raciales (caucásicos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B27 por sí mismo o un gen estrechamente ligado a B27 está involucrado en la patogénesis de estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se relaciona también con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLAB27 positivos en la población en general, sólo el 2% desarrolla EA Si hay
una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes HLA-B27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos 14 alelos de HLA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra más comúnmente en los sujetos normales. Se ha propuesto que la presencia de HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA. incrementa más la susceptibilidad a EA. lo que corrobora la hipótesis de que los alelos no-B27contribuyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las proteínas bactenanas que muestran homología estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia de seis aminoácidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los residuos 188 y 193 de una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y entre las posiciones 71 y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una secuencia de cinco aminoácidos de un plásmido de una cadena atrilogénica de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989). De todas las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es la que más se ha estudiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992; Winler, 1993). La contribución de HLA a la diabetes tipo I no se ha explicada adecuadamente. Existen considerables aumentos en el HLA-DR3y DR4 en pacientes caucásicos. En muchas pero no en todas las poblaciones de pacientes caucásicos con diabetes tipo I hay un exceso de heterocigotos DR3/DR4 por encima del número de homocigotos DR3 o DR4 predecibles por el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no están claras. Por análisis del ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgrupo de DR4 en desequilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actualmente se considera que el último gen es un marcador principal y quizás un determinante primario de la susceptibilidad a la diabetes tipo I, existe sólo en el 70% de los pacientes caucásicos, e incluso en aquellos que lo transportan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para diabetes: DRBV0401. DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 están asociados en gran medida con la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o están menos. Además, se ha observado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el alelo DOBV0302 en el haplotipo DR4. Por lo tanto, parece probable que haya múltiples contribuciones de la región clase II a la susceptibilidad a diabetes DQA 1'0301 esta presente en todos los haplotipos Dispositivos, transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda contribuir al nesgo. Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la diabetes tipo I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que también transportan un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no sufren riesgo en absoluto para la enfermedad (prolección dominanle), como se espera en una alteración recesiva. Un modelo recientemente propuesto para la diabetes tipo I que asume que DOB1 es un determinante directo de la susceptibilidad, sugiere una jerarquía de afinidades entre las diferentes moléculas clase II que compiten por unirse al mismo péptido de diabetes tipo I (no identificado). La susceptibilidad sucede si un producto del gen (por ej., DQBV0302) se une y presenta el péptido. En presencia de un competidor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sinergismo (DR3/DR4) podría explicarse por la unión de un péptido de alta almidad a un dímero clase II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes haplotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afinidades de aquellas moléculas por el péptido. Otro modelo propone que un ácido aspártico en el codón 57 de la cadena DOS protege (rente a la diabetes tipo I. La presencia excesiva en pacientes de un aminoácido dilerente. más frecuentemente valina o serina. en esa posición en haplotipos transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios estudios han confirmado este hallazgo en caucásicos pero no en diabéticos orientales. Otros estudios proyectan la hipótesis de que la presencia de arginina en la posición 52 del DQA1 es otro factor genético. Se ha propuesto que la combinación del ácido no aspártico en la posición 57 de DOB1 y arginina en la posición 52 de DQA 1 es un importante determinante de susceptibilidad para la diabetes tipo I mediada por genes DOB1. Existe datos significativos respecto a la asociación entre marcadores MHC y artritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992). Para la mayoría de las poblaciones estudiadas, el marcador asociado primario es HLA-DR4. En los caucásicos, por ejemplo, los alelos DR4 más comunes asociados con AR son DRBV0401, 0404 y 0408. y en pacientes japoneses, israelíes y chinos, es DRBV0405. Otras especificidades HLADR también se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociación con AR en pacientes caucásicos, japoneses, españoles, griegos e israelíes: DR3
CAPITULO 41
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
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Tabla 41-3 Ejemplos de asociación entre HLA y enfermedad' Enfermedad Enlermedad de Behcet Enfermedad celiaca
Etnia Japoneses Chinos Caucásicos británicos
Caucásicos italianos
Antígeno HLA B51 B51 DRB1-0301 DQB1*0201 DQAV0501 DRB 1-0301 DQB1*0201
Caucásicos checos
Enfermedad de Graves
Caucásicos germanos Japoneses Caucásicos sardos Chinos de Singapur
Tiroidilis de Hashimoto
Caucásicos húngaros
infección VIH
Caucásicos canadienses Caucásicos británicos Caucásicos europeos
Progresor rápido"
Progresor lento Enfermedad de Hodgkin Nefropatia membranosa idiopatica
Caucásicos (Europa/América) Caucásicos británicos
Japoneses
Síndrome nelrótico idiopatico
Caucásicos franceses Caucásicos germanos
Esclerosis múltiple
Caucásicos franceses Caucásicos europeos
Narcolepsia
Japoneses
Caucásicos canadienses
Artritis reumatoide
Caucásicos franceses
Indios asiáticos Chinos Japoneses
79 3.4 26.7 51 8 139 6.9 368
DQ Al'0501 10.9 DRB 1 "0701 4 DQA1-0201 67 DRB t '0301 12.2 11 DOAt-0501 DRB1-0701 3.1 DQA 1-0201 2.9 DR3. B8. Cw7 3.?-5.5 DOAt'0102 9.2 A2 2.9 DPB1-0501 5.3 DRBT1601 2,3 DRB 1 -0301 3,5 DR5? 7,3 DR52 3.4 DR53 4.1 DOA1-0301/0302 DQBV0201 3.6 DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301 9.7 Cw7 1.5 DQB 1 '0601 2,2 B7 3,4 B35 2.5 Cw7 2,1 DQB 1-0605 9,2 DPB 1'0301 1,95 DRB3-0101 5.5 DRB 1 "0301 9.8 DQB 1-0201 21.6 DQA 1'0501 6.7 DRB1M501 14,2 DQB 1-0602 16,8 DQAV0102 7,1 DR7 6,4 5,3 DQA 1-0201 DR7 2,8 DQA 1-0201 3.3 DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010? 3.0 Uno de DQAr010?/0103 o 0501 mas uno de DQB1 0602/ 13.0 0603/0604/0302/ o 0303 DRB T1501 1 030 DRB5-0101 1 263 DR15 384 DQB 1 '0602 1 468 DQAT0102 537 DRBV1501 93.5 DR15 13.2 DQB 1-0602 85.4 DQA 1-010? 28.6 DRB 1'01 3,5 DRB t-0401 4,1 DRB1'0404 107 DR1 34 DRBI-IOOt 3.8 DR1 6.8 FB-FS 3.1 3.6 DRB 1-0405
'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3] tienen un d( (Véase Stool CM. Ludían CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3 as a risk for HIV re Datos extraídos de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 1991 Proceedings of the 11'" Inter 1992
en kuwaitíes; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen pacientes españoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro de diferentes asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la secuencia de un péptido DRB1 compartido está involucrada en conceder
Riesgo relativo
ledad mas rapido t 1988: 1:1185). id Conference New York. Oxford University Press,
susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuencia de aminoácidos muy bien conservada en su tercera región hipervariable (aminoácidos 70 a 74). Estos residuos podrían afectar a la unión de péptídos y a su presentación a las células T. Así. sí existe un péptido artri-
958
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
togénico. puede unirse preferentemente a moléculas con la secuencia DRB1 de la AR. Por el momento, no se ha identificado tal péplido. Una explicación alternativa puede involucrar un mimetismo molecular entre el DRB1 de la AR compartido y secuencias antigénicas de un patógeno que pueda inducir AR. Se ha encontrado una homología de secuencia entre la secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia Coli. Varios artículos han demostrado una relación entre la gravedad de la AR y la frecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha detectado que los pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolución grave de la enfermedad, y los pacientes homocigóticos HLA-DR4 tienen más probabilidad de sufrir una AR mas grave. También es posible que la producción de factor reumatoide esté asociada con DR4 El riesgo asociado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o DRBV10. La AR se diferencia clínicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ). En contraste con la asociación con DR4 en la artritis reumatoide. las asociaciones HLA con ARJ son bastante diferentes. Además, otras asociaciones HLADR varían con los subgrupos clínicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo, se ha descrito que el haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402 está aumentado en todo el grupo pauciarticular y en pacientes con la forma persistente pauciarticular. El haplotipo HLA-DRBV1301. DRB3'0101. DOA1 '0103. DQB1 '0603 también se asoció con pacientes con ARJ pauciarticular persistente (Fernández-Vina, 1994). Otras especificidades asociadas con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ pauciarticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con: DRBI'01. DRBV0801. DRBV1401. DQBV0501, DQBV0503. DQAV0101 y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con iritis crónica muestra una fuerte asociación con DRBV1104. DR8y DR6. Además de las asociaciones Clase II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacientes con ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo después de los ocho años tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En pacientes con ARJ poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y DPBI'0301 han mostrado asociación con la enfermedad. Teniendo en cuenta que la forma poliarticular de ARJ es un caso de AR en la juventud, el DRBV0401 muestra una fuerte asociación. En caucásicos, los dos haplotipos extendidos suponen más del 60% de los haplotipos en pacientes con enteropatía sensible al gluten (ESG) (Goggins, 1994; Marsh, 1992): [HLA-B8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De manera análoga a la diabetes, existe un aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLADR3 como DR7 están en desequilibrio de ligamiento con HLA-DQ2 (DQBV0201. DQAV0501). Esta combinación de genes DQB y DQA se encuentra en el 98% de los pacientes con enfermedad celíaca (EC). El péptido gliadina, que previamente se ha visto que exacerba la lesión EC in vitro e ¡n vivo, parece que se unía a DQ2, aportando más credibilidad a su posible papel en la patogénesis de EC (Shidrawi, 1998). Este hallazgo sugiere que HLA-DQ2 podría presentar al péptido gliadma a las células T para su reconocimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la posibilidad de la existencia de alelos específicos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01 y DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa. El aumento en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica que el haplotipo extendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a través de DP en EGS. Los determinantes de susceptibilidad DP y DQ comparten un residuo cargado positivamente alrededor del codón 71 de la cadena-(5. pero su papel específico aún no está claro. Otro marcador MHC recientemente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP70-2. que se conoce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportadores de HLADR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten algunos rasgos clínicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han aumentado la frecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a ESG. Sin embargo, comparando el halotipo. es evidente que las dos alteraciones son diferentes: los genes de susceptibilidad para ESG están dentro o cerca de la región HLA-DR/DQ. mientras que los de DH parecen estar entre el complemento y la región HLA-DR/DQ. más cercanos a la región del complemento (Ahmed. 1993a). El pénligo vulgar (PV) se ha asociado a dos tipos de haplotipos HLADR4. DQ8 entre los pacientes judíos [HLA-B38. SC31. DR4. DQ8] y [HLA635, SC31. DR4. DQ8] y un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.
DR6. DQ5] en pacientes no judíos. Estos hallazgos indican que dos mutaciones dieron origen a genes de susceptibilidad MHC para el pénfigo vulgar. Uno, quizá el más antiguo, surgió en un precursor de [HLA-B38/35. SC2I/31. DR4. DQ8] en una población judia y se difundió a poblaciones no judías. El otro, más reciente, parece haber surgido sobre [HLA-B55. SB45. DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundió a otras poblaciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantícuerpos PV (desmogleina 3) ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404, DQB1 '0503. DQA V0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de los parientes de los pacientes con PV que comparten los haplotipos de susceptibilidad tienen bajos niveles de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad parece producirse en individuos susceptibles con bajos niveles de anticuerpo cuando un segundo factor, genético o ambiental, induce niveles altos, suficiente para producir vesículas (Ahmed, 1993b). La evidencia que establece un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios que muestran que un péptido de 15 residuos, idéntico a un segmento de la desmogleina 3. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995). En el penfigoide cicatricial (PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han asociado con la forma ocular de la enfermedad (Ahmed, 1991). La forma oral de PC también está asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996). Estos resultados indican que DQBV0301 es un marcador común para ambas formas, oral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola enfermedad. Los análisis de la secuencia de aminoácidos presentes en los alelos DQB1 en los pacientes con formas ocular y oral de PC mostraron que comparten residuos comunes en las posiciones 57 y de la 71 a la 77, y es posible que puedan ser también marcadores para esta enfermedad (Yunis, 1994). El MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas En la malaria, ambas moléculas HLA clase I y clase II se han asociado con la prolección de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un alelo especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clínica progresiva (Goldfeld, 1998) Esta asociación es particularmente intrigante, ya que el alelo DQBV0503 codifica un cambio en la posición 57 del aminoácido de la cadena [i (|i57), que afecta a la carga existente en el bolsillo de la unión al péptido putativo. P9. de la molécula DQ. Se sabe que este bolsillo contiene residuos hidrofóbicos. El alelo DOS V0503 codifica el ácido aspártico negativamente cargado en |557 en lugar del aminoácido valina más común, sin carga e hidrofóbico Es posible que la presentación de péptidos restringida a MHC por los macrófagos infectados de tuberculosis esté afectada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en particular. El bolsillo de unión a P9 cargado negativamente puede unirse a antigenos de tuberculosis con menos efectividad o puede obtener una respuesta inmunogénica disminuida. HLA-DRBV0901 esta más representado en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparación con pacientes TB anérgicos. DfíBJ '0901 es el único alelo que codifica un cambio en la posición 9 del aminoácido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el bolsillo de unión al péptido putativo. P9. de la molécula DR El alelo DRBV0901 codifica el aminoácido lisina cargado positivamente en (59 en lugar del ácido glutámico más común y cargado negativamente Es posible que la respuesta restringida a MHC a los péptidos PPD esté aumentada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El bolsillo de unión a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con más eficacia o puede obtener una respuesta inmunogénica aumentada Los antígenos HLA-B. B-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) (Kaslow. 1996) Las moléculas HLA-B pueden ser clasificadas por la presencia de un epitopo molecular Bw4 o Bw6 o especificidad pública, que está definida por los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hélice a, (Salter, 1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresión de la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en ausencia de terapia antiviral con fármacos, está significativamente asociada con la homocigosidad para alelos HLA-B que comparten el epítopo HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comunicación personal). Estos datos sugieren que los péptidos que se unen a los alelos HLA-Bw4 pueden mostrarse útiles en el desarrollo de vacunas basadas en péptidos. Los polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enfermedades. Se han estudiado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD
satélites en relación con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El polimorfismo en la región promotora TNF-ot, localizada en el nucleótido -308 afín al lugar de comienzo de la transcripción, se relacionó con una aumentada susceptibilidad a la malaria cerebral (McGuire, 1994), espondilitis anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad por choque séptico (Mira, 1999) y leishmaniasis mucoculánea (Cabrera, 1995). Los microsatélites del TNF d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuencias más altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por clozapma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatélites se han asociado con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistémico (Sturfelt. 1996).
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENÉTICOS Polimorfismo genético El polimorfismo genético se define como la existencia en la misma población de dos o más alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importante. La frecuencia se ha determinado de forma arbitraria como mayor que el 1%. Hay dos grupos de polimorfismo genético; equilibrado o estable y transitorio. Un polimorfismo equilibrado se produce cuando dos o más alelos se mantienen en una población por selección. La ventaja heterocigótica es el clásico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfismo transitorio representa una fase de cambios alélicos conducida por deriva genética o por selección. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una población y transitorio en otra, dependiendo del efecto de la selección.
959
Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia usando la fórmula: ¡7 = i-v7
Fuerza de la asociación Se han ideado varios métodos para detectar el grado de asociación de los marcadores genéticos con los hipotéticos genes para la susceptibilidad a la enfermedad. Uno es calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que transportan un alelo especifico de un sistema polimórfico. En este cálculo, el riesgo relativo (RR) o relación de probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de transportar un marcador en una población de individuos enfermos comparado con una población control. Más interesante, pero más dificil de estimar, es el riesgo de tener una enfermedad en un individuo que transporta el marcador (Tabla 41-5, véase también Tabla 41-3). Esta fuerza de asociación es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard. 1983), que es lo mismo que la fracción etiológica (FE) (Miettinen. 1976). Si. en una población de pacientes, individuos a transportan el carácter especifico pero individuos ó no y. en la población normal (control), individuos c transportan el carácter, la información puede ser escrita convenientemente en la tabla 2x2:
Paciente Control
Carácter positivo
Carácter negativo
a c
b d
La frecuencia del carácter en esta población de pacientes (l\) es
Para determinar el polimorfismo genético es necesario encontrar una muestra representativa de la población, valorar los individuos, contar los genes y estimar el número de genes contenidos en la población total. Por ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una población de 100 individuos para un rasgo genético particular o alelo en un determinado gen, se puede definir la frecuencia de fenotipo como el número de individuos que transportan el rasgo o la variante genética. Para calcular la frecuencia (/) de cada alelo, se suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el número total de alelos analizados:
f(x)+t(
Tabla 41-4
HLA-DR
3 2 7 4 7
5 i •;
•i 2 3
Constelación de g e n e s TNF en relación c o n haplotipos e x t e n d i d o s c o m u n e s
C4B
Complotipo C4A BF
1 1 1
0 3
s s
c
3 6 3 2 2 3 I 3
s s
1 1 1. 2 1 3 2 0
I
s
s s s s
I1
C2
c c c c c c c c c 0
c
HSP70 2 8.5 9 g 9 9 9 9 9 'i 9 8,h
1
C .A A M •••
A
e
3 3 3 3 3 3
A
•
A
3 1 3 3
A
A
C
Marcadores en el locus TNF d 862 -308 -856 I 3 3 3 4 3 4 3 4 3 4
2 1 1 1 l 1 1 1 1 l 1
1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1
1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1
u
b
2 11 7. 8 6. 7 2 S 2 10 2 10 1
3 4 4 5 5 5 1 4 1 A 5
HLA-B HLA-Cw
8 7 44 44 57 35 14 38 62 18 18
0701 070? 1601 0501 060? 0401 080? 1203 0304 1203 0501
hl numero de letras debajo de cada columna se refiere a una variante del alelo particular del complemento, proteína 70 del golpe de calor (HSP70). polimorfismo de microsatélite TNF o promotor TNF-« están asociados con las especificidades HLA como se reseña Véase texto para explicación En el caso de TNF-a -308 I y 2 representan las vanantes -307/G y 307/A. respectivamente El alelo TNF-a -856/C se resena como 1 y el alelo -856/T como 2 El alelo 862/C TNF-a se resena como 1 y el -862/A como 2 Dalos extraídos y modificados de Clavijo OP Delgado JC. Awdeh ZL y col Tissue Antigens 1998. 54 303.
960
SECCIÓN V
Tabla 41-5
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Riesgo relativo (RR)* para alelos M H C e n varias e n f e r m e d a d e s HLA-A
HLA-B
HLA-DR
BF
Enfermedad
Alelo
RR
Alelo
RR
Alelo
Diabetes melhtus tipo 1
A1
1.6
B8
2.5 2.5 2,5 0,2 3,5 8,0 3,0 2,3 2,3 1.9 4.9 3.5
DR3 DR4
4,5
DR2 DR2 DR3 DR3 DR3
0.1 4,2 17,0 2.2 4,4
B15 B18 B7
A3 A1 A1
Esclerosis múltiplo Enteropalía gluten Hepatitis crónica activa Glomerulonefritis membranosa idiopàtica Hemocromatosis idiopatica
1.8 i8 1,7
B7 B8 B8 B8
B18 A3 Al
4.8 2.0
B7
B14 B15
.
n
RR
Alelo
RR
BF'Fl
8
BF'Fl BF'Fl
16,0 2,0
•\:
DRw6
3.1 2.9
DR4
„ pacientes con marcador controles sin marcador
H n = —
x
pactonte9 sin marcador controles con marcador .
,
De manera similar, en riesgos disminuidos, para los cuales RR es menor de 1, se puede usar el factor de prevención (FP).
FP
0-RRK RR
(i-
Las fracciones FE y FP pueden variar entre 0 (no asociación) y 1.0 (máxima asociación) Aparte de facilitar estimaciones de tener un marcador si uno ya tiene la enfermedad, estos cálculos ignoran el modo de determinación genética de la enfermedad en cuestión, Esto es particularmente problemático para modos recesivos o más complicados en los cuales ambos haplótipos son importantes para determinar la enfermedad pero se da el mismo peso a los heterocigotos y homocigotos para un marcador dado (esto es, ambos son positivos para el marcador).
Análisis del modelo de herencia basado en parejas
proporción de individuos que son homocigotos para el marcador. La aplicación de este método al HLA-B27 y a la espondilitis anquilosante condujo, en terrenos estadísticos, a la desestimación de un mecanismo recesivo. Asi, se concluyó que la susceptibilidad a la espondilitis anquilosante es heredada como un rasgo dominante. De forma similar, el mismo método de análisis se aplicó a la distribución de BF'Fl entre 1.107 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (Raum. 1981). Para la herencia dominante, se pronosticaron 1,89 homocigotos y para la herencia recesiva 6.2. Se encontraron siete homocigotos BF'Fl. un resultado consistente sólo con la herencia recesiva. Otros modos de herencia que podrian ser desestimadas por estas observaciones incluyen la dominante simple, epistática (enfermedad resultante de la presencia de genes no alélicos) o superdominante (enfermedad con mayor penetrancia cuando dos alelos específicos están presentes que cuando se producen otras combinaciones, incluyendo homocigosidad para cada alelo específico). Aunque un modelo mixto con diferente penetrancia para homocigotos y heterocigotos no podría ser excluido completamente, otras consideraciones podrían hacer insatisfactorio a tal modelo.
de hermanos El análisis de la forma de herencia basado en pareas de hermanos se introdujo para ayudar a superar los problemas de penetrancia incompleta de los genes de la enfermedad y las variaciones en edad al comienzo (Penrose. 1935). El método se basa en la suposición de que si el HLA y/o los genes estrechamente ligados a HLA no influyen en el desarrollo de la enfermedad, entonces las parejas de hermanos afectados compartirán haplótipos HLA con una frecuencia normal: el 25% compartirán ambos haplótipos. el 50% compartirán uno y el 25% no compartirá ninguno. Así, se comparan distribuciones observadas y esperadas de haplótipos compartidos. Si los genes de susceptibilidad o sus marcadores estrechamente ligado son raros y totalmente penetrantes, en una enfermedad determinada recesivamente, la distribución de los hermanos que comparten 2.1 y ningún haplotipo seria 100, 0. 0. respectivamente. Para la determinación dominante, la relación sería 33, 66, 0. Lo que se observa en diabetes, por ejemplo (Rubinstem. 1977), es 60, 35, 5. más cercano a las predicciones recesivas que a las dominantes. Una vez que se ha establecido la forma de herencia, se pueden establecer la frecuencia y la penetrancia del gen de la enfermedad (Thomson, 1977).
Análisis del modelo de herencia basado en estudios de población Thomson y Bodmer (1977) han ideado un método de análisis de los datos de la población para marcadores estrechamente ligados a locus de susceptibilidad para enfermedades con penetrancia incompleta. En esencia, este método predice la proporción de homocigotos. heterocigotos y no portadores para el marcador ligado esperado en casos de herencia dominante o recesiva. La diferencia principal entre los dos modos de herencia se obtiene por la
Método de cálculo de probabilidades (Lod
Score
Method)
Este es un método estadístico de concordancia entre un locus marcador tal como en el MHC y un gen de susceptibilidad a una enfermedad (Sutton, 1980): (1) el valor Zes la relación de la máxima probabilidad de encontrar o no concordancia (P¡ F,/ 0]) en un valor de recombinación particular 0; y (2) el valor o (q) de frecuencia de recombinación, que es una medida de la distancia desde un locus determinado a un valor Z máximo. El cálculo de probabilidades expresa la probabilidad de que alelos en dos locus se separen juntos, en términos de la relación entre la frecuencia de recombinación observada con la pronosticada si concuerdan independientemente. Varios valores de (q) de 0 a 0.5 se sustituyen en la ecuación: P(F,/e) = 1/2 [& (i -or' + e-'ii - « ) ] Donde n = el número de niños en una familia determinada y r= el número de recombinantes. La probabilidad de obtener un estudio genealógico para un valor determinado de 0 (frecuencia de recombinación de 0 a 0,5) se expresa como la relación de P (FJ 0) en una familia en una fracción 0 (de 0 a 0,5) de recombinación dada a P (F./0.5) en la misma familia, asumiendo que ninguna recombinación pueda ser expresada como el cálculo de probabilidades (Z):
z - log
P(F,/0.5)
CAPÍTULO 41
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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
961
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En estudios de concordancia de HLA y enfermedad, los padres pueden tener genes de susceptibilidad impenetrantes dominantes o recesivos. Hay problemas básicos para usar el método de cálculo de probabilidades para detectar concordancias de genes parcialmente penetrantes, aparte de hermanos susceptibles impenetrantes. Si los genes de susceptibilidad son comunes, como parece ser en el caso de la diabetes tipo 1. por ejemplo, los cruzamientos aparentes de hermanos no idénticos podrían sugerir genes de susceptibilidad adicionales en un padre.
962
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
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C A P Í T U L O
42
Trastornos ¡nmunodeficitarios Charlotte Cunningham-Rundles, M.D., Ph.D.
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA
963
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO
964
Medidas enzimáticas
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL
964
Histología
Historia clínica y recuento sanguíneo inicial
Ensayos con células asesinas naturales
Inmunoglobulinas Rayos X y tomografía computarizada
Análisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares
Funciones pulmonares
Citocinas y receptores de citocinas
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL
967
Marcadores adicionales de superficie celular
Producción de anticuerpos
Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA
Subclases de IgG
Utilización de nuevos inmunógenos para valorar la producción de anticuerpos
Inmunidad de células T Valoración funcional de las células T
969
Genética molecular y diagnóstico prenatal
Análisis de leucocitos polimorfonucleares
RESUMEN
972
Evaluación del complemento
BIBLIOGRAFÍA
972
La resistencia a la infección es una particularidad necesaria de la salud. Las principales barreras a las infecciones son las barreras físicas naturales, la piel, la producción de moco en las superficies mucosas expuestas, y la función de las células ciliadas del tracto respiratorio, intestinal y genital que tienen tendencia a eliminar los microbios invasivos. Además de estas barreras, un importante número de funciones inmunitarias ejercen una continua vigilancia: estas funciones pueden ser no especificas no requiriendo ninguna sensibilización previa, y especificas, que requieren una previa exposición para sensibilizarse (Tabla 42-1). Las funciones inmunitarias están compuestas por un conjunto interrelacionado de células inmunitarias y funciones inmunitarias, siendo los principales elementos 1) los Imfocitos B produciendo anticuerpos, 2) los linfocitos T proporcionando funciones celulares, 3) el sistema (agocitario conteniendo leucocitos polimorfonucleares (PMN) y monocitos / macrofagos 4) el sistema complemento y 5) las células asesinas (células NK). La enfermedad por inmunodeficiencia primaria surge debido a anormalidades de uno o más componentes de este grupo interrelacionado de funciones. Estas enfermedades fueron originariamente consideradas como enfermedades bastante poco frecuentes, caracterizadas como enfermedades graves con un comienzo clínico en los primeros años de vida. Sin embargo, como en los últimos años se ha esclarecido el espectro de estos defectos, está claro que estas enfermedades son mucho más comunes de lo que originariamente se creía, y la manifestación clínica puede ser benigna. Lo más importante es que ahora está claro que estas enfermedades pueden ser diagnosticadas en niños mayores, en adolescentes y en adultos de todas las edades. La incidencia general de estas enfermedades de inmunodeficiencia se estima en aproximadamente 1 de cada 10.000, excluyendo la deficiencia selectiva de inmunoglobulina A (Ig A). Por razones desconocidas, mas de la mitad de los defectos inmunes descritos incluyen defectos en la producción de anticuerpos (Fig. 42-1). La Unión Internacional de Ciencias Inmunologías ha catalogado los defectos conocidos del sistema inmunitano.
que periódicamente se actualizan {Primary Inmunodeliciency Diseases. Report of an lUIS Scientific Committee, 1999). En la Tabla 42-2 se muestra un enfoque general de los principales síndromes inmunodeficitarios, clasificados por tipo.
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA El indicador clínico más frecuente de un defecto inmune es la aparición de "demasiadas infecciones". Esta es la principal manifestación en los bebés y niños con deficiencias inmunitarias y representa un reto significativo para el pediatra, ya que las infecciones son muy comunes en la infancia normal. Cuando las infecciones frecuentes y prolongadas se acompañan de retraso en el desarrollo o si aparecen infecciones poco habituales, debe realizarse una evaluación del sistema inmunitano. La confirmación de una enfermedad inmunodeficitaria en un hermano o pariente de primer grado debería implicar una valoración clínica cuidadosa y una investigación de laboratorio, incluso sin antecedentes de infecciones graves o inusuales. Aprovechando las características comunes de infección que aparecen en las enfermedades de inmunodeficiencia primaria, se han creado un grupo de signos de alarma para ayudar a la identificación de individuos que tienen más probabilidad de sufrir un defecto inmune (Tabla 42-3). Quizá los indicadores más importantes para emprender una evaluación del sistema inmunitario surgen al realizar una historia inicial cuidadosa. Junto con las señales de alarma reseñadas en la Tabla 42-3, el médico deberia preocuparse por elementos en la historia que son inusuales, como antecedentes de enfermedad autoinmune. adenopatía significativa, la necesidad en un adulto de realizar una miringotomia. herpes zóster grave, o herpes zóster que aparece en niños pequeños, etc. Estas manifestaciones adicionales pueden también indicar que deberia considerarse un defecto inmune (Tabla 42-4).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 42-1 Mecanismos de defensa del huésped No específicos Barreras (piel, secreciones, moco, lágrimas, saliva) Fagocitos (neutrofilos, macrófagos) Células asesinas naturales Complemento Citocmas Específicos Anticuerpos Funciones de células T
Por supuesto; no es práctico investigar todos los sistemas en todos los pacientes; sin embargo; el cuadro clínico y la edad del paciente indicarán al examinador qué parte del sistema inmunitario es con más probabilidad el causante. Por regla general, la elaboración de una historia cuidadosa y el examen físico completo puede reducir las posibilidades de problemas que implican principalmente a células T. células B, granulocitos o el sistema complemento. La Tabla 42-5 enumera los síntomas y signos clínicos y sus correlaciones con los elementos de defensa del huésped. En muchos casos el tipo concreto de ínfección(es) que el paciente ha padecido puede proporcionar un indicador útil sobre el defecto inmunitario más probable (Fig. 42-2). Si predominan las infecciones por bacterias encapsuladas, se debería investigar la célula B, el sistema de complemento o los sistemas fagocíticos: si hay predominio de infecciones fúngicas o víricas, puede estar defectuoso el sistema de las células T. Las infecciones recurrentes por Neisseria deberían alertar al médico sobre la posibilidad de una deficiencia genética de uno de los componentes del complemento. Las infecciones recurrentes por Candida, incluyendo las aftas orales, no suelen ser un problema alarmante si se han utilizado con frecuencia antibióticos. Sin embargo, la candidiasis oral adquiere una mayor importancia cuando es resistente a una terapia local sencilla y cuando persiste después de seis meses de edad. Las aftas orales no se consideran igual que la candidiasis mucocutánea, una enfermedad caracterizada por diseminación de la infección desde las membranas mucosas a la piel contigua incluyendo generalmente las uñas de los dedos. Estas lesiones cutáneas pueden presentarse de forma granulomatosa. La candidiasis mucocutánea siempre es anormal. También es importante observar las circunstancias clínicas y no fijarse exclusivamente en el número o la gravedad de los episodios infecciosos. Por ejemplo, cuando un proceso infeccioso afecta a la misma zona anatómica repetidamente, es más probable que la etiología sea estructural y no un defecto de una de las defensas del huésped. La osteomielitis crónica en una localización, o episodios recurrentes de neumonía que afectan sólo a un lóbulo pulmonar, o infecciones recurrentes de una herida quirúrgica son ejemplos de estas situaciones. Por razones desconocidas, las infecciones
recurrentes del tracto urinario no son características de deficiencia inmunitaria; el sistema inmune parece jugar un pequeño papel, si es que juega alguno, en la prevención de pielonefritis y cistitis.
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO Basados en las consideraciones previas, cuando se sospecha un defecto inmunitario hay que hacerse estas preguntas: qué parte del sistema inmunitario debería investigarse, qué pruebas se necesitan y hasta dónde deberían llevarse estas investigaciones. La evaluación del sistema inmune se lleva a cabo mejor por etapas, realizando primero las pruebas de delección básicas, hasta llegar a las pruebas más complejas, según el caso. En la Tabla 42-6 se ofrece una visión general de este abordaje por etapas.
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL Historia clínica y recuento sanguíneo inicial Aparte de realizar una historia inicial y exploración física, incluyendo medición de la altura y peso, la primera prueba inmune es el hemograma completo (CBC). Un recuento de glóbulos blancos (WBC) y diferencial proporcionará información sobre la morfología y número de linfocitos pequeños (diámetro<10um). Se espera que haya más de 1.200 linfocitos por milímetro cúbico. Puesto que menos (-10%) de los linfocitos son linfocitos B, una deficiencia absoluta de linfocitos indica sobre todo deficiencia de células T. Parte de la primera visita debe también incluir la obtención de todos los expedientes médicos anteriores, incluyendo informes patológicos o diapositivas, y resultados de cultivos previos y radiografías.
Inmunoglobulinas Como las enfermedades por deficiencia de anticuerpos son más comunes que otros defectos inmunes, se debe empezar investigando las inmunoglobulinas y producción de anticuerpos (Stiehm, 1996). Los análisis cuantitativos de inmunoglobulinas se encuentran disponibles en todos los laboratorios comerciales y hospitalarios, y para realizarse necesitan de muy poco suero (véanse Capítulos 13 y 35). Como los valores de inmunoglobulinas aumentan con la edad, es necesario para la correcta interpretación que se compare con controles de edad (véase Tabla 37-7). Durante los primeros meses, la IgG de origen materno es la principal inmunoglobulina presente en el suero del niño. El punto más bajo se ve aproximadamente a los tres meses. Sin embargo el niño puede sintetizar IgA e IgM: asi. la presencia de estas dos inmunoglobulinas (partícularmenle la IgM, que se sintetiza antes que la IgA) es una evidencia
Figura 42-1. Clasificando los defectos inmunes de una amplia población de pacientes remitidos para análisis inmunológicos y tratamiento, casi un 50% de todos ellos presentaban defectos en la producción de anticuerpos, incluyendo mmunodeficiencia variable común, deficiencia selectiva de IgA, deficiencia de la subclase IgG, nipogammaglobulinemia transiloria del niño y agammaglobulinemia ligada al cromosoma X. Dalos tomados del Mount Sinai Medical Center, Immunodeficiency Clinic.
CAPÍTULO 42
Tabla 42-2
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TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
965
Clasificación d e las inmunodeficiencias primarias' Enfermedad
Deficiencia combinada de células B y células T Disgenesia relicular Inmunodeficiencia severa combinada (IDSC)
Síndrome hiper IgM
Ataxia-telangiectasia Timoma Síndrome Wiskott-Aldrich Deficiencia primaria de célula T Anomalia de DiGeorge
Síndrome de Nezelof Deficiencia de inosina fosforilasa (PNP) Ausencia de expresión de CD3 Candidiasis mucocutánea crónica Deficiencia primaria de células B Agammaglobulinemia congenita ligada al sexo (Bruton) Defecto de p-cadena, cadena sustituida lig. etc. Hipogammagiobulinemia transitoria de infancia Síndrome hiper IgM
Deficiencia selectiva de IgA Deficiencia selectiva de IgM Inmunodelicioncia común variable Deficiencia do subclase de IgG Defectos de complemento Deficiencia de complemento Defectos estructurales Dismotilidad de cilios Defectos de origen desconocido Síndrome hiper IgE Candidiasis mucocutánea crónica
Comentarios
Hipoplasia hematopoyetica generalizada Incluye: (1) La ligada al cromosoma X debido a un defecto en la cadena del receptor IL-2. (2) herencia autosómica recesiva de naturaleza desconocida: (3) causada por deficiencia de adenosma deammasa (ADA); (4) causada por enzima recombinasa (RAG 1.2) delecluosa, (5) Síndrome de Omenn, en muchos casos debido a la mutación en el enzima RAG: (6) asociada con defectos óseos (hipoplasia cartilago-pelo. enanismo de miembros cortos); (7) síndrome del linfocito desnudo, baja expresión de la histocompalibilidad de los antigenos HLA clase II; (8) causada por un defecto en la cinasa JAK; (9) causada por un defecto en el receptor IL-7. (10) causada por un delecto en el enzima ZAP-70 de las células T IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40. el receptor de células B responsable del cambio del isotipo; neumonía por Pneumocystis, a menudo coiangitis asociada con neutropenia cíclica, alta incidencia de esclerosis, normalmente no se ve en las enfermedades de las células B frecuente Deficiencia común de IgE lgG2 y/o IgA: alta incidencia de malignidad linforrelicular defecto de la reparación del cromosoma Detecto en células T variable; hipogammagiobulinemia en algunos Trombocitopenia (plaquetas pequeñas); no respuesta a anticuerpos de carbohidratos: eczema: herencia ligada al cromosoma x alta incidencia de malignidad linforeticular, células CD43+ no detectadas Facies características: lesiones cardíacas (lo más tipico arco aórtico interrumpido); hipoparatiroidismo; la deficiencia en células T puede ser lo suficientemente grave como para ir asociada con deficiencia de anticuerpos, el defecto inmune por lo general mejora espontáneamente: el limo está ausente en su forma completa, casi siempre fracaso del declive normal Se produce inmunoglobulina, pero la respuesta al anticuerpo específico está marcadamente deteriorada; delecto timico no caracterizado A menudo asociado con aplasia de glóbulos rojos primaria Las células T presentan pero no expresan CD3, necesario para la función del receplor de las células T Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endoermopatias. con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos Ausencia de células B Clínicamente se presenta en el primer año de vida, varones para la forma ligada al cromosoma X y varones y hembras para las otras Aparece a los 2-4 meses de edad: dificultad para diferenciarlo del nadir normal de IgG que se produce durante ese periodo IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40, el receptor de células B responsable de la mutación del isotipo; la neumonía por PiieumcKystis, no observada normalmente en las enfermedades de células B. es frecuente: a menudo asociada con neutropenia cíclica lgA<10mg/dl: IgG normal a aumentada; alrededor del 12% con deficiencia de lgG2. deficiencia selectiva de IgA; la deficiencia más común (1/500 de los caucásicos): asociado con herencia de antigenos de histocompatibilidad Bastante rara asociada a infecciones por Neisseha Importante defecto de anticuerpos células B presentes: puede presentarse deficiencia de células T y aumentar con el tiempo Dobido a la supresión de los genes de las cadenas pesadas do IgG. o producción deficiente de isolipos de IgG seleccionados; asintomálica o asociada con infecciones, si la producción de anticuerpos esta deteriorada Puede imitar síndromes de deficiencia de anticuerpos: deficiencias de C3 clínicamente similares a panhipogammaglobulinemia; deficiencias de componentes de complemento, particularmente C6-C9, tienen inlecciones recurrentes con especies de Neissena Imita a los síndromes de de crónicas con bronquéela
encía de anticuerpos; otitis recurrentes e infecciones pulmonares característica
Sindrome de Job-Buckley (hiper-lgE); abscesos en piel y órganos, anormalidades óseas. anormalidades dentales Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endocrinopalías, con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos
Otros defectos Deficiencia molecular de adhesión a la célula Imita algo a los síndromes de deficiencias de anticuerpos: separación retrasada del cordón (LFA-1/Mac-1) umbilical: respuesta inflamatoria pobre periodontitis. episodios sépticos recurrentes • Para mSs delates vGase el articulo IUIS Primary Inmunodeliciency Diseases Report of an IUIS Scientific Committee. Clin Exp Immunol 1999: 17 311-321. con perrraso
convincente de que no existe panhipogammaglobulinemia. La panhipogam- dades significativas hasta la edad de seis meses; si embargo, después de la maglobulinemia es la forma habitual de presentación de la agammaglobulme- edad de un año. un nivel de IgA de 10 mg/dl o menos indica que la deficienmia ligada al cromosoma X. La IgA habitualmente no se encuentra en canti- cía de Ig A será un defecto permanente (Plebani. 1986). En el sindrome hiper-
966 Tabla 42-3
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Diez signos de alerta d e inmunodeficiencia*
Dos o más episodios de neumonía Pérdida inexplicable de peso en adultos, fallo en el desarrollo en lactantes Abscesos recurrentes en órganos profundos o piel Uno o más episodios de infecciones senas tales como meningitis. sepsis, celulitis u osteomielitis Historia familiar de deficiencia inmunitaria Infecciones recurrentes de oídos, necesidad de sondas en adultos Candidiasis orales o cutáneas después de la edad de un año Dos o más meses con antibióticos orales con poco efecto Necesidad de antibióticos intravenosos para curar infecciones Dos o más infecciones de sinus en un año 'Dos o mas pueden indicar inmunodeficiencia.
inmunoglobulina M. se han visto niveles normales o elevados de IgM con ausencia de IgA (Ramesh, 1998; Levy 1997). En general, las desviaciones de otros ¡sotipos de inmunoglobulinas no se diagnostican como síndromes específicos. Sin embargo, los aumentos marcados de IgE forman casi siempre parte del síndrome de hiperinmunoglobulina E (Buckley, 1978), son comunes en el síndrome de Wiskott-Aldrich, algunas deficiencias de células T aisladas y se pueden encontrar en enfermedades crónicas granulomatosas. El síndrome de Wiskott-Aldrich característicamente muestra también un marcado aumento de IgA en suero con bajo IgM (Ochs, 1998).
Radiografías y tomografía computarizada Las radiografías y la tomografía computarizada (TC) y los estudios de resonancia magnética (RM) también pueden ser útiles para valorar las deficiencias inmunitarias. La neumonía crónica intersticial es frecuente en bebés, niños o adultos con deficiencias en células T, y debería confirmarse con radiografías de tórax. Con el tiempo, muchos pacientes con deficiencia primaria de células B (agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable común) pueden desarrollar fibrosis pulmonar crónica o bronquiectasias (Sweínberg, 1991; Cunningham-Rundles, 1999). La tomografía computarizada de tórax en un paciente que presenta infecciones recurrentes del tracto respiratorio es la mejor prueba para investigar una bronquiectasias; si estos cambios se han desarrollado, se necesita seguir investigando. Antes se realizaban proyecciones laterales del cuello para objetivar el tejido linfoide faríngeo en niños. Sin embargo, no se recomiendan las radiografías para la evaluación de tejido linfoide cervical porque la información que éstas proporcionan se obtiene más fácilmente por otros métodos alternativos. Las proyecciones anteriores del tórax pueden revelar una ausencia de la sombra timica en niños pequeños, pero como el timo puede disminuir fácilmente debido al estrés, la evaluación del tamaño del timo por este método no es fidedigna. Las anormalidades óseas, sin embargo, pueden alertar al radiólogo de un problema inmunológico presente en la infancia. Un subgrupo de pacientes con inmunodeficiencias que implican anormalidades de células T o B y T, sufren enanismo de extremidades cortas. Estos pacientes muestran lesiones características, generalmente en las regiones metafisarias de los huesos largos. Los pacientes con deficiencia de adenosina deaminasa muestran biselado de los extremos costales, cuadratura de los omóplatos y articulaciones inusuales de las apófisis transversales costales (Cederbaum, 1976).
Tabla 42-4
Hallazgos clínicos q u e sugieren u n a inmunodeficiencia de defecto o localización inciertos
Defectos en el desarrollo Eczema intratable Dermatitis seborreica generalizada (inmunodeficiencia grave combinada) Adenopatia, esplenomegalia Colitis ulcerosa manifestada antes del primer año de vida Diarrea intratable Enfermedad autoinmune (son habituales PTI o anemia hemolitica) Deficiencia hematológica inexplicable (de cualquier serie: eritrocitos, neutrólilos, plaquetas) PTI = púrpura trombocitopenica inmune.
Tabla 42-5
Síntomas clínicos d e deficiencia correlacionados c o n el tipo de defecto
Se piensa en una deficiencia de células T cuando 1. Vacunas de virus vivos o bacterias atenuadas producen enfermedades sistémicas o resultados inesperados (p ej., viruela generalizada, neumonía de células gigantes con rubéola, infección generalizada por Mycobacterium) 2. Un virus habitualmenie benigno ocasiona una infección contundente (a menudo neumonía) como varicela o citomegalovirus. 3. Candida oral no responde a la quimioterapia, no va asociada a la dermatitis de pañal o anlibioterapia excesiva, o persiste después de seis meses de evolución. 4. Candida está presente en superficies mucosas y se traslada a áreas cutáneas contiguas a modo de candidiasis mucocutánea. 5 El paciente sufre enanismo de miembros cortos (El pelo puede ser muy fino y tejidos laxos con hiperexlensibilidad de articulaciones y gran hernia umbilical) 6. Hay signos de enfermedad intrauterina de injerto contra huésped (p. ej. descamación, eritrodermia, alopecia, defectos en el desarrollo). 7. Enfermedad de injerto contra huésped se produce tras la infusión de un hemoderivado 8. Se produce tetania neonatal. (Buscar mandíbula hipoplásica. surco nasolabial corto, orejas de implantación baja con el pabellón corto, hipertelonsmo de anomalía de DiGeorge.) 9. Lintocitos pequeños (< 10 en diámetro) con recuento permanentemente menor de 1 200/mm . 10. Infecciones debidas a organismos oportunistas o se produce un sarcoma de Kaposi generalizado Buscar factores de riesgo asociados con sida. Se piensa en una deficiencia de células B cuando 1. Infecciones recurrentes con piógenos exlracelulares, Streptococcus, Staphylococcus. Haemophilus. 2. Hiperplasia linfoide nodular de intestino es persistente 3 Infección intestinal por Giardia j Se piensa en un defecto combinado de células T y B cuando 1 Hay signos del síndrome de Wiskot-Aldnch (supuración de oídos, trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, eczema en el varón). 2 Hay signos de ataxia-telangiectasia (La ataxia es el principal signo de la enfermedad, especialmente cuando el niño crece Una característica predominante es la telangiectasia de la esclerótica y los oídos. La expresión facial es triste.) 3 Los síntomas antes mencionados de las enfermedades de células T y B se producen juntos. Se piensa en un defecto bioquímico cuando 1. Hay síntomas de defectos combinados T y B con cambios característicos en las radiografías en costillas, omoplatos, vértebras (deficiencia de adenosina deaminasa). 2. Hay aplasia medular primaria de glóbulos rojos y otros sintomas del síndrome Blackfan-Diamond (deficiencia de nucleósidofosforilasa). Se piensa en un defecto de leucocitos cuando 1. Hay abscesos estalilocócicos de piel recurrentes y graves; se pueden observar abscesos prolundos de órganos internos, pero menos habitualmente (síndrome hiperlgE o síndrome de Buckley-Job). Más adelante aparecen abscesos en pulmón en casi todos los pacientes con síndrome hiperlgE 2. Osteomielitis crónica o recurrente, nodulos linfáticos que supuran, particularmente cuando son causados por especies de Klebsiella o Serraba (enfermedad crónica granulomatosa). Se piensa en una inmunodeficiencia secundaria cuando 1 Hay una infección viral concomitante o anterior (especialmente virus de Epstein-Barr. VIH). La infección viral puede producirse en el útero y producir una enfermedad inmunodeficitaria en el feto. 2. El paciente tiene determinadas enfermedades malignas (p. ej.. leucemia linlocítica crónica, enfermedad de Hodgking. mieloma múltiple). 3 Se produce acidosis, alopecia y convulsiones con candidiasis mucocutánea crónica (deficiencia de botina) Deficiencias de biolina, zinc y selenio pueden producirse en pacientes con prolongada hiperalimentación. 3
4. El paciente está recibiendo inmunosupresores. 5. El paciente tiene una historia consecuente con posible exposición a VIH. 6. El paciente tiene los sintomas clínicos de acrodermatitis enteropática (deficiencia de zinc puede también ocurrir con hiperalimentación prolongada). I VIH = Virus de inmunodeficiencia humana
CAPITULO 42
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TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
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Subclases de IgG La IgG consta de cuatro subclases, de la IgGl a la lgG4. que se distinguen por diferencias tanto estructurales como biológicas (véase Tabla 30-4 y Tabla 42-7) (Normansell, 1987; Schur, 1987). Aunque no se ha establecido el papel individual de cada una de las subclases de la IgG para diferenciarse del resto, los anticuerpos a los antigenos de los carbohidratos se concentran en la subclase lgG2, y muchos antígenos de las paredes de las células bacterianas tienen naturaleza de carbohidrato (Scott, 1988). Asi. la ausencia de respuesta a lgG2 podría traducirse en un defecto para desarrollar protección (rente a infecciones bacterianas. Esta relación es más convincente en el paciente ocasional con deficiencia de IgA que también tiene deficiencia de la subclase lgG2 y que no responde con anticuerpos ante una vacuna como la del neumococo. En aquellos pacientes con deficiencia de IgA e lgG2, las pruebas de función pulmonar pueden ser significativamente anormales comparadas con aquellos sólo con deficiencia de IgA (Bjorkander, 1985). Una deficiencia en la subclase IgG también se ha señalado como causa de infecciones recurrentes en pacientes con niveles normales o casi normales de IgG (Oxelius. 1979: Shackelford. 1990: Wedgwood, 1986: Gross, 1992; Popa. 1994).
Figura 42-2. El espectro de agentes infecciosos encontrado puede indicar el sistema mmunitario donde se encuentra el potencial detecto.
Pueden aparecer anormalidades óseas en pacientes con el síndrome de hiperinmunoglobulina IgE: estas anormalidades incluyen osteoporosis generalizada, fracturas ante un mínimo traumatismo, craniosinostosis y defectos en huesos de la línea media (Grimbacher, 1999).
Funciones pulmonares La inmunodeficiencia. especialmente si ha persistido durante algún tiempo, a menudo afecta a las funciones pulmonares, a todos los volúmenes pulmonares, debiendo evaluarse los volúmenes espiratorios forzados, incluso si la radiografía de tórax es normal. Los pacientes con defectos de células B y T son propensos a infecciones pulmonares, que terminan en broncoespasmo, enfermedad restrictiva u obstructiva, o combinaciones de estas anormalidades.
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL Producción de anticuerpos Para reconocer el significado clínico de los niveles algo reducidos de mmunoglobulina en suero, se miden las respuestas especificas de los anticuerpos a antígenos previamente administrados o que ya existen. Si el niño o el adulto recibieron previamente las inmunizaciones habituales, pueden cuantificarse los títulos de anticuerpos para los antígenos de esas vacunas. Si el niño no ha sido inmunizado o para los adultos donde ha transcurrido más tiempo desde la vacunación, se debe producir una respuesta tras la administración de la vacuna de recuerdo (Moen, 1986)). Las mejores respuestas a vacunas suceden con el tétanos, difteria, haemophilus y neumococos; muchos laboratorios comerciales han desarrollado pruebas de sensibilidad que pueden utilizarse para calcular la producción de anticuerpos. Lo que no está tan claro es cómo interpretar cada respuesta; en general un aumento de dos a tres veces o más por encima de los niveles de referencia, y la existencia de niveles protectores de anticuerpos, significa una adecuada respuesta a estas vacunas. Es importante recalcar que no deben administrarse vacunas de virus vivos a los niños, o a cualquier miembro de la lamilia si se cuestiona el estado inmunológico. Las vacunas del sarampión, paperas, rubéola, polio, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y varicela no pueden ser usadas en esta población. Si el paciente no tiene el grupo sanguíneo AB, se pueden determinar los niveles de las isohemaglutininas A o B que convengan (Parker, 1997). Sin embargo, debido a la relativa inmadurez, o quizá a la inadecuada exposición a edades menores de dos o tres años, las isohemaglutininas pueden ser negativas o de títulos baios en niños pequeños, incluso en aquellos que tienen la inmunidad normal.
A pesar de estos indicadores, la importancia biológica de la deficiencia de la subclase IgG no está clara. De hecho, algunos individuos que carecen totalmente de genes para lgG2 IgA e IgE. están sanos (Lefranc. 1982: Migone, 1984). Además, los anticuerpos anticarbohidrato lgG2 no son la única fuente de protección de anticuerpos para estos antigenos. En realidad, una deficiencia significativa de anticuerpos, limitada a reacciones frente a antigenos de carbohidratos, o más defectos globales, se pueden encontrar en niños o adultos con niveles normales de inmunoglobulina total en suero (Ambrosmo. 1988). La IgGl es el primer tipo de subclase de respuesta frente a antígenos de carbohidratos, produciéndose una conversión a respuesta lgG2 a medida
Tabla 42-6 Niveles de pruebas inmunológicas Nivel*
Medida
Primer nivel
Historia y exploración física CBC y diferencial Número de linfocitos (mortologia de linfocitos) Niveles cuantitativos do inmunoglobulina Radiografías Cultivos Funciones pulmonares | Segundo nivel Respuestas a anticuerpos específicos Análisis de subclase IgG Prueba de complemento Pruebas cutáneas de hipersensibihdad retardada Análisis de marcadores de superficie de linfocitos Estudios de proliferación de células mononucleares (usando células mitogémeas. alogénicas y estimulación de antigenos) Reducción de neutrófilos con tinción (equivalente al citómetro de flujo NBT) Tercer nivel Medidas de enzimas (adenosina deaminasa. PNP") Estudios de citotoxicidad de células NK Estudios de fagocitos (movilidad, glucoproteinas de superficie, bioquímica) Análisis de estructura e inmunohistológico de órganos linfoides Producción de citocínas Estudios complejos de complemento; defectos genéticos Nuevos antigenos a pruebas de producción de anticuerpos Biología molecular, delección de portadores. diagnostico prenatal " El nivel de medida se refiere a la localización clínica en la que se realiza y se interpreta la prueba Las pruebas de primer nivel se obtienen fácilmente en hospitales locales o en laboratorios comerciales El médico de primaria dobe ser capaz de interpretar estos valores. Las pruebas de segundo nivel se realizan si las condiciones clínicas lo justifican y algunas pueden necesilar médicos con formación especializada para determinados análisis Las pruebas de tercer nivel se realizan e interpretan en centros con un interés aelrvo de investigación en el tema. CBC • recuento completo de sangre NBT = nilroazul de tetrazolium; PNP = purina nucleósido fosforilasa; NK = células asesinas naluraies
SECCIÓN V
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Tabla 42-7
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
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Propiedades d e las inmunoglobulinas h u m a n a s IgM
IgG
IgA
IgD
A. Fisiológicas Concentración normal en adultos, mg/ml 1.2-4,0 8.0-16.0 0,4-2.2 0,03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <10O Porcentaje total de inmunoglobulina 13 80 6 1 0.002 Distribución intravascular, porcentaje 41 48 76 75 51 Ritmo de síntesis, mg/kg/dia 2,2 35 24 0,4 0.003 Ritmo de catabolismo en suero, 10.6 6 24 37 90 porcentaje/dia (o semivida. día) (5-6) (18-23) (5-6,5) (2.8) (2.3) B. Biológicas i ± Capacidad de aglulinación +4 Capacidad de fijación de complemento por la ruta clásica +4 + — — Hipersensibilidad homologa anafiláctica +4 — — Anafilaxis heteróloga de cobaya + ± Fijación a mastocitos y basófilos homólogos +4 Unión citofílica a macrótagos + — Transporte placentario al feto + — — Actividad de fijación al factor reumatoide + ± Presente en secreciones externas +4 +2 + Otras propiedades características: IgM Producida rápidamente en respuesta inmune, primera defensa electiva contra la bacteriemia IgG: Combate microorganismos y toxinas en fluidos extravasculares IgA Deliende las superficies externas del cuerpo IgD- Presente en superficie de linfocitos o células inmunocompetent.es, importante para la activación y/o mmunorregulación de células B ;
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que el individuo madura (Scott, 1988). No hay evidencia de que los que se limiten sólo a respuestas IgG 1 tengan ninguna desventaja. Es obligatorio determinar la importancia biológica de una deficiencia en la subclase IgG, probando con una producción específica de anticuerpos, generalmente mediante la administración de vacunas como tétanos, difteria, haemophilus y neumococo. Solamente se debería considerar que tienen un defecto de inmunidad significativo aquellos sujetos con una deficiencia clara de anticuerpos a un número de antígenos.
Inmunidad de células T El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha permitido la rápida enumeración de células T y subgrupos de células T, usando sólo una pequeña cantidad de sangre. Estos marcadores de anticuerpos se han clasificado, con la designación "CD". para "antígenos de diferenciación"("c/usfer ol differentiation"). lo que quiere decir que un grupo de anticuerpos monoclonales identifica una proteína característica determinada de un subgrupo de células mononucleares seleccionadas. La designación CD subdivide a las células T (como un grupo, CD3-*-) en dos principales subgrupos, CD4+, algunas veces llamadas células "colaboradoras", células involucradas en el inicio de las reacciones inmunes, secreción de citocinas y aumento de respuestas de células B, y células T CD8+. asociadas con funciones citolilicas (asesinas). Aunque estas actividades funcionales definen alguna de las actividades inmunológicas de las células T CD4+ y CD8+. ambas moléculas sirven como moléculas señalizadoras, que funcionan en unión con las principales clases I y II de histocompatibilidad de antigenos (MHC), y sirven para ampliar y estabilizar la unión del receptor de la célula T (TCR) con el antígeno. Las enfermedades con inmunodeficiencia que derivan de la generación defectuosa de células T pueden dar lugar a un número bajo o nulo de células T CD3+, produciendo un bajo número de células CD4+ y CD8+, o un número reducido de células CD4+ o CD8+. El síndrome de DiGeorge, por ejemplo, provoca un número bajo de células CD3+ en general (Hong, 1998); una deficiencia de la clase II MHC provoca un número bajo de células CD4+ (Klein,1993); y una anormalidad de la célula iniciadora, Zap-70. esencial a la actividad del receptor de las células T, provoca un número reducido de células T CD8+ (Eider. 1998). En general, si se sospecha un defecto inmunitario, se examina este panel de marcadores de células T y se determina el número absoluto de células en cada grupo, comparándolo con los controles normales de edad similar establecidos por el laboratorio.
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Valoración funcional de las células T Las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada se utilizan habitualmente como medidas de función de las células T. porque miden la capacidad de reconocer y de presentar el antigeno, movilizar las células T y generar una respuesta específica inflamatoria. Ya sean los números de células T normales, bajos o nulos, se debe comprobar la función de las células T si existe cualquier sospecha de existencia de un defecto celular de esta naturaleza. Sin embargo, el principal inconveniente cuando se realizan pruebas cutáneas en lactantes es que no han tenido suficiente exposición para responder a los antígenos (Kniker, 1985). Asi, en el momento en que la valoración de las células T es particularmente importante, estas pruebas son inservibles. Entre los tres y los cinco años de edad, las pruebas cutáneas adquieren más fiabilidad. Otro problema con las pruebas cutáneas es que el antígeno debe ser inyectado intradérmicamente con cuidado. Una idea más definitiva sobre la capacidad funcional de las células T se puede obtener mediante valoraciones funcionales. Junto con las pruebas cutáneas utilizadas como métodos de detección, para valorar la función de las células T se emplea habitualmente una respuesta proliferativa in vilro. Se emplean generalmente tres tipos diferentes de estimulo: mitógenos. antígenos y menos habitualmente, aloantígenos. Los mitógenos son inespecificos (generalmente extractos de plantas), y estimulan linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ independientemente de la especificidad de los antígenos. Los aloantígenos (antígenos presentes en las células que controlan el rechazo en los trasplantes de órganos o tejidos) también estimulan las células CD4+ y CD8+ de una forma relativamente inespecífica; en la práclica se pueden usar células mononucleares irradiadas de un individuo sin parentesco. Las respuestas proliferativas a estos estimuladores indican la presencia de células T, pero una respuesta no garantiza la capacidad de eliminar los agentes infecciosos del huésped. Los pacientes con deficiencias significativas de células T pueden presentar alguna respuesta mitógena o aloantígena. La prueba mejor relacionada con la capacidad a resistir infecciones es la de las respuestas proliferativas a antígenos específicos (Lañe, 1985). En el caso de antigenos específicos se usa habitualmente tétanos, difteria y candida. Se requiere una exposición suficiente al antígeno para una respuesta positiva; por consiguiente la proliferación ante estímulos antigénicos es poco habitual en niños durante el primer año de vida. Otra medida de respuestas específicas de células T, que puede incluso utilizarse en lactantes, es cultivar células mononucleares de sangre periférica con concentraciones mitogénicas del anticuerpo
CAPÍTULO 42
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TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
monoclonal anti CD3; este estimulador normalmente produce la proliferación de lodas las células T CD3+, mientras que la ausencia de proliferación demuestra un grave defecto de células T (Hong, 1996).
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zados de conejo; estas células son potentes activadores de la via alterna. Si alguno de los ensayos es anormal, la identificación del componente individual que es deficiente depende de pruebas inmunoquímicas o funcionales especializadas que sean específicas para cada componente, (véase Cap. 38).
Análisis de leucocitos polimorfonucleares La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es la principal enfermedad de leucocitos polimorfonucleares. Sus principales manifestaciones son adenopatia, neumonía, abscesos en el hígado o los nodulos linfáticos, y osteomielitis; la forma de herencia es ligada al sexo (la más habitual) o recesiva autosómica (debido a mutaciones que afectan a las posiciones de los cromosomas 16p24,7q11.23 o 1 q25). El principal defecto es el error metabólico que provoca el fracaso de la reacción metabólica que sigue a la ingestión fagocítica de las bacterias (Meischl. 1998). En consecuencia, no se reduce el oxigeno molecular a superóxido. No se produce el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno y se pierde un importante mecanismo intracelular de eliminación bacteriana (Babior, 1978). Este defecto se compensa parcialmente por organismos que producen peróxido de hidrógeno en el interior de las células. En la enfermedad crónica granulomatosa, los organismos productores de catalasa, que destruyen el peróxido de hidrógeno citoplásmico. sobreviven a la ingestión intracelular, se multiplican y causan una respuesta de tejido granulomatoso. El Staphylococcus aureus es el microorganismo involucrado más habitual. Las infecciones crónicas con Serratia, especies de Klebsiella, Pseudomonas (ahora Burkholderia) cepacia, y especies de Aspergitlus son particularmente molestas (Gallin. 1983. 1990). Ante una historia sugestiva, se debería considerar en la primera consulta este diagnóstico. La prueba llamada la prueba del nitroazul de tetrazolium (NBT) es el método clásico de laboratorio para detectar la EGC (Park, 1968), pero ha sido sustituida en muchos laboratorios por un equivalente de citometria de flujo (0' Gorman, 1995) que se adapta mejor al estudio de muestras clínicas. Otra prueba de detección de la EGC es la medida de luminiscencia y producción de superóxido (Gallin, 1983, 1990) pero estas pruebas no se realizan en la mayoría de los laboratorios. La característica biológica tundamental del leucocito en la EGC es que fagocítará a las bacterias normalmente, pero no las destruirá. Este comportamiento constituye la base de un ensayo de muerte de bacterias para EGC El síndrome de hiperinmunoglobulina IgE (Buckley, 1978) es de alguna forma fenotípicamente similar a la EGC, con abscesos recurrentes de piel y pulmonares, pero incluyendo también anormalidades óseas, facies anormales y candidiasis cutáneas: sin embargo, la función defectuosa de los PMN no es un rasgo claro de esta enfermedad (Buckley, 1978). El defecto inmunitario en el síndrome de hiperlgE todavía no está muy definido y es difícil la clasificación o asignación de una causa inmunológica o molecular. En una situación de abscesos cutáneos recurrentes y profundos, que generalmente requieren incisiones para su control, debería considerarse el síndrome de hiperlgE. El diagnóstico se sugiere por la manifestación de niveles de IgE superiores a 2.000 Ul/ml (pero tan elevados como 20.000 a 60.000 Ul/ml) con las manifestaciones clínicas correspondientes (Grimbacker, 1999). Todavía no están disponibles pruebas diagnósticas o de confirmación; ésta es una enfermedad reconocida por un fenotipo clínico, aunque se ha identificado una posible localización cromosómica (Grimbacher, 1999).
Evaluación del complemento Se han descrito un número de defectos congénitos del sistema complemento: defectos individuales que conducen a 1) síndromes clínicos claros como angioedema hereditario o la hemoglobinuria paroxistica nocturna, o a 2) una tendencia a enfermedades bacterianas recurrentes, o a (3) enfermedades autoinmunes (Schneider, 1999). Muchas de las deficiencias genéticamente determinadas de la via de activación clásica (C1, C2, C3, C4) y de los componentes terminales (C5, C6, C7, C8 y C9) pueden detectarse mediante hematíes de oveja sensibilizados con anticuerpos en un ensayo completo del complemento hemolítico (CH50). Este ensayo requiere de la integridad funcional de C1 hasta C9. Muchos laboratorios comerciales realizan este ensayo, pero para realizar la prueba con exactitud es necesario el suero recién extraído o que el plasma esté congelado. Lo menos habitual son las deficiencias de los factores D, H, e I y properdina componentes de la vía alterna, que pueden detectarse por un ensayo hemolítico distinto que utiliza hematíes no sensibili-
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL Medidas enzimáticas Las deficiencias enzimáticas relacionadas con el metabolismo de las purinas, adenosina deaminasa (ADA) y purina nucleósido fosforilasa (PNP) están asociadas con deficiencias inmunológicas. El mecanismo básico es el acumulo de metabolitos tóxicos que inhiben la replicación celular, produciendo finalmente la pérdida de importantes lineas celulares de linfocitos. La falta de adenosina deaminasa, que cataliza el catabolismo de adenosina a inosina, produce primero la pérdida de células T (células T CD4+ en particular) y con posterioridad células B. conduciendo a una forma común de deficiencia grave combinada de células T y B (Hirschhorn, 1995). Aproximadamente el 25% de las inmunodeficiencias severas combinadas (IDSC) son causadas por la deficiencia de ADA. A menudo se observan anormalidades óseas características que afectan a las caderas, pelvis y omoplatos (Cederbaum, 1976). Como para muchos de los defectos inmunitarios primarios que primero fueron identificados en su forma grave, la deficiencia de ADA también se ha diagnosticado en adultos con linfopenia de CD4 y defectos significativos de células T (Shovlin, 1994). La deficiencia de PNP provoca deficiencia de células T con un efecto mínimo o nulo sobre las células B. Las enzimas generalmente se miden en usados de hematíes (Kizaki, 1977), pero si se han hecho transfusiones sanguíneas en los tres meses previos, el ensayo puede no ser exacto, y en su lugar se deben determinar en los fibroblastos de la piel, extraídos de una biopsia de piel.
Histología El timo normal y tejidos linfáticos muestran rasgos estructurales característicos que están alterados o ausentes en las inmunodeficiencias (Borzy, 1979; Hong. 19996: Abbas, 1994). En la práctica clínica actual, a menudo estos tejidos no están disponibles, pero cuando se obtienen estos materiales de las biopsias, el examen microscópico de estos tejidos debería incluirse en la evaluación inmunológica. Las pruebas in vilro de las células obtenidas de estos tejidos son bastante reveladoras cuando se estudian mediante reactivos monoclonales dirigidos a tipos específicos de células y marcadores activos.
Ensayos con células asesinas naturales Las células NK forman un subgrupo de células, relacionadas con las células T. pero carentes de un receptor para células T y con morfología de grandes linfocitos granulares. Las células NK son detectadas por CD16, CD56 y CD57; la actividad lítíca se correlaciona mejor con la población CD56+ (Trinchieri, 1989). La actividad funcional de las células NK puede medirse por ensayo de citotoxicidad Irente a una linea celular como K562; esto puede ser importante en el diagnóstico de IDSC, el síndrome de Chédiak-Higashi y casos raros de deficiencia de células NK aisladas. Sólo se ha descrito un caso de ausencia completa de células NK. Este paciente presentaba importantes complicaciones con varicela, herpes y citomegalovirus, pero era capaz de resistir otras infecciones de manera normal (Biron, 1989).
Análisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares Aparte de la EGC, otros defectos de los PMN incluyen los defectos de mieloperoxidasa. y enfermedades de adhesión y movilidad celular. La deficiencia de mieloperoxidasa, heredada como un defecto autosómico recesivo, tiene una importancia clínica desconocida, habiendo sido descrita tanto en individuos asintomáticos como propensos a la infección (Lehrer, 1969; Klebanoff, 1999). Los leucocitos, transportados a través del sistema circulatorio, son atraídos a las áreas de inflamación interaccionando con los receptores de células endoteliales conocidos como selectinas, que ¡nteraccionan con ligandos carbohidratos de los leucocitos tales como el sialyl-Lewís" (antigeno del grupo sanguíneo Lewis). Esto provoca una lenta acción rodante (rolling) a lo largo de la pared del vaso, que "aparca" esencialmente la célula circulante, Des-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOIOGÍA
pues, la activación del leucocito provoca una expresión aumentada de las |5-2 integrinas (CD11/18), que causa una firme adhesión de la célula a la pared del vaso, siguiendo con la emigración y la infiltración del tejido (McEver, 1992). Aparecen anormalidades de adhesión a la célula si hay defectos de la integrina CD18. la cadena p común de LFA-1, Mac-1 y moléculas p150,95 (deficiencia de adhesión al leucocito [LAD-1]) (Anderson. 1987). Esta anormalidad provoca un desprendimiento postergado del cordón umbilical, úlceras cutáneas crónicas, periodontitis y leucocitosis. Las células afectadas son los neutrófilos. monocilos. macrófagos. linfocitos y células NK. Hay defectos demostrables de adherencia y funciones adhesión-dependientes como la difusión, fagocitosis y orientación quimiotáctica (Anderson, 1987). También hay una segunda forma de esta enlermedad deficitaria, que afecta principalmente a los neulrófilos y macrófagos, donde un fallo en la expresión de un ligando selectina sialyl- Lewis' y un fallo de conversión de GDP mañosa en fucosa. provoca un síndrome clínico similar, pero aporta a los individuos el grupo sanguíneo Bombay (LAD-2) (Etzioni, 1993),
res de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15 (Candotti, 1997). Como el IL-7 es esencial para el desarrollo normal de las células T del timo, un defecto en el receptor de IL-7 aislado provoca otra versión de IDSC (Puel, 1998). Hay otras enfermedades congénitas de inmunodeficiencia donde se ha identificado el defecto de una sola citocina. En varios casos raros, la carencia de secreción de defectos del receptor IL-2 en un niño constituye la base para el déficit inmunitario (Doi. 1988; Arnaz-Villena, 1992). Se ha descrito la deficiencia de IL-1 (Chu, 1984). Otro defecto de citocinas, más recientemente descrito, es el de la secreción de IL-12. que provoca una grave susceptibilidad a micobacterias y salmonela. Otros sujetos, que tienen una mutación en el receptor de INF-y. tienen la misma presentación clínica (deJong, 1998); Jouangy, 1999). En este momento se han clonado 18 citocinas que tienen una acción primaria sobre el sistema linlático (llamadas interleucinas). Se están investigando las actividades biológicas de cada una (Véanse Caps. 38 y 39).
Los defectos congénitos de la movilidad de los neutrófilos se producen en las enfermedades de defectos de adhesión antes citadas, así como en otras enfermedades de neutrófilos, síndrome de Schwachman. síndrome de Chédiak- Higashi y deficiencias de granulos específicas. Las dos primeras pueden reconocerse por los signos clínicos: hay anemia, trombocitopenia, insuficiencia pancreática en la primera y albinismo parcial oculocutáneo en la última (Inlrone, 1999). El examen morfológico de los neutrófilos teñidos muestra las anormalidades características en la deficiencia de granulos específicos (Ganz. 1988).
Marcadores adicionales de superficie celular
La quimiotaxis de los PMN técnicamente es una prueba de laboratorio difícil y los resultados irregulares pueden deberse simplemente al laboratorio (Cates. 1981) Una quimiotaxis escasa a menudo es un signo inconstante de enlermedad; asi, no muestra una correlación consistente con la sintomatologia. La evaluación total de los trastornos del movimiento exige una relación más estrecha con todo el cuadro clínico y extensa experiencia clínica. La movilidad de los leucocitos generalmente se evalúa por la migración directa a través de filtros de membrana o con agarosa (Nelson, 1975: Cates. 1981). Otras pruebas para valorar la movilidad de los PMN incluyen inyecciones de epinefrina y esteroides. que hacen que los PMN se desmarquen y abandonen las reservas de la médula. Se ha descrito una alteración de actina, importante en la migración de los PMN (Southwick. 1988). La ventana cutánea de Rebuck. que muestra la duración y características de las células de la migración en la piel, se utilizó en el pasado para describir la respuesta inflamatoria pero no ha tenido mucha aplicación clínica (Southam. 1966); sin embargo, es un indicador biológico real de las funciones de los neutrófilos in vitro.
Citocinas y receptores de citocinas Las respuestas inmunitarias están reguladas por los mediadores solubles, llamados citocinas. que producen una mulliplicidad de acontecimientos inmunes mediante interacciones con los receptores de citocinas apropiados Muchas de estas citocinas y receptores se han caracterizado. Los efectos de las citocinas son a menudo múltiples, con diferentes efectos en diferentes células (Lederer, 1995). Los receptores de las citocinas pueden contener cadenas compuestas, comunes a receptores para varias citocinas diferentes; esto se repite en el sistema hematopoyético. donde los receptores para interleucina-3 (IL-3), IL-5 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) utiliza una cadena p común, y el sistema linfático, cuyos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-5 comparten otra cadena p común. En el último caso, esta cadena p está codificada en el cromosoma X: la presencia común de esta cadena en este grupo de receptores de citocina esenciales es la razón de por qué un defecto molecular a este nivel provoca un estado de inmunodeficiencia profunda como la inmunodeficiencia ligada al cromosoma X (Noguchi, 1993; Puck, 1993). Un mecanismo que es común a un número de receptores de citocinas con dos o más cadenas es la fosforilación y activación de varios miembros de la familia de la cinasa Jak: éstos incluyen IL-2, IL-3, IL-4. IL-5, IL-6. IL-7. IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13. IL-15, GM-CSF, interterón-a (IFN-u), IFN-ji e IFN-y. Podría esperarse que los defectos en la cinasa Jak especifica simulasen un defecto de la citocina, o de su receptor; un ejemplo de esto es la versión de IDSC provocada por una mutación de Jak3, la cinasa asociada con la cadena p común de los recepto-
Para investigar la relación proporcional de vanas subpoblaciones presentes de linlocitos. monocilos y células NK. existen un número de anticuerpos monoclonales, que pueden utilizarse en el análisis de citometria de flujo en muestras de sangre incluso muy pequeñas. Además de los marcadores de superficie de células característicos de las células T, células T colaboradoras o células T supresoras, células B o células NK. éstos y otros tipos de células se caracterizan por moléculas superficiales funcionales, también designadas como "CD" (del inglés: cluster oí dilferentiation). En la Tabla 42-8 se explica un número de estos anticuerpos y sus blancos específicos. Al igual que otros marcadores de células T, la mayoría de las células T se unen al antigeno, mediante un receptor que consta de cadenas a y p Casi un 5% tiene un receptor compuesto de cadenas y y 6. Estas células T se conocen como células T
CAPÍTULO 42
Tabla 42-8
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TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
971
Marcadores d e superficie d e leucocitos
Marcador Series de células T CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD28 CD43 CD45 CD45RO Series de células В CD10 CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD40 CD77 Series mieloides CDl 1b CD11c CD14 CD16 CD34 CD35
Comentario Timocilos corticales Células T. células NK, receptor LFA-3 Parte del complejo del receptor de células T. un marcador pan-T Células T reactivas con antigeno HLA clase II (células colaboradoras) Marcadores pan-T; presentes en un subgrupo de células В Células T reactivas con antígeno HLA clase I (células asesinas) Células T; В activadas; limocitos, lugar de estimulo a la segunda señal Leucocitos excepto células В (leucosialino): reducido en el síndrome de Wiskolt-Aldrich Células T vírgenes (naive) (que no han reaccionado con antigenos), recientemente emigrado del timo Células T de memoria Antigeno común de leucemia linloblastica aguda (ACLLA) Marcador pan-B Marcador pan-B Receptor CR2, EBV Marcador pan-B Células В activadas macrófagos, eosinófilos, plaquetas; el FcRIl de baja afinidad Células B, carcinomas, monocitos; asociado con cambio de isotipo Linfoma de Burkitt CR3, receptor C3bi Receptor CR4 Monocitos, granulocitos, células de Langerhans, macrófagos Células NK, granulocitos, macrólagos: el receptor FcRIIIA, FcRIIIb Células precursoras hematopoyéticas, células endoteliales Granulocitos, monocitos, NK, células B: el receptor CR1/C3b
Series NK CD16
FCYRIII
CD56 CD57
Células NK (N-CAM, NKH-1); con CD16 usados para enumerar el número de NK en sangre perilérica Células NK. subgrupo células T (HNK-1)
Moléculas de adhesión CD11a CD11b CD11c CD18 CD62E CD62L CD62P
Leucocitos, cadena L-integrina (ligando ICAM-l) Granulocitos. monocitos, células NK; cadena M integrma del complejo LFA-1 (MCA-1. fibrinógcno y receptor C30i) Granulocitos. monocitos, células NK; cadena X integrma de LFA-1, gp 150-95 Leucocitos (integrina, cadena |5 de CD11) E- selectina, ELAM-1. células activadas endoteliales L-selectina, células T y B, monocitos, células NK. PMNs. eosinófilos. células progenitoras (LECAM-1.LAM-1) P-selectina; plaquetas activadas, células endoteliales
Marcadores de activación CD25 CD30 CD38 CD69 CD70 CD71 CD154
Células В y T activadas (receptor IL-2) Células В y T activadas, células Reed-Sternberg Células T activadas inmaduras Células В y T activadas células NK. macrófagos Células В y T activadas, células Reed-Sternberg (ligando CD27) Receptor de transierrina El ligando para CD40 en células B. asociado con hiper IgM
Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA En el caso de ausencia completa de IgA. deberían determinarse los anticuerpos para IgA, ya que la presencia de estos anticuerpos provoca anafílaxia en el transcurso de la administración intravenosa de productos sanguíneos que contengan IgA. Los pacientes con deficiencia en IgA presentan una incidencia aumentada de enfermedad autoinmune y. dependiendo de la historia clínica, puede estar indicada la búsqueda de otros autoanticuerpos (Cunningham- Rundles. 1996). Ya se ha mencionado la asociación de deficiencia selectiva de IgA con deficiencia de subclase de IgG (Bjorkander. 1985).
nos, toxoide diftérico, o las vacunas de haemophilus o neumocócica. En la ma. yoría de los casos, la respuesta indicará la capacidad relativa del sujeto para producir una respuesta a la vacunación de recuerdo. Sin embargo, otra herramienta valiosa es la vacuna de investigación, el bacteriófago X 174. Como este es un antígeno nuevo de vacuna provoca en principio una respuesta primaria de IgM. y luego, tras la reexposición, una respuesta secundaria de IgG. Usando X174, los patrones de aclaramiento y las respuestas de isotipo se pueden medir, definiendo varios grados y subgrupos de deficiencias de células B (Ochs. 1971). Esto es muy útil en pacientes que ya han estado recibiendo inmunoglobulina intravenosa, ya que la infusión pasiva de estos anticuerpos a intervalos provoca que no se puedan interpretar las respuestas a vacunas estándar.
Utilización de nuevos inmunógenos para valorar la producción de anticuerpos
Genética molecular y diagnóstico prenatal
Para investigar la producción de anticuerpos, en muchos casos es suficiente investigar la respuesta a los antigenos de las vacunas, como la /acuna del téta-
Actualmente se han identificado, clonado y secuenciado un número de genes involucrados en los síndromes de inmunodeficiencia primaria (Conley,
972
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
1992; Puck. 1993: Derry. 1994; Ramesh. 1998; Víhinen. 1999). En muchos casos, los modelos de ratones knockout se producen para estudiar los efectos de los genes involucrados en la inmunidad. En casos sospechosos de inmunodeficiencia. los genes relevantes pueden ser examinados directamente. Estas técnicas permiten el diagnóstico de pacientes, y la identificación de portadores. Cada vez está siendo más posible el diagnóstico prenatal de un número de defectos inmunes. Si la mutación especifica se conoce, o si se sabe que el patrón de herencia está ligado al cromosoma X, se pueden realizar análisis de marcadores polimórficos ligados o detección de mutaciones especificas usando muestras de vellosidades coriónicas. ADN de amniocitos preparados directamente de células fetales, o de lineas de células cultivadas y expandidas. Cuando el genotipo no se conoce, puede investigarse directamente en las células letales el defecto funcional, aunque estas pruebas se deben realizar más adelante durante el embarazo y suponen más nesgo. Por ejemplo, en los sindromes de IDSC. se puede demostrar en la sangre fetal la linfocitopenia. un número descendido de células T y una escasa transformación de linfocilos (Durandy, 1985). Se pueden determinar deficiencias de enzimas en cultivos de fibroblastos obtenidos por amniocentesis. Se puede realizar, si la sangre letal puede obtenerse sin contaminación de sangre materna, ausencia de antigenos HLA o valoración de (unciones de las células T y quimioluminiscencia de granulocilos.
RESUMEN La valoración de las defensas del huésped es un proceso extraordinariamente complejo que supone la cooperación del médico, científico investigador y del patólogo. Una aproximación lógica, basada en la apreciación de los diversos sistemas involucrados en la defensa del huésped y las diversas capacidades de los distintos laboratorios, pueden llevar a un diagnóstico en casi todos los casos. El impresionante éxito de la terapia moderna, basada en los antibióticos más recientes, la tecnología del ADN recombinante y los trasplantes de médula ósea, favorece la definición precisa y el tratamiento de los estados de inmunodeficiencia inmunológica.
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CAPJTUIO 42
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TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
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CAPÍTULO
43
Evaluación clínica y de laboratorio de las enfermedades reumáticas sistémicas • Carlos Alberto Von Mühlen, M.D., Ph.D. • Robert M. Nakamura, M.D.
INTRODUCCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS
974
LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS
Anticuerpo frente al antígeno nuclear asociado a artritis reumatoide Anti-RA33 y relación con la artritis reumatoide
974
Factores etiológicos en el lupus eritematoso sistémico ¿Cuáles son los criterios diagnósticos para el lupus eritematoso sistémico?
POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS
980
SÍNDROME DE ASTENIA CRÓNICA
981
CONCEPTO DE SÍNDROMES DE SUPERPOSICIÓN
981
Enfermedad mixta del tejido conectivo
¿Qué son los síndromes y enfermedades "tipo lupus"? Perfil de autoanticuerpos en el lupus eritematoso
BIOLOGÍA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS AUTOANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES 981
sistémico Lupus crónico discoide Lupus eritematoso inducido por medicamentos y anticuerpos antihistona SÍNDROME DE SJOGREN
978
ESCLERODERMIA
979
PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS
981
TABLA DE DECISIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
982
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN LA DETECCIÓN DE
Anticuerpos frente a antígenos del centrómero
AUTOANTICUERPOS
982
Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I) VARIACIONES EN LAS METODOLOGÍAS USADAS PARA LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Anticuerpos frente a ARN polimerasas Autoanticuerpos frente al antígeno nucleolar fibnlarina (U3-snRNP) Anticuerpos dirigidos a la región organizadora nuclear ARTRITIS REUMATOIDE
983
Enzimoinmunoanálisis 980
Inmunotransferencia
Factor reumatoide Anticuerpo antiqueratina Factor antiperinuclear
INTRODUCCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS Las enfermedades reumáticas se caracterizan por la presencia de uno o más anticuerpos que pueden estar dingidos contra componentes de la superficie, citoplasma o núcleo de la célula. El último grupo, anticuerpos contra antigenos nucleares (AAN), es el sello de las enfermedades reumáticas sistémicas (Nakamura, 1985.1986,1992; Tan, 1982a, 1989). Se ha progresado mucho en la aclaración de los mecanismos inmunes involucrados en las enfermedades reumáticas durante los últimos 15 años. Muchas de las enfermedades reumáticas tienen un perfil de anticuerpos distintivo con especificidades diagnósticas. Por otra parte, las funciones bioquímicas y biológicas de muchos de los antígenos están involucradas en la replicación del ácido desoxiribonucleico (ADN), el corte y empalme de los precursores del ácido ribonucleico (ARN). y el procesamiento del ARN (Tan. 1989). La clasificación de las diversas enfermedades reu-
RESUMEN
987
BIBLIOGRAFÍA
987
máticas ha sido difícil debido a la falta de una base etiológica constante para la mayoría de las enfermedades. Un subcomité del Colegio Americano de Reumatologia (Decker. 1986) desarrolló una clasificación y vocabulario extenso La clasificación de las enfermedades reumáticas sistémicas y las alteraciones relacionadas realizada por el autor se muestra en la tabla 43-1.
LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS El lupus eritematoso sistémico (LES) es el prototipo de las enfermedades reumáticas sistémicas y posee los siguientes rasgos significativos (Nakamura, 1994a): 1. LES es una enfermedad autoinmune que no es órgano-específica, donde el daño tisular está mediado principalmente por inmunocomplejos ADNanti-ADN.
CAPÍTULO 4 3
Tabla 43-1
EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
Enfermedades reumáticas sistémicas y trastornos relacionados
Lupus erilematoso sistémico (LES) Lupus erilematoso discoide (LED) Síndromes tipo lupus Lupus eritematoso inducido por medicamentos Síndrome de S|0gren Esclerodermia/síndrome CREST (calcinosis cutis, fenómeno de Raynaud, trastornos de la mohlidad esofágica, esclorodactilia y telangiectasia) Artritis reumatoide (AR) Dermatorniositis y polimiositis Síndromes sobrepuestos a) Enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM) b) AR y LES (rupus) c) LES y esclerodermia (lupodermia) d) Esclerodermia y dermatomiositis (esclerodermatomiositis) e) Otros 10. Síndromes de enfermedad del tejido conectivo que no están definidos como para tener una categoría clínica
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comité para los criterios de LES de ARA publicó criterios revisados que incorporaban nuevos conocimientos inmunológicos y mejoraban la clasificación de la enfermedad del LES (Tan. 1982b). Los criterios revisados en 1982 para la clasificación de LES incluían 11 categorías añadiendo 1) título anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o ensayo equivalente y 2) anticuerpo a ADN nativo y/o antígeno Sm. En contraste con los criterios de 1971, los criterios de 1982 retiraban el fenómeno de Raynaud y la alopecia por su falta de sensibilidad y especificidad. Cuando los criterios de ARA de 1982 para la clasificación de LES fueron comparados con los criterios de 1971, hubo una mejora definitiva en la sensibilidad y en la especificidad. Los criterios de 1982 mostraban un 96,7% de sensibilidad y un 96% de especificidad al ser evaluados con pacientes con LES conocido y controles (Tan. 1982b). Los criterios de la ARA de 1982 consideraban que los pacientes tenían LES si cumplían cuatro de los critenos secuencial o simultáneamente en cualquier momento del examen. En 1997, se publicó una actualización de los criterios, donde como cambios se elimino la prueba de las células LE y se añadieron los anticuerpos anticardiolipina (Tabla 43-2) (Gladman, 1999).
¿Qué son los síndromes y enfermedades tipo lupus? 2. Es una enfermedad multisistémica que afecta a la mayoría de las personas de todas las edades y ambos sexos, aunque es más prevalenle en mujeres en edad fértil. 3. La enfermedad manifiesta un sistema inmune hiperactivo con múltiples anormalidades. 4. Los pacientes con LES manifiestan una respuesta de anticuerpos heterogéneos y policlonales, con reacción de formación autoanticuerpo incluyendo mecanismos similares a los vistos en una respuesta inmune típica a inmunógenos extraños (Fatenejad, 1998). 5. El caso típico de LES presenta una media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes de forma simultánea. La prevalencia de anticuerpos varía por encima de un amplio rango, y se han identificado más de 25 tipos diferentes de autoanticuerpos en LES (Nakamura, 1994a).
Factores etiológicos en ei lupus eritematoso sistémico Su etiología sigue sin conocerse bien. Algunos de los factores etiológicos importantes en LES son 1) endocrino-metabólicos, 2) ambientales y 3) genéticos (Chan, 1989). El factor de riesgo más fuerte para el desarrollo de LES es el género femenino (Hochberg. 1990). Se ha considerado que el LES puede tener una posible etiología viral (Pincus. 1982). La presencia de anticuerpos antinucleares se observó en trabajadoras de laboratorio con diversos niveles de exposición a sangre de pacientes con LES. La presencia de anticuerpos antinativos ADN fue mayor en trabajadoras de laboratorio que en un grupo de mujeres no expuestas que no trabajaban en un laboratorio (p<.00l) (Zarmbinski. 1992). Estos resultados ayudan a mantener la hipótesis de que un agente transmisible que puede existir en la sangre de pacientes con LES, puede ocasionar la formación de anticuerpos. Se han implicado algunos productos químicos en el LES (Hochberg, 1990). Se ha estudiado el síndrome del lupus inducido por medicamentos tipo hidralacma. procainamida e isoniacida. como pista en la patogénesis del LES. Diversos artículos demuestran el mecanismo de acetilación como un factor de nesgo en el LES. Existen estudios que han demostrado una mayor relación de concordancia de LES en gemelos monocigóticos y dicigóticos (Block, 1975). La concordancia de LES estaba presente en 11 (58%) de 19 gemelos monocigóticos. El resultado final de la interacción de múltiples tactores etiológicos es la activación policlonal de células B en pacientes LES con producción de un amplio espectro de anticuerpos (Nakamura. 1994a).
¿Cuáles son los criterios diagnósticos para el lupus eritematoso sistémico? En 1971, el Colegio Americano de Reumatologia (ACR: previamente la Asociación Americana de Reumatismo (ARA)) publicó entonos preliminares para la clasificación de LES (Cohén. 1971). Entonces se consideraba que los pacientes tenían LES si cumplían cuatro de los criterios secuencial o simultáneamente durante cualquier momento del examen. En 1982, el sub-
Hay muchas enfermedades y síndromes que pueden compartir ciertos rasgos clínicos con el LES pero no son LES y tienen diferentes etiologías y patogénesis. Las enfermedades que se han enumerado en esta categoria incluyen vasculitis, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedades linfoproliferativas, fiebre reumática, glomerulonefritis, sífilis, hepatitis lupoide. lupus inducido por medicamentos y neoplasia oculta (Panush, 1993). Hay una categoria muy amplia de pacientes que manifiestan menos de cuatro de
Tabla 43-2
Actualización d e 1997 de los criterios revisados en 1982 para la clasificación del lupus eritematoso sistémico'
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Exantema malar Exantema discoide Fotosensibilidad Úlceras orales Artritis no erosiva Serositis (pleuritis o pericarditis) Alteración renal (proteinuna persistente cilindros celulares) Alteración neurología Alteración hematológica a) Anemia hemolitica con reticulocitosis. o b) Leucopenia < 4.000/mm' en >2 ocasiones, o c) Linfopenia < 1 500 mm en >2 ocasiones, o d) Trombocitopema < 100 OOO/mm'en ausencia de un medicamento culpable 10. Alteración inmunológica a) Anti-ADN; anticuerpo contra ADN nativo en titulo anormal, o b) Anti-Sm presencia de anticuerpo contra anticuerpo nuclear Sm. o c) Hallazgos positivos de anticuerpos antifosfolipidos basados en: (t) un nivel anormal en suero de IgG o Igtvl anticuerpos anticardiolipina (2) un resultado positivo para anlicoagulante de lupus usando un método estándar, o (3) un falso positivo en la prueba de la sífilis que se sabe que es positivo durante al menos seis meses y confirmado por inmovilización de Treponema palhdum o prueba de absorción del anticuerpo fluorescente de treponema 11, Anticuerpo antinuclear positivo Un título anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o prueba equivalente en cualquier momento en el tiempo y en ausencia de medicamentos que se sabe están asociados con el síndrome de "lupus inducido por medicamentos" ' La clasificación propuesta esta basada en 11 criterios Con el propósito de identificar a los pacientes en estudios clínicos, se ova que una persona tiene LES si están presentes 4 o mas de los 11 criterios, en serie o simultáneamente, durante cualquier Intervalo de observación De Hochberg MC Updatmg the American College of Rheumalology revised criteria for the classification ol syslemic lupus erythematosus (Carla). Arthntis Rheum 1997; 40 1725, con permiso. /
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
los criterios de clasificación de ARA de 1982 para LES (Lázaro. 1989: LomOrta. 1980: Schur. 1993) pero se considera que tienen enfermedades "tipo lupus". Estos pacientes se han clasificado del siguiente modo: 1) enfermedad reumática indiferenciada; 2) enfermedad no reumática; 3) síndrome sobrepuesto; y 4) lupus incompleto, latente o incipiente. Schur recomendaba, de forma similar a los primeros criterios de ARA para el diagnóstico de la artritis reumatoide (AR), que los pacientes fueran calificados como LES clásico (muchos criterios). LES definido (cuatro o más criterios), LES probable (tres criterios) o posible (dos criterios). Los pacientes con dos o tres criterios pueden ser considerados como incompletos, incipientes o latentes, además de lupus posible y probable (Schur. 1993). Si se sigue a estos pacientes, algunos permanecen con síntomas leves, y como tales quedan clasificados como "enfermedad indiferenciada del tejido conectivo": unos pocos desarrollan un LES definitivo, pero muchos pueden evolucionar a otras enfermedades con un pronóstico mejor.
Tabla 43-3 Antígenos y autoanticuerpos en lupus eritematoso sistémico Antígenos
ADN doble cadena ADN cadena simple H1. H2A. H?B. H3 H4 Proteínas. 29 (B ), 28 (B) 16 (D), y 13(E) kDa en complejo con U1, U2 y U4-U6 snRNAs: componente espliceosoma
RNP nuclear (U1 RNP)
Proleinas, 70, 33(A) y 22(C) 30-40% kDa, en complejo conU1 snRNA, componente espliceosoma Proteínas. 60 y 52 kDa, en 24-60% complejo con Y1-Y5 RNAs Fosfoproteínas. 48 kDa. 9-35% (ormando complejo con Y1 copias ARN Poi III naciente Proteínas. 86 y 66 kDa 1-19% proteínas unión a ADN Proteina nuclear. 34 kDa 31-37% Proteina. 36 kDa, proteína 3% auxiliar de ADN polimerasa Fosfoproteinas. 38. 16 y 10-20% 15 kDa asociado a ribosomas Proteina de golpe de calor. 90 kDa 5-50% Proteína 68 kDa. 11 en raro complejo con Alu-ARN Proteínas asociadas a ADN 9 a 17 kDa 34-70% Fosfolípidos aniónicos. 25% cardiolipina
SS-B/La
el lupus eritematoso sistémico Ku La característica del LES es la presencia de un amplio espectro de autoanticuerpos, incluyendo anticuerpos contra ADN nativo (ds-ADN), antígeno Sm, U1-nRNP, SS-A/Ro, SS-B/La y otras varias proteínas no-histona o complejos proteína no-histona-ARN (Nakamura. 1994a). Existe una policlonalidad de anticuerpos en LES y esclerodermia. y se ve raramente en las otras enfermedades reumáticas sistémicas. El anti-ADN nativo y anti-Sm generalmente son específicos para LES. El lupus eritematoso sistémico se caracteriza por una respuesta de anticuerpos policlonales y heterogéneos, y presenta una media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes simultáneamente. La prevalencia de autoanticuerpos varia por encima de un amplio rango. Los anticuerpos contra ADN nativo e histonas se detectan en hasta un 40% y 70% de los pacientes, respectivamente, y anticuerpos contra el antigeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y ciclina o proteina Alu-ARN en el 3% o menos (von Mühlen. 1995) (Tabla 43-3).
Anticuerpos contra ADN nativo o ADN bicatenarío Anticuerpos anti- ADN bicatenarío (ds-ADN) son bastante específicos para LES y se observan con una frecuencia del 75% al 90% en pacientes LES con enfermedad activa (Buskila. 1992). Se han publicado muchos artículos previos de anticuerpos ds-ADN en otras enfermedades que no son LES. Sin embargo, el pensamiento actual es que los anticuerpos reactivos a ADN en las otras enfermedades eran realmente anticuerpos anti ADN monocatenario. Las pruebas del anticuerpo ds-ADN a menudo utilizaban preparaciones de ds-ADN contaminadas con ADN desnaturalizado o monocatenario. Una posible excepción podría aparecer en el síndrome primario de Sjógren. una enfermedad a veces difícil de diferenciar del LES en gente de más edad. El anticuerpo contra ADN juega un papel definitivo en la patogénesis del LES. En estudios de pacientes LES. al anticuerpo contra ADN le sigue en aparición el antígeno circulante ADN, una secuencia de acontecimientos que terminan con la formación de inmunocomplejos. Estos inmunocomplejos ADN-anti-ADN tienen un tropismo especial por las membranas básales y se depositan enseguida en el glomérulo renal. Esto inicia un daño renal por mecanismos inflamatorios que terminan con la activación del complemento y la lisis de células (Okamura. 1993). Los métodos previos de detección de anticuerpos ADN fueron el método de precipitación insensible, fijación de complemento y hemaglutinación pasiva. Los métodos habituales son radioinmunoanálisis (RÍA), inmunofluorescencia indirecta (IFA) sobre Crithidia luciliae y enzimoinmunoanálisis (ELISA) (Buskila, 1992). Estos pueden detectar anti- ADN en el 75% al 90% de pacientes activos LES no tratados.
Anticuerpos contra Sm y ribonucleoproteina nuclear Los anticuerpos de precipitación al antigeno Sm se han considerado marcadores altamente específicos para LES (Tan, 1989). Los anticuerpos contra Sm y contra ribonucleoproteínas nucleares (nRNPs) se encuentran en pacientes con LES. Los antígenos Sm y nRNPs se asociaban notoriamente, porque el nRNPs no se pudo aislar bioquímicamente del antígeno Sm. Lerner
Frecuencia autoanticuerpo'
ADN nativo ADN desnaturalizado Hislonas Sm
SS-A/Ro
Perfil de autoanticuerpos en
Estructura molecular
hnRNP proteína A1 PCNA RNP ribosomal Hsp '!(.: Proteína ALu ARN HMG-17 B, glucoproteina I
40-70% 70% 50-70% 15-30%
• Las frecuencias están relacionadas sobre lodo con pacientes con enlotmedafl activa. Modificado de Nakamura RM, Bylund DJ. Tan EM Curent status of available standards lor quality improvement ol assays lor the detection of autoantibodies to nuclear and intracellular antigens J Clin Lab Anal 1994b. 8:360 y Krapf AR. von Mühlen CA. Krapf FE. y col Atlas of Immunofluorescenl Autoantibodies Munich. Urban & Schwar/enberg. 1996. con permiso
(1979) empleó las herramientas de la biología molecular para demostrar que los antígenos Sm y nRNP eran partículas subcelulares compuestas de pequeños ARN nucleares formando un complejo con proteínas. La partícula unida por anti-nRNP está formada por un componente ARN llamado U1 (U por rico en uridina). formando complejo con al menos siete proteínas que variaban en peso molecular de 12 a 68 kDa (Tan. 1989), y encontrados con una frecuencia de 20% a 40% (ter Borg, 1990). Los antígenos de Sm constan de varias proteínas, llamadas convencionalmente B1 (29 kDa). D (16 kDa) y E (13 kDa) (Tan. 1989). Los anticuerpos anti B1/B purificados reaccionan de forma cruzada con la proteína D y viceversa, pero no se observa ninguna reacción cruzada en pequeñas cantidades de sueros LES. Así. hay al menos dos epitopos en la proteína B1/B reconocidos por sueros anti-Sm. Los antigenos reactivos con anti-Sm y ARN antinuclear están por consiguiente en unión de proteínas interactivas y ARN ocupados del corte y empalme del ARNm precursor (Tan, 1989). No hay rasgos clínicos característicos aparentes en pacientes LES con anticuerpos anti-Sm (Barada, 1981). aunque algunos autores afirman que estos anticuerpos se asocian a enfermedad renal u otras alteraciones del sistema nervioso central (SNC) Los pacientes que sólo tienen anticuerpos a nRNP presetan una baja lasa de anticuerpos al ADN y baja frecuencia de enfermedad renal clínicamente aparente (ler Borg, 1990). Los anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP pueden detectarse por inmunodifusión, hemaglutinación pasiva o contrainmunoelectroforesis. Sin embargo, los métodos antes mencionados no distinguen exactamente entre anticuerpos y pequeños polipéptidos asociados a ARN nuclear Las reactividades con los ARN individuales y polipéptidos pueden demostrarse mejor por técnicas de inmunoprecipitación del ARN e inmunotransferencia, respectivamente. Se ha comprobado que la inmunotransferencia es más sensible que
CAPÍTUIO 43
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EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
los métodos convencionales para la detección de anti-Sm y anti-nRNP (Nakamura, 1994b). Habitualmente. las pruebas de laboratorio más ampliamente usadas para la detección de anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP son la inmunodifusión y ELISA. Estas pruebas pueden diferenciar entre anticuerpos Sm y nRNP pero no pueden definir los epítopos de los anticuerpos específicos presentes en los sueros de los pacientes. La especificidad de los anticuerpos y los epítopos se determinan mejor por métodos de inmunotransferencia Western Northern.
Anticuerpos contra SS-A/RO y SS-B/La Los pacientes con LES pueden tener anticuerpos contra SS-A/Ro sólo, o pueden tener ambos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. El poseer sólo antiSS-A/Ro está fuertemente asociado con el antígeno leucocito humano (HLA) DR2 y con ser joven (<22 años de edad al comienzo). La presencia de ambos. anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. en el LES está asociado con HLADR3 y se ha visto en pacientes mayores (>50 años de edad al comienzo de la enfermedad). (Hochberg, 1985). Un estudio con 55 pacientes con LES mostró que los pacientes con anti-SS-A/Ro sólo tenían una enfermedad renal mucho más seria (Hochberg, 1985). Los pacientes LES sólo con anti-SS-A/Ro también tenían una mayor incidencia de anticuerpos antiADN concomitantes que aquellos pacientes LES con ambos anticuerpos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La (Chan. 1989). Los auloanticuerpos anti-SSA/Ro se han asociado íntimamente con la aparición de nefritis, vasculitis, adenopatia, fotosensibilidad y leucopenia en pacientes LES. Los anticuerpos anti-SS-A/Ro, como los anticuerpos anti-SS-B/La, son anticuerpos importantes por su fuerte asociación con el síndrome de Sjógren. que se produce en más de dos tercios de los pacientes con este trastorno. El antigenoSS-B/La es una proteina celular unida a una especie de pequeño ARN, formando un pequeño RNP que puede funcionar en el procesamiento de las copias de ARN polimerasa III (Chan, 1989)
Subgrupos clínicos de lupus eritematoso sistémico asociado a anticuerpos contra SS-A/Ro Los niveles elevados de anticuerpos SS-A/Ro están relacionados con vanas alteraciones autoinmunes clínicas, incluyendo: 1) lupus eritematoso cutáneo subagudo, 2) síndrome neonatal de lupus eritematoso con bloqueo cardíaco congénito y lesiones cutáneas; 3) deficiencia homocigótica C2 y C4 con enfermedad tipo LES; 4) vasculitis primaria del síndrome de Sjógren, positividad de factor reumatoide y síntomas sistémicos graves 5) pacientes LES ANA-negativos y 6) LES con neumonitis intersticial (Bylund. 1991). Los anticuerpos de precipitación contra SS-A'Ro se han visto en el 65% al 95% de los pacientes con subgrupos asociados de anti-SS-A/Ro. y más del 90% tienen niveles anti-SS-A/Ro cuando se detectan por métodos ELISA (Bylund, 1991).
Anticuerpos anti-Ku y anti-Ki El sistema antigeno Ku consta de un par de proteínas llamadas p70/'p80 (Francoeur. 1986; Reeves, 1992). Estas proteínas poseen una alta afinidad por el ADN y se sabe que son proteínas de unión al ADN. interaccionando covalentemente con los extremos de ADN nativo. Mediante pruebas de inmunoprecipitación e inmunotransferencia, se encontró el autoanticuerpo Ku en el 10% de los sueros LES y no fue detectado en 100 de los sueros de esclerodermia examinados. En esludios con un enzimoinmunoanálisis, Reeves (1992) mostró que el 39% de LES. el 55% de la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el 40% de los pacientes con esclerodermia presentaban niveles bajos de anticuerpo contra la proteina Ku. El anticuerpo anti-Ki fue descrito por primera vez en Japón (Tojo. 1981) y se observó en casi el 10% de los pacientes LES. Se advirtió una relación entre el antiKi y los rasgos clínicos de artritis, pericarditis e hipertensión pulmonar en pacientes LES. El antígeno Ki lúe purificado del timo de conejo y tenía un peso molecular de 32 kDa. Sakamoto (1989) realizó un ELISA y observó anticuerpos anti-Ki en el 21.4% (30 de 140) de los pacientes LES. mientras que 11 de 140 fueron positivos para anti-Ki por pruebas de doble inmunodifusión.
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Anticuerpos contra proteínas ríbosomales P Cerca del 10% al 20% de los sueros LES muestran anticuerpos dirigidos a tres fosfoproteinas ríbosomales de 15, 18 y 38 kDa en ensayos en sangre completa (WB). La asociación de anti-rRNP con las principales enfermedades del SNC en LES. principalmente los síntomas sicóticos, fue descrita en un estudio retrospectivo (Bonfa, 1987). No se mostró ninguna asociación con el empeoramiento cognitivo o depresión en pacientes con lupus. Se han encontrado diferencias significativas en la prevalencia de anti-rRNP entre razas. Los estudios recientes se concentran en el papel etiopatogénico de anti-rRNP en síntomas SNC en pacientes con lupus (Isshi. 1998; Nakamura, 1997),
Antígeno nuclear de proliferación celular y anticuerpos Hsp-90 En el 3% de los pacientes con LES activo se detectaron anticuerpos contra PCNA y no hay rasgos clínicos distintivos asociados con la presencia del anticuerpo (Miyachi, 1978). Una posible asociación con los rasgos SNC, como mielitis transversa, se ha visto en nuestros propios pacientes (C.A. von Mühlen y R.M. Nakamura, resultados no publicados). Se ha determinado que la proteína PCNA está relacionada con el ciclo celular, y se ha observado que los anticuerpos PCNA son sondas útiles en el estudio de los agentes que regulan la replicación del ADN, la proliferación celular y la transformación del blasto. Se ha detectado un autoanticuerpo contra la proteina del golpe de calor en mamíferos, Hsp-90 (Minota, 1988). La Hsp-90 es una proteína del citoplasma y de la membrana plasmática de 90 kDa. El autoanticuerpo contra Hsp-90 fue observado en el 50% de los pacientes con LES y dos de seis pacientes con polimiositis.
Anticuerpos
antifosfolípido
en
el lupus eritematoso sistémico El síndrome de anticuerpos antifosfolípido o anticoagulante lúpico se caracteriza por la presencia de anticuerpos circulantes contra fosfolipidos y rasgos clínicos de trombosis venosa y arterial, trombocitopenia, anemia hemolitica y varios síntomas sistémicos. Se han encontrado anticuerpos antifosfolipidos frecuentemente en pacientes con LES y también en otras alteraciones como las enfermedades infecciosas (Alarcón-Segovia. 1992: McNeil. 1991). Los anticuerpos antifosfol ¡pidos se encuentran en hasla el 60% de los pacientes con LES. Recientemente, se evidenció de forma clara que los anticuerpos antilosfolípidos son muy heterogéneos, funcional e inmunoquimicamente, y son policlonales (McNeil. 1991). La cardiolipina (fosfolipido aniómco) se ha utilizado ampliamente en la detección de anticuerpos antilosfolipidos. La mayoría de los anticuerpos anticardiolipina reaccionan de forma cruzada con fosfolipidos zwitterionic (McNeil. 1991). Los anticuerpos contra fosfolipidos identificados pueden ser IgG o IgM, mientras que los anticuerpos a fosfolipidos de ion dipolar son más frecuentemente IgM. Los anticuerpos contra fosfolipidos son identificados en pacientes LES de tres maneras (AlarcónSegovia, 1992): 1) prueba falsa-positiva serológicamente para sífilis por pruebas de Laboratorio de Investigación de Enfermedades Venéreas (VDRL). que es un ensayo de floculación con partículas de carbón cubiertas con colesterol, lecitina (fosfatidilcolina) y cardiolipina; 2) el ensayo anticoagulante lúpico, que es la prolongación del tiempo de caolín parcial de tromboplastina (KPTT) que no está corregido por el plasma normal; y 3) el inmunoensayo de cardiolipina con el uso de cardiolipina u otros fosfolipidos negativamente cargados como antígenos. Los pacientes con LES reaccionarán generalmente con un grupo fosfato cargado negativamente presente en la cardiolipina, ácido fosfatídico. fosfatidilserina o fosfatidilinositol. Harris (1987.1990) coordinó unos talleres internacionales para mejorar la precisión y exactitud de los inmunoanálisis de los anticuerpos antifosfolipidos. Se prepararon sueros de referencia y se definieron unidades estándar (GPL y MPL). Una unidad GPL (MPL) es equivalente a 1mg/ml de una muestra estándar IgG (IgM) purificada por afinidad. Sin embargo, López (1992) sugirió que un ensayo IgA específico para anticuerpos antifosfolípido es importante para valorar el síndrome antifosfolípido en pacientes con LES. Parece que se encuentra una mayor prevalencia del isotipo IgA para anticuerpos
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
antifosfolípido en las personas negras. Los ensayos recientemente desarrollados para autoanticuerpos de la glucoproteína I |i, parecen aportar especificidad a los hallazgos, dado que se describió que la glucoproteína f¡¡ es el epítopo específico para anticuerpos antifosfolípidos.
Lupus crónico discoide Una forma benigna de lupus puede manifestarse como lesiones cutáneas discoides" (con forma de moneda o disco) sin síntomas de enfermedad sistémica. Esta alteración se llama lupus eritematoso crónico discoide (LEC) (Sontheimer.1992; Wallace,1992). Las características clínicas y de laboratorio de LEC no se han definido claramente desde la adopción de los criterios del Colegio Americano de Reumatología revisados en 1982 para la clasificación de LES. Las lesiones cutáneas del lupus discoide crónico son las siguientes: 1) eritema localizado persistente. 2) escamas adheridas, 3) taponamiento folicular, 4) telangiectasia y 5) atrofia (Wallace. 1992). El lupus eritematoso subagudo cutáneo (LESC), otro cuadro cutáneo similar, consiste en lesiones papuloescamosas o no cicatriciales con una asociación principal al auloanticuerpo SS-A/Ro. También se han descrito variantes adicionales del lupus crónico discoide, como la paniculitis lúpica y el lupus urticarial (Sontheimer, 1992). Wallace (1992) ha definido el lupus crónico discoide como el cumplimiento de la descripción del lupus crónico discoide o LESC. o una de las variantes de LES donde no se reúnen los criterios ACR para LES. Desgraciadamente, el lupus crónico discoide es una alteración cutánea autoinmune que carece de anormalidad serológica que unifique el diagnóstico. Es una forma leve del lupus eritematoso que raramente evoluciona a LES. Por otra parte, hay una superposición considerable entre el lupus discoide y LES, ya que hasta un 15% de los pacientes con LES tienen lesiones cutáneas discoides. Alrededor del 6% al 12% de los pacientes con LES tenían lupus discoide durante un número variable de años antes del comienzo de la enfermedad sistémica (Wallace, 1992). Habitualmente presentan anticuerpos antinucleares, con una estimación de prevalencia en el lupus discoide del 6% al 50%. La relación mujeres/hombres (2:1) está mucho menos inclinada hacia las mujeres que la forma sistémica
Lupus eritematoso inducido por medicamentos y anticuerpos antihistona Una característica del lupus inducido por medicamentos es la presencia de autoanticuerpos de histona. Las histonas son proteínas básicas moleculares que contienen altas relaciones molares de aminoácidos cargados positivamente, lisina y arginína. Las histonas se encuentran en las células eucarióticas estrechamente asociadas al ADN genómico. La subunidad de este complejo histona-ADN se llama nucleosoma, cuyo núcleo ("core") tiene dos moléculas de cada (H2A, H2B. H3 y H4). y una molécula de H1. junto con ADN de unos 200 bp de longitud (Rubín. 1985,1987), En los estudios de lupus inducido por drogas, el enzima hepático acetiltransferasa parece jugar un papel importante (Woosley, 1987). La acetiltransferasa es un enzima que puede acetilar medicamentos como la hidralazina y procainamida, jugando un importante papel en la desintoxicación y excreción del medicamento. Los pacientes con bajos niveles de acetiltransferasa eran más propensos a desarrollar ANA y síntomas clínicos que pacientes que eran tratados con hidralazina y tenían fenotipicamente niveles altos de acetíltransferasa. Los pacientes con altos niveles de enzima y que eran aceliladores rápidos no eran inmunes al desarrollo de ANA. Estos pacientes, sin embargo, tuvieron una dosis acumulada de hidralazina mayor y más prolongada antes de desarrollar la enfermedad. Estos hallazgos relativos a los fenotipos de acetíltransferasa se han confirmado en pacientes tratados con procainamida (Rubin. 1988). La procainamida es el medicamento implicado más habitualmente en la autoinmunidad inducida por medicamentos. La hidralazina, quinidina y otros medicamentos también se han implicado como causantes de la autoinmunidad inducida por medicamentos. En el lupus inducido por medicamentos, existen anticuerpos frente a ADN de cadena simple e histonas. La procainamida se utiliza para tratar a los pacientes con arritmias, y la mayoría de los pacientes desarrollan anticuerpos anti-histona. Sin embargo, sólo del 10% al 20% de los pacientes tratados con procainamida desarrollan una enfermedad autoin-
mune sintomática (Rubín, 1988). En pacientes asintomáticos. el anticuerpo anti-histona es predominantemente IgM y manifiesta una amplia reactividad con todas las histonas individuales. Los pacientes con enfermedad sintomática desarrollan un único tipo de anticuerpo anti-histona IgG que. más que reaccionar con las histonas individuales, presenta una reactividad específica con el complejo dimero de histonas H2A-H2B (Rubin. 1988) (Tabla 43-4). Asi. la IgG anti-(H2A-H2B) es un marcador útil de diagnóstico, con alta sensibilidad y especificidad para la enfermedad sintomática, en contraste con la forma benigna de autoinmunidad inducida por procainamida. con anticuerpos IgM contra la histona individual. En ambos tipos de lupus eritematoso inducido por medicamentos (hidralazina y procainamida). existen anticuerpos IgM en concentraciones más altas que los anticuerpos IgG. El cincuenta por ciento de todos los pacientes tratados con procainamida desarrollaron ANA después de un año de tratamiento (Tan. 1989). Los acetiladores lentos desarrollaron ANA más rápidamente que los acetíladores rápidos (Woosley. 1987). Todos los pacientes con tratamientos prolongados de procainamida desarrollaron una respuesta ANA positiva con independencia del fenotipo acetilador.
SINDROME DE SJOGREN El síndrome de Sjogren es una enfermedad inflamatoria autoinmune D e gresiva marcada por una progresiva sequedad de ojos, boca y otras mucosas (Schumacher, 1993). La enfermedad puede evolucionar desde las glándulas exocrinas hasta una alteración sistémica asi como una alteración linfoprolíferativa de células B. Se halla mucho más frecuentemente en mujeres que en hombres, con una prevalencia creciente a lo largo de la vida adulta. A menudo asociadas al síndrome de Sjogren están otras enfermedades reumáticas, como AR. LES. cirrosis biliar primaria o esclerosis sistémica (Tabla 43-5). Las glándulas afectadas salivares o lacrimales son infiltradas con agregados de linfocitos. Las manifestaciones extraglandulares incluyen adenopatía. vasculitis cutánea, neumonitis intersticial, etc. Esta enfermedad se ha clasificado dentro del síndrome primario de Sjogren (1). que no está asociado con otras enfermedades del tejido conectivo, y el síndrome de Sjogren secundario (2). donde está presente la AR u otras enfermedades autoinmunes. Se sabe que el síndrome de Sjogren se produce en una forma primaria, con el complejo seco (queratoconjuntivitis seca y xerostomia) como marco característico. Los autoanticuerpos en el síndrome de Sjogren normalmente se confinan a los antígenos SS-A/Ro y SS-B/La (Tan, 1989), pero el autor los ha observado con otras especificidades solas, como complejo anti-Golgi o anti NuMA. El anti SSA/Ro y anti-SS-B/La están presentes en LES pero en prevalencías mas bajas que en el síndrome de Sjogren. El anti ss-B/La se observa en un 60% de los pacientes del síndrome de Sjogren y en un 35% de los pacientes LES. y anti-SS-A/La en el 40% y 15%. respectivamente (Von Mülhen, 1995). La presencia de anti-SS-A/Ro cuando va asociado con anti-SS-B/La
Tabla 43-4
Especificidades de los autoanticuerpos en el lupus inducido por medicamentos: asociaciones o b s e r v a d a s m á s habitualmente en la bibliografía
Medicamento inductor
Especificidad a anticuerpo asociada (prevalencia)
Complejo |H2A-H2B]-ADN (95%), H1 y otras histonas individuales Complejo |H2A-H?B]-ADN (35%). histonas Hidralazina individuales H1. complejo |H2A-H2B)-ADN a-Metildopa Complejo |H2A-H2B)-ADN Isoniazida Complejo [H2A H2BJ-ADN D-Penicilamina Complejo [H2A-H2BJ-ADN (58%) histonas Quinidina individuales Complejo [H2A-H2BJ-ADN Acebutolol Histonas totales Carbamazepma Gotas oftálmicas Timolol Complejo |H2A-H2B)-ADN Procainamida
De von Muhlen CA, Tan. EM: Autoantibody specilicilies in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34 173. con permiso
CAPÍTULO 43 Tabla 43-5
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EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
Asociaciones clínicas frecuentes c o n el s í n d r o m e d e Sjogren
Artrilis reumaloide Tiroiditis auloinmune Lupus entemaloso sistèmico Hepatitis crónica activa Pohdermatomiositis Crioglobulmemia mixta Enfermedad del tejido conectivo mixta Púrpura hipergammaglobulinémica Cirrosis biliar primaria Vasculitis necrotizante sistèmica
es indicativa de un síndrome de Sjogren primario, a veces coexistiendo con LES. La presencia de anticuerpos anti-SS-B es menor del 1% en artritis reumatoide (Tan, 1988). Existe también una asociación notable entre antiSS-A'Ro y la presencia de vasculitis sistémica y cutánea (Bylund. 1991). Se ha observado una asociación de los anticuerpos SS-A/Ro y vasculitis en pacientes con enfermedad de tejido conectivo no clasificada. Paprotnik (1999) encontró títulos fluctuantes de anticuerpos contra SS-A'Ro tanto en el síndrome de Sjogren primario como en el lupus eritematoso sistémico, pero sin correlaciones principales con la actividad de la enfermedad clínica.
ESCLERODERMIA La esclerosis sistémica (esclerodermia) es una enfermedad multisistémica del tejido conectivo de etiología desconocida donde son rasgos prominentes las lesiones vasculares y la fibrosis del tejido. La etiología de la esclerosis sistémica sigue sin conocerse bien. Los pacientes con esclerosis sistémica producen espontáneamente anticuerpos frente a antígenos nucleares, nucleolares, y mitocondriales (Reimer, 1990; Rothfield. 1992). Un paciente con esclerodermia generalmente tiene una heterogeneidad restringida de tipos de anticuerpos. Un paciente determinado raramente tiene más de un autoanticuerpo detectado. La Tabla 43-6 enumera los diversos tipos de autoanticuerpos descritos en la esclerodermia. Los pacientes con manifestaciones cutáneas difusas y de rápida progresión que afecten a las extremidades distales y a menudo proximales y el tronco tienen un riesgo mayor nesgo de desarrollar manifestaciones viscerales precoces. Incluidos en la clasificación de esclerodermia, se encuentra un subgrupo amplio de pacientes que tienen una forma del síndrome CREST (calcinosis del culis, fenómeno de fíaynaud, alteraciones de la motilidad esofágica, esclerodactilia y íelangiectasia). El subgrupo de pacientes CREST puede representar del 20% al 30% de todos los pacientes de esclerodermia (Fritzler, 1980). Los pacientes con la variante CREST tienen una afectación cutánea limitada a las extremidades distales de los dedos y la cara y generalmente un mejor diagnóstico y evolución clínica que los pacientes con afectación cutánea difusa.
Tabla 43-6
Anticuerpos frente a antígenos del centromero Los autoanticuerpos frente a antígenos del centròmero fueron detectados inicialmente por microscopia de inmunofluorescencia. El antigeno del centròmero fue localizado en la región condensada de la metafase de los cromosomas. En estudios de inmunotransferencia, los antigenos del centròmero constan de tres proteínas: 16 kDa, 80 kDa y 120 kDa. Existen autoanticuerpos de las proteínas del centròmero en el 50% al 80% de los pacientes con el subgrupo de esclerodermia llamado CREST. El veinticinco por ciento de los pacientes con fenómeno de Raynaud idiopàtico con otros signos o síntomas de CREST tienen anticuerpos anlicentrómero (Rothfield. 1992).
Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I) Un antigeno importante es Scl-70. que fue detectado inicialmente como una proteína de 70 kDa. Este fue más tarde reconocido como un producto de degradación de una proteina de 95 kDa. ADN Topoisomerasa I (Tan, 1989). El antigeno fue localizado en distribución puntiforme en el nucleoplasma y el nucleolo. En primeros estudios, los autoanticuerpos frente a Scl-70 se detectaron en el 20% de los pacientes con esclerodermia no seleccionados por estudios de inmunodifusión (Tan, 1982a). En estudios posteriores, se detectaron autoanticuerpos Scl-70 en el 75% de los pacientes con la forma difusa severa de esclerodermia por pruebas de inmunodifusión (Jarzabek-Chorzelska, 1986). Este último hallazgo probablemente se realizó por la mejor conservación del antigeno topoisomerasa I en las pruebas, asi como la demostración de una mayor prevalencia del autoanticuerpo Scl-70 en pacientes con la forma difusa severa de esclerodermia (Nakamura. 1992).
Anticuerpos frente a ARN polimerasas Tres ARN-polimerasas catalizan la transcripción de genes en ARN (von Mutilen, 1994). Los autoanticuerpos contra las ARN polimerasas tienden a aparecer al mismo tiempo en el mismo paciente, parecen ser específicos para esclerodermia y aparecen sobre todo en individuos con esclerodermia difusa.
Autoanticuerpos frente al antígeno nucleolar fibrilarina (U3-snRNP) El nombre fibrilarina procede de la localización del antigeno en el componente denso librilar del nucleolo. Los anticuerpos antifibrilarina se ven en hombres jóvenes con esclerodermia y minima afectación de las articulaciones (von Mühlen, 1994).
A u t o a n t í g e n o s y autoanticuerpos en esclerodermia
Autoantígeno Scl-70
Estructura molecular
ARN Pol I ARN Pol II ARN Pol III Fibrilarina U1-nRNP
100 kDa nativo y producto de d e g r a d a c i ó n 70 kDa. ADN topoisomerasa I Proteinas. 17, 80 y 140 kDa, localizadas en las placas de cinetocoro internas y externas Complejo ARN Poi l de proteínas subunidades. 210-211 kDa Transcribe RNAm Transcribe 5S RNAr. RNAt Proteína, 34 kDa, componente de partícula U3 RNP Complejo empalme-soma
V PM-ScL Ku
Complejo de 11 proteinas. 110-120 kDa Proteínas de unión a ADN
Th/To
Proteina, 40 kDa, complejos con RNAs 7S y 8S
NOR-90
Proteina, 90 kDa. localizada en la región organizadora del nucleolo
Centromero
979
Frecuencia de anticuerpo 70% en esclerodermia; 20-59% en todos los pacientes; 13% en CREST 57%-82% en CREST. 8% en lorma difusa 4%-20% en esclerodermia. 13% en forma difusa 4% 23% en esclerodermia; 45% en forma difusa; 6% en CREST 6%-8%; 5% en forma difusa, 10% en CREST 2%-5% en todos los pacientes; 24% en PM/ superposición de esclerodermia 2%-5%; 24% en PM7 superposición de esclerodermia 1%-14% en esclerodermia; 26-55% en PM/ superposición de esclerodermia 4%-10% en esclerodermia; 1-11% en forma difusa, 8-19% en CREST, hasta el 3% en PM/superposición de esclerodermia Raro
980
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Anticuerpos dirigidos a la región organizadora nuclear Los anticuerpos de la región organizadora nuclear (NOR)-90 reconocen el factor de transcripción hUBF (human upstream oinding /actor) de la ARN polimerasa I en el centro fibrilar del nucléolo. Los ÑOR son regiones donde los nucléolos se reconstituyen después de la mitosis, con grupos de genes ARN ribosomales, y zonas donde los antigenos Scl-70. U3-ARN/librilarina, NOR-90 y ARN polimerasa I pueden ser detectados (von Mutilen. 1994).
ARTRITIS REUMATOIDE
ponente esencial en los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (Schellekens. 1998). Esta prueba de inmunofluorescencia es sensible pero menos especifica que AKA en pacientes con AR. Entre un 49% y un 87% de pruebas APF-positivas se han descrito en pacientes con AR (Aho. 1994; Janssens. 1988) y hasta un 5% en otras enfermedades del tejido conectivo o en controles normales. Tanto el AKA como el factor antiperinuclear se han descrito en AR seronegativa en su primera etapa, permitiendo una clara mejora en el diagnóstico de la enfermedad. Se llevó a cabo un ELISA utilizando lilagrina publicada de epidermis humana, con una sensibilidad que iguala la de AKA (Palosuo. 1998),
Anticuerpo frente al antígeno nuclear asociado a artritis reumatoide
La AR es una alteración sistémica autoinmune que se caracteriza por una artritis crónica, simétrica y erosiva de las articulaciones periféricas. Un gran porcentaje de pacientes presenta títulos elevados de factores reumatoides séricos. Existen manifestaciones asociadas no articulares, como nodulos subcutáneos, vasculitis. fibrosis intersticial y otras similares. Los síndromes de Sjógren y Felty se producen habitualmente con AR. Se desconoce la causa primaria de AR. La mayoría de los pacientes con AR tienen los alelos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) Clase II DR4. DR1 o ambos (Schumacher, 1993). La AR está asociada con varios anticuerpos, que pueden servir como marcadores de diagnóstico y pronóstico (Aho, 1994; Viander. 1997). Estos incluyen: 1. Factor reumatoide (RF) 2. Anticuerpo antiqueratína (AKA) 3. Factor antipennuclear (APF) 4. Anticuerpo (rente a antígeno nuclear asociado a AR (RANA) 5. Anti-RA33 Los tres primeros, y posiblemente anti-RA33, pueden preceder al inicio de la AR clínica.
Factor reumatoide
El anticuerpo frente a RANA se encontró en pacientes con síndrome de Sjógren asociado a AR (Tan. 1989). Se descubrió, por estudios microscópicos de inmunofluorescencia. que el RANA estaba localizado en el núcleo de forma finamente moteada. El RANA no fue detectable en cortes tisulares de muchos órganos en ratón, mono y humanos. Se detectó también en dos líneas de células T humanas (Molí 4 y 1301) pero fue detectado en los núcleos de tres lineas de células B (WIL2. Raji y Daudi). Las líneas de células B albergaban virus de Epstem-Barr (EBV). mientras que las líneas de células T no. Existia una clara relación entre RANA y EBV. Antes de la transformación de los linlocilos con EBV, las células eran negativas para RANA. Sin embargo, después de la transformación, los antígenos RANA se encontraban en el núcleo (Tan. 1989). El anticuerpo anti-EA (un antigeno prematuro de EBV) estaba presente también con mayor frecuencia en pacientes con AR. En un estudio, se observó un gran número de pacientes con AR con títulos altos (>1:20) de anti-EA (Fenell. 1981). El lazo de unión entre EBV. AR y RANA no ha sido definitivamente establecido. El fenotipo HLA. EBV y, durante la infección, las deficiencias de inmunorregulación y reactivación de células infectadas por EBV latentes pueden jugar un papel en la patogénesis de la enfermedad (Nakamura, 1992). En los primeros estudios con análisis de inmunodifusión, se delectaron anti-RANA en dos tercios de los pacientes con AR (Tan, 1982a, 1989). Sin embargo, en artículos posteriores, se encontró que la incidencia de anti- RANA estaba por encima del 90% en pacientes con AR (Tan, 1988). En sujetos controles normales la frecuencia de anti-RANA variaba del 6 c al 25% (Tan, 1988). Los estudios seroepidemiológicos para anticuerpos virales de EB en AR han mostrado que había una frecuencia mayor de pacientes con AR con títulos altos (>1:320) de anticuerpos frente al antígeno de cápside viral EB. No hubo diferencia en la frecuencia del antigeno nuclear anti-EB o los títulos entre los pacientes con AR y los normales (Ferrell, 1981). 3
Este anticuerpo está dirigido contra la porción Fe de la molécula IgG. Los estudios del FR monoclonal y policlonal han mostrado un RF polirreactivo con especificidad de unión por sustancias distintas de IgG. como componentes nucleares (Schumacher. 1993). El FR polirreactivo generalmente es de la clase IgM con baja afinidad. El FR no es específico para AR, y a menudo se observa en casos de infecciones crónicas y otras condiciones. El FR en las enfermedades reumáticas tiene una heterogeneidad inmunoquímica considerable. Junto con el FR IgM común, se han detectado tanto FR IgA como FR IgG. El FR IgA se ha visto recientemente que está relacionado con enfermedad grave con erosiones. La mayoría de los FR en suero de los pacientes con AR reaccionan con la zona Ga no alotípica (o yl-2-4) presente en las moléculas de lgG1, lgG2 e lgG4. El FR reactivo con los grupos GM alotípicos presentes en lgG1 e lgG3 también pueden existir en el suero de los pacientes con AR. Además, el grupo de los FR está entre los únicos anticuerpos que claramente muestran que están involucrados en la patogénesis de la enfermedad (Smolen, 1998).
Anticuerpo antiqueratína Este anticuerpo reacciona con la capa córnea del esófago de rala (Young. 1979), El AKA es un marcador para AR bastante específico pero no muy sensible. La aparición de reacciones positivas en suero AR es del 36% al 59% y de 0% al 3% en individuos sanos normales (Aho, 1994). La mayoría de los sueros antiqueratína positivo son también reactivos con el factor antíperinuclear, sugiriendo que ambos antigenos comparten algunas semejanzas.
Anti-RA33 y relación con la artritis reumatoide Hassfeld (1989) ha descrito un anticuerpo antinuclear (anti-RA33) que puede ser específico para la AR. A partir de extractos de células Hela, se descubrió un antigeno de aproximadamente 33 kDa que reaccionaba con el 36% de los 95 sueros de pacientes AR y con sólo 1 de 170 pacientes control. El antígeno fue denominado RA33. y el autoanticuerpo no tiene una relación perceptible con otros anticuerpos antmucleares. El anli-RA33 no estaba relacionado con anti-histona. De 11 pacientes AR con anti-RANA, seis fueron positivos para anti-RA33. De los cinco sueros anti-RANA negativos, dos fueron positivos para anti-RA33. (Hassfeld. 1989). Los análisis de inmunotransferencia con extractos solubles de células Hela mostraban un autoanticuerpo dirigido frente a un antigeno de 33 kDa (anti-RA33) en el 30% de pacientes AR austríacos y ninguno en pacientes con espondilitis anquilosante o artritis psoriásica (Aho, 1994). Sin embargo, se observó una prevalencia de anti-RA33 en finlandeses con AR del 6% (Aho, 1994).
POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS Factor antiperinuclear Este anticuerpo es reactivo con granulos de queratohialma perinucleares de las células de la mucosa bucal. El aminoácido citrulina parece ser un com-
La pohmiositis (PM) es una enfermedad inflamatoria del músculo estriado de etiología desconocida. Se caracteriza por la presencia de infiltrados infla-
CAPÍTULO 43
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EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
matónos en el músculo esquelético, con necrosis de fibras musculares y degeneración asociadas (Targoff, 1992). Cuando la enfermedad se acompaña de cambios típicos en la piel, se denomina dermatomiositis. La polimiositis se caracteriza serológicamente por la presencia de un número de anticuerpos de vanas especificaciones dirigidos contra diferentes sintetasas de ARN de transferencia (RNAt) (von Múhlen, 1994) (Tabla 43-7). Estos anticuerpos definen un subgrupo de pacientes con PM. artralgia. enfermedad pulmonar intersticial y un diagnóstico más insuficiente que los pacientes sin los autoanticuerpos. Los anticuerpos frente a Jo-1 (histidil RNAt smtetasa) aparecen en el 23% al 36% de los pacientes PM. teniendo la mayoría la enfermedad pulmonar intersticial (Targoff. 1992). Los autoanticuerpos frente a treonil y alanil RNAt-síntetasa aparecen con una prevalencia más baja en la miositis autoinmune. Se ha descrito en pacientes con un síndrome clínico que muestren rasgos solapados de polimiositis y esclerodermia, un anticuerpo denominado anti- PM-Scl (Tan. 1988). El anticuerpo anti- PM-Scl reacciona con un complejo de 11 polipeptidos que van de 110 a 120 kDa. El Anti-PM-Scl muestra coloración del nucléolo y nucleoplasma de las células del sustrato por microscopía de inmunofluorescencia indirecta.
mera publicación presentaban una combinación de rasgos generalmente asociados a LES, esclerosis sistémica y polimiositis. De modo característico, por hemaglutmación se detectó un título alto de autoanticuerpos frente a una ribonucleoproteína nuclear en todos los pacientes (Sharp. 1972). La falta de anormalidades renales y neurológicas y la excelente respuesta de estos pacientes a pequeñas dosis de corticoides orales justificó inicialmente la clasificación de estos pacientes como un grupo separado de LES y esclerosis sistémica. Sin embargo, el concepto de MCTD como un grupo separado ha cambiado con el tiempo. Muchos piensan que MCTD representa un solapamiento de esclerosis sistémica. LES y polimiositis (Nimelstein, 1980). Un grupo de pacientes diagnosticados inicialmente como MCTD lueron estudiados de nuevo ocho años más tarde y mostraron una evolución general fuera del patrón de superposición al de una enfermedad única, siendo el diagnóstico más prevalente el de esclerodermia (Nimelstein, 1980). Parece haber una gran superposición que se manifiesta cuando los criterios antes mencionados se aplican a una determinada población de pacientes, y los estudios no confirman totalmente la existencia de MCTD como una entidad clínica individual
BIOLOGÍA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS ANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
SÍNDROME DE ASTENIA CRÓNICA Aunque no pertenece al clásico concepto de enfermedades del tejido conectivo difuso, el síndrome de astenia crónica (SFC) en una enfermedad con afectación sistémica que se ha demostrado que está relacionada con la presencia de autoanticuerpos (von Mikecz, 1997). De 60 pacientes SFC, el 68% fueron positivos para ANA. Utilizando células Hep-2, los autores pudieron obtener palrones nucleolares (13%), moteados (25%), periféricos (52%) y moteados densos y finos (5%). Los estudios de co-localización mostraron unas proteínas asociadas a láminas, factor SC-35 de empalme RNP, y vimentina como posibles dianas, en lo que parece ser una selección para antígenos celulares insoluoles. La alta frecuencia de autoanticuerpos en el SFC puede ayudar a distinguir esta entidad de otras enfermedades sistémicas reumáticas.
981
Muchos de los autoanticuerpos intracelulares, incluyendo los ANA, se han identificado como marcadores de diagnóstico para las enfermedades reumáticas, como el LES. esclerodermia. síndrome de Sjógren, MCTD. lupus inducido por medicamentos y polimiositis/dermatomiositis (Tan. 1989). Los autoanticuerpos en las enfermedades del hombre se han utilizado como herramientas para estudiar varias funciones biológicas moleculares y mecanismos. Los ANA se han utilizado para investigar bibliotecas de expresión de DNAc. con posterior identificación de autoantigenos. Se han estudiado y aclarado las funciones biológicas de muchos de los autoanticuerpos inducidos por autoantigenos. Las funciones biológicas que se han demostrado que los anticuerpos inhiben son el empalme del pre-ARNm, replicación del ADN. reparación del ADN, transcripción, transcripción de ARNr, movimiento del cromosoma basado en el microtúbulo durante la mitosis, y aminoacetilación de ARNt (Tan, 1988, 1989; Casiano. 1996; Tan. 1997).
CONCEPTO DE SÍNDROMES DE SUPERPOSICIÓN El síndrome de superposición se utiliza para describir a los pacientes que muestran síntomas de más de una enfermedad. Por ejemplo, se han descrito pacientes que reúnen los criterios diagnósticos para LES y también tienen manifestaciones que sugieren un segundo diagnóstico como la AR (Lázaro, 1989). Se duda de si los síndromes de superposición pueden representar la coexistencia de dos o más enfermedades diferentes, o si el síndrome constituye una entidad diferente.
Enfermedad mixta del tejido conectivo El concepto de enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) fue propuesto inicialmente por Sharp (1972). Los 20 pacientes descritos en la pri-
Tabla 43-7
PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMICAS Se ha observado que existen distintos perfiles de ANA en dilerentes enfermedades reumáticas sistémicas. Algunas características de éstas incluyen la presencia o ausencia de ciertos anticuerpos y diferencias en los titulos medios de estos anticuerpos (Nakamura. 1986; Tan. 1988). No obstante, se debería tener cuidado del bajo valor predictivo positivo de la prueba de ANA en grupos con una baja prevalencia de enfermedades reumáticas sistémicas y en una población de edad (Slater, 1996). Deben reseñarse las siguientes características:
A u t o a n t i g e n o s y autoanticuerpos e n pollmiosltis ( P M ) y dermatomiositis ( D M )
Autoanligeno
Estructura molecular
Frecuencia de anticuerpo
Jo-1
Proteina histidil ARNt sintetasa. 52 kDa
23%-36%
PL-7
Proteina treonil ARNI sintetasa. 80 kDa
4% en PM
PL-12
Proteina alanil ARNt sintetasa. 110 kDa
3%
Mi-2
Complejo proteina nuclear, proteínas 53 y 61 kDa
15%-35% en PM. 5%-9% en DM
Partícula de reconocimiento
Proteina, 54 kDa. en complejo con 7 SL ARN
4%-5% en PM, no se produce en DM
PM-Scl
Complejo de 1t proteinas. 110-120 kDa
8%-12% en PM. 25% en PM/ superpo:
UtnRNP
Complejo espliceosoma
4%-17%en PM/DM
56 kDa
56 kDa, componente RNP
80%
EJ
Glicil-RNAt sintetasa
<3% en PM
0J
Isoleucil-ARNt sintetasa
<3% en PM
de serial (SRP)
de Tan ( 1988). Nakamura (1992) y von Mühlen y Tan ( ¡994)
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
1 Múltiples ANA observados frecuentemente en LES. a menudo con altos niveles de anticuerpos anti-ds-ADN. 2. Distinción de anti- Sm para LES. 3. Restricción de ANA en lupus inducido por medicamentos a anticuerpos antihistona. 4. Anticuerpos frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares frente a RNP presentes en varias enfermedades reumáticas con diferentes frecuencias. 5. La restricción de ANA en MCTD frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares RNP. 6. Sueros de síndrome de Sjógren caracterizados primariamente por la presencia de anticuerpos frente a SS-A'Ro y SS-B'La. 7. Pacientes con esclerodermia mostrando un perfil consistente en anticuerpos frente a Scl-70, el antígeno centrómero/cinetocoro y antígenos nucleares. 8. La presencia frecuente de RE AKA. APF. anti-RA33 y RANA en artritis reumatoide. 9. La presencia de autoanticuerpos Jo-1. Mi-2 y PM-Scl en PM/DM.
TABLA DE DECISIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES La microscopía de inmunofluorescencia mediante extractos celulares humanos, como células Hep-2. permite la detección sensible de anticuerpos en suero que reaccionan muy específicamente con varias proteínas celulares y ácidos nucleicos. Esta técnica es esencial en laboratorios de inmunología dedicados al diagnóstico rutinario de las enfermedades autoinmunes humanas. De una inmunofluorescencia positiva se puede asociar el patrón específico con la presencia de un autoanticuerpo distinto en el suero de ese paciente particular. Como los patrones de los distintos autoanticuerpos aparecen en las distintas enfermedades, como se trató previamente, los laboratorios ofrecen al médico la posibilidad real de reducir la búsqueda del diagnóstico. En la Tabla 43-8 se desarrolla una tabla de decisión teniendo en cuenta todo esto, así como la clasificación del patrón citoplasmático para utilizarse en el laboratorio de rutina (Tabla 43-9). Las Figuras 43-1,43-2 y 43-3 representan algunos ejemplos de los patrones de inmunofluorescencia.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS Los métodos que habitualmente se utilizan en la detección de anticuerpos se enumeran en la Tabla 43-10. Una prueba ampliamente utilizada en el cribado de autoanticuerpos intracelulares es la microscopía de inmunofluorescencia (IFM) y las pruebas de inmunoenzimas (Nakamura, 1994b). Las pruebas secundarias definitivas para la identificación específica de ANA son la inmunodifusión. inmunoprecipitación, aglutinación de partículas, mmunoenzima, inmunotransferencia y métodos de radioinmunoanálisis (Teodorescu. 1992). La estandarización de la inmunofluorescencia indirecta (IF)-ANA ha resultado muy difícil (Nakamura. 1992; Fellkamp. 1996: Smolen. 1997). Muchos factores están implicados en la realización de las pruebas IF-ANA. Incluyen 1) el sustrato y las variaciones de fijación, 2) óptica microscópica, 3) método y cuantificación de resultados, 4) establecimiento del rango de referencia, 5) interpretación de resultados, 6) sueros de referencia, y 7) especificidad y avidez de los ANA. El Comité de Estandarización de ANA de la Organización Mundial de la Salud recomienda que 1) los laboratorios deberían comunicar los resultados IF-ANA a ambas diluciones, 1:40 y 1:60, y 2) deberían proporcionar información del porcentaje de individuos normales que son positivos a esas diluciones dentro de su propia experiencia (Tan. 1997). Bylund y Nakamura (1991) han mostrado la importancia de la detección de los autoanticuerpos SS-A/Ro en las pruebas de cribaje de autoanti-
cuerpos frente a antígenos nucleares. La detección de anti-SS-A/Ro requiere de la implantación y cumplimiento de varias recomendaciones técnicas y de garantía de calidad. Con el uso de las células de sustrato apropiadas que contengan el antígeno SS-A/Ro, muchos de los llamados pacientes lupus eritematoso ANA-negativos mostrarán resultados positivos en la inmunofluorescencia indirecta, Los análisis de inmunoprecipitina y doble inmunodifusión (ID) se han utilizado para determinar la especificidad de varios ANA. La especificidad del ensayo en doble inmunodifusión depende generalmente de la calidad de los otros sueros control usados en el procedimiento, asi como de la naturaleza de la preparación del antigeno. Las pruebas de inmunodifusión no son muy sensibles. Las pruebas de inmunodifusión positivas tienen un alto grado de especificidad como marcador diagnóstico en ciertas enfermedades reumáticas Existen equipos comerciales de inmunodifusión disponibles para la detección de anticuerpos frente a RNP. Sm, SS-A/Ro. SSS-B/La y Scl-70, asi como otros marcadores menos comunes (Nakamura, 1994b). En la pasada década se han desarrollado un número creciente de enzimoinmunoanálisis con el uso de antígenos estándar purificados y recombinantes (Saitta, 1992). Muchos de estos enzimoínmunoanálisis han demostrado ser más sensibles que los métodos de inmunodifusión análogos. Asi, debido a la alta sensibilidad de los enzimoínmunoanálisis, se necesita determinar el rango de referencia de pacientes normales y los valores discriminantes apropiados. Comparadas con las pruebas de inmunodifusión. las pruebas ELISA mostraron una sensibilidad mucho mayor pero tenían una especificidad menor (Nakamura, 1992). Además, las pruebas ELISA eran frecuentemente positivas en títulos bajos para anticuerpos en sueros de pacientes con enfermedades reumáticas que no fueran LES. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos frente a Sm en pruebas de inmunodifusión se considera como altamente especifica para LES. Sin embargo, en las pruebas ELISA el anlicuerpo Sm
Tabla 43-8 Tabla d e decisión para la identificación de algunos autoanticuerpos u s a n d o células HEp-2 y su asociación con la e n f e r m e d a d 1 Patrón nuclear Envoltura (bordo) Punteado, figura mitótica negativa -> CBP Continuo, figura mitótica negativa -> enfermedades hepáticas crónicas Homogéneo, figura mitótica negativa -> LES, LES inducido por medicamentos Moteado Grande -> hnRNP en LES, Grueso -> Sm, RNP en LES. MCTD Fino -» SS-A/Ro. SS-B/La en LES. SS Pleomorfo -» PCNA en LES Discreto Figura mitótica positiva - * centrómero en SCL Figura mitótica negativa -> p95 en PBC 2 Patrón nucleolar Homogéneo -> PM-Scl en SCL Con grumos -> librilarma en SCL Moteado Figura mitótica punteada -»ARN pol I. NOR-90 en SCL Figura mitótica homogénea -» Scl-70 en SCL 3 Patrón citoplasmático Manchas densas finas -•Jo-1. PL-7 PL-12 en PM/DM Homogéneo -> rRNP en LES Fibrilar -> actina, miosina en MCTD, CBP, HCA Segmentario -> a-actinma, vinculina en MG. EC, CU Reticular -> mitocondna en CBP Polar -> Golgi en SS, LES, infecciones virales Aparato fusiforme -> NuMA en SS, mediocuerpo, p330' en cáncer CBP= Cirrosis biliar primaria: LES = lupus eritemaloso sistomico: MCTD = enfermedad del tejido conectivo mixto. SS = síndrome de Siogron, SCL =esclerodermia. PM = polimiosilis; DM = dermatomiositis; HCA = hepatitis crónica i autoinmune, EC = enfermedad de Crohn: CU = colitis ulcerosa. PCNA » antígeno nuclear de células proliferativas; NuMA = aniigeno nuclear milOlico-ascciado Modificado de Krapl AR. von Mutilen CA Krapf FE. y coi: Atlas ol Immunofluo^rescent Autoaniibodies. Munich. Urban & Schwarzenberg, 1996 con permiso J
CAPÍTULO 43 Tabla 43-9
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EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
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Clasificación de patrones citoplasmáticos en inmunofluorescencia indirecta
Patrones citoplásmicos en IIF (substrato celular) 1. Fibroso Fibras de estrés libras lineales citoesqueléticas. algunas veces con depósitos granulares pequeños (HEp-2. fibroblastos)
Enfermedades y asociaciones clínicas
Antígenos representativos Actina, míosina no muscular
Ambos en hepatitis crónica activa, cirrosis hepática y miastenia gravis: actina en hepatitis autommune. enfermedad de Crohn СВР. hemodiálisis a largo plazo. SHN. pero raro en DCTD
Filamentoso- filamentos y fibrillas separándose del borde nuclear (HEp-2, PIK2 cólulas epiteliales)
Vimentina. queratina
Antivimentina a menudo causada por reacción cruzada con anticuerpos anti-hélix en muchas clases de condiciones inlecciosas o inflamatorias, y en hemodiálisis a largo plazo; raro en DCTD, ambos vistos en SHN: la queratina es sistema principal en EHA (69%). también común en DCTD y psoriasis
Segmental - sólo pequeños segmentos de fibras (cuerpos densos periódicos) están decoradas (HEp-2. fibroblastos)
a-actinma, vinculina. tropormosina
Miastenia gravis. enfermedad de Crohn. colitis ulcerosa
2. Moteado Moteado tino: pequeñas motas esparcidas, la mayoría con londo homogéneo o moteado denso fino (HEp-2) Moteado denso tino nuboso, casi homogéneo en todo el citoplasma (HEp-2) Polo granular, perinuclear, en forma de flecha, granular grueso, correspondiente a los apilados laminares del complejo Golgi (HEp-2) Reticular gruesa reticular grueso difuso y granular (HEp-2) Pequeños moteados esparcidos: irregularmente distribuidas molas citoplasmáticas contables (HEp-2) Reticular lino - reticular lino difuso y granular (HEp-2) AWCA-pANCA tinción perinuclear irregular; cANCA: motas densas, finas o gruesas (granulocitos de sangro periférica, línea celular de leucemia HL-60)
Muchas de las ammoacil-RNAt-sintetasas. PM: "sindrome Jo-1" (miositis y enlermedad pulmonar intersticial) principalmente Jo-1 rRNP. fosfoproteinas ribosomales
LES neuropsiquiátrico
Aparato de Golgi
Raro en LES, SS y otras enfermedades reumáticas sistémicas; descrito en ataxia cerebelosa idiopàtica, degeneración cerebelosa paraneoplásica e infecciones virales, incluyendo EBV y VIH
Proteínas en la membrana mitocondnai interna (M2 principalmente)
CBP; esclerosis sistèmica (43%). raro en otras DCTD. anticuerpos del centròmero están frecuentemente asociados Ninguno reconocido
Lisosomas o peroxisomas
Retículo endoplásmico(¿); otras proteínas desconocidas Dianas pANCA mieloperoxidasa. cANCA dianas PR3 (proleinasa 3)
EHC. detectado en todos los tipos de condiciones inflamatorias (crónicas) Descrito primero en vasculitis sistémica con glomerulonefritis necrolizante y enfermedad pulmonar inflamatoria: granulomatosis de Wegener (cANCA) y otras vasculitis necrotizantes (pANCA); catepsma-G es el antigeno principal en colilis ulcerosa, enfermedad de Crohn y colangitis primaria esclerosante hepatitis autommune; vasculitis en terapia PTU: recientemente descrito en AR (32%). IgM ANCA en tuberculosis y malaria
ANCA = anticuerpos citoplásmicos antineutrotilos, EHA = enfermedad hepática alcohólica; EHC = enlermedad hepática crónica. DCTD • enfermedad ditusa del tejido conectivo; EBV = virus EpsteinBarr; VIH = virus de inmunodeficiencia adquirida; IIF = test de mmunolluorescencia indirecta. SHN • suero humano normal; CBP = cirrosis biliar primaria: PM = polimiositis. PTU - propiltiouracilo. RNP • ribonucleoproleina, SS = sindrome de Sjogren: LES • lupus eritemaloso sistemico Modificado de von Múhlen CA, Tan EM Autoantibody specificities in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34:173. con permiso
era positivo en el 23% de 54 pacientes AR, 25% de 24 pacientes con esclerosis sistémica, 9% de 11 pacientes con polimiositis, y el 2% de 59 pacientes normales (Maddison, 1985). Una sensibilidad creciente y una especificidad decreciente podrían provocar falsos positivos en las pruebas. Ademas, se determinaron asociaciones clínicas con distintos anticuerpos principalmente utilizando técnicas de ID.
VARIACIONES EN LAS METODOLOGÍAS USADAS PARA LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES Los mejores estudios referentes a los diferentes métodos para la detección de autoanticuerpos frente a antigenos intracelulares fueron descritos por un Grupo de Estudio de Consenso Europeo. El Grupo de Estudio de Consenso Europeo para la Detección de Autoanticuerpos frente a Antígenos Intracelulares en Enlermedades Reumáticas se formó en 1988 y ha dirigido cuatro talleres
anuales desde 1989 hasta 1992 (Charles. 1992; Van Venrooij, 1991). En 1988 y 1989, se dirigieron talleres de consenso para definir la concordancia entre laboratorios en la detección de especificidades de autoanticuerpos en enfermedades reumáticas. Veintiocho laboratorios participaron en el estudio y utilizaron diversas metodologías. Los objetivos del estudio del consenso iniciado en 1989 fueron 1) definir el consenso entre laboratorios en cuanto a la detección de autoanticuerpos y especificidades. 2) probar si las discrepancias eran debidas a la metodología utilizada, y 3) hacer recomendaciones para la calidad mejorada de resultados con sensibilidad mejorada y mayor especificidad.
Enzimoinmunoanálísis En los estudios de 1988 y 1989. se observaron muchas reacciones falsopositivas. Las reacciones falso-positivas estaban causadas por reactivos bloqueantes de baja calidad en el proceso; también, se usaban preparaciones de antigeno impuro. En el estudio de cooperación de 1990 y 1991. el laboratorio que usaba ELISA funcionó muy bien, con pocos falso-positivos o resultados negativos extraños. Los ELISA también funcionaron bien al clasificar los sueros con múltiples especificidades. El porcentaje de laborato-
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
CAPÍTULO 43
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EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
Figura 43-2. Inmunolluorescencia indirecta de células HEp-2 con auloanticuerpos para distinguir amígenos citoplasmáticos (x400. mancha FITC). A. Se observa el patrón característico de autoanticuerpos frente al aparato de Golgi. con granulos organizados en grupos en un poio de la célula y respetando los núcleos. B. Los autoanticuerpos frente a miosina no muscular adornan las fibras de estrés del citoesgueleto. Estos autoanticuerpos se encuentran en pacientes con miastenia gravis y enfermedades hepáticas crónicas. C, Autoanticuerpos antimitocondriales presentan un patrón granular grueso que incluye todo el citoplasma, observado sobre todo en cirrosis biliar primaria. Distintos puntos en el nucleoplasma obtenidos por el suero utilizado están determinados probablemente por una segunda población de autoanticuerpos dirigidos contra un antígeno mtranucleoplásmico, un fenómeno no poco habitual en pacientes con enfermedades hepáticas. D. El patrón citoplasmático granular denso, casi homogéneo, obtenido con anticuerpos anti-r RNP. Ellos se dirigen a fosfoproteinas nbosomales. y se asocian clínicamente con manileslaciones del sistema nervioso central en pacientes con lupus eritematoso sistémico. Como se puede ver en el dibujo, no es infrecuente que estos anticuerpos también tiñan el nucléolo en un patrón homogéneo, aunque débilmente. (De von Mühlen CA. Tan EM: Autoantibody specilicilies in autoimmure rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173; con permiso.) Figura 43-1. Inmunolluorescencia indirecta con autoanticuerpos frente a antígenos nucleares y nucleolares en células HEp-2 (x40C. mancha FITC) A, Autoanticuerpos frente a proteínas laminares A, B y C de la envoltura nuclear dan un patrón homogéneo nuclear en células HEp-2, asociados con un borde nucleoplásmico continuo. No se observa ningún borde cuando los anticuerpos se dirigen contra histonas o ds-ADN. Los artículos previos sobre un patrón periférico obtenido por anticuerpos anti-ds-ADN probablemente se debían a arielactos de fijación. El patrón nucleoplásmico moteado que se ve en fies característico de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos nucleares extraibles. como el anli-U1-nRNP mostrado aqui. Los nucléolos y las células en metafase son negativos. C, Autoanticuerpos anticenlrómero, observados típicamente en pacientes con la forma limitada de esclerodermia (síndrome de CREST). pero también en cirrosis biliar primaria. Se observan distintas manchas en el núcleo en interfase. una por cada par de cromosomas, que se reúnen en las placas de metafase durante la división de la célula (en el centro dos células en telofase). Autoanticuerpos frente a NOR-90 y ARN-polimerasa I obtienen el mismo patrón en células HEp-2 (D). con motas nucleolares y puntos a lo largo de algunos husos de las células en metafase (en las dos células dividiéndose en el centro). Pueden diferenciarse por otros ensayos, como la mmunotransferencia o la mmunoprecipítación. Los autoanticuerpos que se dirigen contra la fibrilarina (U3-nRNP) liñen de forma grumosa lodos los nucléolos (£). (De von Múhlen CA. Tan EM: Auloantibody specificities in autoimmuñe rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173: con permiso.)
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Figura 43-3. Algunos otros patrones distintos en ¡nmunofluorescencia indirecta de células HEp-2 (x 400, mancha FITC). A. Células al final de la metalase muestran antigenos que se condensan en la mitad del cuerpo, también lamada la región de puente intercelular. Los polos del huso de las células en división pueden estar adornados, como en 0, con anticuerpos frente al aparato mitótico. como NuMA (proteina nuclear asociada a la mitosis). Los autoanticuerpos PCNA ofrecen un mosaico de patrones nucleoplásmicos (C), que oscilan desde homogéneos a distintos moteados, según las fases de la división celular (detalles en el texto). D, El patrón obtenido con autoanticuerpos anti-p80-coilín, donde se pueden ver de una a ocho manchas nucleoplásmicas. (De von Mühlen CA, Tan EM: Autoantibody specilicities in autoimmune rheumalic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173, con permiso.)
Tabla 43-10
M é t o d o s d e detección de anticuerpos contra antígenos nucleares e intracelulares Método
Extracción del antigeno
Sensibilidad y utilidad
Inmunofluorescencia con microscopía (IFM)
Sección tisular, lineas celulares
Técnica sensible, utilizada a menudo como detección precoz
Inmunodilusión doble (ID)
Tejido y extractos celulares
Necesita una reacción de precipitación, alta especificada
Recuento por mmunoelectroloresis
Tejido y extractos celulares
Elevada sensibilidad y velocidad comparada con las técnicas de ID
Inmunoblot; Western blot (IB. WB)
Extractos celulares
Alta sensiblidad, permite la detección de anticuerpos Irente a antigenos solubres c insolubles
ELISA
Antígenos nativos purificados o recombinantes
Alta sensibilidad y cuantilicación. puede determinar la clase de anticuerpo
pero baja sensibilidad
From Nakamura RM. Bylund DJ. Ian EM: Curent status ol available standards for quality improvement ot assays tor the detection of autoantibodies to nuclear and intracellular antigens J Clin Lab anal 1994b: 8:360. con autorización.
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dad para los mejores reactivos comerciales es la revisión periódica del Colegio de Inmunopatólogos Americanos.
Inmunotransferencia Esta técnica es muy sensible y es un importante método para la caracterización de la naturaleza específica de muchos de los autoanticuerpos. Una importante ventaja del método es que un anticuerpo especifico puede ser identificado mediante preparaciones de extractos de antígeno de células natural (Fig. 43-4). El Estudio de Consenso Europeo observó lo siguiente con el procedimiento de inmunotransferencia (Nakamura, 1994b):
SDS-PACI : l- • yol
1. La preparación del antígeno es muy importante en el procedimiento de inmunotransferencia 2. La detección de anticuerpos frente a nRNP. Sm y Scl-70 fue aceptable. Este método sensible es útil en la detección de múltiples especificidades de anticuerpo en la misma muestra. 3. El método requiere controles cuidadosos a las bandas de peso molecular. Por ejemplo, las bandas de histona pueden ser confundidas con un antigeno centromérico (CENP-A, 19 kDa) y Scl-70 (topoisomerasa I) puede ser confundido con otras bandas de100 kDa. 4. La degradación de proteínas puede producirse en el extracto de células de antigeno usadas para inmunotransferencia, especialmente Scl-70 y antigenos de centrómero. 5. El anti-Sm se distingue por la presencia de anti-D (el antigeno D es una proteína de 16 kDa contenida en todas las partículas principales nRNP). 6. Anti-SS-B/La se detecta enseguida por inmunotransferencia. Anti-SS-A'Ro se detecta mal por inmunotransferencia y es insensible, porque SS-A'Ro puede no demostrar la estructura apropiada para el reconocimiento.
t u r a d o «Ir iinli|>i'iiii: I I K L I la célula VIOIT-4 Sislenia lie ili'li'ccii'in: l-pnuciiiu A
Figura 43-4. Ensayo de immunotranslerencia de autoanticuerpos comunes observados en enfermedades reumáticas. En la banda 1 la zona de nitrocelulosa fue investigada en un suero humano normal (control negativo), no apreciándose ninguna reactividad, tal y como se esperaba. Las siguientes 3 bandas muestran distintas franjas obtenidas por sueros controles positivos mezclados conteniendo especificidades conocidas. La banda 2 representa reactividades con las nbonucleoproteinas (RNP) SSA (52 y 60 kOa), SSB (48 kDa), Sm (B/B\ 28 kDa, y D. 14 kDa) y U1-nRNP (la proteína de 70 kDa y una franja tenue alrededor 0e 19 kDa. el antigeno C; la proteína A. con 32 kDa y también reconocida de modo característico por anticuerpos U1- nRNP. no se ve en este experimento). La banda 3 muestra las franjas obtenidas usando los prototipos de antisueros humanos frente a Jo-1 (52 kDa), Ku (dos bandas alrededor de las regiones de 70 y 80 kDa) y RNP ribosomal (15, 18 y 37 kDa). La pequeña franja por encima del antígeno de 52 kDa no está identificada. La banda 4 presenta las Iranias vistas más comúnmente utilizando sueros de pacientes con esclerodermia, por ejemplo, anti-ADN topoisomerasa I (Scl-70. 95 kDa), y anticuerpos anticentrómero (16 kDa. CENP-A, y 80 kDa. CENP-B). A la derecha, se pueden ver posiciones en kilodaltons del amplio rango de pesos moleculares estándares. (De von MUhlen CA. Tan EM Autoantibody specificities m autoimmune rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994: 34:173, con permiso.)
RESUMEN
Hay muchos tipos de autoanticuerpos trente a antigenos intracelulares y nucleares en las diversas enfermedades reumáticas sistémicas. Normalmente, se considera importante no sólo detectar la presencia y cantidad del autoanticuerpo intracelular y nuclear en el paciente, sino también identilicar la especificidad inmunológica. Estudios anteriores han mostrado que distintos perfiles diagnósticos de los autoanticuerpos se observan en muchas de las enfermedades reumáticas. Algunas de las enfermedades se caracterizan por la presencia o ausencia de un anticuerpo especifico, o por diferencias en el nivel cuantitativo o titulo del anticuerpo. Se ha progresado mucho en mejorar la sensibilidad, especificidad y control de calidad de las diversas pruebas de laboratorio para la detección de autoanlicuerpos frente a antígenos intracelulares y nucleares. Los biólogos moleculares han utilizado muchos de los anticuerpos como sondas biológicas y han aclarado las lunciones biológicas de varios de los autoantígenos. Se ha progresado mucho en el conocimiento de la patogénesis y mecanismos inmunes en las enfermedades reumáticas.
BIBLIOGRAFÍA
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
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CAPÍTULO 43
•
EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS
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C A P Í T U L O
44
Vasculitis Rex M. McCallum, M.D. David J. Bylund, M.D.
CLASIFICACIÓN
990
PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS
990
PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLÍNICAS DE LABORATORIO
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES VASCULÍTICOSIDIOPÁTICOS Poliarteritis nodosa
991
Variantes de PAN
Pruebas de rutina
Síndrome de Churg-Strauss
Pruebas especiales
Síndrome mixto de poliangeítis
Algunos patrones de prueba en vasculitis
Granulomatosis de Wegener Granulomatosis linfomatoide
ANTICUERPOS ANTINEUTRÓFILOS CITOPLASMÁTICOS
993
992
Púrpura de Henoch-Schónlein
Métodos de detección
Arteritis de células gigantes (temporal)
Especificidad antigénica
Arteritis de Takayasu
Asociaciones con enfermedad
Angeítis primaria del sistema nervioso central
Interpretación de la prueba
Enfermedad de Kawasaki
Las manileslaciones clínicas y patológicas de la vasculitis necrotizante sistémica son proteicas. Los clínicos se enfrentan a un paciente que presenta una serie amplia de síntomas y/ o signos confusos y contradictorios. El diagnóstico de un síndrome vasculitico necrotizante sistémico requiere una evaluación minuciosa que relacione la historia de un determinado paciente y la exploración física con los datos de laboratorio. Aunque la vasculitis se puede producir en cualquier zona del cuerpo, se han definido patrones distintos de la enfermedad y su tipificación apunta hacia alteraciones determinadas. El diagnóstico específico es importante porque el Iratamiento y el pronóstico dependen de los lugares y patrones de la afectación del órgano (Langford. 1995). La vasculitis necrotizante sistémica puede definirse patológicamente como una inflamación causante de lesiones vasculares. Estas lesiones pueden incluir la proliferación de células íntimas dentro de la luz de los vasos, estrechando o incluso cerrando ese espacio y causando isquemia y un posible infarto de estructuras anatómicas distales al lugar del daño vascular. También, la pared del vaso puede debilitarse hasta formarse un aneurisma o la ruptura del vaso. La vasculitis idiopática (primaria) se produce cuando el daño inflamatorio vascular es el principal hallazgo clinicopatológico y no hay enfermedad subyacente. La vasculitis secundaria se produce cuando las lesiones vasculares acompañan a una enfermedad subyacente (Tabla 44-1). El foco de este capítulo es la vasculitis idiopática y aquellas pruebas clínicas de laboratorio útiles para su diagnóstico y tratamiento. Como los métodos de diagnóstico y tratamiento en los sucesos vasculares secundarios se centran en las enfermedades subyacentes, se tratan en los capítulos correspondientes de este libro. Sin embargo, los comentarios relacionados con la valoración de laboratorio del daño en el órgano distal en la vasculitis idiopática están relacionados con la vasculitis secundaria.
RESUMEN
998
BIBLIOGRAFÍA
998
CLASIFICACIÓN No existe un sistema de clasificación estándar ampliamente aceptado para las afecciones vasculares idiopáticas. Históricamente, su clasificación se ha basado en varias combinaciones de hallazgos clínicos y patológicos (Jennelte, 1998, 1997). aunque en los últimos años las clasificaciones activas han mejorado debido a los resultados en la nomenclatura estándar (Hoffman. 1998; Hunder, 1990; Jennette, 1994). El esquema de clasificación que aparece en la Tabla 44-2 está modificado a partir del utilizado en los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (Langford, 1995).
PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS Ni la etiología ni la patogénesis de las afecciones vasculares se conocen excepto en los ejemplos de daño directo en los vasos sanguíneos por infección vascular, o vasculitis secundaria. La mayoría de las alecciones vasculares idiopáticas se atribuyen a daños vasculares mediados por la inmunidad inducidos por alguno de varios mecanismos, incluyendo: 1) depósitos inmunocomplejos; 2) autoanticuerpos directos ligados o a estructuras de las paredes de los vasos (p. ej., endotelio o antígenos de la membrana basal) o a neutrófilos cuando la vasculitis está asociada con el anticuerpo antineutrófilo citoplasmático (ANCA); y 3) inflamación mediada por células T. Los efectos patogénicos de todos estos mecanismos se unen en una vía final común de daño vascular que activa los mediadores humorales y celulares de la inflamación. Las moléculas de adhesión que están involucradas en la respuesta inmune normal parecen intervenir en las respuestas inmunes patológicas
CAPÍTULO 44
Tabla 44-1
•
Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas secundarias
Vasculitis relacionada con medicamentos Vasculitis relacionada con proteínas extrañas Vasculitis asociada con infección Vasculitis en neoplasias malignas Granulomatosis linlomatoido Vasculitis urticarial hipocomplementémica Púrpura hipergammaglobulinémica Vasculitis cnoglobulinémica Vasculitis por radiación Vasculitis por trasplante (rechazo vascular) Vasculitis asociada a enfermedades del tejido conectivo Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistèmico Síndrome de Sjogren Esclerodermia Dermatomiositis/ polimiosilis Sarcoidosis Policondritis recidivante Síndrome del anticuerpo anlilosfolipido Enfermedad de Behcet Adaptado de Langford CA, McCallum RM Idiophatic vasculitis. In Belch JJF Zurier RB (eds): Connective Tissue Diseases London. Chapman & Hall, 1995 pag 179. con permiso
observadas en la vasculitis. Se observan anormalidades cuantitativas y cualitativas en la producción de citocinas en la vasculitis sistémica. Se han descrito niveles aumentados de interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6. factor a de necrosis tumoral (TNF-(x) y TNF-J5 (Arimura, 1993: Grau, 1998), asi como una producción aumentada de TNF-u por las células mononucleares circulantes (Deguchi, 1990). Estos mediadores inician la infiltración de células inflamatorias, la activación del complemento y cascada de la coagulación, y la regulación ascendente de otras moléculas inflamatorias (Conn, 1993: Niles. 1995: Snellen 1997).
PERSPECTIVA SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLÍNICAS DE LABORATORIO
VASCULITIS
Tabla 44-3
991
Anticuerpos a s o c i a d o s con vasculitis
Anticuerpo ANCA (generalmente c-ANCA) ANCA (c-ANCA o p-ANCA) Anticuerpos anli C1q
Asociación con e n f e r m e d a d
Prueba principal Métodos
Granulomatosis de Wegener Poliarteritis microscópica
IFM. ELISA IFM, ELISA
Vasculitis urticarial unión C1 q hipocomplementémica Anticuerpos antihepatilis B PAN asociado a hepatitis B ELISA Anticuerpos antinucleares Lupus eritematoso sistemico IFM. ELISA (ANA) Crioglobulmas mezcladas Vasculitis cnoglobulinémica Cnoprecipitación, IEP.IF SSA (Flo). SSB (La) Sindrome de S|ógren IFM. ELISA, ID Factor reumatoide Artritis reumatoide LA, ELISA ANCA = autoanticuerpos antineulróMos citoplasmaticos; c-ANCA = ANCA otoplasmáticos ELISA • ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: GBM • membrana basal glomerular. ID = inmunodilusion, IEP = inmunoelectroforesis; IF = inmunofijación IFM = microscopía de inmunoflorescencia indirecta; LA • aglutinación del látex. p-ANCA = ANCA perinuclear; PAN = poliarteritis nodosa.
mente, la confirmación histológica o angiográfica de la vasculitis debería obtenerse de una biopsia de tejido o angiografia para el diagnóstico definitivo previo a la terapia (Mandell. 1994). Las pruebas clínicas de laboratorio tienen un valor limitado en el establecimiento de un diagnóstico específico de la vasculitis (Mandell. 1994), aunque los clínicos usan estas pruebas como ayuda en la identificación de los patrones de la implicación del órgano característico de la vasculitis, evaluando el alcance y la gravedad del daño en el órgano final, diferenciando la vasculitis idiopática de las formas alternativas secundarias y estableciendo los valores básales para su tratamiento. La asociación de ANCA con ciertas afecciones vasculares idiopáticas se ha convertido en una importante ayuda en el diagnóstico y tratamiento. Los ANCA se tratan con detalle a continuación. Cuando se evalúa a un paciente cuyo diagnóstico diferencial incluye vasculitis, resultan útiles los siguientes principios relativos al uso e interpretación de las pruebas clínicas de laboratorio.
Pruebas de rutina Cuando se evalúan pacientes con una enfermedad multisístémica complicada, el objetivo del clínico es el diagnóstico correcto hasta un nivel que permita un tratamiento adecuado. Como no existe una clínica patognomónica ni rasgos de laboratorio de la vasculitis, el clínico debe utilizar combinaciones de hallazgos clínicos y de laboratorio para reconocer los patrones de la enfermedad. Esto puede permitir un diagnóstico específico o, más comúnmente, la clasificación de la enfermedad del paciente como una dentro de un grupo de trastornos vasculíticos con tratamiento similar, incluso cuando no se identifica ninguna entidad específica. Decidir si un paciente tiene vasculitis basándose estrictamente en los síntomas clínicos conlleva riesgos debido al amplio número de posibilidades de diagnóstico diferencial y la falta de hallazgos patognomónicos. Consecuente-
Tabla 44-2
Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas idiopáticas (primarias) Vasculitis de pequeños vasos Granulomatosis de Wegener Púrpura do Henoch- Schónlem Angeitis primaria del sistema nervioso central Vascuhlis de vasos medianos Síndrome de Churg- Strauss Poliarteritis nodosa Enlermodad de Kawasaki Vasculitis de vasos grandes Arteritis de células gigantes (temporal) Arteritis de Takayasu
Los pacientes cuya historia y exploración física sugieren vasculitis idiopática a menudo presentan una serie confusa de dolencias multisistémicas que han venido sucediendo durante algún tiempo. Las pruebas de primer orden que hay que considerar incluirían las siguientes: cultivos para agentes infecciosos, si el paciente tiene fiebre; recuento completo de sangre (CBC) con recuento diferencial; velocidad de sedimentación globular (VSG); análisis de orina: panel químico de la sangre; y pruebas para la función de un órgano específico, como el hígado.
Pruebas especiales Las pruebas especiales ayudan a diferenciar la vasculitis idiopática de las alternativas en el diagnóstico diferencial activo. Las pruebas relevantes de laboratorio incluirían aquellas que identifican los auloanticuerpos circulantes que se enumeran en la Tabla 44-3 e inmunocomplejos. La biopsia tisular dirigida para la confirmación histológica de la vasculitis y/o la angiogralía se consideran las pruebas definitivas para la vasculitis idiopática.
Algunos patrones de prueba en vasculitis Son útiles ciertos patrones de resultados de pruebas clínicas de laboratorio: • El hallazgo de leucopenia y/o trombocitopenia en afecciones vasculares idiopáticas es raro y sugiere diagnósticos alternativos tales como lupus eritematoso sistémico (LES), neoplasia, alteraciones de la médula ósea, granulomatosis linfomatoide o hiperesplenismo (Mandell. 1994). • VSG. aunque es un hallazgo no específico, está típicamente elevada en afecciones vasculares idiopáticas. Si la VSG no está elevada antes del tra-
992
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tamienlo, el diagnóstico no es arteritis de células gigantes (temporal) o granulomatosis de Wegener (WG). • Puede verse vasculitis con rasgos histológicos de poliarteritis nodosa (PAN) asociada con pancitopenia en pacientes con leucemia de células peludas (Mandell, 1994). Anemia con hemoglobina por debajo de 9 g/dl se produce por circunstancias distintas que la anemia de la enfermedad crónica, tal como la hemolisis, el sangrado oculto o la enfermedad renal (Mandell, 1994). Cuando se sospecha PAN, deberían realizarse las pruebas para la función hepática, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV) y citomegalovirus (CMV) (Golden, 1994; Mandell, 1994). De forma similar, son apropiadas las pruebas serológicas para los virus de la hepatitis B y C cuando un paciente tiene crioglobulinas, vasculitis leucocitoclástica o biopsia cutánea y / o enfermedad renal. 1
1
Creatina-cinasa (CK) en sangre elevada puede indicar miositis o isquemia muscular (Mandell, 1994). Las pruebas para los anticuerpos antinucleares (ANA) y el factor reumatoide (FR) son útiles sólo cuando se sospecha enfermedad del tejido conectivo o artritis. Pacientes con vasculitis reumatoide tienen un alto título de FR. La eosinofilia en sangre periférica se produce en una amplia variedad de alteraciones inflamatorias. Alrededor del 15% al 20% de los pacientes con PAN o WG pueden tener eosinofilia pero no con los altos niveles vistos en el síndrome de Churg- Strauss (CSS). La identificación de ANCA citoplasmático (c-ANCA) apoya el diagnóstico de WG en pacientes con hallazgos clínicos de WG (Mandell, 1994). Pacientes con WG no tratados no tienen leucopenia En la primera orina de la mañana, tanto antes como después de la centrifugación, se deberían examinar cuidadosamente las proteínas, hematuria, células y cilindros que acompañan a la glomerulonefritis que se puede producir en las afecciones vasculares. Si la amiloidosis renal está en el diagnóstico diferencial, existe de forma típica proteinuria sin células.
ANTICUERPOS ANTINEUTROFILOS CITOPLASMATICOS Los ANCA reaccionan con antígenos neutrófilos citoplasmáticos (Jennette, 1993). La identificación de ANCA se ha convertido en un importante accesorio para el diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante (Niles, 1993). En los últimos años, ha habido también un gran interés en cómo ANCA puede ser importante en la patogénesis de WG y otras afecciones vasculares sistémicas (Jennette, 1993,1994).
Métodos de detección Existen varios métodos de laboratorio incluyendo la microscopía de fluorescencia indirecta (IFM), enzimoinmunoanálisis (ELISA), radioinmunoanálisis. transferencia western. transferencia en marcha, citometria de flujo e inmunoprecipitación que se han utilizado para detectar ANCA (Roberts. 1992; Wieslander, 1991). IFM y ELISA son los métodos de prueba usados más comúnmente con este fin. El IFM es el método más sensible para la detección de ANCA.
Figura 44-1. Patrón de anticuerpo citoplasmàtico antineutrófilo citoplasmático (c- ANCA). La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran una fluorescencia citoplasmàtica finamente granular con acentuación central No hay tinción nuclear (x 400).
demuestran tinción citoplasmática y 3) no especificidad por los neutrófilos (p. ej., los linfocitos en el portaobjetos no deberían teñir cuando el verdadero ANCA está presente) y 4) granularidad citoplásmica heterogénea (Roberts, 1992; Saviage, 1998). El p-ANCA se caracteriza por la tinción del área perinuclear (Fig. 44-2). aunque la tinción nuclear mimetizando ANA puede producirse cuando existen títulos altos de este autoanticuerpo (Niles, 1993). El patrón de tinción perinuclear que define p-ANCA está causado por la redistribución de los antigenos diana desde el citoplasma neutrófilo hasta la región nuclear cuando se usa etanol para preparar neutrófilos humanos como sustrato (Jennette, 1993). Cuando se utiliza formalina antes que alcohol para fijar neutrófilos. el antigeno diana se inmoviliza, y el patrón de tinción inmunofluorescente entonces es citoplasmático (Jennette, 1993). El papel del uso de neutrófilos fijados con formalina para detectar ANCA en la labor diagnóstica de rutina sigue siendo una controversia (Chowdhury, 1999).
Especificidad antigénica La especificidad antigénica de c- ANCA se ha identificado como una serín proteasa nuclear de 29 kDa, proteinasa 3 (PR-3), situada dentro de granulos primarios de neutrófilos y lisosomas de monocitos (Niles, 1993; Roberts, 1992). El p-ANCA en vasculitis se debe generalmente a anticuerpos frente a mieloperoxidasa ¡MPO-ANCA) (Falk, 1988). De manera interesante, muchos p-ANCA no se dirigen hacia MPO pero bastantes se dirigen a otros
IFM se realiza utilizando neutrófilos humanos normales aislados como sustrato. Estos neutrófilos son citocentrifugados frente a portaobjetos de cristal multiperforado, fijados con un 99% de etanol, y después incubados con diluciones de sueros de pacientes. Los neutrófilos también pueden sujetarse a los portaobjetos por adherencia, frotis o técnicas de gota (Roberts, 1992, 1990). Los portaobjetos son teñidos con un conjugado de inmunoglobulina (Ig) poliespecífica marcada con fluoresceína; el conjugado poliespecífico se recomienda porque se producen IgM e IgA c-ANCA (Roberts, 1992). Los portaobjetos se leen en un microscopio de fluorescencia. Usando IFM. hay dos patrones principales de tinción de neutrófilos; c-ANCA y ANCA perinuclear (p-ANCA). El c- ANCA se caracteriza por una tinción finamente granular de citoplasma neutrófilo con una acentuación central entre los lóbulos nucleares; el núcleo por sí mismo no liñe (Fig 44-1). Los criterios útiles para diferenciar c- ANCA de tinciones citoplasmáticas no específicas debidas a otros autoanticuerpos incluyen los siguientes: 1) ausencia de acentuación central; 2) menos del 95% de los neutrófilos
Figura 44-2. Patrón de anticuerpo antineutrólilo citoplásmico perinuclear (p-ANCA). La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran fluorescencia perinuclear y nuclear sin tinción citoplasmática ( x 400).
CAPÍTULO 44
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enzimas ciloplasmáticos neutrófilos incluyendo elaslasa, laclolernna. lactoperoxidasa, lisozíma, azurocidma o catepsma G (Hoffman. 1998: Jennette. 1993; Niles. 1993). Los ELISA para detectar autoanticuerpos (rente a PR-3 (PR-3-ANCA) muestran una buena correlación con la presencia de c-ANCA cuando observadores experimentados realizan IFM (Niles. 1993; Robeds, 1992). Un ELISA para detectar PR-3 ANCA debe ser validado cuidadosamente, lijándose de modo especial en el uso de técnicas conocidas en la preparación del antígeno en fase sólida y utilizando un control tanto de los pasos previos como de pasos específicos en la absorción para enlaces no específicos de inmunoglobulina a la fase sólida (Niles, 1993; Roberts, 1992: Wang, 1997). En Europa se han hecho esfuerzos para estandarizar ELISA en fase sólida (Hagen, 1996,1998). Existen en el mercado disponibles ELISA autorizados tanto para PR-3 como para MPO. La mayoría utilizan un recubrimiento de antigeno estándar directo de placas microperforadas de poliestireno para que la pureza del antígeno sea de vital importancia en la definición de la sensibilidad y especificidad analítica (Niles. 1993; Roberts, 1992). Son importantes los intentos para conservar la conformación del antigeno natural, ya que los ANCA frente a PR3 están dirigidos contra los epitopos conformacionales (Hoffman, 1998). La correlación entre p-ANCA y la detección de mieloperoxida en ELISA, sin embargo, no es buena (Roberts, 1992). Varios autoanticuerpos incluyendo ANA, elastasa antineutrófila o ANA granulocito-especificos (GS-ANA) pueden producir un patrón p-ANCA en IFM. Así los sueros que producen fluorescencia nuclear en IFM requieren una prueba adicional para confirmar MPO-ANCA. MPO-ELISA se recomienda para confirmar la especificidad anti -MPO porque se sabe que los verdaderos ANA o GS-ANA y MPOANCA se producen simultáneamente. IFM usando células Hep-2 no hace esta distinción adecuadamente porque ANA y MPO-ANCA pueden producirse juntos, y GS-ANA puede ser negativo en células Hep-2 (Robeds. 1992; Specks. 1994). ELISA tiene limitaciones por lo que. por último, cada laboratorio debe verificar cuidadosamente las informaciones de un fabricante para que el clínico pueda recibir información sobre las características de la realización Esto adquiere especial importancia en las situaciones clínicas confusas donde puede haber discrepancias entre la presentación clínica y los resultados de laboratorio y/o resultados discordantes entre IFM y pruebas ELISA.
Asociaciones con enfermedad Vasculitis Tanto PR-3 ANCA (c-ANCA) como MPO-ANCA (p-ANCA) están asociados con WG, PAN incluyendo poliarteritis microscópica. CSS, glomerulonefritis idiopática necrotizante pauciinmune y progresiva y síndromes de superposición de poliangitis (Cohén, 1991; Niles, 1993). PR-3-ANCA se identifica en alrededor del 90% de los pacientes con WG activa mientras que MPO-ANCA se identifica en menos del 10% de estos pacientes. El ochenta por ciento de los pacientes con poliarteritis microscópica activa tienen o PR3-ANCA o MPO-ANCA más o menos con la misma frecuencia. MPO-ANCA se identifica en pacientes con CSS o glomerulonefritis pauciinmune en el 70% al 80% de pacientes con enfermedad activa; raramente, este último grupo de enfermedades puede asociarse con PR-3-ANCA antes que con MPO-ANCA. Se ha descrito la coexistencia de ANCA y anticuerpos antiglomerulares de la membrana basal (anti- GBM) (Niles, 1993; Bonsib. 1993).
Enfermedad inflamatoria de los tractos gastrointestinal y hepatobiliar Se han publicado vanos artículos sobre la asociación de ANCA con enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal (Gl) y hepatobiliar (Jennette, 1993). Los p-ANCA se han descrito en aproximadamente el 75%-80% de los pacientes con colitis ulcerosa activa o colangitis esclerosante primaria (Ellerbroek. 1994; Klein, 1991: Lo, 1993), alrededor del 75% de los pacientes con hepatitis crónica activa; alrededor del 30% de los pacientes con cirrosis biliar primaria (Kallenberg. 1992: Mulder. 1993) y el 20% de los pacientes con enfermedad de Crohn (Jennette, 1993: Roberts, 1992). Las especificidades del
VASCULITIS
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antigeno diana en la enfermedad inflamatoria intestinal no se han definido plenamente, aunque se han descrito autoanticuerpos contra lactoperoxidasa. proteina bactericida del aumento de la permeabilidad (Hoffman. 1998), lactoferrina (Peen. 1993) o catepsina G (Jennette, 1993).
Otras
enfermedades
Los ANCA también se han descrito en otras enfermedades incluyendo lupus eritematoso inducido por medicamentos, LES. síndrome de Felty y artritis reumatoide. síndrome de Siógren, polimiositis y dermatomiositis. artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, policondritis recidivante, síndrome del anticuerpo antifosfolipido. síndromes mielodisplásicos. virus de inmunodeliciencia humana (VIH), cromomicosis, amebiasis invasiva, endocarditis subaguda bacteriana, fibrosis quíslica y ciertas neoplasias (Choi, 2000; Hoffman. 1998; Jennette, 1993: Peter. 1993). En las alteraciones del tejido conectivo, los ANA que mimetizan p-ANCA deben ser excluidos Muchos pacientes tratados con hidralazina parecen desarrollar MPO-ANCA (Roberts. 1992). Vasculitis asociada a propiltiouracilo se ha asociado con ANCA positivo (Hoffman, 1998).
Interpretación de la prueba La interpretación de las pruebas de ANCA debería considerar vanos factores (Hagen. 1998; Hoffman. 1998: Vassilopoulos.1999): • Las pruebas ANCA no deberían utilizarse como pruebas de detección sistemática en grupos de pacientes no seleccionados donde la prevalencia de vasculitis es baja (Langford. 1998). • Las pruebas de ANCA son más valiosas cuando se ordenan selectivamente en situaciones clínicas donde alguna torma de vasculitis asociada a ANCA sea una posibilidad seria. • El patrón de inmunofluorescencia c-ANCA deberia confirmarse usando PR3 ELISA (Savige. 1999). • La reactividad anti- PR3 se ve más a menudo en WG activo o PAN pero puede verse en glomerulonefritis idiopática progresiva o CSS. • c-ANCA en WG se considera altamente sensible al señalar la enfermedad sistémica activa (67% a 97%) según Vassilopoulos y Hoffman (1999). • El valor predictivo de un título aumentado de c-ANCA como presagio de una recidiva de WG está controvertido, pues no todas las elevaciones en el titulo de c-ANCA se siguen de un empeoramiento de WG (Specks, 1994). • El patrón p-ANCA en IFM no es específico desde el punto de vista diagnóstico. • Los sueros p-ANCA positivos deberían probarse con ELISA para MPOANCA (Savige, 1999) • MPO-ANCA se ve más a menudo en PAN, glomerulonefritis idiopática progresiva o CSS; sin embargo, puede verse en WG. • Ni un diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante ni una decisión para tratar debería basarse sólo en un resultado de la prueba ANCA positivo. • Un ANCA negativo no debería usarse para excluir la enfermedad Los autores consideran un c-ANCA positivo como posible WG y una señal para una evaluación más exhaustiva. Por último, la interpretación de una prueba para ANCA depende de la filosofía y experiencia de los clínicos individuales que tratan las vasculitis (Jennette, 1998).
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES VASCULÍTICOS IDIOPÁTICOS Poliarteritis nodosa Epidemiología PAN. como todas las afecciones vasculares, es una enfermedad poco común. Las estimaciones de la prevalencia de PAN han vanado desde 4.6 por 1.000.000 en Inglaterra, hasta 9.0 por 1.000.000 en el Condado de Olmstead. en Minnesota, y hasta 77 por 100.000 en una población de esquí-
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males de Alaska hiperendémica para hepatitis B (Langford. 1995: Conn, 1993). PAN puede producirse en cualquier género y a cualquier edad, pero es más común en hombres (relación varones/hembras = 2:1) entre 40 y 60 años de edad (Langtord. 1995). No se ha observado predilección racial (Conn.1993).
Rasgos clínicos PAN es una vasculilis sistémica necrotizante que afecta predominantemente a arterias de pequeño a mediano calibre. Las manifestaciones clínicas de la PAN clásica son muy variables. Los pacientes a menudo presentan síntomas no específicos como fiebre, pérdida de peso y malestar. La hipertensión es habitual y puede ser una importante clave diagnóstica. Aunque la PAN puede producirse prácticamente en cualquier órgano, la afectación sintomática de la piel, articulaciones, nervios periféricos, tracto Gl y ríñones normalmente dominan el cuadro clínico (Conn, 1993). Las pruebas que indican una función hepática anormal sugieren la posibilidad de una infección por hepatitis B concurrente (Langford. 1995). La afectación pulmonar en la PAN clásica es rara e incluso controvertida. Aunque algunos investigadores piensan que la PAN pulmonar se produce (Lie, 1989), otros creen que estos pacientes tienen CSS o WG, donde la enfermedad pulmonar es habitual (Langford, 1995: Fauci, 1998). La evolución de la PAN se caracteriza por remisiones, recidivas y, si no se trata, alia mortalidad (Faucí, 1998).
Hallazgos clínicos de laboratorio Los resultados de las pruebas clínicas de laboratorio, aunque no específicas diagnósticamente, refleja la naturaleza sistémica inflamatoria de la PAN. Típicamente, se encuentra una anemia normocrómica, leucocitosis neutrofílica. hipoalbuminemía. hipergammaglobulinemia y una VSG marcadamente elevada. La medida de la creatinina sérica y el nitrógeno de urea en sangre (BUN) junto con un análisis de onna para controlar la proteinuria. hematuria y sedimento anormal son importantes para evaluar la función renal normal. El ANA positivo o FR encontrado en el 10% al 40% de estos pacientes puede estar asociado con niveles disminuidos de componentes de complemento C3 y C4. En todos los pacientes con PAN deberían obtenerse pruebas serológicas para el antigeno de superficie y anticuerpo de la hepatitis B (Langford. 1995; Conn. 1993). Con poca frecuencia se ve eosinofilia en sangre periférica y, cuando está presente en altos niveles, esto debería conducir a considerar un CSS (Fauci, 1998).
Diagnóstico La PAN puede ser difícil de diagnosticar, por su presentación no específica, el potencial para la afectación de diversos órganos de forma difusa, y la baja prevalencia. Sin embargo, una vez que se sospecha, el diagnóstico de PAN se basa en la angiografía y/o la demostración histológica de PAN en la biopsia tisular de la(s) zona(s) sinlomática(s), como músculo, nervio, riñon y testículos. Patológicamente, la PAN es una arteritís necrotizante focal pero panmural de arterias musculares de pequeño y mediano tamaño, que preferentemente se produce en los puntos de ramificación de los vasos. La inflamación necrotizante de célula mixta con necrosis fíbrinoide, circunferencial o segmentaria en la pared del vaso, es la lesión que marca una PAN activa. La dilatación aneurismática o microaneurismática también son características de la fase aguda de la PAN. El proceso inflamatorio se cura con librosis que puede conducir a una endarteritis proliferativa. Un rasgo característico de la PAN es una mezcla de lesiones activas y/o lesiones en curación adyacentes a segmentos normales de vasos sanguíneos (Langford, 1995). La angiografía puede ser especialmente valiosa para identificar anormalidades Gl o cuando una posible biopsia de una zona sea inasequible. En particular, se debería considerar una angiografía antes de intentar una biopsia hepática o renal cerrada con aguja en pacientes con sospecha de PAN, debido a la predilección por aneurismas en estos lugares que aumenta el riesgo de sangrado grave (Langford. 1995).
Tratamiento y pronóstico Los pacientes con PAN se tratan con glucocorticoides. El objetivo del tratamiento con glucocorticoides es el control de la enfermedad sin complicacio-
nes significativas por la medicación en si. La ciclofosfamida puede utilizarse para pacientes con PAN grave (afectación Gl, cardíaca y del sistema nervioso central [SCN]), aquellos en los que fracasan los corticoides solos, y para restringir esteroides en pacientes que presentan efectos adversos significativos a estos (Langford, 1995). El pronostico para pacientes con PAN ha mejorado en gran medida con el uso de glucocorticoides. atendiendo la media de supervivencia de cinco años del 13% al 50% y al 60%. La mayoría de los fallecimientos se producen durante el primer año, pero ya sea antes o después de un año de enfermedad, la mortalidad se produce sobre todo o por infección o por complicación del tratamiento o por secuelas de la obliteración del vaso, como el infarto de miocardio o idus (Langlord. 1995).
Variantes de PAN Dos importantes variantes de la PAN son la PAN cutánea y la PAN asociada con hepatitis B. La PAN cutánea es una vasculitis necrotizante de las arterias pequeñas musculares en el tejido subcutáneo. Por definición, este es un proceso localizado que no afecta a arterias viscerales y por consiguiente, no es una vasculitis sistémica. El diagnóstico se establece por hallazgos histológicos caracteristicos en biopsia de piel con una evaluación sistémica negativa. Las lesiones cutáneas histológicamente idénticas pueden verse en la PAN sistémica; por lo tanto la PAN cutánea puede considerarse un diagnóstico de exclusión. Como regla, la PAN cutánea sigue un curso benigno, no progresa a enfermedad sistémica y tiene un excelente pronóstico a largo plazo (Langford, 1995). La positividad del antigeno de superficie de la hepatitis B se ha encontrado en hasta un 54% de los pacientes con PAN. Hay indicios que indican que la hepatitis C también se asocia con PAN, aunque actualmente se conoce poco del espectro clínico de la enfermedad. La identificación del intervalo entre la infección con hepatitis B y el establecimiento de la PAN ha variado desde meses hasta años, en parte porque los pacientes tienen frecuentemente hepatitis B subclínica, sin diagnosticar, hasta que se diagnostica la hepatitis B asociada a PAN. Sin embargo, no se ha reseñado ninguna asociación entre la actividad inflamatoria en el hígado y la vasculitis. Los pacientes con hepatitis B asociada a PAN tienen una mayor incidencia de pruebas de función hepática elevadas y aneurismas que aquellos con PAN no relacionada con hepatitis pero por otra parte son clínicamente similares. Desgraciadamente, la presencia de hepatitis B complica el tratamiento inmunosupresor, porque la replicación viral puede dar lugar a un riesgo aumentado de la enfermedad hepática progresiva durante el tratamiento e incluso la hepatitis tulminante cuando cesa la inmunosupresión. A pesar de estas cuestiones, la terapia corlicoidea es importante, ya que los pacientes con PAN asociada a hepatitis B no tratada tienen una alta tasa de mortalidad. La terapia antiviral con interterón-a debería utilizarse en todos los pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Guillevin, 1997). El intercambio de plasma puede ayudar a eliminar inmunocomplejos y mejorar el tratamiento de algunos pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Langford, 1995: Guillevin, 1997).
Síndrome de Churg-Strauss Epidemiología Se piensa que CSS es una condición clínica rara; no hay datos epidemiológicos amplios disponibles (Conn, 1993). El CSS comienza típicamente entre las edades de 15 y 69 años, siendo los 38 años la media de edad para el establecimiento de la vasculilis (Langford. 1995).
Rasgos clínicos El CSS. también llamada angeítis alérgica y granulomatosís, es una vasculitis necrotizante sistémica caracterizada por una inflamación granulomalosa vascular y extravascular, afectación múltiple de órganos, y asociaciones con rinitis alérgica, asma grave e hipereosinofilia (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las manifestaciones clínicas de CSS pueden recordar a las de la PAN en muchos aspectos pero difieren en que la enfermedad pulmonar es típica y
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la enfermedad renal es poco común, generalmente menos grave en CSS que en PAN (Faucí, 1998). El curso clínico de CSS a menudo se divide en tres lases distintas, aunque en realidad, estas tres lases no siempre se identifican o pueden superponerse (Langford, 1995): 1) una fase prodrómica caracterizada por enfermedad respiratoria alérgica; 2) una fase eosinofílica caracterizada por hipereosmolilia en sangre periférica y tejido: y 3) una fase vasculítica. La afectación cardíaca, bien carditis eosinofílica transmural o vasculitis coronaria, se produce en el 25% al 62% de los pacientes con CSS y es la principal causa de muerte (Langford. 1995).
Hallazgos clínicos de laboratorio Un signo característico del CSS es la notable eosinofilia en sangre perifonea, que puede verse en cualquier fase de la enfermedad. El recuento de eosinófilos en sangre periférica alcanza los 1.000 eosinófilos por microlitro en el 80% o más de los pacientes con CSS (Conn, 1993); sin embargo, la eosinofilia no puede encontrarse en todos los pacientes debido a los previos tratamientos con esferoides para el asma o a la amplia y rápida fluctuación que se puede producir en el recuento de eosinófilos en esta enfermedad. La normalización del recuento de eosinófilos en respuesta al tratamiento con esteroides es un rasgo de CSS. distinguiéndolo del síndrome hipereosinofílico en el cual la eosinofilia puede ser resistente a corticoides El grado de eosinofilia puede relacionarse con la actividad de la enfermedad vasculítica en algunos pacientes. Otros hallazgos de laboratorio en CSS son no específicos. La anemia, leucocitosis y aumento de la VSG frecuentemente acompañan a la enfermedad vasculítica. Los niveles de IgE en suero pueden estar elevados. El FR en suero puede ser identificado, pero el titulo es generalmente bajo. El complemento en suero está descrito como normal (Conn. 1993). A diferencia de la PAN, no se ha descrito ninguna asociación entre CSS y hepatitis B (Langford, 1995).
Diagnóstico Históricamente, el diagnóstico de CSS se realiza exclusivamente con la demostración histológica de la vasculitis eosinofílica necrotizante. infiltración eosinofílica del tejido, y granuloma extravascular. En la práctica, sin embargo, pocas muestras de biopsia contienen todos estos hallazgos. Para aumentar la probabilidad de la identificación y el diagnóstico de CSS. se puede dar menos importancia a estos indicadores clínicos e incluir rasgos clínicos. Un estudio ha recomendado los siguientes criterios: 1. Asma 2. Eosinofilia de sangre periférica por encima de 1,5 x1 o células u7l 3. Vasculitis sislémica incluyendo dos o más órganos extrapulmonares (Conn, 1993) 3
El diagnóstico delinitivo todavía requiere la demostración de la vasculitis comprobada con biopsia. Una biopsia abierta de pulmón frecuentemente no confirma todos los rasgos histológicos de CSS pero debe considerarse antes del establecimiento de la terapia, si se teme una posible infección. Cuando los síntomas clínicos así lo indican, las muestras de biopsia útiles se obtienen la mayoría de músculo, nervio safeno, próstata y riñon. El diagnóstico diferencial de CSS incluye PAN, WG y el síndrome hipereosinofílico (Langford. 1995).
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entre el establecimiento del asma y el establecimiento de la vasculitis se considera un signo pronóstico desfavorable.
Síndrome mixto de poliangeítis El síndrome mixto de poliangeítis se produce en un grupo heterogéneo de pacientes que. por definición, tienen una vasculitis sistémica necrotizante pero no manifiestan la enfermedad de forma que se sitúen claramente dentro de una categoría específica de diagnóstico. Los pacientes con el síndrome mixto de poliangeítis pueden tener los rasgos combinados de varias enfermedades vasculíticas, signos patológicos mezclados de modo similar, o síntomas atípicos que no encajan con una enfermedad/síndrome especifico (Langford, 1995). El síndrome mixto de poliangeítis tiene la capacidad de afectar a múltiples sistemas de órganos. Aunque el pronóstico para el síndrome mixto de poliangeítis no está establecido, existe la posibilidad de daño visceral serio y enfermedad potencialmente mortal. Tanto desde el punto de vista diagnóstico como terapéutico, estos pacientes deberían tratarse como sí tuvieran un síndrome vasculítico bien definido. Una historia cuidadosa, una exploración física y una evaluación de laboratorio deberían permitir definir el alcance de su afectación sistémica. El diagnóstico del síndrome mixto de poliangeítis debería demostrarse mediante biopsia o angiografía. Una vez que se ha descubierto la presencia de una vasculitis sistémica necrotizante. y se han descartardo otros diagnósticos, específicamente la infección, el tratamiento debería iniciarse con corticoides y considerar el uso de agentes inmunosupresores adicionales, como la ciclofoslamida (Langford, 1995).
Granuiomatosis de Wegener Epidemiología No existe una incidencia anual detallada disponible ni datos de prevalencia para WG, pero se estima que WG es menos común que PAN. La WG se produce en personas de cualquier edad, raza o sexo, aunque se manifiesta predominantemente en caucasianos y tiene un cierto predominio en los varones (Conn, 1993). La edad media de comienzo son los 41 años (Langford, 1995).
Rasgos clínicos WG es un síndrome clínicopatológico de naturaleza desconocida caracterizado patológicamente por una inflamación granulomatosa necrotizante de los tractos respiratorios superior e inferior, glomerulonefritis focal segmentaria, y una vasculitis necrotizante que afecta predominantemenle a las arterias medianas y pequeñas. La WG se manifiesta en las regiones de oido/naríz/garganla con sinusitis, obstrucción nasal o ulceración, otitis media o pérdida de audición (Fauci. 1998: Lie. 1989). El cuarenta y cinco por ciento de los pacientes con WG tienen afectación pulmonar al principio, y el 85% manifiestan una enfermedad pulmonar en algún momento durante el curso de su enfermedad. Las manifestaciones habituales del pulmón incluyen infiltrados pulmonares, nodulos pulmonares, hemoptisis o pleuritis (Faucí, 1998). Aunque sólo alrededor del 18% de estos pacientes sufren inicialmente fallo renal, el 80% manifiestan glomerulonefritis en algún momento en el curso de WG (Faucí. 1998). Otros signos habituales de la enfermedad sistémica incluyen exantema cutáneo, artralgias. liebre, manileslaciones oculares y pérdida de peso (Faucí. 1998: Lie. 1989). Aunque se han descrito pacientes con WG limitado al tracto respiratorio sin afectación renal ("WG limitado"), por encima del 50% de los pacientes con esta enfermedad al inicio desarrollan con el tiempo una enfermedad más generalizada (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico Los corticoides son la base del tratamiento de CSS. La utilidad de la lerapia mmunosupresora con azalioprina y ciclofosfamida no está bien estudiada (Langford. 1995). El diagnóstico precoz de CSS y corticoides ha llevado a estos pacientes a tener una tasa de supervivencia de cinco años del 62%. La insuficiencia cardiaca congestiva y el infarto de miocardio causan el 48% de todas las muertes en CSS. La hemorragia cerebral, fallo renal, perforación o hemorragia Gl. estado asmático e insuficiencia respiratoria también causan fallecimiento de los pacientes con CSS. Todos estos rasgos deberían llevar a considerar el uso de una terapia con un agente citotóxico (ciclofosfamida) en combinación con corticoides (Langlord. 1977). La poca duracón del intervalo
Hallazgos clínicos de laboratorio Los hallazgos clínicos de laboratorio típicos de WG incluyen leucocitosis moderada sin eosinofilia acusada, anemia normocrómica leve y trombocitosis (Conn. 1993. Langford, 1995). No se ha observado leucopenia en los pacientes no tratados y, asi, esto ayuda a distinguir WG de otros trastornos. La presencia de c-ANCA apoya el diagnóstico. Los inmunocomplejos circulantes, determinados por enlaces Clq. se pueden encontrar junto con niveles normales de complemento e hipergammaglobulinemia: a menudo están elevadas las cantidades de subclase IgA (Conn, 1993; Langford. 1995). Los indicado-
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res de afectación glomerular incluyen hematuria microscópica o gruesa, proteinuria, cilindros de hematíes y/o creatinina sérica elevada y BUN. Más del 50% de estos pacientes son FR positivos, pero los ANA están generalmente ausentes (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las pruebas serológicas para autoanticuerpos anti-GBM son negativos. Previo al tratamiento, el 80% de estos pacientes presentan una VSG elevada.
Diagnóstico Aunque los hallazgos clínicos y de laboratorio pueden ser sugerentes. el diagnóstico de WG debería hacerse solo con una biopsia probada, confirmación histológica o cuando se ha comprobado la existencia de c-ANCA en el paciente con sinusitis, infiltrado pulmonar o nodulo y glomerulonelrilis (Langford, 1998). El tejido pulmonar obtenido mediante biopsia abierta de pulmón olrece la mejor oportunidad para hacer un diagnóstico certero (Langford, 1995). La biopsia transbronquial no proporciona el tejido adecuado para el diagnóstico más del 90% del tiempo. Aunque el tejido de cabeza y cuello es directamente más accesible, los rasgos patológicos característicos se encuentran en menos del 23% de estas muestras de biopsías El tejido útil desde el punto de vista diagnóstico de cabeza y cuello que mejor se obtiene, según orden decreciente de frecuencia, es el de los senos paranasals, tejido nasal y región subglótica. Los cambios glomerulares en el tejido de la biopsia renal, aunque sugerentes de WG, son raramente diagnósticos (Langford, 1995). Aunque el espectro morfológico de WG es amplio, el marco de la lesión patológica en WG es la vasculitis granulomatosa y necrolizante. Los vasos afectados experimentan necrosis fibrmoide con infiltración precoz por leucocitos polimorfonucleares seguidos de células mononucleares. El tejido pulmonar puede revelar cualquier combinación de necrosis, vasculitis, e inflamación granulomatosa. aunque las muestras de biopsia no incluyen lodos estos rasgos característicos. El hallazgo más habitual en la biopsia renal es la glomerulonefritis necrotizante segmentaria presente en diversos grados en el 80% de las muestras. La vasculitis renal no relacionada con el glomérulo es poco común y está presente sólo en el 8% de las biopsías. Muchas alteraciones pueden imitar la WG, incluyendo las enfermedades granulomatosas infecciosas o no infecciosas. CSS. síndrome de Goodpasture, granuloma idiopático de media linea, granulomatosis Imfomatoide y neoplasias de las vías respiratorias altas o pulmones (Fauci, 1998). De estos, la infección es una consideración importante, ya que un diagnóstico erróneo puede tener fatales consecuencias cuando se trata de forma equivoca con terapia inmunosupresora (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico Un régimen de ciclofosfamída oral diaria y corticoides es la terapia de elección para la WG. Utilizando este régimen, el Instituto Nacional de la Salud publicó el logro de una marcada mejora o remisión parcial en el 91% de los pacientes, con remisión completa en el 75%. Se observó una tasa de mortalidad global del 20%, el 13% de la cual podría atribuirse de forma completa o parcial a la WG. A pesar de esta marcada mejora en la supervivencia y la remisión comparada con el 100% de mortalidad en los pacientes no tratados, se observaron recidivas y morbilidad tanto de la enfermedad como del tratamiento. La mitad de las remisiones completas fueron seguidas de una o más recidivas, que se produjeron entre tres meses y 16 años después de alcanzarse la remisión (Langford. 1995) El metotrexato es una alternativa a la ciclofosfamída en pacientes que no sufren de enfermedades en las que peligra la vida (Langford, 1997). Durante el primer año de WG. el alcance de la enfermedad renal es el factor más estrechamente relacionado con el pronóstico. Después, la afectación del pulmón se convierte en el indicador de pronóstico más importante, y la glomerulonefritis no parece afectar significativamente al pronóstico.
pulmones, donde clínicamente imita a la WG. Sin embargo, los hallazgos histológicos característicos incluyen la infiltración marcada de vasos sanguíneos ("angiocénlrica") y la destrucción imitando a la vasculitis, pero la morfología celular es más sugerente de linfoma o alteración linfoproliferativa (Langford, 1995). No hay pruebas clínicas de laboratorio especificas.
Púrpura de Henoch-Schónlein Epidemiología La púrpura de Henoch-Schónlein (HSP) se produce principalmente e n niños de edades comprendidas entre los 4 y los 11 años (Conn. 1993) pero también aleda a algunos adultos. La HSP se presenta más habitualmente e n primavera y generalmente sigue a una infección de las vías respiratorias superiores (Conn. 1993). La HSP tiene un predominio en los varones de 3:2 (Langford, 1995).
Rasgos clínicos La HSP. llamada a veces púrpura anafiladoide. es una vasculitis sistémica de pequeños vasos clasificada como un subgrupo de la vasculitis de hipersensibilidad. No se conoce la etiología de HSP. Los hallazgos clínicos típicos en HSP incluyen púrpura palpable no trombocitopénica, artralgias, lesión renal y anormalidades del tracto Gl (Langford. 1995). El 70% de los pacientes con HSP manifiestan signos y síntomas gastrointestinales incluyendo dolor abdominal espasmódico asociado con nauseas y vómitos, sangre o moco en heces, hemorragia Gl potencialmente mortal, e invaginación (Langford. 1995). La enfermedad renal asociada se caracteriza por glomerulonefritis focal proliferativa que tiene una expresión clínica variable que va desde la hematuria aislada con cilindros de hematíes, hasta insuficiencia renal aguda, y Iracaso renal crónico raro (Fauci. 1998; Langford, 1995; Lie, 1989).
Hallazgos clínicos de laboratorio Los estudios clínicos de laboratorio en HSP son no específicos y resultan especialmente útiles para excluir otras alteraciones y buscar evidencia de afectación renal. Se pueden observar leucocitosis y VSG elevada. Las pruebas de CBC con recuento de plaquetas y de coagulación son importantes en la evaluación de púrpura cutánea; en HSP. las púrpuras no son de trombocitopenia. Deberían realizarse coprocultivos intermitentemente para buscar evidencia de pérdidas de sangre oculta. Los niveles de complemento en suero generalmente son normales, aunque se ha descrito una asociación entre HSP y la ausencia congenita del componente del complemento C2 (Conn, 1993). Se deberían realizar análisis de orina y medidas de creatinina en suero al comienzo de la enfermedad y dos veces a la semana hasta que los signos sislémicos hayan cesado (Langford, 1995).
Diagnóstico La dificultad para diagnosticar HSP es rara, excepto cuando la afectación de otros lugares principales precede a la aparición de púrpura palpable. A diferencia de otras vasculitis necrolizantes, el diagnóstico es clínico, con estudios de laboratorio que se utilizan para excluir otras alteraciones. La biopsia renal, que demuestra glomerulonefritis proliferativa, no es propiamente necesaria para el diagnóstico, aunque se utiliza para valorar la gravedad de la enfermedad y estimar el pronóslico Las alteraciones que se han de considerar en el diagnóstico diferencial de HSP incluyen cualquiera que cause abdomen agudo, nefritis o púrpura (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico Granulomatosis linfomatoide La granulomatosis linfomatoide (GL) está considerada como una alteración linfoproliferativa poco habitual que puede evolucionar a un linfoma maligno en aproximadamente el 50% de los pacientes. La GL afecta pnncipalmente a los
El tratamiento de HSP es de sostén y no existe un tratamiento especifico de beneficio probado para la nefritis de HSP. Aunque los glucocorticoides pueden ser útiles para disminuir el edema, el dolor de articulaciones y el malestar abdominal, la terapia de mantenimiento c o n glucocorticoides no es beneficiosa, ya que no disminuye el nesgo de enfermedad recurrente o mejora el diagnóstico renal (Langlord. 1995). Los analgésicos no sali-
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cilatos pueden suavizar el malestar de las articulaciones y tejidos blandos. La terapia para adultos se parece a la de los niños, aunque la hipertensión en adultos debe ser controlada cuidadosamente (Langford. 1995). El pronóstico para esta enfermedad generalmente autolimitada, que dura de 6 a 16 semanas, es bueno (Conn, 1993). La tasa de mortalidad está alrededor del 1% al 3% (Langlord. 1995). y el Iracaso renal es la causa principal de muerte (Langford, 1995). Aquellos que tienen una presentación nefrítica aguda, particularmente con síndrome nefrótico. tienen el peor desenlace, con menos del 50% que recuperen la función renal y los análisis de orina normales en dos años El porcentaje de glomerulos semilunares puede ser también un indicador de pronóstico útil: sin embargo, es importante tomar conciencia de que el curso de HSP puede ser extremadamente variable. Los pacientes con anormalidades graves clínicas o histológicas pueden recuperarse totalmente, y aquellos con cambios benignos pueden evolucionar a insuficiencia renal. La enfermedad se repite en el 25% al 40% de los pacientes y consiste en su mayor parte en manifestaciones cutáneas. El deterioro o la mejora puede ser más notable durante los primeros dos o tres años tras la resolución del episodio agudo, aunque también se han observado cambios significativos con más posterioridad. Es extremadamente importante una revisión regular con medidas de presión sanguínea y análisis de orina durante al menos los cinco primeros años siguientes a un episodio de HSP. (Langford, 1995).
Arteritis de células gigantes (temporal) Epidemiología La arteritis de células gigantes (GC) es una alteración relativamente común. Los estudios epidemiológicos han demostrado una incidencia creciente con la edad. Un estudio que incluía arteritis GC probadas con biopsia demostró una tasa de incidencia anual de 23,3 por 100.000 personas mayores de 50 años (Conn. 1993). Casi todos los casos de arteritis GC empiezan después de la edad de 50 años.
VASCULITIS
997
ción de la vista que sigue a la ceguera secundaria a la arteritis GC. incluso con una terapia de corticoides rápida a altas dosis.
Arteritis de Takayasu Epidemiología Como muchas de las alecciones vasculares idiopáticas. la arteritis de Takayasu es poco habitual, y la epidemiología de esta enlermedad no se conoce exactamente. Esta alteración es más prevalente en adolescentes y mujeres jóvenes en edades comprendidas entre los 10 y 30 años; en realidad, entre el 80% y el 90% de los casos se produce en mujeres. Aunque es más común en Japón, esta enlermedad no tiene limitaciones probadas raciales o geográficas (Conn, 1993: Fauci, 1998).
Rasgos
clínicos
La arteritis de Takayasu es una vasculitis granulomalosa de las arterias elásticas medias y grandes que causa estenosis vascular u oclusión; existe una fuerte predilección por la arteria aórtica y sus grandes ramas, incluyendo las arterias pulmonares (Fauci, 1998; Langford. 1995). Esta enlermedad se llama a veces síndrome de la arteria aórtica o arteritis granulomalosa idiopática. Los pacientes presentan síntomas sistémicos agudos que incluyen fiebre, malestar, sudores nocturnos y pérdida de peso. La isquemia en los órganos que reciben el aporte vascular a través dellos vaso/s afeclado/s causa señales y síntomas órgano-específicos. En la fase crónica obliterante, las pulsaciones de las arterias están disminuidas o ausentes en las arterias implicadas (Langford, 1995), más habitualmente en la arteria subclavia (Fauci. 1998). Son habituales los soplos vasculares y la hipertensión (Langford. 1995). Otros hallazgos incluyen la regurgitación aórtica, cardiomegalia secundaria a hipertensión aórtica o pulmonar, e ictus (Fauci, 1998). La arteritis de Takayasu puede progresar lentamente, puede estabilizarse, o puede causar la muerte rápidamente (Fauci, 1998)
Hallazgos clínicos de laboratorio Rasgos clínicos La arteritis GC es una entermedad sistémica caracterizada por una inflamación vascular granulomalosa que afecta a las arterias medianas y grandes. Aunque las arterias afectadas pueden estar en múltiples lugares, la arteritis GC clásicamente afecta a la arteria temporal y/o otras ramas de la arteria carótida (Faucí. 1998) Las manifestaciones clínicas incluyen fiebre, cefalea y claudicación mandibular en pacientes con más de 50 años La neuritis óptica isquémica puede provocar una ceguera repentina, particularmente en pacientes no tratados (Faucí, 1988). La arteritis GC está estrechamente asociada con la polimialgia reumática, que se caracteriza por rigidez y dolor cervical, de hombros, zona inferior de la espalda, caderas y muslos que es peor por la mañana y mejora con la actividad del día (Fauci, 1998).
Hallazgos clínicos de laboratorio Los hallazgos clínicos de laboratorio incluyen una VSG elevada y anemia normocrómica La fosfatasa alcalina en suero está habitualmente elevada. Se ha descrito una hipergammaglobulinemia, asi como niveles elevados de complemento e inmunocomplejos (Fauci, 1998).
Diagnóstico El diagnóstico se basa en la identificación de las manifestaciones clínicas típicas y una VSG alta en un paciente anciano que puede o no tener también síntomas de polialgia reumática (Fauci. 1998). El diagnóstico se confirma por biopsia de la arteria temporal.
Tratamiento y pronóstico La arteritis GC se trata con glucocorticoides. y la respuesta clínica a esta terapia es generalmente llamativa. El pronóstico clínico es bueno, pues la mayoría de los pacientes consiguen y mantienen una remisión completa Iras la terapia corticoidea (Fauci, 1998). Desgraciadamente, es rara la recupera-
Los estudios de laboratorio de la arteritis de Takayasu definen una alteración inflamatoria sistémica (Langford. 1995). La VSG está elevada en el 75% al 100% de los pacientes, que tiende a volver a la normalidad a lo largo del tiempo. Se cree que la VSG es un índice fiable de actividad inflamatoria y se ha utilizado como herramienta para monitorizar la eficacia de la terapia. El poder de resolución de la enlermedad. tanto sintomática como angiográficamente. se ha visto que está correlacionado con la disminución de la VSG. Los estudios hemalológicos muestran con frecuencia una anemia normocrómica de leve a moderada y/o leve leucocitosis. El FR y ANA son generalmente negativos. Puede haber hipergammaglobulinemia, hiperfibrinogenemia e hipoalbuminemia (Conn, 1993). Los inmunocomplejos circulantes pueden estar presentes en hasta un 50% de estos pacientes pero no parecen relacionarse con la actividad de la enfermedad.
Diagnóstico La arteritis de Takayasu se diagnostica por los datos correlacionados de la historia, la exploración física y la angiografia. La enfermedad debería considerarse como una posibilidad diagnóstica en cualquier mujer joven que carezca o tenga una frecuencia de pulso periférico marcadamente disminuida o que presente variaciones en la presión sanguínea yo soplos arteriales (Fauci. 1998). Los hallazgos angiográficos característicos ayudan a confirmar el diagnóstico clínico. La biopsia del tejido de diagnóstico para la confirmación raramente se requiere o se hace (Fauci, 1998). La predilección de este síndrome por mujeres jóvenes es un rasgo importante que a veces lo separa de otras consideraciones diagnósticas, particularmente de la arteritis GC (Langford, 1995).
Tratamiento y pronóstico En pacientes con entermedad activa, la terapia corticoidea es el tratamiento inicial de elección. Si la enlermedad activa persiste a pesar de los corticoi-
998
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGIA
des, se pueden administrar ciclofosfamida o metotrexato. Los vasodilatadores, anticoagulantes y antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para el alivio sintomático. Puede ser necesana la intervención quirúrgica para la estenosis vascular sintomática o la oclusión (Langford. 1995). El curso clínico de la arteritis de Takayasu es variable. Aunque se produce la remisión espontánea, la mayoría de los pacientes requieren tratamiento. El pronóstico parece estar relacionado con la presencia y gravedad de las complicaciones. Las principales complicaciones incluyen la retinopatia de Takayasu. hipertensión secundaria, insuficiencia de la válvula aórtica y aneurisma aórtico/arterial (Langford, 1995). La supervivencia desciende con el paso del tiempo, a medida que aumenta el número y gravedad de estas complicaciones. Las muertes relacionadas con la enfermedad generalmente se producen por complicaciones vasculares, como insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio y rotura de aneurisma (Langford, 1995).
Angeítis primaria del sistema nervioso central Epidemiología La angeítis primaria del sistema nervioso central (PACNS) es una situación rara donde la dificultad para hacer un diagnóstico definitivo impide los estudios epidemiológicos. PACNS es ligeramente más habitual en hombres que en mujeres (4:3) y comienza a una edad media de 43 años (Langford, 1995),
dificultad para obtener un diagnóstico certero de esta enfermedad, la biopsia es igual de importante para descartar otras posibles etiologías. Histológicamente, existe una inflamación segmentaria mixta con necrosis que afecta predominantemente a arterias craneales de pequeño y mediano tamaño. La inflamación por granulomatosis puede estar presente. A menudo se detecta trombosis; las arterias extracraneales raramente se afectan (Langford, 1995; Rhodes, 1995). Por eso, deben realizarse en todos los casos diagnósticos dilerenciales cuidadosos para decidir las pruebas apropiadas tanto para apoyar un diagnóstico de PACNS como para descartar otros procesos. La combinación de la resonancia magnética (RM) y LCR normales tiene un fuerte valor predictivo negativo y excluye la consideración de PACNS en la mayoría de las situaciones clínicas (Calabrese, 1997).
Tratamiento y pronóstico El tratamiento intensivo está indicado para los pacientes donde se han descartado otras alteraciones, el diagnóstico de PACNS se mantiene, y hay evidencia de dificultades neurológicas progresivas (Calabrese, 1997). Se defiende la terapia combinada de corticoides y ciclofosfamida diarias; sin embargo, el pronóstico de PACNS es malo, con un 60% a un 70% de pacientes que fallecen por la enfermedad antes de un año desde el diagnóstico (Langford. 1995).
Enfermedad de Kawasaki Rasgos clínicos Los pacientes con PACNS presentan cefaleas; déficit focales neurológicos, y estado mental alterado, paraparesia. cuadriparesia. neuropatías craneales, ataques y ataxia (Calabrese, 1997; Fauci. 1998). Los síntomas iniciales están más generalizados y los signos y síntomas focales generalmente se desarrollan más tarde en el curso de la enfermedad (Langford. 1995). El quince por cíenlo de los casos tienen afectación de la médula espinal (Calabrese. 1997). El curso puede ser progresivo rápidamente o crecer y decaer durante un largo periodo de tiempo. Los síntomas sistémicos son raros.
Hallazgos clínicos de laboratorio Los estudios de laboratorio no son útiles para hacer un diagnóstico de PACNS, pero juegan un importante papel en la exclusión de otras enfermedades. La VSG está elevada en la mayoría, pero no en todos, estos pacientes. Solamente se ha visto anemia en el 17% de ellos, y otros parámetros hematológicos son generalmente normales. El FR, ANA y ANCA están ausentes típicamente. Sin embargo, el liquido cefalorraquídeo (LCR) es generalmente anormal con hallazgos que incluyen presión de apertura aumentada, proteínas elevadas y pleocitosis linfocítica. Como el LCR puede ser completamente normal, estas pruebas no siempre excluyen la posibilidad de vasculitis (Langford. 1995).
Diagnóstico El diagnóstico de PACNS continúa siendo de exclusión. Los criterios diagnósticos propuestos han incluido la disfunción del SNC que no se explica por exploración clínica, de laboratorio o neurologica: documentación por angiograma y/o biopsia de una arteritis dentro del SNC; y ausencia de una vasculitis sistémica u otra condición para la cual los rasgos angiográficos o patológicos podrían ser secundarios. Debido a la inevitable dificultad en cuanto al último criterio y el pobre poder discriminatorio de la angiografía en cuanto a la enfermedad vascular inflamatoria frente a la no inflamatoria (Calabrese, 1997), las biopsias de SNC están infrautilizadas. El papel de la biopsia cerebral en el diagnóstico de PACNS permanece en controversia, aunque algunos defienden que esta biopsia es esencial para hacer un diagnóstico definitivo (Calabrese, 1997). La exclusión de una biopsia cerebral como método generalizado se debe no sólo a la naturaleza invasiva sino también por la incapacidad de demostrar la vasculitis histológica debido a la naturaleza heterogénea del proceso. El rendimiento de la biopsia puede aumentarse mediante la obtención de muestras de vasos tanto de parénquima como de la leptomeninge. Por la
La enlermedad de Kawasaki o síndrome linfonodular mucocutáneo es una forma de vasculitis que aféela a arterias de pequeño y mediano calibre. La enfermedad se produce típicamente en niños que presentan linfadenitis cervical y alteraciones en piel y mucosas. La enfermedad de Kawasaki generalmente es autolimitada. pero la arteritis provoca aneurismas coronarios en el 25% de los pacientes. La muerte se produce en hasta un 3% de los pacientes, generalmente por vasculitis coronaria. Los autoanticuerpos de células anliendoteliales han sido determinados en pacientes con enfermedad de Kawasaki (Fauci, 1995).
RESUMEN El diagnóstico de las afecciones vasculares sistémicas necrotizantes requiere un alto grado de sospecha y puede ser difícil debido al amplio número de consideraciones de diagnóstico diferencial. No existen pruebas clínicas de laboratorio patognomónicas en pacientes con afecciones vasculares sistémicas necrotizantes. pero estas pruebas son útiles para definir el alcance y los patrones de la afectación del órgano. Los ANCA y sus asociaciones con la vasculitis sistémica necrotizante. particularmente la asociación de c-ANCA con WG. se han convertido en una prueba serológica importante utilizada en la evaluación de estos pacientes. Sin embargo, los médicos y técnicos de laboratorio que usan esta prueba deben entender a fondo las características operativas, incluyendo limitaciones, de la misma cuando la realizan en su laboratorio, La biopsia de tejido del lugar(es) sintomático(s) con confirmación histológica de vasculitis necrotizante continúa siendo el procedimiento de laboratorio más importante para el diagnóstico de las afecciones vasculares necrotizantes sistémicas.
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4 5
Enfermedades autoinmunes organoespecíficas David J. Bylund, M.D. Robert M. Nakamura, M.D.
MÉTODOS DE DETECCIÓN
1000
Microscopía de inmunofluorescencia indirecta PIEL
1001
1011
Diabetes mellitus 1013
Anemia perniciosa Enteropatia sensible al gluten SISTEMA NERVIOSO
1013
Miastenia gravis Esclerosis múltiple 1006
Neuropatías Autoanticuerpos contra proteínas neuronales
Enfermedades hepáticas 1009
Enfermedades tiroideas
Autoanticuerpos contra gangliósidos neuronales OTROS ÓRGANOS
Autoanticuerpos RIÑON
PÁNCREAS
TRACTO GASTROINTESTINAL
Autoanticuerpos GLÁNDULA TIROIDES
1011
Enfermedad de Addison
Pénfigo Penfigoide Epidermólisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso Dermatitis herpetiforme Dermatosis IgA lineal Lupus eritematoso Vasculitis HÍGADO
GLÁNDULA SUPRARRENAL
1014
Corazón 1010
Glomerulonefritis Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular
Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse como sistémicas o enfermedades específicas de órgano. En este capitulo se tratan la mayoría de las enfermedades autoinmunes organoespecíficas enumeradas en la Tabla 45-1. La principal característica clínica de estos trastornos autoinmunes es la inflamación crónica, que generalmente se localiza en un único órgano específico en cada enfermedad. Dentro de este grupo de enfermedades autoinmunes, aparece con cierta Irecuencia un agrupamiento familiar. Los autoanticuerpos más relevantes pueden ser específicos de la especie o no serlo, pero si exhiben especificidad por un antígeno presente en el tejido u órgano dañado. En este capitulo también se incluyen algunas enfermedades con autoanticuerpos y lesiones inflamatorias restringidas a uno o varios órganos, que combinan las características clínico-patológicas de los dos tipos de trastornos, las enfermedades autoinmunes sistémicas y las específicas de órgano. Como ejemplo de éstas encontramos enfermedades autoinmunes hepáticas como la cirrosis biliar primaria (CBP) o la hepatitis autoinmune (AiH). Si excluimos los autoanticuerpos antireceptores tiroideos, la implicación de los autoanticuerpos en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes específicas de órgano aún no ha sido demostrada.
MÉTODOS DE DETECCIÓN La microscopía de inmunofluorescencia indirecta (IFID), descrita brevemente más adelante, es el método que se utiliza con mayor Irecuencia para
Músculo RESUMEN
1014
BIBLIOGRAFÍA
1014
detectar la presencia de autoanticuerpos circulantes dirigidos contra órganos o tejidos específicos. Sin embargo, gracias a la mejora de los aspectos técnicos, los laboratorios clínicos utilizan con mayor frecuencia los ensayos ELISA (análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas).
Microscopía de inmunofluorescencia indirecta Este procedimiento es esencialmente el mismo para las distintas pruebas, excepto por los suslratos utilizados como objetivo para los autoanticuerpos. El procedimiento general es el siguiente: 1. Preparar diluciones para el cribado o diluciones seriadas de los sueros de los pacientes, y de los controles apropiados con fosfato salino tamponado (PBS). 2. Incubar en cámara húmeda durante 20 a 30 minutos las diluciones de los sueros de los pacienles y los controles sobre secciones de tejido criopreservadas sobre portas de cristal multiporo. No permitir que se sequen los portas. 3. Sacar los portaobjetos de la cámara húmeda. Lavar brevemente y con cuidado cada portaobjetos, dos o tres veces, usando para ello PBS a temperatura ambiente. Después lavar los portaobjetos en PBS durante 15 minutos, cambiando la solución de lavado una vez en este tiempo.
CAPÍTULO 45
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1001
ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Tabla 45-1 Enfermedades autoinmunes organoespecíficas E n f e r m e d a d del ó r g a n o Glándula tiroides Tiroiditis aulommune
M é t o d o / s de d e t e c c i ó n
Autoanticuerpos
Enfermedad de Graves
Receptor de TSH
ELISA. IFID sobre tiroides de mono no lijada IFID sobre tiroides de mono fijada en metanol; hemaglutinación pasiva, aglutinación en látex Ensayo de unión al radiorreceptor, bioensayo do cAMP
Glándula suprarrenal Enfermedad de Addison
Adrenocortical
IFID en corteza adrenal de mono o humana no fijada
Glandula parattroides Paratiroides
Proteínas endoteliales paratiroideas
IFID sobre glándula paratiroides bovina no lijada
Células del islote Asociados a insulina Anti-decarboxilasa de á c i d o glulámico
IFID sobre páncreas humano no lijado, grupo sanguíneo O
PM-1. Jo-1
ELISA; inmunodifusión
Células parietales gástricas Factor intrínseco Células de conductos salivares Células panetalos gástricas
Páncreas Diabetes mellitus dependiente de insulina Músculo Dermatomiositis/polimiosilis Tracto gastrointestinal Gastritis atròfica Anemia perniciosa
Peroxidasa tiroidea Tiroglobulma
Radioinmunoprecipitación ELISA. RÍA. inmunotransferencia
Colitis ulcerosa
Colon; lipopolisacárido; asociado a p-ANCA
Enfermedad de Crohn Enfermedad celiaca
Reticulina Transglutammasa tisular IgA de endomisio Gliadina Reticulina
IFID en estómago/riñón de ratón Ensayo de unión a vitamina B,. radiactiva IFID en glándula salival humana no fijada IFID en sustrato de mucosa gástrica humana, de mono, de ratón o de rala IFID sobre colon humano o de rata, hemaglutinación IFID en neutrófilos fijados en elanol IFID sobre riñon de ratón ELISA IFID sobre e s ó f a g o de mono ELISA IFID sobre n ñ ó n de ratón
Cirrosis biliar primaria Colangitis esclerosante primaria
Músculo liso Microsomas hepáticos y renales ANA Mitocondrial ( M 2 ) p-ANCA
IFID en estómago/riñón de ratón IFID on oslómago/riñón de ralón; ELISA Células Hep-2 IFID en estómago/nñón de ratón, ELISA IFID sobre neutrófilos fijados en elanol
Neurológicas Miastenia gravis
AChR
Inmunoprecipitaaón de AChR conjugado con la-bungarotoxina (músculo esquelético humano); ELISA
Hígado Hepatitis autoinmunc
,26
Enfermedades desmielinizantes (a saber, esclerosis múltiple)
Mielina; lubulina, proteina básica de la mielina; FID sobre m é d u l a espinal de mamitero; ELISA; glucoproleina asociada a mielina inmunotransferencia
Ríñones Enfermedad por anticuerpos anti-GBM Piel Pénfigo Penfigoide Dermatitis herpetiforme
Membrana basal glomerular y pulmonar
Espacios intercelulares (desmogleinas) BMZ (proteínas de hemidesmosomas) Transglutaminasa tisular IgA de endomisio ICS y BMZ
Pénfigo paraneoplásico IgA BMZ Dermatosis lineal por IgA IgA ICS Pénligo por IgA
ELISA
IFD sobre muestra de biopsia de piel. IFID sobre e s ó f a g o de mono o cobaya IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre esófago de mono ELISA IFID sobre e s ó l a g o de mono IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre epitelio de ve|iga de rata IFD sobre biopsia de piel humana. IFID sobre esófago de mono IFD sobre biopsia de piel humana; IFID sobre esófago de mono
AChR = receptor de acetilcolina; BMZ = zona de memprana basal; IFD = microscopía de inmunofluorescencia directa; ELISA • ensayo de inmunoabsorción ligado a onzima; ICS = espacios intercelulares IFID - microscopía de Inmunofluorescencia indirecta; p-ANCA • anticuerpos perinucleares anticiloplasma de neutrófilos; RÍA = radioinmunoensayo. TSH = hormona estimulante de litoides
4. Ir sacando cada portaobjetos por separado del baño de PBS. secar el exceso de líquido de cada portaobjetos, y colocarlos de nuevo en la cámara húmeda. Dispensar en cada pocilio la dilución de conjugado marcado con fluoresceína. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos. No permitir que se sequen los portaobjetos. 5. Lavar los portaobjetos con PBS y azul de Evans como colorante de contraste durante 10 minutos. 6. Montar los cubreobjetos. 7. Observar los portaobjetos al microscopio de fluorescencia. 8. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4°C.
PIEL La detección de autoanticuerpos es muy útil en el estudio de las enfermedades cutáneas ampollosas. En pacientes con enfermedades autoinmunes de la piel, los autoanticuerpos incluyen aquellos dirigidos contra la zona de membrana basal (BMZ), los espacios intercelulares (ICS) o los vasos sanguíneos dérmicos, como se recoge en la Tabla 45-2. Se encuentran disponibles algunas revisiones técnicas excelentes que detallan el uso de la inmunofluorescencia para el examen de la piel (Flotte, 1995; Crosby, 1993).
1002
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 45-2 Enfermedades autoinmunes de la piel H a l l a z g o s inmunológicos esenciales para el diagnóstico Espacios intercelulares epidérmicos Péntigo Pénligo paraneoplásico Zona de membrana basal Penligoide Penligoide gostacional Epidermólisis ampollosa adquirida Dermatosis lineal por IgA Dermatosis ampolloso crónica de la inlancia Papilas dérmicas ± zona de membrana basal Dermatitis herpetilorme Hallazgos inmunológicos útiles para el diagnóstico Manifestaciones cutáneas en enfermedades reumáticas sistémicas Dermatomiositis/polirniosilis Lupus eritematoso Enfermedad mixta del tejido conjuntivo Policondritis recurrente Sindrome de Sjogren Esclerosis sistèmica Vasculitis
tóxica, lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave (MG), penligoide y liquen plano. Raramente se observan en individuos sanos (<1%) (Becker. 1993; Mutasim. 1993; Nousari, 1997).
Pénfigo
foliáceo
Los subgrupos de pénligo foliáceo incluyen el PF idiopático, PF endémico (fogo selvagem), PF inducido por fármacos y pénfigo eritematoso (PE). El principal antígeno en el PF es la desmogleina 1 (Lin. 1998: Naparstek, 1993). IFD. Para todas las formas de PF excepto para PE, el patrón de IFD es similar al de PV. En algunos casos, el mareaje predomina en la epidermis superficial, a nivel de la capa granulosa. En PE, hay un depósito lineal de IgG en ICS epidérmicos combinado con inmunorreactivos granulares a lo largo de BMZ. IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG ICS en prácticamente el 100% de los pacientes de PF con enfermedad activa (Nousari, 1997). Casi el 90% de los pacientes con PF tienen autoanticuerpos detectables cuando se utiliza esófago de mono para los estudios indirectos. El esófago de cobaya es algo más sensible ya que detecta el 10% restante de los pacientes y los títulos indirectos tienden a ser mayores que los obtenidos cuando se utiliza esófago de mono (Jiao. 1997).
Pénfigo
paraneoplásico
Pénfigo El pénfigo se refiere a un grupo de enfermedades que se caracterizan clínicamente por ampollas e histológicamente por acantólisis. Existen tres subtipos principales de pénfigo: pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo y pénfigo paraneoplásico (Nousari, 1999). Cada uno de estos subtipos se caracteriza por la existencia de autoanticuerpos contra las moléculas de adhesión de los desmosomas. Para maximizar la sensibilidad diagnóstica de las evaluaciones iniciales, se utilizan tanto la IFID para detectar autoanticuerpos circulantes como la microscopía de inmunofluorescencia directa, que resulta más informativa.
El pénfigo paraneoplásico (PNP), una enfermedad poco común caracterizada por la presencia de ampollas dolorosas o erosiones de las membranas mucosas y piel, es una afección de pacientes con neoplasias. Estas ampollas o lesiones aparecen en la boca, pero también se han descrito en mucosas de otros lugares. Las neoplasias malignas que se han asociado con PNP incluyen linfoma maligno, leucemia linfocitica crónica, limoma, carcinoma broncogénico de células espinosas y sarcomas. PNP es relacionado con neoplasias benignas rara vez (Mutasim, 1993; Flotte, 1995; Camisa, 1993).
Pénfigo vulgar El pénfigo vulgar es una enfermedad poco común que aparece en todos los grupos raciales y étnicos, aunque la incidencia es ligeramente superior en la población judía. La enfermedad afecta a ambos sexos y ocurre más comúnmente en individuos de entre 40 y 60 años (Becker. 1993). La desmoglema 3 es el principal antígeno en el PV (Lin, 1998; Naparstek. 1993). IFD. La IFD de piel perilesional muestra inmunofluorescencia lineal/granular de inmunoglobulina G (IgG) y C3 en ICS sin depósitos en BMZ (Fig. 45-1). Este patrón se describe a menudo como en forma de "alambrada", que produce el mareaje preferentemente de la mitad inferior de la epidermis. La IgG, especialmente lgG4, está presente en cerca del 100% de los pacientes mientras que C3 está presente entre el 50% y el 100% de los pacientes, generalmente en áreas acantolíticas (Becker, 1993: Flotte, 1995, Lin, 1998). Se observan IgA o IgM inmunorreactivas en el 30% y el 50% de los pacientes (Izuno. 1986). Se muestra inmunofluorescencia debida a C3 exclusivamente, sin IgG. en el pénfigo inducido por fármacos y en el impétigo (Nousari, 1997). IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG contra la superficie de células epiteliales de la capa espinosa en el 100% de los pacientes con enfermedad activa (Nousari,1997). Se considera al esófago de mono como el mejor sustrato tisular. La presencia de autoanticuerpos de PV es anormal a cualquier titulo. El título se suele correlacionar con la actividad de la enfermedad, y títulos que van en aumento pueden ser predictivos de una recaída (Becker, 1993; Crosby, 1993). Sin embargo, existen excepciones a esta correlación, por lo que los exámenes seriados de títulos de IgG para monitorizar estos pacientes se deben correlacionar cuidadosamente con los hallazgos clínicos. Los pacientes que sólo muestran lesiones de la mucosa oral pueden no tener autoanticuerpos de PV circulantes detectables. En estos pacientes, el diagnóstico se realiza utilizando IFD (Izuno, 1986). Se detectan bajos títulos de autoanticuerpos con las características de ICS de forma poco frecuente en diversas condiciones como son las quemaduras de piel, alergia a penicilinas u oíros lármacos, necrólisis epidérmica
Figura 45-1. Inmunofluorescencia directa de lesión de piel en el pénfigo que muestra depósitos lineales/granulares de IgG sobre las superficies celulares de los queratinocitos (espacios intercelulares), sin fluorescencia en la zona de la membrana basal (x 400).
CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Mutasim (1993) propuso los siguientes criterios para definir PNP: • Erosiones mucosas dolorosas y erupciones polimorfas de la piel, con lesiones papulosas que progresan a ampollas y lesiones erosivas que afectan al tronco, las extremidades, las palmas de las manos y las plantas de los pies, asociadas con una neoplasia oculta o clínicamente conocida. • Acantólisis suprabasilar, necrosis de queratinocitos y cambios en la mterfase vacuolar de secciones de tejido microscópicas y ligeras. • IgG contra ICS combinado con depósito lineal / granular de complemento e IgG a lo largo de BMZ. • Autoanticuerpos circulantes contra ICS que se unen a epitelio vesical de roedor y esófago de mono o cobaya. • Inmunoprecipitación de un complejo de cuatro proteínas queratinociticas unidas por los autoanticuerpos: esta es una herramienta de investigación principalmente, pero puede ofrecer información clínica útil en casos difíciles. PNP asociado a neoplasias malignas señala un pronóstico extremadamente malo. Aunque se ha descrito la mejora clínica o la remisión de las lesiones mucocutáneas tras la resección del tumor, el tratamiento de PNP asociado a malignidad es de soporte. PNP asociado a una neoplasia benigna remitió tras la resección del tumor (Mutasim, 1993). IFD. La IFD de piel perilesional o de mucosa de pacientes con PNP detecta IgG contra ICS mmunorreactivo con o sin componentes del complemento. También están presentes depósitos granulares o menos frecuentemente lineales de componentes del complemento (C3, C1q) en BMZ. además de la inmunofluorescencia de IgG contra ICS (Mutasim, 1993). IFID. La IFID con esófago de mono o epitelio vesical de roedor pone de manifiesto una IgG inmunorreactiva tanto en ICS como a lo largo de BMZ. La unión a epitelio vesical de roedor (rata o ratón) es un hallazgo diferencial importante que diferencia PNP de otros tipos de pénfigo (LIU, 1993: Mutasim, 1993).
Pénfigo IgA (Dermatosis intercelular IgA) IFD. La dermatosis intercelular por IgA es una enfermedad vesículo-ampollosa inlraepidérmica poco frecuente. Los estudios directos muestran una inmunofluorescencia lineal en ICS que es suprabasilar. y particularmente acentuada en la epidermis superior. IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgA anti-ICS (Flotte. 1995: Teraki, 1991).
Penfigoide Penfigoide
ampolloso
El penfigoide ampolloso es una enfermedad ampollosa subepidérmica de causa desconocida que aparece en pacientes de cualquier edad, pero que principalmente afecta a adultos mayores de 60 años. Esta enfermedad involucra de forma típica las superficies flexoras de brazos, piernas, ingles, axilas y abdomen inferior. Las membranas mucosas orales también pueden afectarse, pero estas lesiones raramente son el signo de presentación predominante, un punto que diferencia el penfigoide del PV.
mi Figura 45-2. Inmunofluorescencia directa de lesión de piel en el penligoide que mueslra depósito intenso lineal de IgG a lo largo de la zona de membrana basal (x 400). Se puede identificar un patrón lineal epidérmico en BMZ en trastornos clínicos dispares, incluyendo el penfigoide de la membrana mucosa benigno, epidermólisis ampollosa adquirida (EBA). penfigoide gestacional (herpes gestationis) y lupus eritematoso ampolloso (BLE). Para ayudar a diferenciar estos trastornos, son útiles las biopsias directas de piel separada en solución salina (Domloge-Hultsch, 1991). En BP y penfigoide gestacional, se localizan depósitos de IgG lineal en el lado epidérmico o techo de la separación. Sin embargo, se puede observar inmunofluorescencia lineal de C3 a lo largo del lado epidérmico y dérmico de la separación. En EBA y BLE, se observan inmunorreactantes en el lado dérmico de la separación (Nousari, 1997). La correlación clínica se convierte entonces en un factor importante en la resolución de las alternativas diagnósticas. IFID. La BP se caracteriza serológicamente por la presencia de autoanticuerpos circulantes contra BMZ. tanto cutánea como de la mucosa oral. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG contra BMZ en cerca del 50% de los pacientes con penfigoide. pero la sensibilidad aumenta hasta el 70% y 80% si se utiliza como sustrato piel separada en solución salina (Nousari, 1997; Domloge-Hultsch. 1991: Izuno, 1986). En el BP los autoanticuerpos solo se unen al techo de la piel separada en el 80% de los pacientes. En EBA y BLE. los autoanticuerpos se unen a la base, o suelo dérmico, de la separación en el 50% de los pacientes (Korman. 1993; Crosby. 1993: Domloge-Hultsch. 1991).
Penfigoide benigno de membranas mucosas
Los principales anlígenos en BP son dos proteínas hemidesmosómicas de queratinocitos, una proteína ¡ntracelular de 230 kDa (antígeno penfigoide ampolloso 1) y una proteína transmembrana de 180 kDa (antígeno penfigoide ampolloso 2) (Nousari, 1997; Lin, 1998).
El penfigoide benigno de membranas mucosas (BMMP) o penfigoide cicatrizal afecta de forma constante a las mucosas orales y oculares. Otras mucosas afectadas por estas lesiones pueden ser la nasofaringe, laringe, genitales, recto y esófago (Mutasim, 1993). La curación de la lesión está seguida de su cicatrización, y la ceguera es la complicación más temida.
IFD. La IFD sobre piel perilesional libre de ampollas del borde de una ampolla fresca es sensible para el diagnóstico y demuestra de forma típica inmunofluorescencia lineal en BMZ en cerca del 100% de los pacientes (Fig. 45-2). Los inmunorreactivos predominantes son C3 e IgG o C3 exclusivamente. También IgA o IgM pueden estar presentes en casi un 25% de los pacientes, generalmente en menor intensidad y en combinación con IgG (Korman, 1993; Crosby, 1993; Izuno, 1986).
IFD. El patrón de IFD es similar al que se observa en BP. La sensibilidad es del 90% pero aumenta si se realizan biopsias adicionales. El penfigoide cicatrizal localizado crónico, también conocido como penfigoide cicatrizal de Brunstmg-Perry. es una variante del BMMP que se localiza en las regiones de la cabeza y cuello (Sarret. 1991). En esta variante, la IFD demuestra la presencia de IgG exclusivamente, a lo largo de BMZ, sin IgA o IgM; los autoanticuerpos circulantes contra BMZ son poco frecuentes (Izuno, 1986).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG en menos del 33% de los pacientes con BMMP cuando se utiliza exclusivamente mucosa oral como sustrato pero sólo en el 5% a 15% de los pacientes si se utilizan sustratos estándar (Crosby, 1993; Sarret. 1991; Nousan, 1997). El estudio de piel humana separada en solución salina puede revelar IgA, IgG o ambos depósitos en cerca del 80% de estos pacientes (Sarret. 1991). No existe correlación entre la presencia y título de autoanticuerpos y la actividad de la enfermedad.
Penfigoide gestacional Aunque es poco frecuente, la enfermedad ampollosa subepidérmica penfigoide gestacional (GP) (herpes gestationis) se desarrolla durante el embarazo o poco tiempo después (Izuno, 1986). Las lesiones son de forma tipica pruriginosas y se localizan predominantemente en el abdomen o extremidades. IFD. Con IFD tan sólo se pueden encontrar típicamente depósitos lineales de C3 en BMZ. Se detectan depósitos de IgG asociados en el 30% al 40% de los casos, pero son raros los de IgA o IgM (Izuno, 1986). IFID. Los depósitos de C3 sólo pueden ser visualizados a lo largo de BMZ, pero los títulos de autoanticuerpos suelen ser demasiado bajos para ser observados utilizando sustratos estándar de IFID. Sin embargo se puede detectar el complemento utilizando inmunofijación de complemento si se utiliza como sustrato piel humana normal separada en solución salina (Izuno, 1986; Nousari. 1997).
Epidermólisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso EBA y BLE son enfermedades ampollosas subepidérmicas adquiridas caracterizadas por la presencia de autoanticuerpos contra la proteína de colágeno lipo VII en BMZ (Gammon, 1993). EBA puede aparecer a cualquier edad, pero se presenta más comúnmente en adultos de entre 40 y 50 años. Todos estos pacientes están afectados por una combinación de vesículas, erosiones, cicatrices, milia y despigmentación de la piel, localizadas más a menudo en superficies extensoras de piel susceptibles de traumatismo como las rodillas, codos, o el dorso de manos y pies (Gammon. 1993) BLE ocurre en pacientes con lupus eritematoso. IFD. Utilizando IFD, se observan inmunorreactivos lineares en BMZ en los pacientes con EBA y BLE, que suelen estar formados por IgG y C3. Utilizando biopsias directas de tejido de piel separada por solución salina, los inmunorreactivos se localizan en el lado dérmico, o suelo, de la vesícula inducida. IFID. Solo el 40% de los pacientes con EBA tienen autoanticuerpos demostrables cuando se utiliza piel humana sin tratamiento salino como sustrato. Utilizando la técnica indirecta de piel separada en solución salina, se pueden identificar autoanticuerpos circulantes en cerca del 50% al 85% de los pacientes (Fine. 1994; Nousari. 1997).
Dermatitis herpetiforme La dermatitis herpetiforme es una enfermedad ampollosa subepidérmica pruriginosa asociada a enteropatia sensible al gluten. DH también está asociada al tipo de histocompatibilidad HLA-B8. DR3 (Crosby. 1993). IFD. La biopsia directa debe ser de la piel perilesional porque una biopsia de la piel lesionada podria resultar negativa. La IFD delecta IgA granular en la cúspide de las papilas en aproximadamente el 80% al 100% de los pacientes con DH (Flotte, 1995) (Fig. 45-3). Puede haber depósitos de IgA a lo largo de BMZ de forma concomitante. Se encuentran con frecuencia depósitos de C3 con IgA, pero IgG o IgM se detectan poco frecuentemente (Izuno. 1986). IFID. Los pacientes con DH no tienen autoanticuerpos contra BMZ detectabas. Sin embargo, se detectan autoanticuerpos IgA contra endomisio en el 80% de los pacientes con DH. Estos autoanticuerpos son identificados por su
Figura 45-3. Inmunofluorescencia directa oe lesión de piel en dermatitis herpetiforme mostrando deposición granular de IgA predominantemente en las cúspides de las papilas dérmicas (x 400).
patrón característico de inmunofluorescencia en la mucosa muscular subepitelial de esófago de mono (Peters. 1989).
Dermatosis IgA lineal La dermatosis IgA lineal es un cuadro subepidérmíco ampolloso poco común considerado como una entidad clínica distinta en vez de ser una variante de DH como se pensaba (Izuno. 1986; Crosby. 1993). La mayoría de los casos son idiopáticos. pero algunos se asocian con fármacos (Nousari, 1999.1995; Kuechle. 1994). La dermatosis crónica ampollosa infantil es similar a la dermatosis IgA lineal, tanto clínicamente como inmunopatológicamente (Elenitsas, 1995). IFD. En casi el 100% de los casos, la IFD demuestra depósitos lineales intensos de IgA a lo largo de BMZ pero ninguno en las papilas dérmicas (Izuno. 1986). Aunque casos ocasionales pueden mostrar de forma concomitante un mareaje débil de C3 en BMZ, otros inmunorreactivos distintos de IgA no suelen estar presentes. IFID. Se pueden detectar autoanticuerpos circulantes IgA contra BMZ con la IFID en cerca del 10% al 30% de los casos (Flotte, 1995; Crosby, 1993).
Lupus eritematoso El lupus eritematoso es una enfermedad caracterizada serológicamente por la presencia de autoanticuerpos múltiples incluyendo anticuerpos antmucleares, anti-ADN nativo, antihistonas y anti-Sm. IFD. Con la IFD, se observan depósitos característicos gruesos, granulares y continuos de inmunoglobulinas y complemento a largo de la BMZ epidérmica en el 50% al 95% de los pacientes con LES (Izuno, 1986). Los depósitos en BMZ del complejo de ataque a la membrana, C5b-9. en piel de la lesión pueden ser marcadores de LES (Helm. 1993). A pesar de que estos pacientes tienen comúnmente depósitos de IgG, IgM y componentes del complemento (C3 o C1q) (Fig. 45-4), se pueden identificar inmunoglobulinas de todas las clases (Izuno, 1986). Cuando la piel no lesionada contiene al mismo tiempo inmunoglobulinas IgG, IgA o IgM en el patrón típico, es más probable que el diagnóstico sea LES (Izuno, 1986). Aunque es característico, este patrón de reacción se puede observar en otras enfermedades como la enfermedad mixta del tejido conjuntivo, oermatomiositis. reacción de injerto contra huésped, erupción por fármacos y vasculitis (Izuno. 1986). Por tanto es obligatorio correlacionar los resultados directos tanto con la presentación clínica como con los resultados del estudio de una biopsia de piel por microscopia óptica. Esta información es después interpretada en el contexto de los hallazgos directos individuales para clasificar el tipo clínico de LE. Numerosas publicaciones citan la IFD con la finalidad del diagnóstico de LES a partir de piel obtenida por biopsia, con o sin lesiones, y de lugares expuestos o no expuestos al sol. En pacientes diagnosticados con LES. la piel normal expuesta
CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
al sol se confirma como positiva en cerca del 70% de los casos, mientras que la piel normal no expuesta al sol es positiva en cerca del 40% de los pacientes (Izuno, 1986). Sin embargo, el potencial para predecir la actividad de la enfermedad o la afectación renal de esta forma sigue resultando controvertida (Izuno, 1986). Tal vez la aplicación clínica más práctica de las pruebas de laboratorio es el diagnóstico diferencial de LES del LE discoide (LED). Casi el 95% de los individuos con LED tienen depósitos en BMZ gruesos, granulares y continuos similares a los de LES (Izuno. 1986). Sin embargo, los hallazgos positivos con IFD en LED están confinados a la piel lesionada, mientras que la IFD con piel con o sin lesión puede dar hallazgos positivos en el LES (Izuno. 1986). El lupus eritematoso cutáneo subagudo (LECS) está caracterizado clínicamente por artritis, manifestaciones sistémicas leves y autoanticuerpos antiSS-A/Ro. La IFD de biopsias de piel de estos pacientes detecta depósitos de inmunoglobulina o complemento en tan sólo el 50% de las biopsias de piel lesionada y en el 30% de biopsias de piel no implicada (Izuno. 1986). La IFID es positiva en el 50% al 70% de los pacientes con LECS. Otras enfermedades autoinmunes sistémicas importantes no ofrecen hallazgos específicos para el diagnóstico ni por IFD ni por IFID. Aunque algunos pacientes tienen depósitos granulares de IgM a lo largo de BMZ, se considera este hallazgo inmunopatológico un marcador completamente inespecí-
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fico que puede ser detectado no sólo en enfermedades autoinmunes, sino también en un gran número de dermatitis o en la piel expuesta al sol de individuos clínicamente normales (Izuno. 1986).
Vasculitis Las vasculitis de la piel tienen varios sinónimos, incluyendo vasculitis leucocitoclástica, vasculitis alérgica y angeitis I vasculitis por hipersensibilidad. Histológicamente, los pequeños vasos sanguíneos de la dermis muestran células endoleliales con tumefacción, exocitosis neutrofilica. detritus nucleares ("leucocitoclasis") y trombos conjuntamente con eritrocitos extravasados. IFD. La siopsia de tales lesiones dentro de las 24 horas de su comienzo, puede exhibir depósitos de IgM. C3. fibrinógeno y algunas veces IgG (Fig. 45-5). Un resultado negativo no excluye la vasculitis. La biopsia de una piel de más de 24 horas podría no ser útil puesto que el único hallazgo podría ser el marcaje no especifico del fibrinógeno. La confirmación histológica del diagnóstico se hace por tanto esencial. La púrpura de Henoch-Schónlem se diagnostica cuando se observa inmunofluorescencia vascular granular IgA con o sin C3 dentro del marco clínico apropiado.
Figura 45-4. Inmunolluorescencia directa de piel en lupus eritematoso que muestra inmunorreactivos IgG (A), C1q (B) e IgM (C) granulares, bastante continuos a lo largo de la zona de la membrana basal (x 400).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tes con PBC, pero se observan en pacientes con infección por virus EpsteínBarr, infección por citomegalovírus y otros trastornos infecciosos. Los NOMA están dirigidos contra epítopos de los antígenos M2 y M9 en la PBC. pero no contra los mismos antígenos que los AMA (Bylund. 1992). Aunque la trascendencia de los NOMA no está aclarada, su presencia en personas asociadas con pacientes de PBC ha generado preguntas sobre la posible existencia de agentes contagiosos en los sueros de eslos pacientes (Bylund, 1992).
Autoanticuerpos
antimúsculo
liso
Los anticuerpos antimúsculo liso (SMA) se encuentran en aproximadamente un 50% de los pacientes con AiH clásica y suelen aparecer junto con ANA (Nakamura. 1991). Cuando se acompañan de un trastorno hepático, los SMA están dirigidos contra actina F, que forma parte del citoesquelelo Figura 45-5. Inmuno-fluorescencia directa de piel en vasculitis cutánea de pequeños de la célula hepática en asociación directa con la membrana plasmática de vasos que muestra inmunofluorescencia vascular de los vasos del plexo capilar super- las células hepáticas (Nakamura, 1991). Es típico que el título de SMA sea ficial. Esta biopsia es de un paciente con púrpura de Henoch-Schólnem y demuestra superior o igual a 1:80 en el suero de pacientes con AiH. Sin embargo, se el inmunomarcaje vascular por IgA característico de esta enfermedad (x 400). pueden detectar títulos bajos de SMA en pacientes con otros trastornos y en individuos que aparentemente están sanos (Nakamura, 1991).
HÍGADO Autoanticuerpos Autoanticuerpos
antinucleares
Los autoanticuerpos antinucleares (ANA) se detectan más frecuentemente por IFID, aunque la identificación de autoanticuerpos específicos por ELISA se está haciendo más popular en los laboratorios clínicos. Los ANA son un grupo muy heterogéneo, y casi todos los subtipos que aparecen en los trastornos reumatológicos se pueden encontrar en personas con AiH. Los patrones tanto homogéneos como moteados en células Hep-2 se pueden identificar más frecuentemente en pacientes con AiH. También se han descrito autoanticuerpos específicos contra el ADN de doble cadena en enfermedades hepáticas (Manns, 1992). Se detectan títulos de ANA superiores a 1:80 en casi el 80% de los pacientes con AiH (Nakamura. 1991). Sin embargo, también pueden encontrarse ANA en el 60% de pacientes con PBC, 50% de pacientes con trastomos hepáticos relacionados con el alcohol, en el 40% de pacientes con hepatitis viral tipo B y en el 25% de pacientes con AiH que también tienen autoanticuerpos antimicrosomales renales y hepáticos (LKMA) (Nakamura, 1991). Se pueden identificar autoanticuerpos anticentrómero en el 10% a 15% de los pacientes con PBC.
Autoanticuerpos
Se utiliza con frecuencia la IFID sobre sustrato de tejido estomacal de roedor para detectar SMA, de manera que se tiñe la capa muscularis propria del estómago con un patrón uniforme y constante (Fig. 45-7). Es característica la tinción específica de la muscularis mucosa y las paredes de los vasos sanguíneos. Si se utiliza como sustrato un bloque de tejido de estómago/riñón de roedor, se puede producir un mareaje débil en las zonas mesangiales glomerulares debido a la presencia de actina F en esta región. Si se utilizan células Hep-2 en vez de otros sustratos, la IFID revela un mareaje citoplasmático de aspecto "cableado" cuando están presentes los SMA.
antimitocondriales
Se han identificado nueve antigenos mitocondriales por separado que reaccionan con anticuerpos antimitocondriales (AMA). Los AMA dirigidos contra los antígenos M2 y M9 se consideran los marcadores diagnósticos más importantes de PBC (Bylund, 1992). Los AMA que se detectan por IFID usando como sustrato bloques de tejido de estómago/riñón de roedor muestran un patrón de fluorescencia típico que refleja un mareaje citoplasmático homogéneo de las zonas correspondientes a los túbulos renales y a las células parietales; también son positivos los túbulos distales (Fig. 45-6). Este mareaje de los túbulos distales es un punto importante en la diferenciación de la reactividad de los AMA frente a los LKMA. que no producen mareaje en los lúbulos renales distales. El autoantigeno M2 es una mezcla heterogénea que contiene diversos componentes del complejo mitocondrial 2-oxo-ácido dehidrogenasa. El autoantigeno dominante M2 en pacientes con PBC es la subunidad E2 de piruvato dehidrogenasa (PDH-E2), de 70 kDa (Manns, 1992). El segundo autoantigeno mitocondrial más común es la subunidad de 50 kDa E2 de la cadena ramificada oxo-ceto-ácido-dehidrogenasa (BCOADH-E2) (Manns, 1992). Se pueden encontrar autoanticuerpos mitocondriales de aparición natural (NOMA) en personas que han tenido contacto cercano con pacientes de PBC e incluso en el personal técnico de laboratorio que procesa sueros con PBC (Bylund, 1992). Los NOMA se producen raramente en pacien-
Figura 45-6. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimitocondriales utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón. Hay una inmunofluorescencia difusa de los túbulos renales, incluyendo los túbulos distales (A, x 200) que tiene una apariencia citoplasmática homogénea a mayor aumento (B, x 400).
CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
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zando transferencia westem. aunque este ensayo no está disponible fuera de los laboratorios de investigación. Utilizando el procedimiento de transferencia western. los LKMA se han agrupado en tres subtipos basándose en sus antigenos diana (Manns, 1992). Se ha identificado un componente de 50 kDa del citocromo P-450IID6 como el principal antígeno de los LKMA-1 (Manns, 1992). Se encontró LKMA-2, dirigido contra el citocromo P-450 IIC9, en pacientes que estaban en tratamiento con ticrinafeno (Manns, 1992). un fármaco que ha desaparecido del mercado americano. Se ha identificado LKMA-3 en sueros de pacientes con hepatitis viral crónica tipo D (Manns. 1992).
Otros autoanticuerpos
Figura 45-7. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimúsculo liso utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón ( x 400).
hepáticos
Los restantes grupos de autoanticuerpos hepáticos incluyen los autoanticuerpos anticitoesqueleto. anticitosol, antimembrana hepática, antiláminas nucleares, específicos de hígado y autoanticuerpos antirreceptor de asialoglicoproteína. Todos ellos han sido identificados en pacientes con enfermedades hepáticas autoinmunes, pero su uso como marcadores diagnósticos no está actualmente extendido (Nakamura, 1991).
Autoanticuerpos antimicrosomales de hígado y riñon
Enfermedades hepáticas
Los LKMA producen el mareaje de los microsomas de hepalocitos y de túbulos proximales renales cuando se utiliza un bloque de tejido de estómago/riñón de roedor como sustrato para la IFID (Fig. 45-8). Los túbulos renales dislates son característicamente negativos en la inmunolluorescencia. La aparición simultánea de AMA y LKMA es posible pero muy poco probable.
La Tabla 45-3 recoge los perfiles serológicos típicos en AiH, PBC y colangitis esclerosante primaria (PSC). Estos son trastornos crónicos típicamente definidos por concentraciones séricas de transaminasas elevadas al menos durante seis meses. El diagnóstico clínico diferencial común incluye las enfermedades hepáticas relacionadas con el alcohol, daño hepático inducido por fármacos, hepatitis virales, o hígado graso de diabetes mellitus u obesidad. Otros diagnósticos diferenciales menos frecuentes son la hemocromalosis idiopática, la enfermedad de Wilson, el déficit de a,-antitripsina y la afectación hepática en enfermedades sistémicas.
Se está empezando a disponer de ELISA para detectar LKMA en los laboratorios clínicos. La presencia de LKMA también puede ser confirmada utili-
Hepatitis
autoinmune
La AiH aparece de forma clásica en mujeres de aproximadamente 35 años que presentan una elevada concentración sérica de transaminasas. hipergammaglobulinemia. amenorrea, artralgia y autoanticuerpos circulantes como ANA. SMA y LKMA. Por delinición, estas pacientes no tienen evidencia serológica de hepatitis viral, enfermedad de Wilson u otras enfermedades en el diagnóstico diferencial. Histológicamente, la biopsia hepática muestra hepatitis crónica con necrosis en sacabocados. La respuesta del paciente a corticoides es espectacular y el fallo en la respuesta siembra dudas sobre el diagnóstico de AiH. La AiH es un grupo heterogéneo de enfermedades de etiología dudosa. No hay características palognomónicas para la AiH. El Grupo Internacional de Hepatitis Autoinmune (IAHG) ha integrado las características clinicas y de laboratorio que puede presentar un paciente en un sistema de puntuación para diagnosticar de forma definitiva o probable la AiH. La Tabla 45-4 recoge los parámetros analíticos de laboratorio clínico utilizados como criteno para diagnosticar AiH; en la bibliografía se recogen otros criterios e interpretaciones por puntuaciones (Johnson, 1993: Manns, 1998). De manera relevante, la ausencia de ANA, SMA o LKMA no excluye este diagnóstico. Aunque la bibliografía médica muestra subtipos de AiH basándose en los patrones de autoanticuerpos, la utilidad clínica de estos subtipos no está clara, y la IAHG no recomienda la subdivisión de AiH basada en los perfiles de autoanticuerpos. Desde una perspectiva clínica, la AiH puede ser vista como una enfermedad hepática crónica caracterizada por la presencia de gran variedad de autoanticuerpos. La mayoría de los expertos están de acuerdo en que los tipos 1 y 2 de AiH son las principales formas de esta enfermedad, mientras que los subtipos adicionales aun deben demostrar sus resultados. Figura 45-8. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimicrosomales de higado-riñón utilizando como sustrato estómago/riñón de ratón. Aparece inmunofluorescencia de los túbulos renales proximales. pero no en los túbulos distales. (A. x 200) que tiene una apariencia citoplasmática finamente granular a mayor aumento (B. x 400).
Puesto que los distintos subtipos de AiH están ampliamente citados, la clasificación de AiH de acuerdo con su perfil serológico se discute aquí brevemente. Los ANA caracterizan la forma clásica de hepatitis autoinmune. el tipo 1. Los SMA también se detectan con frecuencia. Aunque los AMA son marcadores diagnósticos de PBC específicos y sensibles, como se describe más tarde, también pueden ser detectados en cerca de 15% de los pacientes con
1008
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
E n f e r m e d a d e s hepáticas a u t o i n m u n e s ANTI-HCV
p-ANCA
ACÁ
Tratamiento Inmunosupresión Inmunosupresión
1
Inmunosupresión Inmunosupresión Soporte, traducir Soporte; traducir Inmunosupresión
i + i
M
+
1 + 1 1
l
-H + 1 1 1
-H
i
i i
AMA
1 1 1
l
•
SMA
SLA
+ 1
Hepatitis autoinmune Tipo 1 Tipo 2a Tipo 2b Tipo 3 Tipo 4 PBC PSC AiC
LKMA
i i i i i ++ i
ANA
i +
Tabla 45-3
SECCIÓN V
+
AiC = colangiiis autoinmune; ANA • anticuerpos antmucleares. p-ANCA = anticuerpos pennucleares anticitoptasma de neulrófitos. LKMA = autoanticuerpos antwrucrosomales de hígado y riñon; SLA = anticuerpos contra antigenos hepáticos solubles; SMA = anticuerpos antimusculo liso. AMA = anticuerpos antimitocondriales. HCV = virus de hepatitis C. PBC = cirrosis biliar primaria: ACÁ = anhidrasa carbónica, PSC = colangitis esclerosante primaria. Modificado de Manns MP Autoinmmune diseases ot the liver Clin Lab Med 1992: 12 25-40 con permiso -
...
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las características clínicas e histológicas de AiH, incluyendo la mejora clínica como respuesla a la terapia mmunosupresora. Se considera que dichos pacientes tienen un síndrome con caracterislicas que se "superponen" tanto con AiH como con PBC. El título de AMA en este subgrupo de AiH raramente es superior a 1:40 (Bylund. 1992). Adicionalmente. el antígeno específico
Tabla 45-4 P a r á m e t r o s d e laboratorio y puntuación para el d i a g n ó s t i c o de hepatitis a u t o i n m u n e (AiH) Parámetros analíticos
Puntuación
Bioquímica Proporción de aumento de fosfatasa alcalina respecto a transaminasas > 3.0 < 3.0 Globulinas séricas totales, globulinas o IgG (x nivel superior normal) >2.0 1,5-2.0 1.0-1.5 <1.0 Autoanticuerpos
-2 +2
+3 +2 +1 0
(IFID)
Adultos ANA. SMA. LKM1 >1 80 1 80 1.40 <1:40 Niños ANA LKM >1:20 1:10 o 1:20 < 1 10 SMA >1:20 1:20 <1:20 AMA Delectado No detectado Adultos y niños (si no se detectan ANA. SMA, LKM1) Otros autoanticuerpos hepáticos (SLA. ASGP-R. LC1) Detectados No deteclados Marcadores virales HAV o HBV aguda HCV por ELISA o RIBA ARN HCV por PCR Otras inlecciones virales activas Seronegativo para virus conocidos Factores genéticos HLA-B8-DR3 o alotipo DR4
+3 +2 +1 0
+3 +2 0 -2 0 +2 0 -3 -2 -3 -3 +3 +1
Adaptado de Johnson PJ. McFarlane IG. Convenors on behall ol the panel: Meeting report International autoimmune hepatitis group. Hepatology 1993: 18: 998-1008. con permiso
y
de estos AMA es similar al que se encuentra en la PBC clásica (Manns. 1992|. La enfermedad hepática en la que se detectan LKMA, denominada AiH tipo 2, se ha subdividido en dos grupos, los tipos 2a y 2b. Generalmente los pacientes con esta variante de AiH tienen ANA y SMA negativos. Sin embargo, se detectan con frecuencia autoanticuerpos contra mtcrosomas tiroideos, tiroglobulina y células parietales. La AiH de tipo 2 se caracteriza por bajos niveles de IgA y porque la hipergammaglobulinemia es menos destacada que la observada en la AiH tipo 1 (Manns. 1992). La de tipo 2a aparece en mujeres jóvenes que tienen altos títulos de KLMA-1. serología negativa para virus de hepatitis C y enfermedad activa pero que responde a esteroides. La variante de tipo 2b aparece en pacientes mayores y la preponderancia femenina es menor. Estos pacientes tienen títulos bajos de LKMA-1, manifiestan enfermedad hepática leve y a menudo tienen serología positiva para el virus hepatitis C. Su enfermedad tiende a responder menos a la inmunosupresión que el tipo 2a. Algunos autores han propuesto un tercer grupo de AiH separado de los otros subgrupos de AiH basándose en la identificación de autoanticuerpos contra antigenos solubles de hígado (SLA) (Manns, 1992). Aunque la determinación de estos autoanticuerpos podría convertirse en importante puesto que se ha evidenciado como el único marcador serológico en cerca del 25% de los pacientes de AiH, los test fiables para detectar SLA son técnicamente difíciles y aún no están disponibles para su uso habitual en el laboratorio clínico (Manns. 1992). Puede ser que los altos títulos de SMA dirigidos contra actina F caractericen un cuarto subgrupo de las AiH que se observa frecuentemente en niños (Manns. 1992).
Cirrosis +3 +2 0
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biliar primaria
La PBC es un trastorno crónico, progresivo y colestásico que sucede típicamente en mujeres jóvenes o de mediana edad. Los pacientes pueden estar asmtomáticos o tener síntomas de colestasis (picores). Estudios de laboratorio han demostrado una elevación de la fosfatasa alcalina con o sin hiperbilirrubinemia. así como un incremento de IgM y AMA. Pueden producirse fenómenos inmunológicos extrahepáticos como el fenómeno de Raynaud. complejo sicca. artritis reumatoide. tiroiditis. esclerodermia o enfermedad celíaca (Manns, 1992: Bylund, 1992). Histológicamente, el hígado muestra varios estadios de colangitis destructiva no supurativa. Los AMA son los marcadores diagnósticos más sensibles y específicos para PBC. Como regla general, un título de AMA superior o igual a 1:160 es altamente predictívo de PBC, aunque cerca del 10% de los pacientes de PBC tienen títulos de AMA de 1:16 o menores (Bylund. 1992). Cerca del 95% de los pacientes con características típicas de PBC han mostrado tener anti-M2 o anti-M9, mientras que el 5% restante de pacientes son AMA negativos. La causa de la PBC es desconocida. Aunque esta enfermedad se asocia clásicamente con AMA séricos, el daño inmune mediado por células T a los conductos biliares interlobuhllares intrahepáticos predomina en las lesiones tisulares (Manns. 1991.1998: Batts. 1991: Poupon, 1996). El reciente descubrimiento de anticuerpos contra retrovirus en pacientes con PBC se ha atribuido a una respuesta inmune o a la reactividad inmune contra proteínas virales que comparten epítopos con retrovirus (Masón. 1998).
CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
1009
El diagnóstico de PBC AMA negativo deriva de la presentación clínica, hallazgos en la biopsia hepática y colangiogratía, siendo esta ultima realizado para descartar PSC.
Colangitis esclerosante primaria La PSC ocurre de forma típica en varones con historia de enfermedad inflamatoria intestinal o diarrea. En el 50% de los pacientes, la enfermedad inflamatoria intestinal ligada a PSC es la colitis ulcerosa. El diagnóstico de PSC se basa de forma general en la colangiografía, que revela un patrón arrosariado característico de los conductos biliares debido a constricciones multifocales en estos lugares. La lesión histológica más destacada es la colangitis fibrosa de conductos biliares grandes o pequeños, aunque en la práctica se puede observar un amplio espectro de lesiones inflamatorias crónicas en la biopsia hepática. Estudios bioquímicos de rutina demuestran la elevación de la fosfatasa alcalina y un aumento de transaminasas con o sin hiperbilirrubinemia. Aunque pueden estar presentes los ANA, los AMA no lo están. Además, la IFID en neutrófilos fijados en etanol y formalma exhibe una alta prevalencia de anticuerpos citoplasmáticos perinucleares atipicos antineutrófilos descritos (Bansi, 1996; Lo, 1994; Gur, 1995: Manns, 1992).
Colangitis autoinmune La colangitis autoinmune es una enfermedad hepática crónica colestásica que no parece ser una variante de PSC (Goodman, 1995: Tsui, 1997). La presentación clínica y la apariencia histológica del hígado se asemejan a la PBC. pero los hallazgos serológicos imitan a los de la AiH tipo 1. No se detectan AMA. Además se ha detectado un autoanticuerpo contra la anhidrasa carbónica en algunos pacientes con AiC (Gordon, 1995). Aunque la conexión entre AiC y PBC no está resuelta, la AiC podría ser lo mismo que una PBC AMA negativa. Generalmente los pacientes responden a la inmunosupresión.
GLÁNDULA TIROIDES Enfermedades tiroideas Las enfermedades tiroideas autoinmunes incluyen la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto (Burek, 1995).
Figura 45-9. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos microsomales tiroideos utilizando tejido tiroideo de mono no lijado como sustrato (x 400).
la población lemenina adulta sin enlermedad clínica tiene anti-Tg o anti-TPO detectables. lo que desata la pregunta sobre su significado patogénico (Patrick, 1993) El reemplazo de hormona tiroidea queda reservado para pacientes con hipotiroidismo probado. Existen semejanzas entre la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991). Ambas están asociadas con HLA-B8: ambas comparten fundamentalmente una patogénesis similar, y se cree que la enfermedad de Graves puede progresar hacia una tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991; Patrick. 1993).
Autoanticuerpos En las enfermedades tiroideas autoinmunes hay tres autoanticuerpos principales, que incluyen los anti-TPO, anti-Tg y autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides (anti-TSHR) (Naparstek, 1993). Aunque los anticuerpos anti-TPO y anti-Tg se consideran marcadores de enfermedad tiroidea autoinmune. su papel etiológico no ha sido esclarecido. Pueden aparecer también en otras enfermedades autoinmunes específicas de órgano. Los anticuerpos anti-TSHR. sin embargo, desempeñan claramente un papel causal en la enfermedad tiroidea autoinmune (Naparstek, 1993).
Enfermedad de Graves El paciente con enfermedad de Graves presenta síntomas de hipertiroidismo y bocio difuso. La máxima incidencia aparece entre la tercera y cuarta décadas de la vida, y la razón mujer/hombre es de 4 a 8:1; entre el 60% y el 70% de estos pacientes manifiestan adicionalmente trastornos oculares (Patrick, 1993). Los datos de laboratorio muestran un incremento en los niveles de triyodotironina (T¡) y tiroxma (T,). y también en la captación de Tj. La terapia está dirigida a reducir la capacidad de la glándula tiroides para responder a la estimulación por autoanticuerpos. Esto se puede conseguir por una tiroidectomía subtotal, por administración de yodo radiactivo, o con la utilización de fármacos como propiltiouracilo o metimazol (Patrick, 1993).
Tiroiditis de Hashimoto La tiroiditis de Hashimoto es la forma más común de tiroiditis. y se caracteriza funcionalmente por una lenta progresión hasta hipotiroidismo. En pacientes con hipotiroidismo. los niveles de T „ T. y captación de T suelen ser bajos y la cantidad de hormona estimulante del tiroides (TSH) se incrementa anormalmente (Patrick, 1993). La incidencia de tiroiditis de Hashimoto es máxima desde la tercera a la quinta décadas, con una razón mujeres/hombres de 10:1. Los autoanticuerpos dirigidos contra los antigenos de tiroglobuIma (anti-Tg) y peroxidasa (microsomal) tiroidea (anti-TPO). son clínicamente los más importantes para el diagnóstico (Patrick. 1993), pero hasta el 20% de 3
Autoanticuerpos contra la peroxidasa tiroidea Los anticuerpos anti-TPO van dirigidos contra un antígeno de 105 kDa contenido en la fracción microsomal del citoplasma de células epiteliales tiroideas (Burek. 1995). Aunque el método de laboratorio que se utiliza más comunmente para detectar anti-TPO es la técnica de hemaglutinación pasiva cuantitativa (Nordyke, 1993). el ELISA también puede utilizarse con este fin en los laboratorios clínicos. Históricamente, IFID ha sido un método popular y sensible para la detección de anti-TPO ("anticuerpos antimicrosomales"). El test de IFID utiliza como sustrato secciones de tejido crioconservado de mono o humano, no fijado y secado al aire. Los sueros positivos marcan el citoplasma de las células epiteliales foliculares tiroideas pero no su núcleo (Fig. 45-9). Se debe diferenciar entre anti-TPO y AMA cuando se observe mareaje citoplasmático granular grueso: esto puede hacerse analizando los sueros con tejido de estomago/riñón de ratón. Se pueden detectar anti-TPO en el suero de pacientes tanto con enfermedad de Graves como con tiroiditis de Hashimoto, y su presencia y titulo se correlacionan luertemente con la enfermedad clínica activa (Burek. 1995). Existe cierta controversia entre los investigadores acerca de si la determinación de anti-TPO aislada es suficiente para detectar enfermedad tiroidea autoinmune de manera dable (Kaplan. 1999; Nordyke, 1993). El papel patogénico de los anti-TPO permanece sin esclarecer (Naparstek. 1993).
1010 Autoanticuerpos
SECCIÓN V
contra
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tiroglobulina
Los anti-Tg están dirigidos contra la tiroglobulina, que es la forma de almacenaje de las hormonas tiroideas en los folículos de la glándula tiroides (Burek, 1995). Se encuentran disponibles varios métodos para la medida de anti-Tg, incluyendo la técnica de hemaglutinacíón pasiva cuantitativa, IFID y ELISA. La técnica de hemaglutinacíón pasiva cuantitativa tanto con hemaglutinacíón con cloruro de cromo como con glóbulos rojos recubiertos es el método más sensible y ampliamente utilizado para la detección de anti-Tg (Burek, 1995). Los anticuerpos anti-Tg detectados por hemaglutinacíón son identificados con títulos superiores a 1:1.000 en cerca del 80% de los pacientes con tiroiditis de Hashimoto (Burek. 1995). Los pacientes con enfermedad de Graves (60%) o carcinoma de tiroides (30%) u otras enfermedades autoinmunes como la anemia perniciosa o el síndrome de Sjógren, y entre el 3% y el 18% de los individuos aparentemente normales, también pueden tener anti-Tg, pero sus títulos de hemaglutinacíón son generalmente (>90%) inferiores a 1:1.000 (Burek, 1995). Para localizar anti-Tg, se realiza una IFID utilizando secciones de tejido criopreservadas de glándula tiroides de mono. Se requiere la fijación para impedir la pérdida de tiroglobulina durante las etapas de lavado. Se describen tres patrones de ¡nmunofluorescencia cuando están presentes los anti-Tg (Burek, 1995): 1) patrón flocular; 2) espacios coloidales en sombra pero fluorescencia periférica brillante; y 3) mareaje difuso, brillante, uniformemente marcado en un patrón de "vidrio molido" atribuido a la reacción de anti-Tg con CA2 (Burek, 1995). CA2, denominado segundo antígeno coloidal, se detecta como único marcador serológico de las tiroiditis autoinmunes en el 5% y el 8% de los pacientes que son positivos por IFID pero negativos para anti-Tg y antiTPO utilizando otros métodos (Bigazzi, 1992).
Autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides Los autoanticuerpos anti-TSHR constan de dos grupos de autoanticuerpos que pueden tanto estimular como bloquear los TSHR, causando respectivamente hipertiroídísmo o hipotiroidismo. Los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a estos receptores y estimulan la producción de hormonas se denominan inmunoglobulinas estimulantes del tiroides (TSI), mientras que los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a los receptores y bloquean la unión y (unción de TSH se denominan inmunoglobulinas inhibidoras de la unión de TSH (TBII) (Brunt, 1995, fvlooij, 1993). Los TSI son probablemente la causa del hipertiroidismo en la enfermedad de Graves (Bigazzi, 1992; Brunt, 1995: Wilkin. 1990). Su prevalencia varia desde un 55% hasta un 95%, dependien-
do del método de detección (Bigazzi. 1992; Brunt, 1995). Los TSI. que suelen ser de la clase IgG, estimulan la producción de hormonas tiroideas activando el sistema de adenilato ciclasa tras su unión al TSHR (Patrick, 1993). Los ensayos para anti-TSHR son útiles para confirmar la enfermedad de Graves en pacientes hipertiroideos con resultados equívocos en los estudios habituales de laboratorio (Bigazzi, 1992). Adicionalmente, se puede utilizar un ensayo de anti-TSHR para monitorizar la terapia de sustitución hormonal del paciente o para diagnosticar la tirotoxicosis neonatal (Bigazzi, 1992). Existen dos clases principales de ensayos para anti-TSHR, denominados bioensayos y ensayos de unión; los aspectos metodológicos son revisados en otros trabajos (Bigazzi, 1992; Patrick, 1993; Gupta, 1988). Nuevos ensayos con el suero del paciente basados en la estimulación de adenosin monofosfato cíclico (cAMP) en células de tiroides de rata, mantenidas en cultivo tisular, pueden confirmarse como una mejora sobre las dificultades técnicas de los bioensayos (Burek. 1995). Los TSI son analizados en bioensayos que determinan el aumento de actividad mediado por TSHR por la medida del cAMP liberado o bien por la medida de la captación de yodo por células tiroideas mantenidas en cultivo (Brunt, 1995). Los TBII son analizados por la determinación de la inhibición de la unión de TSH marcada radiactivamente a su receptor o utilizando bioensayos con cAMP (Brunt, 1995).
RIÑON
GLOMERULONEFRITIS La glomerulonefritis es la principal causa de enfermedad renal primaria. Se piensa que los mecanismos mediados por inmunidad juegan un papel importante en la patogénesis de la glomerulonefritis, aunque la confirmación experimental de dichos mecanismos autoinmunes aún no ha sido llevada a cabo. La IFD tiene un papel importante en el estudio y diagnóstico de la glomerulonefritis. Los patrones de reactantes inmunes pueden ser divididos a grandes rasgos en aquellos que causan depósitos granulares o lineales en el glomérulo u otras estructuras del riñon examinadas con IFD. Los depósitos granulares se han atribuido a complejos inmunes (IC) que abandonan la circulación o se forman in situ (McCIuskey, 1995). Los patrones de IFD de depósitos inmunes asociados con las principales enfermedades glomerulares se resumen en la Tabla 45-5. Se encuentran disponibles revisiones minuciosas de estos trastornos en varios textos (McCIuskey, 1995; Heplinstall, 1992). Sin embargo, para esta exposición, sólo se presentan en mayor detalle los autoanticuerpos contra la membrana basal glomerular (anti-GBM).
f Tabla 45-5 Hallazgos por ¡nmunofluorescencia directa en las principales enfermedades glomerulares Patrón de ¡nmunofluorescencia y enfermedad Reactivos inmunes Depósitos granulares, mesangiales y en GBM Glomerulonefritis aguda postestreptocócica Nefritis lúpica proliferativa difusa Glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN. tipo I) Glomerulonefritis idiopática en semilunas por complejos inmunes Enfermedad de depósitos densos (MPGN tipo II) Infecciones crónicas (p.ej. endocarditis bacteriana)
C 3 ± IgG difuso, IgM IgG, IgA, IgM, C 3 C 3 , IgG. IgM IgG. C 3 ± IgM C 3 (globular) ± IgM IgG. IgM. C 3
Granulares, predominancia mesangial Nefritis lúpica Mesangial Proliferativa focal Púrpura de Henoch-Schónlein Nelropatía IgA
IgG, C 3 , generalmente IgM e IgA IgG, C 3 , IgA; depósitos focales en el asa capilar Predominantemente IgA; IgG. IgM, C 3 predominantemente IgA: a menudo IgG. IgM. C 3
Granulares, predominantemente GBM Nefritis lúpica membranosa Crioglobulinemia mixta
IgG C 3 . IgA. IgM IgM IgG C 3 , masas mtravasculares
Lineal, en GBM Nefritis por anti-GBM Nefropatía por cadenas ligeras
IgG, C 3 ; IgA e IgM poco frecuentes Generalmente cadena ligera K, tal vez en TBM. vasos sanguíneos, intersticio
GBM = membrana basal glomerular; TBM = membrana basal tubular. Modificado a partir de McCIuskey RT, Collms AB, Niles JL Kmdney. En Colvin RB, Bhan AK, McCIuskey (eds): Diagnoslic Immunopatthology, 2> ed. New York, Raven Press. 1995, pág 109. con permiso. ...
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CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular La presentación clínica en pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM varía en cuanto que cerca de un 50% tienen enfermedad limitada al riñon mientras que el otro 50% tiene síntomas tanto renales como pulmonares. Esta última presentación es denominada frecuentemente síndrome de Goodpasture. Raramente los pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM pueden tener enfermedad limitada a los pulmones (Wilson, 1987). El diagnóstico de la enfermedad por anticuerpos anti-GBM requiere la detección de autoanticuerpos anti-GBM contra el dominio NC1 del colágeno tipo IV (McCIuskey. 1995), el denominado antígeno de Goodpasture. Los métodos para la detección de anticuerpos anti-GBM incluyen IFID. ELISA y radioinmunoensayo (RÍA) (McCIuskey, 1995: Wilson, 1987): algunos investigadores han desarrollado adicionalmente un test sensible de transferencia western (McCIuskey, 1995). Debido a que la IFID es difícil de estandarizar y requiere experiencia para realizarse, los métodos para la detección se han centrado, en lugar de esto, en la validación de RÍA o ELISA cuantitativos. Actualmente se encuentra disponible un kit ELISA con licencia comercial para la determinación de anticuerpos anti-GBM. Este ensayo determina los valores del paciente a partir de una curva estándar y permite dar resultados como rangos negativos, dudosos limitantes o positivos. La mayoría de los pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa parecen tener valores superiores a 100 unidades. Aunque se pueden obtener valores dudosos limitantes tanto en enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa como latente, también hemos observado estos valores en pacientes con trastornos renales que no son enfermedad por anticuerpos anti-GBM. La coexistencia de anticuerpos contra el citoplasma de neutródlos (ANCA) ha sido documentada en algunos pacientes con glomerulonefritis rápidamente progresiva (RPGN) (McCIuskey, 1995). La coexistencia de estos dos autoanticuerpos varía desde un 0% hasta 40% de los pacientes con RPGN. lo que se acompaña por alguna evidencia de que la presencia de ANCA en pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM proporciona un pronostico renal mejor (McCIuskey, 1995).
GLÁNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison La insuficiencia adrenocortical crónica no tuberculosa, o enfermedad de Addison, tiene una prevalence estimada de entre З у б casos por 100.000 personas (Muir, 1993). Del 65% al 70% de estos pacientes tienen autoanti cuerpos circulantes contra los microsomas y la membrana plasmática de las células adrenocorticales. demostrable utilizando IFID sobre secciones congeladas de corteza adrenal humana (Patrick, 1993; Burek. 1995; Muir. 1993). La 21 -hidroxilasa y la 17-t/hidroxilasa son dos autoantigenos que se han identificado como reactivos con autoanticuerpos adrenocorticales (Song, 1994). No se han encontrado autoanticuerpos adrenocorticales en la enfermedad de Addison causada por tuberculosis u otros agentes exógenos (Patrick, 1993). De manera destacable, cerca del 45% de los individuos asintomáticos con autoanticuerpos adrenocorticales desarrollan trastornos de la función adrenocortical en 2,5 años tras la identificación del autoanticuerpo (Muir, 1991). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos es la que se diagnostica más frecuentemente en personas entre 20 y 50 años y es de dos a tres veces más frecuente en mujeres cuando se diagnostica después de los 30 años (Patrick. 1993; Muir. 1993). Las pruebas de laboratorio muestran acidosis metabólica. hiperpotasiemia. hiponatremia y bajos niveles de cloruro y bicarbonato séricos. Los niveles de Cortisol plasmático están disminuidos y los niveles de hormona adrenocorticotropa elevados (VanArsdel, 1993). Consecuentemente, la terapia consistirá en el reemplazo de glucocorticoides y mineralocorticoides (Patrick, 1993). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos puede ocurrir por sí misma, pero es más común que esté acompañada por otras enfermedades autoinmunes como parte de un síndrome autoinmune poliglandular (APS) (Muir. 1993). Estas enfermedades acompañantes pueden incluir tiroiditis autoinmune. anemia perniciosa o diabetes mellitus insulino-dependiente (Patrick, 1993).
1011
Además de los autoanticuerpos adrenocorticales. se han detectado otros autoanticuerpos en pacientes con enfermedad de Addison, incluyendo autoanticuerpos contra las células esteroideas y autoanticuerpos que se unen a los receptores de la hormona adrenocorticotropa (Muir, 1993).
PÁNCREAS Diabetes mellitus (véase Cap. 11) Diabetes mellitus es el término diagnóstico aplicado a un grupo de trastornos metabólicos que comparten la hiperglucemia como nexo común (Eisenbarth, 1995). El que la DM sea un diagnóstico serio está documentado por el hecho de que las complicaciones agudas y crónicas multiorgámcas justifican un 15% del total del gasto económico del sistema sanitario en EE.UU. (Schatz, 1995). Sin embargo, se ha hecho un progreso significativo en el cuidado de los pacientes diabéticos gracias al conocimiento de que un control agresivo de la glucosa en sangre disminuye el riesgo de desarrollo y progresión de complicaciones vasculares (Schatz, 1993).
Subtipos
clínicos
Existen dos subgrupos principales de DM: el tipo 1. DM msulino-dependienle (DMID); y el tipo 2, DM no insulino-dependiente (NIDDM) (Eisenbarth, 1995). La DM tipo 2 ocurre con más frecuencia en individuos obesos mayores de 30 años. Estos pacientes tienen insulina plasmática, pero en concentración insuliciente para prevenir la hiperglucemia (VanArsdel. 1993). Algunos pacientes tipo 2 tienen autoanticuerpos asociados a insulina en su suero (VanArsdel, 1993). Los pacientes tipo 2 carecen de la mayoría de las otras características autoinmunes observadas en pacientes tipo 1, aunque la diferencia entre tipo 1 y tipo 2 no siempre es tan fácil (Eisenbarth, 1995). Los pacientes tipo 2 se tratan por medio del control del peso y con medicaciones que estimulen la producción de insulina (VanArsdel, 1993). La DM tipo 1 se considera una enfermedad autoinmune crónica que aparece en individuos genéticamente susceptibles y está causada por la destrucción de las células p productoras de insulina en los islotes de Langerhans pancreáticos (Harrison, 1990). Esta destrucción de las células |5 da lugar con el tiempo a una deficiencia de insulina e hiperglucemia crónica. En los Estados Unidos, la DMID aparece en 1 de cada 300 personas (esto es, una incidencia media anual de 15 por 100.000 personas) (Eisenbarth, 1995). Existe un sólido soporte para concluir que la DMID es una enfermedad crónica autoinmune (Harrison, 1990; Eisenbarth, 1995: Schatz, 1995). La detección de autoanticuerpos circulantes precediendo a la manifestación clínica de DMID refuerza esta conclusión y proporciona una información importante respecto a la evolución natural de la DMID y la capacidad para predecir su aparición (Schatz. 11995). Los principales tipos de autoanticuerpos circulantes en DMID son los siguientes: autoanticuerpos contra las células de los islotes, autoanticuerpos contra el ácido glutámico descarboxilasa, autoanticuerpos contra insulina y autoanticuerpos asociados a insulinoma-2 y 2|i.
Autoanticuerpos contra las células de los islotes La IFID es el método clásico para la detección de anticuerpos contra las células de los islotes (ICA) (Atkinson, 1993). Se utilizan secciones congeladas de páncreas humano como tejido de sustrato para detectar fluorescencia citoplasmática, finamente granular y especifica en todas las células de los islotes pancreáticos (Fig. 45-10). Se recomienda sangre humana del grupo O como sustrato para reducir las interferencias de fondo no específicas debidas a isohemaglutininas ABO. Utilizando IFID, los ICA son detectables en cerca del 80% de los pacientes con DMID delectada de novo, entre el 3% y el 4% de parientes no diabéticos de pacientes con DMID. y sólo en el 0.5% de sujetos clínicamente normales (Atkinson, 1994). Los ICA consisten en autoanticuerpos que incluyen aquellos específicamente reactivos con autoanticuerpos contra la descarboxilasa de ácido glutámico (GADA), asi como aquellos que son ICA reactivos con anticuerpos no GADA (Atkinson, 1993; Kaufman, 1992).
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
identificar individuos con riesgo de DMID está siendo evaluado para determinar la necesidad de estudios metabólicos que aseguraren la intolerancia a la glucosa subclinica y demanda de inmunoterapia en la fase preclinica de la DMID (Maclaren, 1992). La determinación de GADA utilizando ELISA puede mejorar finalmente la viabilidad de la difusión del cribado de este autoanticuerpo. Además de los autoanticuerpos sobre los que se ha disculido antes, los pacientes con DMID también pueden tener autoanticuerpos anti-TPO, contra células parietales y anti-adrenocorticales, por lo que debe realizarse un cribado de estos autoanticuerpos en pacientes con DMID al menos una vez (Maclaren. 1992).
TRACTO GASTROINTESTINAL Figura 45-10. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra las células de los islotes utilizando como sustrato páncreas humano de grupo sanguíneo O (x 400).
Anemia perniciosa La anemia perniciosa (PA) se caracteriza por aclorhidria rápida resistente a histamina, hipergastrinemia y déficit de vitamina B (Brown, 1995). El comienzo gradual de los síntomas neurológicos y el desarrollo de anemia megaloblástica son características típicas del curso clínico de PA (Patrick, 1993). Morfológicamente, la biopsia de mucosa del cuerpo del estómago contiene evidencias de grastritis atrófica crónica. tt
Los ICA deben ser titulados en las unidades de la Juvenile Diabetes Foundation (JDF) en referencia a un suero estándar de 80 unidades del Immunology of Diabetes Workshop; títulos superiores a 20 unidades JDF parecen tener significado pronóstico (Maclaren, 1992). Se encuentran disponibles ensayos comerciales para ICA con sustrato de primate.
Autoanticuerpos contra insulina Se han identificado autoanticuerpos contra insulina (IAA) en cerca del 50% de los pacientes con DMID en el momento del diagnóstico y antes de empezar con la terapia insulínica (Atkinson, 1994). Los IAA se suelen determinar utilizando ensayo de radioinmunoprecipítacíón competitiva técnicamente exigente. Este ensayo no puede distinguir entre IAA de aparición espontánea de aquellos que aparecen como resultado de la terapia con insulina. Por tanto, se debe realizar el ensayo para IAA antes de que la insulina sea administrada.
Autoanticuerpos contra la descarboxilasa de ácido glutámico Los GADA se detectan en la mayoría de pacientes recién diagnosticados de DMID y en cerca del 80% de parientes de primer grado, prediabétícos, de pacientes con DMID (Hagopian, 1993. Schatz, 1995). Los dos autoantígenos GAD, clasificados por peso molecular, se denominan GAD65 y GAD67 (Atkinson, 1993). Los GADA en pacientes con DMID son dirigidos en primer lugar contra la isoforma GAD65, que se encuentra principalmente en los islotes pancreáticos y en el sistema nervioso central (SNC), donde actúa como una enzima responsable de la formación del neurotransmisor inhibidor ácido y-aminobutírico (Barmeier, 1992; Luhder, 1994; Maclaren. 1988; Kaufman. 1992). La forma GAD67 predomina en los nervios periféricos (Falorni, 1994; Atkinson. 1993).
La PA está asociada con autoanticuerpos circulantes contra células parietales (APC) en el 90% de los pacientes y contra el factor intrínseco (anti-IF) en entre el 60% y 75% de los pacientes, aunque los anti-IF pueden ser más específicos para PA(Burek. 1995; Brown, 1995). Los APC son detectados por IFID llevada a cabo sobre bloques de tejido de estómago/riñón de ratón. Este bloque de tejido combinado permite la identificación del mareaje específico de células parietales cuando no hay mareaje concomitante de túbulos renales como se vería en presencia de AMA(Fig. 45-11). Los anti-IF son detectados más frecuentemente por RÍA. De los dos tipos conocidos de anti-IF, los anti-IF tipo 1, o autoanticuerpos bloqueantes, impiden la unión de IF a la vitamina B. , y los de tipo 2, o autoanticuerpos de unión, reaccionan con la vitamina B, libre o complejada para inhibir la acción de IF (Karen. 1994; Patrick, 1993). Los anti-IF tipo 1 están considerados más sensibles y específicos para el diagnóstico de PA (Karen, 1994). Sin embargo, la identificación de APC o de anti-IF no es necesaria para el diagnóstico de PA, La PA puede ocurrir en asociación con otras enfermedades autoinmunes como la liroiditis autoinmune o enfermedad de Addison y puede formar parte tanto de APS 1 como de APS 2 (Patrick, 1993). ;
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Enteropatía sensible al gluten La enteropatía sensible al gluten (GSE), o esprúe no tropical, es una enfermedad del intestino delgado caracterizada por malabsorción de la grasa gastrointestinal, que puede estar infradiagnosticada en Estados Unidos
Los GADA también están asociados al raro síndrome del hombre rígido (Eisenbarth, 1995). De manera a destacar, un alto porcentaje de estos pacientes tiene DMID.
Interpretación y utilidad clínica de los autoanticuerpos en DMID Los autoanticuerpos ICA. GADA, IAA e IA-2 se usan frecuentemente como marcadores predíctivos para DMID. Los ICA son un marcador específico asociado con un riesgo elevado de desarrollar DMID, pero los ICA no persisten. Los GADA se detectan generalmente antes del diagnóstico de DMID y generalmente disminuyen su titulo tras el comienzo de la clínica de DMID (Schatz, 1994). Los GADA e IA-2, tanto separados como juntos, parecen ofrecer la mejor utilidad predictiva para el cribado (Schatz, 1995). La identificación de autoanticuerpos contra los islotes puede ser utilizada para confirmar la autoinmunidad en pacientes con DMID aguda, lo que diferencia la DMID de tipo 1 de la de tipo 2. El uso de estos marcadores para
Figura 45-11. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra células parietales gástricas utilizando estómago/riñón de ratón como suslralo (x 400).
CAPÍTULO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS
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(u-BTx) en RÍA competitivo para medir las diferentes formas de anti-AChR (Barna. 1995). La M-BTX es una proteina de veneno de serpiente que se une irreversiblemente a AChR, pero se une al receptor de Ach en un sitio diferente del lugar de unión de los anti-AChR (Rose, 1995). Los AChR se obtienen a partir de extractos de músculo esquelético humano denervado, como puede ser a partir de amputaciones diabéticas, o a partir de cultivo tisular. Para la determinación, se marcan los AChR con u-BTx y después son incubados con el suero del paciente para permitir que cualquier autoanlicuerpo anti-AChR presente se una a los AChR en los sitios cercanos al lugar de unión de u-BTx. Tras la incubación, los complejos radiomarcados son precipitados por inmunoglobulina anti-humana polivalente, y se procede a detectar la radiactividad en el precipitado lavado, después de la corrección de las uniones inespecíficas. El grado de radioactividad en el precipitado es directamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente.
Figura 45-12. Inmunofiuorescencia indirecta de autoanticuerpos IgA contra endomisk) utilizando estómago de mono como sustrato (x 400)
(Ferguson, 1997). La hipersensibilidad al gluten, o derivados del gluten, es la causa de GSE (Brown, 1995). La biopsia de intestino delgado de un paciente con GSE es anormal de forma variable, pero los cambios característicos incluyen la atrofia vellosilaria, elongación de las criptas, lintocitos intraepiteliales y mitosis en las criptas. Los pacientes con GSE manifiestan varias alteraciones inmunes humorales. Es interesante que los niveles de IgA en suero están generalmente elevados en pacientes con GSE, excepto en aquellos con un déficit de IgA, lo que ocurre en pacientes con GSE más frecuentemente que en individuos normales (Brown, 1995). Los pacientes con GSE pueden tener autoanticuerpos IgA circulantes antiendomisio, antireticulina o antigliadina. Los autoanticuerpos IgA antiendomisio se detectan por IFID utilizando esófago de mono como tejido sustrato (Fig. 45-12). La transglutaminasa tisular (ttg) es probablemente el autoantígeno del endomisio (Dietench. 1997). Su identificación está considerada sensible y específica para el diagnóstico de GSE o bien GSE asociada con DH (GSE-DH) (Talal, 1997). La medición del título de autoanticuerpo IgA antiendomisio puede ser utilizada para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta libre de gluten (Karen, 1994). Los autoanticuerpos antirreticulina son detectados por IFID sobre un bloque de tejido combinado de estómago/riñón de ratón. Estos autoanticuerpos son detectables en adultos (40%), asi como en niños (60%) con GSE y también en adultos con GSE-DH (20%). Sin embargo, los autoanticuerpos antirreticulina no son específicos para el diagnóstico, pudiendo estar presentes también en pacientes con enfermedad de Crohn, miastenia gravis, síndrome de Sjógren. y otras enfermedades del tejido conectivo. Los anticuerpos antigliadina son deteclados por ELISA en casi todos los pacientes con GSE o GSE-DH (Brown, 1995). El antígeno diana, la gliadina, se purifica a partir de gluten y es utilizado en la fase sólida del ELISA para detectar estos autoanticuerpos. Como los autoanticuerpos IgA antiendomisio, los autoanticuerpos antigliadina pueden ser utilizados para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta sin gluten.
SISTEMA NERVIOSO Miastenia graves La MG es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad muscular asociada al ejercicio, fatiga y presencia de autoanticuerpos contra el receptor de acetilcolina (anti-AChFt). El AChFt, localizado en las membranas postsinápticas de las fibras musculares esqueléticas, une acetilcolina (ACh) que proviene de las terminaciones nerviosas, lo cual causa una contracción muscular cuando se ha liberado una cantidad suficiente de Ach (Naparstek, 1993: Rose. 1995). Los autoanticuerpos anti-AChR interfieren en esta función neuromuscular, provocando debilidad muscular y fatiga. Los autoanticuerpos anti-AChR se detectan en casi el 90% de pacientes con MG (Rose. 1995). Se utiliza u-bungarotoxina marcada radiactivamente
Se pueden utilizar modificaciones de este ensayo de unión para identificar autoanticuerpos anti-AChR bloqueantes y moduladores. En un ensayo de bloqueo, se permite que el suero del paciente, que contiene anti-AchR. incube con AChR antes de la adición de a-BTx. La base de esta técnica es la premisa de que los anti-AChR capaces de bloquear la unión de r/.-BTx también bloquean la unión de Ach a AChR (Rose. 1995). La cantidad de radiactividad en el precipitado es, por tanto, inversamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente. Se piensa que los autoanticuerpos anti-AChR moduladores aceleran la degradación de AChR, pero su determinación en el laboratorio clínico es técnicamente difícil y no está ampliamente instaurada.
Esclerosis múltiple La MS es una enfermedad desmielinizante relativamente corriente que involucra a la sustancia blanca del cerebro y la médula espinal. La MS ocurre más frecuentemente en mujeres que en hombres (razón de 2:1) y se manifiesta generalmente durante las primeras etapas de la edad adulta con una amplia variedad de manifestaciones clínicas posibles. Cerca del 50% de estos pacientes experimenta periodos alternantes de enfermedad activa y remisiones, mientras que el resto sigue un curso progresivo crónico (Steinman, 1993; McFarland, 1995). El diagnóstico de MS deriva de los hallazgos clínicos y la exclusión de cualquier otro trastorno. Aunque la causa de MS es desconocida, se considera a los mecanismos autoinmunes como importantes en la patogénesis de esta enfermedad (McFarland, 1995). Sin embargo, no hay ningún autoanlicuerpo circulante lo suficientemente característico en la MS como para ser aceptado como diagnóstico en las determinaciones de rutina del laboratorio clínico. Sin embargo, el examen de laboratorio de liquido cefalorraquídeo (LER) proporciona información importante que ayuda al diagnóstico de MS en un marco clínico apropiado (Barna, 1987). La síntesis de IgG se incrementa anormalmente en el SNC de pacientes con MS, de tal forma que la determinación del índice de IgG y la tasa de síntesis de IgG proporciona resultados útiles, pero no específicos (McFarland, 1995; Zweiman, 1991; Karen. 1994: Valenzuela. 1987). La determinación de bandas oligoclonales en el LCR es también útil en un marco clínico apropiado, ya que son identificadas en más del 90% de los pacientes con MS: sin embargo, su presencia no es especifica, puesto que pueden ser detectadas en pacientes con diversos trastornos como neurosífilis, vasculitis SNC, enfermedad de Lyme. panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Guillain-Barré y neoplasias (Karen, 1994). La electroforesis de proteínas séricas también debe realizarse para asegurar que las bandas oligoclonales del LCR no son debidas a filtración en el LCR desde el suero. Las bandas oligoclonales en el LCR se determinan generalmente por electroloresis de alta resolución en gel de agarosa con LCR concentrado (Karen. 1994).
Neuropatías El centro de la atención más reciente es un grupo de síndromes neurológicos que afectan tanto al SNC como al sistema nervioso periférico y están asociados con autoanticuerpos (Naparstek. 1993). Estos autoanticuerpos son detectados por ELISA. IFID o inmunohistoquímica. La importancia de la iden-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tílicación de dichos autoanticuerpos se incrementa indudablemente si los estudios clínicos correlacionan su presencia con una enfermedad particular o un beneficio terapéutico. Sin embargo, hasta la fecha, estos autoanticuerpos no son específicos de una enfermedad y pueden incluso aparecer después de un trauma al sistema nervioso. Los autoanticuerpos contra componentes primarios neurales incluyen aquellos contra proteínas neuronales o contra gangliósidos neuronales (Zeballos, 1992).
Autoanticuerpos contra proteínas neuronales Un subgrupo de pacientes con degeneración cerebelosa paraneoplásica (PCD) tienen autoanticuerpos anti-Yo que generalmente son detectados al mismo tiempo que es descubierta la neoplasia maligna. Los anti-Yo son detectables como fluorescencia citoplasmática en las células de Purkinje utilizando IFID sobre tejido cerebeloso humano. La identificación de anticuerpos anti-Yo en un paciente sin malignidad conocida debe iniciar una evaluación minuciosa en busca de una neoplasia maligna (Zeballos, 1992). Los anticuerpos anti-Ri son autoanticuerpos específicos de neurona, cuya identificación parece limitada a pacientes con carcinoma de mama y opsoclonus paraneoplásico (Zeballos. 1992). Los anti-Ri son caracterizados por fluorescencia en el núcleo neuronal por IFID. Los anticuerpos anti-Hu también son visibles como fluorescencia nuclear neuronal con IFID. Estos autoanticuerpos pueden ser identificados en pacientes con carcinoma de pulmón de células pequeñas y encefalomíelitis paraneoplásica (Zeballos, 1992).
Autoanticuerpos contra gangliósidos neuronales Los gangliósidos son componentes glicolipídicos que se encuentran en las membranas extemas de las células nerviosas periféricas (Naparstek, 1993). Las neuropatías motoras periféricas pueden producirse en pacientes con gammapatías monoclonales IgM, cuya paraproteína IgM reacciona con los gangliósidos GM. o GD,„ (Zeballos, 1992). Aunque los anticuerpos anti-GM, o anti-GD„ pueden ser identificados en una amplia variedad de síndromes neurológicos, su presencia en altos títulos es más característica de enfermedad de neurona motora que otras alternativas (Zeballos, 1992).
OTROS ÓRGANOS Corazón Autoanticuerpos
contra
miocardio
Los autoanticuerpos contra miocardio se han descrito como parte de varias condiciones que dañan el músculo estriado cardíaco, incluyendo infarto de miocardio, después de cirugía cardiaca, y miocardiopatía, aunque su identificación puede ayudar a diferenciar la miocardiopatía mediada por inmunidad de otras causas de miocarditis (Naparstek, 1993; Burek, 1995). Se utiliza la IFID sobre secciones congeladas de corazón de mono para detectar autoanticuerpos contra miocardio. El mareaje específico de miocardio también puede determinarse excluyendo la reactividad de músculo esquelético no cardíaco. Desgraciadamente, los AMA o autoanticuerpos heterófilos pueden causar mareaje fluorescente que puede ser confundido con el que es debido a autoanticuerpos contra miocardio.
Músculo Autoanticuerpos contra músculo esquelético Los autoanticuerpos contra músculo esquelético tienen una aplicación clínica limitada. Se pueden observar títulos bajos (<1:30) en individuos sanos, mientras que algunos pacientes con trastornos miopáticos pueden tener títulos hasta 1:60. Aunque se han encontrado títulos altos (>1:60) de autoanticuerpos contra músculo esquelético en pacientes con MG. los ensayos de anti-AChR tienen mayor utilidad clínica en el diagnóstico o monitorización de MG. Los autoanticuerpos contra músculo esquelético se detectan por IFID sobre secciones congeladas de músculo esquelético de los muslos de mono.
RESUMEN Los autoanticuerpos tienen un papel importante en el estudio de las enfermedades autoinmunes organoespecíficas. La detección de dichos autoanticuerpos puede ser importante en el diagnóstico de algunas enfermedades autoinmunes organoespecíficas, como la enfermedad de Graves, pero más a menudo sirven como soporte más que como elemento esencial para el diagnóstico. De manera similar, aunque algunos de estos autoanticuerpos están directamente involucrados en la patogénesis de una enfermedad, por ejemplo el pénfigo. a menudo su presencia es un marcador de daño inmunológico subyacente atribuible a otro mecanismo de enfermedad, como es el caso de la DMID. Técnicas más recientes de biología molecular han revelado y continuarán haciéndolo, la naturaleza específica de muchos antígenos diana de estos autoanticuerpos. Se espera que este trabajo llegue a elucidar los mecanismos de enfermedad subyacentes, permitiendo la mejora de las pruebas diagnósticas y. tal vez. de nuevas direcciones en las terapias. Los avances técnicos en los ELISA han hecho de ésta una tecnología asequible para la mayoría de los laboratorios clínicos, de manera que muchos ensayos para la determinación de autoanticuerpos específicos de órgano se encuentran disponibles donde la IFID no es factible.
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CAPITUIO 45
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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECIFICAS
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MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA
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Regulación de la síntesis de IgE: influencias genéticas e interacciones celulares Características estructurales de la IgE
Anticuerpos IgE alérgeno-específicos: métodos de determinación, calificación de resultados y utilidad clínica Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibílídad inmediata y para anticuerpos IgE alérgeno-específicos
Liberación de mediadores desde las células efectoras sensibilizadas a IgE EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS
Proteína IgE: métodos de determinación, valores normales y utilidad clínica
BIBLIOGRAFÍA
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La prevalencia global de enlermedades alérgicas en los Estados Unidos excede el 20%, y los síntomas y signos de la alergia son con frecuencia difíciles de distinguir clínicamente de otras etiologías (Huang. 1993). Por estas razones, los médicos con frecuencia consideran la alergia (hipersensibilidad inmediata) como una posible etiología de enfermedad en pacientes que se presentan con diversos signos y síntomas. Cuando se seleccionan apropiadamente, las pruebas de laboratorio son útiles para evaluar pacientes con enfermedades alérgicas, pero el conocimiento de los mecanismos básicos de la hipersensibilidad inmediata y el conocimiento de las relaciones empíricas entre los resultados de las pruebas y su valor diagnóstico predictivo son necesarios para optimizar la eficacia de las pruebas de laboratorio. Este capítulo aborda estos lemas, empezando con una perspectiva general de los mecanismos básicos de la hipersensibilidad inmediata y procediendo a una descripción detallada de las pruebas de laboratorio aplicadas a los modos de cribado y diagnóstico para evaluar diferentes tipos de enfermedades alérgicas. Se ha hecho una mención específica de las aplicaciones de las pruebas de laboratorio que no son rentables o que pueden conducir a conclusiones clínicas incorrectas.
MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA Regulación de la síntesis de IgE: influencias genéticas e interacciones celulares Las investigaciones básicas a linales de los años 60 conducen a la descripción de una clase distinta de inmunoglobulinas en humanos, la inmunoglobulina E (IgE). con potentes propiedades reactivas (sensibilidad cutánea) (Ishizaka, 1966a. 1966b, 1966c). Este resultado marcó el comienzo de la era actual de investigación en cuanto a los mecanismos moleculares de las enfermedades alérgicas. Hasta ahora, se sabe mucho sobre los procesos que acontecen dentro de las membranas celulares de las células efectoras sensibilizadas por IgE, que conducen a la liberación de mediadores vasoactivos. Estos mediadores causan directamente los signos y síntomas de la enfermedad alérgica (véase más adelante). Las investigaciones en este tema se han
'Mayo Foundation conserva los derechos sobre todos los dibujos e ilustraciones del presente capitulo.
enfocado considerablemente en dos áreas: estudios dirigidos al descubrimiento de genes que influyen en el desarrollo del fenotipo alérgico, y estudios celulares y moleculares dirigidos al descubrimiento de mecanismos genéticos y biológicos que influyen en la síntesis y secreción de la proteína IgE y los anticuerpos IgE. Como el nivel de la proteína IgE en sangre se correlaciona fuertemente con la presencia de signos y síntomas de enfermedad alérgica, estas dos áreas de investigación se solapan. Es bien sabido que las influencias genéticas afectan a la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad alérgica (Meyers. 1998). Los individuos predispuestos genéticamente a menudo se conocen como atópicos, un sinónimo para el fenotipo alérgico clínico. Los resultados de los estudios epidemiológicos genéticos sugieren que los niveles en suero de la proteína IgE están influidos por lo menos por dos genes, y esa herencia recesiva o codominante de alelos (aún no definida) sobre esos locus influye en el nivel basal de la proteína IgE en suero (Meyers, 1991). El fenotipo IgE elevado está caracterizado por niveles de proteína IgE en suero varias veces mayor que el fenotipo IgE bajo (Martínez. 1994). Como es lógico, los niveles elevados de IgE en suero se asocian a un fenotipo alérgico con aumento en la prevalencía de enfermedades alérgicas, particularmente el asma. A nivel estructural, se han propuesto varios genes candidatos que podrían actuar para determinar el fenotipo alérgico (Tabla 46-1). Los estudios analíticos de enlace han identificado las localizaciones aproximadas de estos genes candidalos a nivel cromosómico. y los estudios posicionales de clonación corroboran la relación de los genes putativos con genes conocidos para moléculas mmunorreguladoras incluyendo receptores de citocina, antigenos leucocitos humanos y factores de transcripción nucleares (Caraballo. 1999). Una región del cromosoma 5q incluye genes de diversas atocinas que se sabe influyen en la producción de IgE por células inmunocompetentes o reactividad bronquial incluyendo interleucma (IL)-3. IL-4. IL-5. IL-9 e IL-13 y el receptor (5-adrenérgico. respectivamente (Caraballo. 1999). El cromosoma 6p contiene el complejo del antígeno leucocitario humano (HLA) (véanse Caps. 40 y 41). Diversos haplotipos HLA están asociados con el fenotipo alérgico, más marcadamente con el HLA-DR específico y haplotípo DQ. Los productos genéticos de estos locus juegan un importante papel en la determinación de respuestas inmunes a proteínas alergénicas a través de un papel en la presentación del antigeno (véase mas adelante). Otros diversos cromosomas contienen genes que pueden jugar un papel en determinar el fenotipo alérgico: el cromosoma 11q contiene un gen para el receptor de alta afinidad de IgE (F B|. el cromosoma 12q contiene genes para interferón-yy el factor de ere-
CAPÍTULO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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El modelo descrito anteriormente explica los mecanismos comunes que provocan la síntesis de anticuerpos específicos IgG e IgE. pero ciertos mecanismos son particularmente pertinentes para la respuesta de IgE. Estos mecanismos originan la expansión clonal de linfocitos B-lgE y el cambio de isotipo con la expresión de transcnptores maduros más que de líneas germinales. Los linfocitos B requieren por lo menos de dos señales activadoras para iniciar la síntesis de anticuerpos específicos (Vercelli. 1989a). Una señal es emitida como resultado de una interacción afín entre células T complementarías y linfocitos B que muestran los antígenos procesados. Estos linfocitos B, sin embargo, requieren de señales adicionales para iniciar la transcripción del C Í ' mRNA reordenado. En el caso de las IgE. se emiten señales importantes por IL-4 e IL-13. citocinas producidas por un subpoblación de linfocitos Th. Sin embargo, estas señales solas no son suficientes para inducir la síntesis de anticuerpos IgE maduros. cimiento basotilo. y el cromosoma 14q contiene genes para el receptor antigeno de células T y NF-KB1 (Caraballo. 1999). Se necesitan estudios adicionales para determinar la extensión del polimorfismo de estos locus y los efectos de diferentes alelos de estos locus candidatos sobre el fenotipo alérgico. La habilidad de un individuo de responder a un anlígeno exógeno sintetizando anticuerpos específicos está determinada genéticamente por genes de la región HLA-D (véase Cap. 40). Los productos genéticos de estos locus altamente polimórficos —moléculas de DR, DQ y DP de células presentadoras de antigenos— son responsables del proceso de unión al antígeno procesado para presentarlo a los linfocitos T inmunocompetentes. e iniciando por tanto una respuesta de anticuerpos (Bach. 1985; Korman, 1985; Trowsdale. 1985). La síntesis de anticuerpos específicos (incluyendo IgE) para antígenos Tdependientes resulta de una sene de interacciones celulares que incluye la señal relacionada (contacto célula a célula) y no relacionada entre células. Varios pasos están implicados. Inicialmente. el antígeno es metabolizado por una célula presentadora del antígeno, por ejemplo, una célula dendrítica o macrófaga, y el antigeno "procesado" se muestra en la superficie de la célula en una hendidura configurada para el antígeno constituida por moléculas superficiales de la región HLA-D y Iragmentos procesados de un antigeno nativo. La interacción afín entre el complejo antígeno procesado-HLA-D de una célula presentadora del antígeno y los receptores antígenos específicos en una población complementaria de linfocitos T colaboradores/inductores (células Th) origina la activación de las células Th, secreción de citocinas y expansión clonal de la respuesta de los linfocitos (Unanue. 1987). El mismo antigeno puede estar unido a anticuerpos expresados constitutivamente en las membranas plasmáticas de linfocitos B específicos de antígeno; y estas células que procesan el antígeno internalizando el complejo antígeno-anticuerpo también son capaces de metabolizar y presentar el antígeno procesado. De nuevo, después de la interacción afín y la secreción de citocinas. se produce una expansión clonal de linfocitos B antígeno-específicos seguida de la síntesis y secreción de anticuerpos específicos (Fig. 46-1).
Figura 46-1. Interacciones reconocidas y no reconocidas de células presentadoras de antigenos (APC). Células T colaboradoras /inductoras y células B originan la activación y la expansión clonal de las células IgE-B (véase texto para explicación).
La IL-4. junto con IL-13. IL-3 e IL-5, se produce por un subpoblación de linfocitos T llamadas células T2 (Mosmann. 1986: Parronchi. 1991) Los electos de IL-4 e IL-13 son antagonizados por el interferón-y. que junto con la IL-2 se produce en una segunda subpoblación de linfocitos T llamadas células TI. Los productos de citocina de esas dos subpoblaciones T influyen de forma opuesta en la síntesis de IgE. Otras citocinas también influyen en la síntesis de IgE (véase Cap. 39). Las citocinas IL-5 e IL-6 originan la síntesis de anticuerpos IgE por linfocitos B comprometidos, pero ninguna es suficiente para emitir un señal "activadora" para desviar un isotipo relacionado con la producción de transcriptores C, reordenados (Vercelli. 1989b). Como se anotó previamente, en el curso de una respuesta inmune caracterizada por la producción de anticuerpos IgE. los linfocitos B deben diferenciarse a células plasmáticas que producen más IgE que IgM (o IgD). Este proceso, llamado desviación de isotipo. incluye el reordenamiento de los genes inmunoglobulinas a nivel del ADN. No se conocen todos los mecanismos asociados a la desviación del isotipo. pero se conocen mejor muchos de los requerimientos para la desviación del IgE. Un elemento importante es el ajuste del CD40 a los linfocitos B por el ligando CD40 en los linfocitos T. Si no existe ajuste del CD40, los linfocitos B expuestos a IL-4 e IL-13 en presencia de las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T producirán transcriptores C, de la línea germinal. Los esludios experimentales sugieren que los efectos del ajuste de CD40 están mediados intraceluiarmente por la familia Src de tirosina cinasas. que están implicadas en distintos niveles de la activación transcripcional (Vercelli. 1998)
Características estructurales de la IgE La primera evidencia de que los anticuerpos IgE humanos poseen actividad reagínica y son diferentes de otras inmunoglobulinas fue de los Ishizakas (Ishizakas, 1966a, 1966b, 1966c). Estos investigadores cultivaron antisuero de ratón con una fracción aislada de inmunoglobulina rica en reagina aislada del suero de un paciente atópico. Después de la absorción con inmunoglobulinas purificadas de todos los isótopos conocidos (IgG. IgA. IgM e IgD), el antisuero aún reaccionaba con la globulina-y. presente en el suero de pacientes alérgicos. Después de la inmunoprecipitación con este antisuero, se suprimió la actividad sensibilizadora cutánea del suero de diferentes pacientes atópicos La evidencia definitiva de la singularidad inmunoquimica y la actividad reagínica de IgE fue obtenida algo tarde cuando se descubrió que las proteínas del mieloma humano reaccionaban con el antisuero antes mencionado (Bennich. 1969). Los experimentos realizados con fragmentos de inmunoglobulina aislados preparados por digestión enzimática de proteínas IgE de mieloma indicaron definitivamente que la actividad sensibilizadora cutánea requería de una región F, intacta y que los determinantes antigénicos únicos para moléculas de IgE se encontraban en el fragmento F, (Bennich, 1969). Las propiedades fisicoquímicas y las funciones inmunologicas de diferentes regiones de la molécula IgE. determinadas por experimentos llevados a cabo con proteínas IgE de mieloma humano purificadas y fragmentos de inmunoglobulina preparados por digestión enzimática. están resumidas en la Tabla 46-2. La estructura de la IgE humana se muestra en un diagrama en la Figura 46-2. Los anticuerpos IgE humanos sensibilizan la piel para liberar histamina, un fenómeno llamado anafilaxis cutánea pasiva. La actividad sensibilizadora
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
eos IgE de superficie celular (homocitotrópica). receptores de alta almidad para IgE (F , Rl) localizados difusamente en las membranas plasmáticas de las células efectoras. La unión de los anticuerpos IgE a F, Rl es reversible pero de muy alta afinidad (K = 10" M ') (Wank, 1983). Mientras que los anticuerpos IgE en sangre tienen una vida media de sólo dos o tres días, la vida media de los anticuerpos IgE en la piel delimitados por F„ Rl en mastocitos se estima que es superior a los 10 días. Se eslima que el número de receptores por célula oscila entre 40.000 y 500.000. Mayores números de receptores se encuentran en cultivos de basófilos en presencia de IgE, posiblemente reflejando la sobrerregulación de F., Rl expresada por IgE. F, Rl es un receptor multimétnco. compuesto por subunidades a, |i. y y como las siguientes; (/.,. |i, y y . Los anticuerpos IgE están delimitados por la subunidad-u; las subunidades -|i y -y contienen regiones transmembrana que funcionan en la señalización transmembrana (Ravetch, 1991).
Tabla 46-2 P r o p i e d a d e s fisicoquímicas d e la ¡nmunoglobulina E
(
Cadena clase H Fórmula molecular Coeficiente(s) de sedimeniación Peso molecular Carbotndralo (%) Determinantes antigénicos Fijación complementaria (clasica) Vida media en suero (días) Transferencia placentaria Actividad reaginica
E
E -L¡, 8 190 000 11,7 D,. D..2. D,3 Ninguna 2 Ninguna 4+; Los fragmentos que contienen Fe son inhibidores de la actividad sensibilizadora de la piel de IgE nalrvo. pero los fragmentos con Fab. no 2
a
¿
/
cutánea de la IgE es lábil al calor; calentando a 56C durante dos horas se modifican irreversiblemente los dominios C,3 y C,4 de la molécula IgE y se suprime la actividad sensibilizadora de la piel (Ishizaka, 1967). La aglutinación de células electoras también se suprime por la reducción y alquilación de los puentes disulfuro entre las cadena-,. Los agregados de IgE humano no se fijan al complemento por la vía clásica, y no hay paso placentario significativo de IgE humano.
Liberación de mediadores desde las células efectoras sensibilizadas a IgE Los mastocitos y basófilos son las células electoras principales de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Ambos tipos de células contienen histamina en granulos citoplasmáticos que se tiñen marcadamente con tintes básicos metacromáticos (Siraganian, 1988). Los mastocitos y basófilos se desarrollan en la médula ósea a partir de células madre pluripotenciales. un proceso que se estimula por IL-3 (Schrader, 1986). Los basólilos que circulan en la sangre tienen una vida corta, y están bien diferenciados, mientras que los mastocitos que se encuentran en tejidos próximos a los vasos sanguíneos y en tejidos conectivos adyacentes al epitelio del tracto respiratorio, del tracto intestinal y de la piel son células con una vida larga capaces de prolilerar en respuesta a estímulos mitógenos. Los mastocitos son heterogéneos pero contienen normalmente 10 veces más del total de histamina por célula que los basólilos. El mecanismo primario de liberación de histamina desde los mastocitos y basófilos incluye la señal transmembrana mediada por anticuerpos específi-
Las moléculas de F, Rl son móviles dentro de las membranas plasmáticas de las células sintetizadas, como indican estudios llevados a cabo con anticuerpos anti-lgE conjugados con fluorescencia. Esta movilidad para distancias cortas se cree que es importante en la liberación de mediadores desde mastocitos y basófilos. Otros estudios más amplios con basófilos y mastocitos sensibilizados In vitro con proteínas de mieloma IgE o con anticuerpos específicos IgE han mostrado que la formación de puentes de receptores IgE ocupados por antígenos multivalentes o por anticuerpos anti-lgE intactos o sus fragmentos F(ab')^ desencadena la liberación de histamina. pero haptenos univalentes o fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgE no. La importancia de la formación de puentes de receptores también se ha demostrado por estudios llevados a cabo con anticuerpos obtenidos de F Rl. Los anticuerpos intactos de F„ Rl causan la liberación de histamina. pero los fragmentos Fab no. Tomando en conjunto estos resultados se propone que los puentes entre los receptores adyacentes son importantes en la iniciación de la liberación de histamina (Siraganian. 1975). De acuerdo con la "hipótesis puente", los anticuerpos IgE juegan un papel pasivo en la producción de la liberación de mediadores vasoactivos. La señal inicial para la liberación de mediadores está proporcionada por los puntes cruzados de F„ Rl por un alérgeno multivalente, con IgE sirviendo como puente. u
A pesar de los ensayos en los sistemas modelo, las criticas rutas moleculares que siguen al puente de F.,. Rl y que permiten la liberación de histamina de las células sensibilizadas no están bien definidas. Con respecto a este tema, es suficiente mencionar que la señalización transmembrana mediada por F Rl en los mastocitos y basófilos probablemente implica vanos pasos, incluyendo la movilización de Ca-' desde los depósitos intracelulares y desde fuentes extracelulares a través de la formación de canales de Ca •; activación de proteínas aglutinadas de guanosin-trifosfato (GTP) unidas a moléculas de F , Rl, que permiten la activación de proteínas cmasas y metil-translerasas unidas a F,., Rl; activación de adenil ciclasa con el aumento de la producción intracelular del adenosin monofosfato cíclico; e hidrólisis de fosfolípidos que contienen inositol por activación de fosfolipasas A, y C, que generan diacil-glicerol y, seguido de nuevas hidrólisis, ácido araquidónico (Bradlord, 1998). Q
:
c
Estos pasos son importantes por dos razones: muchas señales son importantes para la liberación de mediadores desde los mastocitos y basófilos. y el tratamiento farmacológico de las enfermedades alérgicas a menudo implica el uso de fármacos que interfieren con estos mecanismos de señalización. Por ejemplo, la cromolma usada en el tratamiento de asma interfiere con la liberación de mediadores desde los mastocitos bloqueando la formación de canales de Ca^, y los corticoides interfieren con la señalización mediada por F Rl inhibiendo la hidrólisis de fosfolípidos mediada por la enzima (Mazeruk. 1984). Además, se sabe que el ácido araquidónico liberado por los basófilos y mastocitos tras la activación de las fosfolipasas celulares es el sustrato para las enzimas de las rutas metabólicas 5-lipoxigenasa y ciclo-oxigenasa, que conducen, respectivamente, a la síntesis y secreción de mediadores de inflamación leucotrienos y prostaglandinas (Fig. 46-3) (Lewis, 1981). El leucotrieno B.,. y prostaglandina D producen el movimiento de leucocitos, incluyendo eosinódlos. y ellos estimulan la agregación, liberación enzimática. y generación de superóxido en los neutrófilos. Los leucotrienos C , D y E, son liberados por muchos tipos de células, incluyendo mastocitos pulmonares, perifonéales y de la médula ósea, y leucocitos macrófagos. eosinófilos y basófilos. Estos mediadores causan broncoconstricción. aumentan la permeabilidad vascular en vénulas poscapilares y aumentan la secreción de moco. Estos u
?
4
Figura 46-2. La estructura de la IgE humana.
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CAPÍTULO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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Figura 46-3. Metabolismo del ácido araquidónico por las rutas de 5-lipoxigenasa y ciclooxigenasa.
también pueden mediar la pérdida reversible de capacidad pulmonar observada en el asma humano. Desde el punto de vista molar, los leucotrienos son muchas veces más potentes que la histamina. siendo estos los principales mediadores de los efectos inflamatorios que caracterizan las reaccionas de hipersensibilidad inmediata (Samuelsson, 1983). Otro mediador lípido de la inflamación, llamado factor activador plaquetario (PAF). es un sustituto derivado del glicerol generado a partir de fosfolípidos tras la activación celular. El PAF produce anafilaxia cuando se administra en pequeñas dosis a animales, y el análogo en humanos se cree que es liberado por neulrófilos y macrófagos alveolares. Los efectos biológicos del PAF que ocurren durante la anafilaxia incluyen la agregación y degranulación de plaquetas, contracción del músculo liso y aumento de la permeabilidad capilar (Barnes, 1988).
EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS La enfermedad alérgica es un problema de salud pública significativo. Como antes se comentó, más del 20% de los adultos sufren alguna de las formas crónicas de la enfermedad alérgica. Como muchos individuos atópicos desarrollan alergias durante la infancia, la prevalencia de enfermedades alérgicas en niños proporciona otra estimación de la magnitud de la totalidad de este problema médico. El asma afecta aproximadamente al 5% de los niños en edad escolar, y otras enfermedades alérgicas menos incapacitantes como la rinitis alérgica y el eczema, afectan aproximadamente un 15% y un 5% de los niños, respectivamente. Según una revisión, las enfermedades alérgicas menores afectan a casi el 40% de todos los niños de Estados Unidos. De forma rutinaria los médicos apenas utilizan unas pocas pruebas de laboratorio para la evaluación de enfermedades alérgicas. Las pruebas para proteina IgE y para anticuerpos IgE alérgenos específicos son los pilares. Antes de tratar los detalles de estas pruebas, es importante apuntar que la utilidad de cada prueba viene determinada por el contexto clínico en el que se aplica. En el campo de la alergia clínica, las pruebas para proteína IgE y anticuerpos IgE se piden principalmente para el diagnóstico y menos frecuentemente para la valoración pronostica, o como una ayuda en el tratamiento terapéutico. La utilidad de los resultados de la prueba en cada situación está determinada empíricamente por si es difícil o no establecer un diagnóstico
preciso de enfermedad alérgica o decidir un solo régimen terapéutico determinado en el campo práctico. En niños y adultos, la hipersensibilidad inmediata puede ser el primer mecanismo de la enfermedad o un factor contribuyente; y mientras que en el campo práctico es posible establecer un diagnóstico de presunción de una enfermedad alérgica, a menudo el diagnóstico definitivo y el tratamiento requieren de la identificación inequívoca del alérgeno(s) en particular. Esto es particularmente importante en casos de enfermedad alérgica grave que se produce en individuos sin un antecedente atópico o un antecedente familiar de enfermedad alérgica. La palabra atopia (o atópico) se utiliza sobre todo en la bibliografía médica de la alergia para referirse a los individuos con una historia familiar de enfermedad alérgica que tienen sensibilidad demostrable a una variedad de alérgenos. Estos individuos se incluyen aquí por tener un fenotipo alérgico. Los individuos no atópicos pueden también sufrir enfermedades alérgicas y pueden desarrollan clínicamente reacciones de hipersensibilidad inmediata significativas a alérgenos que se encuentran repetidamente en su entorno. La característica que distingue a los individuos atópicos es su tendencia a desarrollar sensibilidad a una variedad de alérgenos encontrados en condiciones ambientales rutinarias (Hoekelman. 1974). La atopia clínica existe asociada a la normalidad. No se puede explicar la utilidad de las pruebas de laboratorio en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades alérgicas sin mencionar las pruebas ín vivo de la hipersensibilidad inmediata, particularmente la prueba cutánea y las pruebas de provocación órgano-especificas. Históricamente, se consideraban las pruebas in vivo como un criterio de diagnóstico preciso y fiable. La capacidad de reproducir una reacción alérgica específica por un mecanismo in vivo todavía se considera por muchos alergólogos como la técnica más sensible para demostrar la presencia de hipersensibilidad inmediata y para definir su especificidad. Las pruebas cutáneas se realizan por la inyección inlradérmica y por los métodos de pinchazo cutáneo (Bousquet, 1993). La respuesta a la inyección intradérmica de un extracto alérgeno se gradúa determinando el diámetro del grano y por la reacción eritematosa inmediatamente después de la inyección. Una reacción con 1+ se corresponde con un grano de 5 mm a 10 mm. Una respuesta de esta magnitud habitualmente se considera como evidencia de una sensibilidad específica a un alérgeno. Los individuos altamente sensibles a menudo desarrollan granos de diámetros mayores de 15 mm con seudópodos. Las pruebas cutáneas realizadas mediante un pinchazo utilizan un alér-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
geno exaclo más concentrado, a concentraciones 1.000 veces superiores a las utilizadas en las pruebas intradérmicas. y su gradación a menudo se omite. El diámetro medio del grano en milímetros se apunta como un indicador del grado de sensibilidad. Se puede obtener una estimación más cuantitativa de la sensibilidad a un determinado alérgeno mediante una técnica de ajuste final. Esta técnica es una modilicación de los métodos mtradérmicos y de pinchazo cutáneo. De forma senada se utilizan diluciones con 10 veces el extracto alérgeno estandarizado empezando con la solución más diluida. El objetivo de la sensibilidad se define como la mayor dilución que produce una reacción 1+.
12.0(M)
Las pruebas de provocación a determinados órganos son útiles en la práctica clínica y con propósitos de investigación. Las adaptaciones de esta técnica incluyen la prueba de provocación bronquial en el diagnóstico de asma: la prueba de provocación rinoconjuntival en el diagnóstico de rinitis alérgica: la eliminación de comida y prueba provocación en el diagnóstico del asma inducido por comida, urticaria y malabsorción: y la provocación de una picadura en el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica al veneno de insectos (Naclerio. 1993). La aplicación de pruebas de provocación en situaciones clínicas rutinarias está limitada por la necesidad de un alérgeno exlraído bien caracterizado de potencia definida y por el número limitado de alérgenos que pueden ser probados en un individuo en una única ocasión. Como ejemplo, la eliminación de comida y procedimientos de provocación que requieren de períodos de abstinencia de varios dias. durante los cuales el consumo inadvertido de un alimento determinado puede invalidar la prueba. Un obstáculo importante para el diagnóstico exacto en el campo de la alergia clínica es la falta de extractos de alérgeno disponibles de potencia uniforme y composición definida (Bousquet, 1995). Salvo en ejemplos seguros, como las conocidas hierbas, céspedes, ácaros y mohos, los constituyentes químicos que provocan reacciones alérgicas no están caracterizados para muchos alérgenos reconocidos. A pesar de los esluerzos de los fabricantes por producir materiales estandarizados, a menudo los diferentes lotes del mismo alérgeno varian en potencia por apenas una sene de medidas. Se han utilizado diversas técnicas para cuantificar la potencia de alérgenos en el uso clínico, incluyendo medidas del contenido de nitrógeno de proteínas, pruebas cutáneas de ajuste específico, análisis inmunoquimicos con antisuero animal específico, e inhibición de la aglutinación de anticuerpos IgE específicos por alérgenos solubles m w'fro (Gleich. 1974). La inhibición de la aglutinación de anticuerpos IgE específicos por alérgenos en solución acuosa es un método excelente para comparar extractos de alérgenos. La potencia de un extracto alérgeno está inversamente relacionada con la dosis de alérgeno soluble requerida para inhibir la aglutinación de los anticuerpos IgE en un control positivo de suero a una cantidad fija de alérgeno ajustado en fase sólida. La semejanza cualitativa y antigénica de los diferentes lotes de alérgeno y la cantidad de alérgeno presente se pueden estimar comparando las pendientes y ED,„ de las curvas dosis-inhibición. Los diferentes lotes de alérgenos que contienen la misma mezcla cualitativa de constituyentes alergénicos provocan lineas dosis-inhibición paralelas cuando el porcentaje de inhibición se traza frente a la dosis de un extracto alérgeno soluble. El método de inhibición in vilro es útil para comparar la potencia y las características antigénicas tanto de alérgenos puros como de mezclas.
Proteína IgE: métodos de determinación, valores normales y utilidad clínica Existen una variedad de métodos inmunoquimicos disponibles comercialmente para determinar el IgE en suero, incluyendo desplazamiento competitivo e inmunoanálisis sandwich y nefelometría (Homburger. 1993). Los métodos no isotópicos son los más populares. Cada uno de estos inmunoanálisis es capaz de detectar IgE en suero a concentraciones tan bajas como 0,5 U/ml (1,2 ng/ml). Los métodos sandwich de inmunoanálisis utilizan una aproximación analítica común; un anticuerpo anti-lgE policlonal o monoclonal, unido covalentemente a una fase sólida, se incuba con una proporción de suero o estándar, y la IgE unida se detecta mediante incubación con el anticuerpo anti-lgE marcado, purificado de afinidad, o monoclonal. La concentración de IgE en muestras de suero se calcula comparándola con una curva estándar. La máxima sensibilidad analítica se consigue en el rango de 7,5 a 50 U IgE /mi. Las concentraciones menores pueden determinarse por métodos sandwich.
pero la habilidad de detectar pequeños cambios de concentración en el rango de 0,5 a 4 U /mi disminuye comparada con concentraciones más elevadas (Fig. 464). Se han realizado numerosos estudios clínicos de las concentraciones de IgE en suero en sujetos sanos (no alérgicos). En todos los estudios, hay tendencias estrictas en el desarrollo de niveles de IgE con la edad y con distribuciones de frecuencia de concentraciones de IgE observadas en adultos sanos sin tener en cuenta los métodos analíticos (Homburger. 1986). La distribución de la frecuencia de las concentraciones de IgE en adultos sanos se angula positivamente con los límites de percentil 95 y con un número exagerado de valores baios de IgE. Al calcular el percentil 95 de los limites normales, la mayoría de los investigadores han tratado sus datos con transformación logarítmica, produciendo por lo tanto límites superiores a lo normal que son al parecer muy elevados cuando se comparan con las medias aritméticas (Barbee. 1981). Como se comentará más tarde, estos limites superiores de lo normal sirven para reducir la sensibilidad diagnóstica de la prueba de IgE en suero como una prueba de despistaje clínico de alergia cuando el límite superior al normal se usa como valor de corte. La síntesis de IgE en el feto humano se produce incluso a las 11 semanas de gestación en el tejido fetal pulmonar y hepático, aunque el cordón umbilical contiene IgE virtualmente no detectable. La concentración media del cordón umbilical es menor de 1 U/ml (Kimpen. 1989). Las concentraciones de IgE en el suero materno y en el cordón umbilical no se correlacionan, indicando que no hay paso placentario apreciable de IgE materna. La existencia de anticuerpos IgE específicos para la leche de vaca en el cordón umbilical, pero no en el suero materno, indica que puede existir una sensibilización intrauterina y apoya la conclusión de que la proteína IgE detectada en el cordón umbilical tiene un origen fetal. Las concentraciones de IgE en suero de niños aumentan lentamente con el desarrollo o alcanzan los niveles adultos aproximadamente a los cinco a los siete años de edad (Homburger, 1986a). Varios estudios clínicos han mostrado un promedio un tanto más alto de la concentración de IgE en suero en niños de edades entre los 10 y los 14 años que en adultos de 20 años. El significado clínico de este descubrimiento no está claro. No se han observado diferencias entre los niveles de IgE en niños y niñas de edades similares. En individuos mayores de 70 años de edad, hay una tendencia a un promedio de niveles de IgE más bajo que en los adultos jóvenes menores de 40 años de edad. La determinación de la proteina IgE en suero ha sido evaluada a fondo por su utilidad clínica en el diagnóstico de vanas enfermedades alérgicas, por su valor predictivo como un indicador de la probabilidad del desarrollo de enfermedad alérgica en bebés y niños asmtomálicos. y como indicador pronóstico en adultos con algunos tipos de enfermedad alérgica crónica. La determina-
CAPÍTULO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
ción de IgE también es valiosa en la valoración de pacientes en los que se sospecha que puedan tener enfermedades de inmunodeficiencia. enfermedades parasitarias o el raro síndrome hiper-lgE. El síndrome hiper-lgE fue descrito primero en 1972 por Buckley y col., que publicaron dos casos de pacientes con niveles altamente elevados de IgE en suero, dermatitis difusa, furunculosis recidivante y neumonía con neumatoceles secundarios a Staphylococcus aureus. Las publicaciones posteriores de pacientes con este trastorno definen este síndrome clinico: las elevaciones de los niveles de IgE en suero son extremas (de 2.000 a 50.000 U / mi), y los pacientes tienen eosinofilia en sangre y tejidos y un habón fuertemente positivo inmediato y reacciones enlematosas a alérgenos inhalados, pólenes, alimentos, y antígenos bacterianos y de hongos. A pesar de estos descubrimientos, el asma no es común en pacientes con el síndrome hiper-lgE (Buckley, 1978). La síntesis de IgE, como se refleja en los niveles de suero, se ha estudiado en pacientes con un sinfín de enfermedades ¡nmunodeficientes primarias Se han descrito niveles elevados de IgE asociados con deficiencias incompletas de la inmunidad celular, incluyendo el síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome parcial DiGeorge y alinfoplasia timica (síndrome de Nezelof) (Buckley. 1975). Las inmunodeficiencias en las que hay ausencia completa de síntesis de mmunoglobulinas G, A y M, como la enfermedad inmunodeficienle aguda (SCID), muestran característicamente una disminución de la síntesis de IgE y niveles de IgE marcadamente disminuidos en suero. Los niveles de IgE en suero son variables en pacientes con deficiencia de IgA: los pacientes con ataxia telangiectasia típicamente tienen niveles disminuidos, pero los pacientes con deficiencia aislada de IgA pueden tener niveles normales o moderadamente aumentados (Buckley, 1975). La enfermedad alérgica no es común en pacientes con inmunodeficiencias, a excepción de los individuos con deficiencia de IgA selectiva que tienen niveles de IgE elevados en suero. La síntesis elevada de IgE en pacientes con síndrome hiper-lgE o con deficiencias parciales de inmunidad celular posiblemente manifiestan una secreción de IgE aumentada producida por los linfocitos B que escapan del control regulador de los linfocitos T. La infiltración parasitaria del tracto gastrointestinal o órganos parenquimatosos estimula intensamente la síntesis de IgE, y los estudios de laboratorio con animales sugieren que los anticuerpos IgE específicos son importantes en la defensa del huésped frente a parásitos como el Nippostrongylus brasillensis y Schistosoma mansoni (Mulligan, 1965). Las concentraciones de IgE en suero superiores a 1.000 U/ml se encuentran de forma habitual en niños en áreas de infestación endémica con parásitos. Se sabe que existen otras enfermedades parasitarias asociadas a niveles de IgE en suero aumentados, incluyendo la larva visceral migratoria (Toxocara cams), capilariasis intestinal (Capillana philippinensis). esquistosomiasis. anquilostomiasis y equinococosis. En pacientes con enfermedad parasitaria intestinal, se han evidenciado niveles de IgE en suero disminuidos considerablemente después de seguir un tralamienlo exitoso con fármacos antiparasitarios. Al revisar la utilidad de los niveles de IgE en suero como prueba diagnóstica para la enfermedad alérgica, es importante tratar su uso en niños y adultos por separado. Los niveles de IgE en suero elevados al nacer o durante la
Tabla 46-3
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lactancia sucede a menudo antes del desarrollo de la alergia clínica (Kjellman, 1984). Se observaron niveles de IgE en suero por encima del percentil 95 para la edad en el 75% de los niños con antecedentes de ambos padres de enfermedad alérgica; y entre los niños sanos con niveles de IgE mayores de 1 SD por encima de la media para una edad determinada, la incidencia de desarrollo de enfermedad alérgica durante los siguientes 18 meses aumentaba en 10 veces más en comparación a un grupo con niveles de IgE más bajos. Aunque prevén el desarrollo de una futura enfermedad alérgica, estos datos aportan relativamente poca información sobre cómo basar decisiones clínicas especificas. El diagnóstico de enfermedad alérgica en los laclantes es complicada debido a que la rinorrea es la manifestación más común de alergia en este grupo de edad, pero las infecciones respiratorias son comunes durante la lactancia y puede ser imposible distinguirlas de la rinitis alérgica en la práctica clínica. Sin embargo, como la enfermedad alérgica de inicio precoz parece estar asociada con manifestaciones clínicas más agudas, es importante establecer el diagnóstico de alergia lo antes posible {véase más adelanté). El valor principal de las determinaciones de IgE en niños parece ser la alerta para el médico de una posible enfermedad alérgica cuando el diagnóstico clínico de sospecha es diferente. Los niveles de IgE en suero superiores a 20 U/ml en estos casos apoyan el diagnóstico de enfermedad alérgica, pero un nivel normal de IgE no excluye el diagnóstico de enfermedad alérgica durante la infancia o en la vejez. Los resultados de otras pruebas diagnósticas, incluyendo pruebas para anticuerpos IgE, pueden tomarse en consideración en el diagnóstico de exclusión de enfermedad alérgica. En esas situaciones clínicas donde los signos de enfermedad alérgica son inequívocos, por eiemplo eczema y rinitis en un niño con antecedente familiar de atopia, el nivel de IgE en suero proporciona una pequeña información adicional. La situación es bastante similar en niños mayores. La determinación de la proteína IgE en suero tiene una sensibilidad diagnóstica limitada para la enfermedad alérgica cuando el limite superior del rango normal se utiliza como una cota diagnóstica. En general, los niños con hipersensibihdad a varios alérgenos diferentes y múltiples enfermedades alérgicas presentan niveles en suero elevados, y aquellos con hipersensibilidad a menos alérgenos y afectación limitada a un órgano a menudo tienen niveles normales (Berg. 1969). Este detalle se ilustra en los datos de la Tabla 46-3. La sensibilidad diagnóstica es mayor en pacientes con sensibilidad clínica a un numero de alérgenos diferentes. En niños atópicos, la presencia de enfermedad cutánea y manifestaciones gastrointestinales aumenta la probabilidad de que los niveles de IgE en suero estén elevados (Havnen, 1973). También hay evidencias que apuntan que la frecuencia de los niveles elevados de IgE en suero es mayor en niños con hipersensibilidad a los alimentos y a alérgenos del polen que en niños con hipersensibilidad a alérgenos de polvo o moho (Berg. 1969). Los niños con enfermedad alérgica que afecta a varios órganos también suelen tener elevaciones en IgE en suero de mayor magnitud que aquellos con enfermedades más limitadas; las elevaciones extremas ocurren más a menudo en pacientes con manifestaciones cutáneas. La especificidad diagnóstica de un nivel elevado de IgE para la enfermedad alérgica es excelente. La asociación es tan fuerte, que los
Incidencia de c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a s de IgE en s u e r o en n i ñ o s alérgicos de e d a d e s de d o s a 16 a ñ o s con diferentes c o m b i n a c i o n e s d e e n f e r m e d a d e s alérgicas
Diagnostico
№ de n i ñ o s en cada grupo
Sólo asma
№ de niños con IgE en suero e l e v a d o
Incidencia de IgE en suero elevado (%)
3
14
Asma y rinoconjuntivitis
33
13
39
Asma y dermatitis atópica más otras enfermedades de hipersensibilidad
70
41
58
Asma y urticaria más oirás enfermedades de hipersensibilidad
75
46
61
12
50
11
84
Asma y urticaria y dermatitis atópica más otras enfermedades de hipersensibilidad Asma y alergia gastrointestinal más otras enfermedades de hipersensibilidad
13
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
niños asinlomálicos con niveles elevados de IgE a veces se califican como prealérgicos, asumiendo que desarrollarán signos de alergia clínica en el futuro. La determinación de la proteina IgE en suero tiene una utilidad diagnóstica moderada en la mayoria de los adultos con sospecha de padecer una enfermedad alérgica. Los resultados de estudios clínicos de alergia respiratoria adulta indican que aproximadamente el 50% de los adultos con asma extrínseca y menos del 5% de adultos con la denominada asma intrínseca (no atópica) tienen elevados niveles de IgE en suero (Wittig. 1980). Los adultos asmáticos con hipersensibilidad a un número limitado de alérgenos habitualmente tienen niveles normales. Los mayores niveles de IgE en adultos característicamente ocurren en aquellos pacientes con hipersensibilidad a diversos alérgenos y combinaciones de asma, dermatitis atópica y rinitis. Al igual que en los niños, la sensibilidad diagnóstica limitada de los niveles de IgE en suero limita la utilidad clínica de las determinaciones de IgE en aquellas situaciones donde el diagnóstico de enfermedad alérgica es más incierto (Klink, 1990). Esto no quiere decir, sin embargo, que la IgE en suero no pueda determinarse en estos casos, pues un nivel elevado tiene un alto valor predictivo de enfermedad alérgica.
de estas características, la prueba de liberación de histamina leucocitaria presenta aplicaciones limitadas en la práctica clínica. Aproximadamente el 15% de los individuos tienen leucocitos que no liberan histamina in vitro. Aunque se han desarrollado sistemas automatizados para la determinación de histamina, este análisis es incómodo de realizar y caro. La prueba requiere de células sanguíneas frescas y sólo se pueden analizar un número limitado de alérgenos utilizando una muestra única de sangre. Actualmente, la prueba de histamina liberada se utiliza más en investigación que en la práctica clínica.
Los niveles de IgE en suero han recibido una atención particular en niños y adultos con dermatitis atópica. Los mecanismos relacionados con la patogénesis de la dermatitis atópica se desconocen por completo, pero el descubrimiento de niveles muy altos de IgE en la mayoría de los pacientes con dermatitis atópica y enfermedad activa ha provocado diversas investigaciones de la relación entre la actividad de la enfermedad y los niveles de IgE. Aunque no hay un consenso, algunos estudios indican que las fluctuaciones en la gravedad de las manifestaciones cutáneas paralelas cambian análogamente al nivel de IgE en suero (Wuthrich. 1978). Las relaciones causales, si existen, permanecen ocultas.
Las concentraciones reales de anticuerpos IgE no se determinan con precisión con estas técnicas. En el suero de algunos individuos alérgicos, las concentraciones de anticuerpos IgE exceden la capacidad aglutinante de los alérgenos inmunoabsorbentes, y los sobrenadantes incubados en la primera fase contienen cantidades residuales de anticuerpos IgE específicos. En un rango un tanto limitado de concentraciones, la aglutinación de anticuerpos en la segunda fase incrementa en proporción directa a la concentración de anticuerpos IgE en suero y se puede obtener alguna cuantificación. Sin embargo, la aglutinación final refleja cantidades y afinidades de los anticuerpos presentes (Schellenberg, 1975).
La aspergilosis broncopulmonar alérgica también se asocia a una marcada elevación del nivel de IgE en suero. Esta enfermedad ocurre típicamente en pacientes con asma extrínseca, generalmente de larga duración. Los niveles de IgE en suero están elevados en casi todos los pacientes con aspergilosis alérgica cuando existe una infiltración pulmonar aguda, pero los niveles de IgE pueden fluctuar considerablemente durante el curso de la enfermedad. Un nivel normal de IgE en un paciente con enfermedad pulmonar activa excluye prácticamente este diagnóstico (Imbeau, 1978).
Como inicialmente describieron Wide y col. (1967). la prueba del anticuerpo IgE empleaba alérgenos unidos covalentemente a gotas de Sephadex. Una variedad de otros materiales de fase sólida se han utilizado con posterioridad, incluyendo partículas de celulosa, gotas de agarosa. discos de filtro de papel y placas de microtítulaciones de poliestireno. Muchos de estos materiales de soporte pueden activarse químicamente a formas intermedias lábiles que reaccionan con alérgenos en solución acuosa para formar inmunoabsorbentes unidos covalentemente. La aglutinación de alérgenos en las placas de microtítulaciones se realiza por absorción no covalente. Para la aplicación clínica, la fase sólida alérgeno inmunoabsorbente puede contener todos los constituyentes alergénicos presentes en el extracto alérgeno liquido, en las mismas proporciones que el extracto alérgeno original. Aunque es posible controlar la unión de todas las proteínas a inmunoabsorbentes, existen pocos datos disponibles para determinar si todas las proteínas alergénicas relevantes se han fijado a algunos sistemas alergénicos clínicamente importantes.
Anticuerpos IgE alérgeno-específicos: métodos de determinación, calificación de resultados, y utilidad clínica Las pruebas cutáneas y de provocación a un órgano son procedimientos establecidos para la detección de anticuerpos IgE in vivo, como se comentó previamente. También existen métodos in vitro para detectar anticuerpos IgE en suero y en los granulocitos basófilos; los métodos principales son la prueba del anticuerpo IgE específico y la prueba de liberación de histamina leucocitaria, respectivamente. La prueba de liberación de histamina leucocitaria lúe descrita por primera vez hace más de 50 años. Los leucocitos aislados de sangre periférica por sedimentación de dextrano se lavan y se suspenden de nuevo en un tampón que contiene iones Ca y Mg \ Entonces, se añaden concentraciones variables de un extracto alérgeno a un número determinado de leucocitos lavados, y la mezcla se incuba a 37°C durante una hora. La reacción se para congelando los tubos a 4°C, y las células se separan por centrifugación. La histamina secretada por los basófilos como consecuencia de la interacción del alérgeno con las células unidas a anticuerpos IgE se libera en el líquido sobrenadante y se aisla por extracción con butanol ya ácido. La concentración de histamina en el extracto se mide de forma fluorométrica o por inmunoanálisis específico. El procedimiento fluorométrico. realizado manualmente, detecta aproximadamente 1 ng de histamina. El método de inmunoanálisis es un poco más sensible. Los resultados se expresan como un porcentaje del total de histamina celular liberada; la histamina total se determina en los usados ácidos de leucocitos no expuestos al extracto de alérgeno (Lichtenstein. 1964), 2,
2
Los resultados de la prueba de liberación de histamina leucocitaria definen la especificidad de los anticuerpos IgE ligados a células e indican la integridad funcional de los mecanismos mediadores de liberación. A pesar
La prueba de anticuerpo IgE. inicialmente conocida como prueba radioalergoabsorción (RAST), es un inmunoanálisis sandwich análogo en principio a la prueba de Coombs indirecta. Se mezcla la muestra de suero en la que se quieren determinar los anticuerpos IgE con un alérgeno unido a un material en fase sólida. Después de la incubación inicial, los componentes que no son anticuerpos se retiran, y el alérgeno inmunoabsorbente se incuba en una segunda fase del análisis con anticuerpos anti-lgE monoclonales o cromalografia marcada purificada. Los anticuerpos IgE específicos fijados en la primera fase del análisis se detectan con anticuerpos anti-lgE marcados unidos a la fase sólida del complejo alérgeno (Gleich. 1975).
Existe un amplio rango de alérgenos disponible para la prueba de anticuerpo IgE. Es posible adquirir los reactantes en kits o se puede enviar el suero a un laboratorio de referencia para su análisis. Las diversas clases de alérgenos disponibles incluyen epitelio animal; alimentos; pólenes de árboles, céspedes y hierbas; mohos; hongos: venenos de insectos; fármacos; y alérgenos ocupacionales. La mayoría de las drogas son compuestos de bajo peso molecular que no pueden fijarse fácilmente en una fase sólida por los métodos químicos habituales. Algunas drogas macromoleculares, como la insulina, pueden unirse para producir reactivos satisfactorios. En el caso de la penicilina, el grupo peniciloil puede conjugarse a la polilísina o a la proteina transportadora, que así puede fijarse a una fase sólida apropiada para utilizarse en la prueba de anticuerpo IgE (Wide, 1971). No hay reactantes análogos disponibles para detectar anticuerpos IgE de los conocidos determinantes antigénicos menores de penicilina, responsables de algunas reacciones anafilácticas agudas a esta droga. No hay un acuerdo unánime para notificar resultados de las pruebas de anticuerpos IgE. Varios métodos comerciales utilizan un sistema de puntuación que obtiene los resultados de las muestras de pacientes a partir de la comparación con la curva dosis-respuesta de referencia obtenida de una serie de diluciones de un control positivo (Fig.46-5). En un intento de maximizar la sensibilidad analítica de estos métodos, se consideran positivos aquellos resultados superiores a 0,35 KU/L (unidades Killa por litro) estándar. La concentración de anticuerpos IgE puede expresarse tanto en KU / L
CAPÍTUIO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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do. Sin embargo, en la mayoría de los esludios clínicos los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE se han comparado con los resultados de las pruebas de diagnóstico in vivo y los antecedentes de enfermedad alérgica. Está claro según estos estudios que la sensibilidad diagnóstica varia considerablemente dependiendo del tiempo transcurrido desde la exposición a un alérgeno y la prueba, la clase de alérgeno examinado, la edad del paciente y los órganos diana afectados (Homburger, 1986a). En los objetivos de este capitulo, es útil considerar las siguientes aplicaciones clínicas por separado: enfermedad respiratoria alérgica, alergia a alimentos, sensibilidad al veneno de insecto y alergia a lármacos u ocupacional.
2(1.0(10
0.35 0,7
3.5
17,5
50 100
Concentración (kU-1) Figura 46-5. Curva dosis-respuesta para la determinación de anticuerpos IgE por inmunoanálisis de enzima fluorescente comercial. FU = unidades fluorescentes.
como en clases numeradas del O al V o VI. La mayoría de los médicos están más familiarizados con los sistemas de puntuación basados en clases. Sin tener en cuenta el sistema usado para expresar los resultados, debería tenerse en cuenta que la mayoría de los resultados son semicuantitativos. Los resultados dudosos o débilmente positivos pueden deberse a la variabilidad analítica (Jacob, 1982). El suero con niveles de proteina IgE marcadamente elevados también pueden producir resultados falsos positivos, debido a una unión incrementada no específica de IgE. Este fenómeno habitualmente no ocurre a no ser que la concentración de IgE exceda de 1.000 KU / L, lo que puede ocurrir en pacientes con dermatitis atópica o enfermedades alérgicas múltiples. Los resultados de falsos negativos causados por la inhibición de la unión de anticuerpos IgE puede ocurrir en algunos sistemas analíticos debido a la competición por lugares de unión a alérgenos por anticuerpos IgG. Estos anticuerpos tienen afinidades similares a los anticuerpos IgE y habitualmente se encuentran en concentración de microgramo por mililitro en el suero de pacientes tratados con inmunoterapia alérgena (Paull. 1978). Como las determinaciones de anticuerpos IgE no son útiles en pacientes tratados para determinar si existe sensibilidad clínica residual, se entiende que este problema habitualmente ocurre cuando la prueba de anticuerpo IgE se usa mapropiadamenle. La sensibilidad analítica de una prueba de anticuerpo IgE en parte está determinada por el anticuerpo anti-lgE marcado utilizado en la segunda fase del análisis. Los anticuerpos anti-lgE comerciales con afinidad purificada y marcados funcionan bien como proteínas detectoras y permiten la determinación de cantidades en nanogramos de anticuerpos IgE específicos. Los anticuerpos anti-lgE monoclonales marcados también están disponibles comercialmente. Las recomendaciones para el uso clínico de la prueba de anticuerpo IgE se basan en los resultados de estudios clínicos donde los resultados de la sensibilidad del anticuerpo IgE fueron comparados con oirás pruebas diagnósticas. En algunos casos, la decisión de identificar los alérgenos específicos responsables de los signos clínicos está moderada al saber que la terapia no será diferente si se identifican los alérgenos agresores. Este último punto es importante en muchos pacientes cuyo tratamiento está basado en el uso de fármacos que inhiben la liberación de mediadores inflamatorios, producen broncodilatación o suprimen la inflamación. Sin embargo, en la mayoría de los individuos alérgicos, el conocimiento de los alérgenos agresores es clínicamente útil para decidir qué tipo de alérgenos deben usarse en un régimen de inmunoterapia, como en pacientes con rinitis alérgica o sensibilidad al veneno de insectos, o para conseguir evitar un alérgeno en casos de sensibilidad anafiláctica a alimentos o fármacos. Es difícil definir la sensibilidad diagnóstica absoluta y específica de los resultados de anticuerpo IgE porque no hay un método de referencia umversalmente aceptado para definir la sensibilidad hacia un alérgeno determina-
Como los anticuerpos IgE asociados a células median en la enfermedad respiratona alérgica, es razonable tener en cuenta los resultados de las pruebas de provocación a un órgano específico como un criterio para determinar la sensibilidad hacia un alérgeno determinado. Diversos estudios en adultos con asma o rinitis alérgica han mostrado una excelente relación general entre los resullados de pruebas de provocación y las pruebas de anticuerpo IgE llevadas a cabo con alérgenos inhalados, incluyendo pólenes de árboles, céspedes y hierbas, mohos y ácaros. Los resultados de las pruebas cutáneas y pruebas de anticuerpo IgE también concuerdan en la mayoría de los casos. La mayoría de los resultados discordantes fueron pruebas cutáneas débilmente positivas en pacientes con pruebas de anticuerpo IgE negativo (Wide, 1967). En niños con enlermedad alérgica, los estudios epidemiológicos recientes han aportado un secuencia de desarrollo de signos y síntomas de enfermedad que se acompañan de una secuencia predecible de sensibilización a diferentes clases de alérgenos (Bergmann, 1997). Esta denominada marcha alérgica a menudo empieza con alergia a alimentos en niños menores de tres años asociada a manifestaciones gastrointestinales y dermatitis atópica seguida de enfermedad respiratoria incluyendo asma y rinitis causadas por sensibilidad a alérgenos inhalados. La secuencia de detección de anticuerpos IgE que es paralela al desarrollo de manifestaciones clínicas avanza con la edad de la siguiente forma: los anticuerpos IgE de proteínas de alimentos especialmente huevo y leche se detectan primero sobre los tres años de edad, luego anticuerpos de alérgenos inhalados, empezando con alérgenos internos incluyendo epitelio animal y ácaros de polvo sobre los cinco años de edad; y al final de la infancia, los alérgenos inhalados externos incluyendo pólenes. El desarrollo de sensibilidades en esta secuencia tiene implicaciones obvias para las pruebas clínicas en niños. Entre los niños con enfermedad respiratoria alérgica, los estudios clínicos han mostrado que los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE y las pruebas de provocación concuerdan en muchos casos. De nuevo, la mayoría de los resultados discordantes se han observado en niños con pruebas de provocación positivas hacia extractos alérgenos altamente concentrados. Se observó una concordancia importante en niños con alergia moderada o aguda, y en niños con pruebas de provocación negativas. Como muestran estos resultados, la sensibilidad diagnóstica de estas pruebas de anticuerpo IgE hacia alérgenos inhalados varia directamente con la magnitud de sensibilidad clínica en pacientes con alergias respiratorias (Berg, 1974). También es oportuno preguntarse si concuerdan bien los resultados de anticuerpo IgE con las pruebas cutáneas en casos de sospecha de alergia respiratoria. En los estudios previamente mencionados, si los resultados de pruebas cutáneas realizados con el método del pinchazo se utilizaron para definir la sensibilidad hacia un alérgeno, se obtuvieron muchos más resultados discordantes. La prueba de anticuerpo IgE fue negativa en pacientes con pruebas cutáneas débilmente positivas, pero se obtuvieron resultados positivos casi en el 90% de los pacientes con pruebas cutáneas fuertemente positivas. En general, las mejores correlaciones se observaron con alérgenos de polen y alérgenos purificados, mientras que se observaron menores grados de correlación con alérgenos de polvo y moho. Los partidarios de la prueba cutánea defienden que datos como éstos indican que la prueba cutánea es un método diagnóstico más sensible, mientras los partidarios de la prueba de anticuerpo IgE señalan que un alto porcentaje de las pruebas cutáneas débilmente positivas no son validadas por pruebas de provocación positivas. El argumento es un tanto teórico; cualquier método diagnóstico es fiable en pacientes con sensibilidad marcada a un alérgeno y ninguno es completamente fiable para identificar ligeras discordancias de sensibilidad clínica. En este último caso, los dos métodos pueden proporcionar información diagnóstica complementaria.
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Las pruebas para anticuerpos IgE tienen ciertas ventajas comparadas con las pruebas cutáneas. No presenta riesgo para el paciente, y los resultados no están influidos por tratamientos concomitantes con antihistamínicos o broncodilatadores. Además, la prueba de anticuerpo IgE puede ser mejor que la prueba cutánea en ciertos grupos de pacientes, como los bebés, pacientes con dermografismo o pacientes con dermatitis generalizada. También hay desventajas. La prueba serológica es cara si se hace indiscriminadamente, y los resultados no son inmediatos. Recientemente, la prueba de anticuerpo IgE multíalérgeno realizada con inmunoabsorbentes que tienen más de un alérgeno acoplado a su superficie se ha mostrado que es una prueba de detección sistemática sensible y eficaz en coste para la alergia por inhalación. Se necesitan nuevos esludios para documentar la utilidad de esta prueba como una prueba de detección sistemática en otras situaciones clínicas (Ownby, 1984). Como se comentó previamente, la sensibilidad a alimentos sucede precozmente en niños atópicos y se manifiesta con una variedad de signos clínicos en bebés, niños y adultos, incluyendo eczema y dermatitis, rinitis y broncoespasmo, angioedema, urticaria, y rara vez anafilaxia. La determinación de anticuerpos IgE puede ser útil en estos casos, pero existen posibles riesgos al interpretar los resultados de estas pruebas que deberían conocerse. En la determinación total excepto de la sensibilidad anafiláctica a determinados alimentos, el uso de provocación con un alimento a doble ciego se considera el diagnóstico estándar (Bock, 1980). Sin embargo, las pruebas para anticuerpos IgE son útiles para seleccionar alérgenos para pruebas de provocación a doble ciego y para confirmar el antecedente. Los resultados IgE positivos se supone que son clínicamente significativos si los resultados están apoyados fuertemente por la historia clínica. Sin embargo, a diferencia de las alergias por inhalación, la incidencia de resultados falsos positivos (anticuerpos IgE a comida detectables no parece que se asocien a signos clínicos) es considerable, particularmente en niños. Los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE pueden utilizarse para predecir los resultados de la prueba de provocación a alimento (Sampson, 1997). Los resultados negativos rara vez se asocian a provocación a alimento positiva: mientras que los resultados fuertemente positivos pueden evitar la necesidad de pruebas de provocación. Se necesitan nuevos estudios clínicos para definir los límites apropiados para anticuerpos IgE a diferentes alimentos. A menudo se considera la sensibilidad a alimentos en el diagnóstico diferencial de enfermedades cutáneas, enfermedad gastrointestinal o enfermedad respiratoria en bebés y niños jóvenes. Los anticuerpos IgE específicos a alimentos más comúnmente encontrados en bebés y niños pequeños son para proteínas alérgenas en la leche de vaca y al huevo. Las principales proteínas alérgenas en la leche de vaca son la w.-lactalbúmina, p-lactoglobulina, albúmina bovina, y caseína. La relación entre los anticuerpos IgE hacía estas proteínas y las manifestaciones de la alergia a leche de vaca está establecida, pero existen anticuerpos IgE medióles en muchos niños atópicos que toleran la leche de vaca. La prueba de anticuerpos IgE a leche de vaca no puede establecer un diagnóstico de intolerancia a la leche debido a mecanismos distintos de la hipersensibilidad (Liebman, 1981). Los resultados de pruebas para anticuerpos IgE son mucho más específicos y tienen valores predictivos positivos mayores en casos de sensibilidad anafiláctica o angioedema causados por alérgenos alimentarios, por ejemplo, alergia al pescado o a frutos secos. En un estudio publicado, los autores encontraron al menos un resultado de anticuerpo IgE positivo en el 100% de niños con sensibilidad anafiláctica alimentaria, 96% de niños con asma, y 92% de niños con angioedema. En estos casos, la prueba de anticuerpo IgE es más útil porque la historia clínica a menudo incrimina a alimentos particulares como alérgenos (Hoffman, 1974). La prueba de anticuerpo IgE se utiliza comúnmente para investigar la especificidad de la sensibilidad a alérgenos alimentarios en pacientes con dermatitis atópica. Como se citó anteriormente, las pruebas cutáneas pueden ser imposibles de realizar en pacientes con enfermedad cutánea difusa o dermografismo. La interpretación de los resultados de las pruebas en pacientes con dermatitis atópica es complicada por el hecho de que estos individuos a menudo tienen asma y rinitis concomitantes con elevaciones extremas de IgE en suero. En estos casos, no es infrecuente encontrar niveles bajos de anticuerpos IgE a una diversidad de alérgenos. Las especificidades clínicamente importantes se definen por resultados positivos varias clases superiores al
nivel inferior de resultados positivos. A menudo es posible definir la especificidad del alérgeno en estos pacientes mediante un proceso minucioso de eliminación alimenticia combinada con una prueba de anticuerpo IgE. La prueba de anticuerpo IgE es útil en el diagnóstico de sospecha de sensibilidad a veneno(s) de himenóptero. Los individuos sensibles a los venenos de abejas de miel, abejas, avispones o avispas típicamente manifiestan signos de anafilaxís después de un picadura: después puede producirse urticaria, angioedema, broncoespasmo o colapso cardiovascular. La mortalidad publicada por reacciones sistémicas inducidas por picadura es de 30 a 40 casos anuales, pero esta cantidad probablemente subestima la incidencia real. La evolución natural de sensibilidad al veneno no tratada no se conoce completamente. En muchos pacientes con sensibilidad anafiláctica documentada, es posible obtener una historia clínica de reacciones progresivamente más graves a sucesivos episodios de picadura. Por otro lado, la sensibilidad al veneno aparentemente mejora en algunos individuos. La decisión de tratar a un paciente con inmunoterapia al veneno se basa en la evaluación clínica del riesgo de anafilaxia en posibles picaduras futuras. El indicador más fiable de la sensibilidad al veneno es la respuesla a una provocación con una picadura controlada (Parker, 1982). Sin embargo, generalmente no se realiza esta prueba y raramente se requiere en pacientes previamente no tratados para establecer el diagnóstico de sensibilidad al veneno. Las pruebas cutáneas al veneno y pruebas de anticuerpo IgE son útiles para confirmar la impresión de que existe sensibilidad clínica y para definir su especificidad. En esta situación clínica, la mayoría de los esludios indican que la prueba cutánea es la modalidad diagnóstica más sensible (Sobotka. 1978). Las pruebas de anticuerpo IgE al veneno son útiles ante todo para confirmar los resultados de pruebas cutáneas y para definir la especificidad alérgena de la hipersensibilidad al veneno. Excepto cuando se provoca la picadura, no hay pruebas in vilro o in vivo que realmente anuncien la respuesta clínica a una picadura de insecto en un paciente tratado después de inmunoterapia al veneno. Aunque los niveles de anticuerpos IgG en suero aumentan marcadamente con la inmunoterapia al veneno, no se ha definido un nivel límite que pueda utilizarse para identificar a los pacientes que ya no son de riesgo. Las estimaciones semicuantitativas de anticuerpos IgE no son útiles clínicamente, y los niveles de anticuerpos IgE después de tratamiento muestran que no hay relaciones consistentes con el estatus clínico. Medidas de anticuerpos IgE han sido también aplicadas al diagnóstico de hipersensibilidad a fármacos. Aunque muchos fármacos y sus metabolitos son capaces de provocar la síntesis de anticuerpos, sólo hay datos clínicos y resultados de determinaciones de anticuerpo IgE disponibles para la penicilina y sus metabolitos. La penicilina y su isómero, el ácido penicilinico, se combinan con proteínas del suero mediante uniones amidas. El conjugado peniciloil-proteína es el mayor determinante antigéníco, y el conjugado ácido penicilinico-proteina es el menor determinante antigéníco (Fig. 46-6). Los niveles medióles de anticuerpos IgM e IgG específicos para el determinante peniciloil se obtienen comúnmente en pacientes tratados con penicilina, y aunque persisten títulos elevados de estos anticuerpos en plasma durante periodos relativamente cortos, a menudo pueden detectarse títulos inferiores después del tratamiento (Sheperd, 1991). Los intentos realizados en el diagnóstico de hipersensibilidad a la penicilina han contado con pruebas cutáneas con penicilina, peniciloil-polilisina y una mezcla menor de antígenos. Los resultados positivos de pruebas cutáneas ocurren infrecuentemente, especialmente cuando la prueba se realiza mucho después del tratamiento con penicilina. Menos del 30% de los pacientes con posibles antecedentes de hipersensibilidad inmediata a la penicilina tienen pruebas cutáneas positivas, y las reacciones de hipersensibilidad inmediata a la terapia con penicilina son raras en pacientes con pruebas cutáneas negativas. Cuando se utilizan los resultados de las pruebas cutáneas como una referencia diagnóstica, los estudios clínicos han encontrado anticuerpos IgE medióles al determinante peniciloil casi en el 100% de los pacientes con pruebas cutáneas positivas. Los anticuerpos antipeniciloil son indetectables en sujetos control. Según estos datos, es razonable recomendar las pruebas in vitro para anticuerpos IgE-peniciloil sólo en pacientes con antecedentes de reacciones de hipersensibilidad reciente. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir inmediatamente después de reacciones mediadas por IgE y, aunque la mayoría de los datos
CAPITULO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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Figura 46-6. Metabolitos de penicilina, determinantes antigénicos mayor y menor. (De Rose NR, De Macano EC, Fahey JL. et al [eds¡: ManualotClinical Laboratoy Inmunoiogy. 4' ed. Washington DC. American Society tor Microbiology, 1992, pág. 719. con autorización.)
publicados indican que los resultados falsos negativos son raros, la ausencia de anticuerpos específicos de peniciloil-polilisina no excluye completamente la posibilidad de significado clínico de los anticuerpos IgE a otros metabolitos de penicilina (Weiss, 1988). Las enfermedades alérgicas, particularmente el asma, también pueden deberse a una gran variedad de alérgenos encontrados en el lugar de trabajo. El asma puede resultar tanto de mecanismos alérgicos como no alérgicos. La lista de agentes etiologicos relacionados con el asma alérgico ocupacional es larga e incluye los siguientes: proteínas animales, enzimas, proteínas de plantas, legumbres, anhídridos, sales metálicas, tintes, diisocianuros y polvo de la madera. Existen pruebas de anticuerpos IgE disponibles para varios de estos alérgenos. Recientemente, se ha puesto una especial atención en las gomas de látex como un alérgeno en el cuidado de la salud laboral y en ciertos pacientes, por ejemplo, pacientes con espina bifida que han sufrido diversos procedimientos quirúrgicos. La prueba de anticuerpo IgE a la goma de látex es útil para identificar individuos sensibles (Yunginger, 1994). Para finalizar esta sección respecto a la prueba de anticuerpo IgE. es apropiado resumir algunos de los puntos principales marcados anteriormente. La determinación de anticuerpos IgE es útil y puede recomendarse en las siguientes situaciones clínicas: 1) la evaluación de niños con un antecedente lamiliar de enfermedad alérgica importante y signos clínicos de enfermedad precoces: 2) la evaluación de niños y adultos sospechosos de tener enlermedad respiratoria alérgica para establecer el diagnóstico y definir la especificidad de la sensibilidad alérgena a pólenes, polvo, antígenos fungióos y alimentos: 3) para confirmar la expresión clínica de sensibilidad a alimentos específicos en pacientes con sensibilidad anafiláctica o con asma y angioedema: 4) para evaluar la sensibilidad a alérgenos de veneno de insectos, particularmente como una ayuda en la definición de la especificidad de veneno en aquellos casos donde las pruebas cutáneas sean confusas; 5) para confirmar el diagnóstico de hipersensibilidad a la penicilina en pacientes con sensibilidad anafiláctica; y 6) para confirmar la presencia de anticuerpos IgE a ciertos alérgenos ocupacionales, por ejemplo, goma de látex. La prueba de anticuerpos IgE no es útil como una prueba de detección sistemática para enfermedad alérgica, excepto si se realiza por un método analítico multialérgeno; y los resultados no son útiles para evaluar los efectos de
la mmunoterapia o excluir el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica a venenos de insectos en pacientes tratados. Las pruebas para anticuerpos IgE están indicadas sólo en pacientes a los que se les ha realizado una historia médica y exploración (¡sica completa.
Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediatas y para anticuerpos IgG alérgeno-específicos Previamente, se han mencionado varios mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediata, incluyendo la histamina y los mediadores lípidos llamados leucotrienos y factores activadores de plaquetas. Cada uno de estos mediadores causan inflamación en enfermedades alérgicas humanas o en modelos animales de alergia y analilaxia. Estos mediadores inducen muchos de los efectos biológicos característicos de las reacciones alérgicas A pesar de estos descubrimientos, las determinaciones de los mediadores en líquidos corporales tienen una utilidad limitada clínicamente en el diagnóstico diferencial de enfermedades alérgicas. Las determinaciones de histamina en plasma u orina pueden ser válidas en pacientes con analilaxia cuando las pruebas se realizan inmediatamente después del episodio anafiláctico (Friedman, 1989), pero se requiere tener cuidado para obtener una muestra apropiada. La hemolisis puede provocar niveles de histamina falsamente elevados en la sangre y los alimentos ricos en histamina o colonización bacteriana pueden conducir a niveles falsamente elevados en orina. Una prueba muy útil en este entorno clínico es la determinación de triptasa en sangre (Schwartz, 1987,1989). La triptasa es una proteasa de suero de 134 kDa formada por cuatro subunidades unidas no covalenlemente y se encuentra en mastocitos y granulocitos basófilos. La liberación de triptasa desde las células sensibilizadas provoca una relación cruzada de anticuerpos IgE citofilicos. Tras la anafilaxia, los niveles de triptasa en sangre aumentan rápidamente (30 minutos a 1 hora) y permanecen elevados durante 12 horas. Por comparación, la histamina se aclara rápidamente de la sangre con una vida media de minutos. Los leucotrienos y factores activadores de plaquetas se activan localmenle y se encuentran en concentraciones mínimas en los líquidos corporales (Lewis, 1984).
1026
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Otra clase de mediadores de la inflamación de interés en la alergia son los péptidos anafilatóxicos del complemento. C3a. C4a y C5a. producidos durante activación de la cascada del complemento (véase Cap. 38). El papel de estos péptidos como mediadores de la inflamación en la enfermedad alérgica no está bien establecido. Las anafilatoxinas humanas probablemente no se producen por interacción del alérgeno y anticuerpos IgE. Sin embargo, como el C5a provoca la contracción del músculo liso y aumenta la permeabilidad vascular, hay razones para una nueva investigación de las anafilatoxinas complementarias como mediadores inflamatorios en síndromes de anafilaxia. Los anticuerpos del isotipo IgE sensibilizan basófilos humanos y mastocitos durante largos periodos de tiempo, al menos 24 horas, y estos anticuerpos median directamente la liberación de histamina inducida por antígeno. como se comentó anteriormente. En diversas especies de animales, los anticuerpos IgG de una o más subclases también se ligan a células efectoras y originan la liberación de histamina. No está bien establecido el papel análogo de los anticuerpos IgG humanos. Algunos datos experimentales sugieren que los anticuerpos IgG humanos de la subclase lgG4 se ligan a leucocitos basófilos y pueden mediar en la liberación de histamina, y a menudo la concentración de la proteina lgG4 en suero se encuentra por encima de lo normal en adultos con asma (Homburger. 1986b). Sin embargo, los estudios clínicos no han podido demostrar un papel de la determinación de la proteina lgG4 o anticuerpos lgG4 en el diagnóstico o evaluación pronostica en pacientes con asma.
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CAPÍTULO 46
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ENFERMEDADES ALÉRGICAS
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C A P Í T U L O
47
ai Diagnóstico y tratamiento del cáncer mediante marcadores tumorales serológicos James T. Wu, Ph.D.
NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO
1028
TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES
1030
EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS
Respecto a la proliferación celular
Formato sandwich
Respecto a la diferenciación celular
Anticuerpo monoclonal frente al policlonal
Respecto a las metástasis
Anticuerpo heterófilo
Respecto a otros procesos asociados al tumor
MARCADORES TUMORALES PARTICULARES
Respecto a la transformación maligna
a- fetoproteína
Mutaciones heredadas
Moléculas de adhesión
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales específicos APLICACIONES CLÍNICAS
1031
1037
Factores angiogénicos P -microglobulina ?
Examen colectivo
CA19-9. CA50yCA19-5
Diagnóstico
CA125
Monitorización del tratamiento
CA15-3
Detección de recidiva
CA 72-4
Pronóstico
Calcitonina
RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN DE MARCADORES TUMORALES
1036
Unión competitiva
Antigeno carcinoembrionario 1033
Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)
Nunca se base en los resultados de una sola prueba
Cromogranina A
Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de análisis
CYFRA21-1
Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva esté elevado en el paciente antes de la cirugía Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba
Ciclinas Receptores de estrògeno y receptores de progesterona Gonadotropina coriónica humana LASA-P Enolasa neuronal específica p53
Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador tumoral desde la circulación sanguínea
Proteína pS2
Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico
Antígeno prostético específico
Pida marcadores no específicos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Controle la posibilidad de efectos falseados Controle la presencia de marcadores tumorales ectópicos Existe un gran número de marcadores tumorales en la circulación sanguínea. Como el nivel sanguíneo de marcadores tumorales por lo general refleja el volumen de células tumorales y la actividad tumoral. la determinación de los marcadores tumorales en suero se ha convertido en un medio atractivo para la detección y el diagnóstico de enfermedades neoplásicas. incluso para el control de su evolución, especialmente durante el tratamiento La facilidad en la extracción de sangre y la sensibilidad de estos análisis de marcadores tumorales no invasivos también hace que las pruebas serológicas sean muy superiores respecto a otras exploraciones clínicas basadas en métodos físicos.
Hormona paratiroidea relacionada con péptidos PSA libre Carcinoma de células escamosas Antígeno polipéptido tisular BIBLIOGRAFÍA
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NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO Para aprender cómo identificar, seleccionar y utilizar marcadores tumorales para el diagnóstico de cáncer y para el tratamiento de pacientes con cáncer, es imprescindible que uno esté familiarizado con los fundamentos de los procesos neoplásicos (véase Cap. 64). Es importante tener en mente que hay dos importantes procesos involucrados en el crecimiento celular, diferenciación y proliferación. En células normales, ambos procesos se encuentran bien
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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS Tumor
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-l marcadores inmorales
Figura 47-1. Ilustración de cómo la pérdida de regulación en cé'ulas cancerígenas genera diferentes marcadores tumorales y cómo estos procesos tienen que ver con las dos importantes reacciones en el crecimiento celular.
regulados y bajo un estncto control. Cuando alguno de estos procesos pierde su regulación, aumenta el riesgo para las células normales de convertirse en células tumorales (Fig, 47-1). De hecho, cada vez que se produce un crecimiento tisular nuevo, es importante diferenciar entre dos posibles causas del nuevo crecimiento: hiperplasia o neoplasia. La mayor diferencia entre estos dos procesos similares también se relaciona con el control del crecimiento La hiperplasía tiene un propósito útil y está controlado por estímulos, mientras que la neoplasia no está regulada y no sirve a ningún propósito. Por tanto, se puede entender que la proliferación no regulada es una característica fundamental de todas las células neoplásicas, sin reparar en si el tumor es benigno o maligno. El resultado de la proliferación incontrolada nos llevará a la formación de una masa anormal de tejido, conocido como tumor. Seguidamente, el tumor continuará creciendo de forma irregular incluso después de retirar el
Figura 47-3. Ilustración de cómo los tumores están compuestos de células heterogéneas. Cada tipo de célula puede producir un marcador tumoral diferente. Los tumores de diferentes tejidos también son diferentes en cuanto a su composición celular pero pueden compartir células similares. Las bañas de la derecha enseñan la importancia del tratamiento de los múltiples marcadores tumorales para conseguir una sensibilidad del 100%. También indica que un patrón especifico de múltiples marcadores puede estar asociado con un tipo especial de tumor.
estimulo que provoca el cambio. Los tumores benignos se quedarán en esta primera fase y presentarán menos riesgo para el huésped. Los tumores benignos también tienen más posibilidades de curarse mediante una extirpación completa. No obstante, la inestabilidad genética asociada a las células tumorales las hace más susceptibles a mutaciones adicionales, que pueden llevar eventualmente a una enfermedad maligna (Fig. 47-2). Los tumores malignos habitualmente se asocian a diagnósticos erróneos y poca supervivencia debido a su capacidad y tendencia para extenderse y metastatizar por vía linfática y sanguínea. En general, todos los tumores benignos se encuentran bien diferenciados. Las neoplasias malignas, por otro lado, varían desde bien diferenciadas hasta indiferenciadas. Aparentemente, el control de la proliferación y diferenciación se pierde en los tumores malignos. Algunos de los tumores malignos parecen tener la escasa diferenciación fetal y producir sustancias similares a aquellas encontradas en tejidos fetales, las comúnmente conocidas como proteínas carcinoembriogénicas (Figs. 47-1 y 47-2). Las células malignas también pueden producir enzimas proteolíticas que facilitan su escape de su entorno inicial.
Figura 47-2. Ilustración de cómo células normales, después de múltiples mutaciones, se convierten en células malignas. Los marcadores tumorales tienen dilerente capacidad de pronóstico para las células tumorales y diferentes estados de desarrollo.
El cáncer en el ser humano habitualmente se desarrolla a partir de clones mulantes de células como resultado de transformaciones neoplásicas. La mayoría de los cánceres tienen origen monoclonal, pero se requieren múltiples mutaciones para producir células malignas. Las múltiples mutaciones que suceden en los tumores pueden provocar el desarrollo de la heterogeneidad celular del tumor. Es interesante observar que los tumores no eslan compuestos de células homogéneas; normalmente están constituidos por subpoblaciones celulares con fenotipos claramente diferentes (Schnipper, 1986). El proceso de evolución y progresión tumoral puede también generar diversidad biológica dentro y en los diferentes focos melastásicos. Una célula obtenida de un determinado tumor puede ser distinta por varios factores:
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
tasa de crecimiento, receptores superficiales celulares, inmunogenicidad. expresión de marcadores tumorales (Fig. 47-3). capacidad de invasión y metástasis, y respuesta a drogas citotóxicas (Fidler, 1982).
TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES A pesar de que el cáncer se origina por una transformación maligna de una célula normal, hay pocas diferencias en cuanto a la expresión fenotípica entre una célula cancerígena y una célula normal. Las mutaciones inducidas por el cáncer no parecen alterar ninguna de las expresiones genéticas o lenolípicas excepto en las regulaciones del crecimiento celular. En consecuencia, en los últimos años los esfuerzos para identificar un marcador tumoral especifico o un epítopo tumoral específico no han tenido éxito. Por otro lado, cualquier producto celular como enzimas, proteínas séricas, metabolitos, receptores, proteínas carcinoembríonarias, oncoproteínas y proteínas codificadas por genes supresores puede utilizarse como marcador tumoral siempre que tenga relación con algún proceso durante la formación o el crecimiento tumoral. así como en la transformación maligna, proliferación, diferenciación y metástasis. La evaluación clínica de algún marcador tumoral determinado dependerá de la intención de su utilidad clínica y de la especificidad y sensibilidad del marcador tumoral. El uso de marcadores tumorales como factores pronósticos o factores de riesgo también ha ganado más y más popularidad en estos últimos años. La determinación de los factores de riesgo es muy valiosa en la valoración de la agresividad de un tumor y útil en la selección de las estrategias de tratamiento (Fig. 47-4).
Respecto a la proliferación celular Muchas hormonas ¡gonadotropina coriónica humana (hCG)). proteínas séricas, enzimas (lactato deshidrogenasa [LD], fosfatasa alcalina [АР]) y sus metabolitos (ácido vanilmandélico [VMA], acido homovanílico [HVA], ácido 5hidroxiindolacético [5-HIAA]) pueden llegar a estar elevadas en los tumores debido a la alia velocidad de proliferación de las células tumorales. Sus concentraciones en suero aumentan incluso a concentraciones mayores cuando un tumor benigno se convierte en maligno y metastatiza. Como las enfermedades benignas y no malignas también pueden tener niveles de marcadores altos, no es conveniente el uso de estos marcadores para la detección sistemática ni para el diagnóstico de cáncer debido al gran número de falsos positivos. Estos marcadores se utilizan para monitorizar a los pacientes durante el tratamiento. Cáncer de inania
Respecto a la diferenciación celular Las proteínas carcinoembnonanas encontradas en ambos tejidos, letal y tumoral, pero no en el tejido adulto normal, normalmente carecen de alguna función fisiológica conocida y presentan niveles de concentraciones en sangre de milímetros por nanogramo (Figs. 47-1 y 47-2) Por tanto, las determinaciones de las proteínas carcinoembríonarias en sangre se deben realizar mediante inmunoanálisis. La especificidad y sensibilidad asociadas a estas proteínas, aunque no son del 100°», si son mucho mayores que otras enzimas y metabolitos utilizados como marcadores tumorales en el pasado. La concentración serológica de estas proteínas carcinoembríonarias no sólo se correlaciona bien con la actividad tumoral sino que también se utiliza para predecir el pronóstico. En general, las proteínas carcinoembríonarias no son convenientes en el examen colectivo: primero, los anticuerpos policlonales contra estas proteínas a menudo tienen reacciones cruzadas con otras proteínas normales, y segundo estas proteínas carcínoembrionarias no aparecen lo suficientemente pronto en la sangre de pacientes con cáncer. Sin embargo, se han utilizado como pruebas complementarias de diagnostico de cáncer y son extremadamente útiles para controlar el éxito del tratamiento y para detectar recidivas.
Respecto a las metástasis Las metástasis tumorales tienen varios pasos importantes (Liotta, 1987). Primero, las células tumorales tienen que penetrar en zonas cercanas, después invadirán el torrente sanguíneo o los vasos linfáticos. Entonces, las células tumorales viajan a zonas distantes, hasta que se alojan en lechos venosos o capilares de órganos distantes. En este nuevo entorno, estas células tumorales han de penetrar de nuevo por las paredes vasculares para crecer en este nuevo lugar. Todos los productos celulares liberados y sintetizados durante estos pasos son posibles factores de nesgo. Su aparición en el tejido tumoral o en la circulación sanguínea indica el riesgo o la aparición de metástasis o un pobre pronóstico. Las determinaciones de muchos de estos marcadores, sin embargo, están aún limitadas a tejidos tumorales o citosoles de tejidos tumorales.
Respecto a otros procesos asociados al tumor Aparentemente, las actividades enzimáticas de varias glucosiltransferasas órgano-específicas están alteradas en células tumorales. Algunas de las glucosiltransferasas elevadas se han utilizado como marcador tumoral. La secuencia del azúcar y la composición de parte del hidrato de carbono de muchas glucoproteínas séricas, incluidas sustancias del grupo sanguíneo y mucinas como CA 19-9. son marcadores tumorales resultantes de la alteración de la glucosiltransferasa. La AFP (alfa-fetoproteína) aislada en pacientes con hepaloma primario tiene una fucosa adicional comparada con la AFP de enfermedades benignas hepáticas, un ejemplo de la fucosiltransferasa alterada en células del hepatoma (Wu. 1990).
Respecto a la transformación maligna
Figura 47-4. Ilustración de cómo la afectación ganglionar determina el riesgo de las pacientes con cáncer de mama y del propio tratamiento. Actualmente se utiliza un panel con varios nuevos marcadores pronósticos determinados en el citoplasma del tumor junto con la determinación de ganglios para proporcionar una valoración más correcta de los riesgos para las pacientes con cáncer de mama.
Los oncogenes, que codifican proteínas que funcionan en todos los niveles de regulación del crecimiento, juegan un importante papel en la transformación celular (Druker. 1989). Estas oncoproteínas son similares a los productos normales de los protooncogenes excepto en que han perdido la tuerza reguladora de su actividad y no necesitan señales de activación externas para originar una proliferación celular. La determinación de la expresión tisular de estas oncoproteínas se ha utilizado para el pronóstico. Una de las oncoproteínas más extensamente estudiadas, llamada, proteina c-erbB-2 (p185), se ha detectado en el suero por inmunoanálisis. Una investigación posterior descubrió que el dominio extracelular del c-eroB-2 podría fraccionarse y liberarse a la circulación sanguínea. El dominio extracelular del p185 parece que se relaciona no sólo con la cantidad de p185 expresado en la membrana de la célula tumoral, sino también con el cambio de la concentración de muchos importantes marcadores tumorales séricos (Wu. 1995). Como la transformación maligna es un acontecimiento especifico en la carcinogénesis. cualquier producto celular asociado a este evento tiene la posibilidad de ser un marcador tumoral específico más. Es posible que otros receptores transmembrana reía-
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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS
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Tampoco se necesita la caracterización e identificación completa de la molécula que lleva el epitopo. Un hibridoma se puede preparar inyectando a un ratón una fracción enriquecida de la membrana de la célula tumoral o incluso toda la célula tumoral. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de interés se seleccionan para el procedimiento posterior de detección sistemática. Una vez concretado el hibridoma, se obtendrá un número ilimitado y consistente de anticuerpos monoclonales para diferentes utilidades. La especificidad tanto de los anticuerpos como del inmunoanalisis esta bien definida y es reproducible. Muchos de los problemas relacionados con los análisis que utilizan anticuerpos policlonales. como la reducción de una gran parte de la variación del anticuerpo e inconsistencias del análisis, desaparecerán o se reducirán sobremanera.
Figura 47-5. Ilustración de cómo se detinen e identifican los epítopos situados en la superficie de una gran molécula del marcador lumoral mediante anticuerpos monoctonales. Las diferentes moléculas pueden compartir los mismos epítopos. pero la composición global o el modelo de múltiples epítopos en distintas moléculas particulares pueden diferir entre ellas.
cionados con la transformación celular puedan comportarse similarmente y ser útiles como marcadores tumorales o indicadores de pronóstico. Se necesitan amplios estudios detallados sobre el c-erbB-2 y otras proteínas codificadas por oncogenes para evaluar completamente el potencial de las oncoproteínas en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con cáncer.
También han fracasado las tentativas para identificar epítopos específicos tumorales usando anticuerpos monoclonales. Como sucede con los marcadores tumorales identificados por anticuerpos policlonales, sólo hay epítopos asociados al tumor (Fig. 47-5). No obstante, se ha demostrado que las pruebas para definir los marcadores tumorales para un tumor definido tienen una sensibilidad y especificidad más alta que otros que utilizan anticuerpos policlonales. Por ejemplo. CA 19-9. CA 125 y CA 15-3 son mucho más sensibles y especificas que el antígeno carcinoembrionario (CEA) en el carcinoma pancreático, ovarico y de mama, respectivamente. Estos marcadores (Tabla 471) están recomendados para reemplazar la prueba del CEA policlonal en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con los carcinomas previamente mencionados. Muchos epítopos asociados al tumor comparten con varios marcadores tumorales derivados de diferentes tumores. Por eiemplo. CA 19-9, CA 15-3. y CA 125 se expresan en casi todos los carcinomas de distintos grados. Además de la participación de unos epítopos determinados en más de un carcinoma, también es posible que una sola molécula exprese más de un epitopo (Yu, 1991); por ejemplo, como sucede cuando CA 15-3 y CA 125 son expresados por la misma molécula de mucina en el suero.
Mutaciones heredadas Aparte de los oncogenes, pero igualmente importantes, está un grupo de genes supresores que han sido descubiertos incluso más recientemente. Las proteínas codificadas por genes supresores son responsables de la supresión del crecimiento celular. Estos genes supresores pueden sufrir supresiones o mutaciones resultando en la producción de productos del gen inactivos, que fueron encontrados en familias con alto riesgo de cáncer. Se han identificado los distintos genes supresores y las proteínas que codifican. Por ejemplo, la p53 se ha investigado considerablemente por su papel en distintos cánceres. Los genes supresores y sus productos son potencialmente útiles como marcadores tumorales para el examen colectivo e identificación de familias o individuos de alto riesgo. El descubrimiento de dos genes susceptibles (o genes supresores tumorales) para el cáncer de mama, llamados BRCA1 y BRCA2. ha generado recientemente un tremendo interés (Miki, 1994; Wooster. 1994). Los estudios (Easton. 1993) sugieren que las mutaciones en el BRCA1 son responsables de aproximadamente la mitad de todos los casos de cáncer de mama hereditario. Además, los portadores de las mutaciones del BRCA 1 también provocan un incremento del riesgo de cáncer de ovario, colon y próstata (Futreal, 1994). El BRCA2, segundo gen susceptible para el cáncer de mama, se cree que se encuentra en casi el 70% de casos de cáncer de mama hereditario que no se debe a mutaciones del BRCA1 y está relacionado con un aumento de nesgo en el cáncer de mama en hombres. El desarrollo de inmunoanalisis para la determinación de las proteínas que codifican BRCA1 y BRCA2 está en proceso y debería servir para la identificación de individuos de alto riesgo y sus familias.
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales específicos El desarrollo de la tecnología del hibridoma ha tenido mucho impacto en la identificación de marcadores tumorales. Antes de conocer una molécula completa de una estructura proteínica conocida, actualmente es posible centrarse en una pequeña área de superficie, un epitopo o determinante antigénico mediante anticuerpos monoclonales (Fig. 47-5). Ya no se necesita purificar el antigeno para la preparación de anticuerpos policlonales en animales.
APLICACIONES CLÍNICAS Es esencial que se entienda el significado de las pruebas de sensibilidad y de especificidad de los marcadores tumorales antes de hablar sobre las aplicaciones de los marcadores tumorales (von Kleist, 1988; Sell, 1990). De hecho, la utilidad clínica de un marcador tumoral depende casi totalmente de la especificidad y la sensibilidad del marcador tumoral. Cuando el análisis de un marcador tumoral se dice que tiene una sensibilidad del 100%. significa que el análisis puede detectar a todos los pacientes con ese tipo concreto de cáncer, mientras que un análisis con una especificidad del 100% significa que el análisis identificará solamente a los pacientes con ese tipo especifico de tumor y no aquellos con enfermedad benigna o no maligna. En consecuencia, la sensibilidad es una medida de los verdaderos positivos y se calcula con la siguiente fórmula;
% Verdaderos positivos Sensibilidad = (% Verdaderos positivos + % Falsos negativos) Por otro lado, la especificidad es una medida de los falsos positivos y se calcula con la siguiente fórmula; % Verdaderos negativos Especificidad = (% Verdaderos negativos + % Falsos positivos)
Tabla 47-1
Determinación de m a r c a d o r e s tumorales mediante anticuerpos m o n o c l o n a l e s
M a r c a d o r tumoral
E n f e r m e d a d maligna importante
CA 125 CA 19-9
Carcinoma ovárico Carcinoma pancreatico
CA 15-3 CA 72-4
Carcinoma de mama Carcinoma gástrico
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Teniendo en cuenta esta información, se puede comenzar a hablar de las siguientes aplicaciones clínicas de los marcadores lumorales.
Examen colectivo El primer intento por parte de Gold (1965) en detectar el carcinoma colorrectal en hombres mediante radioinmunoanálisis (RÍA) de CEA en suero llevó al autor a la comprensión de que ninguno de los marcadores tumorales descubiertos tenía la especilicidad y la sensibilidad para el examen colectivo. En la actualidad no se recomienda el examen colectivo, especialmente en una población asintomática. Además de la carencia deseada de especificidad y sensibilidad de los marcadores tumorales, la baja prevalencia del cáncer y la baja sensibilidad y especificidad de los marcadores tumorales en general también se opone al examen colectivo de los cánceres. Se temia que la naturaleza no específica de la mayoria de los marcadores tumorales examinados pudiera crear demasiados falsos positivos y causar de forma innecesaria una alarma o preocupación en la población general. Por otro lado, hay excepciones donde el examen colectivo del cáncer está comprobado usando marcadores tumorales. El examen colectivo del hepatoma primario en China mediante el tratamiento de la AFP en suero es un buen ejemplo de estas excepciones debido a la alta incidencia de cáncer hepático en esta área del mundo (Wu, 1987). La posibilidad del examen colectivo de cáncer de ovario en mujeres con la determinación en suero del CA 125 sigue en proceso de investigación. El diagnóstico de cáncer oválico depende en principio de la cirugía. Sin embargo, en la mayoria de los casos, en el momento de la detección del tumor, éste se encontrará en estadio avanzado, donde la posibilidad de curación es baja. La recomendación de la identificación sistemática de cáncer de próstata mediante la determinación del antigeno especifico prostático (PSA) en suero junto con el tacto rectal digital (DRE) se debe a la especificidad del tejido para el PSA (Wu. 1994) y a la alta prevalencia del cáncer de próstata en hombres a partir de los 50 años de edad. Está especialmente recomendado en hombres afroamericanos, debido a que el porcentaje de incidencia para este grupo es casi el doble que para la población general, y el porcentaje de mortalidad es Ires veces superior. El examen colectivo permite el tratamiento confinado al órgano, potencialmente curable del cáncer de próstata descubierto en hombres con una esperanza de vida superior a 10 años. La combinación de la prueba del PSA y del DRE proporciona el mínimo coste considerado para la detección precoz del cáncer de próstata (Littrup, 1993).
Diagnóstico Los problemas tanto de la especificidad como de la sensibilidad asociados a la mayoría de los marcadores tumorales excluyen su determinación en el diagnóstico del cáncer. La frecuencia de detección de niveles elevados de marcadores tumorales en enfermedades no malignas y la coexistencia observada entre las concentraciones normales y las concentraciones de marcadores tumorales en pacientes con cáncer se oponen a su uso en el diagnóstico. La mayoría de los marcadores tumorales usados en la actualidad no pueden distinguir las enfermedades malignas de las benignas. Los marcadores tumorales, no obstante, siguen utilizándose con éxito como prueba complementaria para la detección del cáncer. Se han propuesto recientemente varios abordajes para mejorar la especificidad diagnóstica de muchos marcadores lumorales. El uso de múltiples marcadores es un abordaje que ha tenido gran aceptación. Los patrones específicos de múltiples marcadores tumorales parecen estar relacionados con determinadas enfermedades malignas. Los principales inconvenientes para el uso de múltiples marcadores tumorales son el coste y los rigores de la propia selección de los marcadores tumorales para incluirlos en el panel. Otro abordaje para mejorar tanto la especificidad como la sensibilidad de un marcador tumoral. como en el caso de la prueba de PSA en suero, implica la medida de la velocidad (porcentaje de aumento en la concentración de PSA en el tiempo) y la densidad (p. ej.. dividiendo la concentración de PSA en suero entre el volumen de la glándula prostética, determinado por ecogralía transrectal) (Benson, 1992). Un ligero aumento del nivel de PSA en suero asociado con una glándula prostética pequeña puede indicar cáncer, mientras que la misma valoración en un paciente con una glándula grande puede indicar sólo una hiperplasia prostética benigna (HPB).
Monitorización del tratamiento Una de las dos aplicaciones más útiles de los marcadores tumorales implica el control del curso de la enfermedad, especialmente durante el tratamiento. En la Figura 47-6 se muestra el cambio en los niveles en suero de diversos marcadores tumorales durante el curso de un cáncer ovárico en una paciente. El nivel en suero de los marcadores tumorales refleja bien el éxito de la cirugía o la eficacia de la quimioterapia. Cuando se detectan niveles elevados de un marcador tumoral después de la cirugía, esto puede indicar una extirpación incompleta del tumor recidiva, o la presencia de metástasis. La determinación de los marcadores tumorales en suero durante la quimioterapia también aporta una indicación de la elicacia del citostálico utilizado y una guía para la selección de los medicamentos más efectivos para cada caso en particular.
Detección de recidiva La segunda aplicación más útil de los marcadores tumorales es controlarlos para la detección de recidiva después de la extirpación quirúrgica del tumor. Se sabe que la aparición de la mayoria de los marcadores tumorales circulantes tiene un "tiempo de adelanto" de vanos meses (de tres a seis meses) antes de cualquier procedimiento físico utilizado en la detección del cáncer. La facilidad de su detección en sangre y la sensibilidad de los marcadores tumorales hacen que este proceso de control no invasivo sea aceptado de forma generalizada en la actualidad. La especificidad de los marcadores tumorales no presenta un problema para esta aplicación.
Pronóstico La estimación de la agresividad tumoral y el pronóstico para la evolución del paciente con cáncer han ganado creciente popularidad en estos últimos años. El conocimiento de la agresividad lumoral también ayuda al desarrollo de una terapia apropiada para el paciente. Por ejemplo, la detección de marcadores tumorales. altamente asociada con malignidad y metástasis, apuntará un tratamiento más riguroso y sistémico. La mayoría de los marcadores tumorales se elevan cada vez más cuando el tumor metastatiza. Desdichadamente, muy pocos marcadores tumorales tienen un límite bien definido entre estadios benignos y malignos. Los (actores de riesgo asociados al proceso de metástasis tumoral, como proteasas y moléculas de adhesión, son habitualmente mejores marcadores para predecir el pronóstico. Sin embargo, la mayoria de estos marcadores aún se determinan en tejidos tumorales y citoplasmas. El hallazgo del dominio extracelular de la proteína c-eroB-2 en el suero y la correlación entre el dominio extracelular del suero con los niveles de otros marcadores tumo-
Día Figura 47-6. Ilustración del cambio de los niveles en suero de CA 125 en el transcurso de la enfermedad en una paciente con cáncer ovárico. También se acentúa el hecho de que múltiples marcadores pueden aumentar o descender conjuntamente. Los niveles de los marcadores tumorales se normalizan dividiéndolos por sus cotas superiores normales.
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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
rales en suero es alentadora. Se espera que en un futuro cercano sea posible la determinación en la circulación sanguínea de estos factores de riesgo para el pronóstico.
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tardarán 30 días para disminuir a un rango no detectable después de un éxito quirúrgico.
Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN DE MARCADORES TUMORALES Cuando se solicitan marcadores tumorales como prueba diagnóstica complementaria y para el tratamiento de los pacientes con cáncer, se deben considerar las siguientes recomendaciones para evitar equivocaciones en los resultados de las pruebas.
Nunca se base en los resultados de una sola prueba Debido a que la mayoría de los marcadores tumorales no son específicos, es difícil diferenciar entre enfermedades malignas y otras enfermedades benignas o no malignas basándose en los resultados una sola prueba. La mayoría de las elevaciones encontradas en las enfermedades no malignas son frecuentemente transitorias, mientras que en el cáncer los niveles se mantienen elevados o aumentan continuamente. La petición de pruebas consecutivas puede ayudar a detectar falsos niveles de elevación debidos a elevaciones transitorias. El mejor ejemplo es la AFP en suero. La AFP elevada en suero puede detectarse en pacientes con hepatoma primario o con enfermedades hepáticas. Sin embargo, en una segunda prueba dos semanas más tarde la AFP en suero permanecerá elevada en pacientes con cáncer, mientras que en pacientes con enfermedades hepáticas la AFP en suero volverá a un nivel normal.
Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de análisis Cada equipo comercial distinto puede generar diferentes resultados aunque todos estén diseñados para el mismo marcador tumoral. Cuando se piden desde el mismo laboratorio también se garantiza una mayor seguridad en la ejecución. Es importante asegurarse de que algunos cambios observados durante el proceso controlado se deben al cambio del volumen tumoral o a otras actividades tumorales y no a la variabilidad de laboratorio (Fig. 47-6).
Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva esté elevado en el paciente antes de la cirugía Como ninguno de los marcadores tumorales tiene una sensibilidad del 100% en la detección de un determinado cáncer, para estar seguro es importante que el marcador tumoral concreto para detectar la recidiva esté elevado antes de la cirugía. De lo contrario, se deberían detectar múltiples marcadores antes de la cirugía para seleccionar el marcador tumoral más elevado que pueda controlar la actividad de la enfermedad.
Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba Estime el tiempo requerido para que el nivel determinado antes de la cirugía disminuya al nivel normal o. en el caso del PSA, a un nivel indetectable basándose en el conocimiento de la vida media de los marcadores tumorales. Es importante que la determinación de las concentraciones de marcadores tumorales para determinar el éxito de la extirpación quirúrgica de ese determinado tumor no se realice antes de las dos semanas del postoperatorio. Sería preferible esperar todo un mes debido al tiempo necesario para que los niveles de marcadores tumorales preexistentes en suero desciendan a niveles más bajos. Por ejemplo, la vida media del PSA en suero es de aproximadamente tres a cuatro días; por tanto, 50 ng/'ml de PSA en suero
tumoral desde la circulación sanguínea A menudo se detectan marcadores tumorales elevados en suero en pacientes con enfermedad renal o hepática, dependiendo de si el marcador tumoral se elimina por filtración glomerular o se metaboliza por el hígado. Por ejemplo, el CEA en suero a menudo se eleva en pacientes con enfermedades hepáticas porque el hígado dañado es incapaz de eliminarlo eficazmente de la circulación sanguínea, mientras que una |J-microglobulina (|i2M) elevada a menudo se detecta en pacientes con fracaso renal, donde hasta la pequeña molécula (Í2M tiene dificultad para atravesar la membrana glomerular de una manera normal. 2
Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico Como se ilustra en la Figura 47-3, los tumores están formados por células heterogéneas. Algunas pueden incluso ser células normales y otras pueden ser células tumorales heterogéneas como resultado de una secuencia diferente de múltiples mutaciones. Cada tipo de célula puede expresar un único marcador o un numero de marcadores tumorales característico. El mismo marcador puede también ser producido por diferentes tipos de células. Puede que algunas células nunca produzcan un solo marcador. Como se ilustra en la Figura 47-3, los distintos tumores que derivan del mismo tipo de tumor aparentemente pueden incluso ser heterogéneos en su composición celular. Igualmente, se necesita más de un marcador tumoral para proporcionar una sensibilidad en la detección del 100%. La heterogeneidad en la composición celular y el porcentaje de la distribución celular de cada tumor explican por qué se necesita un número de marcadores tumorales para alcanzar el 100% de sensibilidad de detección y por qué la sensibilidad de un marcador en particular también es diferente entre pacientes con cáncer. En la Tabla 47-2 se detallan múltiples marcadores tumorales relacionados con enfermedades malignas particulares: la aparición de marcadores tumorales característicos en varias neoplasias se detalla en la Tabla 47-3. Esto explica por qué ninguno de los marcadores tumorales utilizados actualmente tiene una especificidad y sensibilidad del 100%. y por qué el uso de múltiples marcadores mejorará la sensibilidad de detección. Sin embargo, un único patrón de múltiples marcadores puede identificarse en tumores derivados de los mismos tejidos. Por tanto, al pedir múltiples marcadores tumorales también se mejorará la especificidad. Por ejemplo, un patrón específico puede estar asociado a carcinomas de colon, de mama, de ovario y de páncreas cuando los cuatro marcadores tumorales determinados por anticuerpos monoclonales, como CEA. CA 19-9, CA 15-3 y CA 125, se miden simultáneamente. Esta información es clínicamente importante, ya que más del 60% de los cánceres que se tratan son carcinomas derivados del epitelio celular (Wu, 1989). Se desarrollaron múltiples marcadores para una estrategia de detección precoz mas especifica para el cáncer ovárico. Se vio que el uso de CA 15-3 y TAG72 junto con CA 125 puede aumentar la especificidad aparente de los análisis de CA 125 para distinguir enfermedades malignas de benignas (Bast, 1991). Se debería tener en cuenta que durante la selección de los múltiples marcadores tumorales, sólo se deberían de seleccionar los marcadores que son complementarios unos con otros. Aquellos numerosos marcadores tumorales que van paralelos a la actividad tumoral no deberían seleccionarse para este propósito.
Pida marcadores no específicos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Si el único objetivo es controlar la eficacia del tratamiento, debería considerarse el uso de marcadores tumorales no específicos (Tabla 47-4). Aunque estos marcadores no específicos carecen de especificidad para el diagnóstico y, en lo que respecta a algunos tipos específicos de tumores, sus concentraciones son sin duda muy sensibles a algunos cambios en la actividad tumo-
Tabla 47-2
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
SECCIÓN V
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Marcadores tumorales s e r o l ó g i c o s relacionados con enfermedades malignas particulares
Tumores pituitarios acromegálicos Tumores pituitarios suprarrenales Leucemia de lintocitos B crónica Linlocitos B malignos Cáncer de vejiga
Hormona del crecimiento Cortisol TdT B2M
Cáncer de hueso Tumor cerebral Cáncer de mama
Foslatasa alcalina Desmesterol CA 15-3
Carcinoma broncogénico Tumores carcinoides Cáncer cervical Conocarcinoma Cáncer colorrectal Leucemia mieloide crónica Síndrome de Cushing Tumores pancreáticos endocrinos Carcinoma gástrico
Prolactina
Gastrinoma Glucagonoma Leucemia de células peludas Tumores de cabeza y cuello Carcinoma hepatocelular Hipercalcemia maligna Enfermedad de Hodgkin Insulinoma Cáncer de duodeno Tumores renales Leucemia
Gastnna Glucagón Receptor IL-2 SCC AFP Péplido relacionado con PTH
Cáncer de pulmón Lmfoma Cáncer medular de tiroides Antigeno de melanoma Microadenomas (pituitaria) Mieloma múlliple Mesotelioma Microadenomas Neoplasias endocrinas múltiples Tumor testicular no seminomatoso Neuroblastoma Tumores no-islotes Cáncer microcítico Osteosarcomas Carcinoma ovárico Carcinoma pancreático
Tumores de islotes pancreáticos Cáncer tiroideo papilar y folicular Tumores paratiroideos Feocromocitoma Tumores pituitarios Tumores placentarios Leucemia de células plasmáticas Carcinoma prostálico Carcinoma de células renales Sarcoma Seminoma Tumores de bazo Cáncer de células escamosas Cérvix Pulmón Cabeza y cuello Cáncer de estómago Teratoblastoma Cáncer testicular no seminomatoso Cáncer uterino Vipoma (páncreas)
Otros marcadores
Marcador importante
Enfermedades malignas
SCC hCG CEA TdT ACTH Polipéptido pancreático CA 72-4
IGF-I Catecolaminas libres, DEA, 17-cetoesteroides, prolactina B2M en suero. LASA-P LD Antígeno-T, inhibidor de urocinasa, CEA, TPA. citoqueratinas, glucosammoglucosas Protema de Bence Jones, hidroxiprolma. calcio en suero Poliaminas CEA, calcitonina. CA 549, CA M26. CK-BB. termina, B-hCG. LASA-P, prolactina, proteína P 21, PS-2 Histamina, ADH, bradicmina Anticuerpos AG-4. CA 125, CEA, TPA CA 19-5, CA 19-9, CA 72-4, CK-BB, NSE Endorfina. lípotropina CA 19-9, CA 50, CEA, ferritina, CK-BB. hCG. LASA-P, pepsinógeno II, prolrombina
CEA, ferritina, rGT, ALP. TPA, y-glutamiltranspeptidasa LASA-P. ferritina
Insulina ADH CEA TdT
Péptido-C, proteina I aglutinante IGF-I
NSE ALP, ß2M, ferritina, LDH. protema mielina básica. NSE adenosine deaminasa, PNP ACTH, CK-BB, calcitonina. CA 72-4. CEA, AFP, lerritina. LASA-P. TPA B2M TdT. Ki-67, LASA-P Calcitonina NSE LASA-P relacionado con melanoma, i-dopa NSE, catecolaminas plasmáticas Prolactina Inmunoglobulina densa de cadena ligera y densa Proteína de Bence Jones. ß2M. IgA Ácido hialurónico Prolactina Cromogranma A AFP hCG VMA HVA. NSE. cistationina, ferritina, metanefrinas Insulina como factor de crecimiento ACTH, ADH, CEA, CK-BB, NSE, bombesina, calcitonina ALP UGF, inhibina. AFP, isoenzima amilasa, CEA. CK-BB. CA 125 hCG, galactosiltransferasas, LDH. TPA CA 19-5. CA 50. CA 72-4, CEA, CK-BB, ADH. ALP. CA 19-9 ferritina. isoenzima II galactosiltransferasa. Y-glutamiltranspeptidasa, PAP Insulina Tiroglobulina PTH íntegro Cromogranma A, catecolaminas plasmáticas Metanetnna FSH, LH, prolactina, TSH othCG libre hCG a-hCG libre TdT PSA PAR ALP, CEA, CK-BB, TPA Renina, eritropoyetina, interleucina-4, prostaglandina A. CA 15-3, hormona paratiroidea, NSE, prolactma B2M NSE Ferritina SCC SCC SCC CA 72-4 AFP hCG AFP SCC VIP
CYFRA 21-1 Ferritina CEA, NSE hCG. ferritina ß-hCG, LDH
La labia continúa en la siguiente página
CAPÍTULO 47
Tabla 47-2
DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
1035
M a r c a d o r e s tumorales serológicos relacionados c o n e n f e r m e d a d e s m a l i g n a s particulares (continuación)
E n f e r m e d a d e s malignas Enfermedad de Waldenstrom Síndrome de Zollinger-Ellison
M a r c a d o r importante
Otros marcadores
Inmunoglobulinas IgM Gastrina
2M
ACTH = hormona adenocorticolropa: ADH = hormona antidiurética; AFP • -letoproteina; ALP = tosfatasa alcalina; AMF = tactor de motilidad autocrino; 2M = beta microglobulina; HPB = hiperplasia prostática benigna; CEA = antlgeno carcinoembrionario; CK-BB = isoenzima BB creatina cinasa; DEA = dehidroepiandrosterona. FDP = productos de degradación de fibrina; FSH = hormona lollculo-estimulanle: Gl = gastrointestinal; GT = gamma-glutamil Iransferasa; hCG = gonadolropina orlonica humana. HVA = ácido homovanilico; IGF-I = factor de crecimiento insulinico I: IL-2 = interleucina; LASA-P = ácido siálico relacionado con lipidos: LD = laclato deshidrogenasa: LH = hormona lutemizante; NSE = enolasa especílica neuronal PAP = fosfatasa ácido prostático: SCC = antigeno de células escamosas óe carcinoma. TdT = deoxinucleotidol transferasa terminal; TPA = antlgeno de tejido polipéptido; TSH = lirotropina; VIP • pohpéptido intestinal vasoaclivo. VMA = ácido vanilmandélico.
Tabla 47-3
E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s relacionadas con m a r c a d o r e s t u m o r a l e s s e r o l ó g i c o s particulares E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s asociadas
Marcador tumoral"
Enfermedades menos importantes
Enfermedades importantes
AFP -hCG. cadena libre 2M
Carcinoma hepatocelular primario Tumores pituitarios Neoplasias de linfocilos B
CA 15-3 CA 19-9 CA 72-4 CA 125 -hCG Proteína de Bence Jones Bombesina CA 549 CA M26 Calcitonina CEA c-erbB-2 oncoproteína Cromogranina A
Cáncer de mama Carcinoma pancreático y gástrico Carcinoma gástrico Carcinoma ovárico Coriocarcmoma Mieloma multiple Cáncer microcítico Cáncer de mama Cáncer de mama Carcinoma medular Carcinoma colorrectal Cáncer de mama Feocromocitoma. neuroblastoma
CYFRA 21-1 Desrnesterol DEA ADN Ferritina
Carcinoma de células escamosas del pulmón Tumores cerebrales Cáncer adrenal/pituitaria Carcinoma cervical Leucemia mieloide aguda
Galactosillranslerasa Isoenzima II galactosillranslerasa Gastrina Histaminasa hCG
Cáncer de ovario Cáncer pancreático Gastrinoma Cáncer medular/tiroideo Coriocarcinoma
Linfoma de Hodgkin, neuroblastoma y vanos carcinomas, leraloblastoma
Ácido hialurónico IgA IGF-I Receptor IL-2 Inmunoglobulinas
Mesotelioma Mieloma múltiple Cáncer hipofisario Leucemia Mieloma múltiple
Carcinoma gástrico, ovárico y de mama, tumores trofoblásticos o de células germinales, cáncer testicular
Inhibiría Insulina como factor de crecimiento Catacalcina 17-cetoesteroides LASA-P Antígeno relacionado con melanoma Metanefrinas Enolasa neuronal especifica Polipéptido pancreático Proteina P 21 Catecolaminas plasmáticas PNP POA PSA PAP Proteína PS-2 SCC
Tumores de célula granulosa Tumores de células no-islotes Cáncer medular de tiroides Cáncer adrenal/pituitaria
Linfoma mediterráneo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma maligno
TdT Tiroglobulma TPA TAG 72 Inhibidor de urocinasa VIP
Leucemia Cáncer tiroideo No especifico Carcinoma gástrico Tumores de vejiga Vi poma
'Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.
Melanoma Feocromocitoma Carcinoma microcítico de pulmón Tumor endocrino Cáncer de mama Feocromocitoma Leucemia Cáncer pancreático Cáncer de próstata Cáncer de próstata Cáncer de mama
Teratoblastomas de ovarios y testículos Mieloma múltiple, linfoma de linlocitos B. leucemia linlocítica de linfocilos B crónica y células reticulares, sarcoma enfermedad de Waldenstrom Carcinomas varios Carcinomas vanos Carcinomas varios Carcinomas varios Cánceres testiculares (no seminomatosos). tumores trolobláslicos
Cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer renal Carcinomas varios Carcinomas varios Neoplasias endocrinas múltiples, cáncer microcítico de pulmón, tumores carcinoides
Síndrome de Zollmger-Ellison
Insulinoma
Carcinomas varios, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin Neuroblastoma, ganglioneuromas Neuroblastoma, tumores renales
Hipertrolia prostática benigna (HPB) Algunas leucemias Carcinoma de células escamosas del útero, cérvix, SCC de pulmón y de cabeza y cuello
Carcinomas varios Cáncer colorrectal, de pulmón, pancreático y de ovario
SECCIÓN V
1036 /*
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' "' " " """""
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•
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•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
.
Tabla 47-4 M a r c a d o r e s t u m o r a l e s n o específicos* Antlgeno Tennessee CEA (policlonal) Antigeno del tepdo polipéplido
B2M
Ácido siálico relacionado con llpidos •Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.
El Colegio Americano de Médicos también ha publicado las directrices clínicas en lo que se refiere a la detección precoz del cáncer de próstata. Subrayan la importancia de la identificación sistemática del PSA y de la realización del DRE en la detección precoz del cáncer de próstata. Aunque el DRE no es tan sensible como el de la identificación sistemática del PSA, detecla el cáncer que de otro modo podría no detectarse con el PSA (Coley, 1997a b).
EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS ral. Muchos de ellos son económicos y fáciles de determinar y son. por tanto, útiles para controlar la terapia y para detectar una recidiva en pacientes con diagnóstico conocido. Por eiemplo. el ácido siálico P asociado a lípidos (LASA-P) puede cuantificarse con un procedimiento de calorimetría simple, rápido y económico y su concentración en suero está estrechamente relacionada con las concentraciones en suero de muchos marcadores tumorales de alta especificidad.
Controle la posibilidad de efectos falseados Uno de los inconvenientes del popular inmunoanálisis de tipo sandwich es la capacidad para provocar efectos engañosos (Wu. 1991). El efecto trampa que tiene lugar en un inmunoanálisis tiende a dar un valor falsamente bajo cuando la concentración del marcador tumoral en la muestra sube por encima de una muy elevada concentración. El nivel exacto de marcador tumoral donde puede producirse un efecto trampa depende del diseño de la prueba y de la concentración de anticuerpos utilizada en el análisis. El uso de la misma muestra para dos diluciones distintas (sin diluir y dilución de 1:10) revelará el efecto trampa. La muestra diluida 1:10 normalmente producirá un valor 10 veces menor que otra muestra no diluida. Si hay un efecto trampa, la muestra diluida 10 veces producirá un valor más alto que la muestra original (después corregir con el factor de dilución). El análisis del marcador tumoral deberá repetirse con una muestra diluida 10 veces cuando el resultado de un inmunoanálisis de tipo sandwich sea demasiado bajo para equiparar la gravedad clínica del paciente.
Controle la presencia de marcadores tumorales ectópicos La expresión de marcadores tumorales tiene una regulación genética. Para tumores benignos, los marcadores producidos por el tumor normalmente son específicos para células y están relacionados con los productos celulares normales en una elevada concentración (Figs. 47-1 y 47-2). Cuando el tumor benigno se convierte en agresivo y más maligno, las células comienzan a perder el control y se convierten en autónomas. Las proteínas que normalmente se encuentran en un estado fetal precoz, y no se expresan en el tejido adulto normal, empiezan a aparecer en el tumor como resultado de la pérdida de la regulación de la expresión genética. Esta es la razón por la que las proteínas carcinoembrionarias y los marcadores tumorales ectópicos normalmente se expresan en enfermedades malignas avanzadas. En otras palabras, la aparición de marcadores tumorales ectópicos se asocia a un mal pronóstico o metástasis. Por ejemplo, las concentraciones elevadas de AFP en suero pueden detectarse en pacientes con cánceres del tracto gastrointestinal con metástasis, aunque las pruebas de luncion hepática sean normales. En la Tabla 47-5 se muestran algunos de los marcadores ectópicos conocidos y las enfermedades malignas asociadas. Hay que tener en cuenta las recientes directrices sobre el uso de marcadores lumorales gastrointestinales y de mama publicados por la Sociedad Americana de Oncología Clínica (Smith, 1999). Ellos recomiendan que se deberia realizar una autoexploración mamaria mensual, mamografia anual de la mama conservada y de la contralateral, y una historia clínica detallada y exploración física cada 3 ó 6 meses durante dos años, y después anualmente. No recomiendan el uso de marcadores tumorales. como son CEA, CA 15-3 y CA 27.29. para el examen colectivo. Ni tampoco recomiendan de forma habitual la gammagrafia ósea, la radiografía de tórax, el recuento hematológico sanguíneo, la ecografia hepática o las imágenes de tomografía computarizada.
El impacto del diseño de una prueba, incluida la selección de anticuerpos, no sólo afecta a la sensibilidad y especificidad de la prueba y al porcentaje de concentración, sino que también afecta al nivel de marcador tumoral donde aparece el electo trampa y si un resultado falso negativo o falso positivo provocará interferencias.
Unión competitiva El primer RÍA desarrollado se basó en el formato de unión competitiva. La combinación de una prueba de unión competitiva con un antigeno marcado radiactivamente aportaba la sensibilidad necesaria para cuantificar muchos marcadores tumorales circulantes, especialmente las proteínas carcmoembrionarias, en los rangos de concentración de nano y picogramo por mililitro. La base de este formato de prueba incluye la competición entre una cantidad fija de antigeno marcado radiactivamente y del antigeno en la muestra con una cantidad limitada de anticuerpo. Después de la separación del compuesto antígeno-anticuerpo del antigeno libre, la medida de la radiactividad del compuesto permitirá la estimación de la cantidad de antigeno presente en la muestra. En la Figura 47-7 se presentan dos formatos de prueba diferentes, uno para RÍA y uno para el enzimommunoanálisis absorbente (ELISA). No obstante, algunas sustancias que interfieren en la unión entre antigeno y anticuerpo provocarán un resultado falsamente elevado. Lo que no se tuvo en cuenta es el hecho de que la misma sustancia que interfiere y que está presente en un análisis empleando el mismo antigeno y anticuerpo en formato sandwich producirá un resultado falsamente negativo (Wu. 1983). En la década de los 80 se mostró que los dos sistemas importantes comercializados de CEA, uno de Abbott empleando un formato sandwich y uno de Roche usando el formato de unión competitiva, no producían el mismo resultado de CEA de las mismas muestras cuando las muestras contenían sustancias que interferían, como las giucosaminoglucanos.
Formato sandwich El ELISA, usando el formato sandwich, se ha convertido en el método más popular para la cuantificación de marcadores tumorales. En este caso, un anticuerpo específico es adsorbido a la tase sólida. Después se añade una solución del antigeno y se deja que se una. Después del tiempo suficiente de incubación y lavado, se añade un anticuerpo marcado con enzimas en la lase sólida y se deja incubar. El anticuerpo marcado que no esta unido se retira y el resto de la fase sólida contiene el antigeno "en sandwich" entre el anticuerpo adsorbido a la fase sólida y el anticuerpo marcado. Luego se
Tabla 47-5
M a r c a d o r e s tumorales ectópicos*
AFP Calcitonina
C'omo(jr;irun;i A
rx-hCG libre hCG
Tiroglobulina
Carcinoma Gl. renal, de pecho, de vejiga y de ovario Carcinoma de pulmón, de células no-islolos. carcinoide. de mama, medular y de ovario. feocromocitoma Para tumores endocrinos (carcinoma medular de tiroides, adenoma de adenohipófisis. carcinoma de células de islotes pancreáticos) Carcinoma colorrectal y tumores pancreáticos endocrinos Carcinoma gástrico y pancreático, hepatoma, adenocarcinoma ovárico tumores de células germinales de los testículos Carcinoma tiroideo diferenciado
"Véase Tabla 47-2 para abreviaturas
CAPÍTUIO 47
•
DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
Aglutinación competitiva
Formato sandwich
1037
rando por tanto una respuesta analítica falsa. Se conoce que entre el 15% y el 40% de los individuos puede tener uno o mas anticuerpos heterófilos. El método estándar para reducir la interferencia de anticuerpos heterófilos es incluir en el análisis mucho suero de ratón o inmunoglobulmas de ratón no especificas en el inmunoanálisis.
MARCADORES TUMORALES PARTICULARES cx-fetoproteína Figura 47-7. Ilustración de las diferencias importantes entre los dos formatos de prueba importantes de mmunoanáiisis. La interferencia en la aglutinación competitiva produce un valor falsamente elevado; en un formato sandwich produce un resultado falsamente bajo.
añade el sustrato enzimático y el desarrollo colorimétrico resultante es proporcional a la cantidad de antigeno en la solución de la prueba. Aunque se disponen de otros marcadores distintos de enzimas, la enzima sigue siendo el marcador más popular. La sensibilidad de ELISA puede acercarse a la del RÍA, especialmente cuando se usa un sistema de amplificación biotina-avidinalEngvall, 1971). Recientemente, el formato de prueba de la unión competitiva ha desplazado al procedimiento de sandwich. A pesar de las muchas ventajas asociadas al nuevo formato, puede persistir el problema de los efectos trampa al obtenerse un valor falsamente bajo de una muestra que contiene una concentración altamente elevada de marcadores lumorales. Por ejemplo, se produjeron valores falsamente bajos de CA 19-9 en el equipo Centocor, empleando un formato sandwich, con muestras que contenían niveles altamente elevados de CA 19-9. Sin embargo, cuando se utilizó el equipo de RÍA Biomira, basado en un principio de aglutinación competitiva, se pudieron evitar completamente los valores falsamente bajos de CA 19-9. La utilización del equipo de RÍA Biomira también reduce el número de repeticiones debido a que el nivel de CA 19-9 en la muestra puede aproximarse por la canlidad de radiactividad (Wu. 1991).
Anticuerpo monoclonal frente al polielonal
La AFP es una proteína fetal importante del suero y también una de las más importantes proteínas carcinoembrionarias (Wu, 1987). La AFP se parece a la albúmina en muchas propiedades fisicoquímicas. En el feto, la AFP es sintetizada por el saco vitelino y por los hepatocitos fetales y en menor grado por el tracto gastrointestinal fetal y el riñon. La AFP elevada puede encontrarse en pacientes con hepatoma primario y en tumores de células germinales derivadas del saco vitelino. La AFP es el marcador serológico más útil para el diagnóstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, la AFP también se eleva de forma transitoria durante el embarazo y en muchas enfermedades hepáticas benignas. Debido a la alta prevalencia de cáncer de hígado en China y en otras ciudades en el sudeste de Asia, las pruebas de la AFP se han usado con éxito en el examen colectivo de hepatoma en esa zona del mundo. Las pruebas tanto de AFP como de hCG son útiles para reducir los errores en el estadiaje clínico en pacientes con algunos tumores testiculares y ayudan en el diagnóstico diferencial de varios tumores de células germinales. Como se observó un aumento de la fucosilación de la AFP (de ahí la reactividad de lecitina de lenteja de AFP serológica) en el carcinoma hepatocelular primario, la determinación de la reactividad en suero de lentil lecitina con AFP ha sido útil no sólo para diferenciar entre hepatoma pnmario y enfermedades benignas de hígado, sino también para proporcionar una señal precoz que indique cuándo se puede empezar a desarrollar un hepatoma en pacientes con enfermedades hepáticas.
Moléculas de adhesión Las moléculas de adhesión celulares (CAM) pueden dividirse en cuatro grupos importantes: caderinas. selectinas, una superfamilia de inmunogtobulinas e integrinas (Wu. 1997). Estas moléculas de adhesión, especialmente la E-selectina, pueden contnbuir al crecimiento tumoral y a las metástasis. Las moléculas de adhesión intercelulares solubles pueden encontrarse en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Hebbar. 1998).
El desarrollo por Kohler y Milstein (Milstein. 1983) de anticuerpos monoclonales murinos (MAb) con técnicas de hibridación de células somáticas permite un análisis inmunoquímico mucho más detallado y molecular de antigenos asociados al tumor que antaño era imposible. Al combinar los anticuerpos monoclonales con la fase sólida de la prueba en sandwich, se han desarrollado muchos análisis nuevos que han eliminado numerosos problemas relacionados con los análisis pohclonales, que conllevan una escasa reproducibilidad, muchas variaciones, pobre especificidad y reactividad cruzada no especifica (Diamond. 1981). También reduce las diferencias entre los diferentes equipos y amplía el rango de concentración lineal del análisis. Siempre que se disponga de un anticuerpo monoclonal, se recomienda su uso. Para conseguir una mayor sensibilidad de la prueba, parece que el uso de una combinación de múltiples MAb mejora la afinidad entre los múltiples MAb absorbidos en fase sólida y el antígeno soluble.
La angiogénesis es la formación de vasos sanguíneos in situ; incluye la migración ordenada, la proliferación y la diferenciación de células vasculares. La neoformación de vasos sanguíneos también es importante en la patogenia del crecimiento rápido y metástasis de tumores sólidos. Se han identificado muchos factores angiogénicos incluyendo factores de crecimiento fibroblástico ácido y base, angiogenina y factores de crecimiento -o. y -|i transformados (Folkman, 1992; Wu, 1997). Ambos factores angiogénicos y antiangiogénicos se han encontrado en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Morelli. 1998).
Anticuerpo heterófilo
|i -microglobulina
El uso de MAb en inmunoanálisis y la creciente aplicación clínica de MAb de ratones para dianas imaginarias y de la mmunoterapia establecen un nuevo problema. Los individuos tratados producen aparentemente anticuerpos heterófilos contra anticuerpos murinos y esto interfiere con muchos de los inmunoanálisis de marcadores tumorales (Nahm, 1990). La interferencia de los anticuerpos heterófilos en suero humano puede aumentar o disminuir los resultados de un inmunoanálisis. Estos anticuerpos reaccionan de un modo similar frente a antígenos en términos de aglutinación a anticuerpos asociados a fase sólida y marcados con una señal. Estos anticuerpos heterófilos se pueden aglutinar en otro lugar distinto que el sitio analizado para la aglutinación, cruzando la señal del anticuerpo mediante el anticuerpo captura y gene-
La [52M es la cadena ligera constante del antigeno del locus antigénico de histocompatibilidad humano (HLA) expresado en la membrana de la mayoría de las células nucleadas. La |J2M sólo tiene un peso molecular de 11,8 kDa. Cuando las células nucleadas son metabolizadas. la cadena ligera (o |)2M) se vierte al líquido extracelular. La |52M es un marcador tumoral no especifico debido a que está elevado no sólo en los tumores sólidos sino también en las enfermedades linfoproliferativas (incluyendo leucemia de linfocitos B crónica, linfoma de no Hodgkin y mieloma múltiple) (Wu. 1986a). La concentración de (32M se correlaciona con la actividad lintocítica y es un buen marcador para las neoplasias de la linea de linfocitos B. Se ha utilizado como un indicador de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los niveles de |Í2M en el liqui-
Factores angiogénicos
2
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
po cefalorraquídeo (LCR) es útil para detectar metástasis en el sistema nervioso central (SNC). Se debería saber que las elevaciones sucesivas de en estas situaciones pueden también deberse al deterioro de la función renal, como sucede en el riñon del mieloma.
CA19-9, CA 50 y CA 19-5 El CA 19-9 es el primer marcador tumoral de un grupo de nuevos epítopos. incluyendo CA 125 CA 15-3 y CEA, definidos por anticuerpos monoclonales. Estos nuevos equipos de monoclonales detectan los recién descubiertos epilopos y estaban destinados a sustituir las determinaciones policlonales de CEA en vanos carcinomas (Wu, 1988a). El análisis de CA 19-9 mide un carbohidrato angiogénico determinante expresado en una mucina de alto peso molecular. El CA 19-9 es un epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 1116NS-199; se define como una lacto-W-fucopentosa II sialilada. La molécula, que transporta el epitopo CA 19-9, aparece como una mucina en el suero de pacientes con cáncer pero como un ganglíósido en las células tumorales. El CA 19-9 también está relacionado con las sustancias del grupo sanguíneo de Lewis y sólo el antigeno serológico de pacientes con cáncer pertenecientes al grupo sanguíneo Le(a b) o Le(ab ) serán positivos para CA 19-9. Además del CA 19-9, también se ha definido otros dos marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales que son sólo ligeramente diferentes del CA 19-9. Son el CA 19-5 y CA 50. El epitopo relacionado a CA 50 es muy similar al de CA 19-9 pero carece de residuo de lucosa, el mismo epítopo encontrado en individuos con Lewis-negativo Le(ab~). Las concentraciones en suero de CA 19-9 no sólo suelen estar altamente elevadas en carcinomas gástricos y pancreáticos sino que son útiles para controlar el éxito de la terapia y para detectar recidiva en estos pacientes de cáncer. Sin embargo, se ha visto que el CA 19-9 y CA 50 se complementan el uno al otro en el carcinoma pancreático y en otros carcinomas: su uso simultáneo mejorará la sensibilidad en la detección de estas enfermedades malignas. El CA 19-5 es detectado por el anticuerpo monoclonal en ratones CC3C-195 y reacciona tanto con el epítopo Le" como con el sialil-Le . El CC3C-195 se aglutina con alta afinidad con el antigeno del grupo sanguíneo Le sialilado, pero exhibe una baja afinidad con la forma no sialilada. Los niveles elevados en suero de CA 19-9, CA 50 y CA 19-5 también pueden verse en pacientes con carcinomas de colon, pancreático y hepatocelular. La elevación encontrada en enfermedades hepáticas benignas puede deberse a coleslasis en estos pacientes (Wu, 1992). -
a
1
CA125
variedad de adenocarcinomas, incluyendo mama, colon, pulmón, ovario y páncreas. El CA 15-3 es un marcador muy sensible y específico para controlar el curso clínico de pacientes con cáncer de mama metastálico. Significativamente más pacientes tienen elevados niveles circulantes de CA 15-3 que de CEA (96.2% frente a 69,8%). En general, el CA 15-3 se correlaciona con la progresión, la regresión, o la estabilidad de la enfermedad en un mayor número de pacientes que el CEA Determinado CEA y CA 15-3 no se mejoran los resultados obtenidos sólo con CA 15-3. Sin embargo, CA 15-3 también puede estar elevado en hepatitis crónica, cirrosis hepática, sarcoidosis, tuberculosis y lupus eritematoso sistémico (Tondini, 1988).
CA 72-4 El análisis de CA 72-4 detecta un antigeno relacionado con adenocarcinoma humano parecido a la mucina, TAG-72, que tiene un alto peso molecular (>10 MW), como la compleja molécula de mucina. Debido a que TAG-72 puede detectarse en el epitelio fetal y en el suero de pacientes con diversos carcinomas, también se considera como una proteina carcinoembnonaria. Sin embargo, sólo se puede detectar CA 72-4 moderadamente elevado en la mayoría de los carcinomas. Actualmente, el CA 72-4 está considerado como el único marcador útil para el tratamiento de pacientes con carcinoma gástrico, a pesar de su baja sensibilidad. El CA 72-4 puede ser útil como uno de los múltiples marcadores para tumores derivados de células epiteliales. Los RÍA de CA 72-4, CA 19-9 y CEA son complementarios unos con otros en la detección de diversos carcinomas (Wu, 1992). I,
Calcitonina La calcitonina es una de las hormonas peptidicas circulantes que pueden llegar a elevarse en pacientes con una tasa de recambio ósea incrementada asociada a metástasis óseas. La calcitonina puede encontrase ectópicamente elevada en carcinomas broncogénicos. También se eleva en el carcinoma medular de tiroides.
Antigeno carcinoembrionario El CEA es una glucoproteina con un peso molecular de aproximadamente 200 kDa. El CEA es la primera de las denominadas proteínas carcinoembrionarias que fue descubierta por Gold y Freedman (1965). El CEA sigue siendo el marcador tumoral más extensamente usado en la actualidad para el cáncer gastrointestinal, pero la mayoría de los análisis de CEA han reemplazado el anticuerpo policlonal por el anticuerpo monoclonal anti-CEA.
El CA 125 es otro determinante angiogénico definido por anticuerpos monoclonales y también está relacionado con glucoproteinas parecidas a mucinas con un alto peso molecular (>200 kDa). El CA 125 se expresa en más del 80% de los carcinomas epiteliales no mucinos ováricos. El CA 125 se encuentra en la mayoría de los carcinomas de ovano serosos, endometriales y de células claras (Jacobs. 1989). Sin embargo, los pacientes sometidos a quimioterapia pueden mostrar un (also descenso del antigeno CA 125, y un resultado negativo no siempre descarta la recidiva del tumor. El CA 125, también se ha utilizado clínicamente en el seguimiento de tumores uterinos (>60% están elevados) y en tumores benignos, incluyendo endometnosis. Recientemente, se está probando la determinación de CA 125 en suero para determinar si puede utilizarse en la identificación sistemática del cáncer ovárico Se ha indicado el uso de múltiples marcadores para mejorar la especificidad y sensibilidad de las pruebas para cáncer ovárico (Wu. 1988b: Jacobs, 1989).
Aunque el RÍA de CEA en suero no cumple con las expectativas iniciales, las intensas investigaciones sobre el CEA en los últimos 20 años nos han enseñado muchas lecciones valiosas que tienen gran beneficio en el campo de los marcadores tumorales. En un principio se pensó que el CEA era un marcador específico para el cáncer colorrectal. pero en nuevos estudios resultó ser un marcador no especifico. Se aprendió en los estudios de CEA que los marcadores tumorales podian utilizarse para seguir a los pacientes durante la terapia y para detectar las recidivas después de una cirugía exitosa. También se descubrió a través de los estudios de CEA una asociación entre una concentración elevada en suero de marcador tumoral con metástasis y mal pronóstico. Como el CEA se metaboliza en el hígado, los daños hepáticos pueden alterar la aclaración del CEA y con ello provocar un aumento de los niveles en la circulación sanguínea. Se han observado concentración elevadas de CEA en algunos pacientes después del tratamiento con radio y quimioterapia (Wu. 1986b).
CA15-3
Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)
El CA 15-3 es un antigeno circulante relacionado con el cáncer de mama identificado por dos anticuerpos monoclonales distintos. El análisis emplea un anticuerpo monoclonal conjugado en fase sólida, MAb 115D8. para capturar el antigeno MAM-6 en el plasma humano y uno denominado MAb DF3 como marcador. MAb 115D8 se preparó contra los glóbulos grasos de leche desnalada humana mientras que MAb DF3 se preparó contra la linea celular MCG-7 del carcinoma de mama. El antigeno CA 15-3 está presente en una
El gen c-eroB-2 (HER-2/neu) es un miembro de la clase de los oncogenes relacionados con la proteina tirosma cinasa. Se ha descrito que el gen c-erbB-2 se encuentra amplificado del 25% al 30% de cáncer humano de mama y ovario. Se ha demostrado que la amplificación del c-eroB-2 es un predictor independíente tanto de la recaída como de la supervivencia global, y es superior a todos los demás factores pronósticos conocidos excepto cuando los ganglios linfáticos son positivos. Recientemente se ha
CAPÍTULO 47
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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS
1039
deteclado que el c-eroB-2 es un útil marcador para identificar a pacientes con cáncer de mama, que se beneficiarán más de altas dosis de quimioterapia adyuvante (Tandon, 1989: Duffy, 1990). Hay una relación directa entre la amplificación del gen c-erbB-2 y la sobreexpresión de la proleina c-eróB-2. Como consecuencia, se ha visto que tanto la amplificación como la sobreexpresión de c-eroB-2 están relacionadas con un mal pronóstico y con una escasa supervivencia y recidiva en diversos carcinomas.
placenta y es una hormona heterodimérica compuesta por subunidades
La proteína codificada por c-erbB-2 es un receptor transmembranoso de 185 kDa (p185); también es una glucoproteína que tiene dominios intracelular, transmembrana y extracelular. La proteina c-erbB-2 muestra una semejanza estructural y funcional con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Recientemente se ha publicado que el ectodominio de la oncoproteina c-erbB-2 se podría separar proteolíticamente del receptor intacto y podría eventualmente descubrirse en la circulación sanguínea Parece que el ectodominio secretado en la matriz extracelular del tumor de mama corresponde con niveles de expresión de p185 en el tejido del tumor de mama. También parece existir una relación entre el ectodominio serológíco y pl85. aunque no se ha probado. En la actualidad hay estudios en marcha para determinar si el ectodominio serológico de la proteina c-eróB-2 puede utilizarse como un marcador pronóstico (Wu, 1995).
Sin embargo, se puede encontrar una elevación de hCG en tumores trofoblásticos, coriocarcinoma y tumores testiculares. Más del 60% de los pacientes con tumores no seminomatosos y entre un 10% y un 30% de los seminomas tienen una |i-hCG libre elevada. La determinación de la subunidad p libre es útil para la detección de recidiva de metástasis en el coriocarcinoma cuando la hCG intacta sigue normal El análisis de las subunidades hCG en suero puede ser especialmente útil en el tratamiento de pacientes con cancer seminomatoso, ya que en estos pacientes no se encuentra otro marcador tumoral elevado.
Cromogranina A
El cáncer testicular seminomatoso contiene hCG intacta y p-hCG o subunidades o libres en la misma proporción; por tanto, sólo se necesita un análisis para controlar a estos pacientes. Por otro lado, en pacientes con cánceres no seminomatosos sólo se encuentran hCG o subunidades p-hCG. La determinación de las subunidades libres y de hCG intacta aumentará la sensibilidad de la prueba en pacientes con cánceres no seminomatosos.
La cromogranina A es una importante proteína soluble de los granulos cromafines. La cromogranina A puede liberarse de la médula adrenal junto con catecolaminas tras la estimulación de nervios esplácnicos; sin embargo, no está limitada a células cromafines de la médula adrenal y neuronas simpáticas: también existe en diversos tejidos neuroendocrinos. Los niveles elevados de cromogranina A en suero pueden detectarse en feocromocitomas y en el carcinoma microcítico de pulmón (OConnor, 1984).
La producción de p-hCG ectópica libre se produce casi en el 30% de los pacientes con cáncer urotelial, pero sólo se detectaron la subunidad p-hCG libre y sus respectivos productos de degradación, (i-core, en estas muestras clínicas. La «-hCG es un marcador de malignidad en tumores endocrinos pancreáticos (Madersbacher. 1992).
CYFRA 21-1
Los ácidos siálicos (ácidos /V-acetilneuraminicos) son los derivados acilados del ácido neuramínico y los residuos terminales del extremo no reducido de las cadenas de carbohidratos en glucoproteinas y glucolipidos. La LASA-P. por otro lado, se considera como un marcador tumoral no especifico; se encuentra elevada en una variedad de enfermedades malignas, aunque también en enfermedades inflamatorias no malignas. Esta ausencia de especificidad tumoral limita sustancialmente su utilidad como un marcador tumoral para el diagnóstico. La LASA-P tiene una sensibilidad muy baja, y sólo se puede detectar en suero que contenga marcadores tumorales en elevadas concentraciones, hablamos de rangos de mil nanogramos por milímetro de concentración El método más comúnmente usado para medir la LASA-P en suero es un procedimiento colonmétrico simple y baralo que utiliza ácido tíobarbitúnco y resorcinol (Katopodis, 1982).
CYFRA 21-1 es un fragmento de la citoqueratina 19 encontrada en el suero. Es una subunidad del filamento de citoqueratina intermedio expresado en el epitelio simple y su análogo maligno. La elevación de CYFRA 21-1 indica un mal pronóstico en el carcinoma de células escamosas de pulmón (Pujol, 1993).
Ciclinas La progresión en el ciclo celular de las células eucariotas está controlada por la familia de ciclinas y las quinasas afines dependientes de ciclinas. Las distintas proteínas ciclinas se pueden encontrar en diferentes estadios del ciclo celular. Tres ciclinas diferentes marcan las diferentes fases del ciclo celular —E para G, y S precoz. A para S y G,. y B para G, tardía—; la fracción de células positivas para un cíclico determinado predecirá la fracción en una fase determinada del ciclo celular. La apariencia periódica de las ciclinas en las distintas lases del ciclo celular sugiere que pueden utilizarse como marcadores de proliferación tisular. Se ha detectado expresión elevada de varias ciclinas en extractos de cánceres humanos (Sherr. 1996).
Receptores de estrógeno y receptores de progesterona La determinación de receptores de estrógeno (RE) y receptores de progesterona (RP) en el citoplasma del tumor de mama se utiliza para identificar a las pacientes que probablemente se beneficien más de terapia endocrina. Los RE y RP positivos también indican buen pronóstico, largo intervalo libre de enfermedad y larga supervivencia en general. Aproximadamente del 55% al 60% de las pacientes cuyos tumores primarios tienen RE positivos, y casi el 85% de las pacientes con RE y RP positivos, responderán a la terapia endocrina (Wu. 1997).
Gonadotropina coriónica humana La gonadotropina coriónica humana es un miembro de la familia de las hormonas glucoproteicas, se sintetiza y secreta por los trofoblastos de la
LASA-P
Enolasa neuronal específica La subunidad y de una isoenzima enolasa en la vía glucolítica. que se encuentra predominantemente en células neuronales y neuroendocnnas, se llama enolasa neuronal específica (NSE) y se identifica por inmunoanálisis. Los niveles elevados de NSE se pueden encontrar en tumores que se originan de células del sistema neuroendocrine Los niveles de NSE en suero parecen ser marcadores relativamente específicos del cáncer microcítico de pulmón (SCLC) (85%). Se ha visto que es un marcador útil para controlar el tratamiento y predecir recaídas en pacientes con SCLC (Burghuber, 1990).
p53 La p53 es una fosfoproteina nuclear de 53 kDa y un regulador negativo del crecimiento celular. Funciona como un supresor tumoral induciendo la expresión de productos del gen que son responsables de la inhibición o detención del crecimiento y la proliferación celular. La habilidad de la proteina p53 para regular la transcripción de estos genes diana se basa en la actividad aglutinante de la secuencia específica del ADN y en la presencia de un dominio que puede activar la transcripción cuando se une al dominio unido al ADN de otra proteína. Es el dominio unido al ADN el que parece ser sensible a la disrup-
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
ción por mutación y a más lesiones relacionadas con cánceres humanos que producen en este dominio. Se ha visto que el gen codificador para p53 está mutado en casi la mitad de prácticamente todos los tipos de cáncer surgidos desde un espectro amplio de tejidos. La inhibición funcional de la activación de p53 también parece jugar un papel en la génesis tumoral humana. La sobreexpresión de algunos productos de oncogenes en ciertos tumores sirve para aglutinar y enmascarar la activación del dominio de p53. La p53 puede determinarse tanto en tejido como en fibroblastos, células blancas o en suero. Existe disponible en el mercado un inmunoanálisis de enzima sandwich de Oncogene Science para la cuantilicación de proteínas p53 desnaturalizadas mulantes. Debido a la corta vida media (20 minutos), no se detecta la proteína p53 en estado puro en la circulación sanguínea (Harris, 1993; Malkin. 1990).
Proteína pS2 La pS2 es un péptido rico en cisteina inducido por estrógenos. Es una pequeña proteína secretada por las células de la mama. Su detección en los citoplasmas de tumores de mama permite que se pueda prever la respuesta a la terapia endocrina. Se ha visto que la expresión de pS2 está asociada a una supervivencia larga en general y libre de enfermedad. La pS2 negativa está asociada con recidiva precoz y mortalidad: RE+ / RP+ / pS2+, del 85% al 97% tiene buen pronóstico frente a RE+ / RP + / pS2-, sólo del 50% al 54% tiene buen pronóstico
Hormona paratiroidea relacionada con péptidos Las concentraciones en plasma de la hormona paratiroidea relacionada con péptidos (PTH-RP) se encuentran elevadas en la mayoría de pacientes con cáncer asociado a hipercalcemia. Son secretadas por tumores asociados con hipercalcemia. Las formas circulantes de PTH-RP en estos pacientes incluyen tanto un péptido aminoterminal largo como un péptido carboxitermínal con una secuencia similar homologa a la paratirina (PTH). El mecanismo por el cual PTH-RP induce hipercalcemia incluye aglutinación y activación de receptores que también aglutinan PTH. La determinación de las concentraciones de PTH-RP puede ser útil en el diagnóstico diferencial de hipercalcemia relacionada con malignidad y asociada también con hiperparatiroidismo primario, sarcoidosis, toxicidad de vitamina D o diversas neoplasias (incluyendo carcinomas de células escamosas, renales de vejiga y de ovario). Se debería conocer que los pacientes con afectación de la función renal, pero sin hipercalcemia o cáncer, pueden presentar concentraciones en plasma de PTH-RP aumentadas (Burtis, 1990).
En la circulación sanguínea, la mayoría del PSA presente se encuentra como complejo PSA-ACT
Antígeno prostético específico El PSA se sintetiza en las células epiteliales de la glándula prostética y quizá sea el mejor marcador tumoral descubierto hasta ahora. La especificidad tisular del PSA hace que sea el marcador tumoral más útil disponible para la detección sistemática y el tratamiento del cáncer de próstata. La ausencia de especificidad es el único inconveniente del PSA. Los procesos benignos como la HPB. la prostatitis y el infarto también se correlacionan con niveles elevados de PSA en suero. Debido a su especificidad tisular, el análisis del PSA es particularmente útil para controlar el éxito después de una prostatectomia quirúrgica. La completa extirpación de la próstata resultaría en un nivel de PSA indetectable; cualquier detección de PSA después de una prostatectomia radical indicaría persistencia de tejido prostético o metástasis. En estos pacientes, el incremento en las concentraciones de PSA después de una cirugía con éxito indica una recidiva de la enfermedad. Sin embargo, si la detección de PSA en suero después de una prostatectomia radical se debe a una resección glandular incompleta y no de persistencia de enfermedad, el nivel permanecerá inalterable en los posteriores seguimientos. Hay que saber que puede existir un aumento leve pero pasajero de los niveles de PSA durante la radioterapia, que no debe malinterpretarse como progresión de la enfermedad. La especificidad tisular del PSA también permite que esta prueba sea un excelente instrumento para detectar una recidiva después de una prostatectomia radical. Ha surgido una gran demanda para el desarrollo de una prueba de PSA ultrasensible. Una prueba de PSA muy sensible permitiría una detección precoz de recidiva y metástasis y proporcionaría una mejor oportunidad para un tratamiento con éxito. Muchas de las pruebas de PSA actualmente disponibles en el mercado son capaces de detectar PSA en suero por debajo de 0,1 ng/ml. Se recomienda el uso de PSA en suero junto con un DRE o ecografía transrectal de la próstata como instrumento de examen para detectar cáncer de próstata clínicamente significativo (Calalona, 1991; Brawer. 1992). El PSA es una serin proteasa capaz de unirse formando complejos con diversos inhibidores de proteasa. En consecuencia, existe PSA en suero principalmente en forma de complejo PSA-ACT (PSA-ct.-anliquimotripsJna) (Christensson. 1993) (Fig. 47-8). Hay convencimientos de que la determinación directa del complejo PSA-ACT no sólo elimina muchos problemas técnicos relacionados con el análisis del PSA sino que también mejora la dilerenciación de la HPB (hipertrofia prostética benigna) del cáncer de próstata (Wu, 1994,1998).
PSA libre La determinación del PSA libre (fPSA) y el cálculo del %fPSA (%fPSA = [fPSA/PSA] x 100) se ha utilizado para diferenciar entre HPB y cáncer de
Inmunoanálisis sandwich para el complejo PSA-ACT
Figura 47-8. La ilustración muestra que la mayoría del PSA existente en la circulación sanguínea se encuentra en forma de complejo PSA-ACT. La figura de la derecha indica cómo se puede desarrollar un análisis específico para el complejo PSA-ACT mediante dos anticuerpos diferentes, uno para el PSA libre y otro para ACT. en un formato sandwich
CAPÍTULO 47
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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS
1041
Brawer MK: Screening lor prostatic carcinoma with proslate-specilic antigen. J Urol 1992:147:841. Burghuber OC. Worofka B, Schernthaner G. et al: Serum neuron-specilic enoiase is a useful tumor marker for small cell lung cancer Cancer 1990; 65:1386. Burtis W. Brady TF, Orloff JJ. et al: Immunochemical characterization of circulating parathyroid hormone-related protein in patients with humoral hypercalcemia of Carcinoma de células escamosas cancer N Engl J Med 1990; 322:1106. Catalona W, Smith D, Ratlitf T et al: Measurement ol prostate-specific antigen in El antigeno del carcinoma de células escamosas (SCC) es una subfracción serum as a screening test lor prostate cancer. N Engl J Med 1991 324 1156 casi neutral del antígeno tumoral TA-4 purificado del tejido del carcinoma de Catalona W. Smith D. Wollerl RL, el al: Evaluation ol percentage ol free serum proscélulas escamosas del cérvix uterino. El peso molecular del antigeno SCC es tate-specilic antigen to improve specifidty of prostate cancer screening JAMA 1995; 274:1214. de aproximadamente 48 kDa, Más del 70% de las pacientes con cáncer de Christensson A, Bjork T. Nilsson O, et al: Serum prostate specific antigen complecérvix avanzado tiene un SCC elevado. El RÍA de SCC es útil para el seguixed to u-,antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J Urol 1993; miento de pacientes con cáncer de cérvix durante el tratamiento. El SCC tam150:100. bién es útil para controlar carcinomas de células escamosas de cabeza y cueColey CM. Barry MJ. Fleming C. et al: Early detection ol prostate cancer. Part I: Prior probability and effectiveness of tests. The American College ol Physicians. llo, pulmón, esófago y canal anal. Las concentraciones de SCC en suero son Ann Intern Med 1997a: 126:394. mayores en pacientes con metástasis. En pacientes con fallo renal, incluso el Coley CM. Barry MJ. Fleming C. et al: Early detection ol prostate cancer Part II: 50% podría tener concentraciones aumentadas de SCC en suero debido a un Estimating the risks, benefits, and costs. Ann Intern Med 1997b; 126 468 aclaramiento alterado de la circulación. Coombes RC, Powles TJ, Gazet JC, et al; Biochemical markers in human breast cancer Lancet 1977:1:132. Diamond BA, Yellon DE, Schartl MD: Monoclonal antibodies. A new technology lor producing serologic reagents. N Engl J Med 1981: 304 1344. Antígeno polipéptido tisular Druker Bl. Mamon HJ. Roberts TM: Oncogenes, growth factors, and signal transduction. N Engl J Med 1989; 321:1383. El antígeno polipéptido tisular (TPA) es una mezcla de citoqueratinas asoDuffy MJ: Biochemical markers as prognostic indices in breast cancer. Clin Chem ciadas a epitelios de baio peso molecular (Weber. 1984). Como es más abun1990: 36:188. dante en células en mitosis y mucho menos en interfase. el TPA es una mezcla Easton DF. Bishop DT. Ford D, el al: Genetic linkage analysis in familial breast de la proliferación celular. El análisis de TPA utiliza una combinación de antiand ovarian cancer: Results Irom 214 families. Am J Hum Genet 1993: 52:678. cuerpos monocíonales específicos de citoqueratinas de epitelio simple. El TPA Engvall E. Perlmann P: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative es un marcador sensible pero no especifico para diferenciar entre enfermedad assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 8:871. en progresión y en remisión completa. Las elevaciones del TPA aparecen en Fidler IJ. Hart IR Biological diversity in metastatic neoplasms Origins and implicauna gran diversidad de enfermedades inflamatorias y en el embarazo, asi como tions. Science 1982: 2)7:998. Folkman J, Shing Y: Angiogenisis J Biol Chem 1992: 267:10931 en muchos tipos de tumor Muchos artículos insisten en el uso del TPA junto con otros marcadores, especialmente el CEA, para controlar una gran diversidad de Futreal PA, Liu Q. Shattuck-Eidens D, et al: BRCAI mutations in primary breast and ovarian cancers. Science 1994 266:120. carcinomas, incluyendo mama, colorrectal, ovario, vejiga y pulmón. El TPA tamGold P. Freeman SO: Demonstration 61 tumor-specilic antigens in human colonic bién es válido para detectar recidiva y para ayudar a diferenciar entre colangiocarcinomata by immunological tolerance and absorption techniques. J Exp Med 1965; 121 439. carcinomas (positivo) y carcinoma hepatocelular (negativo). Harris CC. Hollstein M: Clinical implications ol the p53 tumor-suppressor gene N Debe advertirse de que cualquier molécula puede utilizarse como marEngl J Med 1993: 329:1318. cador tumoral siempre que las variaciones en su concentración reflejen Hebbar M, Revillion F, Louchez M-M, et al: The relationship between concentrations of circulating soluble E-selectm and clinical, pathological, and biological features cierta actividad celular tumoral. La valoración de la utilidad clínica de un in patients with breast cancer Clin Cancer Res 1998; 4:373. marcador tumoral particular se basa en su sensibilidad y especificidad. Ha Jacobs I, Bast RC Jr: The CA 125 tumour-associated antigen: A review ol the liteexistido una clara tendencia para mejorar la especificidad y sensibilidad de rature Human Reprod 1989; 4:1. la prueba al pedir múltiples marcadores tumorales. Sin embargo, todavía Katopodis N: Lipid associated sialic acid test for the detection ol human cancer. Cancer Res 1982: 42:5270 existen discrepancias respecto a cuál y cuántos marcadores tumorales se Liotta LA: Biochemical mechanisms of tumor invasion and metastases Ctrl Physiol deben incluir en el panel de determinadas enfermedades malignas. El Biochem 1987; 5:190. coste que conlleva la petición de múltiples marcadores tumorales también Littrup PJ. Coodman AC, Metllin CJ: The benefit and cost of prostate cancer early puede ser prohibitivo. Existen varios marcadores tumorales nuevos posidetection. CA Cancer J Clin 1993; 43:134. bles. Estos marcadores tumorales están compuestos de oncoproteínas. Madersbacher S, Klieber R, Mann K: Free u-sbunit. free |5-subunit of human chorionic gonadotropin (hCG), and intact hCG in sera ol healthy individuals and tesproteínas supresoras, moléculas de adhesión, ciclinas y factores angiogéticular cancer patients Clin Chem 1992: 38:370 nicos. Éstos difieren sobre todo de los marcadores tumorales utilizados Malkin D U FP. Strong LC, et al: Germ line p53 mutations in a familial syndrome of actualmente en su asociación con rutas metabólicas específicas conocidas breast cancer, sarcomas and other neoplasms. Science 1990; 250:1233. o reacciones fisiológicas. La mayoría de los marcadores tumorales que se Miki Y. Swensen J, Shattuck-Eidens D. et al: Isolation of BRCA1. trie 17q-linked breast and ovarian cancer susceptibility gene. Science 1994; 266:66. emplean actualmente para el tratamiento de pacientes no están asociados Milstein C, Cuello AC: Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry con ninguna reacción biológica específica conocida. Posiblemente, midienNature 1983: 305:537. do estos nuevos marcadores tumorales se proporcionará información Morelli D, Lasserini D. Cazzaniga S, el al: Evaluation ol the balance between angiosobre defectos más específicos, lo que ayudará al diseño de tratamientos genic and antiangiogenic circulating factors in patients wilh breast and gastrointestinal cancers. Clin Cancer Res 1998: 4:1221. más apropiados. El mejor ejemplo es el célebre uso de Herceptin (un antiNahm MH, Hoffmann JW: Heteroantibody: Phantom ol the immunoassay Clin Chem cuerpo monoclonal humano contra el ectodominio del receptor c-eróB-2) 1990, 36:829. en pacientes con cáncer de mama metastático. Sólo las pacientes con O'Connor DT, Bernstein KN: Radioimmunoassay of chromogranin A in plasma as a sobreexpresión de la oncoproteina c-eroB-2 (HEfl2) en su tumor son measure of exocytotic sympatho-adrenal activity in normal subjects and patients with pheochromocytoma. N Engl J Med 1984; 311:764. seleccionadas para el tratamiento Herceptin (Wu, 1999). Pronto estará disPujol J-L, Grenier J, Daures JP. et al: Serum fragment ol cytokeratin subunit 19 ponible un análisis en suero de la oncoproteina c-erbB-2 (Wu, 1998). measured by CYFRA 21-1 immunoradiametric assay as a marker ol lung cancer. Cancer Res 1993: 53:61. Schnipper LE Clinical implications of tumor cell heterogeneity N Engl J Med 1986: 314:1423. BIBLIOGRAFÍA Sell S: Cancer markers of the 1990s. Comparison of the new generation of markers defined by monaclonal antibodies and oncogene probes to protolypic markers. Clin Lab Med 1990:10:1. Bast RC Jr, Knauf S. Epenetos A, et al: Coordínate elevation ol serum markers in ovarían cáncer bul not m benign disease. Cáncer 1991; 68:1758. Sherr CJ: Cancer cell cycles. Science 1996; 274:1672. Benson MC, Wang IS, Pantuck A, et al: Prostate specific antigen density: A means Smith TJ, Davidson NE, Schapira DV. et al: American Society ol Clinical Oncology of distinguishing benign prostatic hyperplasia and prostate cáncer J Urol 1992; 1998 update ol recommended breast cancer surveillance guidelines. J Clin 147:815. Oncol 1999:17:1080. Bodansky O: Rellections on biochemical aspects ol human cáncer. Cáncer 1974; Tandon AK. Clark GM. Chamness GC. et al: HER-2'neu oncogene protein and prog33:364. nosis in breast cancer. J Clin Oncol 1989; 7:1120. próstata, reduciendo por tanto las biopsias innecesarias en pacientes con HPB. Un %fPSA alto (>23%) normalmente se asocia a HPB, mientras que el cáncer prostético está asociado a un %fPSA bajo (<6%) (Catalona, 1995).
1042
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tondini C, Hayes DF, Gelman R. Comparison of CA 15-3 and carcinoembryonic antigen in monitoring the clinical course of patients with metastatic breast cancer Cancer Res 1988: 48:4107 von Kleist S: What's new in tumor markers and their measurements'' Path Res Pract 1988:183:95. Weber K, Osborn M. Moll R: Tissue polypeptide antigen (TPA) is related to the nonepidermai keratins 8. 18. and 19 typical of simple and nan-squamous epithelia: Re-evaluation of a human tumor marker. EMBO 1984: 3:2702. Wooster Ft. Neuhausen SL. Mangion Y: Localization of a breast cancer susceptibility gene. BRCA2. to chromosome 13q12-l3. Science 1994; 265 2088 Wu JT: Expression of monoclonal antibody-detined tumor markers in four carcinomas Ann Clin Lab Sci 1989:19:17. Wu JT: Measurement ot AFP and its lectin reactive isoforms in liver diseases and various malignancies. Ann Clin Lab Sci 1990: 20:98 Wu JT: Assay for prostate specific antigen (PSA): Problems and possible solutions J Clin Lab Anal 1994: 8:51 Wu JT. Astill ME. Gagon SD. et al: Measurement of c-ertB-2 protein in sera from patients with carcinomas and in breast tumor tissue cytosols: Correlation with serum tumor markers and membrane-boumd oncoprotein. J Clin Lab Anal 1995; 9:151. Wu J T, Carlisle P: Low frequency and low level ot elevabon of serum CA 72-4 in human carcinomas in comparison with established tomor markers. J Clin Lab Anal 1992. 6:59. Wu JT Christensen SE: Effect ol dillerent test designs ot immunoassays on "hook effect' of CA 19-9 measurement J Clin Lab Anal 1991a. 5.228 1
Wu JT. Clayton F. Myers S. Knight JA: A simple radial immunodiffusion method for assay ol (^-microglobulin in serum. Clin Chem 1986a: 32:2070 Wu JT. Knight JA: Alpha-fetoprotein: Its use in clinical medicine ASCP check sample. Clin Chem 1987 27:1. Wu JT. Knight JA: Monoclonal immunoassays for tumor markers ASCP check sample. Clm Chem 1988a. 28:1. Wu JT. Knight JA, Knight DP: Carcinoembryonic antigen (CEA) in Ihe diagnosis and management of colorectal cancer. Check Sample. Clin Chem 1986b. 86.8. Wu JT, Liu GH. Advantages of replacing the total PSA assay with Ihe assay for PSA(/.,-antichymotrypsin complex lor the screening and managemenl ol prostate cancer J Clin Lab Anal 1998a: 12:32. Wu JT. Mau E, Kmghl JA: Interference with carcinoembryonic antigen radioimmunoassays by glycosaminoglycans, and their removal Clin Chem 1983: 29:2049 Wu JT. Miya T. Knight JA: Improved specificity of the CA 125 EIA for ovanan carcinomas by use of the ratio ol CA 125 to CEA. Clm Chem 1988b 34:1853 Wu JT, Nakamura R: Human Circulating Tumor Markers Chicago. American Association ol Clinical Pathologists. 1997 Wu JT, Zhang P, Bentz JS: Quantification of HER2 oncoprotein in breast fine-needle aspirates. Am Clm Lab Sci 2000. 30:49-55 Wu JT, Zhang P, Lyons BW. Wu LL: Isolation ot Ihe intact molecule and ectodomain of cerbB-2 oncoprotein from SK-BR-3 cells and development of immunoassays on microplate. J Clin Lab Anal 1998b; 12:298-303. Yu H, Schlossman DM. Harrison CL et al: Coexpression ol different antigenic markers on moieties that bear CA 125 determinants Cancer Res, 1991b. 51:468.
S E C C I Ó N
VI
Microbiología médica Gail L. Woods, M.D. John Bernard Henry, M.D.
CAPÍTULO
48
Infecciones víricas • Michael Costello, PhD. • Margare» Yungbluth, M.D.
Cultivo de virus Detección de antigenos y detección molecular Serología vírica Obtención y transporte de las muestras Equipos y material Síndromes clínicos infecciosos causados por virus INFECCIONES HERPÉTICAS MUCOCUTÁNEAS Aislamiento del virus del herpes simple mediante cultivo celular Detección directa del virus del herpes simple
1050
Diagnóstico serológico INFECCIONES VÍRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO 1053 Gripe (Influenza) Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial Crup Obtención de muestras Ensayos para la detección de antigenos víricos Aislamiento de virus MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E INFECCIONES RELACIONADAS 1057 Diagnóstico serológico
La virología clínica es una ciencia que ha experimentado una profunda evolución en los últimos 40 años, de tal forma que hoy en día está claramente establecido que los virus son la causa más frecuente de enfermedades infecciosas en el hombre. El ámbito de las enfermedades víricas es muy amplio, con manifestaciones que van desde el trivial resinado común hasta la reciente patología consistente en un estado de inmunosupresión de consecuencias fatales, resultante de la destrucción de los linfocitos T-CD4 por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Los métodos de cultivo inicialmente disponibles para llevar a cabo el aislamiento e identificación de los virus eran complejos y tediosos y, en consecuencia, poco prácticos para ser utilizados de forma sistemática en el diagnóstico. Sin embargo, debido a la epidemia de infecciones venéreas producidas por el virus del herpes simple, al incremento en el número de pacientes inmunocomprometidos que padecen infecciones oportunistas y al desarrollo de agentes antivirales eficaces, se ha generado una fuerte demanda de servicios de virología clínica que sean accesibles fácilmente. En este contexto, hoy en día los hospitales, tanto los municipales como los universitarios, asumen como algo habitual la confirmación de las infecciones respiratorias, del sistema nervioso central (SNC), gastrointestinales (Gl) y diseminadas, causadas por virus. Un diagnóstico específico de una infección vírica es de gran ayuda para el médico de cara a optimizar las condiciones de hospitalización del paciente y a administrar la quimioterapia antivírica más apropiada en cada caso; de este modo, se evitan o reducen los tratamientos innecesarios y se consigue un ahorro significativo en los procedimientos diagnósticos, implementando al mismo tiempo los métodos de aislamiento más eficaces para limitar la diseminación nosocomial de los virus. Los beneficios secundarios para la salud pública de una diagnóstico preciso no deben ser pasados por alto; los datos epidemiológicos sobre la gnpe, el síndrome de inmunodeficiencia adqumda (sida), las infecciones por arbovirus y enterovirus y el herpes venéreo representan una información tan valiosa como la compilada sobre la tuberculosis, la salmoneltosis. la gonorrea y la sífilis.
Mononucleosis infecciosa heterófilo-negativa Síndrome de la fatiga crónica INFECCIONES VÍRICAS CONGÉNITAS Y PERINATALES Citomegalovirus Rubéola Virus del herpes simple Virus de la inmunodeficiencia humana, parvovirus, enterovirus ENCEFALITIS Y MENINGITIS VÍRICA
1059
1060
Diagnóstico de laboratorio EXANTEMAS VIRALES GASTROENTERITIS VÍRICA
1063 1064
Diagnóstico de laboratorio HEPATITIS VÍRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS Virus de la inmunodeficiencia humana INFECCIONES VÍRICAS EN HUÉSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS BIBLIOGRAFÍA
1065
1067 1068
Existen varios trabajos de excelente calidad que contienen información sobre la taxonomía y patogenicidad de los virus humanos (Fields. 1996; Topley, 1998; Murray. 1999). En este capitulo se revisan los síndromes infecciosos de origen vírico más comunes y que son responsables de la mayor parte de pruebas diagnósticas que se llevan a cabo en un laboratorio de microbiología clínica típico. Se analizarán los aspectos relativos a la organización del laboratorio, equipos y suministros, recogida de muestras y selección de las pruebas, junto con los métodos habituales de aislamiento e identificación que tienen una mayor aplicación práctica en clinica. Ya que las enfermedades víricas son tan comunes y afectan tanto a los niños y adultos sanos como a inmunocomprometidos, la mayor parte de hospitales municipales registran una mezcolanza de casos clínicos que justifica la existencia de un servicio de virología. En la Tabla 48-1 se recogen los datos relativos al número de pruebas de aislamiento y de detección de anlígenos, asi como las frecuencias de recuperación en el General Hospital Lutheran, un centro médico suburbano de 600 camas localizado en Chicago, con un gran volumen de atención pnmaria pediátrica y de adultos y servicios de obstetricia, neonatologia y hematología'oncologia de alto riesgo. Esta mezcla de pacientes conlleva una amplia variedad de infecciones víricas comunes; en otros hospitales con diferentes perfiles de especialidades médicas se recuperarán básicamente los mismos tipos de virus, aunque pueda haber variaciones en los porcentajes relativos de aislamiento. El tiempo medio requerido para la detección de la mayor parte de virus es corto (a menudo, dos días o menos) y. desde luego, está en la misma escala de tiempo que se necesita para el aislamiento habitual de baclenas mediante cultivo. Ello es consecuencia del uso de pruebas rápidas para la detección de antigenos y ácidos nucleicos (utilizando las correspondientes sondas especificas) y de cultivos en "shell vial" que necesitan cortos periodos de incubación. El porcentaje de recuperación es alto -del 15% al 38%- y, por lo general, vanas veces superior al valor que se obtiene en el caso de los
SECCIÓN VI
1046 I
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA :
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Tabla 48-1 Detección de virus: frecuencias de aparición, tiempos de detección medios y frecuencias de positividad viral (Lutheran General Hospital, Park Ridge, II) 1995
Virus Virus del herpes simple Cilomegalovirus Adenovirus Virus de la influenza A Enlerovirus Virus de la vancela-zósler Virus de la influenza B Virus de la parainfluenza Virus respiratorio sincitial Sarampión y paperas Total de muestras procesadas Porcentaje de recuperación de virus
1998
34% 3% 5% 6% 8% 2% 1% 6% 27% <1% 3.323
25% 4% 6% 11% 7% 1% <1% 4% 41% 0%
Tiempos de detección medios (días) 2 3 3 2 4 3 2 2 0,33 5
3.040
21%
23%
hemocultivos o los cultivos de heces ordinarios, los cultivos de micobacterias y el examen en busca de parásitos y sus huevos (Costello, 1996). Muchos de los virus más comunes muestran variaciones estacionales. Las epidemias de gripe y de las infecciones por virus respiratorio sincitial (VRS) se repiten anualmente durante los meses fríos, al igual que sucede para las infecciones por los virus tipo 1 y tipo 2 de la parainfluenza. Las infecciones por adenovirus, virus tipo 3 de la parainfluenza, citomegalovirus (CMV) y virus del herpes simple (VHS) tienen lugar a lo largo de todo el año. Las enfermedades provocadas por enterovirus se concentran al final del verano y principio del otoño (Fig. 48-1). Estos patrones de distribución temporal de la incidencia de las diferentes infecciones provocan fluctuaciones en las necesidades de personal de laboratorio que son particularmente problemáticas en los hospitales pediátricos. En la Tabla 48-2 se muestran los tres métodos principales para el diagnóstico de laboratorio, todos los cuales tienen ventajas y limitaciones. Las técnicas de cultivo y detección de antigenos requieren que en la muestra existan virus via-
bles o fragmentos del virus relativamente intactos; las muestras deben obtenerse del lugar en donde está teniendo lugar la replicación activa del virus, durante la fase aguda de la infección. Debido a su mayor sensibilidad, las técnicas de hibridación con sondas de ácidos nucleicos específicas permiten una mayor libertad a la hora de obtener el espécimen; sin embargo, la interpretación de los resultados puede ser más difícil, puesto que es posible seguir observando valores positivos con estas técnicas, incluso durante la fase de recuperación o convalecencia. Los ensayos con sondas pueden discriminar entre infección activa y latente mediante la detección de componentes del genoma vírico que estén replicándose activamente; por ejemplo, el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la transcríptasa reversa (RT) (RT-PCR) para ARN específico de CMV indica replicación activa del virus, mientras que la PCR específica para ADN puede dar también un resultado positivo durante la fase de latericia. El diagnóstico serológico tradicional requiere el análisis de dos muestras de suero, una tomada durante la fase aguda y la otra durante la de convalecencia de la enfermedad, para poner de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior en el título de anticuerpos específicos frente al virus entre ambas muestras. Aquellos métodos que detectan IgM específicas frente al virus permiten diagnosticar la enfermedad aguda a partir de una única muestra de suero obtenida durante la lase aguda o al comienzo de la fase de convalecencia de la enfermedad. Por último, las pruebas que identifican inmunoglobuiinas especificas del tipo IgG se utilizan habítualmente para poner de manifiesto la existencia de un estado inmune en el individuo frente a un determinado agente viral. En la actualidad, todos los materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo el aislamiento de virus, los ensayos de detección de antígenos virales y los métodos serológicos están disponibles comercialmente. Los laboratorios de virología ya no necesitan mantener las líneas de cultivos celulares o preparar sus propios reactivos, al igual que un laboratorio de microbiología general tampoco utiliza medios de cultivo y colorantes preparados de forma casera. El número de virus que puede identificarse y cuantificarse mediante ensayos de amplificación de ácidos nucleicos continúa aumentando, aunque sólo están disponibles unos pocos sistemas comerciales de aplicación general basados en esta tecnología. En este contexto, los procedimientos particulares son la regla más que la excepción y necesitan una buena experiencia técnica y un severo control de calidad para garantizar la precisión y Habilidad del diagnóstico.
Adenovirus Herpes simple Citomegalovirus Varieela-zóster Sarampión Paperas Virus respiratorio sincitial
Parainfluenza tipos I y 2 Parainfluenza tipo 3
Influenza A y B
Enterovirus Arbovirus Rotavirus
Figura 48-1. Variación de la aparición de infecciones víricas en función de la estación del año.
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
Tabla 48-2 M é t o d o s d e laboratorio para e l diagnóstico d e las infecciones virales Cultivo de tejidos Cullivo en tubo (monocapa estándar de células) Métodos de cultivo potenciados mediante centrifugación (monocapa de células en "shell-vials'/monocapa de células mixtas) Detección de antigenos/ácidos nucleicos del virus en el espécimen del paciente Tinción directa con anticuerpos fluorescentes (DFA) Enzimoínmunoensayo (EIA) Ensayos directos con sondas de ácidos nucleicos (hibridación in situ, HIS) y técnicas de amplificación (PCR, RT-PCR, SD. bADN. LCR. TMA. HC. etc.) Secuenciación de genomas (VIH. VHC. ele.) Scrologia Pruebas con anticuerpos policlonales Métodos específicos para IgM. IgG. e igA HIS = Inundación in situ. TMA » amplificación mediada po' transcripción. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; RT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa reversa SD = desplazamiento de cadena; bDNA = ensayo de ADN ramificado, LCR • reacción en cadena de la ligasa. VIH = virus de la inmunodeficiencia humana; VHC = virus de la hepatitis C A pesar de estas restricciones, los métodos basados en la biología molecular son particularmente atractivos para la identificación de virus que se propagan lentamente, o incluso no lo hacen, en los cultivos celulares, y, en teoría, deberían proporcionar una sensibilidad y una precisión cuantitativa superior a la que tienen los sistemas convencionales.
Cultivo de virus La propagación de virus en cultivos de tejidos se consiguió por primera vez hace más de 50 años, y hoy en día aun continúa siendo el procedimiento más versátil y amplio para el diagnóstico de las infecciones víricas. Muchos virus (aunque no todos) de importancia clínica son capaces de replicarse en cultivos celulares, existiendo una correlación entre la recuperación del virus y la fase aguda de la enfermedad correspondiente. Sin embargo, el cultivo requiere mucho esfuerzo y experiencia técnica, y generalmente implica al menos uno o dos días de espera para obtener resultados positivos. La replicación en tejidos de ratón recién nacido o en huevos embrionados puede ser preferible, o incluso esencial, para algunos virus incómodos: sin embargo, la mayor parte de laboratorios clínicos confían en los cultivos de líneas celulares in vitro. y, en consecuencia, la inoculación en animales o huevos se realiza muy raramente fuera de los laboratorios de investigación o de las instituciones de salud pública (Nalonen, 1998). Los cultivos de tejidos celulares se dividen en tres categorías: cultivos primarios, lineas celulares diploides y líneas celulares heteroploides. Los cultivos celulares primarios se preparan a partir del órgano original directamente (como puede ser riñon de mono o de conejo). Las células son separadas individualmente mediante triturado y tratamiento con tripsina, y la mezcla de células resultante se transfiere a tubos de ensayo o "shell-vials", donde las células se unen formando una monocapa confluente. El cultivo de células se recubre con un medio que mantiene su viabilidad, consistente en una solución salina tamponada
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a pH fisiológico que contiene sales minerales, glucosa, aminoácidos, vitaminas y coladores. El medio mínimo esencial de Eagle en solución salina balanceada de Earl o de Hanks es la combinación utilizada más frecuentemente como medio nutritivo para los cultivos celulares: usualmente se le añade una baja concentración de suero letal bovino rico en proteínas y pobre en inmunogtobulinas. con objeto de mantener en buenas condiciones fisiológicas la monocapa de células, pero sin favorecer su proliferación. Las lineas de células diploides son generalmente fibroblastos que derivan de pulmón o de prepucios de recién nacidos, la mayoría de los cuales tienen una dotación diploide de cromosomas normal. Estas células se propagan en un medio de cultivo rico, con suero, y pueden ser subcultivadas de 20 a 50 veces antes de que pierdan su viabilidad; algunos tipos celulares de esta categoría son MRC-5, wl-38 y los fibroblastos procedentes de prepucio. Las líneas de células heteroploides derivan de tumores malignos y son células "inmortalizadas" que pueden ser subcultivadas indefinidamente: tienen un genoma aneuploide y se dividen rápidamente. Las líneas celulares heteroploides más populares son HEp-2 (denvada de un carcinoma laríngeo). HeLa (de un carcinoma cervical) y A549 (también de un carcinoma laríngeo). Los cultivos primarios deben examinarse para comprobar que no están contaminados por virus endógenos. Las líneas diploides y heteroploides deben examinarse periódicamente para comprobar tanto la ausencia de contaminación por micoplasmas como que sigan siendo susceptibles a la infección por virus. Lógicamente, si las células son adquiridas comercialmente. todos estos controles, que implican una gran inversión de tiempo, son responsabilidad de la firma suministradora. Las lineas celulares "híbridas" representan un nuevo concepto: en este caso, la monocapa está constituida por una mezcla de dos tipos celulares distintos capaz de permitir el crecimiento de una amplísima gama de virus. Un ejemplo de esta categoría es el sistema R-Mix (Diagnostic Hybrids) formado por células A549 y células de pulmón de visón. en un medio de mantenimiento que contiene tripsina, y que permite la recuperación de varios patógenos respiratorios, como los virus de la gripe y parainfluenza. VRS y adenovirus. Los virus no infectan con igual afinidad todos los tejidos humanos y también difieren en su capacidad para replicarse en las líneas celulares de los cultivos de tejidos, por lo que para incrementar al máximo las probabilidades de recuperación cada espécimen debe inocularse en diferentes líneas celulares. La Tabla 48-3 muestra una lista de varias líneas de cultivos de tejidos con los virus que son capaces de infectarlas. Todas están disponibles en el comercio y pueden suministrarse en tubos, shell-vials, o en frascos a granel (Fig. 482). Cada laboratorio debe seleccionar las líneas que necesite para cubrir todas sus necesidades, en tunción de los tipos de virus que más frecuentemente se aislan a partir de la población de pacientes que están bajo su responsabilidad, aunque los requerimientos en el número y tipo de cultivos celulares puedan variar para aiustarse a los cambios estacionales en la incidencia de las diferentes infecciones virales. La replicación de los virus en las monocapas de células se pone de manifiesto mediante el examen de la lámina de células con un microscopio invertido de contraste de fases, con objeto de observar las alteraciones citopáticas causadas por la proliferación del virus. Las monocapas de células en tubo tienen una gran versatilidad: una única línea celular puede permitir el crecimiento de varios virus, siempre que cada uno de ellos cause un efecto citopático (ECP) distintivo, o bien
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Detección de antígenos y detección molecular La identificación rápida (menos de un día de espera) de virus por métodos directos es especialmente útil en los casos para los que hay disponible una terapia antivírica específica (p. ej.. en las infecciones causadas por VHS. VVZ. CMV. virus de la gripe o VRS) y cuando existe riesgo de infección nosocomial (como es el caso del virus de la gripe, VRS, rotavirus y VVZ). Los antígenos virales pueden ser detectados con una sensibilidad y especificidad semejantes, tanto por inmunofluorescencia directa (DFA) como mediante enzimoinmunoensayo (EIA). El test DFA tiene la ventaja de que permite observar la celularidad del espécimen, lo que permite establecer fácilmente si la muestra es adecuada (Rossier, 1989). La realización del método DFA requiere una inversión considerable de tiempo y esfuerzo, lo que es un inconveniente importante, ya que implica una carga adicional de trabajo en aquellos laboratorios en los que se procesa un gran número de muestras. El EIA puede ejecutarse de forma mucho más automatizada y la interpretación de los resultados obtenidos con el mismo es menos subjetiva que la de los datos del test DFA, aunque el EIA no permite determinar la calidad de la muestra. Para el método DFA es recomendable utilizar un microscopio equipado con epifluorescencia, y deben Figura 48-2. Ejemplos de dilerent.es tipos de cultivos de tejidos suministrados por fir- realizarse en paralelo, de forma habitual, controles positivos y negativos. La mas comerciales. En los sistemas tradicionales en tubos, la monocapa de células mayor parte de los procedimientos basados en el EIA están adaptados para el crece en uno de los lados de los mismos, y son transportados e incubados en la análisis de muestras individuales, e incluyen tanto el control positivo como el orientación correcta (horizonlalmente) para que el medio de mantenimiento esté negativo incorporados directamente en las placas de un solo uso. Los procesiempre en contacto con la lámina de células. En los tubos shell-vial, la monocapa de dimientos automatizados de EIA para el análisis masivo combinan en un células está adherida sobre un cubreobjetos de vidrio que se encuentra en el fondo del recipiente, junto con un volumen de 2 mi de medio de mantenimiento, y se alma- mismo equipo todos los componentes necesarios para el lavado, lectura espectrofotométrica y procesado de datos. Los controles se realizan indivicenan, transportan e incuban en posición vertical. dualmente para cada ensayo, y la interpretación de los datos de la lectura se lleva a cabo de acuerdo con un valor de corte establecido previamente. algún otro tipo de manifestación característica (hemaglutinación, hemoadsorción, interferencia). Los ECP pueden aparecer entre uno y tres días (en el caso Los métodos de hibridación y amplificación detectan a los virus mediante el del VHS), o pueden tardar de 5 a 20 días en ser detectados (VRS, virus de la reconocimiento de secuencias específicas del genoma de ADN o ARN vírico. varicela-zóster [VVZ], CMV); por tanto, la mayor parte de cultivos deben ser La hibridación ir) situ (HIS) es una técnica directa utilizada en patología quirúrincubados dos semanas, o incluso más. En la técnica que implica la utilización gica para identificar, mediante sondas específicas, el virus del papiloma de cultivos celulares en shell-vials, la lámina de células descansa sobre un humano (VPH), CMV, VHS y parvovirus B19: la especificidad de la misma es cubreobjetos redondo, que se coloca en el shell-vial con la monocapa orientada excelente, aunque su sensibilidad por debajo de los valores óptimos limita, en hacia arriba. El espécimen es inoculado en el recipiente, que es seguidamente gran medida, su aplicación en clínica. Los métodos de amplificación han increcentrifugado para favorecer la adhesión de los virus a las células. Tras un corto mentado la sensibilidad del diagnóstico molecular más allá de los valores que, período de incubación, generalmente de uno a tres días, la monocapa de céluen este contexto, tienen los ensayos para la detección de antígenos y las téclas es analizada mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de nicas de cultivo, mediante la amplificación exponencial de la secuencia oligoantígenos virales específicos (Gleaves, 1985). El cultivo en shell-vials es un pronucleotídica del virus elegida como diana (PCR y desplazamiento de cadena cedimiento idóneo para identificar un único tipo de virus (VHS) o un número limi[SD]), la amplificación de la señal quimioluminiscente (captura de híbridos [HC] tado de virus (VRS y virus de la gripe), y para agentes de crecimiento lento (CMV y ADN ramificado [bADN]), o por amplificación de la sonda o la señal (reacción y VVZ). El material procedente de las lesiones vesiculares causadas por el VHS en cadena de la ligasa [LCR] e Invader). La amplificación por las técnicas de es un candidato excelente para intentar el aislamiento del virus mediante la técPCR y bADN se ha convertido en el estándar de elección para la monitorizanica del cultivo en shell-vials, la sensibilidad roza el 100% y el tiempo de espera ción cuantitativa del VIH y el virus de la hepatitis C (VHC). La PCR es el para los cultivos negativos se reduce de siete días a tan sólo uno. Los shell-vials método preferido por su gran sensibilidad para el diagnóstico de la meningitis tienen una eficiencia comparable o incluso superior a la del método en tubo para por enterovirus y la encefalitis por VHS (Tang, 1998: Read, 1999); la detección la recuperación de CMV a partir de orina, aunque se recomienda realizar un culdel virus Epstein-Barr (VEB) en el liquido cefalorraquídeo mediante PCR es un tivo suplementario en tubo a partir de una muestra de sangre periférica para diagnóstico positivo de linfoma del sistema nervioso central (SNC) en pacienaumentar las posibilidades de aislamiento de este tipo de virus. En la Tabla 48tes con sida. La PCR cuantitativa de CMV en fluido bronquioalveolar o en san4 se indican diversas situaciones en las que la utilización de los cultivos en shellgre permite predecir una neumonía viral en pacientes sometidos a un trasvials está recomendada para la detección de virus. plante de médula ósea. La automatización de los métodos de amplificación, con la incorporación de estándares internos para detectar inhibición y de protocolos experimentales configurados para evitar la contaminación cruzada de amplicones, ha acortado los plazos de obtención de resultados y reducido los errores de interpretación debidos a los falsos positivos y negativos. Aunque todavía no hay una gran cantidad de reactivos disponibles en el mercado, hay varios sistemas para la identificación de virus patógenos comunes basados en sondas génicas que están actualmente en fase de desarrollo. La visualización directa de los viriones mediante microscopía electrónica (ME), utilizando tinción negativa con ácido fosfotúngstico o fijación con osmio seguida de tinción con acetato de uranilo. es un método empleado para detectar aquellos virus que no crecen en las lineas celulares estándar o para una demostración rápida de la presencia de virus en una muestra. La ME ha sido una técnica de gran ayuda, particularmente para identificar el agente causal en casos de gastroenteritis vírica: rotavirus. adenovirus intestinales, virus Norwalk, astrovirus y calicivirus se multiplican muy pobremente, o no lo hacen en absoluto, en los cultivos de células en monocapa. pero tienen características ultraestructurales distintivas que permiten su identificación al microscopio electrónico.
CAPÍTULO 48 Tabla 48-5
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Aplicaciones de la serologia para el diagnóstico de las infecciones virales
Aplicación
Virus
Demoslració inmunidad preexistente Método diagnóstico pretendo por su relación coste/eficacia
IgG VHA, VHB rubéola, sarampión, paperas. WZ IgM VHA, VHB. VEB. sarampión. paperas, rubéola, parvovirus Bt9. arbovirus IgG: VIH. VHB, VHB. VHC, VLHT Síndrome de Revé (influenza, WZ) poslmlecciOn PEES (sarampión) IgG: VHB. VHC. VIH. CMV. VLTH
Diagnóstico de Control de la infecí hemoderivados
VHA = virus de la hepatilis A: VHB = virus de la hepatitis B: VHC = virus de la hepatitis C VEB = virus de Epstein-Barr; VIH = virus de la inmunodeliciencia humana VLTH = virus de la leucemia humana de células T, PEES = panencela lilis esclerosante subaguda. Pora ver el signilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 y 48 4
Serologia vírica El diagnóstico serológico de las infecciones virales representa una alternativa atractiva, ya que las muestras de suero pueden obtenerse, transportarse y almacenarse con gran facilidad. La serologia viral tiene dos ámbitos de aplicación principales: diagnosticar una infección reciente y poner de manifiesto la existencia de inmunidad previa. El diagnostico de infección actual o reciente requiere la detección de IgM especificas frente al virus en una muestra de suero obtenida durante la lase aguda de la infección o durante la observación de un incremento de cuatro veces o superior en título de IgG específicas entre dos muestras de suero, una tomada durante la fase aguda y otra en la de convalecencia. Las IgM
Tabla 48-6
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INFECCIONES VÍRICAS
especificas están presentes en sangre generalmente durante la primera semana de la infección primaria, para hacerse después prácticamente mdetectables entre el pnmer y tercer mes siguientes: el enzimoínmunoensayo es más sensible y es capaz de detectar IgM persistentes aproximadamente durante el doble de tiempo del que es posible hacerlo con la inmunofluorescencia. Se puede incrementar la sensiblidad y especificidad de los ensayos para detectar IgM eliminando del suero el factor reumatoide y las IgG, para evitar la competición de estas últimas con las IgM con los antigenos virales. Las IgG especificas aparecen entre una y dos semanas después de la infección primaria, y su titulo va aumentando hasta alcanzar un pico entre las cuatro y las ocho semanas para comenzar a bajar a partir de este momento, aunque pueden ser detectadas oe forma indefinida. La respuesta inmune secundana que aparece como consecuencia de una reinfección o reactivación vírica da lugar a un perfil serológico diferente: las IgM pueden aparecer transitonamente. con un titulo baio, mientras que el título de IgG aumenta muy rápidamente, alcanzando el peo a unas concentraciones más altas que las observadas durante la respuesta primana Por supuesto, estos son patrones o perfiles generales: la intensidad, especificidad y tipo de respuesta (clase de mmunoglobulina producida) están condicionados por el tipo del virus infectivo, el sitio donde se ha producido la infección y la situación inmunológíca del paciente. En las infecciones congémtas, los anticuerpos (IgG) matemos pasan a la circulación fetal a través de la placenta, aunque cualquier otra clase de mmunoglobulinas (IgM, IgA o IgE) presentes en la sangre del leto, del cordón umbilical o del recién nacido, son producidas por el feto o por el neonato en respuesta a una infección primana perinatal La serologia puede ser utilizada como un respaldo a los métodos de detección directa y de cultivo de virus, especialmente en el caso de que la calidad del espécimen o las condiciones de transporte del mismo no hayan sido las más adecuadas. Si durante el primer examen del paciente no ha existido nada que hiciese sospechar la existencia de una infección vírica, la serologia puede ser el
Obtención de muestras para el diagnóstico de los s í n d r o m e s virales c o m u n e s
Síndrome Bronquiolitis/bronquitis
Gripe Neumonía
Virus VRS. parainfluenza 1,3, adenovirus. influenza A y B Influenza A y B
E s p é c i m e n preferido y condiciones de transporte
Validación de los e s p e c í m e n e s
SNF LBA transportar inmediatamente en hielo
Células columnares o macrófagos alveolares
DFA. EIA cultivo
SNF o hisopado de garganta en MTV. esputo. LBA. transportar inmediatamente en hielo SNF. LBA. hisopado de garganta en MTV: transportar inmediatamente en hielo Hisopados o exfoliados de la conjuntiva en MTV. transportar inmediatamente en hielo Fluido de vesículas/células en MTV, frotis secados al aire, transportar inmediatamente en hielo Fluido de vesículas/células en MTV, frotis secados al aire; transportar cuanto antes LCR", hisopado de garganta, heces. transportar inmediatamente
Células columnares o macrólagos alveolares
DFA. EIA, cultivo
Células columnares o macrófagos alveolares
DFA, EIA. cultivo
Células epiteliales
DFA, EIA. cultivo
Células epiteliales
DFA cultivo
Células epiteliales
Cultivo. DFA
Exantema vesicular
VRS. parainfluenza 3, influenza A y B, adenovirus VHS. adenovirus. clamidias. enterovirus. WZ. sarampión VHS. WZ. enterovirus
Infección genital
VHS
Meningitis
Enterovirus. VHS. paperas WZ. adenovirus. VLCM, sarampión VHS, arbovirus, Biopsia de tejido cerebral fresco. Enterovirus, rabia LCR. suero (arbovirus); transportar inmediatamente Rotavirus, adenovirus Heces frescas (heces, pañales El hisopo debe estar (40.41), calicivirus. o hisopados rectales), cubierto más de un Coronavirus, asirovirus. transportar cuanto antes 75% con las heces virus Norwalk CMV, VHS. WZ, Orina (en hielo), sangre (a temperatura adenovirus ambiente), LBA, biopsia pulmonar (en hielo); transportar inmediatamente
Conjuntivitis
Encefalitis Enteritis
Infección viral diseminada
Pruebas más útiles
PCR. cultivo PCR. cultivo. DFA. serologia EIA, látex. ME
Cultivo, prueba cuantitativa para CMV. PCR cuantitativa (en investigación)
SNF = secreción nasofaríngea: LBA = lavado bronquioalveolar. DFA = fluorescencia directa con anticuerpos; EIA = enzimoínmunoensayo; MTV = medio de transpone para virus; VLCM = virus de la linlocoriomenmgitis LCR = liquido cefalorraquídeo. PCR = reacción en cadena de la polimeíasa; ME = microscopía electrónica Para ver el signilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 4 8 - 3 y 4 8 - 4 'Los cultivos a partir de muestras de LCR pueden ser positivas en el caso de neonatos, pero raramente lo son en el caso de adultos con encefalitis causada por el VHS.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
único procedimiento diagnóstico disponible, una vez se haya descartado el empleo de otras alternativas analíticas como son el cultivo y la detección de antigenos o ácidos nucleicos vírales. La serología también puede ayudar a clarificar los resultados obtenidos mediante la técnica del cultivo; por ejemplo, el aislamiento de enterovirus a partir de heces en un paciente con encefalitis cobra una importancia mayor si el título de anticuerpos frente a estos virus aumenta. La serología es la elección lógica para el diagnóstico de infecciones causadas por virus que requieren el empleo de métodos complejos para su aislamiento (VEB. VIH, herpesvirus humanos [HVH-6). o inoculación en animales (arbovirus. algunos virus Coxsackie A), o de aquellos cuya manipulación implica riesgos biológicos graves (VIH, arbovirus). Para algunos tipos de infecciones, la serología es una alternativa más rápida y barata; tanto el sarampión como las paperas pueden diagnosticarse mediante el aislamiento del virus responsable, aunque las IgM específicas están presentes en el suero del paciente, a partir del tercer día desde el comienzo de la enfermedad, y su detección requiere menos tiempo y expenencia que el diagnóstico mediante cultivo. Los virus pueden incluso no ser detectados cuando comienzan a manifestarse los síntomas de la infección: por ejemplo, los arbovirus pueden desaparecer, a menudo, del líquido cefalorraquídeo en el momento en el que el paciente desarrolla la encefalitis, lo que hace que la serología sea el método diagnóstico de elección en este caso. Frecuentemente, en las infecciones con un pródromo prolongado puede existir un título detectable de anticuerpos cuando se manifiestan los síntomas (VEB y mononucleosis). Las situaciones clínicas específicas para el diagnóstico serológico están resumidas en la Tabla 48-5.
Obtención y transporte de las muestras El éxito en cualquier diagnóstico de infección viral depende de que la muestra sea recogida y transportada en condiciones adecuadas. El laboratorio debe establecer unas directrices realistas para una óptima manipulación del espécimen y una política de rechazo de muestras inapropiadas. y hacer circular esta información entre el personal médico y las unidades de enfermería (Tabla 48-6). Las muestras para cultivo y detección de antígenos y ácidos nucleicos virales deben obtenerse durante la fase aguda de la enfermedad, cuando la liberación de los virus es mayor; la recuperación de los virus es esporádica y poco fiable durante la fase de convalecencia.
pado con epilluorescencia para los ensayos de DFA e IFA y espacio de almacenamiento a -70 C y a -20 C. para reactivos y especímenes Todos los equipos y productos esenciales para la identificación de los virus más comunes están disponibles en el mercado. Los cultivos celulares son alimentados con una solución salina balanceada (SSB; puede utilizarse tanto la Hanks como la de Earle). a la que se añaden sustancias tampón. suero y una mezcla nutritiva como el medio mínimo esencial (MME) de Eagle. El MME de Eagle es una mezcla definida de aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, cofactores y el resto de requerimientos nutricionales que necesitan las células en la monocapa. El suero bovino fetal (SBF) es el suplemento nutricional y hormonal que con mayor frecuencia se añade al MME; se añade entre un 5% y un 10% de SBF en el medio de crecimiento para el cultivo de tejidos y un 2% en el medio de mantenimiento. Los mayores problemas del SBF son la variabilidad que presenta de lote a lote y su alto coste: como alternativa más económica al SBF se puede utilizar suero de ternera enriquecido (OmniSerum), que además tiene una composición mucho mas estable y funciona aceptablemente para cultivar las líneas celulares utilizadas para el aislamiento del VHS y otros tipos de virus. En el laboratorio también debe existir una reserva de tripsina (solución al 0.25%). tampón fosfato salino (PBS). soluciones de glutamina y bicarbonato de sodio, medio de transporte para virus, mezclas de antibióticos para descontaminar los especímenes y ácido fosfotúngstico al 2% para microscopía electrónica. a
Los laboratorios que toman a su cargo por primera vez los sen/icios de diagnóstico de infecciones virales deberían comenzar su actividad con pruebas sencillas, como el cultivo de VHS y la detección de antígenos virales. Durante los meses de invierno se pueden ir añadiendo otros protocolos analíticos para el virus de la gripe. VRS y rotavirus. La identificación de CMV es prioritaria en aquellos hospitales en donde existen pacientes inmunodeprimidos. En principio, puede considerarse el aislamiento de enterovirus durante el verano y el otoño. A medida que la experiencia del personal técnico vaya incrementándose se pueden ir incorporando las técnicas necesarias para el cultivo y detección de antígenos de VVZ, adenovirus y virus de la parainfluenza.
Síndromes clínicos infecciosos causados por virus
Un enfoque habitual en el diagnóstico de laboratorio consiste en separar las enfermedades virales de acuerdo con síndromes clínicos específicos, Un medio de transporte para virus (MTV) contiene una solución salina tamaconsejando al médico que asocie un grupo, lógico pero limitado, de virus con ponada. un estabilizador proteico, un indicador de pH y antibióticos para inhibir la patología que sufre el paciente. El laboratorio debe solicitar información el crecimiento indeseado de bacterias y hongos contaminantes. Se han desespecífica sobre el paciente (datos demográficos), el diagnóstico clínico y los arrollado medios de transporte muy versátiles, que sirven tanto para virus como posibles agentes virales asociados a la patología, con objeto de que el trabajo para clamidias y micoplasmas (M4. Flextrans): la mayor parte de formulaciones analítico pueda racionalizarse y enfocarse hacia la utilización de la prueba pueden conseguir estabilizar a los virus durante 24 horas como mucho (Johnson. que sea más rápida y eficiente y rinda los mejores resultados. En este capi1990). Todas las muestras, excepto las de sangre, deben transportarse y almatulo se analizarán las siguientes enfermedades virales: cenarse a 4'C hasta el momento de proceder a su análisis. A veces puede ser Infecciones herpéticas mucocutaneas. inevitable tener que transportar el espécimen a temperatura ambiente, aunque el Síndromes respiratorios en niños y adultos. clínico debe ser consciente de los efectos negativos que esta circunstancia Mononucleosis infecciosa. puede tener en la recuperación del virus. Las muestras de sangre para el aislaInfecciones congénitas y neonatales. miento de virus deben mantenerse a temperatura ambiente todo el tiempo. Los Infecciones virales del sistema nervioso central. cultivos deben realizarse el mismo día en el que las muestras lleguen al laboraExantemas e infecciones intestinales en niños. tono, preferiblemente dentro de las 36 horas siguientes al momento de la recoHepatitis vírica e infección por VIH gida; al menos debe programarse una sesión de inoculación de cultivos durante Infecciones víricas en el huésped inmunocomprometido. los fines de semana. Las muestras pueden congelarse a -70 C sólo como último recurso; las muestras de sangre y orina y los especímenes respiratorios para el INFECCIONES HERPÉTICAS MUCOCUTANEAS aislamiento de CMV y VRS. respectivamente, no deben congelarse. S
Equipos y material La mayor parte de los equipos utilizados en virología son relativamente baratos y, a menudo, están disponibles en las secciones de microbiología e inmunologia de los laboratorios. Para la inoculación de los cultivos, y siempre que los mismos vayan a ser manipulados, debe utilizarse una cabina de flujo laminar de clase II para proteger al personal técnico de los aerosoles infectivos y reducir la contaminación accidental de los cultivos. También debe encontrarse disponible una centrifuga adaptada para acomodar los shell-vials. Asimismo son necesarios incubadores para mantener las lineas celulares no inoculadas e incubar los cultivos inoculados; los incubadores deben estar equipados, a ser posible, con un dispositivo que permita instalar un tambor giratono en su interior. Finalmente, es necesario disponer de un microscopio invertido con contraste de fases para identificar los ECP en las monocapas de los cultivos celulares, un microscopio equi-
La familia Herpesviridae contiene dos virus que tradicionalmente producen infecciones en la piel y en las membranas mucosas del cuerpo: el VHS y el VVZ. Ambas infecciones son muy comunes, y aunque no ponen en peligro la vida, el hecho de que el tratamiento de las mismas con aciclovir sea muy efectivo ha incrementado la demanda de diagnósticos rápidos, especialmente en el caso del VHS (Corey. 2000). El VVZ se describirá más adelante en el apartado de Exantemas virales. El VHS es ubicuo e infecta a lodos los grupos raciales humanos a nivel mundial. Las dos cepas del VHS. el serotipo 1 y el serotipo 2. comparten muchas características biológicas y moleculares e infectan preferentemente a las células epiteliales escamosas; sin embargo, cada una de ellas tiene un perfil antigénico distinto y una epidemiología un tanto diferente. El VHS1 es altamente infeccioso y se transmite por la saliva para infectar la boca, la faringe, los labios y la piel de la cara. Las lesiones pueden aparecer, ocasionalmente, en la piel
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INFECCIONES VÍRICAS
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Figura 48-3. Esquema del protocolo experimental para el cultivo del VHS mediante el método tradicional en tubo (izquierda) y el sistema shellvial (derecha). expuesta de los combatientes de lucha libre o en las manos del personal médico tras un contacto directo con saliva infectada. La mayor parte de las infecciones por VHS1 se producen antes de la pubertad, especialmente en individuos pertenecientes a grupos con un nivel socioeconómico baio. A menudo la infección primaria es asintomática. aunque una minoría significativa de infectados tienen fiebre y desarrollan una gingivoeslomatitis dolorosa (Kuzushima. 1991). El VHS1 infecta las células del ectodermo y. a medida que el virus se replica en el núcleo, las células pierden su integridad citoplasmática. pierden líquido y se separan unas de otras, formando una vesícula. Las bacterias de la microbiota de la piel y las mucosas transforman las vesículas en pústulas, que terminan por ulcerarse cuando las células epiteliales dañadas se lisan por completo. Por lo general, las lesiones herpéticas curan sin dejar cicatriz a medida que se van regenerando las capas de la epidermis. La respuesta inmune trente a la infección por VHS1 implica la actuación de las células natural killer (NK), linlocitos T citotóxicos. y la producción de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, ni los mecanismos de la inmunidad humoral y celular son capaces de impedir la migración del VHS a lo largo de los nervios sensoriales hasta los ganglios trigéminos, donde persiste por tiempo indefinido, en un estado durmiente, en el núcleo de las neuronas (Straus. 19891. Esporádicamente, el VHS se reactiva y viaja de vuelta a través de los axones neurosensonales hasta llegar a la boca y la piel, donde vuelve a replicarse otra vez en el epitelio escamoso. La mayor parte de las infecciones recurrentes son asinlomáticas o producen vesículas que sólo tienen importancia desde el punto de vista estético. Sin embargo, en los casos en los que existe un problema grave en los mecanismos de la inmunidad celular (enfermos de sida o pacientes trasplantados), las inlecciones recurrentes por reactivación del virus pueden ser graves e incluso látales. La encefalitis es otra forma gravísima, aunque poco frecuente, de infección por VHS1. Estas dos complicaciones se describirán más adelante, en otras secciones de este capitulo. La infección por VHS2 tiene lugar a nivel del epitelio escamoso de la mucosa del aparato genital, se transmite por contacto sexual directo y se ha convertido en un grave problema de salud pública en los últimos 30 años Millones de americanos se encuentran infectados en la actualidad, y se estima que cada año
aparecen 500.000 casos nuevos. La recuperación del VHS2 a partir de niños es muy rara y generalmente suscita la sospecha de que pueda ser consecuencia de un abuso sexual; sin embargo, con el comienzo de la adolescencia la seroprevalencia aumenta de forma constante hasta la madurez, siendo proporcional al número de contactos o compañeros sexuales (Fleming. 1997). La prevalenoa del VHS2 en Estados Unidos es del 22%: en individuos de 13 o más años, la seropositividad en relación con la edad ha aumentado un 30% desde 1980. El
Figura 48-4. Cultivo en monocapa de células de riñon de conejo, que presentan ECP debidos a la multiplicación del VHS. Las células de riñon de mono tienen, habitualmente, una forma poligonal y se encajan lateralmente unas con otras para formar un mosaico celular continuo. Las células infectadas por el VHS en este cultivo de tres días exhiben una forma redondeada e hinchada, y varias células adyacentes se han fusionado para formar sincitios celulares gigantes. Las zonas vacias en la preparación corresponder a aquellas áreas de la monocapa del cultivo en donde las células infectadas han muerto y se han lisado (aumento: x 200: microscopía de contraste de fases).
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 48-5. Monocapa de fibroblastos MRC-5 en s/iefl-wálque muestra la presencia de antigenos del VHS en el citoplasma y núcleo de las células tras 16 horas de incubación. El aspecto de la monocapa de células es normal, y los ECP característicos aún no son detectables (aumento: x 250: tinción DFA para antígenos del VHS) VHS2 produce un patrón de infección primaria y recurrente, con lesiones mucocutáneas semejantes a las que se observan con el VHS1. El virus se encuentra latente en los ganglios neurales sacros, y la reactivación se produce con una frecuencia del doble, al menos, de la observada en el caso del VHS1.
Aislamiento del virus del herpes simple mediante cultivo celular Los especímenes tomados con una torunda y depositados en medio de transporte (MTV) con antibióticos pueden conservarse entre 12 y 24 horas a temperatura ambiente (22"C), con una reducción mínima en la viabilidad del virus. Los especímenes deben sembrarse en los cultivos celulares en el momento que llegan al laboratorio, aunque pueden almacenarse en refrigeración durante una noche, si así fuese necesario. El aislamiento del VHS es todavía el mejor test de diagnóstico y es más sensible que cualquier otro método basado en la detección de antígenos virales o hibridación con sondas de ácidos nucleicos específicas; sin embargo, las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos son claramente superiores al cultivo. El VHS crece excepcionalmente bien en una amplia variedad de líneas celulares: los fibroblastos humanos (WI-38. MRC-5. prepucio) son una de las alternativas más populares, aunque otras líneas celulares como HeLa, Vero y HEp-2, así como cultivos celulares de rabdomiosarcoma (RD), pulmón de conejo y pulmón de visón, también permiten un buen crecimiento del virus. Los cultivos primarios de riñon de mono (PMK) no son adecuados y. en consecuencia, no deben utilizarse. Generalmente se inoculan dos tubos con distintas líneas celulares (uno con RK y otro con MRC-5): el procedimiento se resume en la Figura 48-3.
un tambor giratorio (Mavromoustakis. 1988). Aquellos cultivos inoculados a partir de muestras de lesiones genitales, en los que no es posible detectar los ECP característicos del VHS tras cinco/siete días de incubación, pueden considerarse negativos: debido a que también pueden recuperarse otros virus (p. ej., VVZ. adenovirus. enterovirus) a partir de ciertas localizaciones anatómicas no relacionadas con el aparato genital, como la boca, la córnea o el cerebro, estos cultivos deben incubarse durante dos semanas, al menos. Las células individuales infectadas por el VHS se hinchan y adquieren forma redondeada, y el daño celular se extiende rápidamente por toda la monocapa del cultivo, El VHS2 induce frecuentemente la formación de sincitios. debido a la coalescencia de las membranas plasmáticas de las células infectadas (Fig. 48-4). Este ECP es característico, aunque no el único, del VHS: un técnico con poca expenencia puede interpretar incorrectamente como ECP provocados por VHS las alteraciones o cambios causados por otros virus, por toxinas bacterianas o incluso por tricomonas. por lo que se recomienda confirmar los resultados de la observación con una tinción DFA. Para ello, la monocapa de células es retirada, transferida a un portaobjetos de vidrio, lijada con acetona y seguidamente teñida con anticuerpos monoclónales o policlonales frente al VHS (Lipson. 1991). Los anticuerpos monoclonales específicos de tipo pueden distinguir entre VHS1 y VHS2 mediante el test DFA, aunque el tiempo y los reactivos adicionales necesarios para ejecutar la prueba hacen que se incremente el coste de la misma, añadiendo, por lo general, muy poca información a los datos del examen clínico. El serotipado debe reservarse para aquellos casos en los que existan discrepancias de criterio entre médicos o manifestaciones clínicas ambiguas. La gran cantidad de peticiones de cultivo para VHS conducen al empleo de la técnica de cultivo en shell-vials. mediante la que es posible detectar los antígenos virales en la monocapa de células por medio del test DFA tras un día de incubación solamente (Gleaves, 1985) (Fig. 48-5). La detección del VHS en los cultivos de los shell-vials empleando enzimoinmunoensayo o hibridación in situ, es una alternativa igualmente sensible y especifica (Espy. 1988; Patel, 1991; Michalski, 1986). También se han utilizado, aunque con resultados variables, algunas adaptaciones del método de cultivo favorecido por centrifugación que utilizan placas de microtitulación en lugar de tubos (Woods, 1988; Ziegler, 1988)
Detección directa del virus del herpes simple La preparación de Tzanck consiste en realizar un frotis directo del contenido de una vesícula herpértica. que se tiñe por el método de Giemsa para revelar la presencia de células gigantes epiteliales multinucleadas (sincitios) y de inclusiones intranucleares. Estos hallazgos no son específicos de una infección por VHS; en este contexto, también se han visualizado cambios celulares idénticos, consecuencia de la infección por VVZ (en vesículas de la varicela y del herpes zóster). La preparación de Tzanck es positiva en el 67% de las lesiones herpéticas, cuando éstas se encuentran en fase de vesícula; a pesar de la rapidez con la que se ejecuta este procedimiento, la baja sensibilidad del mismo limita su utilidad práctica.
La inmunotinción de los frotis directos con anticuerpos frente al VHS, marcados con fluoresceína o peroxidasa, elimina la posibilidad de confusión con el WZ y permite la detección de antígenos virales incluso en ausencia de sincitios y en células que no muestran, todavía, las inclusiones nucleares. Sin embargo, cuando se compara con el método del cultivo, el test DFA tiene, como El VHS se replica a gran velocidad y los ECP aparecen entre el segundo y termínimo, entre un 20% y un 30% de error por falsos negativos (Lafferty, 1987; cer día, después de la inoculación, especialmente si los tubos son incubados en Moseley, 1981) (Tabla 48-7). Todos los resultados negativos en el test de detección directa deben ser considerados potencialmente como falsos negativos, que Tabla 48-7 Sensibilidad (%) de las técnicas de aislamiento deben ser validados mediante cultivos realizados en paralelo. Por otro lado, el mediante cultivo, preparación de Tzanck (frotis teñidos diagnóstico por PCR del herpes mucocutáneo genital tiene entre un 20% y un por el método de Giemsa), inmunofluorescencia directa 30% más de sensibilidad comparado con el método del cultivo (Slomka, 1998). ( D F A ) y tinción con inmunoperoxidasa (IP) a partir de La PCR es ocho veces más sensible que el cultivo para la identificación de las lesiones del herpes simple infecciones asintómaticas (Cone, 1994). La amplificación de señal mediante Estadio Sensibilidad (%) del m é t o d o captura de híbridos para detectar el ADN del VHS también es superior al cultivo d e la como método diagnóstico (Cullen. 1997). En su formato de ensayo múltiple Tzanck DFA IP Cultivo lesión para la evaluación de la enfermedad genital ulcerosa, la PCR mostró un 100% 67 76-87 76 Vesícula 70-95 de sensibilidad para la detección del VHS. asi como una mejora sustancial en 58-67 75 Pústula 67-83 55 el diagnóstico del chancroide y de la sífilis primaria (Orle, 1996). 32-67 30-38 55 Úlcera — Costra 17 10 Diagnóstico serológico Los valores mostrados son una combinación de los indicados por Pindak (1986). Langenberg (1988) y Mavromoustakis (1988) en sus respectivos trabajos
Debido a que existe una homología antigénica considerable entre los serotipos 1 y 2 del VHS, es necesano utilizar antigenos purificados que sean especí-
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
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VRS
ticos de serotipo en los ensayos serológicos. Utilizando antígenos selectos de la envoltura de ambos serotipos del VHS y los métodos de ELISA o de transferencia electrolorélica {Western ¡mmunoblotting) se puede evitar la detección de anticuerpos con reactividad cruzada (Ahsley, 1988; Lee. 1986). Hasta el momento, sólo existe un sistema comercial de ELISA que ha mostrado una sensibilidad, especificidad y capacidad discriminatona aceptables (Ahsley. 1998). Sin embargo, un estudio longitudinal en adultos jóvenes seropositivos puso de manifiesto que la pérdida de reactividad era un comportamiento habitual, tanto en los ensayos comerciales como en los métodos de laboratorio (Schmid, 1999). El error debido a los falsos negativos conduce a una subestimación de los datos sobre seroprevalencia y limita, también, la utilidad clínica práctica del serodiagnóstico. En cualquier caso, una vez que estén disponibles los métodos que permitan llevar a cabo una serotipificación precisa, su aplicación más importante será la determinación de anticuerpos específicos frente al VHS2 en mujeres embarazadas para establecer el riesgo de transmisión neonatal (Brown. 1991).
INFECCIONES VÍRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO Cada año se producen en Estados Unidos varios millones de visitas ambulatorias y hospitalizaciones debido a las infecciones del tracto respiratorio, que en su mayoría están causadas por virus. Las infecciones van desde resfriados irrelevantes hasta patologías graves como la laringotraqueobronquitis (crup), la bronquiolitis y la neumonía. Los niños y adultos sanos tienen el nesgo potencial de enfermar durante las epidemias anuales de crup, bronquiolitis y gripe y la morbilidad y mortalidad asociadas a estas infecciones pueden ser drásticas. El brote de gripe durante 1998-1999 en Estados Unidos tuvo sólo una gravedad moderada, pero el porcentaje de muertes debidas a la neumonía asociada a la gripe alcanzó el 8,8% (Update. 1999)
Resfriados y faringitis son tratados clinicamente sin necesidad de realizar pruebas de laboratorio; sin embargo, el número de peticiones de ensayos para la determinación de antígenos o de cultivos para el diagnóstico de las infecciones virales del tracto respiratorio inferior puede sobrepasar fácilmente el de las pruebas equivalentes para la detección del VHS (Tabla 48-1 ). El virus de la gripe y el VRS son los patógenos más importantes en adultos: en niños pequeños, la mayor incidencia corresponde al VRS, virus de la parainfluenza, virus de la gripe y adenovirus.
Gripe (Influenza) Los virus de la gripe A y B causan anualmente, durante los meses fríos, brotes de enfermedades febriles, agudas, del tracto respiratorio superior e inferior, que están acompañadas de una serie de manifestaciones sistémicas. Por lo general, la influenza A es más común y produce una enfermedad más grave que el tipo B. Debido a que los antígenos virales experimentan cambios determinados por mutaciones puntuales o por recombinación de fragmentos de ARN vírico y humano, los anticuerpos producidos durante episodios anteriores de gripe proporcionan una protección escasa durante brotes subsiguientes de la infección. La gripe es altamente contagiosa, y se extiende de persona a persona a través de aerosoles o por contacto con las manos contaminadas (Troanor. 2000). El virus de la gripe se multiplica rápidamente en las células columnares ciliadas de la fannge y el árbol traqueobronquial. La fiebre suele manifestarse de manera brusca: la necrosis del epitelio respiratorio causada por el virus provoca dolor de garganta y tos, aunque otras manifestaciones asociadas, como mialgias, dolor de cabeza y un estado generalizado de debilidad, son, por lo general, más importantes y graves que los problemas respiratonos. Si no hay complicaciones, la enfermedad remite en cuatro o cinco días. Cada año se producen aproximadamente 100.000 hospitalizaciones y 20.000 muertes en
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MICROBIOLOGÍA MEDICA
Estados Unidos como consecuencia de la gripe. En un porcentaje pequeño de afectados, la necrosis viral aguda se extiende hasta las células que recubren los bronquios, causando una forma grave de neumonía potencialmente fatal (Yeldandi. 1994). Sin embargo, la mayor parte de fallecimientos relacionados con la gripe están provocados por una neumonía secundaria de origen bacteriano, que aparece como consecuencia de la colonización del epitelio de la mucosa respiratoria dañado por el virus, por Staphylococcus aureus, Streplococcus pneumoniae, Haemophilus inlluenzae y otras bacterias presentes en la orólaringe. La infección bacteriana es más frecuente en pacientes con una enfermedad pulmonar crónica o fallo congestivo cardíaco preexistente. Muy raramente aparecen otras complicaciones asociadas a la gripe, como miocarditis, meningoencefahtis, síndrome de Reye y síndrome de Guillain-Barré. La gripe se diagnostica mejor durante los dos o tres primeros días de la enfermedad, cuando se produce una máxima liberación de virus. El cultivo representa el método diagnóstico más sensible, siendo los especímenes más adecuados para este fin un aspirado de secreciones nasofaríngeas (SNF), esputo obtenido mediante expectoración y material recogido de la garganta con hisopo. El cultivo en shell-vials es una alternativa que ofrece una excelente sensibilidad y permite obtener los resultados tras un periodo de incubación de uno o dos días (Beekmann, 1996; Leonardi, 1994), lo que puede afectar positivamente al tratamiento del paciente y a la prevención de los contagios por contacto. El cultivo medíanle las tradicionales monocapas celulares puede tardar entre dos y siete días en ofrecer resultados. La detección de antígenos del virus mediante DFA es un procedimiento útil para realizar un diagnóstico rápido; el aspirado de SNF contiene abundantes células columnares epiteliales infectadas por el virus, por lo que representa el tipo de espécimen preferido para este fin. La sensibilidad del ensayo varia entre un 77% y un 93% para la detección del virus de la influenza A y entre un 70% y un 80% para la influenza B; la especificidad es superior al 95% y está fuertemente condicionada por la experiencia del observador y la calidad de la muestra. El material recogido de la garganta con hisopo contiene pocas células columnares y, por tanto, no es adecuado para la tinción DFA. Los enzimoinmunoensayos comerciales tienen una buena sensibilidad para detectar antigenos virales, si se utilizan con aspirados de SNF como muestra; la sensibilidad es menor si el espécimen utilizado es el material recogido con hisopo de la garganta del paciente (Leonardi, 1994). La delección de un antígeno específico de los tipos A y B del virus (neuraminidasa) mediante inmunoensayo óptico tiene una buena sensibilidad diagnóstica que oscila entre un 80% cuando se utiliza el aspirado de SNF y un 83% con espulo obtenido por expectoración (Mulford. 1999).
Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial El VRS es la principal causa de infección grave en el tracto respiratorio inferior en niños y jóvenes (Anderson, 1990; Hall, 1998). El VRS se transmite fácilmente mediante gotas de aerosoles, y los brotes aparecen de forma recunente cada invierno en Estados Unidos (Fig. 48-6). La inmunidad generada por el huésped frente al virus es incompleta y de corta duración, siendo frecuentes las reinfecciones, cada vez con manifestaciones más leves, a lo largo de la vida, aunque el VRS puede causar también enfermedades pulmonares graves en los ancianos y los individuos inmunocomprometidos (Pohl. 1992; Hamngton. 1990). El VRS infecta, al igual que el virus de la gnpe. las células columnares epiteliales, desde la nasofannge hasta los bronquiolos más distales: la forma más grave de presentación de la infección es la bronquiolitis, especialmente en niños de menos de un año. cuyas vías respiratorias, poco desarrolladas, son obstruidas fácilmente por las células epiteliales necrosadas y los residuos originados como consecuencia del proceso inflamatorio. La obstrucción de los bronquiolos produce un atrapamiento del aire e hipoxia, que puede ser lo suficientemente grave como para necesitar hospitalización. Las infecciones más graves por VRS se producen en niños prematuros, en niños que tienen una patología cardiopulmonar subyacente o una inmunodeficiencia y en receptores de trasplantes. Aproximadamente un 1% de los niños con bronquiolitis por VRS hospitalizados mueren por hipoxia, fallo cardíaco accesorio o sobreinfección bacteriana. Es importante un diagnóstico rápido del VRS en los pacientes hospitalizados para instaurar medidas de control con objeto de impedir la infección nosocomial (uso de mascarillas y guantes: aislamiento de los pacientes con diagnóstico positivo) y para que comience a administrarse inmediatamente
Tabla 48-8
R e c u p e r a c i ó n de virus a partir de secreciones nasofaríngeas (SNF): relación con la calidad del e s p é c i m e n *
Muestra (N = 2.173)
Número de % de muestras a partir muestras de las que se logró la recuperación de virus de SNF
SNF con <1 células columnares por campo (observación a x 250)
243
6
SNF con 22 células columnares por campo (observación a x 250)
1 930
27
• Datos del Lulhoran General Hospital, desde enero 3e 1985 a mayo de 1990. un 11% de especímenes tenían insuficientes células y ueron obtenidos de nuevo
ribavirina por vía mtranasal o inmunoglobulmas frente al VRS por vía intravenosa (Ottolmi. 1997: Hall. 1998). El VRS es particularmente frágil y lábil, y puede inactivarse si la muestra tarda un cierto tiempo en llegar al laboratorio. Una vez inoculado en los cultivos celulares, se replica lentamente, y los ECP aparecen tardíamente; el tiempo necesario para el aislamiento oscila entre 3 y 10 días (Arens, 1986; Tristram, 1999). La centrifugación de la muestra en cultivos celulares en shellvials incrementa la recuperación del VRS y acorta a dos días el tiempo necesario para el aislamiento (Beekmann, 1996; Pedneaull, 1994: Smilh. 1991). La delección de antígenos del VRS en secreciones respiratorias mediante DFA o EIA representa otra posibilidad para el diagnóstico igual de sensible, o incluso más, que el cultivo, y permite obtener resultados en una banda de tiempo relevante desde el punto de vista clínico: por tanto, estos métodos se han convertido en la alternativa práctica definitiva para el diagnóstico del VRS (Rossier. 1989; Smith, 1991) El enzimoinmunoensayo es rápido y fácil de realizar, aunque los reactivos necesarios son caros y los procedimientos existentes no permiten evaluar la adecuación de la muestra. El test DFA necesita más tiempo para su ejecución y experiencia para la interpretación de los resultados, aunque puede implementarse fácilmente para la detección de múltiples virus y permite confirmar, de una forma sencilla, la calidad de la muestra.
Crup El crup es una enfermedad generalmente causada por el virus de la parainfluenza (VPI) (Hennckson. 1994: Vainionpaa. 1994). La incidencia del VPI1 y VPI2 se incrementa durante el otoño o la primavera, mientras que el VPI3 causa infecciones respiratorias por igual a lo largo de todo el año. Los diferentes tipos del VPI, particularmente el VPI3. son la segunda causa de infección viral del tracto respiratorio inferior en niños de menos de 6 meses. La necrosis epitelial que produce la multiplicación del virus en la laringe, la traquea y los bronquios, estrecha la luz de los conductos, dificultando el paso del aire y causando ronquera, tos y un patrón de estridencias respiratorias debidas a la obstrucción que son características del crup. La inmunidad desarrollada es transitoria y las reinfecciones son frecuentes; sin embargo, en niños mayores y en adultos, los síntomas son menos graves y se circunscriben al tracto respiratorio superior. El cultivo de las SNF es el método con mayor sensibilidad para el diagnóstico, aunque la detección de antígenos del VPI en muestras de SNF es otro procedimiento que tiene también una buena sensibilidad, que oscila entre el 69% y el 85% (Costello. 1993). Aquellas muestras que dan resultados negativos con el test DFA deben ser cultivadas para aumentar las posibilidades de recuperación.
Obtención de muestras Todos los mixovirus y adenovirus respiratorios pueden infectar las células columnares ciliadas del epitelio respiratorio, desde la nasofaringe a los alvéolos. Por tanto, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad respiratoria (crup, bronquiolitis. neumonía o gripe), la mucosa del tracto respiratorio superior es la localización más accesible para lomar una muestra para el cultivo o un test de detección de antígenos. Los especímenes deben obtenerse durante los primeros días de la enfermedad, cuando la rephcación del virus está en sus cotas más altas. El material recogido con hisopo de la garganta, depositado en MTV con antibióticos, es un material aceptable para el cultivo del virus de la gripe, aunque el rendimiento es entre un 10% y un 20% menor: las muestras de esputo tomadas por expectoración también son adecuadas
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INFECCIONES VÍRICAS
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tra de SNF debe homogeneizarse con ser tampón fosfato salino que contenga para el cultivo (Kimball. 1983: Yungblulh, 1998). en especial en el caso de una sustancia mucolitica (Sputolysin) y ser centrifugada a continuación; el aquellos pacientes que tienen tos productiva. sobrenadante resultante se utiliza para el cultivo, y el sedimento se resusLas SNF se recogen mediante la inserción de un catéter adosado a una pende en tampón fosfato salmo: a partir de esa resuspensión se hace un frojeringuila a través de los orificios nasales hasta alcanzar la nasofaringe, instilando seguidamente entre 1 mi y 2 mi de suero salino y aspirando a continua-tis en láminas de teflón o en portaobjetos recubiertos con polk-lisina. Las extensiones se dejan secar al aire, se fijan seguidamente con acetona al ción las secreciones de la mucosa por medio de la leringa. Todas las muestras 100%. y se tiñen con anticuerpos específicos frente a antigenos virales, condeben ser transportadas rápidamente en un baño de hielo para minimizar la jugados con fluoresceina, utilizando azul de Evans como colorante de conpérdida de viabilidad del VRS. La calidad de las muestras debe venlicarse antes traste. Hay que observar el número de células columnares ciliadas asi como el de intentar levar a cabo el cultivo o la detección de antigenos. Aquelas muesgrado de tinción inespecifica debida a la presencia de moco residual en el tras de SNF en las que se detectan al menos dos células ciliadas columnares fondo de la preparación o de neutrólilos. La Figura 48-8 muestra una tinción del epitelio respiratorio por campo microscópico (observación a x 250) rinden DFA de una muestra de SNF positiva para influenza A. La especificidad de los una recuperación cuatro veces mayor de patógenos respiratorios virales. anticuerpos acoplados a fluoresceina se ensaya frente a una batería de cultiEnsayos para la detección de antígenos víricos vos de células control positivas; los patrones de tinción deben mostrar una distribución celular e intensidad constantes de la fluorescencia en todos los lotes En la Figura 48-7 se describe un procedimiento basado en el cultivo y la tinde células analizados. En conjunto, los métodos de tinción fluorescente tienen ción mediante DFA para la identificación de virus respiratorios. Una detección u n a g r a n especi ficidad y sensibilidad (Cheeseman, 1986; Hughes, 1988). reproducible y precisa de antígenos virales mediante DFA requiere cierta En la actualidad están disponibles en el mercado varios enzimoinmunoenexperiencia para la interpretación de la observación al microscopio, por lo sayos (EIA) para la detección del VRS y el virus de la gripe. La especificidad que. si es posible, debe realizarse simultáneamente un cultivo de virus y un y sensibilidad de estos sistemas comerciales es bastante buena, comparable ensayo de detección de antígenos. Los hospitales con una unidad pediátrica a la tinción DFA (Hughes. 1988: Miler, 1993;Thomas. 1991). Las muestras de de gran tamaño examinan de forma periódica las muestras respiratorias para detectar diferentes virus (VRS, influenza A y B. distintos tipos de VPI y ade- SNF utilizadas para EIA deben examinarse para detectar la presencia de células ciliadas epiteliares columnares: para ello, se realiza un preparación en novirus) durante los meses de invierno, si el presupuesto lo permite. Los pacientes adultos deben ser analizados en busca del virus de la gripe; el VRScámara húmeda, mezclando una gota de la muestra con una gota de solución salina, que se observa al microscopio (x 250) para verificar que en el espécidebe tenerse también en cuenta en el caso de pacientes geriátricos. La mues-
Figura 48-7. Esquema del protocolo experimental para el diagnóstico de infecciones respiratonas virales mediante cultivo (izquierda) y por el método de inmunofluorescencia directa (DFA) (derecha).
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 48-8. Tinción Oe inmunofluorescencia directa de un frotis de un aspirado nasofaríngeo que revela la presencia de antigenos fluorescentes en el núcleo y el citoplasma de las células columnares ciliadas del epitelio y en los mononucleares (aumento x 250; tinción para antígenos específicos del virus de la influenza A).
Figura 48-10. Monocapa de un cultivo de células HEp-2. donde son apreciadles ios ECP debidos a la multiplicación del VRS en las mismas. Es patente la presencia de s^ncitios multinucleados tras una incubación de 9 días (aumento • 200: microscopia de contraste de fases).
men existen suficientes células columnares nasofaríngeas. Las muestras tomadas de la garganta o de la nasofaringe con un hisopo contienen muy pocas células para poder llevar a cabo un preanálisis citologico.
cación del sistema basado en el cultivo puede ampliarse para la recuperación de virus que no están incluidos en los ensayos de detección de antígenos, como el virus del sarampión y los enterovirus (Johnston. 1990; Rabalais, 1992). El matenal recogido con hisopo de la garganta, cuya finalidad única sea servir de muestra de partida para el cultivo del virus de la gripe, debe depositarse en MTV con antibióticos inmediatamente después de ser obtenido y transportarse rápidamente hasta el laboratorio, preferiblemente en un baño de hielo: la inoculación de los cultivos celulares no debe demorarse más allá de 48 horas y debería realizarse, preferiblemente, el mismo día en que el espécimen es obtenido. El recipiente con MTV debe agitarse enérgicamente antes de retirar y desechar el hisopo. El líquido sobrenadante se utiliza para inocular, por duplicado, tubos shell-vial que contengan cultivos tripsmizados de las líneas celulares MDCK (células Madin-Darby de nñón de perro) o PMK. Tras la centrifugación para favorecer la adsorción de los viriones a las células, se añade a los tubos un volumen de MME (medio mínimo esencial de Eagle) sin suero bovino fetal (SBF), ya que el SBF puede contener anticuerpos frente al virus de la gripe. Después de uno o dos días de incubación a 35 C, las monocapas de células son teñidas mediante la técnica DFA, con objeto de detectar los antígenos del virus de la gripe (Reina, 1997). Adicionalmente. se puede inocular un tubo más con células PMK o MDCK. que se incuba en un tambor rotatorio y se examina para detectar la multiplicación del virus, añadiendo eritrocitos de cobaya recién obtenidos. Al igual que los virus del sarampión y de la parainfluenza. el virus de la gripe no produce ECP de forma constante, aunque es capaz de inducir la integración de hemaglutininas en la membrana plasmática de las células de los cultivos, lo que provoca que los eritrocitos se adhieran a las células de la monocapa, hecho que revela que el virus se está replicando en éstas. Si la cantidad de trabajo lo permite, los tubos deben examinarse diariamente para detectar la hemoadsorción (Minnich. 1987). Una vez se ha apreciado la existencia de hemoadsorción. la monocapa de células debe analizarse con una batería de anticuerpos para determinar qué tipo de virus está presente. En la Figura 48-9 se muestra una monocapa de células PMK en un tubo shell-vial en la que se ha multiplicado el virus de la influenza A. tras dos días de incubación, y un cultivo estándar de células PMK infectadas por el mismo virus, que muestra la hemoadsorción de los eritrocitos de cobaya, tras tres días de incubación.
Aislamiento de virus En el caso del aislamiento de virus mediante cultivo, tienen validez los mismos requerimientos y restricciones respecto a la muestra que se tienen en cuenta en los ensayos de detección de antigenos. Los cultivos a partir de SNF procedentes de adultos y niños no inmunodeprimidos pueden modificarse para ajustarse a las epidemias estacionales de infecciones causadas por el virus de la gripe, VRS y VPI (Fig. 48-6). Como mínimo, debe intentarse llevar a cabo el aislamiento del VRS y del virus de la gripe durante el invierno; si las disponibilidades de personal asi lo permiten, también deben realizarse cultivos para el aislamiento del VPI y adenovirus a partir de pacientes pediátricos. En la Tabla 483 se muestra un listado de las lineas celulares que permiten el crecimiento de virus patógenos del tracto respiratorio mfenor. La técnica del cultivo mejora globalmente el rendimiento diagnóstico, más allá del que se obtiene mediante el método de detección de antígenos, aproximadamente entre un 10% y un 20%, para lodos los agentes virales, excepto en el caso del VRS. El ámbito de apli-
Figura 48-9. Cultivo de células primarias de nñón de mono infectadas por el virus de la gripe A. según se desprende de la aparición de fluorescencia, tras una tinción con anticuerpos específicos frente al virus (izquierda). Se observa la hemoadsorción de eritrocitos de cobaya sobre la monocapa de células inducida por la replicación del virus (derecha).
La Figura 48-7 muestra un esquema del procedimiento de cultivo en tubos shell-vial aplicado a las SNF, empleando una monocapa híbrida de células, formada por células A549 y ML (de pulmón de visón), que conjuntamente permiten el crecimiento del VRS, adenovirus, virus de la influenza A y B y los distintos tipos del virus de la parainfluenza En comparación con las líneas celulares tradicionales, el cultivo de tejidos híbrido tiene, globalmente. unos porcentajes de recuperación de entre el 96% y el 100%. con tiempos de espera más cortos, y unos costes totales reducidos (Schindler, 1999). Aquellos laboratorios que se dedican exclusivamente al cultivo del VRS deben considerar la utilización de los tubos shell-vial en lugar de los tubos Ira-
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
dicionales para realizar los cultivos de tejidos, con objeto de reducir el tiempo necesario para el aislamiento. Las células HEp-2 o A549 en MME de Eagle enriquecido con suero bovino fetal (entre un 2°= y un 5%) permiten la replicación del VRS. Las monocapas de células contenidas en los tubos deben examinarse diariamente para detectar la aparición de ECP. En la Figura 48-10 se observan los típicos ECP causados por la multiplicación del VRS en las células (formación de sincitios multinucleados), patrón que depende del contenido en cationes y de la frescura del medio de mantenimiento (Tristram. 1999). Los adenovirus también son capaces de replicarse en las líneas celulares A549 y HEp-2. produciendo un redondeamiento de las células de la monocapa. que se hinchan, adquiriendo una morfología que semeía un grano de uva, generalmente entre cinco y siete días de incubación; el empleo de tubos shell-vial acorta el tiempo de detección de los adenovirus hasta los tres días Existen una serie de métodos serológicos para detectar anticuerpos específicos frente al virus en la sangre del huésped infectado, aunque son poco prácticos para llevar a cabo un diagnóstico rápido de cara a la gestión clínica habitual. Sin embargo, el diagnóstico serologico es de la mayor utilidad en los estudios de salud pública.
MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E INFECCIONES RELACIONADAS La mononucleosis infecciosa (MI) es una enfermedad linfoproliferativa sistémica, bastante común, que está causada por una inleccion primaria con el virus de Epstein-Barr (VEB), El VEB pertenece a la familia Herpesviridae y. al igual que el VHS. tiene una distribución mundial, pudiendo infectar a la mayor parte de la población. El VEB se disemina mediante la saliva contaminada: la infección primaria en la niñez temprana es generalmente asinlomática, pero si se retrasa hasta los años de la adolescencia o la juventud adulta, entonces provoca, a menudo, la entidad clínica conocida como mononucleosis infecciosa. En EE.UU. se detectan unos 150.000 casos de MI anualmente (Schooley. 2000: Straus. 1993). El VEB infecta primero el epitelio faríngeo, por lo que el dolor de garganta y la fiebre son los síntomas que se manifiestan típicamente al inicio de la enfermedad. El VEB es fuertemente linfotrópico. uniéndose al receptor para el C3d (CD21) presente en la superficie de los Imfocitos B e iniciando una proliferación policlonal blástica de células B. La respuesta de la inmunidad celular está mediada por las células NK y los linfocitos T-CD8 cítotóxícos. que se encargan de destruir las células B infectadas, aunque estas células defensivas también contnbuyen a la patología sistémica de la MI. Los linfocitos B infectados por el VEB se acumulan en los ganglios linfáticos del cuerpo, y los linfocitos T cilotóxicos infiltran las áreas nodales interfoliculares, el bazo y el hígado y circulan como linfocitos atipicos en sangre periférica (Strickler. 1993). A medida que los mecanismos celulares van controlando la replicación del VEB, los síntomas de la MI disminuyen y la Imfadenopatía, la esplenomegalia y la hepatitis remiten. Como otros herpesvirus, el VEB puede persistir en el huésped en un estado latente. Un pequeño porcentaje de linfocitos B contienen en su núcleo ARN codificados por el VEB (EBER). asi como el antigeno nuclear del VEB (ANEB) y otro antígeno, la proteina latente de membrana (PLM), que mantienen el genoma durmiente del VEB en las células B transformadas; una excesiva proliferación de las células B es controlada por los linfocitos T-CD8. La reactivación asinlomática del VEB es un hecho frecuente, y hasta un 20% de los adultos sanos liberan, esporádicamente, un pequeño número de viriones completos, con capacidad infectiva, en su saliva. En individuos que se encuentran en una situación de mmunodepresión (enlermos de sida, pacientes sometidos a trata-
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miento para evitar el rechazo tras ser sometidos a trasplante, individuos afectados por la enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X). la reactivación del VEB no puede ser mantenida bajo control y se desarrollan enfermedades como la leucoplaquia oral vellosa y el linfoma de células B. El VEB también está ligado al carcinoma nasofaríngeo en asiáticos y al linfoma de Burkitt en África; aparentemente, el VEB actúa como un iniciador en estas patologías, aunque son otros factores, como la coinfección o la desregulación del sistema inmune, los que conducen, posteriormente, a la malignización.
Diagnóstico serologico Los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos apoptósícos circulan por la sangre durante la enfermedad (Fisher. 1996): la linfocitosis atipica |>10% de linfocitos totales) tiene, relativamente, una ba|a sensibilidad como criterio diagnóstico de la MI causada por el VEB. aunque tiene una especificidad total de al menos el 95%. El VEB puede ser cultivado en líneas celulares linfoblastoides, pero el aislamiento del virus no es un hecho que permita distinguir entre inleccion primana o infección por reactivación. Las pruebas serológicas constituyen el principal método de laboratorio para el diagnóstico de la MI (Schooley. 2000). La proliferación policlonal de linfocitos B en la infección aguda por el VEB tiene como consecuencia la generación de diversos autoantícuerpos transitónos y generalmente inocuos, tales como IgM anti-i (aglutininas trias), factor reumatoide, y anticuerpo antinuclear. Quizás el tipo más inusual de inmunoglobulinas producidas durante la MI sean los anticuerpos heterófilos de Paul-Bunnell. Estos anticuerpos, que pertenecen a la clase de las IgM, tienen afinidad por los erilrocitos de bóvido. caballo y oveja, pero no están dirigidos contra antígeno alguno del propio virus. Estos anticuerpos son, aparentemente, producidos de forma aleatoria como consecuencia de la proliferación policlonal de los linfocitos B. inducida por el VEB. y aparecen durante la primera semana de la enfermedad, disminuyen durante la fase de convalecencia y dejan de ser detectados, usualmente, entre tres y seis meses después. Durante la enfermedad del suero y ocasionalmente en otras infecciones virales, se generan diferentes anticuerpos heterófilos; sin embargo, los anticuerpos de este tipo, con una fuerte afinidad por antígenos de los eritrocitos vacunos, que no es alterada por adsorción con antígeno de riñon de cobaya (test de la adsorción diferencial), son específicos de una MI causada por el VEB. En algunas de las pruebas se mezcla directamente sobre un portaobjetos el suero del paciente con una suspensión del antigeno de nñón de cobaya, y seguidamente se añade el antigeno de eritrocitos vacunos o equinos, que frecuentemente se encuentra adhendo a partículas de látex; si es positiva, la aglutinación aparece de forma casi inmediata si en el suero del paciente hay anticuerpos heterófilos. Los test de aglutinación rápida, y sus modificaciones en fase sólida, tienen una especificidad enlre el 80% y el 90%, con un porcentaje de falsos positivos menor del 2% y un valor prediclivo positivo del 95% o supenor, por lo que son herramientas de gran valor en la atención primaria (Rogers, 1999: Farhat, 1993: Lmderholm. 1994). Su principal limitación es la sensibilidad, puesto que aun cuando los anticuerpos heterófilos están presentes en más del 80% de adolescentes y adultos este porcentaje baja hasta el 40% en el caso de niños pequeños con MI por VEB. A medida que la infección por VEB evoluciona desde la fase primaria a la de latencia, van expresándose varios antígenos virales, de tal forma que los anticuerpos específicos que se generan frente a los mismos son unos marcadores valiosos para determinar el estadio en el que se encuentra el proceso infeccioso. Los antígenos que se expresan tempranamente (EA) la ADN polimerasa y la timidma (cinasa) se sintetizan durante la fase aguda de la infección, durante la replicación activa del virus, al igual que el antigeno proteico estructural (ACV) de la nucleocápsida del virus. Las IgM frente al ACV son un marcador sensible y espe-
Tabla 48-9 Perfiles s e r o l ó g i c o s e n las infecciones producidas por el virus. d e E p s t e l n - B arr Anticuerpos heterófilos (IgM) Ausencia de infección Infección primaria silenciosa Mononucleosis infecciosa Infección primaria reciente Infección pasada remota Paciente inmunodeprimido con reactivación reiterada
ACV (IgM)
+/++ -/+
+/++ -/+
*h
+/-
•
ACV (IgG)
EA (IgG)
+ + + + +
+ ++ + + ++
ACV = antígeno de la capsida viral EA= antígeno que se expresa tempranamente, ANEB = antígeno nuclear del VEB.
ANEB (IgG) + + + + ++
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
cílico de infección primaria por el VEB. A medida que la mononucleosis aguda va remitiendo, un pequeño porcentaje de linfocitos B infectados por el virus escapan a la destrucción mediada por las células T y albergan en estado de latericia el ADN del VEB en forma de un episoma circular; el ANEB (antígeno nuclear del VEB) es el responsable de la replícación y supervivencia de dicho episoma. En consecuencia, las IgG trente al ANEB aparecen, típicamente, después de que la fase aguda de la enfermedad haya remitido Los patrones serológicos que se detectan a lo largo de las diferentes fases de la infección por VEB se muestran en la Tabla 48-9. Los métodos con anticuerpos fluorescentes (IFA) utilizan líneas de células linloblásticas. en las que la replícación del VEB ha sido interrumpida en diferentes etapas, con objeto de caracterizar la expresión de antígenos específicos en cada una de ellas. Los tesl IFA tienen una buena sensibilidad y especificidad, aunque están sujetos a una cierta subjetividad en lo referente a la interpretación de resultados. Los enzimoinmunoensayos (EIA) que utilizan el antígeno ACV purificado u obtenido mediante técnicas de ADN recombinante muestran una sensibilidad superior al 95% y una especificidad de casi el 100%. y además tienen la ventaja de poderse llevar a cabo de forma automatizada, y de que la interpretación de los resultados no está afectada por criterios subjetivos de ningún tipo (Tranchard, 1999; Chan. 1998). Muchos médicos confian en la demostración de linfocitos atípicos en sangre periférica, en el rastreo rápido de anticuerpos heterófilos y en la detección de IgM e IgG frente al ACV para diagnosticar la MI. Los métodos de referencia de detección cuantitativa de anticuerpos heterófilos en tubo, IgG anti-ANEB y anti-EA (antígenos que se expresan tempranamente), son de ejecución más compleja y tienen una menor aplicación práctica.
Mononucleosis infecciosa heterófilo-negativa Entre los pacientes que presentan las manifestaciones clínicas características de la MI, un 70% o más dan positiva la prueba de anticuerpos heterófilos, lo que identifica al VEB como el agente causal de la enfermedad. Del 30% de enfermos restante, aproximadamente la mitad de ellos tienen IgM antiVCA, lo que también representa una evidencia de infección aguda por el VEB. Aproximadamente en un 15% de pacientes con un síndrome febril de MI linfoproliferativa, el agente etiológico identificado es Toxoplasma gondii, o bien otros virus como CMV, el virus del herpes humano 6 (VHH6) o VIH; en el 5%10% restante de los casos no es posible determinar la etiología. La toxoplasmosis se describe en el Capítulo 55. La infección primaria por CMV adquirida durante la infancia es, a menudo, asinlomática, mientras que en los adolescentes y en los adultos puede manifestarse como una enfermedad sistémica, febril y linfoproliferativa. El aislamiento del CMV de la orina o de la saliva no es de gran ayuda, ya que la reactivación asintomática del virus es bastante frecuente. La recuperación del CMV a partir de sangre periférica representa una alternativa diagnóstica válida por su sensibiliaad. pero es pro-
cedimiento caro, que requiere más tiempo para su realización que el diagnóstico serologico. La detección de IgM frente al CMV mediante IFA se complica por el hecho de que las células infectadas por el CMV, utilizadas como sustrato antigénico, expresan también un receptor para el fragmento Fe de la molécula de inmunoglobulina; el test de la inmunofluorescencia anticomplementaria (ACIF) es más complejo desde el punto de vista técnico, pero reduce la aparición de resultados falsamente positivos. Los enzimoinmunoensayos (ELISA) específicos para IgM tienen, en conjunto, una precisión comparable a la del ensayo ACIF-IFA para la detección de este mismo tipo de anticuerpos (Roseff. 1993: Schaefer. 1988: Smith. 1987; VanEnk, 1991). El VHH6 también es un virus linfotrópico que produce la roseola infantil (exantema súbito), una enfermedad exantemática febril común en niños pequeños (Pruksananonda, 1992; Braun. 1997). Pasada la infancia, la infección primaria puede producir mononucleosis (Akashi. 1993). La enfermedad aguda se puede diagnosticar mediante ensayos IFA y EIA específicos para IgM. y lambién por PCR, aunque en la actualidad estos métodos aún no están disponibles comercialmente (Steeper, 1990: Sumiyoshi, 1993; Chiu. 1998). La infección por VIH-1 puede producir un síndrome retroviral agudo que mimetiza. desde el punto de vista clínico, a la mononucleosis causada por el VEB (Kessler. 1987: Steeper. 1988). Hasta un 50% de pacientes desarrollan fiebre, linfadenopatia. linfocitosis atípica y, ocasionalmente, daño hepatocelular leve o meningoencefalitis (Fox. 1987). Los métodos estándar de enzimoinmunoensayo específicos para el VIH son incapaces, por lo general, de detectar anticuerpos específicos durante esta fase temprana de la infección, aunque la cuantificación por RT-PCR de virus en suero da usualmente valores elevados (del orden de 10' copias/ml) (Henrard. 1994). A partir del segundo o tercer mes. las pruebas serológicas (ELISA, inmunotransferencia electroforética [Western immunoblottingj e IFA) dan sistemáticamente resultados positivos en lo que respecta a la detección de anticuerpos anti-VIH específicos, al mismo tiempo que las manifestaciones asociadas a la infección aguda van remitiendo (Clark, 1991). La Figura 48-11 muestra el esquema general de trabajo para llevar a cabo la evaluación serológica de un paciente que presente síntomas de una mononucleosis aguda. En cualquier caso, a pesar de la gran variedad de métodos analíticos disponibles para la identificación de los agentes causales de mononucleosis, la etiología no llega a ser determinada en el 5% al 10% de los casos.
Síndrome de la fatiga crónica En los últimos 15 años se ha prestado una considerable atención, tanto en la prensa médica especializada como en la no especializada, a una entidad clínica que se caracteriza por el hecho de que los pacientes alectados sufren una fatiga persistente incapacitante, acompañada, a menudo, de fiebre, faringitis, linfoadenopatía suave, artralgias y mialgias (Holmes, 1988; Klonoff, 1992). En los pacientes sospechosos de padecer esta enfermedad, debe
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
investigarse también la posibilidad de que existan tumores malignos ocultos, enfermedades endocrinas y dolencias psiquiátricas, aunque las características clínicas de esta enfermedad sugieren, con gran fuerza, un origen infeccioso para la misma, En los estudios iniciales se propuso al VEB, tanto en infecciones primarias persistentes como reactivadas, como responsable del síndrome, ya que muchos pacientes tenían títulos elevados de anticuerpos frente a los antígenos VCA y EA del virus de Epstein-Barr. Sin embargo, los ensayos serológicos nunca fueron estandarizados y los resultados descritos no fueron reproducibles (Holmes. 1987). y la detección del VEB mediante técnicas de cultivo a partir de saliva y de hibridación in silu (HIS) en linlocitos circulantes no mostró diferencias entre pacientes con síndrome de fatiga crónica y población control normal. Distintos estudios han implicado a otros agentes infecciosos como CMV, VHH6, VLHT (virus de la leucemia humana de células T), e incluso Toxoplasma gondii. aunque no existe consenso sobre la etiología de la enfermedad (Gold, 1990). Las pruebas inmunológicas y serológicas no son de ayuda para el diagnóstico o la prognosis. En resumen, el síndrome de la latiga crónica sigue estando definido por los síntomas clínicos más que por los resultados de las pruebas de laboratorio (Lloyd. 1998).
INFECCIONES VÍRICAS CONGÉNITAS Y PERINATALES El útero de la mujer embarazada es un entorno estéril y aislado que protege al feto de la agresión de los microorganismos extemos. La mayor parte de infecciones durante el embarazo son provocadas por las bacterias que se encuentran en la vagina, y que ascienden a través de una barrera cervical defectuosa, aunque las infecciones maternas pueden alcanzar al feto por el torrente circulatorio a través de la placenta, o bien afectar directamente al niño en el momento del parto vaginal. Algunos ejemplos de infecciones perinatales son la toxoplasmosis (véase Cap. 55), las causadas por diversos virus, como el de la rubéola, CMV, VHS. VIH, parvovirus. enterovirus, y por bacterias como Treponema palüdum (véase Cap. 52). Muchas de las infecciones maternales son silenciosas o producen síntomas leves solamente: sin embargo, el sistema inmunológico inmaduro del leto es incapaz de desarrollar una respuesta celular o humoral eticaz, por lo que la necrosis tisular puede ser muy grave o incluso fatal.
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por CMV en la madre se manifiesta como una viremia que se extiende hematógenamente al feto por vía transplacentaria. y que comporta el nesgo más elevado de provocar daños graves en los tejidos leíales. La reactivación del CMV en la madre conlleva que el virus pueda atravesar la placenta, aunque las IgG anli-CMV de la madre ejercen un cierto efecto protector; en este caso, estos niños son, por lo general, asintomáticos. aunque entre un 5% y un 15% de ellos pueden desarrollar una pérdida sensorial auditiva o tener problemas de desarrollo neuronal (Istas. 1995: Lazzarotta, 1998). La detección del CMV a partir del liquido amniótico mediante PCR junto con el aislamiento del virus por cultivo son los métodos más seguros para el diagnóstico prenatal (Hagay. 1996; Lazzarotta, 1998). La recuperación del CMV mediante cultivo o PCR a partir de la orina, saliva, líquido cefalorraquídeo o sangre del recién nacido también es una alternativa diagnóstica de gran sensibilidad, aunque los especímenes deben obtenerse dentro de las tres semanas siguientes al nacimiento para evitar confusiones con una posible infección posnatal (Warren. 1992: Nelson. 1995). La presencia de IgM frente al CMV en muestras de sangre tomadas del cordón umbilical, intrautennamente o en el momento del parto, posee valor diagnóstico, aunque tiene un porcentaje del 30% de falsos negativos (Fowler. 1992). La visualización de las típicas inclusiones nucleares producidas por el CMV en frotis otológicos preparados a partir de orina tiene carácter específico, aunque es una aproximación diagnóstica que tiene muy poca sensibilidad; incluso las muestras obtenidas mediante autopsia pueden poseer muy pocas células apropiadas para el diagnóstico si la necrosis tisular está muy avanzada
Rubéola El virus de la rubéola (sarampión alemán) produce fiebre suave y una erupción cutánea transitoria en niños y adultos. El virus circula por la sangre, incluso en los casos leves, y la diseminación transplacentaria de la viremia durante el primer trimestre del embarazo provoca gravísimas maltormaciones cardíacas, oculares y cerebrales en el feto (Schluter, 1998). El síndrome congénito de la rubéola es raro en la actualidad, debido a las eficaces campañas de vacunación pediátrica y a los programas sistemáticos de revisión prenatal (Miller, 1984). Cuando se sospecha un caso de rubéola aguda en una mujer emDarazada. el método más sencillo para el diagnóstico es el análisis del suero de la madre para detectar IgM especificas frente al virus, mediante enzimoínmunoensayo o IFA. El aislamiento del virus en cultivos de tejidos es una técnica compleja que requiere mucho tiempo para su ejecución, por lo que no se realiza de forma ordinaria en la mayor parte de laboratorios clínicos. La detección del ARN del virus de la rubéola a partir de liquido amniótico mediante RT-PCR tiene un 100% de sensibilidad y especificidad, pudiéndose llevar a cabo también con muestras de placenta o de tejidos procedentes de autopsias (Revello. 1997). Los recién nacidos infectados congenitamente liberan, a menudo, el virus durante muchos meses e incluso años.
El diagnóstico de las infecciones perinatales se centra en dos aspectos: identificación de la infección aguda en la madre (en particular, la infección primaria) y verificación de que el feto o el recién nacido está implicado. La mejor forma de establecer la infección materna es mediante el aislamiento del microorganismo sospechoso, aunque para ciertos agentes infecciosos esto es poco práctico o imposible de llevar a cabo y, en consecuencia, la detección de IgM especificas, aunque imperfecto, sigue siendo el método diagnóstico más aceptado. La infección en la madre atraviesa la placenta para alectar al feto entre el 30% y el 60% de los casos. La ecografia puede detectar el daño en los órganos del feto (p. ej., microcalcificaciones. microcefalia, hidrocefalia, organomegalia, hidropesía), aunque para probar que existe infección fetal es necesario aislar el microorganismo mediante cultivo, demostrar la presencia de antigenos o secuencias de ácidos Virus del herpes simple nucleicos del mismo en la sangre o en tejidos del feto, o detectar la existencia de La infección genital primaria por el VHS durante el embarazo conlleva un anticuerpos específicos. En la Tabla 48-10 se muestra una selección de métodos riesgo elevado de corioamnionitis herpética ascendente que puede conducir para el diagnóstico de las infecciones perinatales y congénitas más comunes. a un aborto espontáneo, alumbramiento prematuro y a la exposición del niño durante el parto vaginal por contacto mucocutáneo (Brown, 1987). La infecAun cuando la monitonzación de todas las mujeres embarazadas en busca de ción genital primaria por el VHS. más que las infecciones recurrentes, implica anticuerpos frente al virus de la rubéola es, en la actualidad, una práctica habiun grave peligro para el niño por dos razones: la carga viral en la madre y el tual de atención primana. la realización de pruebas para detectar anticuerpos número total de lesiones son normalmente mayores durante la infección prifrente a Toxoplasma gondii. VHS y CMV no está establecida. En particular, los maria y, por otro lado, aunque el suero de la madre tiene IgM específicas, premétodos serológicos para IgM pueden exhibir una gran variabilidad intra e intersenta pocas (o incluso carece de ellas) IgG que puedan ejercer un electo prolaboratorio, con errores debidos a falsos negativos y posilivos: los ensayos para tector transplacentario en el lelo (Prober, 1987). IgG por si solos no son capaces de diferenciar entre infección materna primaria y recurrente o latente, y no pueden predecir que el feto esté implicado. La mayor parte de los niños tienen una presentación cefálica durante el parto,
Citomegalovirus El CMV es la causa más frecuente de infección intrautenna y afecta aproximadamente a un 1% de los recién nacidos vivos en EE.UU. Alrededor de un 90% de estos niños son asintomáticos en el momento del nacimiento; el aislamiento del virus a partir de la orina o de la saliva o la detección de IgM específicas pueden ser los únicos indicadores de infección congénita. Sin embargo, el restante 10% de individuos sintomáticos presenta ictericia junto con hepatoesplenomegalia y pancitopenias: aproximadamente un 10% muere y el resto queda con secuelas neurológicas durante mucho tiempo. La infección primaria
por lo que el cuero cabelludo y la cara son las partes del cuerpo del feto que primero entran en contacto con el VHS durante el tránsito por el tracto genital de la madre; otras zonas que también quedan expuestas con bastante frecuencia a la infección por el virus son el pecho y las nalgas, especialmente durante el parto de nalgas. Las vesículas se desarrollan en todas aquellas localizaciones de la piel y las mucosas donde ha tenido lugar la inoculación directa con el virus. Puesto que el sistema inmunitario del recién nacido está todavía relativamente inmaduro, el único recurso que el niño tiene para alterar el curso de la infección es la IgG de la madre frente al VHS; cuando esta protección pasiva está ausente, tiene lugar de forma incontrolada tanto la replicación del virus como su disemí-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
nación a diferentes órganos (Whitley, 1988). Las lesiones que aparecen en la conjuntiva, en la mucosa oral y en la piel son, generalmente, reas en virus: si se produce la diseminación, virtuaimente cualquier órgano puede resultar infectado. Hoy en día, en plena era del herpes genital, todavía existe cierta controversia sobre cuál debe ser la estrategia más adecuada que debe utilizarse en el parto, aunque algunos esludios al respecto merecen ser destacados. El aislamiento mediante cultivo, realizado de forma sistemática a partir de todas las madres o niños en el momento en que se inicia el parto y en el de dar a luz. tiene un rendimiento bajísimo (0.2%) y, en consecuencia, no es un método recomendado (Prober, 1988). Los cultivos de control del VHS a partir de mujeres embarazadas con un historial de herpes genital recurrente tampoco pueden predecir qué madres liberarán el virus en el momento del parto (Arvin, 1986). Estudios realizados con mujeres que han experimentado su primer episodio, reconocido clínicamente, de herpes genital durante el embarazo han demostrado que tan sólo una mitad, aproximadamente, de estas mujeres habían tenido un verdadero herpes genital, aunque estas madres expenmentaron complicaciones (amnionitis herpética, parto prematuro e infecciones neonatales graves) muy frecuentemente. En las mujeres con infecciones recurrentes se detectaron infecciones neonatales con mucha menor frecuencia, que quedaron confinadas a las superficies mucocutáneas, sin diseminación visceral (Brown, 1987,1991). Es una práctica aceptada que las mujeres que están de parto y tienen lesiones genitales que hacen sospechar la existencia de un herpes deben ser sometidas a una cesárea para prevenir una posible exposición del niño al virus. Aquellas mujeres que tienen un historial previo de herpes genital recurrente pueden dar a luz por vía vaginal siempre que no se delecten lesiones activas, aunque en este caso se recomienda que se lleve a cabo un control cuidadoso de los recién nacidos, incluyendo cultivos del VHS a partir de la conjuntiva, mucosa oral y cualquier lesión cutánea sospechosa. La infección neonatal por el VHS puede permanecer silenciosa durante varios días antes de que la enfermedad se manilieste clínicamente A pesar de la terapia antivírica, la inlección generalizada es. con frecuencia, mortal; aquellos niños que tienen la infección confinada en el sistema nervioso central pueden sobrevivir, aunque con un grave retraso mental permanente. El diagnóstico de laboratorio de la infección por el VHS fue descrito previamente en otra sección de este capitulo. Las pruebas rápidas como los fro-
tis de Tzanck o las técnicas para la detección de antígenos dan resultados positivos a partir de las lesiones vesiculares, aunque no son lo suficientemente sensibles como para reemplazar al diagnóstico por cultivo (que ahora está disponible en muchos laboratorios y permite obtener resultados positivos en 24 horas, en especial si se utilizan los cultivos en shell-viat). La técnica de la PCR puede identificar el ADN del VHS en el suero del neonato o en el liquido cefalorraquídeo con una sensibilidad mayor de la que tiene el cultivo, aunque en ocasiones no es posible utilizar este procedimiento diagnóstico en el momento preciso, lo que limita su utilidad (Kimura. 1991: Kimberlin. 1996)
Virus de la inmunodeficiencia humana, parvovirus, enterovirus El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede diseminarse hematógenamente al feto, actuando como reservono del virus los trofoblastos de la placenta y los macrófagos de Hofbauer. Sin embargo, aproximadamente un 75% de las infecciones perínatales se contraen en el momento del parto, al entrar en contacto el feto con la sangre materna infectada El nesgo de infección pennatal por VIH oscila entre el 13% y el 45%, dependiendo de la carga viral (VIH-1) en la madre, aunque el porcentaje de transmisión baja hasta un 8% si se administra cidovudina a la madre durante el embarazo y el parto. El parto por cesárea y el tratamiento con cidovudina reducen el riesgo de contagio por debaio del 1% ¡Connor, 1994; Sperling, 1996). El diagnóstico de la infección por VIH en la madre es sencillo (determinación mediante enzimoinmunoensayo de anticuerpos frente al VIH y posterior confirmación de los resultados por medio de inmunotranslerencia electrolorética ¡Western immunoblottingj o IFA), y a todas las madres positivas se les debe administrar tratamiento profiláctico. Las inmunoglobulinas maternas pasan a través de la placenta y permanecen en la sangre del niño hasta 15 meses; por tanto, los métodos estándar de ELISA no pueden ser utilizados para diagnosticar la infección neonatal. Las modificaciones del enzimoinmunoensayo o de la inmunotransferencia electrolorética, encaminadas a la detección de IgM o IgA (ninguna de estas moléculas de anticuerpos pueden ser transferidas de forma pasiva al feto y, por tanto, si están presentes en el suero, sólo puede ser debido a que el niño las haya producido), podrían permitir el diagnostico de la
Tabla 48-10 Métodos de laboratorio para el diagnóstico de las infecciones virales congénitas y perinatales* '
i
ni
ni
A g e n t e pagóteno
Serologia materna
Cultivo, detección de antígenos. PCR
Serologia del feto o del recién nacido
CMV
EIA o ACIF para IgM
Cultivo de CMV. sangre de la madre Cultivo de CMV orina, saliva, sangre, tejidos (del recién nacido, primeras tres semanas) PCR para CMV liquido amniótico, saliva, orina, LCR (del recién nacido, primeras tres semanas) Detección de inclusiones nucleares del CMV tejidos
EIA o ACIF para IGM
Rubéola
EIA o IFA para IgM
EIA o IFA para IgM
VHS
EIA para IgM frente a VHS1 y VHS2
Cultivo de virus de la rubéola: orina RT-PCR para virus de la rubéola liquido amniótico. glóbulos blancos letales, tejidos Cultivo de VHS conjuntiva, mucosa oral, piel, LCR. tejidos (del neonato) PCR para VHS: LCR. sangre (del neonato) Detección de inclusiones nucleares del VHS te|idos, piel
VIH
EIA o WB para el VIH; ensayos cuantitativos (HT-PCR o bADN)
Enterovirus
Parvovirus E 19
EIA o IFA para IgM frente al PB19: PCR para el ADN del PB19
EIA o IFA para IgM
Cuantificación de VIH (RT-PCR o bADN). PCR del ADN del VIH (en el recién nacido), detección del antigeno p24 (en el recién nacido)
EIA para IgM e IgA, WB Monitorizar VIH mediante EIA para comprobar serorreversión
RT-PCR para enterovirus LCR y sangre (del neonato) Cultivo de enterovirus: sangre. LCR. tejidos, heces, hisopados de garganta (del neonato) Visualización de inclusiones nucleares del virus HIS para PB19 en entroblastos ADN del PB19 (a partir de sangre) PCR para el ADN del PB19: plácenla, tejidos leíales, sangre
EIA para IgM'
"Se recomienda eliminai las IgG y el lactor reumaloide antes de llevar a cabo la determinación de IgM para ovilar los errores debidos a lalsos negativos 'Métodos de investigación y de laboratorios de referencia. EIA = enzimoinmunoensayo. ACIF = inmunolluorescencia anticomplementaria; PCR = reacción en cadena de la pdimerasa LCR * liquido cefalorraquídeo. RT-PCR • reacción en cadena de la polimerasa de la iransciiptasa reversa VIH = virus de la inmunodeficiencia humana. bADN = ensayo de ADN ramificado. WB = Western blotting (inmunotransferencia electrolorética). IFA = ensayo de inmunofluorescencia indirecta; PBI9 = parvovirus B19. HIS = hibridación in sitir. para ver el signilicado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 y 48-4. k,
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CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
infección perínalal con una gran precisión; sin embargo, la sensibilidad de estos métodos depende de la edad del paciente, y son poco fiables durante los tres primeros meses después del nacimiento (Quinn. 1991). La detección del antígeno p24 del VIH tiene una sensibilidad subóptima durante el periodo inmediatamente posterior al nacimienlo (Burgard. 1992; Miles. 1993: Sisón. 1992). El ensayo de la PCR para el ADN del VIH detecta el genoma vírico que ha sido transcrito e integrado en las células linfoides circulantes y tiene una sensibilidad de casi un 100% al mes de edad (Rogers. 1989). debido a la típica estabilidad del ADN, este ensayo es válido incluso cuando se lleva a cabo a padir de especímenes de sangre seca. La RT-PCR se utiliza para el control cuantitativo de aquellos niños con diagnóstico positivo de infección que están recibiendo una terapia antirretroviral combinada. El parvovirus B19 (PB19) produce un tipo de exantema infantil, benigno y autolimitado, denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar). Aproximadamente un 50% de mujeres jóvenes son seronegativas para esta enfermedad. La infección durante el embarazo conlleva un riesgo de infecciones fetales del 25%; las estimaciones de muerte fetal oscilan entre el 2% y el 38% (Alder. 1993). El PB19 tiene como diana las células inmaduras del linaje eritrocitano. y la citotoxicidad virolitica causa anemia y provoca hidropesía fetal (Anand, 1987; Gratacos. 1995). Los eritroblastos infectados exhiben una inclusiones nucleares características que recuerdan a vidrio molido. Los parvovirus sólo han podido cultivarse en suspensiones de médula ósea humana que contengan células precursoras eritrocitarias. La infección aguda se diagnostica mediante la detección de IgM específicas en la sangre de la madre o del feto, hibridación in silu o amplificación del ADN viral por PCR en muestras de líquido amniótico o de sangre del cordón umbilical (Erdman, 1991; Bruu, 1995: Zerbini, 1996). La infección por enterovirus es muy habitual en la población en general, con más de 10 millones de casos detectados anualmente en EE.UU. La infección de la madre en un momento próximo al parto puede provocar la diseminación del virus a través de la plácenla y alcanzar el feto, sin que exista al mismo tiempo una transferencia de IgG neutralizantes de la madre. El niño nace, entonces, con el virus diseminado por las visceras, pero sin anticuerpos que puedan modificar el curso de la infección. Algunos virus ECHO y Coxsackie A y B se han asociado con infecciones de la madre en el último trimestre de embarazo y del feto dentro del útero materno o en el momento del parto; se han registrado brotes nosocomiales en los que el virus ha sido transmitido por el personal sanitario. El virus ECHO 11 es particularmente virulento, causando necrosis hepatocelular y meningoencefalitis. Generalmente, la infección perinatal debida a otros enterovirus es benigna. Los virus ECHO crecen bien en cultivos de tejidos en tubos estándar y en tubos shell-vial (utilizando las líneas celulares PMK. HDF y RD [cultivos celulares de rabdomiosarcoma]): los tipos de especímenes empleados para el cultivo incluyen sangre del neonato, liquido cefalorraquídeo, hisopados rectales y de garganta o tejidos (en casos de muerte). La tipificación de los enterovirus puede realizarse en laboratorios de referencia nacionales o locales (Modín, 1986).
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nostico en estos casos. El virus que se aisla con mayor frecuencia en los casos de encefalitis es el VHS. como consecuencia de una reactivación del VHS1 latente que se extiende (a través de los nervios craneales, trigémino y olfativo) hasta el córtex cerebral, produciendo una masa de tejido necrosado que ocupa una cierta extensión. Anualmente se detectan unos 700 casos, con un patrón esporádico no ligado a cambios estacionales. La progresión de la enfermedad es muy rápida y la mortalidad elevada, aunque un diagnostico rápido y el tratamiento con aciclovir reduce tanto la mortalidad como el grado de incapacidad permanente (Whitley, 1995; Mitchell. 1997). Los mosquitos son los vectores de cientos de virus neurotrópicos en el mundo, pero sólo cuatro arbovirus (de arthropod borne, transmitidos por artrópodos) son encontrados de forma regular en EE.UU.: el virus de la encefalitis equina oriental, de la encefalitis equina occidental, de la encefalitis de San Luis y el virus Calilomia-LaCrosse. El número total de casos varía desde unos 100 hasta más de 2.000 en años de epidemia. La gravedad y mortalidad son más elevadas en el caso del virus de la encefalitis equina oriental, que es el menos frecuente dentro del grupo (Calisher. 1994). La información actualmente disponible sobre la actividad global de los arbovirus y los riesgos para los viajeros está disponible a través de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades en la siguiente dirección: wvvw.cdc.gov/travel. Diversos enterovirus. especialmente los virus Coxsackie y ECHO, producen encefalitis ocasionalmente; la poliomielitis (causada por el poliovirus, que produce una necrosis de la médula espinal y de las neuronas motoras cerebrales) ha sido eliminada en EE.UU. y en la mayor parte del mundo. El virus de la rabia se desplaza hasta alcanzar el SNC a través de las fibras nerviosas, produciendo lesiones necróticas en el cerebro (Smith, 1999). Raramente se detectan complicaciones del tipo de la encefalitis en otras enfermedades virales como el sarampión, la parotiditis, la MI por VEB y la varicela (Kennedy. 1991): el VHH6 también causa encefalitis focal (McCullers, 1995). La demencia en las fases avanzadas del sida está causada, a menudo, por una replicacíón progresiva del VIH en las células ghales del SNC (Atwood. 1993). En los pacientes inmunocompromelidos también se producen infecciones necrotizantes por VHS, CMV y WZ, asi como destrucción de la oligodendroglia por papovavirus JC. Cerca del 75% de los casos de meningitis vírica en EE.UU. están causados por enterovirus, que típicamente siguen un curso benigno. La meningoencefalitis crónica grave puede manifestarse en niños con hipogammaglobuImemia, y cualquier infección del SNC por enterovirus. con un componente de encefalitis, es más virulenta y tiene riesgo de dejar secuelas permanentes. Los enterovirus se transmiten fácilmente de persona a persona por vía orofecal, existiendo una variación estacional, con brotes anuales durante el
Tabla 48-11
Virus a s o c i a d o s c o n e n f e r m e d a d e s d e l sistema nervioso central
Síndrome
Causas frecuentes
Meningitis aséptica
Enterovirus VIH Parotiditis
Parálisis Encefalitis
Enterovirus Allavirus Flavivirus Bunyavirus VHS Parotiditis Sarampión VIH Enterovirus
Síndrome de Guillain-Barré Síndrome de Reye
VEB CMV Inlluenza A y B VVZ
ENCEFALITIS Y MENINGITIS VÍRICA Las infecciones virales del sistema nervioso central son relativamente infrecuentes, aunque la morbilidad y mortalidad asociadas a las mismas son considerablemente altas. El diagnóstico de laboratorio es importante para que los hospitales puedan organizar eficientemente el tratamiento de los pacientes y para que los organismos públicos responsables lleven a cabo el control de los insectos que son vectores para los arbovírus. La proliferación de los virus en las membranas meníngeas que rodean el cerebro provoca una inflamación aguda que cursa con fiebre, dolor de cabeza, rigidez de nuca y pleocitosis en el líquido cefalorraquídeo. En la encefalitis, la replicacíón del virus tiene lugar en el parénquima cerebral: la inflamación y la necrosis de los tejidos puede ser difusa o puede dar lugar a una lesión espacialmente definida y masiva. Muchos virus están asociados con cada una de las dos patologías (meningitis y encefalitis), aunque el daño puede solaparse implicando a ambas localizaciones anatómicas (meningoencefalitis) (Tabla 48-11). La encefalitis es una enfermedad relativamente poco frecuente en EEUU registrándose unos 2.000 casos anuales, aproximadamente El diagnóstico preciso está limitado por el hecho de que algunos virus neurotrópicos son delicados, siendo necesario el empleo de técnicas moleculares par? realizar el diag-
HIV = virus de la mmunodeficien linfocitica. para ver el significadc 48-3 y 48-4
Causas menos frecuentes
VHS CML WZ Hepatitis B Poliovirus Sarampión Poliovirus Rubéola Rabia Hepatitis B Adenovirus CML VVZ VRS Vacuna influenza CMV
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MESES/AÑOS
Figura 48-12. Variación estacional en el aislamiento de enterovirus (Lutheran General Hospital. Park Ridge. IL) verano-otoño (Figura 48-12). Las infecciones por los virus de las parotiditis, sarampión y adenovirus raramente se complican con una meningitis aguda. Las infecciones agudas por el VIH producen ocasionalmente una inflamación meníngea aguda (Fox, 1987). Aproximadamente en un 1% de infecciones primarias de herpes genital por VHS2 se manifiesta una meningitis transitoria asociada: el VHS2 es la principal causa de la denominada meningitis linfocítica benigna recurrente de Mollaret.
Diagnóstico de laboratorio El método más sencillo y sensible para diagnosticar la encefalitis viral es la amplificación del ácido nucleico del virus a partir de una muestra de LCR. La identificación de enterovirus por RT-PCR y de VHS, VVZ, VEB. CMV y HHV6 mediante PCR es una alternativa diagnóstica más sensible que la basada en el aislamiento en cultivo de los virus responsables, tanto de LCR como de tejido cerebral; se han desarrollado algunos sistemas comerciales para la identificación por PCR del VHS (Tang, 1998, 1999a). Se recomienda llevar a cabo un examen del LCR para detectar la presencia de proteínas, así como un recuento de células, puesto que los herpesvirus raramente son identificados cuando ambos parámetros son normales en el LCR (Tang, 1999b). Ocasionalmente puede realizarse una biopsia de cerebro, si existen sospechas clínicas de un posible tumor o una infección no viral. Una biopsia de un tamaño de 0,5 cm es más que suficiente para llevar a cabo el estudio anatomopatológico. realizar extensiones citológicas para el examen directo, el análisis por PCR y el cultivo pormenorizado de los posibles agentes infecciosos. La obtención del espécimen se describe en el Capítulo 57. La recuperación del VHS mediante cultivo celular se ha descrito con anterioridad en otra sección de este mismo capítulo; lambién debe intentarse el aislamiento de otros virus, y la muestra debe ser inoculada en todas las líneas celulares disponibles en el laboratorio. Las extensiones teñidas mediante Giemsa o FDA pueden poner de manifiesto la existencia de inclusiones nucleares herpéticas o de antígenos virales específicos. Muchos arbovirus y algunos enterovirus han de ser inoculados en animales de laboratorio para poder replicarse; si es necesario, la muestra de tejido puede congelarse a -70'C y enviarse a un laboratorio de referencia.
(diferentes combinaciones de células PMK, HDF, HEp-2, RD y de mono verde Buffalo) permite el crecimiento de muchos enterovirus y de otros virus (VHS, VVZ, sarampión, parotiditis y adenovirus). Si se intenta llevar a cabo el aislamiento de virus, se debe inocular sin demora alguna un volumen de 0.1 mi a 0,2 mi en los cultivos celulares en tubo estándar o en tubo shell-vial. Los ECP inducidos por los enterovirus comienzan como un cambio picnólico focal, con células aisladas que comienzan a redondearse y que rápidamente se extienden por la monocapa del cultivo celular (Fig. 48-13). El ECP es detectable al cabo de unos cuatro días hasta en el 69% de los cultivos positivos. La tipificación de enterovirus puede realizarse en los laboratorios de salud pública. En la Figura 48-14 se muestra un esquema de trabajo para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones víricas del SNC. Esta aproximación experimental mejora el rendimiento del diagnóstico y favorece un uso eficiente de los recursos de los laboratorios, especialmente en lo relativo a la identificación de las infecciones del SNC asociadas a los artrópodos. Un brote inesperado de encefalitis por el virus West Nile fue delectado rápidamente gracias a los esfuerzos combinados de los laboratorios hospitalarios y gubernamentales (MMWR, 1999).
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Los enterovirus son el agente infeccioso más común en la meningitis aséptica aguda: la RT-PCR se ha convertido en la técnica idónea para la identificación de enterovirus en LCR, con unos rendimientos del 128% al 142% cuando se compara con el aislamiento mediante cultivo celular (Rotbar, 1994, 1997; Kessler, 1997). Se necesitan entre 10 pl y 100 ul de LCR para la RT-PCR; los formatos simplificados de las pruebas de microtitulación han permitido acortar el tiempo de espera a 6 horas. El cultivo del LCR con la inoculación de varias líneas celulares
Figura 48-13. Monocapa de un cultivo de tejidos de células A549 donde aparecen los ECP causados por la multiplicación de un enterovirus ECHO (aumento: x 200; microscopia de contraste de fases).
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
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Figura 48-14. Esquema del prolocolo para el diagnóstico de la meningoencefalitis viral.
EXANTEMAS VIRALES Varios tipos de virus atacan primariamente la piel: algunos infectan la epidermis escamosa directamente (herpes oral y genital, verrugas causadas por papilomavirus humanos o el molluscum conlagiosum provocado por poxvirus). pero la mayoria de los exantemas son debidos a virus que afectan la piel y las membranas mucosas por diseminación hematógena (VVZ, sarampión, rubéola, enlerovirus. parvovirus. VHH6) (Cherry, 1993). La mayor parte de estas infecciones son relativamente benignas y típicas de la infancia, que se diagnostican clínicamente, sin necesidad de pruebas de laboratorio; sin embargo, el aislamiento del virus por cultivo, la identificación de antígenos virales o la confirmación por métodos serológicos pueden ser de utilidad a la hora de elegir la terapia antiviral, delimitar la extensión de la enfermedad en los casos graves o aplicar medidas de control de la infección en los pacientes hospitalizados. Los procedimientos diagnósticos de laboratorio se resumen en la Tabla 48-12. El VVZ causa la varicela y el zóster. En la varicela, el VVZ se disemina mediante gotítas de líquido infectadas en aerosoles que son inhalados, se multiplica en la nasofaringe y seguidamente penetra en el torrente circulatorio, por donde circula hasta alcanzar la piel (Weller, 1992). La replicación del virus en el epitelio escamoso da lugar a la aparición de unas vesículas pruriginosas que rápidamente se transforman en úlceras que eventualmente se recubren con una costra y curan sin dejar cicatriz. En los niños, los síntomas sístémicos son suaves y las secuelas son raras: en los adultos, mujeres embarazadas, neonatos y pacientes inmunocomprometidos, la enfermedad puede ser más grave, con neumonía y afectación visceral además de las típicas lesiones en la piel (Gershon, 1976), Una vez que la varicela ha remitido, la infección por el VVZ se mantiene latente en los ganglios sensitivos neuronales (Mahalingham, 1991; Straus. 1989); con la reactivación, el VVZ se extiende desde las raíces de los ganglios trigéminos o dorsales hasta alcanzar nuevamente la piel, donde origina unas vesículas cutáneas dolorosas. con una distribución en dermatoma (zóster). El zóster es más frecuente en ancianos y en pacientes francamente inmunocomprometidos; cuando aparece en adolescentes y adultos jóvenes, puede ser indicativo de una infección subyacente por el VIH (Pana, 1994)
Tabla 48-12
El liquido de las vesículas es rico en virus, siendo el espécimen ideal para el aislamiento por cultivo y la tinción DFA. Las células HDF permiten el crecimiento del VVZ. El cultivo en tubos tradicionales es un método lento y de poca sensibilidad, pero si se utilizan tubos shell-vial para el cultivo, aumenta el rendimiento (hasta un 75%) y la rapidez en la detección (Brinker. 1993). La recogida de muestras a partir de las lesiones de la piel sospechosas de estar producidas por el VZZ se lleva a cabo de la misma forma que en el caso de las vesículas causadas por el VHS. De igual modo, el protocolo para el cultivo del VVZ es similar al que se sigue para el VHS (Fig. 48-3); sin embargo, los cultivos estándar en tubo se incuban durante dos semanas y las monocapas de células en los tubos shell-vial se tiñen a los tres y cinco días con la técnica DFA, utilizando un conjugado para el WZ. Los ECP causados por el WZ aparecen como pequeños parches de células redondeadas, hinchadas y retráctiles en la monocapa de fibroblastos, y son semejantes a los que aparecen como consecuencia de la proliferación del CMV. Debido a que la conducta del VVZ en los cultivos de tejidos es algo problemática, la tinción DFA de las células presentes en las vesículas para detectar los antígenos virales es el método diagnóstico más rápido y sensible (Schrim, 1989). De los aproximadamente 70 serotipos de enterovirus. varios son capaces de producir erupciones vesiculares o maculopapulares generalizadas (Coxsackie B1 y A9, y virus ECHO 2, 4. 9,11,19 y 33). habitualmente durante los meses cálidos. La enfermedad de mano, pie y boca (causada pnncipalmente por el virus Coxsackie A16) es típica de niños pequeños, y se manifiesta con la aparición de vesículas en la lengua y en la piel de la palma de las manos y la planta del pie. Los miembros adultos de la familia del niño infectado también pueden desarrollar, ocasionalmente, la enfermedad con los síntomas característicos. El diagnóstico de laboratorio está limitado a la recuperación del virus en cultivos celulares: la piel que recubre las vesículas, especialmente las de la palma de la mano y planta del pie. debe levantarse completamente para dejar expuestas las células escamosas, que deben recogerse frotando enérgicamente con un hisopo. Las infecciones por enterovirus también afectan al tracto gastrointestinal, por lo que el material recogido con hisopo de la garganta y el recto es apropiado para llevar a cabo el cultivo. La identificación de enterovirus en cultivos celulares ha sido descrito en una sección anterior de este capitulo. Ni la tinción
Diagnostico d e laboratorio de las e n f e r m e d a d e s e x a n t e m á t i c a s víricas c o m u n e s Exantema
Virus
Cultivo/Detección de antigenos
Vancela/zósler
Varicela-zóster
EIA o IFA (varicela) para IgM
Erupción cutánea por enterovirus (enfermedad de mano, pie y boca) Sarampión Rubéola Eritema infeccioso
Enterovirus
Preparación de Tzanck Extensión para DFA* Cultivo (mayor sensiblidad en tubos s/tell-vial) Cultivo* Cultivo Cultivo de interferencia' HIS en eritroblastos infectados PCR Co-cullivo en linfoblastos* Cultivo* Frotis para tinción DFA
EIA o IFA para IgM" EIA para IgM" EIA o IFA para lgM
Sarampión Rubéola Parvovirus B19
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Serologia
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Exantema súbito VHS
VHH6 VHS1 y VHS2
'Método recomendado 'Métodos utilizados en los laboratorios de investigación y/o referencia VHH = herpesvirus humano; para ver el significado de otras abreviaturas, consúltense las Tablas 48-3 hasta la 48-6
EIA para IgM'
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
DFA ni la serología tienen utilidad para el diagnóstico de los exantemas producidos por enterovirus (Cherry, 1963,1993; DeChamps, 1988). El sarampión es una enfermedad viral altamente contagiosa que tiene síntomas sistémicos y respiratorios (liebre, conjuntivitis, coriza, lesiones orales, tos y una erupción cutánea eritematosa y maculopapular generalizada) (Bellini, 1994). La vacunación ha reducido en gran medida la incidencia del sarampión en EE.UU., pero la enfermedad continúa siendo un grave problema en países pobres, en donde está asociada con una gran morbilidad y mortalidad, debido a las complicaciones acompañantes (neumonía) y a la malnutrición. El virus causante puede aislarse de la nasofaringe al comienzo de la enfermedad, aunque la infección aguda se diagnóstica más fácilmente por técnicas serológicas, detectando las IgM específicas frente al virus. La inmunidad adquirida tras la infección permanece, presumiblemente, de por vida y se comprueba mediante la detección de IgG especificas: sin embargo, la inmunidad debida a la vacunación puede desvanecerse durante los últimos años de la adolescencia y la madurez. La infección que pueda producirse en estas circunstancias produce una enfermedad atípica, con unas grandes posibilidades de sufrir neumonitis y con una erupción no característica. El diagnóstico serológico es particularmente útil en el caso del sarampión atípico. El parvovirus B19 produce un tipo de exantema infantil denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar), una enfermedad febril infantil que presenta una erupción cutánea maculopapular distintiva que da a la cara una apariencia de "mejillas abofeteadas" (Erdman, 1991: Plummer, 1985). La infección en los adultos puede producir también ariralgias (Naides, 1990). Los parvovirus infectan las células precursoras inmaduras del linaje eritrocitario, presentes en la médula ósea, y pueden provocar crisis aplásica en pacientes con hemoglobínopatía o con infección por VIH (Harris, 1992). La infección primaria durante el embarazo puede ocasionar una aplasia de glóbulos rojos en el feto, con anemia grave e hidropesía fetal. El diagnóstico de laboratorio fue objeto de análisis con anterioridad dentro de este mismo capítulo. El virus de la rubéola produce el denominado sarampión alemán, una enfermedad febril suave con una erupción cutánea maculopapular transitoria (Cherry, 1993). La infección en los niños no tiene mayores consecuencias, aunque en los adultos puede provocar artralgias. La única complicación seria de la rubéola es la diseminación transplacentaria del virus hasta alcanzar al feto, lo que conlleva un riesgo muy elevado de aparición de malformaciones congénitas. La infección aguda se diagnostica mediante la detección de IgM específicas frente al virus. La comprobación de la situación mmunitaria de una persona se determina fácilmente investigando si posee IgG específicas frente al virus. El VHH6, un virus linfotrópico capaz de infectar a los linfocitos B y T, causa el exantema súbito (roséola infantil), una enfermedad autolimitada, común de la primera infancia, que se caracteriza por una fiebre elevada y la aparición de una erupción cutánea maculopapular fugaz, que desaparece al mismo tiempo que la fiebre remite bruscamente (Asano, 1994; López. 1988: Salahuddin, 1986). La infección primaria, por el VHH6 en niños mayores y en adultos está asociada a una enfermedad febril linfoproliferativa, con características de MI aguda (descrita con anterioridad en este capítulo) y que pudiera estar asociada con el síndrome de fatiga crónica, y posiblemente con retinitis y neumonitis en pacientes inmunosuprimidos (Cone, 1993). También se ha descrito el diagnóstico de laboratorio de la infección causada por el VHH6 en este capítulo.
GASTROENTERITIS VÍRICA La gastroenteritis vírica es una importante causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con una mayor incidencia en los niños pequeños en países en vías de desarrollo. En EE.UU., la enteritis de origen vírico raramente es mortal, aunque se detectan del orden de 3 millones de casos anualmente, con unas 200.000 hospitalizaciones pediátricas, aproximadamente ¡Parashar, 1998). Los virus responsables son muy diversos, pero todos comparten la característica de ser ubicuos. En bebés y niños pequeños, la diarrea grave está causada por rotavirus, adenovirus entéricos, calicivirus, astrovirus y coronavirus (Bates, 1993: Barnes, 1999). El virus Norwalk y otros virus parecidos provocan náuseas, vómitos y diarrea, principalmente en adultos (Hedberg, 1993) (Fig. 4815). El tratamiento de todas la gastroenteritis virales es de mantenimiento. Los rotavirus son responsables de al menos el 50% de los casos de diarrea acuosa en niños pequeños y bebés en EE.UU.; la enfermedad tiene un pico en su incidencia entre los 3 y los 15 meses de edad (Haffejee, 1991). Tam-
Figura 48-15. Detección de virus que producen gastroenteritis mediante enzimoinmunoensayo (EIA) y microscopía electrónica (ME). bien se detectan infecciones sintomáticas por rotavirus en ancianos ingresados en residencias (Marríe. 1982). La transmisión es por vía orofecal. y en las áreas de clima templado las epidemias por rotavirus tienen lugar durante los meses frios: sin embargo, en climas cálidos los casos aparecen durante todo el año. La deshidratación con desequilibrio electrolítico es la complicación más grave de la infección por rotavirus, y es la razón principal para hospitalizar al paciente. Los rotavirus pueden sobrevivir transitoriamente en superficies inertes, razón por la que deben extremarse las medidas de control y aislamiento para prevenir la diseminación nosocomial. Los serotipos 40 y 41 de adenovirus están asociados con procesos de gastroenteritis y son responsables de un 10% a un 20% de las infecciones de este tipo en niños (Brandt, 1983). La enteritis por adenovirus es similar a la enfermedad causada por rotavirus, aunque no muestra variaciones estacionales. Los astrovirus han sido identificados como responsables de infecciones nosocomiales y de brotes en asilos (Mitchell, 1993; Sastri, 1998): también se han detectado casos de gastroenteritis suave en adultos y de diarrea en pacientes infectados por el VIH (Grohman, 1993). Los calicivirus son responsables de entre el 1% al 6% de casos de gastroenteritis en niños pequeños y, ocasionalmente, en ancianos (Dinulos. 1994). Los coronavirus raramente causan diarrea en niños. El virus Norwalk y otros virus morfológicamente relacionados con él (Hawaii; Snow Mountain) se incluyen dentro del grupo de los calicivirus; todos ellos provocan gastroenteritis aguda, que se caracteriza por que los afectados manifiestan náuseas y vómitos más intensos que la propia diarrea acompañante. Los niños mayores y los adultos son los más frecuentemente afectados, aunque todos los grupos humanos pueden ser afectados con independencia de la edad. Los virus Norwalk sobreviven en aguas contaminadas, crustáceos y alimentos preparados, y son responsables de numerosos brotes en todo el país (EE.UU.) (Hedberg. 1993).
Diagnóstico de laboratorio Todos los virus causantes de gastroenteritis crecen pobremente, o no lo hacen en absoluto, en las líneas celulares estándar. El diagnóstico se ha basado tradicionalmente en la morfología distintiva de cada uno de ellos mediante microscopía electrónica (ME) (Fig. 48-16). Las muestras de heces se centrifugan y se filtran, y una alícuota de la muestra procesada se transfiere a una rejilla para ME y se tiñe con ácido fosfotúngstico. Los virus son teñidos negativamente mediante este procedimiento, lo que permite visualizar con gran facilidad sus características morfológicas (tamaño, organización de la cápsida, características distintivas de la superficie). Si se añade un anticuerpo especifico al filtrado de la muestra de heces, se consigue aglutinar las partículas víricas en acúmulos, lo que facilita su reconocimiento e identificación (inmunomicroscopia electrónica). Los rotavirus son virus con una cápsida icosaédrica sencilla o doble, sin envuelta, que miden entre 55 nm y 75 nm de diámetro y tienen un aspecto que recuerda a una rueda. Los adenovirus entéricos son morfológicamente idénticos al resto de adenovirus; tienen una cápsida icosaédrica y tienen un diámetro entre 70 nm y 90 nm. Los calicivirus también carecen de envuelta, tienen entre 30 nm y 35 nm de diámetro y presentan una serie de depresiones en forma de
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
copa ordenadas regularmente en su cápsida. Los astrovirus tienen entre 27 nm y 30 nm de diámetro: ciertas estructuras de su cápsida dan lugar a una morfología que semeja a una estrella de seis puntas. Los virus Norwalk miden entre 24 nm y 40 nm, y son virus sin envuelta, geométncamente simétricos. Los coronavirus son los únicos virus, dentro de este grupo, que presentan una envuelta lipídica: los viriones son más grandes (tienen un diámetro entre 75 nm y 100 nm) y presentan unas estructuras en forma de bastón que se proyectan desde la cubierta, dando al conjunto la apariencia de una corona. La morfología de cada tipo de virus al microscopio electrónico es muy característica, pero la ME no está disponible en muchos laboratorios. Se puede llevar a cabo una detección sencilla y precisa de rotavirus en heces mediante ¡nmunoensayos o aglutinación con látex. Ambos métodos tienen una gran especificidad, pero el EIA tiene una sensibilidad ligeramente superior (Dennehy. 1994,1999: Thomas, 1994). El diagnóstico rápido es de gran ayuda en el caso de pacientes hospitalizados para aplicar las medidas que eviten o reduzcan la diseminación nosocomial de los virus. Está disponible comercialmente un EIA para detectar antigenos de adenovirus entéricos que también es sensible y específico. Se han desanollado una serie de métodos (EIA, técnicas de hibridación directa o previa amplificación con sondas de ácidos nucleicos, y ensayos genotípicos) para otros virus que producen gastroenteritis que están disponibles en los laboratorios de investigación y de sanidad pública; estos métodos han sido de particular utilidad en la evaluación de los brotes relacionados con la ingestión de alimentos contaminados.
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HEPATITIS VÍRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS Muchos virus afectan directamente al hígado. El virus de la fiebre amarilla y otros arbovirus hepatotóxicos provocan una necrosis hepatocelular masiva. La agregación de linfocitos atípicos en el hígado asociada a la infección por VEB. CMV. VHH6 y VIH también provoca daño hepático como parte del síndrome de la mononucleosis. En pacientes inmunodeprimidos. adenovirus. VHS, VVZ. CMV y virus ECHO causan, ocasionalmente, una hepatitis muy agresiva (Hierholzer, 1992). De todos modos, la mayor parte de enfermedades víricas del hígado están producidas por los virus de la hepatitis A, B, C. D y E. que son todos hepatotrópicos y causan una lesión debida a la destrucción litica de los hepatocitos (Iwarson, 1992). El contagio por los virus de la hepatitis A (VHA) y de la hepatitis E (VHE) tiene lugar de persona a persona, transmitiéndose por vía oro-fecal. El VHA es un picomavirus sin envuelta relacionado con los enterovirus que puede sobrevivir en agua contaminada y alimentos; los mariscos contaminados con aguas residuales sin depurar han sido responsables de varios brotes de gran envergadura. Las personas que viven en condiciones sanitarias deficientes, los niños en los asilos y en instituciones masificadas. y personal sanitario o que está al cuidado de niños representan los grupos que tienen mayor riesgo de resultar infectados por el VHA (Iwarson, 1992). En los niños, la enfermedad aguda es suave y, a menudo, asintomática: ocasionalmente, los adultos
Figura 48-16. Observación al microscopio electrónico de preparaciones de muestras de heces teñidas negativamente con ácido losfotúngstico. A, Rotavirus: se aprecian distintos monotipos con cápsida sencilla o doble (aumento: x 200.000). 6. Adenovirus: se aprecia el característico patrón triangular en la superficie (aumento: x 100.000). C. Calicivims: se aprecian las depresiones superficiales en forma de copa (aumento: x 200.000). En la micrografia se pueden observar también dos rotavirus (de mayor tamaño) por encima de los calicivims. (Fotografías cortesía de Teresa Valdivieso.)
SECCIÓN VI
1066 Tabla 48-13
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Características clínicas de las infecciones por virus de la hepatitis Hepatitis A
Clasificación Via de iransmisión Genotipos Tiempo medio de incubación (rango) Cronificación
Riesgo de carcinoma hepatocelular Porcentaje de mortalidad. hepatitis aguda
Picornaviridae (Enterovirus 72) Fecal-oral Uno 4 semanas (10-50 dias) No
No -0.3%
Hepatitis B
Hepatitis D
Hepatitis E
Flaviviridae
Virus satélites
Calicivirus
Percutánea. mucosas Al menos 8 12 semanas (14-180 dias) 10% en adultos, 25% en niños. 80% en beóés Si. elevado -1,4%
Percutánea, mucosas Al menos 6 8 semanas (14-182 dias) 85% (un 20% desarrolla una cirrosis) Sí, bajo t%-2%
Percutánea, mucosas Uno (21-91 días)
Fecal-oral Uno 6 semanas (14-63 dias) Poco (recuente
pueden desarrollar una enfermedad grave, aunque la hepatitis fulminante con resultado de muerte es rara (un 0,6% o menos de los afectados). La recuperación es total y no existe estado de infección crónica. Existen vacunas para el VHA que son seguras y eficaces (Ashur, 1999). Se han producido brotes de la enfermedad debidos al VHE en países en vías de desarrollo que tienen unas condiciones de alimentación y de potabilización del agua por debajo de los niveles óptimos, habiéndose descrito muy pocos casos en EE.UU. (Viswanathan, 1957: Wald, 1995). Los más frecuentemente afectados son los adolescentes y los adultos jóvenes. La mortalidad es muy baja, excepto en el caso de las mujeres embarazadas, en las que el porcentaje de fallecimientos puede alcanzar el 20% (Duff, 1998). El VHE no provoca infección crónica. El virus de la hepatitis B (VHB) se transmite normalmente a través de la sangre, y la infección se contrae, clásicamente, mediante transfusiones con sangre infectada o pinchazos con agujas hipodérmicas contaminadas. Sin embargo, la transmisión vertical de la madre al feto durante el embarazo, el contagio por contacto sexual directo y la exposición a fluidos corporales, como la saliva en el ambiente familiar, también son rutas importantes para la diseminación de la enfermedad. La infección aguda es, frecuentemente, sintomática y puede ser fulminante, causando una necrosis hepatocelular masiva de pronóstico fatal en un 1% o 2% de los casos. La infección por el VHB puede hacerse crónica, aunque el carácter crónico depende de la edad en la que se contrajo la infección. Hasta un 90% de los niños que adquirieron la infección en el útero, por transmisión vertical desde la madre, pueden convertirse en portadores crónicos, comparado con el 25% que se detecta entre niños infectados con postenoridad al nacimiento o el 10% entre los adultos. El daño hepatocelular es continuo durante la infección crónica: en el 2% de los casos de infección crónica puede manifestarse una forma crónico-activa de hepatitis con riesgo eventual de cirrosis (Lee, 1993; Overby, 1992). La cirrosis por VHB es un factor de riesgo para desarrollar un carcinoma hepático (CCH). La infección por VHB puede ser prevenida en gran medida mediante vacunación. La vacunación masiva de niños en Taiwan ha reducido de forma significativa la incidencia del CCH pediátrico (Chang, 1997).
Tabla 48-14
Hepatitis C
Hcpadnavindae
5%-10% ?
2%-20%, con cointección con VHB, 30% con sobreinlección
No 1 %-2%; hasta un 20% en mujeres embarazadas
La coinfección o sobreinfección del VHB con el virus de la hepatitis D (VHD) provoca una aceleración en la destrucción de hepatocitos y un incremento en los porcentajes de mortalidad hasta valores de un 30%. El VHD es un virus incompleto que necesita la intervención de ciertos antígenos del VHB para poder expresarse y replicarse completamente. El VHD puede transmitirse de persona a persona en entornos familiares, en aquellas áreas donde el virus tiene carácter endémico (América del Sur. África. Italia), aunque en EE.UU. las transfusiones sanguíneas y la drogadicción por vía intravenosa son las principales causas de transmisión (Hadziyannis. 1997). En EE.UU., el virus de la hepatitis C (VHC) es el responsable de la denominada hepatitis no A, no B, siendo el responsable del 80% al 90% de los casos de hepatitis adquirida tras una transfusión sanguínea, antes de que se estableciesen, a partir del año 1990. los análisis habituales para el control de la sangre y los hemoderivados (Cuthbert, 1994). El consumo de drogas por vía parenteral es, en la actualidad, el principal factor de riesgo; el personal sanitario infectado por haberse pinchado inadvertidamente con agujas contaminadas constituye un porcentaje minoritario de casos. La transmisión del VHC durante el embarazo, o como consecuencia de relaciones sexuales o contacto entre miembros en el entorno familiar, se da con una eficiencia mucho menor de la observada para el VHB (Rooney, 1998). El porcentaje de casos de hepatitis fulminante con resultado de muerte es semejante al que se observa asociado a la infección por el VHB. Sin embargo, más del 75% de infecciones por el VHC se hacen crónicas y hasta un 20% acaban en cirrosis; el riesgo de desarrollar un carcinoma hepatocelular también es elevado. El tratamiento con interferón-u y ribavirina ha traído como consecuencia una disminución progresiva de los casos de infecciones crónicas por VHB y VHC, lo que puede modificar o prevenir, a largo plazo, las secuelas duraderas (Yoshioka, 1992; Christie, 1999). Desafortunadamente, el porcentaje de respuesta es menor en las infecciones por el genotipo 1 del VHC. que representan el 75% de todos los casos en EE.UU. (Gitnick, 1998). Las técnicas de segunda y tercera generación de inmunotransferencia con proteínas recombinantes y los métodos de enzimoinmunoensayo (EIA) tienen
M a r c a d o r e s s e r o l ó g i c o s y antigénicos en el diagnóstico de la hepatitis
VHA - aguda Antigua/posvacunación VHB - temprana Período ventana En resolución Crónica Antigua Posvacunación VHC -aguda Crónica Antigua VHD - cointección Sobreinlección VHE + = posUivo - = negalivo Adaptada de Biesemier KW. Parks D. Gertis C y cols : Viral hepatitis serology at the University ol North Carolina Hospitals Update. Bull Lab Med 1994; 134:1; con permiso del editor.
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
una elevada sensibilidad y especificidad en la delección de anticuerpos (rente al VHC. Los pacientes seropositivos deben ser evaluados adicíonalmente en busca de una infección persistente por el VHC. realizando estudios de la función hepática en los mismos y. en algunos casos, una biopsia hepática, cuantificando mediante RT-PCR la carga de ARN del VHC y, si procede, caracterizando el genotipo del virus (Lam, 1999). Los cinco virus de la hepatitis no se replican en las líneas celulares estándar. La fase en la que se encuentra la infección queda definida mediante la detección de IgM e IgG específicas y de antígenos virales (Biesemier, 1994). Las características clínicas de los virus do la hepatitis y los marcadores serológicos de infección se resumen en la Tabla 48-14. A partir de individuos que han desarrollado una hepatitis después de haberles sido realizada una transfusión, se han aislado el virus de la hepatitis G'GVB-C (un flavivirus relacionado con el VHC) y el virus transmitido por transfusión (VTT), un virus con ADN de cadena sencilla. Sin embargo, ambos virus se encuentran frecuentemente en personas asintomáticas, por lo que su asociación con una patología hepática no está clara (Hadziyannis, 1998; Abe. 1999: Ding, 1999).
Virus de la inmunodeficiencia humana El VIH-1 es un retrovirus incluido dentro de la subfamilia Lentivirinae que en la actualidad parece estar diseminado por todo el mundo. El VIH infecta y destruye a los Imfocitos T-CD4, lo que da lugar a que se produzcan numerosas infecciones oportunistas y tumores secundarios en los individuos afectados (Phillips, 1992; Stein. 1992; Poli, 1993: Schnittman, 1990). El VIH también es neurotrópico y puede causar meningitis aguda y una encefalopatía destructiva lenta (Atwood, 1993). La mitad de los individuos con intección aguda manifiestan unos síntomas parecidos a los de la mononucleosis (véase la sección titulada Mononucleosis infecciosa heterófilo-negatíva, en este mismo capitulo) antes de entrar en una fase asintomática en la que va teniendo lugar una destrucción progresiva de las células T-CD4. El tiempo medio necesario para manifestar todas las características del sida es de 10 a 11 años: entre el 5% y el 10% de los afectados desarrollan el sida en dos o tres años, mientras que entre un 5% y un 10% de infectados mantienen estables los valores de recuento de linlocitos y permanecen asmtomáticos indefinidamente (Muñoz, 1995). Los niños que han sufrido una infección vertical en el momento del nacimiento muestran generalmente una progresión muy rápida de la enfermedad (Downs. 1995). Existen varios sistemas comerciales basados en la técnica del enzimoinmunoensayo, preparados con antígenos purificados del VIH u obtenidos mediante recombinación, que son capaces de detectar IgG especificas frente al VIH, entre dos y cuatro semanas después de que se haya producido la infección, con unos niveles de especificidad y sensibilidad excelentes. Los bancos de sangre buscan de forma habitual los anticuerpos frente al VIH-2: esta es una estrategia deseable también en las áreas de África, donde la infección es endémica. Un EIA que ha dado positivo para anticuerpos frente al VIH debe ser repetido y a continuación confirmado con un test adicional como la mmunotransferencia [Western immunoblotting, mediante el cual sea posible verificar que los anticuerpos del paciente reaccionan con antígenos específicos del VIH (MMWR, 1991). Los resultados que se muestren en los informes serológicos de laboratorio en relación con el VIH deben ser concisos, y debe evitarse el empleo de comentarios ambiguos o confusos (Hewitt. 1992).
1067
El tratamiento antirretroviral de gran eficacia (TARGA) con drogas pertenecientes al menos a dos clases distintas de antirretrovirales (análogos nudeósidos inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores no análogos e inhibidores de la proteasa) ha mejorado de forma espectacular las expectativas de supervivencia y la calidad de vida de los afectados (Saag, 1996; Shafer, 1999). La terapia también ha reducido enormemente la transmisión perinatal. Desgraciadamente, continúan apareciendo variantes del virus resistentes a los antirretrovirales, incluso en aquellos pacientes que están recibiendo una terapia combinada, lo que refuerza la necesidad de trabajar constantemente en la búsqueda y producción de nuevos tipos de agentes antirretrovirales. El VLHT (virus de la leucemia humana de células T) infecta a los linlocitos T-CD4- y causa una leucemia adulta de células T (LAT); la enfermedad se da entre el 2% y el 4% de las personas infectadas por el VLHT-1 en áreas endémicas del Japón (Folks, 1998). El VLHT-I también causa mielopatia/paraparesis espástica tropical (HAM/TSP). una enfermedad degenerativa crónica caracterizada por un debilitamiento progresivo de las extremidades inferiores, espasticidad y pérdida de la función sensorial y del control de la vejiga (Manns, 1999). El VLHT-II se ha aislado a partir de pacientes con leucemia de células T peludas o tricoleucemia, aunque la relación del virus con la enfermedad no está claramente establecida. Existen técnicas de enzimoinmunoensayo para la detección de anticuerpos que se utilizan en bancos de sangre.
INFECCIONES VÍRICAS EN HUÉSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS La respuesta inmune a la infección por virus implica una compleía interacción tanto de factores humorales como celulares. El control de la infección aguda es llevado a cabo por los procesos de la inmunidad celular. Los granulocitos natural M/er(NK) de gran tamaño que circulan por la sangre y los tejidos identifican aquellas células que expresan antígenos virales (antigenos extraños o no propios) y las destruyen por lisis proteolítica. Al principio de la infección aguda, los antigenos virales son procesados por los macrofagos y presentados a los Imfocitos T: las células T-CD4 producen citocinas que promueven la expansión clonal de las células T-CD8 citotóxicas. las cuales eliminan, a continuación, las células hospedadoras que contienen antigenos virales. Cualquier alteración en la normal interacción entre las células CD4, CD8 y los NK reduce la capacidad del huésped para controlar la enfermedad vírica. La inmunidad mediada por células también juega un papel crítico en la supresión de virus que se encuentran en fase de latencia en el hospedador (tales como VHS. CMV y VEB). En los individuos sanos, la mayor parte de infecciones por reactivación con estos virus son asintomáticas o producen una enfermedad limitada que queda confinada a localizaciones anatómicas concretas (p. ej.. el herpes oral o genital). Si los mecanismos de la inmunidad celular están alterados, cualquier infección recurrente puede dar lugar a un
El VIH puede propagarse en cultivos de tejidos, co-cultivando linlocitos o muestras de tejidos infectados del paciente con linfocitos de un donante sano que hayan sido estimulados con fitohemaglutinma. mterleucina-2 e mterferón. Esta es una técnica cara y compleja, y potencialmente peligrosa, que no debe realizarse en los laboratorios de diagnóstico ordinario. La necesidad de tener que aislar el VIH mediante cultivo ha sido reemplazada por los métodos de diagnóstico molecular. La amplificación por PCR del ácido nucleico proviral del VIH se utiliza, en principio, para diagnosticar la infección Iransmitida verticalmente durante los primeros meses de vida del recién nacido (véase la sección titulada Infecciones víricas congénitas y perinatales, en este mismo capitulo). Los ensayos para determinar la carga viral cuantifican los transcritos de ARN del VIH en el plasma. Estas determinaciones tienen un valor prognóstico y han representado una revolución en el uso de la terapia antirretroviral. Las reducciones en el número Figura 48-17. Monocapa de fibroblastos MRC-5 que muestra los ECP causados de copias de ARN viríco. hasta un valor de 0,5 unidades logarítmicas por mi. por la replicación del CMV tras 11 días de incubación (microscopía óptica de coninducidas por el tratamiento, se asocian con una progresión clínica más lenta. traste de fases: aumento: x 100).
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SECCIÓN VI
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 48-15 Direcciones d e interés e n Internet Nombre de la página
Dirección en la web
Centers tor Disease Control and Prevention Wold Health Organization Association for Professionals m Infection Control and Epidemiology Medscape American Society tor Microbiology European Society lor Clinical Virology National Centers lor Inlectious Diseases Pan American Society lor Clinical Virology Lab Explorer All the Virology on Ihe WWW Johns Hopkins Infectious Disease
proceso altamente agresivo a nivel local o bien a la diseminación del agente patógeno, produciendo lesiones multiorgánicas graves. El número de pacientes inmunodeprimidos se ha incrementado de forma espectacular en los últimos 20 años. Los tratamientos con corticosteroides, quimioterápicos, radiaciones, drogas inmunosupresoras, asi como la eliminación de los linfocitos T-CD4 por la acción del VIH, causan daño en los mecanismos que regulan la respuesta inmune celular y aumentan la susceptibilidad a la infección por una gran variedad de virus. Infecciones pnmanas como la mononucleosis por el VEB. la gripe y la varicela son, a menudo, mucho más graves en estas circunstancias. También puede tener lugar una proliferación de los condilomas genitales causados por papilomavirus humanos, con una progresión acelerada hacia la displasia escamosa y el carcinoma, tanto en mujeres como en hombres. A menudo, las enfermedades víricas más graves son consecuencia de la reactivación en el hospedador de virus durmientes endógenos (CMV, VHS y VVZ). En este contexto, se han descrito casos de necrosis de las lesiones mucocutáneas orales y perianales causadas por el VHS, y zóster con afectación de varios dermatomas. Las infecciones víricas oportunistas más comunes están causadas por CMV. en pacientes infectados por el VIH y en trasplantados. Los enfermos de sida con unos valores de recuento de células CD4 por debajo de 100 por mnv padecen retinitis por CMV como complicación más frecuente. También se dan casos de neumonía, así como de infecciones del tracto gastrointestinal y del SNC causadas por CMV. Tampoco es infrecuente observar afectación multiorgánica en autopsia (Drew, 1992). La infección por CMV produce las típicas inclusiones específicas en las células infectadas, aunque la observación de las mismas carece de sensibilidad de cara al diagnóstico. La sensibilidad se incrementa ligeramente realizando tinciones con inmunoperoxidasa o hibridación in silu (HIS). aunque el aislamiento del virus es la técnica que goza de una mayor precisión diagnóstica. El CMV se replica casi exclusivamente en la línea celular HDF: su crecimiento es lento, siendo necesario incubar durante siete dias. e incluso más. para que se desarrollen los ECP. Los fibroblastos infectados conservan inicialmente su morfología fusiforme, mientras que su núcleo se hincha y se hace más refringente.
Figura 48-18. Cultivo de fibroblastos MRC-5 en tubos shelt-vial donde se aprecia un gran número de núcleos fluorescentes tras la tinción con el anticuerpo específico frente al antigeno precoz del CMV, conjugado con fluoresceina (aumento: x 250).
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Eventualmente. toda la célula puede redondearse y distorsionarse, a la vez que el virus se extiende a las células adyacentes, formando una zona de células dañadas que va aumentando de tamaño progresivamente (Fig. 48-17). La detección del CMV se acorta en uno o dos días si se utilizan los cultivos en tubos shell-vial y se lavorece la adsorción de los virus a la monocapa de células mediante centrifugación (Gleaves, 1984, 1987). Las monocapas de células HDF se inoculan con leucocitos de sangre periférica (separados mediante centrifugación en gradientes de densidad), liquido del lavado bronquioalveolar (LBA). orina o tejidos homogeneizados; tras unas 16 a 40 horas de incubación, la monocapa se tiñe con un anticuerpo especifico frente al antigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina. Los fibroblastos infectados muestran una fluorescencia homogénea por todo el núcleo (véase Fig. 48-18) La especificidad del método es del 100% y la sensibilidad excelente cuando los cultivos celulares se inoculan con orina, tejidos homogeneizados o LBA (del 95% al 100%). Sin embargo, la inoculación de leucocitos de sangre periférica en cultivos en tubos shell-vial tiene tan sólo una sensibilidad del 75% comparada con la que se obtiene cuando la inoculación se lleva a cabo en monocapas en tubos estándar: por tanto, se recomienda siempre efectuar un cultivo suplementano. En los pacientes inmunocomprometidos. el CMV es la causa más frecuente de viremia. aunque ocasionalmente estos individuos pueden desabollar infecciones por VVZ, VHS. adenovirus y. a veces, enterovirus. Los cultivos tradicionales en lubo de células HDF y A549 incubados durante 14 días luncionan adecuadamente para la recuperación de todos esos agentes y también del CMV (Stanberry, 1994). Otra ventaja del aislamiento del CMV en tubos shell-vial es la facilidad con que esta técnica permite realizar cultivos semicuantilativos (Buller, 1992: Slavin, 1992). El empleo de un inoculo estandarizado de células (leucocitos o células del LBA) y un recuento de los núcleos fluorescentes que aparecen en el cultivo celular tras la tinción con el anticuerpo especifico frente al antigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina, proporciona unos datos que tienen una cierta utilidad clínica a la hora de eslimar la gravedad de la infección, controlar la respuesta al tratamiento y realizar una estimación pronóstica. En cualquier caso (cultivos celulares en tubos estándar o en tubos shell-vial), la recuperación del CMV se incrementa si los especímenes se inoculan inmediatamente después de haber sido obtenidos en cultivos celulares frescos (Brumbach, 1997; Roberts, 1997). La infección por CMV en receptores de trasplantes de órganos o de médula ósea (alogénico) compromete seriamente el resultado de los mismos El virus puede dañar directamente los órganos trasplantados, y la toxicidad de las drogas antivíricas asi como la deliberada disminución de la terapia inmunosupresora anti-rechazo también pueden representar una seria amenaza para la supervivencia del injerto. Los cultivos de vigilancia ordinarios del CMV :¡enen una utilidad escasa para predecir el desarrollo de una enfermedad por CMV y tomar decisiones clínicas (Falagas, 1997). La determinación cuantitativa del antigeno pp65 del CMV en leucocitos de sangre periférica y la delección del ADN del virus mediante PCR son técnicas más sensibles que el cultivo y también son capaces de detectar la viremia con mayor antelación (Méndez, 1998; Boeckh. 1998). Los análisis secuenciales suministran datos de alerta temprana que permiten ajustar con la mayor precisión posible las terapias antivirales e inmunosupresoras. La detección del antígeno del CMV se lleva a cabo en los leucocitos de sangre periférica, mediante el método IFA (Erice, 1995; Storch, 1994; Landry, 1996); la principal limitación de esta técnica es la leucopema. La PCR cuantitativa parece ser un procedimiento útil para predecir infección por CMV en personas sometidas a un trasplante de hígado o riñon (Drouet. 1994.
CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
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SECCIÓN VI
1070
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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CAPÍTULO 48
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INFECCIONES VÍRICAS
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CAPÍTULO
49
Infecciones causadas por clamidias, rickettsias y micoplasmas Gail L. Woods, M.D. David H. Walker, M.D. INFECCIONES POR CLAMIDIAS
1072
Estructura
Infecciones causadas por organismos del género Ehrlichia
Multiplicación
Infecciones causadas por Coxiella burnetii
Chlamydia trachomatis
Infecciones causadas por organismos del género Bartonella (Rochalimaea)
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae
INFECCIONES POR MICOPLASMAS
Diagnóstico de laboratorio
Mycoplasma pneumoniae
Tratamiento INFECCIONES POR RICKETTSIAS
1083
Micoplasmas genitales 1076
Infecciones causadas por organismos del género Rickettsia Tifus "scrub" (tifus de las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi
Las infecciones causadas por clamidias. rickettsias y micoplasmas en humanos se consideran independientemente en este volumen porque los microorganismos responsables de las mismas son diferentes de la mayor parte del resto de bacterias en varios aspectos: son de tamaño más pequeño, la estructura de su pared celular es distinta y son parásitos intracelulares obligados, en particular las clamidias y la mayor parte de rickettsias.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS Las clamidias tienen tropismo por las células epiteliales columnares. Su pared celular es semejante a la de las bacterias gramnegativas; poseen tanto ácido desoxirribonucleico (ADN) como ácido ribonucleico (ARN). tienen ribosomas procariotas y son capaces de sintetizar sus propias proteínas, ácidos nucleicos y lipidos: se dividen por bipartición; y son sensibles a ciertos antibióticos. A diferencia de otras bacterias, las clamidias son "parásitos energéticos"; son bacterias intracelulares obligadas que no pueden multiplicarse fuera de las células que las albergan y son incapaces de sintetizar compuestos ricos en energía como el adenosín Irilosfato (ATP). Las clamidias están incluidas en el orden Chlamydiales. Una revisión reciente de la taxonomía ha sugerido la creación de tres familias, una de las cuales, Chlamydiaceae, incluiría las especies patógenas para el hombre (Everett, 1999). Se han propuesto dos géneros en donde estarían englobadas tres especies patógenas humanas: Chlamydia trachomatis. Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci y Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae. En la Tabla 49-1 se indican algunas características útiles para diferenciar las tres especies mencionadas. Además, estos géneros incluyen también otras seis especies que no han sido asociadas con infecciones en el ser humano.
Estructura Las clamidias presentan dos formas morfológicamente distintas. Por un lado, el denominado cuerpo elemental, una forma esférica, densa, con un diámetro entre 0.2 pm y 0,4 pm, que contiene ARN ribosomal procariótico y posee una pared celular rígida, debido a la gran cantidad de enlaces que se establecen entre los componentes proteicos de la misma, a través de puen-
Diagnóstico de laboratorio Tratamiento BIBLIOGRAFÍA
1085
tes disulfuro. El cuerpo elemental es la forma infecciosa del organismo, y tiene una capacidad de supervivencia limitada fuera de la célula hospedadora. Por otro lado, el cuerpo reticular, con un diámetro entre 0.6 iim y 1.0 pm. es la forma mtracelular, metabólicamente activa, incapaz de sobrevivir en el medio ambiente exocelular. El ADN circular de ambas formas se encuentra organizado, de forma compacta, en un nucleoide central y su genoma tiene un tamaño de enlre 1,0 y 1,2 millones de pares de bases (pb). Entre los componentes de la membrana externa del cuerpo elemental, dos tienen importancia para el diagnóstico. El más importante es la proteina mayontaria de la membrana externa (MOMP), una especie transmembranal que posee epitopos, definidos en base a su reactividad frente a anticuerpos monoclonales, específicos de serovariedad. especie, género y familia. La infección por clamidias induce en el huésped la aparición de anticuerpos anti-MOMP específicos, aunque el papel protector de estos anticuerpos no está claramente establecido. La membrana extema de las clamidias también posee un antígeno de naturaleza hpopolisacaridica (LPS), que es el antigeno mayoritario detectado mediante pruebas serológicas, especificas de género, como indicador de infección por clamidias. Se han utilizado anticuerpos monoclonales y anticuerpos polivalentes monoespecificos frente al LPS o la MOMP, para detectar la presencia de antigenos de clamidia en especímenes clínicos, mediante mmunofluorescenoa directa (DFA) y enzimoinmunoensayo (EIA).
Multiplicación Las clamidias se multiplican en el citoplasma de la célula hospedadora infectada. El ciclo biológico de desarrollo comienza con la adhesión del cuerpo elemental a microvellosidades de una célula columnar susceptible; en cualquier caso, los receptores específicos implicados en esta interacción no han sido identificados todavía. El cuerpo elemental desciende entonces por la microvellosidad, hasta alcanzar la membrana plasmática de la célula hospedadora, localizándose en invaginaciones o indentaciones de la misma Seguidamente, la clamidia penetra en la célula en un endosoma, donde las diferentes especies, C. psittaci C. pneumoniae y C. trachomatis, permanecen durante su desarrollo mtracelular. El contenido de los endosomas que contienen los cuerpos elementales de C psittaci no se acidifica, y no se produce la fusión de aquellos con los lisosomas celulares; sin embargo, los endosomas con cuerpos elementales de
CAPÍTULO 49
Tabla 49-1
•
INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Características útiles para diferenciar las e s p e c i e s de Chlamydia y Chlamyodophila p a t ó g e n a s del h o m b r e Especies Chlamydia trachomatis
Característica Susceptibilidad a las sulfamidas Tinción de glucógeno de las inclusiones Forma del CE
S
Clamydophila psittaci R
Clamydophila pneumoniae R
+ Redondeada Redondeada De pera o redondeada
CE = cuerpo elemental. S • susceptible; Fl = resistente: * = positivo. - = negativo.
C. trachomatis pueden fusionarse entre ellos y. probablemente, con los lisosomas. Entre seis y ocho horas después de que el cuerpo elemental haya penetrado en la célula huésped, comienzan a producirse cambios en la estructura de la pared celular asociados a la transición a cuerpo reticular, se inicia la síntesis de ADN, ARN y proteínas y comienza la división por bipartición. Las mitocondnas de la célula hospedadora migran y se sitúan frente al endosoma, cuyo tamaño va creciendo, lo que permite que los cuerpos reticulados en multiplicación utilicen el ATP generado por la propia célula infectada. Los cuerpos reticulados comienzan a reorganizarse tras 18 a 24 horas después de la infección; y, presumiblemente, cuando se agotan los nutrientes, tiene lugar su maduración y transformación a cuerpos elementales, que son finalmente liberados al medio extracelular. Las células infectadas por C. psittaci sufren daños importantes como consecuencia de la multiplicación de los microorganismos en su interior, teniendo lugar la liberación de las clamidias por la lisis de la célula huésped 48 horas después de que se haya producido la infección. Por el contrano, C. trachomatis es liberada, entre 72 y 96 horas después de la infección, tras la fusión de la membrana que delimita el cuerpo de inclusión que contiene los cuerpos elementales con la membrana plasmática, dejando una lesión en la misma y permitiendo la supervivencia de la célula hospedadora.
Chlamydia
trachomatis
Chlamydia trachomatis es la causa más frecuente de enfermedades transmitidas por contacto sexual en EE.UU. Asimismo, en regiones de Oriente Medio y del norte de Africa y de la India, donde el tracoma es endémico, es una importante causa de ceguera.
Epidemiología, patología y manifestaciones clínicas El ser humano es el único hospedador conocido para todas las cepas de C. trachomatis conocidas. Las manifestaciones clínicas, asi como la especificidad por el órgano afectado en el cuerpo, vienen determinadas tanto por el mecanismo de transmisión como por las propiedades de la cepa infectante. Desde un punto de vista epidemiológico, las infecciones por C. trachomatis se dividen en tres categorías: el clásico tracoma, las enfermedades transmilidas por contacto sexual en adultos y las infecciones perinatales. oculares y del tracto respiratorio. El tracoma clásico es una causa importante de ceguera en aquellas áreas donde las condiciones sanitarias son inadecuadas y la higiene personal escasa, aunque es la causa de ceguera que, a nivel mundial, puede ser prevenida más fácilmente. Típicamente, la infección se transmite entre los niños a través de los dedos, mediante fómites y probablemente por las moscas. En áreas donde la enfermedad es endémica, la conjuntivitis aguda provocada por clamidias en adultos o en niños es poco frecuente, aunque muchos niños quedan infectados crónicamente pocos años después de su nacimiento. Exposiciones repetidas a C. trachomatis conducen, eventualmente, al desarrollo de queratoconjuntivitis folicular crónica, cicatrización de la conjuntiva y pannus (invasión de la córnea por los vasos sanguíneos). Entre las enfermedades que se transmiten por contacto sexual directo en adultos, y que están provocadas por C. trachomatis. se encuentran el linfogranuloma venéreo (LGV) y la uretritis/cervicitis, con las complicaciones asociadas a las mismas. El LGV tiene carácter endémico en Asia, África y América del Sur. En EE.UU. se registran alrededor de 500 casos anualmente: la enfermedad afecta más al hombre que a la mujer, en una relación de 3 a 1, y es más frecuente entre personas pertenecientes a un estrato socioeconómico bajo en los
1073
estados del sureste, homosexuales e individuos que han visitado paises fuera de EE.UU., donde el LGV tiene carácter endémico. El LGV se transmite por contacto sexual directo, aunque también se ha observado transmisión del microorganismo a través de fómites y por aerosoles formados durante accidentes de laboratorio, asociada a casos de neumonitis. derrames pleurales y lintadenopatia mediastinica o hiliar (Jones. 2000). El reservono del agente infeccioso está constituido por personas infectadas pero asintomáticas o por individuos con infección uretral, cervical o anorrectal ignorada. El LGV es la única infección causada por C. trachomatis que produce manifestaciones multisistémicas y constitutivas. Durante la lase primaria se forma una vesícula indolora o una pápula no indurada, de pequeño tamaño, que aparece, frecuentemente, en los genitales externos, entre tres días y tres semanas después de la exposición al microorganismo, y que desaparece rápidamente sin dejar cicatriz. La lase secundaria se caracteriza por una linfadenopatía supurativa local y otros síntomas como liebre, escalofríos, anorexia, dolor de cabeza, mialgias y artralgias. comenzando entre dos y seis semanas después de la infección. El examen histológico de los ganglios linfáticos afectados muestra la existencia de granulomas que rodean abscesos estrellados. Los ganglios linfáticos afectados aparecen enmarañados y eventualmente supuran, dando lugar a fistulas que sanan, con cicatrización, varios meses después. La fibrosis y el drenaje linfático anormal resultante son responsables del estrechamiento uretral o rectal y de la induración y edema linfático de los genitales que aparece durante la tercera fase. El espectro clínico de las enfermedades de transmisión sexual debidas a cepas de C. trachomatis que no causan LGV (cepas no LGV) es semejante al de las infecciones debidas a Neisseria gonorrhoeae (véase Cap. 50). En el hombre. C. trachomatis es responsable del 30% al 50% de casos de uretritis no gonocócica. aunque un tercio de varones que albergan a C. trachomatis en su uretra no manifiestan síntoma alguno (Stamm. 1984). Muy raramente, la uretritis producida por C. trachomatis evoluciona hasta una epidídimitis. Entre los varones homosexuales, las cepas no LGV de C. trachomatis se han asociado a casos de proctitis. El microorganismo se ha aislado también de la uretra de un 70% de individuos con síndrome de Reiter no tratado asociado con uretritis (Keat, 1983). La infección genital por C. trachomatis tiene una incidencia mayor en la mujer que en el hombre y es más frecuente entre mujeres jóvenes, solteras o divorciadas, negras, de nivel socioeconómico bajo y que tengan múltiples compañeros sexuales. La infección de la endocérvix por C. trachomatis puede ser asintomálica o bien producir una cervicitis mucopurulenta. que puede extenderse hasta la uretra y la vejiga unnaria. dando lugar al "sindrome uretral agudo" o piuría sin bacteriemia, o hasta el endometno y las trompas de Falopio. causando entonces endometritis o salpingitis. Las infecciones del tracto reproductivo superior pueden evolucionar hasta una enfermedad inflamatoria pélvica o provocar cicatrización y dislunción del sistema de transporte de los oviductos, lo que puede traducirse en infertilidad o embarazo ectópico. La diseminación intrapentoneal de la infección puede provocar peritonitis aguda, perihepatitis (síndrome de Fitz-HughCurtis), periapendicitis o inflamación del bazo. Un pequeño porcentaje de adultos con infección genital por clamidias desarrollan una conjuntivitis de inclusión. En los paises desarrollados donde las infecciones de transmisión sexual por C. trachomatis tienen carácter epidémico, el microorganismo puede pasar de la madre al hijo durante el tránsito por el canal del parto. Estudios llevados a cabo en Norte América indican que entre el 60% y el 70% de los niños expuestos a C. trachomatis durante el parto por via vaginal resultan infectados por la bacteria, mientras que la infección en aquellos que nacen mediante cesárea es muy poco frecuente (Jones, 2000). Es posible recuperar a C. trachomatis de la conjuntiva de los niños infectados tras una o dos semanas y a partir de la nasofaringe inmediatamente después. La frecuencia de aislamiento a partir de la conjuntiva disminuye a partir de la quinta/sexta semana, aunque C. trachomatis puede ser recuperada de la nasofaringe, conjuntiva, recto y vagina (habitualmente sin producir síntomas) durante varios meses. La conjuntivitis de inclusión, la manifestación más frecuente de la infección por C. trachomatis en niños, aparece en casi el 80% de aquellos en los que el cultivo a partir de la conjuntiva o el examen citológico revela la presencia del microorganismo (Jones, 2000). Entre 2 y 25 días después del nacimiento se produce un Huido mucopurulento y la conjuntiva se inflama y se vuelve edematosa. Los síntomas generalmente desaparecen sin tratamiento en unos cuantos meses y sin dejar secuelas, aunque puede quedar cierto grado de cicatrización en la conjuntiva.
1074
SECCIÓN VI
•
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Aproximadamente un 20% de niños que son infectados por C. trachomatis durante el nacimiento desarrollan neumonitis intersticial. La enfermedad comienza entre las dos semanas y los tres meses de edad (con un pico entre las tres y las seis semanas) con una congestión nasal, seguida de una característica tos staccato con taquipnea y crepitantes, pero sin fiebre. La mitad de ellos tienen o han tenido conjuntivitis. Los síntomas se manifiestan durante varias semanas, aunque los crepitantes inspiratorios y los cambios en el examen radiológico del lórax pueden persistir durante meses.
Chlamydophila (originalmente
Chlamydia) psittaci
La neumonía asociada con el contacto con pájaros fue descrita en Suiza por primera vez en 1879. La enfermedad fue rara en EE.UU. y Europa hasta finales de 1920. cuando comenzaron a ponerse de moda los pájaros tropicales como mascotas. El agente patógeno responsable fue aislado por Bedson en 1930 a partir de muestras de tejido humano y de ave durante la investigación de un brote epidémico en el zoológico de Londres.
Epidemiología La infección causada por ChiamydophUa (originalmente Chlamydia) psttacci (llamada psitacosis) aparece distribuida mundialmente. Las aves de la familia de las psitaciformes se consideran el principal reservorio del microorganismo responsable de la enfermedad, aunque la mayor parte de especies de pájaros pueden ser infectadas por la bactena. Los animales infectados pueden, obviamente, enfermar y morir, aunque frecuentemente sólo muestran síntomas ligeros como anorexia, diarrea, letargo y plumaje rizado. La enfermedad en humanos tiene carácter esporádico y ha sido asociada con el contacto con loros, canarios, palomas, gorriones, patos, gallos, aves de corral (principalmente pavos) y ocasionalmente mamíferos. Más de la mitad de los 40 a 60 casos de psitacosis que se detectan anualmente en EE.UU. se dan entre las personas que poseen pájaros como mascotas. Los empleados de las tiendas de anímales, criadores de palomos, trabajadores en zoológicos, veterinarios y todos aquellos que por su actividad laboral están en contacto con las aves tienen un mayor riesgo de padecer la infección. Se han detectado brotes epidémicos en plantas procesadoras de pavos, principalmente entre los empleados que matan a las aves y las despluman y aquellos que realizan la evisceración de los cuerpos (CDC, 1990). En las últimas dos décadas, la prevalencia de la psitacosis en EE.UU. se ha reducido enormemente como resultado de la adición de tetraciclma a los piensos que se les suministran a las aves para su alimentación, el tratamiento de las aves psitaciformes importadas antes de entrar en el país y la cría doméstica de periquitos. C. psittaci está presente en la sangre, tejidos, excrementos y plumas de los pájaros infectados y puede permanecer acantonada varios meses después de la infección aguda. La infección se transmite al ser humano generalmente a través de la inhalación de aerosoles infectivos procedentes de heces, heces pulverizadas, y secreciones de aves infectadas por C. psittaci. pero puede producirse también por la manipulación de plumaje o tejidos contaminados, picotazos o por contacto directo entre boca y pico. El contacto con los pájaros no tiene por qué ser directo o prolongado. La diseminación persona a persona de C. psittaci es poco frecuente.
Patogenia y patología Chlamydophila psittaci penetra en el cuerpo a través del tracto respiratorio y es transportada por los macrófagos hasta el hígado y el bazo, donde tiene lugar la multiplicación de la bacteria. Seguidamente, los microorganismos pasan a la sangre y llegan al pulmón, que es el blanco primario de la infección, y a otros órganos. El examen histológico del tejido pulmonar revela la presencia de linfocitos en los espacios alveolares e intersticiales. Se pueden apreciar también pequeñas hemorragias y macrófagos con inclusiones mtracitoplasmáticas. El hígado, el bazo y los ganglios linfáticos hiliares aumentan de tamaño y pueden mostrar focos de necrosis, y en los casos graves pueden verse también afectados el miocardio, el pericardio, las meninges, el cerebro y las glándulas suprarrenales
Manifestaciones
clínicas
La psitacosis comienza bruscamente tras un periodo de incubación de una a dos semanas, con fiebre y escalofríos, o se manifiesta gradualmente con un aumento paulatino de la fiebre y la sensación de malestar general. Un sintoma
prominente es la aparición de una tos seca y persistente que, ocasionalmente, puede producir un esputo sanguinolento. El pulso cardíaco es. a menudo, lento para la temperatura corporal del paciente, y también es frecuente padecer una jaqueca intensa y difusa. Son comunes otros síntomas como malestar general, mialgias dolorosas y artralgias. y también puede aparecer una erupción macular (manchas de Horder) que semeja las manchas rojizas de la fiebre tifoidea. Un cierto grado de obnubilación puede manifestarse al final de la primera semana, y unos pocos afectados tienen molestias gastrointestinales (Gl). Chlamydophila psittaci raramente causa endocarditis destructiva: la mayor parte de personas afectadas tienen un historial de enfermedad reumática cardiaca o de malformaciones congénitas de las válvulas cardíacas (Jones. 1982).
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae En 1986, una especie particular de clamidia se asoció con una patología aguda del tracto respiratorio humano. El organismo, inicialmente considerado como una cepa de Chlamydia psittaci, fue denominado TWAR, siglas que correspondían a las letras de identificación de los dos primeros aislamientos de la bacteria obtenidos: TW-183. aislado en 1965 del ojo de un niño de un grupo control durante un ensayo de vacunación realizado en Taiwan, y AR-39, recuperado ese mismo año de la garganta de un estudiante de la Universidad de Washington afectado de faringitis. Muy poco tiempo después de su detección, los datos de los estudios de homología de ADN y de las observaciones al microscopio electrónico pusieron de manifiesto que se trataba de una especie diferente, inicialmente designada como Chlamydia pneumoniae, y que recientemente ha sido reclasilicada como Chlamydophila pneumoniae (Everett, 1999; Chi. 1987: Campbell, 1987; Cox. 1988). Las cepas de C. pneumoniae y C. psittaci tienen un 10% o menos de homología en la secuencia de ADN. y ba|0 ciertas condiciones el cuerpo elemental de C pneumoniae tiene forma de pera, mientras que en otras es redondeado, como los cuerpos elementales de Chlamydophila psittaci y Chlamydia trachomatis.
Epidemiología El concepto actual de la epidemiología de la infección por Chlamydophila pneumoniae se basa en los datos de estudios retrospectivos con muestras de suero recogidas a partir de pacientes con enfermedades del tracto respiratorio. Alrededor del 50% de los adultos tienen anticuerpos frente a C. pneumoniae. La tasa de prevalencia de anticuerpos en niños es baja, aumenta de forma abrupta en los adolescentes, continúa aumentado durante la madurez y permanece con valores elevados en la vejez; las tasas son entre un 10% y un 25% más elevadas en varones. Los datos de los estudios serológicos retrospectivos y prospectivos indican que la enfermedad causada por C. pneumoniae tiene carácter endémico en EE.UU. y epidémico en Escandinavia y Finlandia, aunque los brotes epidémicos no aparecen con una periodicidad estacional consistente (Grayston, 1990. 1989). C. pneumoniae parece ser un patógeno bumano primario que se transmite de persona a persona, sin que en la transmisión participe un reservorio avícola o animal alguno. El mecanismo y lugar de la transmisión, el periodo de incubación y la infectividad del microorganismo no han sido determinados todavía. Los datos obtenidos a partir de estudios retrospectivos realizados en soldados finlandeses han puesto de manifiesto que los brotes epidémicos causados por C. pneumoniae se prolongan de cinco a ocho meses, lo que sugiere que la infección se disemina lentamente, incluso en grupos de población cerrados (Kleemola. 1988).
Patogenia La patogenia de la infección por C. pneumoniae es desconocida. Debido a que la enfermedad es. generalmente, suave y autohmitada. no hay disponibles dalos de autopsias.
Manifestaciones
clínicas
Se estima que C. pneumoniae es responsable de alrededor de un 10% de los casos de neumonía detectados en una comunidad (Grayston, 1990). La neumonía es. usualmente, suave, con la aparición de un único infiltrado subsegmentano. aunque puede tener un carácter grave, especialmente en personas ancianas y en aquellos que tienen enfermedades crónicas. Frecuentemente comienza con faringitis y ronquera, seguidas de una tos persistente. Aunque la neumonía es el síndrome más frecuentemente asociado con la
CAPÍTULO 49
•
INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Tabla 49-2 Tipos d e e s p e c í m e n e s clínicos para la detección d e C. trachomatis Entermedad Cervicitis mucopurulenta Síndrome ureiral agudo (mujeres) Endometritis aguda Salpingitis aguda Uretritis no gonocócica (hombres) Conjuntivitis de inclusión Tracoma Linfogranuloma venereo
Espécimen Hisopo endocervical orina" Hisopo uretral, orina" Aspirado endometrial Biopsia de trompas de Falopio Hisopo uretral, orina" Hisopos o raspados conjuntivaies Hisopos o raspados conjuniivales Aspirado de nodulo linfático, biopsia de la lesión ulcerosa, suero Suero, aspirado traqueobronquial. hisopo nasofaríngeo
Neumonitis (niños) "La orina es u n espécimen aceptablo para algunos enzimoinmunoensayos y pata las pruebas comerciales de amplilicación de ácidos nucleicos
.
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infección por C. pneumoniae, los estudios serológicos realizados durante brotes epidémicos entre soldados han mostrado que tan sólo un 10% de las infecciones por C. pneumoniae evolucionan a neumonía, lo que sugiere que la infección es, frecuentemente, suave o asintomática y no detectada. Otras manifestaciones de la infección por C. pneumoniae son bronquitis, faringitis, fiebre de origen desconocido, otitis, procesos seudognpales, miocarditis, endocarditis y posiblemente ateroesclerosis (Campbell, 1998).
Diagnóstico de laboratorio Chlamydia
trachomatis
El tipo de espécimen utilizado para el diagnóstico de las infecciones causadas por C. trachomatis está determinado por las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Tabla 49-2). Los procedimientos específicos empleados para la recolección de los diferentes tipos de muestras se describen en el Capitulo 57. La mayor parte de las infecciones afectan al epitelio de las membranas mucosas, por lo que los especímenes deben recogerse directamente de la superficie afectada y contener una muestra adecuada y representativa de células epiteliales Los fluidos purulentos no son un tipo adecuado de espécimen, por lo que deben ser eliminados antes de proceder a la recogida de la muestra con un hisopo o un cepillo. De entre los diferentes tipos de hisopos existentes, los que tienen la torunda de dacrón o rayón son los preferidos. Los hisopos con mangos de madera no deben ser utilizados, ya que la madera es tóxica para la bacteria. Los hisopos de alginato calcico pueden resultar tóxicos para las clamidias o para las células que permiten su crecimiento. Los hisopos con torundas de algodón son aceptables, aunque ocasionalmente pueden resultar tóxicos para las clamidias.
Cultivo celular Los cultivos celulares son actualmente el método de referencia para el diagnóstico de las infecciones causadas por clamidias y deben utilizarse cuando el diagnóstico es objeto de controversia y en los casos en los que existe sospecha de agresión o abuso sexual. Las líneas celulares utilizadas más frecuentemente son McCoy o mono verde Butfalo. Ambas tienen una sensibilidad parecida, pero las segundas son más fáciles de mantener y más resistentes a las sustancias citotóxicas, habiéndose observado que en las mismas se forma un número más elevado de inclusiones y de mayor tamaño (Krech, 1989). La adición de cicloheximida (0,5 pl-1,5 pl/ml) al medio de cultivo aumenta la sensibilidad. Las células crecen en monocapa en la superficie de cubreobjetos situados en el interior de sheil vials, o en placas de 24 pocilios, o en la superficie de placas de cultivo de poliestireno de 48 o de 96 pocilios. Para incrementar la recuperación de C. trachomatis, los especímenes son sonicados o agitados en un mezclador vértex antes de ser inoculados, para liberar los cuerpos elementales de las células infectadas, y los shell vials inoculados o las placas de cultivo son centrifugados. Tras 48-72 horas de incubación, las monocapas de células son fijadas y seguidamente teñidas con anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína. Si se utiliza un sistema de cultivo de 96 pocilios, se recomienda resembrar los especímenes que son negativos a las 48 horas para incrementar la eficiencia del proceso de detección; sin embargo, la detección no aumenta significativamente cuando se utiliza una estrategia semejante en el caso de emplear contenedores o placas de 24 pocilios (Schacter. 1987; Zimmerman, 1992).
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Métodos de detección directa no basados en el cultivo Fluorescencia directa con anticuerpos. La prueba de detección mediante fluorescencia directa con anticuerpos (DFA). que fue uno de los primeros métodos no basados en el cultivo desarrollados para la detección de clamidias, permite la visualización directa de los cuerpos elementales de C. trachomatis en frotis de los especímenes clínicos. El tiempo total necesario para la ejecución del procedimiento oscila entre 30 y 60 minutos. Es el único método que permite determinar directamente la calidad del espécimen Las muestras que contienen células columnares o metaplásicas escamosas son adecuadas, mientras que aquellos especímenes en los que existen pocas células columnares, o tienen una excesiva cantidad de mucus, o en los que hay una excesiva cantidad de células escamosas, no son aceptables. Sin embargo, la interpretación de los resultados de la observación de los frotis es subjetiva, y la fatiga del analista puede representar un problema en aquellas situaciones en las que hay que procesar un gran volumen de muestras. En la actualidad hay disponibles anticuerpos monoclonales procedentes de diferentes firmas comerciales. Los anticuerpos dirigidos frente a la MOMP especifica de especie de C. trachomatis parecen ser los que presentan una mayor especificidad, y producen una fluorescencia más intensa que la que se observa con anticuerpos dirigidos frente al LPS de las clamidias (Cíes. 1988). por lo que son los que se utilizan más frecuentemente (Woods, 1994). Ocasionalmente, incluso los anticuerpos específicos de especie pueden teñir otras bacterias distintas a C. trachomatis. posiblemente debido a una adsorción inespecifica de las inmunoglobulinas o a una reactividad cruzada. La tinción de bacterias distintas de C. trachomatis es particularmente frecuente en el caso de especímenes rectales; en consecuencia, el cultivo es el método preferido en este supuesto, aunque existen algunos reactivos para DFA aprobados para la evaluación de muestras rectales. También se ha desculo la existencia de reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales entre miembros de la familia Chlamydiaceae y Bartonella. La sensibilidad de la técnica DFA varia entre el 50% hasta casi el 100% en comparación con el cultivo como método estándar, dependiendo de la prevalencía de la infección en la población que eslá siendo objeto de evaluación y del número de cuerpos elementales necesarios para obtener un resultado positivo (Bames, 1989). En general, la sensibilidad es más elevada, con valores de corte más bajos para los cuerpos elementales y en poblaciones con una alta prevalencia de la enfermedad. La especificidad del DFA suele ser superior al 95%. Enzimoinmunoensayos. Los enzimoinmunoensayos (EIA) detectan el LPS de las clamidias utilizando como sonda anticuerpos mono o policlonales etiquetados con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado. Tanto los sistemas de fase sólida, que utilizan plástico o microesferas recubiertas con el anticuerpo, como los sistemas de membrana están disponibles comercialmente. El tiempo total de procesamiento oscila entre 15 y 30 minutos para los sistemas de membrana, y entre tres y cuatro horas para los sistemas de fase sólida. Las ventajas de los EIA son la objetiva interpretación de los resultados y la facilidad de uso para procesar un gran número de muestras. Al igual que en el caso de la DFA. la sensibilidad de los EIA varia (entre cerca del 70% hasta el 100%) en comparación con el cultivo como método estándar, y tiende a ser más elevada en poblaciones con una alta prevalencia de la enfermedad, como es el caso de aquellas personas que acuden a una clínica para enfermedades de transmisión sexual (Bames. 1989: Clarke, 1993: Ehret, 1993; Kluytmans. 1993: Mills. 1992; Warren, 1993). La especificidad del EIA es del 95% o incluso superior. Las causas que explican los falsos positivos son la presencia de una infección bacteriana del tracto urinario (Demaio, 1991) o la contaminación del espécimen con moco cervical o secreciones vaginales. Este último problema puede reducirse mejorando la técnica de recogida de las muestras (eliminando el moco cervical y obteniendo una verdadera muestra endocervical). asi como utilizando anticuerpos bloqueantes (Mills. 1992). Hibridación de ácidos nucleicos. Eslá comercialmente disponible una sonda de ADN marcada con éster de acridina, complementaria del ARN ribosomal de C. trachomatis. que permite la detección directa de este microorganismo en especímenes urogenitales y conjuntivales. El método requiere el empleo de un baño de agua y de un medidor de luminiscencia. El tiempo total de procesamiento requerido está entre dos y tres horas. La sensibilidad de la prueba comparada con la del cultivo como método de referencia varia enlre las muestras endocervicales y los especímenes recogidos con hisopos ure-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
trates en el hombre (del 76% al 97%) (Blanding, 1993: Clarke, 1993; Warren, 1993; iwen, 1991; Kluytmans, 1994, 1991). La especificidad de la sonda es del 97% o superior, y puede ser mejorada aún más mediante un ensayo de competición (Woods. 1996). Amplificación de ácidos nucleicos. Existen diferentes métodos para la detección directa de C. trachomatis en especímenes endocervicales y uretrales tomados con hisopo, y en muestras de orina tanto de hombre como de mujer, basados en la amplificación de ácidos nucleicos, que están disponibles comercialmente en la actualidad. El tiempo total de procesado oscila entre cuatro y cinco horas. Los datos de estudios comparativos entre el método de amplificación de ácidos nucleicos y el cultivo indican que el primero es altamente específico y más sensible que el segundo (Vincelette, 1999: Goessens, 1997; Ferrero, 1998: Wylie. 1998; Mahony, 1998; Toye. 1998; Carroll, 1998; Puolakkainen, 1998). Dado el precio considerable del método basado en la amplificación de ácidos nucleicos, el director de cada laboratorio debe determinar si los beneficios compensan la inversión en su población de pacientes.
Verificación de las pruebas no basadas en el cultivo Los expertos del Centro para la Prevención y Control de las Enfermedades (CDC) recomiendan que los resultados positivos resultantes de las técnicas de rastreo (DFA, EIA, sondas) deben confirmarse con una prueba complementaria si un resultado falsamente positivo pudiera tener consecuencias médicas, sociales o psicológicas adversas (CDC, 1993). En poblaciones donde la prevalencia de la infección es baja, la confirmación puede ser algo habitual, pero debe tener carácter selectivo en poblaciones con elevada prevalencia. La confirmación mediante cultivo es un procedimiento óptimo, pero requiere un segundo espécimen recogido bien durante la primera visita o en una segunda sesión. Los test EIA con anticuerpos bloqueantes, los ensayos de competición con sondas o la monitorización del medio de transporte con un test DFA pueden ser métodos de verificación alternativos.
Pruebas
serológicas
Las pruebas serológicas tienen muy poca utilidad para el diagnóstico de las infecciones por clamidias por dos razones. En primer lugar, los anticuerpos frente a C. trachomatis persisten durante bastante tiempo después de que la infección remita, por lo que un resultado serológico positivo no tiene por qué relacionarse necesariamente con un proceso infeccioso activo. Por otro lado, muchas pruebas serológicas no son específicos para C. trachomatis. ya que estos métodos detectan anticuerpos frente a determinantes antigénicos específicos de género. Las excepciones a esta norma están representadas por el diagnóstico del LGV y de la neumonitis causada por C. trachomatis en niños. Debido a que el LGV tiene un largo periodo de latencia y a que el diagnóstico sufre, a menudo, retrasos, los anticuerpos están generalmente presentes cuando se toma la muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfermedad, por lo que, a menudo, no es posible detectar un incremento de cuatro veces en el título de anticuerpos entre las muestras de suero tomadas en la fase aguda y en la de convalecencia. Por tanto, un titulo único o estable de 1:64 o superior de fijación del complemento apoya un diagnóstico presuntivo de LGV. Para el diagnóstico de la neumonitis por C. trachomatis en niños, la detección de inmunoglobulinas M (IgM) especificas medíante microinmunofluorescencia puede ser el método de elección (un título de 1:32 o superior es diagnóstico).
Chlamydophila
psittaci
C. psittaci puede crecer en cultivos celulares, aunque su manipulación sólo es recomendable en centros especialmente equipados y con personal experto, porque este organismo es particularmente virulento y se ha asociado frecuentemente a infecciones adquiridas en laboratorio. La infección por C psittaci se diagnostica usualmente por métodos serológicos. preferentemente comparando las muestras de suero obtenidas en las fases aguda y de convalecencia, respectivamente. Un incremento de cuatro veces (o superior) en el título de anticuerpos, entre ambas muestras en un paciente con síntomas de psitacosis. apoya un diagnóstico positivo. Un único título de 1:32 o superior en un individuo con una patología cuyos síntomas sean compatibles representa una evidencia presuntiva de psitacosis. Los anticuerpos se detectan normalmente hacia el final de la segunda semana de la enfermedad, aunque un tratamiento anticipado con antibióticos puede retrasar su aparición durante varias semanas. Incrementos falsamente positivos en el titulo de anticuerpos se detectan raramente en individuos afectados de legionelosis.
Chlamydophila
pneumoniae
El diagnóstico de la infección causada por C. pneumoniae se basa fundamentalmente en los test de tipo serológico (Grayston, 1990). El test de microinmunofluorescencia frente al antígeno TWAR es específico para C. pneumoniae. Las IgM aparecen unas tres semanas después del comienzo de la enfermedad primaria, generalmente comienzan a disminuir entre los dos a seis meses siguientes hasta un nivel en el que no pueden ser detectados, y pueden no reaparecer aunque haya una reinfección. Las inmunoglobulinas G se detectan entre seis y ocho semanas después del inicio de la infección primaria, permanecen de por vida, y su título puede incrementarse una o dos semanas después de que se haya producido una reinfección. Los resultados de los test serológicos indicativos de una infección aguda son: un incremento de 4 veces o superior del titulo de IgG entre dos muestras de suero tomadas en la lase aguda y de convalencia de la enfermedad respectivamente, un único título de 1:512 o superior o un titulo de IgM de 1:16 o superior. C. pneumoniae puede ser aislada en cultivos de tejidos, aunque crece peor que C. trachomatis (Roblin, 1992).
Tratamiento Las tetraciclinas son el tratamiento de elección para las infecciones causadas por clamidias. Para las infecciones genitales por C. trachomatis. otros agentes antimicrobianos eficaces son la eritromicina, la acitromicina, el sulfisoxazol y el ofloxacino. Las infecciones oculares por C. trachomatis requieren un tratamiento sistémico con tetraciclina (en adultos) o con eritromicina o sulfisoxazol (en neonatos); la terapia tópica suprime los síntomas pero no elimina al microorganismo. Los macrólidos son una alternativa aceptable para el tratamiento de las infecciones causadas por C. pneumoniae. Las sulfonamides son ineficaces frente a C. psittaci y C. pneumoniae.
INFECCIONES POR RICKETTSIAS El concepto de rickettsia se desarrolló, históricamente, al mismo tiempo que se definía la naturaleza molecular y física de los virus (Weiss, 1988). En contraste con los agentes virales que afectan al hombre, que también necesitan células eucarióticas hospedadoras para su multiplicación, las rickettsías son bacterias con una pared celular típicamente gramnegatíva y su crecimiento es inhibido por determinados antibióticos. Las rickettsías se diferencian, además, de otras bacterias que también son parásitos intracelulares obligados por su ecología y modo de transmisión mediante insectos artrópodos que actúan como vectores. El esquema taxonómico tradicional de las rickettsías basado en algunas de esas características fenotípicas. como son su multiplicación intracelular y su transmisión vía insectos artrópodos, necesita una modificación importante a la luz de los últimos conocimientos derivados de los estudios de comparación de secuencias génicas. Los géneros que contienen especies patógenas para el ser humano son Rickettsia. Ehrlichia. Coxiella y Bartonella (originalmente Rochalimaea) (Weiss, 1984). Basándose en las características genéticas y fenotípicas. el agente etiológico del tifus scrub o tifus de las malezas, Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugamushi ha sido incluido en un nuevo género independiente (Tamura, 1995). A pesar de su tradicional relación con la "rickettsiología" y la transmisión por artrópodos, el género Bartonella (originalmente Rochalimaea) incluye organismos que pueden crecer en medios carentes de células y que no pertenecen al orden Rickettsiales (Brenner, 1993). Además, los miembros de los géneros Rickettsia. Orientia, Ehrlichia y Bartonella están más relacionados entre sí que con las especies del género Coxiella. Agrupadas por géneros, en este capítulo se describen las siguientes enfermedades: Rickettsia, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, fiebre botonosa, fiebre de la picadura de la garrapata africana, ricketlsiosis vesicular, tifus murino; Orientia, lifus scrub o tifus de las malezas; Ehrlichia, "ehrlichiosis" monocitica humana causada por £ chaffeensis y las infecciones granulocíticas originadas por £ phagocytophila y £ ewingii; Coxiella, fiebre Q; y Bartonella, enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis bacilar y peliosis, fiebre de las trincheras y bartonellosis sudamericana. Las enfermedades causadas por cada género constituyen entidades clínicas coherentes y agrupadas y, en conjunto, las enfermedades causadas por rickettsías plantean problemas similares en lo que respecta a su diagnóstico, con aproximaciones técnicas semejantes para su solución.
CAPÍTULO 49
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Infecciones causadas por organismos del género Rickettsia Estructura y función Las rickettsias de los grupos de la liebre maculosa y del tifus son bacterias genéticamente relacionadas que tienen una delgada morfología bacilar (0.3 a 0,5 x 1 a 2 urn) y una pared celular típica de gramnegativas que posee lipopolisacárido con determinantes antigénicos que diferencian los dos grupos. Todas las especies del género Rickettsia viven libres en el citosol de la célula hospedadora y se multiplican por bipartición Las rickettsias se adhieren a la célula hospedadora a través de una adhesina de naturaleza proteica, penetran seguidamente mediante fagocitosis inducida y salen por último del fagosoma hasta el citosol (Li, 1992, 1998: Walker, 1984). Todos estos eventos tienen lugar en pocos minutos y están asociados con una actividad fosfolipásica A , aparentemente de origen rickettsial. Las rickettsias del grupo de la fiebre maculosa se desplazan en el interior de las células infectadas y durante el proceso de liberación estimulan la polimerización de la actina F de la célula hospedadora en un polo de la misma (Heinzen, 1993). Aquellas rickettsias que poseen esta capacidad (p. ej.. R. rickettsii) salen más rápidamente de las células hospedadoras y se diseminan con mayor facilidad que aquellas especies que no la tienen (p. ej.. R. prowazekii). que se dividen inlracelularmente para dar lugar a un gran número de microorganismos hasta que la célula huésped estalla, liberando a las bacterias formadas en su interior. De acuerdo con los datos actuales de secuen?
Tabla 49-3
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
cias de ADN. las especies del género Rickettsia que son patógenas del hombre han evolucionado en tres genogrupos (Tabla 49-3) (Roux. 1995.1997; Stolhard. 1995). El grupo del tifus incluye las especies R. prowazekii y R. typhi. En el grupo de la fiebre maculosa se encuentran las especies R. rickettsii. R. conorii. R. ¡aponica, R. atricae. R. honei. R sibinca y R. slovaca. Una subdivisión recientemente identificada incluye a R. akari. R. australis y R tefe. Rickettsia akan y R. australis fueron consideradas Iradicionalmente como miembros alejados de las otras especies del grupo de la liebre maculosa. con las que comparten los antígenos de naturaleza lipopolisacaridica.
Fiebre maculosa de las Montañas Rocosas La más grave de todas las rickettsiosis. la liebre maculosa de las Montañas Rocosas (RMSF). tiene una tasa de mortalidad importante, habitualmenle del 5%, incluso entre niños y adultos jóvenes inmunocompelentes y sin patología previa (Dalton. 1995a: Paddock. 1999). En la naturaleza. Rickettsia rickettsii habita normalmente en las garrapatas: Dermacentor vanabilis. la garrapata americana del perro, en los dos tercios del este de EE.UU. y California: Dermacentor andersoni, la garrapata de la madera de las Montañas Rocosas, en el este de EE.UU.; Rhipicephalus sanguineus. la garrapata del perro marrón, en México: y Amblyomma cajennense. en América del Sur Estas garrapatas conservan a R. nckettsii en su intenor mientras mudan de una fase a otra (larva, ninfa y adulto) y transováricamente de generación en generación. Menos de un 1 por 1.000 de garrapatas son portadoras de células virulentas de R. rickettsii,
Infecciones causadas por Rickettsia. Ehrlichia, Coxiella y Bartonella Enfermedad
A g e n t e etiológico
Distribución geográfica
Transmisión
Fiebres maculosas
R. rickettsii R. conorii R. atricae R. sibirica R. japónica R. honei
Fiebre maculosa de las Montanas Rocosas América del Norte. Central y del Sut Fiebre botonosa Sur de Europa. África. Rusia, Georgia. Oriente Medio, subcontinente indio Fiebre africana de las garrapatas Sur y este de África Tifus de las garrapatas del norte de Asia Rusia, China. Mongolia, Pakistán Fiebre manchada oriental Japón Fiebre manchada de la isla de Flinders Australia, sudeste asiático
Mordedura de garrapata Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata Mordedura de garrapata Mordedura de garrapaia (presumiblemente) Mordedura de garrapata (presumiblemente)
Tifus
R prowazekii
Tilus epidémico
R prowazekii
Enfermedad de Bnll-Zinsser
R rowazekn
Tifus de las ardillas voladoras
R typhi
Tifus murino
Otras fiebres rickettsiales R akan Rickeltsiosis vesicular R australis Tifus de la garrapata de Queensle R telis Tifus de la pulga del galo
Distribución mundial (polencialmente) Heces de piojo infectado en décadas recientes en África. en erosiones cutáneas América del Sur. Cenlroaménca, México. Asia Distribución mundial; en cualquier lugar Reactivación de una infección latente donde residan personas que hayan padecido en el pasado tifus epidémico Heces de pulgas o piojos de la ardilla Estados Unidos infectados (presumiblemente) Distribución mundial en zonas tropicales y subtropicales Estados Unidos. Ucrania. Croacia, Corea Este de Australia Estados Unidos
Mordedura de acaro Mordedura de garrapa!; Mordedura o heces de | (presumiblemente)
Sudeste asiatico Japón China Sri Lanka, India, Rusia asiática. Tadyikistán indonesia, oeste del Pacifico, norte de Australia
Mordedura de acaro
Ehrlichiosis monocitica humana Ehrlichiosis granulocitica humana Ehrlichiosis humana por Ehrliclva cwingii Ricketlsiosis sennetsu
Estados Unidos, Europa. África, Tailandia Estados Unidos, Europa Estados Unidos Japón. Malasia
Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata
Fiebre Q
Distribución mundial
Material seco procedente de animales infectados y. posiblemente, ingestión de alimentos de origen animal o mordedura de garrapata
Oeste de America i Distribución mundi;
Picadura de mosquito Arañazo o mordedura de galo
Distribución mundial (probablemente)
Arañazo o mordedura de galo (presumiblemente) Heces mlectadas del piojo Pediculus
Tilus scrub Orienlia tsutsugamushi Tilus setub (tifus de las malezas)
Ehrlichiosis
E. chatfeensis E phagocytophila E ewmgu
Mi Dec
i (presumiblemente)
Barlonellosis
ß bacillilormis B henselae B. clarridgeirae B quintana
Enfermedad del arañazo de galo, angiomatosis bacilar y peliosis Enfermedad del arañazo de gato (semejante) Fiebre de las trincheras
Europa y América del Norte
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
que parecen ser medianamente patogénicas para las garrapatas. Nuevas líneas de garrapatas se infectan al alimentarse de roedores enfermos, reponiendo la población de bacterias mantenidas transováricamente en las garrapatas. Las infecciones tienen lugar cuando y donde una persona se encuentra con una garrapata infectada por R. r/círeífs//(Helmick, 1984). Aunque en los últimos años se han detectado casos de RMSF en prácticamente todos los estados de la unión, con excepción de Hawaii, Alaska y Vermont. la mayor incidencia se ha registrado en los estados del Atlántico sur. desde Maryland a Georgia, y los estados centrales del sur. Oklahoma, Missouri, Arkansas y Tennessee. La mayor parte de casos aparecen al final de la primavera y en verano, aunque, particularmente en las latitudes más sureñas, pueden darse casos incluso en invierno. La mayor incidencia se detecta entre niños y otras personas que están expuestas a las picaduras de las ganapatas durante actividades al aire libre. La relación entre casos y mortalidades es más elevada entre afroamericanos, varones y personas mayores de 30 años. Casos fulminantes de RMSF (muerte al quinto día de la enfermedad) tienen lugar asociados con una hemolisis moderada, por ejemplo, en hombres afroamericanos con una deficiencia en la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Walker, 1983). Las rickettsías son inyectadas a través de la dermis del paciente, mediante las secreciones de las glándulas salivares de la garrapata infectada, entre 6 y 10 horas después de que la garrapata se haya alimentado, y se diseminan por todo el cuerpo por medio del torrente circulatorio, El endotelio vascular es el blanco de la invasión intracelular, con un cierto grado de invasión de las células musculares de los vasos sanguíneos adyacentes. El endotelio infectado es dañado por la producción de moléculas reactivas derivadas del oxígeno y, posiblemente, por la actividad de la fosfolipasa A. (Silverman, 1992.1997). El daño en el endotelio se manifiesta en un incremento de la permeabilidad vascular, edema, hipovolemia e hipotensión. Las consecuencias del daño vascular a nivel del sistema nervioso central (SNC) y los pulmones, y que ponen en peligro la vida del paciente, son la menmgoencefalitis rickettsiósica y el edema pulmonar no cardiogénico. En los primeros estadios de la enfermedad, las lesiones muestran la presencia de rickettsias en las células endoteliales. sin trombos o respuesta celular alguna. En estadios más avanzados, el infiltrado linfohistocítico perivascular característico se manifiesta como una neumonía intersticial, miocarditis intersticial, nodulos guales perivasculares en el cerebro y lesiones vasculares similares en la dermis, tracto gastrointestinal, hígado, músculos esqueléticos y ríñones. Las lesiones extensas pueden estar acompañadas por hemonagias focales, pero rara vez por microinfartos, excepto en la sustancia blanca del cerebro. ¿
La fase clínica de la enfermedad comienza habitualmente con fiebre, dolor de cabeza y mialgias entre 2 y 14 días después de la mordedura de la garrapata (Kaplowitz, 1981). Durante los tres primeros días de la enfermedad son frecuentes las náuseas, vómitos, dolor y ablandamiento abdominal y diarrea. La erupción cutánea que, generalmente, comienza entre el tercer y quinto día se inicia típicamente con la aparición de máculas alrededor de las muñecas y tobillos, y más tarde en brazos, piernas y tronco. Las lesiones se vuelven maculopapulares, y en la mitad de los casos aparece una petequia central en muchas de las máculas papulares. La afectación característica de las palmas de las manos y las plantas de los píes se detecta sólo en la mitad de los afectados como una manifestación tardía. El fallo renal es una característica de los casos graves de RMSF. La afectación del sistema nervioso central es notoria; entre el 8% y el 10% de los afectados sufren ataques y coma como preludio a un desenlace fatal. En el 50% de los casos existe trombocitopenia, pero la coagulación intravascular diseminada (DIC) es muy poco frecuente (Elghetany, 1999).
kettsia japónica se ha descrito solamente en Japón, mientras que las infecciones en humanos causadas por R. australis y R. honeise han detectado exclusivamente en Australia, Después de un periodo de incubación medio de siete días, estas enfermedades comienzan con fiebre, dolor de cabeza y mialgias. Frecuentemente, se puede descubrir una escara tras un examen cuidadoso de la piel en esa fase de la enfermedad. En la patología de estas fiebres maculares está perfectamente descrito que esta escara o botón negro conesponde al punto donde se produjo la inoculación de la rickettsia. como consecuencia de la mordedura de la garrapata (Walker, 1988a). La infección del endotelio y el daño causado por R. conorii en la escara produce necrosis dérmica y epidérmica y edema perivascular, Entre las defensas del hospedador que llevan a cabo la destrucción de las rickettsias intracelulares se incluyen los linfocitos T y los macrófagos, que se infiltran alrededor de los vasos sanguíneos de la dermis infectados (Herrero-Herrero, 1987). La activación de las células endoteliales por la acción de atocinas induce una actividad que destruye intracelularmente las rickettsias, aunque la eliminación final de los microorganismos está mediada por los linfocitos T citotóxicos. La infección diseminada del endotelio se traduce en la aparición de una erupción maculopapular. meningoencefalitis y lesiones vasculares en pulmones, riñones, tracto gastrointestinal y corazón (Walker, 1985). Existe una correlación entre el aumento moderado de la concentración de transaminasas hepáticas y la aparición de necrosis hepatocelular multifocal y lesiones semejantes a granulomas (Walker, 1986).
Rickettsiosis
vesicular
Rickettsia akan se mantiene en la naturaleza por transmisión transovárica en el acaro Liponyssoides sanguineus, un ectoparásito del ratón doméstico. Mus musculus. Este microorganismo se ha aislado solamente en EE.UU., Croacia, Ucrania y Corea, aunque ello pueda indicar simplemente que los estudios en relación con la distribución de esta especie de rickettsia no son muy amplios. Tras un periodo de incubación de aproximadamente 10 días, aparece una pápula en el lugar donde se produjo la picadura del acaro que evoluciona hasta convertirse en una escara con un tamaño entre 1 cm y 2,5 cm. La enfermedad comienza con escalofríos, fiebre, malestar general, fuerte dolor de cabeza y mialgia. La erupción, que aparece entre dos y seis días más tarde, es maculopapular inicialmente. más tarde papular, y en los casos típicos se vuelve pustular y finalmente vesicular. Algunos pacientes también experimentan náuseas, vómitos, faringitis, fotofobia, esplenomegalia y rigidez en la nuca. El examen histopatológico de la escara revela una necrosis coagulativa de la epidermis, daños en los vasos sanguíneos subyancentes y un infiltrado linfocítico perivascular en el que los macrófagos parecen ser las células atacadas principalmente (Brettman, 1981; Kass, 1994; Walker, 1999). La linfadenopatia regional y la erupción cutánea son consecuencia, posiblemente, de la diseminación del microorganismo por el sistema linfático y circulatorio, respectivamente,
Tifus murino La infección endémica producida por R. typhi, transmitida por la picadura de la pulga, el tifus murino, es en la actualidad la enfermedad más importante dentro del grupo del tifus en EE.UU.. causando una gran morbilidad en todas las regiones templadas del mundo (Azad, 1990). Históricamente, las epidemias de infecciones por R. prowazekii transmitidas por piojos han tenido una gran influencia en el desenlace de muchas campañas militares, y han constituido un grave azote entre las poblaciones víctimas de güeñas, hambrunas y desastres naturales (Patterson, 1993; Zinsser, 1935). Rickettsia prowazekii continúa provocando infecciones en áreas empobrecidas y deprimidas del mundo y reaparece en situaciones como las que provocan la guerra en Burundi y las condiciones sociales, políticas y económicas actuales en la extinta Unión Soviética. El recrudecimiento de las infecciones latentes por R. prowazekii puede tener lugar años más tarde de la infección primaria en inmigrantes procedentes de áreas afectadas por el tifus. En EE.UU. se ha detectado una transmisión endémica de R. prowazekii a partir de un reservorio infeccioso natural constituido por las ardillas voladoras y sus ectoparásitos (McDade, 1980). 1
Fiebre botonosa y otras fiebres maculosas Rickettsia conorii ha sido aislada en el sur de Europa; norte, este y sur de África; Israel; la India, Pakistán, Rusia, Georgia y Ucrania. La ecología de R. conoriiy la epidemiología de la fiebre botonosa están íntimamente ligadas a las garrapatas, especialmente Rhipicephalus sanguineus. que alberga a la rickettsia transováricamente y transmite la infección al hombre cuando se alimenta (Walker, 1991). Se han diagnosticado casos importados en viajeros que regresan a EE.UU. y a países del norte de Europa desde África y países de la cuenca mediterránea. La tasa de mortalidad entre los pacientes hospitalizados oscila entre el 1,4% y el 5,6%, especialmente en pacientes que tienen alguna otra enfermedad subyacente. Una enfermedad más suave causada por R. aíricae aparece con bastante frecuencia en viajeros que regresan del sur de África. La especie R. sibirica ha sido aislada en Rusia, China. Mongolia y Pakistán. Ric-
El tifus murino se da particularmente en zonas costeras tropicales y subtropicales donde abundan las ratas (Rattus rattus) y las pulgas. Las pulgas absorben las rickettsias de la sangre de las ratas infectadas, manteniendo la infección durante todo su período de vida normal. La transmisión transovárica solamente tiene lugar a bajos niveles; por tanto, la transmisión horizontal
CAPÍTULO 49
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
entre ratas es un tactor clave para el mantenimiento de R. typhi en la naturaleza. Otros ciclos mamífero-artrópodo se encargan del mantenimiento de la rickettsia y pueden ser responsables de la transmisión de la infección a los seres humanos (p. ej., la pulga del gato. Ctenocephalides tefe, y la zarigüeya en Texas y California) (Schriefer, 1994b). Se cree que el ser humano es infectado, habitualmente, por inoculación intradérmica de heces contaminadas a través de la piel erosionada por el rascado. Sin embargo, la inhalación de aerosoles que contengan heces pulverizadas de las pulgas o la propia mordedura de la pulga pueden ser también responsables de la transmisión en algunos casos Después de un período de incubación de entre una y dos semanas, la enfermedad comienza con fiebre acompañada en algunos casos por una fuerte jaqueca, escalofríos, mialgias y náusea. En el 80% de los pacientes de piel blanca aparece, entre el quinto y sexto día. un exantema macular o maculopapular, que es particularmente evidente en el torso, porcentaje que baja hasta el 20% en personas con la piel fuertemente pigmentada. Una baja proporción de pacientes tienen tos y presentan infiltrados pulmonares. Los individuos fuertemente afectados pueden sufrir coma, ataques y otros síntomas neurológicos. Aproximadamente un 10% de los pacientes hospitalizados deben ser ingresados en la unidad de cuidados intensivos, y entre un 1% y un 2% de los afectados por el tifus murino fallecen (Dumler, 1991). Las lesiones patológicas del tifus murino incluyen inflamación endotelial e infiltración linfohistocistica perivascular que implican a los vasos sanguíneos de la dermis, SNC. pulmones, corazón, tracto gastrointestinal y ríñones (Walker, 1989). Las consecuencias más serias son la menmgoencefalomielitis y la lesión alveolar difusa.
Diagnóstico de laboratorio A diferencia de la mayor parte de enfermedades infecciosas cuyo diagnóstico debe hacerse durante la fase aguda de las mismas, que es cuando deben tomarse decisiones terapéuticas criticas, las infecciones causadas por rickettsias se diagnostican con mucha precisión, basándose en las sospechas clínicas y epidemiológicas, y se tratan de forma empírica sobre la base del diagnóstico presuntivo (Kaplowitz. 1981). El análisis serológico. que muchas veces se pretende llevar a cabo de forma equivocada en los estadios iniciales de la enfermedad, sólo confirma en la mayor parte de los casos el diagnóstico inicial, poniendo de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior en el título de anticuerpos, pero ya en la fase de convalecencia. Incluso cuando se utilizan los métodos serológicos más sensibles, menos del 20% de los pacientes poseen anticuerpos específicos frente a antigenos rickettsiales, detectables en suero, cuando acuden por primera vez a la consulta médica en busca de atención. Otras aproximaciones diagnósticas utilizadas en ese momento incluyen la visualización de las rickettsias por métodos inmunohistológicos en las lesiones cutáneas, la identificación inmunocitológica de las rickettsias en células endoteliales desprendidas y circulantes, la detección de ADN rickettsial en muestras de sangre y tejidos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Furuya, 1995; Schriefer, 1994a; Sexton, 1994; Williams, 1994). y el cultivo de las rickettsias presentes en las muestras de sangre y tejidos, aunque la mayor parte de estas técnicas no están disponibles en muchos laboratorios clínicos. Las rickettsias fueron puestas de manifiesto por primera vez por Wolbach en muestras de tejidos de pacientes afectados por la RMSF y por el tifus transmitido por piojos, utilizando el método de tinción de Giemsa. durante e inmediatamente después de la primera guerra mundial. Este método, que en esencia ya es un arte perdido, requiere mucha atención y cuidado en los detalles relativos a la fijación y teñido de las rickettsias, y en la actualidad no se realiza de forma exitosa en los labóratenos histológicos actuales. Una modificación del método de Brown-Hopps tiñe una pequeña proporción de microorganismos, que aparecen como bacilos delgados entre las células endoteliales. Una aproximación más sensible y específica para visualizar las rickettsias es la inmunohistología. bien por inmunofluorescencia o bien por tinción inmunoenzimática. utilizando como sondas anticuerpos específicos frente los agentes infecciosos del grupo de la fiebre maculosa o del grupo del tifus (Dumler, 1990; Kaplowitz. 1983: Walker, 1989,1997b. 1999). La tinción mediante inmunofluorescencia de muestras de biopsias de piel de pacientes con RMSF tiene una sensibilidad del 70% y una especificidad del 100%. Los pacientes con fiebre botonosa, tifus murino y rickettsiosis vesicular han sido diagnosticados también mediante la delección mmunohistológica de las rickettsias en las lesiones de los exantemas y las escaras Mediante un anticuerpo monoclonal Irente a
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un epítopo presente en el lipopolisacándo de la pared celular especifico del grupo de la fiebre maculosa se puede detectar la presencia de R. rickettsii. R. conorii. R. akari, R japónica. R. australis. R. atricae. R. honei y R. sibinca en muestras de tejidos fijadas con formol e incluidas en parafina. mientras que otro anticuerpo monoclonal específico frente al lipopohsacárido de los miembros del grupo del tilus se ha utilizado de lorma similar para la detección de R. prowazekii y R. typhi'(Walker. 1997b). En el momento actual, no están disponibles comercialmente los reactivos para el diagnóstico inmunohistoquimico de las rickettsiosis, aunque es posible que en el futuro se desarrollen sistemas comerciales para la detección de grupos específicos de rickettsias, utilizando los anticuerpos monoclonales generados en los laboratorios de investigación. Una aproximación muy particular para el diagnóstico es la detección inmunocitológica de R. conorii en células endoteliales desprendidas que circulan por el torrente circulatorio del paciente. Estas células son capturadas a partir de las muestras de sangre por medio de microesferas magnéticas recubiertas por un anticuerpo monoclonal frente a componentes de la superficie de las células endoteliales humanas (La Scola. 1996a). En enfermos de fiebre botonosa, este procedimiento tiene una sensibilidad del 58% cuando se utiliza para el examen de muestras únicas de sangre, y puede emplearse en los pacientes antes de la aparición del exantema, que debe manifestarse para poder seleccionar las zonas donde han de tomarse las muestras de piel por biopsia que permitan llevar a cabo el diagnóstico por técnicas inmunohistológicas. El "estándar oro" en el diagnóstico serológico de las rickettsiosis es el método de la inmunofluorescencia indirecta (IFA) (Kaplan, 1986). El test indirecto con anticuerpos acoplados a peroxidasa ofrece unos resultados parecidos. En EE.UU.. para las infecciones producidas por rickettsias de los grupos de la fiebre maculosa y del tifus, títulos de 1:64 o superiores en el test IFA se consideran indicadores de diagnóstico positivo cuando se da una situación clínica y epidemiológica compatible En paises donde existe una alta prevalencia de individuos con anticuerpos frente a estas rickettsias, debido hipotéticamente a una estimulación por especies no patógenas de rickettsias o a infecciones subclinicas o no diagnosticadas, son necesarios títulos más elevados para poder establecer el diagnóstico. En cualquier caso, un incremento de cuatro veces en el titulo de anticuerpos en un test IFA hasta un valor, al menos, de 1:64 tiene valor diagnóstico. La sensibilidad del test IFA en el caso de la RMSF oscila entre el 94% y el 100%, mientras que la especificidad es del 100%. Con unos valores de corte en el titulo de 1:128. para las IgG. y de 1:32, para las IgM, el test indirecto de la mmunoperoxidasa rinde valores semejantes y tiene la ventaja de que sólo se necesita un microscopio óptico convencional, en lugar de un microscopio con iluminación ultravioleta. Otros test serológicos disponibles comercialmente son la aglutinación con látex y el enzimoinmunoensayo en fase sólida (Kelly. 1995). Ambos métodos ofrecen información útil para el diagnóstico, requieren un equipo menos caro para su ejecución, aunque no se consideran, generalmente, tan fiables como el método IFA. Ciertamente, con estas técnicas se obtienen resultados mucho más fiables que los que se consiguen con la prueba de Weil-Felix, que mide la aglutinación de las cepas OX-19 y OX-2 de Proteus vulgaris (Kaplan, 1986). Este test de Weil-Felix, poco sensible e inespecífico, no debería utilizarse excepto en los casos de países en desarrollo en los que no es posible utilizar otro método diagnóstico.
Tratamiento Las rickettsiosis de los grupos de la liebre maculosa y del tifus se tratan de forma eficaz con deoxiciclina. tetraciclina o cloranfenicol (Raoult. 1991). Las fluoroquinolonas son aclivas frente a las rickettsias in vitro: pata el tratamiento de la liebre botonosa se han utilizado, con éxito, ciprolloxacino. olloxacino y pefloxacino, aunque estas quinolonas no han sido evaluadas todavía para el tratamiento de la RMSF.
Tifus scrub (tifus de las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi La pared celular propia de una bacteria gramnegativa de Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugamushi difiere de la que presentan las otras especies de rikettsias pertenecientes a los grupos de la fiebre maculosa y del tifus: en este contexto, la membrana extema presenta la lámina externa más gruesa y la interna más delgada, distintas proteínas mayoritanas, y carece de lipopoli
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
sacárido y peptidoglucano (Jamura. 1995). La rickettsia productora del tifus scrub crece en el citoplasma de la célula huésped y sale de la misma mediante un proceso que implica la formación de una pequeña evaginación de la membrana plasmática que engloba a la rickettsia en tránsito hacia el medio exocelular. Orientia tsutsugamushi se mantiene transováricamente en acaras del género Leptotrombidium (Traub, 1978). Los huevos infectados eclosionan para liberar las larvas, la única fase que se alimenta en el hospedador animal. Las ratas se infectan después de que las larvas que albergan las rickettsias (chiggers) se alimenten de sus fluidos corporales, aunque las larvas que están alimentándose y se infectan con las rickettsias no trasmiten la infección a su descendencia. Por tanto, los humanos y las ratas son sólo huéspedes accidentales, no esenciales y terminales de la rickettsia que causa el tifus scrub. Esta enfermedad se da en el área comprendida dentro del triángulo delimitado por Japón. Pakistán y el norte de Australia. La infección se contrae en zonas con vegetación densa, donde una gran población de ratas alberga a su vez una gran población de larvas que contienen las rickettsias. La lesión patológica básica es el daño vascular con inflamación linfohistocítica perivascular. que se manifiesta en la zona de la piel donde se produjo la inoculación de la rickettsia y en el cerebro, pulmones, corazón, tracto gastrointestinal y ríñones. Después de un período de incubación entre 6 y 21 días, la enfermedad comienza con fiebre, dolor de cabeza y. en algunos pacientes, mialgia, los y síntomas gastrointestinales (Watt. 1999). En la mitad de los pacientes occidentales aparece una escara, normalmente antes del comienzo de la fiebre, que rara vez aparece en los pacientes indígenas. Igualmente, en la mitad de los occidentales afectados con infección primaria aparece un exantema macular o maculopapular, entre dos y nueve días después del comienzo de la enfermedad. Los pacientes gravemente afectados pueden manifestar hipotensión, meningoencefalitis, fallo renal agudo y procesos hemorrágicos, A menos que se administre un tratamiento antimicrobiano adecuado, un 7% de los casos son fatales. El tifus scrub puede también afectar a los excursionistas y otros viajeros expuestos a las larvas en las zonas en las que la infección tiene carácter endémico. Para el diagnóstico del tifus scrub en zonas endémicas, un título de 1:400 o superior en un ensayo de IFA tiene una especificidad del 96% y una sensibilidad del 48%. Un incremento de cuatro veces en el título de anticuerpos específicos hasta un valor de 1:200 o superior implica una especificidad del 98% y una sensibilidad del 54%. También están disponibles para el diagnóstico el test indirecto de la inmunoperoxidasa, un inmunoensayo en fase sólida y un test de aglutinación de la cepa OX-K de Proteus mirabilis. y parece ser prometedor un ensayo con anticuerpos dirigidos frente a la proteína superficial mayoritaria de 56 kDa, obtenida mediante técnicas de ADN recombinante (Kim, 1993: Weddle, 1995). El tratamiento con un antibiótico del grupo de las tetraciclinas, como la deoxiciclina, o con cloranlenicol es eficaz, excepto entre algunos casos registrados en la parte norte de Tailandia (Watt, 1996).
Infecciones causadas por organismos del género Ehrlichia Estructura y función Los especies del género Ehrlichia son bacterias gramnegativas de pequeño tamaño (0,5 um). de morfología cocobacilar, parásitos intracelulares obligados que viven en el interior de la vacuola citoplasmática de los glóbulos blancos sanguíneos (Weiss, 1984). La microcolonia intravacuolar de bacterias semeja a una mora cuando se observa bajo tinción por el método de Wright-Giemsa, razón por la que a esta formación se le da el nombre de mórula (del latín, mora). Conocidas y estudiadas desde hace tiempo como agentes causales de enfermedades veterinarias, las especies del género Ehrlichia han emergido últimamente como patógenos humanos. Primariamente, las causas que han llevado a esta nueva situación han sido su reciente detección en humanos, su rápida caracterización con las herramientas moleculares analíticas actualmente disponibles y el incremento de las poblaciones y la distribución geográfica de las especies de garrapatas que tienen como hospedador a los ciervos. La taxonomía de estos organismos está pendiente de revisión debido a los nuevos datos genéticos que se han ido acumulando en los últimos años. Los patógenos animales como Cowdria ruminantiumy Anaplasma margínale están incluidos dentro de los géneros a los que pertenecen los agentes causales de ehrtichiosis en humanos encontrados en EE.UU. La denominación del género Anaplasna data de 1910,
lo que sugiere que pueden producirse ciertos cambios en la nomenclatura de estos microorganismos. Un agente causante de ehrtichiosis granulocitotrópica en humanos, identificado mediante PCR y secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S, es una coespecie de E. phagocytophilay E. equi. existiendo para esta última un precedente histórico (Chen, 1994), Otro agente que infecta a los granulocilos humanos, denominado Ehrlichia eivingii. presenta una gran semejanza con E. chaífeensis (Anderson, 1992).
Ehrlichiosis monocitotrópica humana Ehrlichia chaffeensis es transmitida por garrapatas, principalmente por la especie Amblyomma americanum. la garrapata Lone Star (estrella solitaria, nombre que se le da al estado de Texas, en EE.UU.), pero también por Dermacentor variabilis e Ixodes paciíicus (Anderson, 1992a: Ewing, 1995; Kramer, 1999). Los casos detectados tienen carácter rural y estacional predominantemente, ya que el 68% de los mismos aparecen entre mayo y julio (Fishbein, 1994). Los ciervos son un reservorio del microorganismo bien conocido, aunque los perros infectados también pueden ser reservónos potenciales. Las garrapatas resultan infectadas mientras se alimentan en el estado de larva o de ninfa, portando las ehrlichias mientras experimentan la muda entre las diletenles fases de su ciclo, transmitiendo la infección durante una posterior alimentación con la sangre del animal hospedador. La ehrlichiosis monocitotrópica humana (HME) ha sido detectada en 47 estados de la Unión: la mayor parte de los casos han aparecido dentro de la zona de dispersión de A. americanum en los estados del tercio sudeste de EE.UU., delimitado por una linea trazada desde Nueva Jersey a Texas. El número de casos detectados es particularmente elevado en Oklahoma, Missouri, Arkansas, Texas, Virginia. Tennessee y Georgia, Desde que en 1987 se detectara el primer caso de ehrlichiosis en EE.UU., más de 700 pacientes con infección por E. chaffeensis confirmada en el laboratorio han sido documentados en el CDC de Atlanta y más de 1.500 casos en un laboratorio comercial (Fishbein, 1994). Aproximadamente entre un 2% y un 3% de los casos han resultado fatales, aunque este porcentaje podría haber sido mucho más elevado si no se hubiera aplicado un tratamiento antibiótico eficaz en muchos pacientes (Fichtenbaum, 1994; Fishbein, 1994). La gravedad de la enfermedad se refleja en el hecho de que el 62% de los pacientes son ingresados. Aunque los casos graves aparecen, a menudo, entre personas ancianas, los niños también son susceptibles a la enfermedad (Schultz, 1997). La duración media de la enfermedad en una extensa serie de casos estudiados por el CDC. incluyendo aquellos en los que se administró tratamiento, fue de 23 días. Los signos y síntomas corresponden a los de una enfermedad sistémica que no tiene características clínicas distintivas para el diagnóstico: fiebre (97% de los casos), cefalea (81%), mialgia (68%). anorexia (66%), náuseas (48%), vómitos (37%). exantema (6% al inicio de la enfermedad. 25% durante la primera semana y un 36% en conjunto), tos (26%), faringitis (26%), diarrea (25%). linfadenopatías (25%), dolor abdominal (22%) y obnubilación (20%). Entre las complicaciones graves se incluyen el síndrome de distrés respiratorio del adulto, la coagulación intravascular diseminada y la insuficiencia renal. Los datos analíticos clínicos muestran leucopenia (60%). trombocitopenia (68%) y valores elevados de transaminasas hepáticas (86%). La afectación del sistema nervioso central viene indicada por ciertos síntomas como ataques y coma, y se confirma por una pleocitosis en el líquido cefalorraquídeo (LCR), por la presencia de E, chaffeensis y por un incremento de la concentración proteica en el LCR. y por la existencia de lesiones cerebrales que se ponen de manifiesto mediante autopsia (Dunn, 1992; Ratnasamy, 1996; Walker, 1997a). En los pacientes ¡nmunocomprometidos, incluyendo los enfermos de sida, la ehrlichiosis monocitotrópica humana puede ser una infección abrumadora, con un crecimiento masivo de las ehrlichias y un desenlace fatal (Paddock, 1993; Walker, 1997a). También existe documentación sobre infecciones suaves. Ehrlichia chaffeensis produce una infección persistente en sus hospedadores naturales y al menos ha sido documentado un caso semejante en humanos (Dumler, 1993b). Tras la entrada del microorganismo mediante la picadura de la garrapata. E. chaffeensis se disemina por el organismo a través de los sistemas linfático y circulatorio. Las mórulas del microorganismo han sido detectadas en el interior de los monocitos y los macrófagos de la médula ósea, sangre periférica (aunque raramente), sinusoides hepáticos, bazo, ganglios linfáticos, meninges, riñon y epicardio (Dumler. 1993a; Walker. 1997a). El examen de la médula ósea pone frecuentemente de manifiesto la existencia de granulomas, hiperplasia mieloide y megacariocitosis. Otras lesiones detectadas han sido
CAPÍTULO 49
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
infiltrados linfohistociticos perivasculares en el riñon, meninges, cerebro y corazón; neumonitis mononuclear intersticial; focos de muerte celular semejante a la apoptosis en el hígado, ganglios linfáticos y bazo; hiperplasia reticuloendotelial difusa; eritrofagocitosis; y colestasis.
Infección por Ehrlichia ewingii en el hombre Inicialmente identificada en 1971 como un patógeno del perro. E eiv/ngHtambién es transmitida por la garrapata A. americanum (Anziani, 1990: Ewing, 1971). Esta especie comparte antígenos comunes con E. chaffeensis. aunque infecta principalmente a los neutrófilos. En el informe sobre el descubrimiento de esta bacteria como patógeno humano, tres de los cuatro pacientes estudiados eran inmunocomprometidos, lo que sugiere que los individuos inmunocompetentes pueden ser relativamente resistentes a la enfermedad (Buller, 1999).
Ehrlichiosis
granulocitotrópica
humana
causada
por Ehrlichia phagocytophila En EE.UU. se han documentado más de 600 casos de ehrlichiosis granulocitotrópica humana (HGE). detectados principalmente en ios estados de la parte norte del medio oeste (Wisconsin y Minnesota) y los estados del nordeste (Nueva York, Connecticut, Rhode Island y New Jersey), aunque también se han confirmado casos de infecciones autóctonas hacia el sur, a lo largo de la costa este, así como en California y en Europa (Aguero-Rosenfeld, 1996; Bakken, 1996; Horowitz. 1998; Petrovec. 1997). La infección es transmitida por las garrapatas Ixodes scapulahs. I. pacificus e /. ricinus. siendo el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) y otros pequeños mamíferos el reservorío de la bacteria en EE.UU., mientras que el ciervo rojo, ovejas, cabras y el ganado en general tienen ese papel en Europa (Hodzic, 1998). La patología viene pobremente definida por la observación en sangre periférica y diversos órganos de neutrófilos con mórulas en su interior, de infiltrados de macrófagos espumosos en órganos del sistema reticuloendotelial. de infiltrados linfohistociticos vasculares periféricos y de apoptosis hepatocelular focalizada (Walker, 1997a). La mortalidad está asociada frecuentemente con infecciones secundarias oportunistas provocadas por hongos y virus (Hardalo, 1995). Las manifestaciones de la ehrlichiosis granulocitotrópica humana van desde formas asintomáticas hasta casos graves, y muchos de los pacientes diagnosticados necesitan ser hospitalizados (Bakken, 1996). La infección resulta mortal en menos del 1% de los casos, y es muy probable que algunas infecciones tengan un curso subclínico. La enfermedad comienza con escalofríos, fiebre, dolor de cabeza y mialgia. En la mayor parte de los casos aparece trombocitopenia, y leucopenia en cerca de la mitad de los afectados. El dato que indica la existencia de daño hepatocelular es la detección de niveles elevados de enzimas hepáticas, y los pacientes gravemente enfermos pueden sufrir un choque séptico con afectación multiorgánica.
Diagnóstico de laboratorio El aislamiento de las ehrlichias a partir de sangre humana en cultivos celulares sin antibióticos, una herramienta utilizada en la investigación, se ha logrado más a menudo con E. phagocytophila (en células HL-60) que con £ chaffeensis (en células DH-82), sólo una vez con E canis (en una persona asintomática). y aún no ha sido logrado (o al menos descrito en la bibliografía) con E ewingii(Childs, 1999: Dawson, 1991; Goodman, 1996; Pérez, 1996). La amplificación del ADN de las ehrlichias por PCR, empleando cebadores específicos de especie, es un método eficaz para el diagnóstico de todas las ehrlichiosis humanas, aunque no está disponible para su empleo de forma general (Anderson, 1992b; Buller, 1999; Chen, 1994; Comer, 1999; Everett, 1994). La sensibilidad del método de PCR oscila entre el 79% y el 100% para el diagnóstico de la ehrlichiosis monocitotrópica, y entre un 48% y un 86% en el caso de la ehrlichiosis granulocitotrópica causada por E phagocytophila (Anderson, 1992b; Everett, 1994). En fases más avanzadas de la enfermedad, debido al menor número de microorganismos en sangre o al tratamiento con tetraciclina, disminuye la sensibilidad del método de detección de ehrlichias basado en la PCR. Aunque sea un método laborioso, la visualización de mórulas en los neutrófilos de sangre periférica es una buena alternativa para el diagnóstico de la ehrlichiosis humana, ya que puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio. Esta técnica tiene una mayor sensibilidad (entre el 30% y el 80%) para el diagnóstico de las infecciones causadas por E phagocytophila que para el de aquellas en el que la responsable es E chaffeensis (menos del 10%). Es importante
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eliminar cualquier interpretación que signifique un resultado falsamente positivo debida a la presencia de granulaciones tóxicas, cuerpos de Dóhle. plaquetas superpuestas o partículas contaminantes. La detección inmunohistoquimica de E chaffeensis en muestras de tejidos se ha utilizado exclusivamente como técnica de investigación (Dumler, 1993a; Yu, 1993). El diagnóstico serológico es el procedimiento más habitual para la detección de la ehrlichiosis humana mediante IFA, empleando E chaffeensis propagada en cultivos celulares y antígenos de E. phagocytophila (Nicholson, 1997: Olano. 1999: Walls. 1999). Este método es muy sensible para detectar seroconversión hasta un título de 1:64 o superior entre dos y cuatro semanas después del inicio de la enfermedad. El resultado esperado en una muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfermedad es la ausencia de anticuerpos. Por lanío, el tratamiento debe iniciarse empíricamente en base a factores clínicos y epidemiológicos y no quedar pendiente de la confirmación diagnóstica de laboratorio. Existen opiniones variables respecto a cuál debe ser el título de anticuerpos presente en una única muestra de suero que varían entre valores de 1:64 y 1:256 para E chaffeensis. Aproximadamente en un 20% de pacientes afectados por HME y HGE respectivamente se detecta reactividad cruzada entre E phagocytophila y E chaffeensis. En consecuencia, en aquellas zonas geográficas donde existe una superposición de ambos tipos de infecciones (HME y HGE), o bien hay una posibilidad evidente de quedar expuesto a la infección como consecuencia de un viaje, es esencial determinar el titulo de anticuerpos frente a los dos microorganismos. Una diferencia de cuatro veces en el titulo es el criterio utilizado para distinguir entre ambos agentes infecciosos. Aquellos casos en los que sólo se detecta una diferencia de dos veces o menor se diagnostican como ehrlichiosis de etiología indeterminada. Poder diferenciar a E chaffeensis de E ewingii según criterios serológicos es más problemático, porque esta última especie aún no ha podido ser cultivada. La inmunotranslerencia (Western blot) es. actualmente, una técnica de investigación útil para distinguir las infecciones causadas por E chaffeensis. mediante la detección de una familia de proteínas de 120 kDa y 28 kDa especificas, y las provocadas por E phagocytophila, que muestra un patrón de especies proteicas mayoritarias entre 42 kDa y 49 kDa (Asanovich. 1997: Chen, 1997a, 1997b; Zhi, 1997). Los ensayos serológicos basados en estos antígenos obtenidos mediante técnicas de ADN recombinante parecen ser prometedores y podrian ser desarrollados en un futuro próximo (Yu, 1999).
Tratamiento La doxiciclina es muy eficaz para el tratamiento de las ehrlichiosis humanas (Bakken, 1996; Fishbein, 1994). El cloranfenicol también parece acortar la duración de la ehrlichiosis monocitotrópica humana (Fishbein, 1994), aunque los estudios llevados a cabo m vitro con cultivos celulares revelan que tanto E. chaffeensis como E. phagocytophila son resistentes a este antibiótico, así como a ciertos antimicrobianos de prescripción frecuente como los p-lactámicos. macrólidos, aminoglucósidos y sullamidas (Brouqui, 1992: Klein, 1997). Ehrlichia phagocytophila es sensible a la rifampicina y a la rifabutina cuando se encuentra creciendo en cultivos celulares.
Infecciones causadas por Coxiella burnetii Estructura y función Coxiella burnetii se encuentra bastante alejada desde el punto de vista genético del resto de rickettsias patógenas, y es el único microorganismo integrado en el grupo -/de las Proteobacterias. Estas bacterias gramnegativas tienen un aspecto variable que va desde una morfología bacilar hasta una cocácea, y mediante microscopía electrónica se han identificado dos lormas distintas: una representada por células largas (entre 0,5 pm y 1,2 pm) y otra por células densas de pequeño tamaño (0.5 pm), que podrian indicar la existencia de un ciclo de desarrollo. Se ha puesto un gran énfasis en los fenómenos asociados con el cultivo de C. burnetii en el laboratorio, como es la pérdida de la capacidad para sintetizar completamente el lipopolísacárido de la pared celular, tras un periodo prolongado de pases sucesivos en cultivos celulares o huevos embrionados. El cambio consistente en la síntesis de una molécula truncada de lipopolisacárido en lugar de la molécula completa del mismo, y que es análogo a la interconversión entre los fenotipos liso y rugoso que se da en la familia Enterobacteriaceae, se ha denominado como variación de fase, de fase I a fase II. La fase I se encuen-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Ira en la naturaleza y en los anímales y personas infectadas, mientras que la lase II aparece tan sólo en condiciones de laboratorio. Coxiella burnetii penetra en las células blanco, los macrófagos, por un proceso de fagocitosis pasiva y está fuertemente adaptada a las condiciones existentes en el interior del fagolisosoma (p, ej„ la bacteria sintetiza superóxido dismutasa y fosfatasa acida), donde tiene lugar la mulliplicación de la bacteria por fisión binaria.
Fiebre Q El nombre de fiebre O deriva del desconocimiento de su etiología cuando el síndrome clínico-epidemiológico fue descrito inicialmente como liebre interrogante. La ecología de C. burnetii incluye infecciones silenciosas en animales: muchas especies de garrapatas, ungulados (especialmente ovejas, vacas y cabras), otros mamíferos (incluyendo gatos y conejos salvajes), peces, pájaros y marsupiales (Mame. 1988.1997). Los seres humanos se infectan principalmente por la inhalación de aerosoles que tienen su ongen en restos de los partos del ganado doméstjco. aunque también por la ingestión de leche contaminada no pasteurizada (Fishbein, 1992). Muchas de las infecciones humanas tienen carácter de enfermedad ocupacional: se da entre empleados de mataderos, granjeros y veterinarios. Por el contrario, los casos urbanos no relacionados con una profesión de riesgo son, sin lugar a dudas, muy poco frecuentes en algunos de los grupos de población donde han sido evaluados, como sucede por ejemplo entre los pacientes inmunocomprometidos en Francia (Brouqui, 1993). La mayor parte de las infecciones humanas son asintomáticas (Mame. 1990). La enfermedad aguda se manifiesta, a menudo, como una afección febril mdiferenciada y autolimitada, o como una neumonía, hepatitis o meningoencefalitis (Drancourt. 1991; Duponl, 1992). Los pacientes individuales con mialgias. anorexia y dolor de cabeza raramente son investigados con objeto de diagnosticarles una fiebre Q, aun cuando estos síntomas son la presentación clinica más clásica de esta inlección, que representa, a su vez. un porcentaje significativo entre los pacientes que manifiestan dichos síntomas en algunos grupos de población. Las manifestaciones de la forma neumónica de la fiebre Q son variables: la tos puede ser no productiva o estar ausente, y la neumonía puede ser grave y progresar rápidamente o ser detectada radiológicamente, visualizando la presencia de múltiples infiltrados radiológicos redondeados o segmentarios, con ausencia de síntomas pulmonares. La forma hepática de la fiebre Q puede tener una presentación clinica semejante a la de la hepatitis viral aguda o la manifestación patológica de una hepatitis granulomatosa determinada mediante biopsia. La fiebre Q crónica está considerada como un sinónimo de endocarditis producida por C. burnetii. pero también aparece menos frecuentemente como consecuencia de la infección de un aneurisma o de prótesis vasculares, o de osteomielitis(Brouqui, 1993; Marrie. 1990). La forma de endocarditis crónica de la fiebre Q implica, generalmente, a una válvula aórtica o mitral previamente dañada, produciendo una enfermedad no febril que puede manifestarse con fallo cardiaco, bepatoesplenomegalia. ruidos cardiacos cambiantes y pérdida de peso. Las manifestaciones de la enfermedad asociadas a inmunocomplejos circulantes incluyen un exantema purpúrico asociado a vasculitis o glomerulonefritis. La patología de la fiebre Q aguda incluye neumonía bronquiolo-alveolar intersticial mixta con células inflamatorias mononucleares e inflamación granulomatosa del hígado y la médula ósea (Walker, 1988b). Los granulomas asociados a la fiebre Q presentan, a menudo, una vacuola central transparente rodeada por un anillo de fibrina y por macrófagos epitelioides. De todos modos, estos granulomas no son lesiones con valor patognomónico ni tampoco el único tipo de granulomas que se detectan en el higado y la médula ósea de los pacienles afectados por fiebre Q. Las válvulas cardíacas alectadas en la endocarditis asociada a la fiebre Q muestran una inflamación subaguda y crónica, con una gran cantidad de macrófagos espumosos que tienen el citoplasma repleto de células de C. burnetii.
Diagnóstico de laboratorio El diagnóstico de laboratorio de la fiebre Q se lleva a cabo, en la mayor parte de los casos, mediante la detección de anticuerpos frente a C. burnetii (Fournier, 1996. 1998). Los métodos serológicos utilizan antigenos característicos de ambas fases (fase I y fase II) y. a menudo, evalúan la producción de anticuerpos específicos de clase. Los métodos del enzimommunoensayo y el IFA son altamente específicos y mas sensibles que los basados en la fijación del complemento. En la fiebre Q aguda, los anticuerpos frente a los antigenos de la fase II aparecen muy pronto tras la infección, mientras que los anticuerpos frente a la
fase I pueden detectarse unas dos semanas después del inicio de la enfermedad. En general, la fiebre Q aguda se asocia con títulos elevados de anticuerpos frente a los antigenos de la fase II y bajos frente a los de la fase I. Mediante el test de IFA, un título de IgG y de IgM frente a antigenos de la fase II de 1:200 o superior y de 1:50 o superior, respectivamente, tiene una sensibilidad del 58% y una especificidad del 92% para el diagnóstico de la fiebre Q aguda. En la forma crónica de la enfermedad, se detecta un título más elevado de anticuerpos frente a la fase I (de 1:800 o supenor mediante el test de IFA) mientras que el titulo de anticuerpos frente a la fase II es. generalmente, igual o inferior al de la fase I. Frecuentemente es posible detectar una respuesta de IgA frente a antígenos de la fase I en pacientes aquejados de fiebre Q crónica. Un título de 1:128 o superior de anticuerpos frente a antigenos de fase detectados mediante fijación de complemento se considera también que tiene valor diagnóstico de fiebre Q crónica, si bien algunos pacientes presentan títulos inferiores. Debido a la reactividad cruzada existente entre Bartonella henselae y B. quintana con C. burnetii. no debe llevarse a cabo el diagnostico serológico de la endocarditis causada por Bartonella hasta que no se haya determinado el titulo de anticuerpos frente a C. burnetii (LaScola. 1996b), que, en el caso de la endocarditis asociada a la fiebre Q, es sustancialmente más elevado que el detectado frente a Bartonella. Otros métodos empleados para el diagnóstico de la endocarditis asociada a la fiebre Q crónica son la tinción inmunohistológica, la microscopía electrónica, y la detección de C burnetii mediante PCR, aunque todos ellos implican la utilización de técnicas que son más propias de la investigación básica. Coxiella burnetii puede ser recuperada a partir de la sangre o de las válvulas cardiacas mediante cultivo in vttro utilizando un sistema de cultivo de células HEL en shell vial, facilitado por centrifugación. Este procedimiento puede detectar e identificar la presencia de coxiellas en unos siete días, pero debe emplearse solamente en instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.
Tratamiento La doxiclma es eficaz para acortar la duración de la fiebre O aguda cuando se administra durante los tres primeros días después del comienzo de la enfermedad (Levy, 1991). Las fluoroquinolonas representan una medicación alternativa para aquellos pacientes que no pueden ser tratados con tetraciclinas. El tratamiento de la endocarditis asociada a la forma crónica de la enfermedad implica la administración durante liempo prolongado de doxicíclina y una quinolona simultáneamente, aunque a menudo esta pauta no es capaz de eliminar la infección (Marrie. 1997). El éxito del tratamiento viene indicado por una lenta caída en el título de IgG frente a antígenos de la fase I hasta un valor por debajo de 1:200, momento en el que puede considerarse la posibilidad de suspender el tratamiento. La sustitución de las válvulas cardíacas afectadas se lleva a cabo, frecuentemente, por razones de tipo hemodinamico.
Infecciones causadas por organismos del género Bartonella
(Rochalimaea)
Estructura y función Los organismos originalmente clasificados dentro del género Rochalimaea han sido reclasificados como un género nuevo, Bartonella. mientras que la familia Bartonellaceae ha sido suprimida del orden Rickettsiales (Birtles. 1996; Brenner. 1993). Las especies patógenas del hombre. S. quintana (el agente etiológico de la fiebre de las trincheras, una de las pnncipales enfermedades transmitidas por piojos durante la primera guerra mundial), B. henselae (el agente causal de la enfermedad por arañazo de gato), B. elizabethae (asociada con endocarditis infectiva) y B. bacilliíormis (una bacteria transmitida por los mosquitos que provoca una forma febnl de anemia hemolítica aguda y una lesión cutánea crónica denominada verruga peruana en América del Sur), han podido ser cultivadas en medios artificiales enriquecidos con sangre en presencia de un 5% de CO-, Estos bacilos gramnegativos. parásitos intracelulares facultativos, no producen ácidos de los carbohidratos y. generalmente, se localizan en el interior de los entrocilos del animal mamífero que constituye su hospedador natural. Entre las numerosas nuevas especies descritas del género Bartonella, B. clarridgeiae podría ser un segundo agente etiológico de la enfermedad por arañazo de gato (Kordick, 1997),
Enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis bacilar y peliosis bacilar Bartonella henselae es transmitida al ser humano por los arañazos o mordeduras de mascotas infectadas que están bacteriémicas durante muchos meses
CAPÍTULO 49
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
aunque aparentemente parezcan sanas (Bergmans, 1997; Chomel, 1995; Heller, 1997; Tapperò, 1993). La bacteria se transmite entre gatos a través de sus pulgas (Chomel. 1996; Higgins. 1996). La naturaleza de la enfermedad está determinada, en gran medida, por el propio hospedador. En individuos inmunocompetentes, alrededor del 80% son jóvenes menores de 21 años que presentan una pápula o pústula cutánea en el punto donde se produjo la inoculación del microorganismo, con una linfadenopatia regional limitada. Menos del 2% de los pacientes sufren complicaciones en el hígado, bazo, pulmones, huesos, sistema nervioso central, retina, conjuntiva o piel como consecuencia de la diseminación del microorganismo por la sangre (Listón. 1996). Desde un punto de vista histopatólogico, las lesiones de la enfermedad por arañazo de gato consisten en granulomas que rodean a microabcesos estrellados. En pacientes profundamente inmunodeprimidos, la infección por B. henselae cursa con fiebre y bacteriemia o con lesiones cutáneas o viscerales angioproliferativas. Estas últimas se caracterizan por ser proliferaciones vasculares lobulares de células endoteliales rechonchas con racimos de pequeños capilares que rodean a los capilares ectáticos separados por un estroma edematoso, mucilaginoso o fibrótico que contiene cúmulos de neutrófilos y de restos de los mismos, así como microcolonias granulares de bartonellas. Cuando se forman en la piel, estas lesiones reciben el nombre de angiomatosis bacilar, mientras que cuando aparecen en el hígado y el bazo se denominan peliosis hepática o esplénica. La infección también puede diseminarse a otras localizaciones. Las lesiones angioproliferantes provocadas por B. henselae y B. quintana en pacientes inmunodeprimidos son indistinguibles entre si y bastante parecidas a las de la verruga peruana causada por 8. bacilliformis (Koehler, 1997). Bartonella henselae, B. quintana y 8. elizabethae han sido descritas como agentes responsables de endocarditis infecciosa en humanos, al igual que B. vinsoniien perros (Drancourt, 1995).
Fiebre de las trincheras y angiomatosis bacilar Bartonella quintana produce una bacteriemia prolongada en pacientes convalecientes, que constituyen, aparentemente, su reservono. Durante la primera guerra mundial, se estableció que la infección se transmitía de persona a persona mediante la picadura del piojo {Pediculus humanus corporis) en las trincheras de la primera linea del frente (Bruce. 1921), no habiéndose identificado otras fuentes o mecanismos para la transmisión de la infección. A partir de las heces del piojo cargadas con B. quintana, el microorganismo penetra por las erosiones de la piel que el propio individuo se produce al rascarse tras la picadura, y aproximadamente ocho días más tarde comienzan a aparecer los síntomas de la enfermedad, que se manifiesta con un nivel de gravedad variable. Los síntomas incluyen fiebre, que generalmente desaparece en menos de una semana, jaqueca, mialgias, dolor pretibial y la aparición de una erupción macular evanescente. Las recaídas se producen a menudo con intervalos de cuatro a cinco días. La bacteriemia en el ser humano afectado persiste durante semanas, meses o incluso más tiempo, siendo la fuente a partir de la cual los piojos se infectan, incluso aun cuando la persona se sienta relativamente saludable. En la actualidad se detectan casos de la enfermedad entre los grupos de alcohólicos y vagabundos en ciudades amencanas y europeas (Spach, 1995).
Fiebre de Oroya y verruga peruana La bartonellosis sudamericana, que se manifiesta como una enfermedad aguda, denominada liebre de Oroya, o en forma de una lesión cutánea crónica llamada verruga peruana, se transmite por la picadura del mosquito Lutzomyia. Los portadores humanos asintomáticos a largo plazo son el reservorio de la bacteria responsable, B. bacillilormis. Tras un período de incubación de unas tres semanas aproximadamente, la liebre de Oroya comienza de una forma insidiosa con anorexia, dolor de cabeza, malestar y febrícula, o bien de manera brusca con escalofríos, fiebre elevada y delirios. Las bartonellas invaden los glóbulos rojos sanguíneos, provocando cambios en los mismos que se traducen en eritrofagocitosis y anemia. La verruga peruana, caracterizada por la aparición de nodulos duros, con una coloración que va de rojo a púrpura, que surgen en grupos durante un período de entre uno y dos meses y persisten durante meses e incluso años, es un cuadro que se manifiesta tras la liebre de Oroya, o puede aparecer sin que existan síntomas previos de ningún tipo (Arias-Stella. 1986).
Diagnóstico de laboratorio El hemocultivo por el procedimiento de lisis-centrifugación y el sistema Bactec para hemocultivo han sido utilizados para la recuperación de 8. henselae y B. quintana a partir de los pacientes (Brenner. 1997). El crecimiento
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óptimo se obtiene en medios de cultivo enriquecidos con sangre de conejo, en agar chocolate o en agar con extracto de levadura y carbón activo. Las colonias tardan entre 9 y 15 días, y en ocasiones incluso más tiempo, en aparecer y ser detectadas. Las especies del género Bartonella son bacterias gramnegativas de morfología bacilar, con una longitud entre 1 u.m y 3 u.m y un diámetro entre 0,2 u.m y 0,5 u.m. Bartonella henselae da negativas las pruebas de la oxidasa, catalasa y ureasa y no utiliza los carbohidratos. La identificación definitiva requiere un análisis de la composición de ácidos grasos, secuenciación de ADN o hibridación con sondas específicas, técnicas que se utilizan por lo general en los laboratorios de referencia (Scott, 1996). La PCR representa un método atractivo para el diagnóstico molecular. Bartonella bacillilormis puede ser cultivada y aislada a partir de muestras de sangre o de las lesiones cutáneas en agar infusión de cerebro y corazón, conteniendo un 0,4% de agar y un 5% de sangre humana, de caballo o de cone|0. Originalmente, el diagnóstico de la enfermedad por arañazo de gato se basaba en una combinación de datos clínicos, epidemiológicos y patológicos. Los estudios morfológicos, incluyendo la tinción de Warthin Starry, han sido utilizados como datos adicionales para el diagnóstico de la angiomatosis bacilar y la enfermedad por arañazo de gato. La fiebre de Oroya puede diagnosticarse mediante la visualización de las bartonellas en el interior de los eritrocitos, que aparecen como formas cocáceas o bacilares, ocasionalmente con morfologías curvadas o en anillo, en muestras de sangre periférica cuidadosamente teñidas mediante el método de Giemsa. para evitar la aparición de artefactos que pudiesen conducir a una interpretación errónea de lo observado. El diagnóstico de las infecciones causadas por 8. henselae y 8. quintana se lleva a cabo habitualmente mediante la demostración de la existencia de anticuerpos específicos mediante inmunofluorescencia indirecta o enzimoinmunoensayo (Dalton, 1995b). El diagnóstico serológico de la endocarditis por bartonellas debe contemplar también la determinación del título de anticuerpos frente a C. burnetii, que puede incrementar el título de anticuerpos que reaccionan cruzadamente con Bartonella (Maurin, 1997). El título frente a la fase I de C. burnetii es mucho más elevado que el de anticuerpos anti-8artone//a en la endocarditis asociada a la forma crónica de la fiebre Q.
Tratamiento Por lo general, la enfermedad por arañazo de gato es autolimitada, aunque parece responder favorablemente al tratamiento con acitromicina. Los fármacos de elección para el tratamiento de la angiomatosis bacilar, peliosis por Bartonella, bacteriemia o endocarditis son eritromicina, acitromicina o doxiciclina (Guerra, 1993). Eventualmente pueden producirse recaídas que necesitan un nuevo tratamiento o incluso una terapia de mantenimiento a largo plazo. Para el tratamiento de la fiebre de Oroya es preferible el cloranlenicol, debido a la efectividad de este antibiótico frente a la sobreinfección por salmonellas. cuya aparición está claramente reconocida. El tratamiento puede producir una reacción semejante a la de Jarisch-Herxheimer. que cursa con fiebre y otros síntomas sistémicos. La verruga peruana se trata con rifampina por vía oral. En el tratamiento de la fiebre de las trincheras se han utilizado con éxito tetraciclina y cloranfenicol.
INFECCIONES POR MICOPLASMAS La capacidad de los micoplasmas para causar enfermedades en el hombre fue puesta de manifiesto en 1962. cuando un organismo de este tipo (seguidamente denominado Mycoplasma pneumoniae) fue identificado como el agente etiológico de la enfermedad denominada neumonía atípica primaria (Chanock, 1962). Los micoplasmas son los microorganismos más pequeños conocidos con capacidad para vivir como formas libres. Son bacterias pleomórficas, con forma esférica, de pera o filamentosa, con un diámetro entre 0,2 u,m y 0,8 p.m. La mayor parte de especies son anaerobias facultativas y se dividen por escisión binaria. Los micoplasmas constituyen un grupo único entre las bacterias porque carecen de pared celular. Son incapaces de sintetizar los constituyentes de la pared celular y necesitan que en el medio exista colesterol (y otros esteroles relacionados) para poder llevar a cabo la síntesis de membranas. Los micoplasmas también carecen de las rutas enzimáticas necesarias para realizar la síntesis de purinas y pirimidinas, por lo que necesitan medios de cultivo complejos (como el caldo infusión de corazón de vacuno, enriquecido con suero de caballo, extracto de levadura y ácidos nucleicos) para poder crecer in vitro. En este capítulo se tratarán las especies potencialmente patógenas, Mycoplasma pneumoniae y los micoplasmas genitales {Mycoplasma hominis y Ure-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
aplasma urealyticum). Las otras especies de micoplasmas forman parle de la microbiota normal de los tractos respiratorio y genitourinario en el ser humano.
Mycoplasma
pneumoniae
Epidemiología Mycoplasma pneumoniae tiene una distribución mundial. Las epidemias provocadas por esta bacteria se dan en grupos de población cerrados, como niños en escuelas, familias, reclutas militares, típicamente a intervalos de tiempo enlre cuatro y ocho años, especialmente al final del verano y comienzo del otoño. En los años de los períodos interepidémicos, los casos aparecen a lo largo de todo el año y por lo general la infección se extiende lentamente, siendo necesario para el contagio que exista un contacto directo con una persona enferma. Sin embargo, durante las epidemias la infección puede diseminarse rápidamente, y la detección de brotes puntuales que no parecen estar asociados a una exposición cercana y prolongada al microorganismo sugiere que M. pneumoniae puede transmitirse a través de partículas de pequeño tamaño presentes en aerosoles. La tasa de infección con M. pneumoniae es elevada en niños en edad escolar y adultos jóvenes, y la enfermedad aparece con mayor frecuencia en personas con edades comprendidas entre los 5 y los 20 años, especialmente en aquellas que se encuentran en la franja entre los 15 y los 19 años. La infección por M. pneumoniae es frecuente en niños con menos de 5 años, aunque por lo general es asintomática o produce tan sólo una enfermedad suave con conza y silbidos respiratorios pero sin fiebre o neumonía (Femald. 1975).
Patogenia y patología Mycoplasma pneumoniae es un parásito superficial que coloniza el epitelio de la mucosa del tracto respiratorio. Su capacidad para adherirse a las células de la mucosa respiratoria, escapar a la fagocitosis y modular la respuesta del sistema inmune es fundamental para que se desencadene la enfermedad. Su movilidad por deslizamiento puede permitirle penetrar a través de las secreciones respiratorias, y su forma filamentosa y flexible, que posee un orgánulo de adherencia terminal, facilita su localización en huecos y plegamientos de la membrana plasmálica de las células hospedadoras y entre las microvellosidades y los cilios de las mismas, donde queda protegido de la acción de las células fagocíticas. La adhesión de M. pneumoniae a las células hospedadoras está mediada por la proteína P1, que mteracciona con glucoproteinas que contienen ácido neuramínico. presentes en la superficie de la membrana celular (Chandler. 1982; Geary, 1987). El peróxido de hidrógeno y el ion superóxido producido por M. pneumoniae puede causar daño en las células de la mucosa, provocando la detención del movimiento de los cilios y el desprendimiento de las células superficiales (Almagor, 1984) Algunos factores relacionados con el hospedador también parecen estar implicados en la patogenia de la enfermedad producida por M. pneumoniae. La aparentemente elevada prevalencia de la infección por esta bacteria en niños y jóvenes, el carácter suave de la enfermedad en individuos pertenecientes a estos grupos y la aparición de una forma más grave de la afección en personas con edades más avanzadas sugiere que la enfermedad grave podría ser consecuencia de la respuesta inmune del hospedador a la reinfección por el microorganismo; sin embargo, se desconoce la naturaleza del mecanismo específico responsable del daño celular en este caso Además, se sospecha que los síntomas exlrapulmonares (que se comentarán más adelante) están mediados por una respuesta inmune, ya que M. pneumoniae se aisla con muy baja frecuencia a partir de muestras no respiratorias. La interacción de M. pneumoniae con el determinante antigénico I de los glóbulos rojos humanos, que contiene los restos de 2.3-sialil-poli-/V-acetilgalactosamina necesarios para el reconocimiento, puede causar una alteración en dicho antigeno I, transformándolo en antígeno extraño que estimule la producción de aglutininas frías. Otros anticuerpos autoinmunes que se forman durante la infección por M. pneumoniae (anticuerpos frente a pulmón, cerebro, músculo liso y Imfocitos) pueden tener un origen semejante. La primera linea de defensa durante la infección primaria por M. pneumoniae es la activación del complemento por la vía alternativa y la fagocitosis de las bacterias a nivel de la superficie de las mucosas. Determinados componentes galactosilados y glucosilados presentes en la superficie de la membrana celular del microorganismo parecen tener la capacidad de inducir la producción de anticuerpos, de los que los más impodantes son las IgA. que se encuentran predominantemente en las secreciones propias de la mucosa.
Los antígenos intracelulares de M. pneumoniae que quedan expuestos como consecuencia de la fagocitosis y subsiguiente degradación de las bacterias fagocitadas estimulan la respuesta mediada por linfocitos T. que a su vez determina, aparentemente, la gravedad de la enfermedad Existe poca información sobre la patología de la enfermedad causada por M. pneumoniae, ya que la mayor parte de infecciones son autolimítadas. y muy raramente se obtienen muestras de tejidos por biopsia para su examen. En los casos látales se pueden observar zonas de consolidación parcheadas en los pulmones. El examen histológico de los focos de tejido afectado revela la existencia de bronquitis, bronquiolilis y neumonitis intersticial y alveolar con acúmulos peribronquioiares de linfocitos y células plasmáticas, acompañados por macrófagos y neutrófilos en el caso de que exista necrosis celular.
Manifestaciones
clínicas
La manifestación más común de la enfermedad causada por M. pneumoniae es la Iraqueobronquitis. La neumonía, que aparece aproximadamente en un tercio de personas infectadas, comienza de forma gradual entre dos y tres semanas después de la exposición al microorganismo, con fiebre, malestar, dolor de cabeza, faringitis y una tos seca persistente no productiva (Baum. 2000). Es frecuente una sinusitis clínicamente inaparente, y también puede aparecer miringitis. Las radiografías de tórax muestran una bronconeumonía unilateral en el lóbulo inferior del pulmón y, ocasionalmente, infiltrados dilusos bilaterales. El recuento de leucocitos en sangre periférica es normal inicialmente. para aumentar a medida que la enfermedad avanza. En aproximadamente un 15% de los afectados, aparece una erupción cutánea maculopapular y. con menor frecuencia, vesicular, unos pocos días después del comienzo de la enfermedad. Sin tratamiento antimicrobiano la fiebre desaparece entre los 2 y 14 dias. pero el malestar general, la tos y las anomalías radioscopias persisten entre dos y seis semanas. En un bajo porcentaje de niños y adultos, la neumonía es lo suficientemente grave como para requerir hospitalización: en estos pacientes pueden aparecer abscesos pulmonares, derrames pleurales, infecciones bactenanas secundarias, bronquiectasias o recaídas clínicas. Las manifestaciones extrapulmonares son poco frecuentes e incluyen anemia hemolítica clínicamente aparente, asociada típicamente con títulos muy elevados de aglutminas frías: eritema multiforme, eritema nodoso y urticaria; encefalitis, meningoencefalitis, mono o polineuritis y meningitis: miocarditis y pericarditis, y artralgias y. raramente, artritis (Baum. 2000; Cassel. 1981: Ponka. 1979)
Micoplasmas genitales Epidemiología En los niños, la colonización con micoplasmas genitales liene lugar en el momento del nacimiento cuando el feto pasa por el canal del parto infectado y. por lo general, persiste un poco menos de dos años. Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden ser aislados del tracto genital de hasta un 30% de las niñas (con menor frecuencia a partir del tracto genital de niños), y también pueden aislarse a partir de nariz y garganta de un 15% de niños y niñas (Klein. 1969). En un estudio se encontró que el 20% de las niñas prepúberes estaban colonizadas con ureaplasmas y un 6% con M. hominis. aunque en niños prepúberes los micoplasmas genitales fueran aislados muy raramente (Hammerschlag. 1978). La colonización con micoplasmas genitales después de la pubertad es consecuencia del contacto sexual. Alrededor del 60% de mujeres aparentemente sanas, sexualmente activas, son portadoras de U. urealyticum en su vagina, mientras que un 20% lo son de M. hominis.
Manifestaciones
clínicas
Ureaplasma urealyticum es responsable de algunos casos de uretritis no gonocócica; ha sido asociado con fiebres posparto, corioamnionitis y nacimientos con peso bajo, aunque no se ha probado que exista una relación causal en este último caso: y también es raramente responsable de casos de uretrocistitís crónica en individuos inmunodepnmidos (Taylor-Robinson. 1980. 1985: Casell. 1986). Mycoplasma hominis es uno de los agentes causales de fiebre posparto y postaborto; y también es la causa, aunque con muy poca frecuencia, de casos de bacteriemia. artritis, peritonitis, meningitis, osteomielitis e infecciones de las heridas, principalmente en personas inmunocomprometidas, aunque también en otras que no manifiestan, aparentemente, deficiencia inmunológica subyacente alguna (Taylor-Robinson, 1980: DeGirolami. 1982: McMahon. 1990).
CAPÍTULO 49
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
Diagnóstico de laboratorio Mycoplasma
pneumoniae
Las muestras recomendadas para llevar a cabo el diagnóstico de la infección causada por M. pneumoniae son exudados de garganta tomados con hisopo y suero, aunque también son aceptables el Huido del lavado broncoalveolar, esputo y biopsias de tejido pulmonar. Un test serológico no específico que puede proporcionar información útil es la detección de aglutinmas frías, que son anticuerpos del tipo IgM (rente al antígeno I de los eritrocitos humanos. Estas aglutinmas aparecen al final de la primera o comienzos de la segunda semana de la enfermedad, al menos en la mitad de las personas infectadas, aunque su presencia no es diagnóstico de infección por M. pneumoniae. El diagnóstico definitivo se basa en la delección del microorganismo, o de IgM específicas en suero, o en la observación de un incremento de cuatro veces en el título de IgG entre muestras de suero tomadas en la fase aguda y de convalecencia de la enfermedad. Para aislar M. pneumoniae. se inocula un sistema bifásico de cultivo que se incuba a 35°C-37"C hasta un máximo de tres semanas en el interior de un contenedor sellado, en una estufa normal. Los cultivos se examinan al microscopio (x40) una o dos veces por semana para detectar en los mismos la presencia de las típicas colonias que recuerdan a un "huevo frito" (presentan una zona central densa, rodeada de un área menos compacta), embebidas en la matriz del agar del medio de cultivo. Tales colonias, típicas de M. pneumoniae. deben ser analizadas para comprobar su carácter hemolitico {M. pneumoniae es |J-hemolítico) según el siguiente procedimiento: se prepara un agar al 1% en solución salina al 0.85% que se mantiene fundido a la temperatura de 50 C. mezclándose a continuación con sangre de oveja o de cobaya para obtener una concentración final de eritrocitos del 5%; seguidamente se deposita un volumen de la mezcla final resultante sobre la superficie del medio de cultivo donde aparecieron las colonias, para obtener, tras la solidificación del agar, una delgada capa que cubra las mismas; el cultivo es reincubado durante 24 horas, examinándose seguidamente para detectar los halos de hemolisis completa alrededor de las colonias. Debido a que el aislamiento de M. pneumoniae puede requerir vanas semanas, los test rápidos resultan más útiles para el diagnóstico. Por ejemplo, la detección de IgM específicas en una única muestra de suero es indicativa de infección aguda. Si lo que se determina son IgG, entonces deben analizarse muestras de suero tomadas durante la lase aguda y de convalecencia de la enfermedad, para observar un incremento de cuatro veces o superior en el titulo de anticuerpos específicos.
Micoplasmas
genitales
Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden recuperarse a partir del material obtenido a partir de la vagina, uretra o endocérvix con un hisopo, o bien de muestras de orina, sangre, material de abscesos, secreciones prostéticas, semen o biopsias de tejidos. Se pueden utilizar varios sistemas de cultivo para llevar a cabo el aislamiento de los micoplasmas genitales (Clyde. 1984; Yajko. 1984; Wood. 1985: Phillips. 1986). Tradicionalmente. se han utilizado procedimientos separados para cada especie (caldo U y agar U para U. urealyticum y caldo H y agar H para M. hominis). debido a que el pH óptimo de crecimiento de los dos microorganismos es diferente (pH entre 5,5 y 6.5 para U. urealyticum y entre 6 y 8 para M. hominis). Sin embargo, en la actualidad existen sistemas únicos de cultivo que permiten detectar con gran eficacia ambas bacterias (Yajko, 1984; Wood. 1985: Phillips, 1986). Los cultivos en medio líquido se incuban en aerobiosis en tubos sellados. Los cultivos en medios sólidos se incuban en anaerobiosis o en una atmósfera que contenga entre el 5% y el 7% de C0 . y son examinados diariamente con el microscopio. M. hominis también crece en agar sangre de ove|a. donde forma colonias visibles, no hemolíticas. y en la mayor parte de medios líquidos para hemocultivo. aunque en éstos no produce evidencia visible y detectable de su crecimiento. ;
Las colonias de M. hominis. con un diámetro entre 200 pm y 300 pm y la típica forma de "huevo frito", aparecen tras cinco días, o incluso menos, de incubación. En un medio liquido que contenga rojo de fenol como indicador de pH y un 0.1% de arginina, M. hominis transforma la arginina en amoniaco, provocando un cambio de color en el medio, que pasa de rojo a amarillo. Las placas de agar U son examinadas diariamente durante cuatro días, y en el cuarto día
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se tiñen con una o dos gotas de una solución de CaCI.-urea depositadas directamente sobre la superficie del medio. Las colonias de U. urealyticum tienen un diámetro de 15 pm-16 pm y se tiñen de un color marrón oscuro en unos 5 minutos al entrar en contacto con la solución anterior. En caldo U. U. urealyticum provoca un cambio en el pH del medio, haciendo que el color del mismo varíe de amarillo a rojo. En ese momento debe sembrarse por estria con el asa de platino una muestra del cultivo en medio líquido en una placa con medio sólido, para llevar a cabo el aislamiento del microorganismo.
Tratamiento La terapia antimicrobiana no está recomendada en el caso de faringitis o traqueobronquitis causada por iVf. pneumoniae. Una tetraciclma o un macrólido son antibióticos adecuados para el tratamiento de la neumonía inducida por M. pneumoniae. aunque la terapia no alecta, aparentemente, a la transmisión del microorganismo. Las tetraciclinas son eficaces frente a M. hominis y la mayor parte de cepas de U. urealyticum. Alrededor de un 10% de ureaplasmas son, sin embargo, resistentes a la tetraciclina: las infecciones causadas por cepas resistentes responden bien, por lo general, a la entromicma (Taylor-Robinson. 1986) o alguno de los nuevos antimicrobianos de los grupos de los macrólidos o las quinolonas. BIBLIOGRAFÍA
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1086
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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CAPÍTULO 49
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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS. RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS
1087
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C A P Í T U L O
50
Bacteriología médica • Barbara S. Reiner, Ph.D. • Gail L. Woods, M.D.
PROCESADO DE LA MUESTRAS
1088
Bacilos grampositivos
Tinción de Gram
Bacterias gramnegativas
Técnicas de cultivo
Bacterias anaerobias
BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA
1091
BIBLIOGRAFÍA
1118
Cocos grampositivos Es posible recuperar una amplia variedad de especies bacterianas a partir de los diferentes tipos de especímenes clínicos. Para poder valorar correctamente la importancia desde el punto de vista clínico de estos organismos, es esencial tener un perfecto conocimiento de la microbiota bacteriana que existe normalmente en las diferentes localizaciones anatómicas de donde pueden proceder las muestras clínicas que van a ser analizadas. En la Tabla 50-1 se muestra un listado de todos aquellos microorganismos que pueden encontrarse en diversos lugares y superficies del cuerpo humano sano. En algunos casos, el número de organismos existentes puede ser extremadamente elevado: por ejemplo. 10 organismos/cnv en la piel. 10 organismos/ml en las secreciones orales y 10'' organismos'g en el contenido intestinal (colon). En consecuencia, es muy importante que la muestra obtenida tenga una contaminación mínima con microorganismos perteneciente a la microbiota normal. Este objetivo es difícil de lograr, pero puede conseguirse si se utilizan los procedimientos técnicos apropiados. Dichos procedimientos, junto con las técnicas de procesamiento utilizadas para incrementar la eficiencia en la recuperación de microorganismos patógenos, se presentan en el Capítulo 57. Este capítulo comienza con una breve descripción de los métodos de laboratorio utilizados para el procesamiento de la muestra, orientado hacia el cultivo bacteriano, seguida de un análisis mucho mas detallado sobre las especies bacterianas consideradas generalmente como patógenas del hombre. 6
PROCESADO DE LA MUESTRAS Tinción de Gram
v
te estériles, se puede utilizar una citocentrifuga para concentrar los microorganismos presentes en el espécimen de 10 a 100 veces (Peterson, 1988), Una vez realizada la extensión se deja que seque al aire, se fija mediante tratamiento con etanol. o por medio de calentamiento suave, y se tiñe seguidamente con los reactivos de la tinción de Gram (cristal vicíela, solución de yodo lugol], alcohol y safranma). Dependiendo de la estructura de la pared celular característica de cada categoría, las bacterias grampositivas resistirán la acción decolorante del metanol y conservarán el color púrpura del cristal violeta, mientras que las gramnegativas quedarán decoloradas y se teñirán de rojo con la safranina. Una vez realizada la tinción, las extensiones se observan con un objetivo de bajo aumento para detectar estructuras grandes, como larvas de nematodos, espirales de Curschmann. granulos y partículas, microcolonias bacterianas y células o formas fúngícas. A continuación, se emplea el objetivo de inmersión en aceite para determinar el tipo de bacterias presentes. Debido a que es necesario que exista una concentración de 10* de microorganismos por mi en la muestra, para que pueda observarse al menos 1 bacteria por cada campo microscópico cuando se utiliza el objetivo de inmersión (x 1.000), el frotis debe examinarse meticulosa y exhaustivamente para poder detectar aquellos microorganismos que estén en bajo número en el espécimen. Debe determinarse el tamaño, la forma y el tipo de tinción de Gram de las bacterias observadas y dar una desenpción lo más detalada posible de la observación realizada; por ejemplo, indicar en el informe que se ha deteclado la presencia de cocos grampositivos en parejas, que se parecen a Streptococcus pneumoniae (Lámina 50-1), resulta de mucha más ayuda que indicar simplemente que se han observado cocos grampositivos formando cadenas. Debe indicarse y cuantificarse también la presencia de leucocitos o hematíes, asi como cualquier posible bacteria intracelular que pudiera observarse.
Es difícil encontrar argumentos en contra del hecho de que el examen directo de un espécimen clínico bajo tinción de Gram representa uno de los métodos con mayor valor y utilidad entre los empleados en el laboratorio de Técnicas de cultivo microbiología. Los resultados de la tinción de Gram proporcionan rápidamente una información valiosa que puede ser utilizada no sólo por el clínico para La selección de los medios de cultivo se realiza teniendo en cuenta que hay elegir la terapia antimicrobiana apropiada, sino también por el técnico de laboque proporcionar las condiciones óptimas de crecimiento a los patógenos que ratorio, para valorar la calidad de la muestra y la profundidad con la que debe pueden encontrarse comúnmente en una determinada localización o en un abordarse la caracterización de algunos de los microorganismos aislados en espécimen concreto. Hay que prestar una atención especial a los requericultivo. En general, se concede una mayor atención a aquellos organismos mientos nutricionales de las bacterias asociadas con un determinado proceso que eslán presentes en número elevado en especímenes que contienen infeccioso, asi como a la necesidad de tener que aislar ciertas bacterias patóabundantes células blancas sanguíneas (CBS) que a los que se encuentran genas que se encuentran formando una población mixta con otros microoren bajo número en muestras en las que las CBS están ausentes. ganismos de la microbiota autóctona o comensal. Por tanto, puede ser necesario incluir medios selectivos y diferenciales junto con los medios de Para preparar una extensión (frotis) sobre la que realizar la tinción, debe enriquecimiento estándar. repartirse una alícuota de la parte más purulenta o sanguinolenta de la muestra sobre la superficie de un portaobjetos limpio, de tal forma que la extensión preEl agar sangre es un buen medio de cultivo general en el que pueden cresente áreas de diferente espesor. En el caso de fluidos organices originariamen- cer una gran diversidad de bacterias y permite, además, poner de manifiesto
CAPÍTULO 50 Tabla 50-1
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
1089
M i c r o o r g a n i s m o s q u e l o r m a n parte de la microbiota n o r m a l de las p e r s o n a s sanas
Localización a n a t ó m i c a Piel
Boca y orolaringe
Microorganismos detectados
Frecuencia relativa de aislamiento
Staphylococcus aureus Staphylococcus apidermidis Eslreplococos del grupo vindans Especies del género Corynebacterium Propionibacterium acnes Malassezia lurlur Especies del género Candida Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estreptococos del grupo viridans Especies del género Enterococcus Especies del género Lactobacillus Especies del género Actinomyces Especies del genero Peptostreptococcus Especies del género Neisseria Haemophilus influenzae Especies del género Haemophilus Especies del género Bacteroides Especies del género Porphyromonas Especies del género Prevotella Especies del género Fusobacterium' Especies del género Veilionella Especies del género Treponema Especies del género Candida
++ ++++ + ++++ ++++ ++++ + + +++ ++ ++++ +
++ +
+ ++
+ + ii
++ ++ ++++ ++++ +++ ++
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estreptococos del grupo viridans Especies del género Neisseria Especies del género Haemophilus
++
Oido externo
Staphylococcus epidermidis Especies del genera Pseudomonas Enterobacteriaceae
++++ +
Conjuntiva
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Especies del género Haemophilus
+
Nariz
++++ +
++ + +
+ ++++
Esófago y estómago
Bacterias supervivientes del tracto respiratorio superior y de los alimentos
Intestino delgado
Especies del género Especies del género Especies del género Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del género
Intestino grueso'
Vagina
Enterococcus Lactobacillus Clostridium
++ +++
++ ++ +++
Mycobacterium
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estreptococos del grupo viridans Especies del género Enterococcus Especies del género Lactobacillus Especies del género Clostridium Especies del género Actinomyces Especies del género Peptostreptococcus Especies del género Pseudomonas Otros no lermentadores Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del género Treponema Especies del género Mycobacterium Especies del género Candida Especies del genero Mycoplasma Ureaplasma urealyticum Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estreptococos del grupo viridans Especies del género Enterococcus Especies del género Lactobacillus Especies del género Clostridium Especies del género Actinomyces
++ + +
+ ++ ++ +++ ++++ +
++++ +
+ ++++ ++++ + + + +/+/+ + + +
++++ ++
(La tabla continua en la pag. siguiente)
1090
SECCIÓN VI
•
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
c Tabla 50-1 M i c r o o r g a n i s m o s q u e f o r m a n parte de la microbiota normal de las p e r s o n a s s a n a s (Continuación) Localización a n a t ó m i c a Microorganismos detectados Frecuencia relativa de aislamiento Vagina
(cont.)
Especies del
género
Propionibacterium
+ + +
Bifidobacterium
acnes
Especies del género Peptostreptococcus Especies del género Neisseria Especies del género Acinetobactcr Enterobactenaceae
Gardnerella
*/-
+ + + + ++
vaginalis
Bacteroidaceae Especies del género Candida Genitales externos y extremo distal de la uretra
Microbiota cutánea (véase más arriba) Especies del género Mycoplasma
Ureaplasma
urealyticum
+/+ + +/+ ++
Especies del género Enterococcus Especies del género Peptoslreplococcus Enterobacteriaceae Baderoidaceae Especies del género Mycobacterium'
"Menos prevalento en individuos desdentados. 'El 95% o mas de los microorganismos son anaerobios obligados. Los protozoos pueden estar présenles en personas que viven en paises subdesarroliados 'Muy frecuente on ol esmegma de varones no circuncidados •+-C+ = casi siempre presente: +++ • usualmente presente +• = presente con Irecuencia: + = présenle ocasionalmente: +/- = presente con muy poca frecuencia. Adaptada de Tramonl EC General or nonspecilic host delense mechanisms En Mandell GL. Douglas RG Jr Bennett JE (eds) Principles and Praclice ol Inlectious Diseases 3' ed Nueva York. Churchill Livingstone. 1990. pag 33. con permiso.
la actividad hemolítica de los microorganismos sobre los hematíes presentes en el mismo. Es posible crear medios selectivos para bacterias grampositivas como el agar CNA, añadiendo sustancias como colistina y ácido nalidixico. o el agar PEA. que contiene alcohol feniletílico. en donde el crecimiento de los bacilos gramnegativos queda inhibido. El calentamiento de la sangre durante la preparación del medio para obtener agar chocolate y la incorporación de suplementos vitamínicos conducen a la creación de un medio enriquecido que contiene hemina (factor X) y NAD (nicotinamida-adenina-dinucleótido; factor
Tabla 50-2
V) disponibles, sustancias cuya presencia es necesaria para poder llevar a cabo el aislamiento de especies del género Haemophilus y otras bacterias delicadas. Los bacilos gramnegativos pueden separarse de los grampositivos utilizando sustancias como la bilis y diversos colorantes que están presentes en ciertos medios como el agar MacConkey. en el que es posible, además, distinguir bacterias lermentadoras y no termentadoras de la lactosa en función del color de las colonias que forman las mismas en dicho medio. En consecuencia, el agar MacConkey tiene carácter selectivo y diferencial. En la
Medios de cultivo r e c o m e n d a d o s para el aislamiento de m i c r o o r g a n i s m o s a partir de diferentes tipos de e s p e c í m e n e s M e d i o s para bacterias aerobias y a n a e r o b i a s facultativas
Espécimen
Fluidos Cefalorraquídeo Abdominal Pleural Sinovial Heridas Hisopo Aspirado Biopsia de tejido
THIO
AS
X X
X
•
•
•
•
•
•
X" X X
ASC
•
BBA
LKV
•
X X
•
•
X X
X
X
X
X X
X
X
ASS X
X X
X
•
X
•
i
•
•
X X
Otros
X
•
•
Vías respiratorias Garganta Esputo Lavados bronquiales Vias genitourinarias Cérvix. vagina Otero, fondo de saco Próstata Uretra
MAC
Medios para bacterias anaerobias*
MTM
MTM
Orina Micción (toma limpia) Aspirado suprapUbico
X
•
•
<
Heces
X
X
•:
EH GN Campy
'Solo para muestras obtenidas a partir de una fuente apropiada y enviadas al laboratorio en un recipiente para anaerobios • El caldo tioglicolalo (THIO) está recomendado sólo para el fluido cerebroespinal procedente de una desviación ventncular y el liquido de diálisis pentoneal ambulatoria continuada. ++Se puede utilizar agar AS, pero es preferible emplear el agar ASS. THIO = caldo lioglucolato: AS = agar sangre MAC = agai MacConkey ASC - agar sangre chocolate; HE = agar entérico Hektoen; GN = calcio de enriquecimiento: BBA = agar Brucella con sangre LKV = agar sangre lacado con vancomicina y canamicma; ASS = agar selectivo para estreptococos: MTM = medio de ThayerMar tin modificado; Campy = medio selectivo para Campylobacter. Adaptada de Washington JA II (ed ) Laboralory Proceduies m Clinical Microbiology. 2" ed. Nueva York. Springer-Verlag, 1985. pp 95-123. con permiso.
CAPÍTULO 50
•
Tabla 50-3 Duración d e la incubación d e los cultivos bacterianos Tipo de incubación antes de considerar el cultivo negativo (días)
Tipo de espécimen Sangre Fluidos Abscesos, heridas Tejidos Vias respiratorias Garganta Esputo Lavado bronquial Vías genitourinarias Cérvix, vagina Útero, tondo de saco Próstata Uretra Orina Material fecal Anaerobios Brucella Actmomyces
1091
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
5-7 2-4 2 2-4' 2 1 2' 2 2-4' 2 2 : 1-3' 4-7 21-30 14-21
'Las placas con medios solidos se eliminan después de 48 horas; los tubos con medios líquidos se conservan durante 4 días "Los cultivos iniciales y tos subcultivos en caldo enriquecido se examinan Iras 18 a 24 horas de incubación para detectar colonias lactosa negativas, si estas no están presentes, los cultivos se consideran negativos para especies de Saímonella y de Shigella Las placas para el aislamiento de Campylobacter deben incubarse durante 72 horas.
incubación en su interior que mantienen la temperatura adecuada. Cada uno de los diferentes sistemas de incubación para anaerobios tiene sus ventajas e inconvenientes pero, en general, todos tienen una eficacia semejante para el aislamiento de bacterias anaerobias de interés clínico Los cultivos bacterianos deben examinarse sistemáticamente tras un período de incubación entre 18 y 24 horas. La excepción a esta norma son los cultivos en anaerobiosis que se examinan a las 48 horas para permitir que las bacterias anaeróbicas que son de crecimiento más lento produzcan colonias que puedan ser detectadas a simple vista. En la Tabla 50-3 se muestran los tiempos de incubación recomendados para los diferentes tipos de cultivos. En general, los medios sólidos se incuban durante 48 horas, mientras que para los medios líquidos la incubación puede prolongarse entre 24 y 48 horas más. Hay que elaborar un informe preliminar tras examinar por primera vez el cultivo, que se va actualizando a medida que se va disponiendo de nueva información adicional. Algunos resultados (p. ej., observación positiva de microorganismos bajo tinción de Gram en muestras de sangre o líquido cefalorraquídeo [LCR]. aislamiento de un microorganismo cuya detección implica que hay que tomar medidas efectivas para controlar la infección) son remitidos al centro sanitario inmediatamente después de ser obtenidos. Los informes finales se redactan una vez que se han completado todas las determinaciones analíticas a partir del microorganismo aislado en cultivo.
BACTERIAS DE IMPORTANCIA MEDICA Cocos grampositivos Staphylococcus
Tabla 50-2 se muestra una guía para seleccionar los medios de cultivo que deben utilizarse para el aislamiento de bacterias a partir de diferentes tipos de muestras clínicas. Los cultivos bacterianos se incuban generalmente a 35 C y se inspeccionan inicialmente tras ser incubados entre 18 y 24 horas. La presencia de una concentración del 5% al 10% de C0 estimula el crecimiento, y puede ser incluso esencial para que se produzca el mismo, en el caso de bacterias como Neisseria gonorrhoeae. Haemophilus influenzae y S. pneumoniae, por lo que esta premisa en las condiciones de incubación debe cumplirse siempre que sea factible. Las excepciones a esta recomendación están representadas por aquellos cultivos crecidos en medios diferenciales y selectivos (p. ej.. el agar XLD [xilosa-lisina-desoxicolato] o agar entérico Hektoen [EH]). en los que el hecho que permite distinguir entre distintos tipos de colonias es un cambio en el pH, que puede verse afectado por la presencia de C0 . ?
2
Para la recuperación de bacterias anaerobias, los medios de cultivo deben colocarse, una vez inoculados, en un ambiente anaeróbico lo más rápidamente posible. Hay disponibles varios tipos de sistemas para el cultivo de anaerobios. Uno de ellos es la jarra de anaerobios, en la que se añade un pequeño volumen de agua en el interior de un sobre que contiene unos compuestos químicos que generan C0 y H al entrar en contacto con el agua. El O. que queda en el interior de la jarra en el momento de ser cerrada es convertido en agua al combinarse con el H, por la acción catalítica del metal paladio que se encuentra recubriendo unas lentejas de aluminio, que se hallan en el interior de un receptáculo adosado a la cara interna de la tapa de la jarra. Una modificación de este sistema consiste en una bolsa de plástico transparente, diseñada para albergar una sola placa de agar nutritivo, que contiene su propio generador de K, y catalizador de paladio individuales. 2
Características. Los estafilococos son bacterias de morfología esférica, catalasa positivas, que en los frotis teñidos aparecen en grupos que semejan racimos de uvas (Lámina 50-2) Crecen bien en cualquier medio de cultivo que contenga peptona en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. pueden producir hemolisis en agar con sangre de diferentes especies animales y formar pigmentos de color amarillo o anaranjado cuando crecen en medios sólidos. El crecimiento de los estafilococos se observa fácilmente en placas de agar sangre o en diferentes tipos de medios nutritivos líquidos. Un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus aureus contiene entre un 7.5% y un 10% de NaCI y manitol. Las pruebas que permiten distinguir los estafilococos de los micrococos (que generalmente son considerados como no patógenos) se recogen en la Tabla 50-4 (Kloos. 1999). S. aureus se distingue de otras especies del género por su capacidad para producir coagulasa, enzima que es capaz de coagular el plasma sanguíneo. Se han identificado dos formas antigénicamente distintas de la coagulasa producida por la bactena: una de las formas que se encuentra ligada a la pared celular, recibe el nombre de factor de agregación y se detecta mediante la prueba de la coagulasa en portaobjetos, mientras que la otra es la forma libre o no ligada y se detecla mediante la prueba de la coagulasa en tubo.
?
Otra posibilidad para el cultivo en condiciones anaeróbicas está representada por la cámara de anaerobios, que consiste en una cabina grande de plástico transparente, cerrada herméticamente, y en cuyo interior se introduce una mezcla gaseosa carente de oxígeno, compuesta por nitrógeno, hidrógeno y dióxido de carbono. Todo el material que ha de ser manipulado (muestras, placas, tubos) se introduce o se extrae de la cámara a través de un cierre de intercambio gaseoso. La atmóslera anaeróbica se mantiene en el interior de la cámara gracias al hidrógeno de la mezcla gaseosa y a la acción catalítica de las partículas de paladio. Todas las manipulaciones en el interior de la cámara se realizan a través de unos guantes de neopreno que están sellados a la pared frontal de la cámara o. en el caso de los sistemas "sin guantes'. a través de orificios en donde están acopladas unas mangas de material plástico que se ciñen ajustadamente a los antebrazos. Las cámaras poseen estulas de
Manifestaciones clínicas y patogenia. S. aureus puede encontrarse formando parte de la flora autóctona de la piel, ojos, vías respiratorias superiores, tracto gastrointestinal, uretra y. con menor frecuencia, vagina En consecuencia, la infección puede tener un origen endógeno o exógeno. Los factores que juegan un papel importante en el desarrollo de infecciones por S. aureus son las hendas y discontinuidades en la superficie de la piel y mucosas, la presencia de
Tabla 50-4 P r u e b a s para diferenciar los estafilococos d e los micrococos Prueba Crecimiento en anaerobiosis en medio con glucosa Susceptibilidad a la lisostafina Producción de ácidos en aerobiosis a partir de glicerol Oxidasa modificada para la detección de citocromo c Susceptibilidad a la bacitracina
Estafilococos
+ S
Micrococos
-
R
+ +
R
S
1092
SECCIÓN VI
•
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
7. Otras, p. ej.. abscesos viscerales imraabdominales: bazo, hígado, páncreas Figura 50-1. Secuencia patogénica de la infección por Staphylococcus aureus. (De Cohen JO [ed.]: The Staphylococci. Copyright © 1972. reproducida por John Wiley & Sons. Inc.) cuerpos extraños e implantes, una enfermedad vinca previa, haber sido sometido con anterioridad a una terapia antimicrobiana y padecer enfermedades subyacentes con defectos en la inmunidad celular o humoral. Las infecciones causadas por S. aureus pueden afectar a una gran variedad de órganos y sistemas (Fig. 50-1). Entre las más comunes están aquellas que afectan a la piel y sus discontinuidades, tales como el impétigo. la foliculitis, la mastitis y las infecciones de heridas quirúrgicas S. aureus es una de las causas principales de bacteriemia en pacientes hospitalizados y puede provocar endocarditis, particularmente en personas que padecen valvulopatías del lado izquierdo y en consumidores de drogas por vía intravenosa. Esta bacteria también es la principal responsable de abscesos epidurales y de flebitis supurativa intracraneal, y puede recuperarse a partir de abscesos cerebrales que aparecen tras un traumatismo. La meningitis causada por S. aureus es poco frecuente y generalmente aparece como consecuencia de un traumatismo cefálico o un procedimiento neuroquirúrgico. S. aureus es responsable de muchos casos de osteomielitis, es la causa más común de artritis séptica en niños prepúberes y ocasionalmente provoca artritis séptica en adultos. En las zonas tropicales puede causar abscesos profundos espontáneos en los músculos que afectan, predominantemente, a personas desnutridas que padecen una infección parasitaria concomitante (Chiedozi, 1979). Asimismo, S. aureus es una causa frecuente de neumonía comunitaria, generalmente asociada a la aspiración de bacterias endógenas de la nasofaringe. Entre los factores que predisponen se encuentran la infección por el virus del sarampión o de la influenza A, la fibrosis quistica y un
estado de mmunodeficiencia. Sin embargo, la neumonía por S. aureus en la población general es poco frecuente. Por último, entre las intecciones en el tracto urinario causadas por esta bacteria se encuentran la pielonefritis y los abscesos parenquimatosos y perirrenales. Diversos factores juegan un papel relevante en la virulencia de S. aureus. Si está presente, la cápsula tiene propiedades antilagocitanas. Los peptidoglucanos de la pared celular tienen actividad endotóxica y estimulan la liberación de atocinas por los macrófagos, la activación del complemento y la agregación de las plaquetas. La proteína A. una sustancia inmunológicamenle activa que se encuentra formando parte de la estructura de la pared celular, tiene propiedades antilagocitarias que dependen de su capacidad para interaccionar con el fragmento Fe de la molécula de las mmunoglobulmas (lg) G. Otras proteínas de superficie denominadas componentes de la superficie microbiana son capaces de reconocer ciertas moléculas adhesivas de la matriz extracelular (MSCRAMM) y pueden jugar un papel importante en la capacidad de los estafilococos para colonizar los tejidos del hospedador. S. aureus produce numerosas toxinas. La exotoxma TSST-1 es responsable del síndrome del shock tóxico y las enterotoxinas (de la A a la E) causan intoxicaciones alimentarías. Las toxinas exfoliantes, las toxinas epidermoliticas A y B, causan el enrojecimiento y desprendimiento de la piel que se observan en el denominado síndrome de la piel escaldada. También producen varias enzimas hidroliticas (proteasa. lipasa y hialuronidasa) que destruyen los tejidos del hospedador, lo que probablemente facilita la diseminación de la bacteria y el avance de la infección.
CAPÍTULO 50
•
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Las enfermedades directamente relacionadas con la actividad de toxinas producidas por S. aureus son el síndrome de la piel escaldada, las intoxicaciones alimentarias y el síndrome del shock tóxico. El síndrome de la piel escaldada se da en bebés y en niños muy pequeños infectados por una cepa de S, aureus productora de toxinas exfoliativas. La enfermedad comienza de forma brusca con eritema cutáneo, que en dos o tres días es seguido por la acumulación de líquido por debajo de la piel que provoca su separación, por lo que cualquier fricción leve puede hacer que se desprendan grandes colgajos o capas de la piel, dejando áreas en carne viva que eventualmente pueden cicatrizar completamente. La intoxicación alimentana estafilococo que cursa con nauseas, vómitos, retortijones abdominales y diarrea aparece entre una y seis horas después de haber ingerido alimentos contaminados con la enterotoxina estafilocócica preformada. El síndrome del shock tóxico es una enfermedad multisislémica que afecta a aquellos individuos que no tienen anticuerpos contra la TSST-1 y han sido colonizados por cepas de S. aureus productoras de la toxina TSST-1 o. mas raramente, de enterotoxinas B o C. La enfermedad es más frecuente en mujeres de entre 15 y 25 años que utilizan tampones durante la menstruación, aunque también puede darse en otras personas, sin que exista asociación alguna con la regla, como es el caso de mujeres durante el período posparto, individuos que tienen una herida quirúrgica o algún otro tipo de infección focal, o personas que han sufrido una intervención quirúrgica en la nariz o senos nasales. El síndrome del shock tóxico comienza de forma súbita con fiebre, mialgias, vómitos y diarrea: a estos síntomas les sigue hipotensión, shock hipovolémico y una erupción cutánea eritematosa que afecta, sobre todo, a las palmas de las manos y a las plantas de los pies y que termina por producir una descamación de la piel al cabo de una a dos semanas. El diagnóstico es clínico, no siendo necesario llevar a cabo el aislamiento de S. aureus para confirmarlo. Por lo general la persona afectada se recupera totalmente, aunque puede experimentar episodios repetidos.
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también el polisacárido capsular, lo que aumenta la capacidad para detectar las cepas de S aureus resistentes a meticilma (oxacílina). S. saprophyticus y S. sciuri son las otras dos especies del genero que pueden dar positiva la prueba de aglutinación en látex. Se han identificado muchas especies coagulasa negativas de estafilococos; sin embargo, con la excepción de S. saprophyticus. que es una especie resistente a la novobiocina. la identificación de estos aislamientos hasta el nivel de especie no es de utilidad práctica ni está clínicamente recomendada. Si es necesario, puede intentarse llevar a cabo dicha identificación utilizando métodos comerciales que tienen una fiabilidad que oscila entre el 70% y más del 90%. Alternativamente, los aislados pueden enviarse a un laboratorio de referencia con capacidad para realizar ensayos bioquímicos estándar. Con una finalidad epidemiológica, para localizar el origen de una infección o intoxicación alimentaria, los estafilococos pueden identificarse a nivel de cepa en base a diferentes parámetros, como la susceptibilidad a diferentes bacleriófagos. los perfiles plasmídicos y de ácidos grasos celulares, los patrones electroforéticos de enzimas multilocus o el tipado cromosómico molecular (electroforesis en campo pulsado y en campo pulsado reverso). Por lo general, estas pruebas sólo pueden llevarse a cabo en los laboratorios de referencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. Casi todos los estafilococos son resistentes a la penicilina. Dado que esta resistencia es debida a una |i-laclamasa inducibie. cuya síntesis esta codificada por un plásmido. la sensibilidad a la penicilina debe confirmarse tras un periodo de inducción en un medio que contenga un agente |i-lactámico.
La resistencia a las penicilinas resistentes a penicilmasas (meticilina, oxacílina. nafeilina) se detecta en un 70% a 80% de estafilococos coagulasa negativos y hasta en un 40% de cepas de S. aureus. La resistencia a este grupo de agentes antimicrobianos depende del gen mecA. que codifica la síntesis de una proteína que liga penicilina anormal, la PBP2a. Típicamente, la resistencia es heteLas infecciones causadas por las especies coagulasa negativas de Staphyrogénea, lo que significa que sólo unas pocas células (1 de cada W a 10") lococcus tienen lugar como consecuencia de la implantación de válvulas carexpresan la resistencia. Debido a este hecho, nay que seguir un protocolo espediacas, prótesis articulares y desviaciones ventriculares. S. epidermidis es la cífico para garantizar la detección: para el método de difusión en placa debe utiespecie que está implicada con mayor frecuencia en este tipo de infecciones. lizarse un disco impregnado con 1 itg de oxacílina; para el método de microdiluS. saprophyticus es un importante agente causal de bacteriuria, particularcíón debe utilizarse caldo de Mueller-Hinton con cationes y un 2% de NaCI; tanto mente en mujeres jóvenes sexualmente activas. las placas de agar como las de microtitulación deben incubarse durante 24 horas a 35 C. Para determinar la resistencia a la oxacílina. se inoculan en vanos punDiagnóstico de laboratorio. La observación microscópica de cocos típitos con un hisopo de algodón placas de agar Mueller-Hinton que contengan un camente redondeados, grampositivos y que se agrupan formando racimos en 4% de NaCI y 6 itg/ml de oxacílina, que se incuban seguidamente durante los frotis realizados a partir de muestras tomadas de lesiones cerradas o no 24 horas. Se han desarrollado algunos procedimientos para detectar rápidamendrenadas, o del líquido de un hemocultivo positivo, es indicativa de la existe la resistencia a la oxacílina Entre éstos se encuentran la ampliación de ácitencia de una infección estafilocócica. dos nucleicos y la hibridación con sondas especificas para el gen mecA. un enS. aureus produce coagulasa. una enzima que liga el fibrinógeno del plasma sayo de aglutinación en látex para la PBP2a y un ensayo de fluorescencia para sanguíneo, provoca que las bacterias aglutinen o que el plasma coagule; práctilas bacterias crecidas en presencia de oxacílina. Aunque los estafilococos resiscamente ninguna otra especie del género Staphylococcus presenta esta enzima. tentes a la oxacílina pueden parecer susceptibles a las cefalosporinas, también Alrededor del 95% de aislamientos de S. aureus se identifican mediante la prueba de la coagulasa en portaobjetos, que detecta la enzima ligada a la pared celu- deben considerarse como resistentes a estos antibióticos, asi como al imipenem. lar bacteriana (factor de coagulación), y prácticamente todas las cepas se caracLa resistencia a la vancomicina ha sido detectada sólo muy raramente en los terizan mediante la prueba en tubo, que detecta la coagulasa extracelular. estafilococos. Las pocas cepas resistentes aisladas tenían concentraciones =
La prueba en portaobjetos se lleva a cabo mezclando una emulsión densa de microorganismos con plasma sanguíneo en la supedicie de un portaobjetos de vidrio. La prueba es positiva si se observa aglutinación en un plazo no superior a 30 segundos. S. lugdenensis y S. schleileri son las otras dos especies que pueden dar positiva la prueba de la coagulasa con esta técnica. Para realizar la prueba en tubo, se transfieren varias colonias a un tubo con plasma que se ncuba a 35 C durante 4 horas, observándose seguidamente la formación del coágulo. Si éste no se ha formado al cabo del tiempo indicado, el tubo se reincuba a temperatura ambiente y se vuelve a examinar tras un período total de 20 horas. La prueba debe examinarse después de cuatro horas, ya que la mayor parte de aislados de S. aureus coagulan el plasma en este intervalo de tiempo y porque algunas cepas producen una actividad fibrinohtica que puede disolver el coágulo, pudiendo dar una reacción falsamente negativa si la prueba se lee a las 20 horas solamente. S. intermedius y S. hytcus también dan positiva la prueba de la coagulasa con el método en tubo, aunque estas especies son patógenos animales y muy raramente se encuentran presentes en especímenes humanos. Hay disponibles algunos ensayos comerciales de aglutinación en látex que petmiten llevar a cabo una identificación rápida de S aureus. Estos ensayos detectan la existencia de proteina A y del lactor de coagulación, y algunos
mínimas inhibitorias (CMI) en el rango intermedio (de 8 ng'ml a 16 iig/ml). Los
Tabla 50-5 Clasificación d e e s t r e p t o c o c o s y enterococos Hemolisis U
«oy
Grupo de Lancefield A B C
Especies
S. pyogenes S. agalactiae S dysagalactiae subesp equisimilus Enterococcus spp D Vanantes de colonias pequeñas Grupo anginosus de los grupos A. C. F. G o inclasificables D Enterococcus spp D S bovis Variantes de colonias pequeñas Grupo anginosus de los grupos A. C. F. G o inclasificables Ninguno S pneumoniae Ninguno Estreptococos v
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SECCIÓN V!
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
organismos con unos valores de CMI elevados para la vancomícina deben enviarse a un laboratorio de referencia para su confirmación, y los casos confirmados deben notificarse al Cenrer lor Disease Control and Prevention (CDC).
Streptococcus y Enterococcus Características. Los estreptococos son cocos catalasa negativos, grampositivos. esféricos, ovoideos o lanceolados, dispuestos a menudo formando parejas o cadenas. Son anaerobios facultativos. Algunas cepas necesitan CO;, para su aislamiento inicial, pero pueden perder este requerimiento al ser subcultivadas posteriormente. Los estreptococos pueden ser clasificados en categorías muy amplias en función del tipo de hemolisis que producen en agar sangre (Tabla 50-5). Aquellas cepas que lisan totalmente los hematíes alrededor de las colonias que forman en el medio se denominan |5-hemolíticos, y pueden ser clasificadas subsiguientemente en algunos de los grupos de Lancefield, atendiendo a los componentes (carbohidratos y proteínas) antigénicamente reactivos presentes en su superficie celular. Los miembros más importantes de este grupo son Streptococcus pyogenes (grupo A) y Streptococcus agalactiae (grupo B). Aquellas especies que causan una hemolisis parcial (produciendo un halo verdoso alrededor de la colonia) reciben la denominación de «-herrtolíticas. Un miembro importante de este grupo es S. pneumoniae. Los estreptococos que no lisan los hematíes son los y-hemolíticos. Dentro de este grupo la especie más destacable es S. bovis. Algunas cepas de S. agalactiae también pueden ser y-hemolíticas. La mayor parte de las especies a- y y-hemolíticas son denominadas globalmente estreptococos del grupo "vindans", que incluye S. mutans. S. sanguis, S. mitis. S. salivariusy S. anginosus. El grupo de estreptococos previamente denominados como variantes nutricionales (dependientes de piridoxal, vitamina B o tiol) ha sido incluido ahora en el género Abiotrophia. 6
Los enterococos, previamente designados como estreptococos del grupo D debido a que los ácidos teicoicos de su pared celular reaccionaban con antisueros frente a las cepas típicas del grupo D, son lo suficientemente diferentes de los otros miembros del género Streptococcus como para ser incluidos dentro de un género independiente. Estos microorganismos son cocos grampositivos, anaerobios facultativos, que se presentan aislados, en parejas, o formando cortas cadenas. La mayor parte de enterococos son a- y y-hemoliticos. aunque algunas cepas pueden exhibir |5-hemólisis en agar sangre. Otros géneros de cocos grampositivos. catalasa negativos, que pueden aislarse a partir de especímenes clínicos son Leuconostoc. Pediococcus. Stomatococcus, Aerococcus y Lactococcus spp. Se considera que la virulencia potencial de estos microorganismos es baja y, por lo general, sólo son patógenos en hospedadores inmunocomprometidos. Manifestaciones clínicas y patogenia. Una de las manifestaciones clínicas más comúnmente asociada a los estreptococos del grupo A es la faringitis. La faringitis puede venir acompañada por la escarlatina, que se manifiesta en forma de un exantema puntiforme sobre un eritema difuso que por lo general aparece ¡nicialmente en el cuello o parte superior del pecho, posteriormente adquiere carácter generalizado y finalmente acaba con descamación de la piel. Entre las infecciones de la piel causadas por los estreptococos del grupo A se incluyen celulitis, erisipela y pioderma. La fiebre reumática aguda, que se caracteriza por manifestaciones como carditis, poliartritis, eritema marginado, corea y nodulos subcutáneos, puede aparecer entre una y cinco semanas después de haber sufrido una faringitis causada por un estreptococo del grupo A. La glomerulonefritis aguda puede desarrollarse entre 10 días y tres semanas después de padecer faringitis o pioderma provocada por estreptococos del grupo A. A finales de los ochenta comenzaron a detectarse, cada vez con mayor frecuencia, una serie de síndromes clínicos graves causados por estreptococos del grupo A, entre los que cabe destacar la fascitis necrotizante, la miositis, la escarlatina maligna, la bacteriemia y el síndrome del shock tóxico. Estos síndromes han sido asociados con porcentajes de morbilidad y mortalidad del 30% o incluso superiores. Las causas de este incremento no están claramente determinadas, aunque pudieran estar relacionadas con cambios en la prevalencia de microorganismos con «potencial de virulencia» incrementado (Kaplan. 1996). Asociados a las células de S. pyogenes existen una gran cantidad de componentes estructurales y enzimáticos que actúan como factores de virulencia. Uno de los más importantes es la proteína M de la pared celular, que tiene actividad antifagocitaria. Los anticuerpos generados frente a este antígeno confieren inmunidad específica de tipo permanente: sin embargo, debido a que existen más de 60 tipos antigénicamente diferentes de la proteina M, es posible
sufrir una infección por un estreptococo del grupo A que posea una proteina M frente a la cual no haya generado anticuerpos específicos el hospedador afectado. Otro componente importante de la pared celular es el ácido lipoteicoico, que actúa como mediador en la adhesión de las bacterias a las células del epitelio respiratorio. S. pyogenes sintetiza también alrededor de unos 20 productos extracelulares, que incluyen enzimas (estreptolisinas, hialuronidasa, estreptocinasa, desoxirribonucleasas [ADNsasj y nicotinamina-adeníodinucleotidasa ¡NADasaj) y toxinas eritrogenéticas. La estreptolisina O es una enzima oxígeno-lábil con carácter antigénico que produce hemolisis en agar sangre en la zona subyacente a la superficie del medio de cultivo; la estreptolisina S es una enzima estable frente al oxigeno, no inmunogenia, y que produce hemolisis en la superficie del agar sangre. Ninguna de las dos estreptolisinas parece tener un papel en la patogenia de las infecciones en el hombre. La estreptocinasa desarrolla una actividad fibrinolitica transformando el plasminógeno en plasmina, mientras que la hialuronidasa puede favorecer la diseminación del microorganismo a través del tejido conectivo. El papel de la ADNsa y la NADasa en la patogenia es desconocido. Las toxinas pirógenas (eritrogénicas), de las que se conocen tres serotipos (A,B, y C), son producidas por cepas de S. pyogenes que contienen un bacteriófago lisogenizado. Su carácter pirógeno es debido a su acción directa a nivel del hipotálamo. La patogenia de la fiebre reumática aguda no está bien comprendida todavía. Ciertos tipos antígénicos de la proteina M pueden tener carácter reumatógeno. La presencia de complejos de inmunoglobulinas y el componente C3 del complemento a lo largo del sarcolema de las miofibrillas cardíacas en individuos aquejados de miocarditis reumática sugiere que la enfermedad es consecuencia de la formación de anticuerpos frente al antígeno M de la pared celular de los estreptococos, que tienen reactividad cruzada con componentes de los tejidos del corazón. En este contexto, se ha identificado un antigeno de S. pyogenes que comparte epítopos comunes con la proteina M, aunque es antigénicamente distinto de ésta, y que exhibe reactividad cruzada con moléculas de los tejidos cardíacos (Barnett, 1990). El daño renal en la glomerulonefritis aguda está causado por el depósito de inmunocomplejos (formados por antígenos estreptocócicos y anticuerpos del hospedador frente a los mismos) circulantes en los glomérulos renales y por la subsiguiente activación del complemento. También pueden estar implicados procesos de inmunidad celular frente a una membrana basal del glomérulo alterada, así como la activación del complemento por la via alternativa. Las infecciones más frecuentes causadas por los estreptococos del grupo B son la sepsis neonatal, la neumonía y la meningitis. La colonización del tracto genital materno se asocia con la colonización del recién nacido y el riesgo de enfermedad neonatal, con infecciones que aparecen tempranamente (en los días inmediatamente siguientes al parto) y un poco más tardíamente (después de la primera semana de edad). Con objeto de reducir la incidencia de las infecciones neonatales, el CDC de Atlanta ha publicado una guia específica que permite la identificación precoz y el tratamiento preventivo de mujeres colonizadas por estreptococos del grupo B, asi como la identificación y tratamiento de neonatos con riesgo de desarrollar enfermedad (Schuchat, 1996). Las infecciones por estreptococos del grupo B en adultos incluyen la endometritis de posparto, infecciones de las vías urinarias, bacteriemia, infecciones de la piel y tejidos blandos, neumonía, endocarditis, meningitis, artritis y osteomielitis. Los estreptococos de los grupos C y G son semejantes a S. pyogenes en el sentido de que pueden causar un amplio abanico de infecciones, incluyendo bacteriemia, endocarditis, meningitis, artritis e infecciones de la piel y las vías respiratorias. La faringitis causada por estos estreptococos es similar a la que provocan las bacterias del grupo A, excepto por que no acarrea secuelas no supurativas del tipo de las fiebres reumáticas. S. pneumoniae causa neumonía, meningitis (especialmente en niños pequeños y ancianos), bacteriemia espontánea (en personas que carecen del bazo), otitis, sinusitis y peritonitis espontánea. Esta bacteria forma parte de la microbiota normal que se encuentra en las vías respiratorias superiores del 25% al 50% de niños en edad preescolar, y en cerca del 20% de adultos, individuos a los que se denomina portadores (Hendley, 1975). La diseminación del microorganismo se ve favorecida por las infecciones del tracto respiratorio superior y por la masificación en los entornos humanos. La neumonía puede desarrollarse cuando las defensas inmunitarias del huésped están debilitadas. La mayor parte de los casos tienen un origen endógeno y son consecuencia de la aspiración de secreciones orales que contienen microbiota normal, incluyendo a S. pneumoniae. La
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Figura 50-2. Esquema para la identificación presuntiva de las especies |i-hemoliticas del género Streptococcus (+ = resultado positivo: - = resultado negativo; S = susceptibilidad; R = resistencia). (Reproducida de Woods GL, Gutiérrez Y: Diagnostic pathology ol infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso dei editor.) transmisión de persona a persona durante las epidemias tiene lugar por inhalación de gotitas de humedad en aerosoles. El pnncipal (actor de virulencia en S. pneumoniae es el carácter fuertemente antifagocitario del polisacando capsular, por lo que aquellas cepas que poseen una gruesa cápsula mucosa, como es el caso de las células del tipo 3, son particularmente virulentas. En la actualidad hay disponibles vacunas diseñadas para ofrecer protección frente a la infección por neumococos pertenecientes a los grupos predominantes atendiendo al antígeno capsular de los mismos. Asimismo, se dispone de una vacuna para ser administrada en bebés y niños que ofrece protección frente a la enfermedad invasiva por neumococo. La endocarditis bacteriana es la infección más común causada por los estreptococos del grupo viridans; otras patologías incluyen abscesos en el cerebro o en el hígado, bactenemia y caries dental. La bacteriemia por S. bows ha sido asociada con procesos tumorales en el tracto gastrointestinal.
Los enterococos no son muy patógenos; sin embargo, estos microorganismos son una causa muy frecuente de infecciones de las vías urinarias en personas hospitalizadas. También pueden provocar endocarditis, bacteriemia e infecciones de las heridas. Diagnóstico de laboratorio. Los estreptococos crecen bien en agar sangre o agar chocolate, aunque el agar sangre es preferible, ya que permite determinar las caracteristicas hemolíticas del microorganismo. Cuando se siembra a partir de muestras anorrectales de mujeres embarazadas tomadas con hisopo, con objeto de aislar específicamente estreptococos del grupo B, las muestras deben ser inoculadas inicialmente en un medio liquido selectivo, como el caldo LIM (caldo de enriquecimiento para S. agalactiae basado en el medio de ToddHewitt modificado), para llevar a cabo un enriquecimiento de estos microorganismos (Schuchat, 1996). Las pruebas que deben utilizarse en el laboratono de microbiología clínica para identificar presuntivamente las especies (3-hemolíticas
Figura 50-3. Esquema para la identificación presuntiva de las especies u-nemoliticas y -/-hemoliticas de los géneros Streptococcus y Enterococcus (+ = resultado positivo; - = resultado negativo). (Reproducida de Woods GL. Gutiérrez Y Diagnostic pathology of infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso del editor.)
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SECCIÓN VI
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
del género Streptococcus se muestran en la Figura 50-2. Más del 99°c de aislamientos de estreptococos del grupo A son susceptibles a la bacitracina. aunque un porcentaje muy pequeño de cepas del grupo B y entre un 10% y un 20% de aislamientos de los grupos C y G también son sensibles a esta sustancia. Por tanto, los resultados de la prueba de la susceptibilidad a la bacitracina sólo permiten llevar a cabo una identificación presuntiva. Un aislamiento puede ser identificado tentativamente como un estreptococo del grupo A en base a la prueba de la hidrólisis de la t-pirrolidonil-[i-naftilamída (lest PYR: PYRasa) (Wellstood, 1987). Todas las cepas del grupo A y más del 99% de aislamientos de Enterocoecus dan positiva esta prueba. La identificación de un estreptococo del grupo A se confirma mediante serotipado con un ensayo de aglutinación en látex, o por hibridación con sondas de ácidos nucleicos especificas.
nias a-hemolilicas, que son mucosas y planas con una depresión central, sugieren la presencia de S. pneumoniae, por lo que debe ensayarse la susceptibilidad de los microorganismos presentes en las mismas al clorhidrato de etilhidroxicupreína, compuesto al que comunmente se denomina optoquina (disco P); S. pneumoniae es sensible a la optoquina, mientras que otros estreptococos (/-hemolíticos son resistentes Los presuntos aislamientos de S. pneumoniae realizados a parlir de localizaciones estériles del cuerpo pueden ser identificados más rápidamente por medio de ensayos de aglutinación en látex que detectan el polisacando capsular, o mediante sondas quimioluminiscentes de ADN
Una cepa que sea |5-hemcJitica e hidrolice el hipuralo o dé una reacción positiva en la prueba del AMP cíclico (cAMP) puede identificarse presuntivamente como un estreptococo del grupo B. Un aislamiento con estas características, obtenido a partir de una muestra procedente de una localización anatómica habitualmente estéril, debe identificarse mediante serotipado (utilizando aglutinación en látex o coaglutinación) o con una sonda quimioluminiscente de ADN. Las sondas de ADN también pueden ser empleadas para identificar estreptococos del grupo B crecidos en medio LIM u otros caldos de cultivo selectivos. Los aislamientos de estreptococos |t-hemolíticos de los grupos C, D, F y G pueden ser identificados mediante serotipado con ensayos de aglutinación en látex.
Los estreptococos «-hemolíticos resistentes a la optoquina. y que dan negativa la prueba de la PYRasa. y los estreptococos PYRasa negativos, incapaces de crecer en presencia de un 6.5% de NaCI, se clasifican como estreptococos no hemolíticos (viridans). Dentro del grupo viridans. la identificación de las especies individuales se lleva a cabo mediante pruebas bioquímicas convencionales (Coykendall, 1989). También hay disponibles sistemas comerciales para la identificación de estos microorganismos.
En el caso de las colonias (/.-hemoliticas que no corresponden a S. pneumoniae. asi como de las y-hemoliticas. debe realizarse la prueba de la hidrólisis del L-pirroltdonil-Li-naftilamida (prueba de la PYRasa); los enterococos son PYRasa positivos mientras que los estreptococos del grupo vindans dan Los estreptococos del grupo A pueden detectarse directamente en las muesnegativa esta prueba. Además, todos los enterococos pueden crecer en pretras tomadas directamente de la garganta con un hisopo utilizando métodos sencia de una concentración del 6,5% de NaCI, mientras que los estreptococomerciales diseñados para proporcionar resultados rápidamente. Estos métodos cos viridans son incapaces de hacerlo en esas condiciones. Los enterococos son muy específicos, pero dada su baja sensibilidad, que, según diversos estuhidrolizan la esculina en presencia de bilis (lo que provoca un ennegrecidios, varía entre el 31% y el 95% (Carroll, 1996: Wegner. 1992), un resultado miento del medio asociado al crecimiento bacteriano), aunque hasta un 10% negativo obtenido con los mismos debe ser reconfirmado mediante cultivo. Las de cepas de estreptococos vindans también son esculina positivos Para llepruebas serológicas encaminadas a detectar anticuerpos frente a la estreptoJisina O y la AONsa B en muestras de suero obtenidas durante las fases aguda y de var a cabo la identificación de los enterococos a nivel de especie son necesarias pruebas bioquímicas adicionales (Facklam, 1989a). La mayor parte de convalecencia se emplean fundamentalmente para diagnosticar fiebres reumátilos aislamientos clínicos corresponden a E. laecalis. cas o glomerulonefritis aguda tras una infección por estreptococos del grupo A.
Hay disponibles pruebas de aglutinación en látex para la detección directa de estreptococos del grupo B (asi como de S. pneumoniae. algunos serotipos de Neissena meningitidis. Escherichia cotí y Haemophilus influenzae serotjpo b) en muestras de LCR. suero y orina. Sin embargo, la Food and Drug Administration (FDA) ha publicado un informe alertando sobre la posibilidad de obtener resultados tanto lalsos positivos como falsos negativos cuando se utilizan este tipo de pruebas para detectar la presencia de estreptococos del grupo B en muestras de onna (FDA. 1997). Además, los datos de algunos estudios indican que la sensibilidad de estos ensayos en el caso de estreptococos del grupo B, S. pneumoniae. N. meningitidis. E. coliy H. influenzae es menor o igual que la que posee la tinción de Gram, excepto en los casos de meningitis en los que ya ha comenzado a aplicarse el tratamiento con antibióticos. Asimismo, otros estudios han mostrado que los resultados de estas pruebas tienen poca influencia en el proceso global de atención y cuidado del paciente (Bhisitkul. 1997; Granoff. 1986; Maxson. 1994; Perkins. 1995). Por estas razones, y porque las pruebas para la detección rápida de antígenos bacterianos son mucho más caras y requieren más tiempo y esfuerzo que la tinción de Gram, muchos laboratorios han prescindido de su uso o lo han limitado de forma estricta. Las pruebas utilizadas para la identificación presuntiva de los estreptococos «- y y-hemolíticos y los enterococos se muestran en la Figura 50-3. Las colo-
Es importante llevar a cabo la diferenciación entre los enterococos que han adquirido resistencia a la vancomicina y las especies de los géneros Leuconostoc y Pediococcus intrínsecamente resistentes a este antibiótico. Las características que son de utilidad para cumplir este objetivo se muestran en la Tabla 50-6 (revisado por Facklam, 1989b). Las especies del género Abiotrophia no crecen en ausencia de piridoxal. A menudo se identifican inicialmente por el tenómeno del satelitismo, ya que forman colonias alrededor de otra de S. aureus. Las características diferenciales de las especies A. defectiva y A. adiacens han sido descritas por otros autores (Ruoff. 1990). Sensibilidad a los antimicrobianos. Los antibiogramas de los estreptococos de los grupos A, B. C y G son predecibles. ya que todos estos microorganismos son sensibles a la penicilina: por tanto, los ensayos habituales para determinar la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos son mnecesanos salvo que no pueda utilizarse la penicilina en el caso de personas alérgicas a este antibiótico. Debido a que las cepas de S. pneumoniae con un grado medio (CMI entre 0.1 y 1.0 mgl) o elevado (CMI >2 mg/l) de resistencia a la penicilina están diseminadas por todo el mundo, los aislamientos de esta especie deben analizarse para determinar su susceptibilidad al antibiótico utilizando el método de difusión en medio sólido con discos que contengan 1 pg de oxacilina. Aquellos aislamientos que no muestren susceptibilidad por este método deben ser reevaluados utilizando la técnica de la macrodilución o de la microdilución en caldo, utilizando medio de Mueller-Hinlon enriquecido con sangre de caballo lisada. o 2
CAPÍTUIO 50
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medíante la prueba E para determinar su CMI para la penicilina. Asimismo, pueden aparecer resistencias trente a las cefatosporinas de tercera generación; en consecuencia, también debe determinarse la susceptibilidad de los aislamientos frente a estos agentes antimicrobianos. Los ensayos de susceptibilidad deben realizarse con las cepas de estreptococos no hemoliticos (viridans) aisladas de localizaciones estériles del cuerpo, debido a que en estos casos puede existir resistencia a la penicilina. Las especies del género Enterococcus también deben ser analizadas para identificar, en principio, resistencia elevada a penicilina o ampicilina. estreptomicina y gentamicina. y resistencia a la vancomicina (Tenover. 1993).
ción respiratoria. Aunque pueden producirse infecciones de otras partes del organismo por C. diphteriae. las más frecuentemente observadas en EE.UU.son las de la piel. La vía de transmisión de C. diphteriae es por inhalación de gotitas de humedad expulsadas de las vías respiralonas supenores o por contacto con un loco de infección cutánea. Debido a que el resto de corinebacterias forman parte de la microbiota normal presente en la piel y las mucosas, es difícil establecer su papel etiológico. El significado clínico de la detección de una de estas bacterias aumenta si el organismo observado en frotis teñidos por el método de Gram aparece acompañado por leucocitos, si el aislamiento ha tenido lugar a partir de una localización estenl o si ha sido recuperado a partir de muestras múltiples. Corynebactenum jeikeium se ha asociado de forma clara con infecciones que aparecen tras el implante de prótesis (p. ej., válvulas cardíacas. LCR y articulaciones), se ha identificado como responsable de cuadros de endocarditis bacteriana subaguda y ha estado implicado en una gran variedad de infecciones oportunistas. Corynebacterium ureolyticum se ha relacionado con infecciones de las vías urinarias, asi como con bacteriemia. endocarditis e infecciones de las hendas.
Bacilos grampositivos Corynebacterium y Arcanobacterium Características. Las corinebacterias o bacilos "difteroides". como son a veces denominados, aparecen en las extensiones teñidas por el método de Gram como bacilos grampositivos. ligeramente curvados, con los lados no paralelos y. en ocasiones, con los extremos engrosados, lo que confiere una apariencia de maza (Lámina 50-3). Estas bacterias son catalasa positivas. Existen 46 especies dentro del género Corynebacterium. La mayor parte de las mismas raramente son patógenas para el hombre; las excepciones más notables son Corynebacterium diphteriae y las especies o variedades estrechamente relacionadas con ella, como son C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Las especies de interés clínico dentro del género Arcanobacterium son A haemolyticum. A. pyogenes y A. bemardiae. Al microscopio bajo tinción de Gram, estos microorganismos también aparecen como bacilos grampositivos con forma irregular. Las arcanobactenas se diferencian de las corinebacterias por que dan negativa la prueba de la catalasa.
Arcanobacterium haemolyticum ha sido asociado con procesos de laringitis y con infecciones de las heridas y tejidos blandos, mientras que otras especies como A. pyogenes y A. bemardiae son responsables de la formación de abscesos. Diagnóstico de laboratorio. Debido a que la difteria es, en la actualidad, una enfermedad relativamente rara en EE.UU., el diagnóstico clínico puede ser pasado por alto y el laboratono de análisis puede errar a la hora de reconocer los cultivos. Siempre debe proporcionarse al laboratorio un diagnóstico tentativo, de tal forma que los especímenes sospechosos puedan ser manipulados correctamente. Las connebactenas crecen en agar sangre sin mayor problema; sin embargo, el agar sangre cistina-telurito (CT) es el medio de cultivo pretendo para el aislamiento e identificación del microorganismo. En el medio CT, las colonias que forma C. diphteriae tras 48 horas de incubación son de color gris o negro. Las colonias pueden ser tanto grandes como pequeñas y planas convexas. Los medios de Lóffler (con suero coagulado) o de Pai (con huevo coagulado!, que son más deficientes desde el punto de vista nutnctónal. son apropiados para cultivar microorganismos que exhiban morfologías características al microscopio: apariencia pleomórfíca, agrupación en empalizada (los bacilos se disponen adosados lateralmente unos con otros) y presencia de granulos metacromáticos.
Manifestaciones clínicas y patogenia. En el lugar de la infección inicial a nivel de las amígdalas y la orofaringe. C. diphteriae se multiplica sobre las células epiteliales y produce una exotoxina que provoca necrosis celular local e inllamación subsiguiente. Las lesiones exudativas coalescen. formando unas seudomembranas adherentes de color gris-negruzco. La toxina, que es producida solamente por las cepas de C. diphteriae infectadas por un fago lisogénico que contiene el gen que codifica para la toxina, es absorbida y pasa al torrente circulatorio, mediante el que se disemina sistémicamente, produciendo cambios degenerativos en el corazón, sistema nervioso y ríñones. La molécula de la toxina está formada por dos subunidades: el fragmento A, que contiene el sitio enzimáticamente activo, y el fragmento B. en donde se encuentra el dominio que determina la unión a las células del huésped. La toxina diftérica se une a las células a través de la subunidad B. sufre un proceso de escisión y el fragmento A penetra en el intenor de la célula mediante un mecanismo totalmente desconocido. Una vez en el citoplasma, la subunidad A bloquea la síntesis proteica, catalizando la inactivación de la actividad translocadora del ARN de transferencia, impidiendo la interacción de este último con el ARN mensajero y deteniendo la incorporación de nuevos residuos de aminoácidos a la cadena polipeptidica en crecimiento. La toxina puede alectar a cualquier célula del organismo, pero las que resultan dañadas más gravemente son las del corazón, nñón y tejido nervioso. El propio microorganismo y la toxina que sintetiza producen un exudado seroso y un infiltrado celular en la mucosa de la faringe, lo que conduce a la formación de unas seudomembranas de color grisáceo. Aunque se considera que producción de toxina y patogenicidad son términos sinónimos, las seudomembranas también pueden formarse en personas infectadas por cepas no toxigenicas. La extensión de las seudomembranas por arriba hacia la nasofaringe y por debajo hacia la laringe puede ser tan masiva como para producir una obstruc-
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
La clasificación de las corinebacterias, o bacilos difteroides. de la piel y la boca es difícil y confusa. Las características diferenciales de algunas especies se muestran en la Tabla 50-7. Existen sistemas comerciales disponibles para la identificación de este grupo de microorganismos. Los aislamientos sospechosos de ser C. diphtenae deben ser analizados para establecer su capacidad de producir la exotoxina. La síntesis de la misma puede ser detectada in vitro mediante la prueba de inmunodifusión de Elek, que consiste en sembrar sobre una tira de papel de filtro impregnada en antitoxina y embebida en la masa del agar del medio de cultivo una única estría en perpendicular del microorganismo que va a ser estudiado, observando al cabo del tiempo de incubación la aparición de lineas de precipitado que se forman con un ángulo de 45 grados en relación con la lira de papel y la estría del crecimiento microbiano. Se han descrito muchas modificaciones de este método, todas las cuales han conducido a la obtención de resultados erróneos, como puede ser la no aparición de lineas de precipitado con cepas genuinamente toxigénicas o la lormación de bandas de precipitación mespecíficas con microorganismos no productores de exotoxina. Varios lactores, como son la concentración del suero antitoxina, la cantidad de inoculo, el tipo de suero de enriquecimiento utilizado en el medio y el tiempo de incubación, pueden afectar el resultado de esla
Características diferenciales d e a l g u n a s e s p e c i e s del g é n e r o C o r y n e b a c t e r i u m y bacterias relacionadas
Prueba Catalasa Hemolisis Gelatinasa Ureasa Reducción de los nitratos Fermentación de la sacarosa + = positivo: - = negativo: v = variable.
C. diphteriae
C. ulcerans
C. pseudotuberculosis
C. jeikeium
+
+ + + +
+
+
+
-
V
V
Arcanobacterium haemolyticum
A rcanobacterium pyogenes
+
+ -
V
V
+
v v
-
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
prueba. Se han descrito métodos alternativos basados en la PCR que pueden ser de utilidad para detectar el gen que codifica la síntesis de la exotoxina. Las especies de Arcanobacterium son catalasa negativas y (i-hemolíticas en agar sangre. Las colonias que se forman después de una incubación de 48 horas son de pequeño tamaño. Las mismas pruebas bioquímicas que se utilizan para la identificación de las corinebacterias pueden utilizarse también en el caso de las arcanobacterias. La especie A. haemolyticum produce fosfolipasa D, enzima que es responsable de una reacción inversa del cAMP cuando esta bacteria se incuba simultáneamente con otra especie bacteriana, Staphylococcus aureus, en agar sangre. A. haemolyticum inhibe la hemolisis alrededor de la estría de crecimiento de S. aureus, produciendo una zona con lorma triangular en la que no se detecta hemolisis. Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el suero antitoxina sigue siendo el único método específico para el tratamiento de la difteria, también se administran antibióticos a los pacientes que manifiestan la enfermedad y los portadores asintomáticos de cepas toxigénicas. C. diphteriae es sensible a la penicilina, la eritromicina y la clindamicina. Debido a su elevada eficacia y a que es bien tolerada, la eritromicina es el antibiótico que se utiliza con mayor frecuencia en este contexto; sin embargo, la penicilina-benzatina también puede ser de utilidad en aquellos casos en los que se espera que el paciente coopere en la pauta de administración del antibiótico. La sensibilidad a los anlimícrobianos de otras especies de corinebacterias o bacilos difteroides es bastante menos predecible. Por ejemplo. C. jeikeium es, usualmente. resistente a las penicilinas y cefalosporinas, sensible pero con mucha variabilidad a la mayoría de los restantes antibióticos y sensible casi de manera uniforme a la vancomicina. El tratamiento de las infecciones causadas por estos microorganismos se ve complicado, a menudo, por unas defensas del huésped disminuidas y por la presencia de prótesis implantadas. Las arcanobacterias son sensibles a (5-lactámicos, rifampicina. tetraciclina y macrólidos. Prevención. La prevención de la difteria se basa casi exclusivamente en programas de inmunización activa y pasiva, con administración suplementaria de antibióticos para eliminar el estado de portador de cepas toxigénicas durante las epidemias.
Listeria Características. Las especies del género Listeria son bacilos grampositivos, no ramificados y no esponjados. El crecimiento óptimo de L. monocytogenes, la única especie del género patógena del hombre, tiene lugar entre 30"C y 37°C; sin embargo, esta bacteria puede crecer a 4°C. Las colonias que aparecen a las 24 horas son pequeñas y muestran una estrecha zona de hemolisis [i alrededor en agar sangre. A temperatura ambiente este microorganismo exhibe una movilidad a saltos característica que raramente se observa a 35°C. Esta motilidad dependiente de la temperatura también se aprecia en los medios semisólidos, en los que el crecimiento bacteriano se distribuye en un área cuyo perímetro semeja a un paraguas en la parte superior del tubo. Manifestaciones clínicas y patogenia. Listeria monocytogenes se encuenlra en el suelo, polvo, agua, pasto, aguas residuales y leche entera sin pasteurizar. La transmisión del microorganismo a través de alimentos como las ensaladas de col, cebolla y zanahoria, leche pasteurizada y quesos frescos ha sido la causa de las diversas grandes epidemias que han tenido lugar en Norte América y Europa (Fleming, 1985; Linnan, 1988). De acuerdo con los datos emanados del control microbiológico de los alimentos, L. monocytogenes ha sido detectada en el 2% al 3% de productos lácteos, en un 20% de
Tabla 50-8 y
Características diferenciáis d e Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopatiae
Prueba
L. monocyogenes
B-hemólisis
+
Crecimiento a 4°C Catalasa Movilidad Hidrólisis de la esculina Utilización del gluconate Voges-Proskauer Producción de H-.S en agar TSI
+ + + + + +
E.
rhusiopathiae
-
+
quesos tiernos o frescos y de carnes elaboradas, en un 30% de diversos vegetales (repollos, rábanos) y hasta en un 50% de carne cruda y aves de corral (Broome. 1993). Entre un 2% y un 20% de animales y personas pueden ser portadores transitorios. Es muy posible que alteraciones en el sistema inmunológico del huésped determinen el establecimiento de la enfermedad, ya que la mayor parte de individuos aquejados de listeriosis son inmunodeprímidos. Los macrófagos y los linfocitos T representan los principales mecanismos de defensa del hospedado! frente a la infección por L monocytogenes. La virulencia de este microorganismo está relacionada con la producción de listeriolisina O, una proteína de 52 kDa que liene actividad hemolítica y citotóxica, que es excretada en condiciones de pH ácido y baja concentración de hierro, como las que existen en el interior del fagolisosoma. Se cree que la proteína se une de forma irreversible al colesterol de la membrana del lisosoma. provocando su rotura y permitiendo la multiplicación bacteriana incontrolada en el citoplasma de la célula fagocítica. Las manifestaciones clínicas de la listeriosis son diferentes según se trate de mujeres embarazadas, neonatos y personas inmunodeprimidas, que constituyen los principales grupos de riesgo. Durante el embarazo, generalmente en el primer trimestre del mismo, la listeriosis cursa con unos síntomas semejantes a los de la gripe. La bacteriemia concomitante en la mujer afectada es responsable de la inlección del feto. La infección puede progresar hasta una amnionitis que provoca un parto prematuro o un aborto séptico en el plazo de tres a siete días. La infección en la madre es autolimitada porque la fuente de la misma desaparece con la expulsión del feto infectado y del resto del contenido uterino. La listeriosis neonatal puede tener un comienzo temprano o tardío. En el primer caso, la enfermedad, que se puede manifestar en el mismo momento del nacimiento o unos pocos días después, es consecuencia de la infección en el interior del útero. El recién nacido presenta una temperatura inestable, alteraciones hemodinámícas y problemas respiratorios; también son característicos de la enfermedad los granulomas, que aparecen ampliamente diseminados, afectando sobre todo a la placenta, el tramo posterior de la faringe y la piel, aunque eventualmenle pueden no estar presentes. La enfermedad de inicio tardío, que afecta a los niños nacidos a término de madres con embarazos normales, debe tener su origen en una infección contraída posparto, aunque en la mayor parte de los casos la fuente de la misma es desconocida. En este caso, los síntomas clínicos típicos de una meningitis aparecen tras el nacimiento en un rango de tiempo muy amplio que va desde días hasta varias semanas después. La listeriosis en los adultos aparece generalmente en individuos inmunodeprimidos, aunque en la tercera parte de casos no se ha identificado o asociado un factor de riesgo con la infección. La mitad aproximadamente de estas infecciones cursan como una meningitis; otras formas de listeriosis que afectan al SNC son la cerebritis y los abscesos en el troncoencéfalo y el cordón espinal. La bacteriemia primaria o las infecciones focales en localizaciones diferentes al SNC son muy poco frecuentes. Diagnóstico de laboratorio. Las colonias son pequeñas, de color gris azulado, y rodeadas de una zona o halo estrecho de hemolisis |5 en agar sangre. La prueba que permite diferenciar a L monocytogenes de los estreptococos del grupo B. que pueden formar colonias con una apariencia semejante, es la catalasa, que es positiva en la primera y negativa en los segundos. L monocytogenes es móvil a temperatura ambiente y forma ácidos a partir de glucosa, trehalosa y salicina. Otras características de esta bacteria se indican en la Tabla 50-8. Sensibilidad a los antimicrobianos. L. monocytogenes es sensible, usualmente, a la penicilina, ampicilina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina y gentamicina. Recientemente, se han identificado plásmidos que confieren resistencia a cloranfenicol, macrólidos y tetraciclinas en varias cepas de origen clínico. Para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria se ha utilizado con éxito la ampicilina sola o en combinación con un aminoglucósido. En los pacientes que tienen alergia a la penicilina puede utilizarse como alternativa terapéutica el Irímetoprim-sulfametoxazol.
Erysipelothrix Características. Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo, catalasa positivo, inmóvil, anaerobio facultativo, que no forma esporas y que tiene una distribución mundial. Las bacterias presentes en las colonias lisas son bacilos de pequeño tamaño, rectos o ligeramente curvados, mientras que en las colonias rugosas los microorganismos son bacilos largos y filamentosos.
CAPÍTUIO 50
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Manifestaciones clínicas y patogenia. £ rhusiopathiae se transmite de los animales al ser humano mediante heridas en la piel causadas por objetos contaminados o al entrar en contacto con sangre, carne, visceras o heces de animales infectados. £. rhusiopathiae se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza en los animales tanto salvajes como domésticos, pájaros, peces, materia orgánica en descomposición, y causa infección en cerdos, ovejas, conejos, ganado, pájaros y aves de corral. Entre las personas con nesgo de contraer infecciones por esta bacteria se encuentran los carniceros, empleados de mataderos, pescadores y manipuladores de pescado, personal de granjas avícolas y veterinarios. La forma más común de la enfermedad erisipeloide es una infección cutánea local que cursa con dolor, hinchazón y una erupción en la piel, consistente en una zona de color violáceo ligeramente elevada y de progresión lenta, que aparece alrededor del punto en donde tuvo lugar la inoculación del microorganismo. La hinchazón y el eritema migran periféricamente y la lesión involuciona sin producir descamación de la piel. La enfermedad sislémica es rara, aunque existen informes sobre casos de septicemia y endocarditis causadas por E. rhusiopathiae. También son muy poco frecuentes los casos de artritis y abscesos cerebrales. Diagnóstico de laboratorio. La biopsia o los aspirados de tejidos de las lesiones erisipeloides son los mejores tipos de especímenes para el cultivo. Los microorganismos están localizados profundamente en la capa subcutánea del borde externo de la lesión; por tanto, el material recogido de la superficie de la piel con un hisopo no es de utilidad para intentar el aislamiento. E. rhusiopathiae crece en agar sangre o agar chocolate, pero puede necesitar hasta siete dias de incubación para desarrollarse. Los medios convencionales para hemocultivo son adecuados para el aislamiento de la bacteria a partir de sangre. E. rhusiopathiae es oxidasa y catalasa negativo y produce, típicamente. H,S en agar TSI (agar triple azúcar-hierro). Es inmóvil, no reduce los nitratos a nitritos y fermenta la glucosa y la lactosa. Un rasgo muy característico de esta bacteria es el aspecto de su movilidad en un medio con gelatina, inoculado en picadura e incubado a 22 O que semeja a un «desatascador de tuberías». £ rhusiopathiae se distingue fácilmente de las especies del género Listeña (véase Tabla 50-8). Sensibilidad a los antimicrobianos. £ rhusiopathiae es sensible a las penicilinas, cefalosporinas, imipenem. eritromicina, clindamicina, cloranfenicol. tetraciclinas y fluoroquinolonas. pero resistente a las sulfonamidas, aminoglucósidos y vancomicina.
Gardnerella Características. Gardnerella vaginalls es una bacteria Gram variable y pleomórfica. ya que puede aparecer en forma de bacilos delgados o cocobacilos. Es inmóvil y catalasa negativa. El crecimiento se observa mejor tras 48 horas de incubación en una atmósfera enriquecida con un 5% de CO . Las colonias son pequeñas y producen hemolisis (} en agar con sangre de conejo o sangre humana. Manifestaciones clínicas y patogenia. Este microorganismo se ha asociado con la vaginosis bacteriana, aunque probablemente no sea el único agente etiológico de esta enfermedad. Ha sido aislado a partir de la sangre de pacientes con fiebre posparto y también puede causar infecciones en los recién nacidos. G. vaginalls forma parte de la microbiota del recto y el ano en adultos sanos de ambos sexos, así como en niños, y de la microbiota endógena de la vagina en mujeres en edad fértil. Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de la vaginosis bacteriana no requiere cultivo, sino que se lleva a cabo mediante examen directo de las secreciones vaginales para detectar la presencia de las células clave, que son células epiteliales con el borde recubierto de bacterias, la existencia de bacilos pequeños y cocobacilos gramnegativos, la ausencia de lactobacilos (bacilos grampositivos delgados), un valor de pH superior a 4,5 y un olor a aminas (a pescado) que aparece cuando se añade una solución a la secreción de KOH al 10%. Cuando se observa en cultivo. G. vaginalls puede ser identificado presuntivamente en base a la hemolisis que produce en agar de dos capas con sangre humana y Tween tras 48 horas de incubación. Sensibilidad a los antimicrobianos. No existe una recomendación expresa sobre la realización de pruebas de susceptibilidad de G. vaginalls a los antimicrobianos. por lo que no existe un protocolo específico para llevar a cabo este análisis. El metronidazol es la sustancia de elección para el tratamiento de la vaginosis bacteriana. Las infecciones sistémicas causadas por
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este microorganismo pueden tratarse con ampicilina, porque no se ha encontrado que tenga capacidad de producir [Mactamasa.
Bacillus Características. Las especies del género Bacillus son bactenas aerobias estrictas o anaerobias facultativas, de morfología bacilar, formadoras de esporas, catalasa positivas y grampositjvas. Con la única excepción de Bacillus anthraos. todas las especies son móviles por medio de flagelos laterales o pentncos. Algunas cepas se tiñen como gramnegativas y, debido al carácter variable de la prueba de la oxidasa, pueden contundirse con bacilos gramnegativos. La característica diagnóstica más fiable es la capacidad que tienen las especies del género para formar endosporas, proceso que tiene lugar de manera óptima en condiciones aeróbicas entre 25' C y 30 C en una gran variedad de medios de cultivo. En las extensiones teñidas por el método de Gram, las esporas aparecen como zonas o huecos no teñidos en el interior de las células. Las endosporas pueden teñirse por vanos procedimientos específicos. Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las numerosas especies del género Bacillus. B. anthracls es la única que es fuertemente patógena de forma consistente. Deben extremarse las precauciones a la hora de manipular muestras y materiales en los que se sospeche la existencia de este microorganismo. Las manipulaciones deben ser realizadas en cabinas de bioseguridad por personal inmunizado y protegido con guantes, ropas apropiadas y máscaras; las superficies de trabajo deben desinfectarse con hipoclorito o con fenol (ambos al 5%); al finalizar, todos los materiales y equipos utilizados deben ser descontaminados. Existen tres formas clínicas de la enfermedad que produce B anthraos. el ántrax: cutáneo, pulmonar e intestinal. En su forma cutánea, el ántrax se caractenza por la aparición de una lesión macular rojiza de pequeño tamaño que evoluciona hasta formar una vesícula que termina por necrosarse. formando una escara negra. Junto con estos síntomas, también puede haber linfadenopatia regional y septicemia. Sin tratamiento, la mortalidad en esta forma de la enfermedad está alrededor del 20%. La inhalación de las esporas de B. anihracis puede producir bronconeumonia aguda, mediastinitis y septicemia («enfermedad de los esquiladores»). La mortalidad en los casos diagnosticados de esta variedad del ántrax está próxima al 100%. La forma intestinal aparece como consecuencia de la ingestión de alimentos contaminados y cursa con náuseas, vómitos y diarrea. En algunos casos aparecen hemorragias intestinales, seguidas de postración, shock y muerte. En las tres formas del ántrax puede haber septicemia, que puede conducir a una meningitis purulenta de pronóstico fatal Un factor de virulencia determinante de la capacidad patogénica del microorganismo es la presencia de una cápsula formada por un polipéptido neo en ácido glutámico que inhibe la fagocitosis: los anticuerpos especílicos frente al antígeno capsular no tienen efecto protector contra la enfermedad. La bacteria produce, además, una compleja toxina formada por tres componentes (factor edematoso, antígeno protector y factor letal) que es la responsable de los síntomas del ántrax. Los seres humanos se infectan al entrar en contacto con animales infectados o sus cadáveres o al ingerir o inhalar subproductos derivados de los mismos. El ganado vacuno, ovejas, caballos y cabras son los animales que se infectan más frecuentemente y constituyen una fuente inmediata de formas vegetativas de la bacteria que esporulan y perpetúan la contaminación en el ambiente. Otras especies del género pueden causar también enfermedad, aunque habitualmente sean formas saprofitas. En este contexto, Bacillus cereus se ha asociado con infecciones del oído, neumonía, infecciones de heridas oculares postraumáticas, septicemia y endocarditis. Los pacientes con neumonía y septicemia están afectados, frecuentemente, por algún proceso de inmunosupresión. Esta especie puede ocasionar bacteriemia asociada con el uso de drogas por vía intravenosa o de dispositivos mtravasculares contaminados. Existen dos formas de gastroenteritis relacionadas con las especies del género Bacillus. La intoxicación alimentaria causada por Bacillus puede producirse entre una y seis horas después de la ingestión de alimentos contaminados con B. cereus que contienen preformada una toxina termoestable que el microorganismo ha sintetizado in situ. Los síntomas principales de esta intoxicación alimentaria son náuseas, vómitos, retortijones y, ocasionalmente, diarrea. Clásicamente, esta forma de gastroenteritis es el resultado de la elaboración, en gran cantidad, de alimentos que no necesitan ser recalentados antes de servirse. La cepa de fi. cereus tipo 1 crece particularmente bien en
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
arroz írílo y es más resistente al calor que otros tipos, por lo que esta forma de gastroenteritis se manifiesta con mucha frecuencia asociada al consumo de arroz frito en los restaurantes chinos. La segunda forma de gastroenteritis causada por fl. cereus es consecuencia de la contaminación de platos de carne y vegetales y cursa con retortijones y diarrea que aparecen entre 8 y 16 horas después de la ingestión del alimento contaminado. En este caso los síntomas están causados por una enterotoxina termolábil. Diagnóstico de laboratorio. En los casos en los que se sospeche la existencia de la forma cutánea del ántrax, debe recogerse el líquido de las vesículas, asi como material del borde de la escara, con un hisopo para realizar extensiones para la observación al microscopio y para el cultivo. Si hay sospecha de ántrax pulmonar, hay que obtener muestras de esputo para los frotis y el cultivo. En el caso de la forma intestinal hay que llevar a cabo un coprocullivo. En el caso de que pueda tratarse de una meningitis deben realizarse observaciones microscópicas y cultivos a partir del LCR. En la fase septicémica deben realizarse hemocultivos. La detección de bacilos grampositivos grandes y con los bordes rectos (aspecto denominado boxear) en los frotis realizados a partir de cualquiera de los especímenes indicados en el párrafo anterior tiene valor diagnóstico. La microscopía de fluorescencia, disponible en algunos laboratorios de análisis y en el CDC. permite llevar a cabo un diagnóstico presuntivo rápido. Las especies de Bacillus crecen bien en agar con sangre de oveja. Las colonias de 8. anthracis son habitualmente planas, con bordes irregulares (forma que se denomina "cabeza de Medusa"), blancuzcas con la superficie áspera (aspecto de cristal esmerilado) y, usualmente. no hemolíticas. Cuando se tocan con el asa de inoculación, las colonias son pegajosas y se levantan como la clara de huevo batida. B. cereus y otras especies del género también forman colonias con forma de cabeza de Medusa. El bacilo del ántrax es inmóvil, tanto por la prueba de la gota pendiente como en medio semisólido, mientras que las restantes especies son móviles. La determinación de la movilidad por la técnica de la gota pendiente es una prueba útil para diferenciar B anthracis de 8. cereus, pero debe hacerse con cultivos jóvenes de ambos microorganismos. El resto de pruebas bioquímicas y características adicionales que pueden utilizarse para identificar los aislamientos a nivel de especie han sido recopiladas por Logan y Turnbull (Logan, 1999). Las pruebas de virulencia se llevan a cabo inyectando subcutánea o mtraperitonealmente en ratones una suspensión ligeramente turbia de las bacterias, que se prepara resuspendiendo en solución salina las colonias crecidas en medio sólido. No debe utilizarse un cultivo en medio líquido para los ensayos de virulencia debido a los productos toxigénicos que otras especies de Bacillus pueden formar en caldo nutritivo. La muerte del ratón tiene lugar entre 24 y 72 horas después de la inyección, y es posible detectar los microorganismos en frotis realizados a partir de muestras de sangre del corazón, hígado y bazo. No es posible llevar a cabo de modo fiable el diagnóstico de la gastroenteritis causada por 8. cereus mediante coprocultívo. porque este microorganismo puede formar parte de la microbiota autóctona del intestino. Por tanto, el diagnóstico depende del cultivo cuantitativo realizado a partir del alimento sospechoso de estar contaminado. La presencia de un número igual o superior a 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en el alimento sospechoso constituye una evidencia presuntiva de contaminación alimentaria por 8. cereus (Logan, 1999). 5
Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el agente causal es sensible a varios agentes antimicrobianos. la terapia con antibióticos del ántrax se centra en el uso de la penicilina sola o en combinación con estreptomicina. Ambos antibióticos son muy activos frente a 8. anthracis. aunque algunas cepas producen una |5-lactamasa. La susceptibilidad de otras especies de Bacillus a las penicilinas y cefalosporínas es extremadamente variable. Sin embargo, la mayor parte de especies son inhibidas por tetraciclinas, aminoglucósidos y cloranlenicol a bajas concentraciones. Prevención. La prevención del ántrax en el hombre depende del control de los animales infectados. La rápida detección de los animales enfermos, su aislamiento y tratamiento, y la incineración de los cadáveres son procedimientos indicados cuando se detectan brotes epidémicos esporádicos. En las áreas enzoóticas se utiliza la vacunación con preparados de esporas no encapsuladas. Aquellas personas que por su profesión puedan tener riesgo de quedar expuestas también deben inmunizarse.
La enfermedad diarreica aguda producida por 8. cereus se puede prevenir mediante la cocción correcta y la refrigeración de los alimentos preparados en grandes cantidades, para prevenir la proliferación de las formas vegetativas de las bacterias y la formación de la enterotoxina.
Nocardia Características. En los frotis de muestras clínicas teñidos por el método de Gram. las especies de Nocardia aparecen como bacilos grampositivos largos y delgados, formando rosarios de células o ramificados (Lámina 50-4). La característica más destacable de las nocardias es que son parcialmente ácido-alcohol resistentes: las células se tiñen positivamente con una modificación de la tinción de ácido-alcohol resistencia (Zielh-Neelsen o Kmyoun), lo que diferencia a estas bacterias de las del género Actinomyces. que pueden tener una apariencia semejante cuando se observan bajo tinción de Gram. La ácido-alcohol resistencia parcial puede ser difícil de demostrar y puede visualizarse mejor si se hace crecer al microorganismo en el medio de Middlebrook 7H10 o en leche tornasolada. La mayor parte de las infecciones están causadas por Nocardia asteroides, seguida por N. brasiliensis y con mucha menor frecuencia por N. olitidis caviarum. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las nocardias se encuentran en el suelo y en la materia orgánica, tienen distribución mundial y causan enfermedades en animales y peces. La infección en humanos es ligeramente superior en el hombre que en la mujer. La infección se contrae usualmente por inhalación del microorganismo, aunque también puede tener lugar por contaminación de las heridas con tierra, o cuando las bacterias penetran en el organismo a través del tubo digestivo cuando un material contaminado entra en contacto con una zona ulcerada de la mucosa digestiva. En los pulmones, las nocardias son fagociladas por los macrólagos alveolares, multiplicándose en el interior de los mismos, lo que desencadena una respuesta inflamatoria mixta (neutrófilos, linfocitos y macrófagos) que eventualmente da como resultado la formación de abscesos y. ocasionalmente, de granulomas. Los estudios realizados in vitro sobre los mecanismos de defensa del hospedador frente a las nocardias sugieren la implicación de los neutrófilos, los macrólagos activados y las células T citotóxicas. Aunque los neutrófilos son incapaces de destruir las especies virulentas de Nocardia. inhiben su crecimiento, deteniendo el avance de la infección hasta que los macrófagos están totalmente activados Si la infección no queda limitada al pulmón, los microorganismos pueden extenderse por crecimiento hasta otros tejidos adyacentes, produciendo empiema, afectación de la pared costal y senos drenantes, o diseminarse hemalógenamente formando abscesos, especialmente en el cerebro, tejidos subcutáneos y ríñones. El principal factor relacionado con el hospedador, y que implica un riesgo elevado de contraer nocardiosis. es una disfunción en la inmunidad celular, aunque muchas personas infectadas por Nocardia spp. no tienen problema reconocido alguno en su inmunidad celular y humoral (Wilson. 1989) La enfermedad pulmonar es la manifestación más frecuente de la nocardiosis y se caracteriza por una serie de síntomas como fiebre, anorexia, pérdida de peso, tos, disnea y dolor pleural. La infección en la piel y el tejido subcutáneo puede dar lugar a pioderma, celulilis, formación de abscesos (uno o múltiples), una afección linfocutánea semejante a la esporotricosis y aparición de nodulos. En América Central y del Sur. la infección primaria de la piel con N. brasiliensis puede producir un actmomicetoma (una masa granulomatosa indurada y localizada con conductos fistulosos por los que mana pus y los denominados granulos de 'azufre"), generalmente en las extremidades inferiores. La enfermedad diseminada casi siempre está causada por N. asteroides. en la mayor parte de los casos tiene su origen en el pulmón, y se manifiesta típicamente en forma de abscesos múltiples que afectan al sistema nervioso central. La piel es la segunda localización más común del cuerpo para la diseminación de las bacterias, seguida por el nñón, el hígado y los ganglios linfáticos Diagnóstico de laboratorio. Las especies del género Nocardia crecen aeróbicamente en la mayor parte de medios no selectivos como agar con sangre de oveja y agar chocolate, agar Sabouraud-dextrosa sin cloranfenicol o medio Middlebrook. Estas bacterias también pueden ser cultivadas en el medio BCYE (medio tamponado que contiene sangre, carbón vegetal, y extracto de levadura), utilizado para el aislamiento de Legionella spp. Es importante indicar que las especies de Nocardia no siempre sobreviven a los procesos de descontaminación de las muestras que se aplican en los protocolos para el
CAPÍTULO 50
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
aislamiento de micobacterias. La incubación en una atmósfera que contenga un 10% de CO¡ favorece el crecimiento de estos microorganismos. Las especies de Nocardia pueden crecer en 48 horas, aunque normalmente las colonias tardan en aparecer entre 5 y 20 días, y pueden presentar aspecto cerúleo, una superficie muy irregular o un aspecto rugoso aterciopelado, generalmente pigmentadas con tonalidades que van del amarillo al anaranjado. La observación de formas filamentosas que se tiñen exclusivamente con un método modificado de tinción de ácido-alcohol resistencia distingue a las especies de Nocardia de las micobacterias. Las nocardias se diferencian de la mayor parte de los actinomicetos aeróbicos comprobando la resistencia a la lísozima (las especies de Nocardia son resistentes, mientras que las de los géneros Streptomyces. Rhodococcus. Gordona y Aclinomadura son sensibles a la enzima). Las especies de Nocardia se distinguen atendiendo a su capacidad para hidrolizar caseína, hipoxantina, tirosina y xantina. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las sulfonamidas son usualmente los agentes antimícrobianos de elección: sin embargo, la terapia antimicrobiana óptima depende de la especie de Nocardia presente, del patrón de resistencia o sensibilidad de la cepa en particular y del tipo de infección. Otros agentes antimícrobianos de utilidad potencial son el trimetoprim-sulfametoxazol. la amicacina y el imipenem.
Otros
actinomicetos aerobios
Otros géneros del grupo de los actinomicetos que incluyen especies de interés clínico para el hombre son Rhodococcus. Gordona. Tsukamurella. Actinomadura y Streptomyces. Otro miembro de este grupo, Trophyrema whippelii. es un microorganismo no cultivable que es el agente causal de la enfermedad de Whípple. Manifestaciones clínicas y patogenia. Los miembros de este grupo de microorganismos son ubicuos y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habiendo sido aislados del suelo, aguas dulces y marinas y materia orgánica. Rhodococcus equies la única especie del género Rhodococcus patógena para el hombre. Es un patógeno oportunista que afecta a individuos con un grado de inmunodepresión profundo, en los que causa una neumonía granulomatosa de progresión lenta. El microorganismo puede aislarse a partir de la sangre de los pacientes infectados. La infección se adquiere probablemente por vía respiratoria, posiblemente como consecuencia de la exposición a animales mlectados. La capacidad del microorganismo para sobrevivir en el interior de los macrófagos y, en último término, causar su destrucción parece ser la responsable de su poder patógeno. Las infecciones causadas por las especies de los géneros Gordona y Tsukamurella son muy poco frecuentes. Las especies de Tsukamurella son patógenas solamente cuando concurren ciertas condiciones clínicas (p. ej.. inmunosupresión, presencia de cuerpos extraños o infecciones crónicas activas, como tuberculosis). Las especies del
Tabla 50-9
Diagnóstico de laboratorio. Los actinomicetos aeróbicos son de crecimiento lento y pueden necesitar entre dos y tres semanas de incubación para formar colonias. Estos microorganismos crecen en la mayor parte de medios no selectivos utilizados para aislar bacterias, micobacterias y hongos. Las especies de Rhodococcus crecen como cocobacilos dispuestos en zigzag. En los medios líquidos se observan formas filamentosas con ramificaciones rudimentarias. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas y presentan pigmentos de color marrón claro, coral, anaranjado y rosa intenso, que aparecen tras varios días de incubación. Las colonias de R. equi son de color rosa o amarillo pálidos, o coral, y pueden tener una textura viscosa. Las especies del género Gordona forman colonias lisas y mucosas que se adhieren al medio o secas y elevadas. Los pigmentos que producen tienen colores que van del beige al salmón Las especies del género Tsukamurella son levemente acidoalcohol resistentes cuando se tiñen mediante una modificación del método de Kinyoun. Aparecen como bacilos largos que se fragmentan en tres trozos y no forman hitas aéreas. Las colonias son circulares, con los bordes enteros o rizados. Pueden tener una textura seca o mucosa con pigmentos de color blanco a anaranjado. Las colonias rugosas aparecen tras siete días de incubación. Las especies del género Actinomadura forman colonias con apariencia cerebriforme, cerúleas, duras, membranosas, con pigmentos de color blanco, amarillo, rosa o rojo. Las colonias del género Streptomyces son secas, con una textura que tiene una apariencia de tiza o terrea, con aspecto amontonado o plegado, con pigmentos de color blanco-grisáceo a amarillo y con un olor que recuerda al de los sótanos con humedad. Producen una amplia variedad de pigmentos que dan color tanto a las hilas como al sustrato donde crecen éstas. Algunas especies no forman hitas aéreas.
Bacterias gramnegativas Enterobacteriaceae Características. Las enterobactenas son bacilos gramnegativos. aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas, inmóviles o móviles por flagelos perítricos, oxidasa negativos, que producen ácidos por vía fermentativa a partir de la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Los géneros incluidos en este grupo son los siguientes: Budvicia. Buttiauxella. Cedecea. Qtrobacter. Edwar-
Medios selectivo y diferenciales para enterobacterias
Medio
A g e n t e bacteriostático para g r a m p o s i t i v o s
Eosma-azul de metileno (EMB) MacConkey
Eosina Y Azul de metileno Cristal viólela Sales biliares Sales biliares
Xilosa-lisinadesoxicolato (XLD) Hektoen entérico (HE)
Sales biliares
Salmonella-shigella (SS) Sulfilo de bismuto (BS) Tiosullato-citrato-saies biliares-sacarosa (TCBS)''
Sales biliares Verde brillante Sales biliares, pH 8 6
' D = diferencial, S = selectivo Fórmula de Levine. # Las saínemelas que producen H,S forman colonias negras Utilizado para el aislamiento de especies del género Vibrio :
v
noi
género Actinomadura son una causa frecuente de micetomas actinomicóticos. la mayor parte de los cuales aparecen en países tropicales y subtropicales, donde caminar descalzo incrementa las posibilidades de exposición a los microorganismos a través de pequeñas heridas punzantes en la planta de los pies. Tradicionalmente se ha considerado que las especies del genero Streptomyces tienen una escasa relevancia clínica: sin embargo, una de las especies, S. somaliensis, ha sido identificada como un agente causal de micetomas actinomicóticos. Las restantes especies del género tienen importancia médica sólo muy ocasionalmente.
Carbohidrato fermentable Lactosa' Lactosa Xilosa Lactosa Sacarosa Salicina Lactosa Sacarosa Lactosa Glucosa Sacarosa
Color de las colonias Categoría"
Indicador Fermentador
No termentador
Eosina Y Azul de metileno Rojo neutro
Rojas o negras con brillo Rojas
incoloras
S, D
incoloras
S, D
Rojo lenol
Amarillas
Rojas
S. D
Azul de bromotimol
Amarilloanaranjadas
Verdes, azul verdosas
S, D
Rojo neutro Sulfito de bismuto Azul Ge timol Azul de bromotimol
Rojas # Amarillas
Incoloras n Incoloras
S S S. D
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
siella. Enterobacter. Escherichia. Ewingella. Hafnia. Klebsiella, Kluyvera. Leclercla, Leminorella. Moellerella. Morganella. Obesumbactenum, Pragia, Panloea. Pholorhabdus, Proleus. Providencia. Rahnella. Salmonella. Serralia. Shigella. Tatumella. Trabulsiella. Xenorhabdus. Yersinia y Yokenella. Solamente unos pocos de estos géneros serán objeto de análisis en este capítulo. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las bacterias de la familia Enterobactenaceae se encuentran presentes en las plantas, el suelo, las aguas y el intestino del hombre y de los animales. Se han asociado con una gran diversidad de infecciones clínicas que incluyen abscesos, neumonía, meningitis, septicemia e infecciones de las vías urinarias. Los microorganismos que están implicados con mayor frecuencia en las infecciones en el hombre son Escherichia coii y varias especies incluidas en los géneros Klebsiella, Proteus, Enterobacter. Salmonella, Shigella, Serralia. Citrobacter y Providencia. Las especies E. coli. Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae son las que se encuentran con una mayor frecuencia en las vías urinarias. K. pneumoniae es el responsable que con mayor frecuencia se encuentra asociado a las neumonías causadas por bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Las especies causantes de bacteriemias son E. coli. K pneumoniae y P. mirabilis. Los miembros pertenecientes a los géneros que exhiben una acusada resistencia a los antibióticos, como Citrobacter, Enterobacter y Serratia, son los responsables más probables de las infecciones nosocomiales atribuidas a esta familia. Las enterobacterias asociadas con procesos diarreicos son diversas especies incluidas en los géneros Shigella. Salmonella. Yersinia y las cepas enterohemorrágicas, enteropatógenas. enterotoxigénicas. enteromvasivas y enteroadherentes de la especie E coli. Las especies del género Shigella se aislan muy raramente de una localización que no sea el tracto gastrointestinal, mientras que las del género Salmonella se aislan con mayor frecuencia de otras fuentes como sangre y orina. Las endoloxinas, que están presentes como componentes estructurales de la membrana externa de la pared celular de las enterobacterias. asi como en otros bacilos gramnegativos. son responsables en gran medida de la morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones causadas por estas bacterias. Las endotoxinas están formadas por una parte lipidica y otra polisacarídica. con un componente minoritario de naturaleza proteica. Estos componentes de la célula bacteriana pueden producir fiebre, escalofríos, hipotensión, granulocitosis. trombocitopenia. coagulación intravascular diseminada y activación del complemento por las dos vías, clásica y alternativa. El shock endotóxico es el resultado de una septicemia por bacterias gramnegativas, donde la endotoxina reacciona con los macrófagos, leucocitos, plaquetas, complemento y otras proteínas del suero para incrementar los niveles séricos de ciertas proteínas proteoliticas y de sustancias vasoactivas. con la consiguiente estasis sanguínea, incremento de la vasoconstricción periférica y disminución del gasto cardiaco. Debe quedar claro que los efectos letales de las endotoxinas dependen de la activación y respuesta de los macrófagos. y que la producción de caqueetma por los macrófagos activados desempeña un papel fundamental en la manifestación del shock profundo y en las múltiples lesiones orgánicas (Tracny, 1988).
Otros factores patogénicos de las enterobacterias incluyen el antigeno K1. que está presente en un elevado porcentaje de cepas de E. coli que causan meningitis neonatal; la cápsula de K. pneumoniae. que. al igual que la de los neumococos, inhibe la fagocitosis; el antigeno Vi de Salmonella typhi, que puede interferir con los procesos que causan la muerte intracelular de este organismo: y diversos tipos de antígenos superficiales como las umbrías, que participan en la adherencia de los microorganismos a las superficies mucosas. Los factores determinados por plásmidos parecen desempeñar un papel importante en las propiedades invasivas de Salmonella. Shigella y las cepas enteroinvasivas de £ coli. Además, las enlerotoxmas termolábiles (TL) y termoestables (TE) de E. coli están codificadas por plásmidos. Las toxinas TL estimulan a la enzima adenilato ciclasa en las células de la mucosa del intestino delgado, que, a su vez. activa el cAMP, lo que provoca una salida de líquidos y electrólitos desde las células a la luz intestinal, produciendo diarrea acuosa. Por el contrario, las toxinas TE parecen activar la guanilato ciclasa. Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos a partir de muestras contaminadas se facilita en gran medida con el empleo de medios selectivos y diferenciales (Tabla 50-9). El agar EMB (con eosina y azul de metileno) y el agar MacConkey pueden ser utilizados de forma indistinta como medios mínimamente selectivos y diferenciales para la selección y diferenciación inicial de los bacilos gramnegativos termentadores y no termentadores de la lactosa. Los medios XLD y HE son medios diferenciales con un carácter selectivo más acusado, y son especialmente útiles para recuperar especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras con un elevado grado de contaminación bacteriana, como son las heces. El agar bismuto-sulfito (BS) es un medio fuertemente selectivo de gran utilidad para la detección de salmonelas durante los brotes endémicos o epidémicos de las infecciones causadas por estas bacterias. Las especies del género Salmonella producen H;S y se reconocen fácilmente por que las colonias que forman en los medios XLD, HE y BS presentan el centro de color negro. Los medios de enriquecimiento como el caldo selenito F o el caldo GN (para gramnegativos) son recomendables cuando se pretende detectar las especies de los géneros Salmonella o Shigella que están en bajo número en muestras de heces. El agar CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) incubado a temperatura ambiente es selectivo y diferencial para la recuperación de Y enterocohtica. Las colonias de esta bacteria en agar CIN tienen una apariencia que se denomina "en ojo de toro", con el centro rojo y los bordes transparentes. El agar MacConkey con sorbitol como azúcar fermentable permite diferenciar la cepa 0157:H7 de E coli asociada a síndrome hemolítico urémico, porque a diferencia de oirás cepas de E. coli. ésta es incapaz de fermentar el sorbitol. Algunas enterobactenas pueden ser identificadas presuntivamente mediante la determinación de unas pocas pruebas bioquímicas y características de las colonias que forman. Por ejemplo, las especies de Proteus exhiben una movilidad en enjambre cuando crecen en agar sangre, las de Klebsiella forman colonias mucoides voluminosas, las de Serralia pueden sintetizar un pigmento rojo, las de Salmonella pueden producir H,,S y E. coli es indol positiva. La identifica-
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Tabla 50-10 Caraceristicas diferenciales d e las e s p e c i e s d e enterobacterias aisladas m á s f r e c u e n t e m e n t e e n e l laboratorio d e microbiología clínica (Continuación)
ción deliniliva requiere pruebas bioquímicas adicionales. Se han descrito innumerables esquemas de identificación basados en la realización de pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. En la Tabla 50-10 se indican las caracleristicas diferenciales de las enterobacterias mas comúnmente aisladas en los laboratorios de microbiología clínica. Hay disponibles diferentes sistemas comerciales para la identificación de la inmensa mayoría de enterobacterias que ofrecen una gran sencillez de uso y precisión. En algunos casos, la identificación puede llevarse a cabo en unas pocas horas y con una elevada fiabilidad mediante estos métodos. Los sistemas semiautomatizados pueden combinar la realización de las pruebas de identificación con las de sensibilidad a los antimicrobianos en un único dispositivo. En general, todos estos sistemas tienen un grado de precisión muy elevado y permiten obtener resultados comparables. La clasificación de las enterobacterias ha experimentado una profunda revisión en los últimos años como resultado de los estudios realizados con técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Debido a que la agrupación fenotipica basada en pruebas bioquímicas no está siempre de acuerdo con el parentesco genético, se ha eliminado la categoría de tribu (p. ej., Klebsielleae, Proteae) para agrupar a las especies dentro de la familia.
lutivamente antes de que los antibióticos comenzaran a utilizarse terapéuticamente. Un ejemplo de esto es la resistencia a la penicilina observada en especies de los géneros Citrobacter. Klebsiella. Enterobacter y Serratia. Algunas de ellas son intrínsecamente resistentes también a las cefalosponnas de primera generación. La resistencia adquirida es el resultado de la exposición a los agentes antimicrobianos. Ejemplos de la misma son las cefalosporinasas de tipo I producidas por Citrobacter treundh y Enterobacter cloacae. que confieren resistencia a ceftacidima, y las |5-lactamasas de amplio espectro sintetizadas por K. pneumoniae o £ col!, que son responsables de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generación. Debido a que el patrón de resistencia de las enterobacterias es impredecíble, las pruebas de sensibilidad deben realizarse, como regla general, si se considera administrar una terapia antimicrobiana. En caso contrario, como pueden ser las infecciones intestinales sin complicaciones causadas por salmonelas, en las que un tratamiento con antibióticos contribuye realmente a prolongar el estado de portador en el individuo afectado, no es necesario llevar a cabo las pruebas de sensibilidad.
Vibrio Características. Las especies del género Vibrio son bacilos gramnegativos cortos, rectos o curvados, anaerobios facultativos, oxidasa positivos, generalmente móviles por flagelos polares, capaces de fermentar los carbohidratos y de reducir los nitratos a nitritos. Algunas de las especies tienen importancia clínica (Tabla 50-11).
Históncamente, el género Salmonella se ha divido en la siguientes especies: S. typhi. S. paratyphi A y B, S. choleraesuis. S. typhimurium y S. enleritidis. Debido a que todas estas especies están muy relacionadas genéticamente, actualmente sólo se reconocen dos especies, S. entérica y S. bongori. cada una de las cuales incluye múltiples serotipos. Casi todos los serotipos conocidos están incluidos en la especie S. entérica (Brenner, 2000). El serotipado se basa en la reactividad inmunológica de los antígenos somáticos "O" termoestables, que son fundamentalmente de naturaleza lipopolisacaridica. y los antígenos flagelares "H", que son termolábiles y de composición proteica. El serotipo typhi de Salmonella también sintetiza un antígeno capsular denominado Vi. que es de naturaleza polisacarídica y termolábil. En la práctica, la mayor parte de laboratorios clínicos identifican los aislamientos como "especie de Salmonella" basándose en las pruebas bioquímicas, utilizando seguidamente los sueros específicos de grupo para asignar el microorganismo aislado a un serogrupo específico. La identificación a nivel de serotipo sólo se lleva a cabo en los laboratorios de referencia. Los aislamientos que se componan como Shigella desde el punto de vista bioquímico también se clasifican atendiendo a la reactividad inmunológica de sus antigenos "O" al igual que las cepas de E coli identificadas como causas potenciales de diarrea, síndrome hemolitico urémico o púrpura trombocitopenica. Hay disponibles sistemas comerciales que permiten la identificación de £ co//0157:H7 y la detección de algunos tipos de toxinas en los cultivos o en muestras de heces; sin embargo, la realización de estas pruebas es llevada a cabo, generalmente, por los laboratorios de referencia.
Las cepas 01 de Vibrio cholerae productoras de toxina colérica son responsables de las epidemias de cólera, enfermedad que se caracteriza por una masiva pérdida de líquidos a nivel del intestino y que provoca deshidratación en el paciente. La toxina colérica ejerce su acción uniéndose a la enzima adenilato ciclasa de las células del epitelio de la mucosa del intestino delgado causando su activación, lo que trae como consecuencia una hipersecreción de agua y electrólitos (Kaper, 1995). Las cepas no-01 de V. cholerae causan una gastroenteritis autolimitada y no provocan epidemias de la enfermedad. Prácticamente ninguna de las cepas no-01 de V. cholerae produce toxina colérica, aunque sí que sintetizan dos tipos de hemolismas y una enterotoxina termoestable.
Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de las enterobacterias a diversos agentes antimicrobianos es muy variable debido tanto a factores intrínsecos como a mecanismos de resistencia adquiridos. La resistencia intrínseca es el resultado de rasgos genéticos que han aparecido evo-
Las especies V mimicus y V. parahaemolyticus causan gastroenteritis primariamente. La patogenicidad en el caso de V. parahaemolyticus parece estar relacionada más con el carácter invasivo de esta especie que con la producción de enterotoxinas. Más del 95% de cepas de V. parahaemolyticus ais-
Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las especies del género. Vibrio vulniticus causa la patología más grave. Las infecciones de las heridas y la septicemia debidas a esta bacteria son. a menudo, mortales. La enfermedad está asociada con el consumo de ostras crudas o con heridas producidas al manipular ostras. En los casos graves casi siempre existe una afección hepática subyacente. Una función hepática disminuida provoca un aumento en la concentración de hierro utilizable por el microorganismo, lo que facilita su crecimiento,
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
ladas de pacientes con gastroenteritis producen una hemohsina exocelular que es letal para el ratón cuando se le inyecta en dosis elevadas, lo que se conoce con el nombre de fenómeno de Kanagawa. Esta bacteria halófila está ampliamente distribuida en las aguas marinas, contaminando a pescados y mariscos. Los brotes de diarrea aguda tras la ingestión de pescado crudo han sido particularmente frecuentes en Japón, pero también se han producido en EE.UU. y otros países. Diagnóstico de laboratorio. Aunque antiguamente la preocupación sólo afectaba a los viajeros de EE.UU. que iban a áreas endémicas, recientemente se han detectado casos de enfermedad causada por V. cholerae en este pais asociados a la ingestión de mariscos contaminados procedentes de la costa del golfo de México. Además, se han descrito casos de gastroenteritis por V. parahaemolyticus y otras especies halófilas del género Vibrio presentes en mariscos contaminados en muchas regiones del país, especialmente en zonas costeras. Por consiguiente, es importante que los laboratorios clínicos tengan la capacidad para realizar coprocultivos para el aislamiento de especies de Vibrio cuando esté indicado, en función del historial (viajes realizados, alimentos consumidos) de la persona sobre la que existe la sospecha de que esté sufriendo infecciones de este tipo. Con la excepción de V. cholerae y V mimicus, el crecimiento de los vibrios requiere que los medios de cultivo contengan NaCI. La mayor parte de medios de cultivo sólidos y líquidos utilizados habitualmente para el cultivo de bacterias contienen sodio suficiente, por lo que no es necesario utilizar medios especíales en esos casos. Los medios selectivos que contienen sacarosa, como el agar con tiosulfato, citralo y sales biliares (agar TCBS). son de gran utilidad para el cultivo de Vibrio spp. a partir de muestras de heces. Algunas especies (V. cholerae y V. alginolyticus) son capaces de fermentar la sacarosa y forman colonias de color amarillo en ese medio. Puede utilizarse un medio de enriquecimiento como el agua de peptona alcalina antes de realizar la inoculación en medio sólido selectivo, con objeto de aumentar las posibilidades de recuperación de las especies de Vibrio a partir de muestras de heces. Los miembros del género pueden diferenciarse entre ellos y de otros bacilos intestinales gramnegativos según las características bioquímicas que se muestran en la Tabla 50-11. En el caso de los vibrios halófilos puede ser necesario utilizar medios que contengan entre un 1% y un 3% de NaCI para llevar a cabo las pruebas pertinentes. Si se inoculan placas con agar TSI (agar triple azúcar-hierro) y agar LIA (agar lisina-hierro) con finalidad analítica, las reacciones observadas deben ser pendiente ácida/fondo ácido sin gas (A/A) o con formación de H S, y pendiente alcalina/fondo alcalino (K/K), respectivamente. No todos los sistemas comerciales existentes para la identificación de bacterias gramnegativas son seguros para llevar a cabo la identificación de las especies del género Vibrio, y sólo deben utilizarse cuando se ha comprobado previamente su Habilidad ?
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos pueden realizarse mediante el método de difusión en disco, utilizando agar Mueller-Hinton. El National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha establecido los patrones de referencia para interpretar los resultados de las pruebas de sensibilidad de V. cholerae frente a la ampicilina. la tetraciclina, el trimetoprim-sulfametoxazol. el cloranlenicol y las sullonamidas (NCCLS. 2000a). No existen patrones de referencia para las otras especies del género.
Aeromonas Características. Las especies de este género son bacterias gramnegativas de morfología bacilar, oxidasa y catalasa positivas, y anaerobias facultativas. Generalmente son móviles por medio de flagelos polares, aunque algunas especies son inmóviles. Producen ácidos a partir de los carbohidratos, tanto por via oxidativa como fermentativa, y reducen los nitratos a nitritos. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Aeromonas se encuentran presentes en hábitats acuáticos principalmente. Se han aislado a partir del agua potable, agua de ríos, suelo y varios tipos de alimentos, y sólo raramente de ambientes marinos. Estos microorganismos se han asociado con infecciones intestinales y extraintestinales. Aunque no existe una evidencia definitiva que demuestre el papel de las Aeromonas en las infecciones gastrointestinales, la presencia de especies de Aeromonas en muestras de heces se asocia más con un proceso diarreico que con un estado de portador asintomático. La diarrea se asocia con la capacidad que tienen algunas cepas
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para producir una enterotoxina. También se ha descnto una hemolisina y un factor citopático. Las especies de Aeromonas también causan infecciones de heridas traumáticas, diarrea o septicemia en pacientes inmunocomprometidos (Janda, 1991.1994). Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos. termentadores y oxidasa positivos, sugiere fuertemente la posibilidad de que se trate de una especie de Aeromonas. Estos microorganismos crecen fácilmente en los medios de cultivo convencionales, lormando colonias que recuerdan a las que producen las especies del género Pseudomonas. con un color verdoso semejante al del vidrio triturado y un olor afrulado. La mayor parte de especies son [i-hemoliticas cuando crecen en agar sangre. El aislamiento de aeromonas a partir de muestras de heces se facilita si se utiliza agar sangre con ampicilina o medio CIN (agar cefsulodina-irgasán-novobiocina). Sensibilidad a los antimicrobíanos. Las Aeromonas son sensibles a las quinolonas. las cefalosporinas de tercera generación, los aminoglucósidos, el cloranfenicol y las tetraciclinas, aunque producen una |Wactamasa que es responsable de la resistencia a las penicilinas y las cefalosponnas de primera generación. Se ha comprobado que las Aeromonas albergan plásmidos R tanto de enterobacterias como de Pseudomonas spp. Los sistemas comerciales rápidos para las pruebas de sensibilidad pueden no ser liables para este grupo de bacterias, por lo que se recomienda el método de difusión en disco.
Plesiomonas Características. Plesiomonas shigelloses, la única especie comprendida dentro del género Plesiomonas. es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, oxidasa y catalasa positivo, que fermenta la glucosa. Las últimas evidencias obtenidas mediante técnicas de genética molecular indican que el género Plesiomonas está estrechamente relacionado con el género Proteus de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones clínicas y patogenia. P shigelloses se encuentra en ambientes acuáticos, con una distribución geográfica limitada por la temperatura mínima de crecimiento de la bacteria, que es 8 C. El microorganismo puede aislarse a partir de aguas dulces y de estuario en países tropicales, y provoca gastroenteritis, a menudo tras la ingestión de mansco crudo. Las heces diarreicas contienen, frecuentemente, leucocitos polimorionucleares y hematíes, aunque los individuos infectados también pueden padecer una enfermedad similar al cólera. La gastroententis puede aparecer en casos esporádicos o en forma de epidemias. Las formas extraintestinales de la infección por P shigelloides incluyen meningitis, septicemia, celulitis, artritis y endoftalmitis. Se sabe relativamente poco sobre los factores de virulencia asociados a esta especie bacteriana. P shigelloides parece tener carácter invasivo, y algunas investigaciones sugieren la existencia de una actividad enterotoxigémca (Brenden, 1988). Diagnóstico de laboratorio. P. shigelloides puede aislarse en diversos medios de cultivo no selectivos y selectivos para enterobacterias, incluyendo el agar HE. La producción de ácidos a partir de la lactosa tiene carácter variable, aunque por lo general esta bacteria aparece como no termentadora de la lactosa cuando crece en medios selectivos para bactenas entéricas. Entre otras caracteristicas bioquímicas se pueden citar las siguientes; es indcJ positiva, reduce los nitratos a nitritos, produce catalasa, da positiva la prueba del rojo de metilo y fermenta la glucosa, la maltosa y la trehalosa (Brenden, 1988). Sensibilidad a los antimicrobianos. P. shigelloides es sensible a una gran variedad de antibióticos, incluidos aminoglucósidos, trimetoprim-sulfametoxazol. cloranfenicol. tetraciclinas y quinolonas. La sensibilidad a las penicilinas es variable debido a la producción de una |i-lactamasa similar a la de Aeromonas spp
Campylobacter Características. Los miembros del género Campylobacter son bacterias gramnegativas de pequeño tamaño (0.5 pm -8 pm de largo por 0.2 iim-0,5 pm de ancho), curvadas (en forma de coma o de letra S). móviles y no formadoras de esporas, con un crecimiento óptimo en una atmósfera que contenga entre un 5% y un 10% de oxigeno solamente, razón por la que estas bactenas se consideran microaerófilas. Campylobacter je/uni es la causa más común de enteritis bacteriana en los EE.UU. Otras especies del género asociadas con esta patología son C. coli. C. tari y C upsaliensis. C. letus subespecie fetus causa tromboflebitis séptica, artritis, peritonitis, abscesos y pericarditis (Penner, 1988), especialmente en personas con enfermedades crónicas subyacentes.
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Manifestaciones clínicas y patogenia. C. jejuni se encuentra distribuido por todo el mundo, formando parte de la microbiota del tubo digestivo de animales salvajes y domésticos (ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos y aves de corral, como pavos y pollos). Es la causa más común de enteritis bacteriana en EE.UU.. con una incidencia estimada de 1.000 casos por cada 100.000 individuos. La incidencia de la infección es similar en el Remo Unido y en otros países desarrollados, mientras que en los países subdesarrollados es incluso más elevada. Las infecciones tienen lugar, generalmente, durante el verano y el otoño y normalmente son consecuencia de la ingestión de alimentos mal cocinados, en especial carne de pollo y otras aves de corral. También se han asociado algunos brotes de enteritis por C. jejuni al consumo de leche y a fallos en los sistemas municipales de potabilización de aguas. La infección puede ser desde asintomática hasta muy grave. Las heces diarreicas pueden indistintamente contener o no sangre y leucocitos. Los síntomas pueden durar hasta una semana y generalmente son autolimitados. También pueden producirse infecciones extramtestmales como bacteriemia. artritis reactiva, infecciones de las vías urinarias y meningitis. C. ¡ejuni también está reconocido como la causa antecedente del síndrome de Guillain-Barré. La capacidad patogénica de esta bacteria no está totalmente esclarecida: parece que primero coloniza la mucosa intestinal y luego es capaz de atravesar la superficie epitelial para alcanzar los tejidos subyacentes. El habitat principal de C. telus subesp. lelus es el intestino de ovejas y ganado vacuno, aunque también puede encontrarse en el tracto genital de estos animales, en sus placentas, en el contenido gástrico de los fetos abortados y, con menor frecuencia, en otros animales y en aves. Los mecanismos de transmisión al hombre no están plenamente caracterizados. El contacto directo con animales infectados es una posible causa de contagio, aunque menos de un tercio de individuos infectados tienen un historial de riesgo a la exposición por razones profesionales o ambientales. Los alimentos y las aguas contaminadas pueden ser un vehículo para la infección en humanos, aunque también ésta puede producirse a partir de una fuente endógena. Diagnóstico de laboratorio. Una única muestra de heces es apropiada, generalmente, para detectar patógenos intestinales, incluyendo las especies de Campylobacter. El examen de la muestra en busca de leucocitos fecales no está recomendado porque sólo aparecen en menos de un 25% de los casos. Está disponible un enzimoinmunoensayo (EIA) para la detección de antígenos de C. jejuni y C. coli directamente en las muestras de heces. Pueden utilizarse diferente medios para el aislamiento selectivo de las especies de Campylobacter. como agar carbón vegetal-cefoperazona-desoxicolato, medio selectivo con carbón vegetal, medio semisólido sin sangre (para movilidad), medio de Skirrow y agar Campylobacter con un 5% de sangre de oveja y cinco antimicrobianos (cefalotina, tnmetoprim. vancomicina. polimixina B y anfotericma B). La mayor parte de especies necesitan una atmósfera de incubación microaerófila (5% de 0 , 10% de CO, y 85% de N,). que puede conseguirse mediante sistemas generadores de gases disponibles comercialmente, La cantidad de oxígeno existente en una jarra con vela es demasiado baja para permitir el crecimiento de Campylobacter spp.. por lo que no debe utilizarse. La incubación de los medios a 42' C incrementa la selectividad para C. jejuni. 2
Si se sospecha la presencia de Campylobacter spp. en un hemocultivo basándose en el historial clínico o en la apariencia del microorganismo observado bajo tinción de Gram. el caldo debe ser subcultivado en un agar sangre no selectivo, que se incubará a 37 C en una atmósfera microaerofilica. En general, las colonias de Campylobacter spp. son de color gris, planas, irregulares y extensas, que pueden convertirse en redondas, convexas y relucientes a medida que la humedad del medio va disminuyendo. La observación de la morfología típica bajo tinción de Gram y una prueba positiva de la oxidasa a partir de una colonia crecida en un medio selectivo a 42'C son evidencias suficientes para identificar a un aislamiento como una especie de Campylobacter. C. jejuni es capaz de hidrolizar el hipurato y es sensible al ácido nalidíxico y resistente a la cefalotina. C. coli no hidrolíza el hipurato. Las cepas de C. fetus subesp. ietus son resistentes al ácido nalidíxico, son incapaces de hidrolizar el hipurato y no crecen generalmente a 42°C. Sensibilidad a los antimicrobianos. C jejuni tiene una sensibilidad variable a los agentes antimicrobianos. La mayor parte de especies no son sensibles a las penicilinas y las cefalosporinas. En el caso de infección intestinal, la eritromicina es el antibiótico de elección, con las quinolonas como opción alternativa, aunque se han detectado resistencias frente a ambos
agentes. No existen hasta el momento métodos estandarizados para llevar a cabo las pruebas de sensibilidad en este grupo de microorganismos.
Helicobacter Características. Las especies del género Helicobacter son bacilos gramnegativos curvados o en espiral, no esporulados. que miden entre 0,3 um-1.0 iim de ancho y 1.5 Lim-10 iim de largo. Son móviles por medio de múltiples flagelos localizados en ambos polos de la bacteria o de un único flagelo monopolar, microaerofílicas y tienen metabolismo respiratorio. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Helicobaterse encuentran en el Irado gastrointestinal de los mamíferos y las aves. La transmisión entre hospedadores es por vía oral u oro-fecal. Helicobacterpylori está considerado como una de las especies "gástricas" del género. Esta bacteria vive dentro de la capa mucosa del estómago adyacente al epitelio o inmediatamente por debajo de la misma. También se encuentra transitoriamente en el duodeno, en la saliva y en las heces. La infección por H. pylon puede provocar los síntomas de una gastritis aguda. La mayor parte de pacientes infectados desarrollan una gastritis crónica activa que puede conducir a una dispepsia no ulcerosa o a una úlcera duodenal. Esta especie se ha asociado con el 90% de los casos de úlcera duodenal y con la práctica totalidad de los de úlcera gástrica. La infección por H. pylori también se ha relacionado con el carcinoma y el lintoma gástricos (Murray, 1993: Parsonnet, 1991,1994). La prevalencia de la gastritis asociada a la infección por H. pylon aumenta con la edad, lo que sugiere que el microorganismo se adquiere a medida que la gente envejece, Las especies "intestinales" del género, tales como Helicobacter (antiguamente Campylobacter) cmaedi y H. lenelliae. han sido implicadas en casos de gastroenteritis. Estos microorganismos invaden raramente el torrente circulatorio, pudiendo ser aislados entonces mediante hemocultivo. Diagnóstico de laboratorio. Los métodos no basados en el cultivo bacteriano se han utilizado clásicamente para el diagnóstico de las infecciones causadas por H. pylori. Uno de estos métodos se basa en la detección de urea en el aliento. Esta técnica no invasiva detecta la actividad uteásica de H. pylori midiendo el CO etiquetado con C o C que se desprende en el aire expelido por el paciente al que se le ha administrado previamente urea marcada radiactivamente. Los métodos serológicos también se utilizan ampliamente en los pacientes sintomáticos para detectar anticuerpos frente a H. pylon. En algunos casos pueden obtenerse por biopsia muestras de tejido afectado que se examinan histológicamente mediante tinción con hematoxilina y eosina o por la técnica de Gíemsa. para detectar la presencia de bacterias con la morfología típica de H. pylon. Debido a que el microorganismo hidrolíza la urea muy rápidamente, una alícuota de la biopsia de tejido gástrico debe incubarse directamente en caldo urea o en placas con agar urea, para detectar la hidrólisis de la urea entre 1 y 24 horas después. Desde hace poco tiempo, se encuentra disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para la detección de antígenos de H. pylon en heces, que augura ser una alternativa muy prometedora para el diagnóslico no invasivo de las infecciones causadas por esta bacteria. M
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Para el cultivo, las muestras de tejidos deben mantenerse a 4 C y ser procesadas antes de que transcurran dos horas tras su recolección. Como medios de transporte pueden utilizarse diferentes alternativas, como el caldo Brucella con un 20% de glicerol, el medio Albemí con cisteína y un 20% de glicerol. solución salina isotómca con un 4% de glucosa y el medio de transporte de Stuart. Las muestras procesadas deben inocularse en alguno de los medios apropiados, entre los que se encuentran el caldo infusión de cerebro y corazón, agar Brucella. agar Columbia y medio de Skirrow enriquecido con sangre o suero de caballo, o con sangre de oveja. Se recomienda que los medios contengan vancomicina, anfolencina y cefsulodina como agentes selectivos, Una vez inoculados, los medios deben incubarse en una atmósfera microaerofilica (5%-10% de CO.„ 80%-90% de N y 5%-10% de 0 ). con humedad elevada, a 35 C. durante 5-7 días. La presencia de H (5%-8%) en la atmósfera de incubación favorece el crecimiento de H. pylon. 2
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Por lo general, en los medios antenormente mencionados. H. pylori óa lugar a colonias pequeñas, de color gris y translúcidas, formadas por bacilos espirales gramnegatívos. cuando se observan en extensiones teñidas por el método de Gram, y que dan positivas las pruebas de la oxídasa, la catalasa y la ureasa. Generalmente no se lleva a cabo el aislamiento de las especies intestinales de Helicobacter a partir de heces. Las diferentes especies del género pueden
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
crecer y delectarse en los sistemas automatizados para hemocultivo que se emplean en muchos laboratorios, aunque en este caso puede ser necesano prolongar el período de incubación más allá de los cinco días estándar. Sensibilidad a los antimicrobianos. Para el tratamiento de las infecciones causadas por H. pylori se utilizan regímenes de administración combinada de antibióticos, que incluyen, usualmente. dos antibióticos (metronidazol. clantromicina, tetraciclina o amoxicilina) y un medicamento antiácido. Se ha descrito la existencia de cepas que son resistentes al metronidazol y a la claritromicina. Para realizar las pruebas de sensibilidad, el NCCLS recomienda el método de dilución en agar, empleando agar Mueller-Hinton enriquecido con un 5% de sangre de oveja (NCCLS, 2000b).
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que producen las bacterias de este grupo. Las reacciones se detectan usualmente al cabo de 48 horas, aunque en algunos casos puede ser necesario prolongar la incubación hasta siete días. Sensibilidad a los antimicrobianos. Como regla general, las pruebas de sensibilidad deben realizarse con todos los aislamientos de P. aeruginosa con significado clínico. Esto es especialmente importante en el caso de cepas hospitalarias, que pueden ser resistentes frente a uno o incluso todos los agentes antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones Entre éstos se incluyen los aminoglucósidos, las carboxi- y ureidopenicilinas, la celtacidima o cefepima y las quinolonas.
Burkholderia y Stenotrophomonas Pseudomonas Características. El género Pseudomonas ha experimentado una profunda revisión y en la actualidad muchas de las especies que habían sido inicialmenle clasificadas dentro de este género han sido reclasificadas dentro de los géneros Burkholderia. Slenolrophomonas, Comamonas, Shewanella. Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas. Acidovorax y Brevundimonas. Entre las especies que permanecen dentro del género Pseudomonas. P. aerugmosa es la que tiene mayor importancia como patógeno del hombre. Las pseudomonas son bacilos gramnegativos. aerobios estrictos, catalasa y oxidasa positivos. Su metabolismo es estrictamente respiratorio (oxidativo), nunca fermentativo, utilizando el oxígeno como el aceplor final de electrones. Algunas especies son móviles por medio de flagelos polares. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies del género Pseudomonas se encuentran distribuidas en ambientes húmedos. Algunos de los habitat más inusuales en donde se pueden encontrar estas bacterias incluyen los productos cosméticos, el agua de las piscinas y jacuzzis. y la parte interior de la suela de las zapatillas. En este último caso, esta es la fuente a partir de la que pueden infectarse con P. aeruginosa pequeñas heridas punzantes en la planta de los pies. La especie del género responsable de la mayor morbilidad y mortalidad hoy en día es P. aeruginosa. Aunque otras especies del género se aislan a menudo a partir de especímenes clínicos, sólo están implicadas ocasionalmente en infecciones en el hombre. P. aeruginosa es ubicua en el ambiente hospitalario, encontrándose presente en casi cualquier lugar en el que haya humedad, incluyendo equipos médicos, soluciones desinfectantes y jabones. Se encuentra muy raramente lormando parte de la microbiota normal en las personas sanas, pero en los individuos hospitalizados la lasa de colonización se incrementa de forma proporcional a la duración del período de hospitalización. P. aeruginosa puede producir infecciones graves en pacientes con quemaduras, que tienen heridas traumáticas o quirúrgicas, que han sufrido manipulaciones en sus vías urinarias, que tienen enfermedades en los sistemas hematopoyético. reticuloendotelial y linfático, y en todos aquellos que tienen problemas en sus defensas inmunológicas de tipo humoral o celular. Las infecciones pulmonares causadas por estos microorganismos aparecen primariamente en pacientes con fibrosis quistica La tasa de mortalidad más elevada se da en individuos con leucopenia grave (<1.000 leucocitos neutrófilos polimorfonucleares [PMN] por mnr). P. aeruginosa sintetiza un polisacárido mucoso, una endotoxina y varias proteasas que inactivan los componentes del complemento, lo que conlleva una cierta inhibición de la opsonización y de la respuesta inflamatoria, contribuyendo a la invasividad del microorganismo. La exotoxina A causa daño celular, favorece la invasión de los tejidos y es tóxica para los macrófagos. Diagnóstico de laboratorio. A menudo es posible sospechar la presencia de P. aeruginosa en los cultivos por el olor a uvas y a humedad (o a tortilla de maíz) de los mismos, el aspecto rugoso o de polvo de cristal de sus colonias y la presencia de pigmentos o de un brillo metálico en las mismas. Su identificación se puede llevar a cabo fácilmente determinando la prueba de la oxidasa (P. aeruginosa es oxidasa positiva), una reacción pendiente alcalina/fondo neutro en agar TSI, la capacidad para crecer a 42"C y la formación de brillo metálico y/o de pigmento en la pendiente de los tubos con agar TSI o agar P para Pseudomonas. Otras características que pueden determinarse adicionalmente se indican en la Tabla 50-12. Las pruebas de utilización de los carbohidratos deben realizarse en el medio basal para la delerminación del metabolismo óxido-fermentativo (O-F), que contiene una cantidad mínima de peptona (fuente de nitrógeno) y una concentración relativamente elevada de carbohidrato, y que permite la detección de las cantidades muy pequeñas de ácidos
Características. Las pseudomonas fueron inicialmente divididas en cinco grupos en función de los datos de homología de sus ácidos ribonucleicos (ARN). Estudios taxonómicos recientes han dado como resultado una reclasificación de los microorganismos incluidos en cuatro de esos cinco grupos en varios géneros nuevos: Burkholderia, Slenolrophomonas. Ralstonia, Brevundimonas. Comamonas y Acidovorax. Todas estas bacterias son grampositivas, tienen morfología bacilar, no forman esporas, son aerobias estrictas y, con la excepción de Burkholderia mallei. son móviles mediante flagelos polares. Son catalasa positivas y la mayor parte de especies son también oxidasa positivas. En agar MacConkey estas bacterias no fermentan la lactosa. Importancia clínica y patogenia. Estos microorganismos se encuentran en las aguas, el suelo y las plantas. Debido a su predilección por los ambientes en donde existe humedad, algunos de ellos pueden encontrarse en entornos hospitalarios y tienen la capacidad potencial para producir infecciones nosocomiales. Dos especies patógenas de importancia dentro del género Burkholderia son Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia. B. pseudomallei infecta por inhalación o a través de heridas o abrasiones en la piel, causando la enfermedad denominada melioidosis. La infección puede ser asintomática. hacerse crónica o provocar una sepsis fulminante. La melioidosis tiene una mayor prevalencia en el sudeste asiático y en Australia, aunque también se dan casos en otros ambientes tropicales y subtropicales. Burkholderia cepacia. un patógeno nosocomial que se encuentra en equipos contaminados, medicinas y desinfectantes, puede causar bacteriemia. infecciones de las vías urinarias, artritis séptica e infecciones respiratorias. También es un patógeno importante en los pacientes con fibrosis quistica o con enfermedad granulomatosa crónica. Los enfermos de fibrosis quistica con infección crónica por este microorganismo tienen una tasa de supervivencia más baja. Stenotrophomonas maltophilia es un patógeno nosocomial importante. Los factores de riesgo que incrementan las posibilidades de colonización o de infección por este microorganismo son la respiración asistida, la terapia con antibióticos de amplio espectro, la cateterización y el estado de neutropenia. Las especies de los géneros Ralstonia. Brevundimonas. Comamonas y Acidovorax se aislan con muy poca frecuencia a partir de las muestras clínicas. Diagnóstico de laboratorio. Las especies de estos géneros crecen bien en los medios de cultivo estándar, como agar sangre y agar chocolate. El aislamiento de B. cepacia a partir de especímenes contaminados, como el esputo, puede facilitarse utilizando medios selectivos, como agar PC (Pseudomonas cepacia). agar base para metabolismo óxido-fermentativo, con polimixina B. bacitracina y lactosa (agar OFBL). y agar selectivo para B. cepacia (agar BCSA) Son necesarias una amplia variedad de pruebas bioquímicas para poder distinguir cada una de estas especies. Una prueba bioquímica importante para diferenciar a S. maltophilia es la prueba de la oxidasa, que es negativa para esta especie. Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de estos microorganismos a los agentes antimicrobianos varia considerablemente. B. cepacia es muy resistente a un gran número de antimicrobianos, aunque normalmente es sensible a la piperacilina, azlocilina. cefoperaxona. ceftacidima, cloranfenicol y trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas aisladas a partir de pacientes con fibrosis quistica que han recibido sesiones de tratamiento con antibióticos repetidas son probablemente resistentes a los antibióticos empleados. S. maltophilia es intrínsecamente resistente a muchos antibióticos El trimetoprim-sulfametoxazol es el antibiótico de elección, aunque las infecciones graves pueden necesitar un tratamiento combinado con diferentes agentes
Tabla 50-12
Características diferenciales de las p s e u d o m o n a d á c e a s aisladas de muestras clínicas
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
antimicrobianos. No existen métodos estándar para la realización be las pruebas de sensibilidad para este microorganismo, por lo que es difícil obtener resultados precisos y reprodúceles.
Acinetobacíer Características. Los microorganismos de este género son gramnegativos, tienen morfología bacilar, a veces casi cocácea, y son inmóviles, oxidasa negativos y aerobios estrictos. En los frotis teñidos por el método de Gram aparecen a menudo dispuestos en parejas y pueden ser difíciles de decolorar. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies del género Acinetobacter se encuentran habitualmente en el suelo y en las aguas, y con mucha menor frecuencia en la piel y mucosas de las personas sanas. Es escasa la información sobre los factores de virulencia asociados a este grupo de microorganismos, aunque parecen producir endotoxina en pequeñas cantidades. Aunque son usualmente no patógenas, estas bacterias han sido asociadas, cada vez con una mayor frecuencia, con septicemia, neumonía, bacteriuria e infección de las heridas en el entorno hospitalario. Diagnóstico de laboratorio. Las especies de Acinetobacter pueden distinguirse fácilmente de otras bacterias del grupo de las pseudomonas en base a su inmovilidad, su incapacidad para reducir los nitratos y dar negativa la reacción de la oxidasa. Puede ser difícil llevar a cabo la diferenciación de las especies que oxidan la glucosa: estos aislamientos se agrupan dentro del denominado complejo A calcoacelicus-baumannii(Gerner-Smidt, 1991) La mayor parte de aislamientos glucosa-negativos y no hemolíticos corresponden a la especie A. Iwotfi. mientras que los hemolíticos se identifican como A haemolyticus. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las especies de este género son resistentes a la mayor parte de los antibióticos |i-lactámicos y ammoglucósidos existentes. La resistencia a los aminoglucósidos está determinada por acetil-. adenil- y fosfotransferasas codificadas por plásmidos Las especies de Acinetobacter son sensibles a doxiciclma. trimetoprim-sulfametoxazol. quinolonas, ureidopenicilinas, imipenem, ampicilina-sulbactam y ceftacidima. Las pruebas de sensibilidad deben llevarse a cabo con todos los aislamientos que tengan interés clínico.
Actinobacillus Características. Actinobacillus actinomycetemcomitans es una bacteria gramnegativa, no formadora de esporas y con morfología cocobacilar (bacilos cortos). Crece tanto en condiciones aerobias como anaerobias. La presencia de C0 (entre un 5% y un 10%) en la atmósfera de incubación favorece su crecimiento. Las colonias aparecen lentamente en agar sangre y son de pequeño tamaño. ?
Manifestaciones clínicas y patogenia. Estas bacterias se encuentran en la mucosa de las vías respiratorias y del tracto genitourinario de los animales y el hombre. Generalmente sólo causan infecciones en individuos inmunodeprimidos o cuando penetran accidentalmente en un tejido sano a través de una herida traumática. A. actinomycetemcomitans tiene un bajo poder patógeno. Su nombre deriva del hecho de que se encuentra frecuente-
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mente asociada con las lesiones actinomicóticas. Sin embargo, en los últimos años esta bacteria ha sido identificada, cada vez con mayor frecuencia, como agente causal de endocarditis bacteriana subaguda. periodontitis y abscesos cerebrales, habiéndose caracterizado dos factores de virulencia en la misma: una leucotoxina y una colagenasa. Diagnóstico de laboratorio. A. actinomycetemcomitans crece bien en agar sangre y agar chocolate. Después de 24 a 72 horas de incubación, las colonias tienen entre 1 mm y 3 mm de diámetro con el centro arrugado. El microorganismo es catalasa, oxidasa y ureasa positivo. Deben realizarse pruebas bioquímicas adicionales para diferenciarlo de otros bacilos gramnegativos delicados, de crecimiento lento (véase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobianos. Este microorganismo es resistente a la penicilina, pero habitualmente es sensible a otros muchos antibióticos como cefalosporinas, combinaciones de un [5-lactámico con un inhibidor de |ilactamasas, fluoroquinolonas y tetracichnas.
Eikenella Características. Clasificados antiguamente como Bacteroides corrodens. los "bacilos corrosivos" anaerobios facultativos se han integrado en la especie Eikenella corrodens. que comprende microorganismos gramnegativos de morfología bacilar, oxidasa positivos, catalasa negativos, no fermentadores, cuyas colonias pueden corroer el agar o hacer agujeros en el mismo. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia de CO¿ (5%-10%) en la atmósfera de incubación y generalmente requiere la presencia de factor X en el medio de cultivo. Manifestaciones clínicas y patogenia. Poco se sabe acerca de los factores que contnbuyen a la virulencia del microorganismo, que tiene un bajo nivel de patogenicidad en los animales. E. corrodens se encuentra principalmente en la cavidad oral y se aisla con frecuencia de las vías respiratorias superiores. También se ha recuperado a partir de abscesos y otros tipos de infecciones en casi cualquier localización del cuerpo, puede invadir el torrente circulatorio y causar endocarditis. Los procesos infecciosos en los que está involucrado este microorganismo son generalmente mixtos (en combinación con otras bacterias). Diagnóstico de laboratorio. E. corrodens crece en agar sangre o chocolate, pero no en MacConkey. La característica más llamativa de los cultivos de esta bacteria son las excavaciones que aparecen en el agar como consecuencia del crecimiento de la misma, aunque la capacidad de lormar agujeros no es expresada por todas las cepas. Las colonias tardan en aparecer (entre dos y cuatro días) y por lo general son de pequeño tamaño (entre 0,5 mm y 1,0 mm de diámetro). Usualmente deben distinguirse de las que lorman otros bacilos gramnegativos delicados y de crecimiento lento (véase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobianos. E corrodens es sensible a las penicilinas, quinolonas y tetraciclinas. tiene una sensibilidad variable frente los aminoglucósidos y es resistente a la clindamicina y el metronidazol.
Legionella Características. Las especies del género Legionella son bacterias gramnegahvas de morfología bacilar, delgadas, no formadoras de esporas, que se
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
tiñen débilmente. Estas bacterias fueron identificadas por primera vez como agentes causales de infecciones en el hombre durante una epidemia de neumonía que afectó a los miembros de la Legión Americana de Pennsylvania, reunidos en 1976 en Filadelfia para celebrar el bicentenario de la asociación. En la actualidad, el género incluye más de 20 especies y un cierto número de especies a las que todavía no se ha asignado nombre. La mayoría de casos clínicos se deben a la especie Legionella pneumophila, serogrupo 1.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Los resultados de las pruebas de sensibilidad no se correlacionan necesariamente con la respuesta clínica al tratamiento; por tanto, no es necesario llevar a cabo dichas pruebas. La terapia se realiza, generalmente, mediante la administración de eritromicina y rifampicina. Otros agentes que también han sido utilizados son el trimetoprimsulfametoxazol, las quinolonas, la claritromicina y la azitromicína.
Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Legionella se encuentran en los entornos en los que existen niveles altos de humedad. La capacidad de estos microorganismos para multiplicarse en el interior de protozoos es, muy probablemente, un factor muy importante para garantizar la supervivencia de los mismas en el medio ambiente. La transmisión al ser humano tiene lugar a través de la exposición a aguas contaminadas de orígenes diferentes (p. ej.. las que fluyen de grifos, duchas y fuentes públicas). No se cree que exista transmisión de persona a persona o que la infección se pueda adquirir durante las manipulaciones de laboratorio.
Neisseria y Moraxella
Las infecciones pueden ser subclínicas, no neumónicas, neumónicas o extrapulmonares. Usualmente, la infección se manifiesta en forma de una neumonía aguda fibrinopurulenta, con distribución lobular. Histológicamente, se aprecia un infiltrado alveolar de neutrófilos y macrófagos acompañado por fibrina y extravasación de hematíes. Las legionelas pueden encontrarse en el interior de los macrófagos alveolares. L. pneumophila ha sido aislada también mediante hemocultivo. Diagnóstico de laboratorio. Las legionelas pueden aislarse en agar BCYE enriquecido con factores de crecimiento, entre los que se encuentran la L-cisteína, una sal férrica y el
Características. Estos géneros incluyen bacterias gramnegativas, aerobias, catalasa y oxidasa positivas e inmóviles, que presentan lorma cocácea, apareciendo a menudo los cocos asociados en parejas con los lados adyacentes aplanados, lo que da una apariencia de un riñon o de granos de calé (Lámina 50-5). Estos microorganismos son algo delicados, y en algunos casos necesitan que los medios de cultivo sean enriquecidos con sangre, suero, colesterol o ácido oleico para contrarrestar el efecto de algunas sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano que pueden estar presentes en los medios, como son los ácidos grasos. Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis deben incubarse rápidamente en una atmósfera que contenga CO, para que puedan ser aisladas: sin embargo, este requerimiento depende de la cepa de que se trate, varía con la fase de la curva de crecimiento en la que se encuentre el microorganismo y desaparece a menudo con el posterior subcultivo. N. meningitidis y la mayoría de cepas de N. gonorrhoeae no son inhibidas por diferentes agentes antimicrobianos, tales como vancomicina o lincomicina, colistina y nistatina, característica particularmente útil para el aislamiento selectivo de estas especies a partir de muestras donde existan otras bacterias. Algunos aislamientos de N. gonorrhoeae (en especial las cepas AUH, que necesitan arginina, uracilo e hipoxantina) son sensibles a la vancomicina. La posición taxonómica de Moraxella catarrhalis es objeto de estudio en la actualidad, habiéndose formulado la propuesta de que sea trasladada a su propio género. Branhamella. En la actualidad ambos nombres están en uso. Manifestaciones clínicas y patogenia. Aunque se ha descrito que otras especies del género Neisseria, distintas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae, pueden causar infecciones oportunistas en huéspedes inmunocomprometidos, por lo general estas especies no son patógenas. N. meningitidis puede colonizar las mucosas de las vías respiratorias superiores, un hecho que es seguido al cabo de unos 7 a 10 días por la formación de anticuerpos bactericidas y hemaglutinantes. que no eliminan el estado de portador pero confieren inmunidad específica de grupo. En unos pocos casos, la enfermedad aparece rápidamente tras la colonización en lorma de meningococemia y meningitis. El microorganismo también tiene tendencia a invadir las membranas serosas y los tejidos de las articulaciones, lo que conduce al desarrollo de pleuritis, pericarditis y artritis. Entre un 5% y un 15% de individuos sanos son portadores de Ai. meningitidis en su nasofaringe, porcentaje que puede ser más alto en grupos cerrados, como los soldados en los cuarteles. No ha podido establecerse una correlación directa entre porcentaje de portadores e incidencia de la enfermedad, con la única posible excepción de grupos familiares grandes o de hogares en los que ha habido un caso infantil durante epidemias de la enfermedad. También se han aislado meningococos a partir de muestras genitales, y aunque su significado clínico es desconocido en estos casos, pueden ser fácilmente identificados de forma incorrecta como gonococos salvo que se hagan las pruebas adecuadas para poder diferenciar las dos especies. El factor de virulencia más importante de N. meningitidis es un complejo endotoxina-polisacárido que en animales de experimentación activa la cascada de la coagulación, provocando el depósito de fibrina en los capilares (coagulación intravascular diseminada), hemorragias en las glándulas suprarrenales y en otros órganos y alterando la resistencia vascular periférica, lo que conduce al shock y a la muerte. Las manifestaciones clínicas y la patogenia de las infecciones gonocócicas difieren un poco de las observadas en el caso de la infección por N. meningitidis. Los tipos patogénicos (1 y 2) de N. gonorrhoeae se adhieren a distintos tipos de células humanas por medio de "pili", apéndices muy delgados distintos de los flagelos que no son producidos por las células de los tipos no patógenos (3 y 4). Estos "pili" que son antigénicamente heterogéneos, uno de los principales factores de virulencia en N. gonorrhoeae, pueden inhibir la fagocitosis e inducir la formación de anticuerpos específicos de cepa. Otros posibles factores de virulencia en N. gonorrhoeae están menos claramente definidos. Tanto N. gonorrhoeae como N. meningitidis producen una proteasa para IgA que puede jugar un papel
' La mayor parte de cepas sensibles a la vancomicina no crecen en agar Thayer-Martin Puede aparecer una reacción débilmente positiva en las pruebas rápidas para determinar la utilización de carbohidratos Biovar perllava. -». biovar flava. -. ' Algunas cepas son positivas y otras negativas • = >90% de cepas positivas: - = >90% de cepas negativas: D = variable 1
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
importante en la patogenia, ya que las IgA son la clase de anticuerpo que predomina en las secreciones de las membranas mucosas. Moraxella catarrhalis puede encontrarse en la orofaringe de niños y adultos sanos. Es una bacteria encapsulada que también posee ''pili" que se prolongan más allá de la membrana externa de la pared celular y que desempeñan el papel de adhesinas. Las infecciones que causa con mayor frecuencia son bronquitis, otitis, sinusitis y neumonía (especialmente en el caso de personas con una enfermedad pulmonar crónica subyacente) (Catlin, 1990). M. catarrhalis también causa, aunque con mucha menor frecuencia, bacteriemia, endocarditis, meningitis, infecciones urogenitales y oflalmia neonatorum. Diagnóstico de laboratorio. Los aspectos más importantes en el diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae son la elección del espécimen clínico adecuado y su recogida y transporte hasta el laboratorio en condiciones apropiadas (véase Cap. 57). Las cepas patógenas del género Neisseria son sensibles a la desecación y las temperaturas extremas, por lo que las muestras deben cultivarse rápidamente para incrementar las posibilidades de recuperación. Son bacterias mesófilas y crecen mal. si es que lo hacen, a temperatura ambiente. Muchas de ellas necesitan ser incubadas con prontitud en una atmósfera con C0 (2%-8%) para su aislamiento inicial. Los medios basados en el agar chocolate son adecuados para su cultivo y deben contener una mezcla de diferentes antibióticos (p. ej., vancomicina o lincomicina. y colistina. nistatina o anisomicina y trimetoprim) si el aislamiento ha de llevarse a cabo a partir de muestras contaminadas con microbiota autóctona. Los gonococos sensibles a vancomicina deben ser cultivados en un medio que contenga lincomicma; sin embargo, teniendo en cuenta el efecto sinérgico entre la lincomicina y el trimetoprim, este último debe suprimirse en los medios que contengan la primera. Lo ideal es llevar a cabo la inoculación directa en la misma cabecera de la cama del enfermo e incubar las placas inmediatamente a 35°C en una atmósfera con CO,. Si alguno de estos cultivos tiene que ser enviado a un laboratorio de referencia para su análisis, ha de incubarse primero durante la noche para asegurar el crecimiento de los microorganismos. 2
Un aislamiento obtenido a partir de un espécimen urogenital, que forme colonias con aspecto típico en un medio selectivo, puede ser identificado presuntivamente como N. gonorrhoeae en base a los resultados de la observación microscópica bajo tinción de Gram y de las pruebas de la oxidasa y la catalasa. La observación al microscopio de los frotis preparados a partir de las colonias sospechosas, teñidos por el método de Gram, debe revelar la presencia de diplococos gramnegativos con la morfología característica, aunque los microorganismos también pueden aparecer formando tetradas, especialmente en los cultivos jóvenes. Todas las especies del género Neisseria son oxidasa positivas y todas, con la excepción de fV. elongata. son catalasa positivas. Debido a que es posible recuperar otras especies del género, al margen de N. gonorrhoeae, a partir de tracto genitourinario, es de la mayor importancia realizar pruebas confirmatorias de la identificación, preferiblemente mediante más de un procedimiento, en especial en el caso de muestras extragenitales o cuando exista la sospecha de un caso de abuso sexual. La confirmación de N. gonorrhoeae y la identificación de otras especies del género Neisseria y de M. catarrhalis se basa en sus características bioquímicas y de crecimiento (Tabla 50-14) (Knapp, 1988). El método de identificación estándar es la detección de la formación de ácidos a partir de azúcares en un medio base (agar cisteína-tripticasa de soja; medio CTA) y otras pruebas bioquímicas convencionales. Sin embargo, dados los inconvenientes de los métodos tradicionales, hoy en día se utilizan en muchos laboratorios sistemas de identilicación más rápidos. También hay disponibles procedimientos para la detección directa de N. gonorrhoeae y N. meningitidis en las muestras clínicas. En principio, el tipado de los aislamientos de ambas especies se lleva a cabo en estudios con un propósito epidemiológico. En el método estándar de identificación, se analiza la producción de ácido a partir de glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa en medio CTA, comparando los resultados frente a los de un tubo control con medio de cultivo sin carbohidrato. Una vez inoculados, los tubos se incuban a 35°C-37"C en ambiente aeróbico y se examinan a intervalos de 24 horas hasta que los resultados sean interpretables, o al cabo de 72 horas. Los resultados esperables para las especies de Neisseria y para M. catarrhalis se muestran en la Tabla 50-14. Sin embargo, de manera ocasional, un aislamiento de N. meningitidis puede producir reacciones anómalas; glucosa y maltosa negativas y ausencia de actividad sacarolítica. Si de todos modos en estos casos existe la fuerte sospecha de que pueda tra-
tarse de N. meningitidis, debe confirmarse la identificación mediante un ensayo de aglutinación en portaobjetos, utilizando una mezcla de anticuerpos polivalentes frente a los diferentes serogrupos o anticuerpos individuales para cada uno de ellos. Además de las pruebas convencionales de degradación de carbohidratos, debe determinarse también la reducción de los nitratos a nitritos y la producción de ADNsa. Esta última es particularmente útil para la identificación de M. catarrhalis. que es ADNsa positivo, mientras que las especies de Neisseria dan negativa esta prueba. Los inconvenientes de los métodos convencionales son la necesidad de tener que emplear inóculos densos de cullivos puros, los largos tiempos de espera y la incapacidad de algunas especies delicadas de N. gonorrhoeae para crecer en el medio base utilizado. Algunos sistemas comerciales pueden detectar la formación de ácido a partir de los carbohidratos en un tiempo muy corto (entre una y cuatro horas) (Knapp, 1988). El inoculo debe prepararse a partir de un cultivo puro del aislamiento, por lo que la identificación puede realizarse generalmente a las 24 horas de haber llevado a cabo el aislamiento. Las reacciones acidas en el caso de algunas cepas de N. gonorrhoeae y, en menor proporción, de N. meningitidis pueden ser difíciles de interpretar o aberrantes en el caso de algunos de los sistemas existentes, por lo que las cepas de N. gonorrhoeae que son débilmente productoras de ácidos a partir de la glucosa pueden aparecer como glucosa negativas. Algunas cepas de N. cinérea, especie que no produce ácido a partir de la glucosa, pueden aparecer como glucosa positivas en algunos de métodos comerciales. Las pruebas sobre sustratos para enzimas permiten una identificación rápida (entre una y cuatro horas) solamente para aquellos aislamientos de diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, obtenidos en un medio de cultivo selectivo (Kellogg, 1995; Knapp. 1988). Estas pruebas son de utilidad para distinguir las cepas maltosa negativas de N. meningitidis de N. gonorrhoeae, aunque los cambios de color pueden ser sutiles y si, en consecuencia, son interpretados de forma errónea pueden provocar que los aislamientos de N. meningitidis y otras especies de Neisseria sean clasificados incorrectamente como N. gonorrhoeae. Además, las cepas de Neisseria cinérea y de Kingella denitrificans que crecen en los medios selectivos para el gonococo pueden ser identificadas equivocadamente como N. gonorrhoeae si no se realizan pruebas adicionales de confirmación de identidad. Los sistemas comerciales que combinan las pruebas con sustratos enzimáticos con los métodos convencionales modificados proporcionan una alternativa rápida y precisa para la identilicación de las especies de los géneros Neisseria y Haemophilus (Janda, 1987). Los métodos inmunológicos para N. gonorrhoeae (coaglutinación y tinción con anticuerpos fluorescentes) se ulilizan para la identificación de las colonias aparecidas en los medios de aislamiento primarios. La inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales tiene una gran sensibilidad y especificidad en el caso de N. gonorrhoeae, pero puede dar lugar a falsos positivos con otras especies de Neisseria y con Kingella denitrificans. habiéndose detectado también unión inespecífica a través del fragmento Fe de la molécula de las IgG con otras bacterias (Beebe, 1993; Dillon, 1988; Kellogg, 1995). Por tanto, se sugiere que estos reactivos sean utilizados solamente para identificar microorganismos gramnegativos, oxidasa positivos, aislados en medios selectivos para gonococos. Puede emplearse también una sonda quimioluminiscente de ácidos nucleicos específica para N. gonorrhoeae, para la confirmación de un aislamiento obtenido por cultivo o para la detección directa de la bacteria en las muestras de exudados de la uretra o de la endocérvix, recogidos con un hisopo (Hale, 1993; Limberger. 1992). Asimismo, hay disponibles ensayos, basados en la amplificación de ácidos nucleicos para ser utilizados con las muestras de exudados uretrales y endocervicales, que parecen tener una sensibilidad mayor que las técnicas de hibridación con sondas de ácidos nucleicos o de cultivo microbiológico (Carrol, 1998; Kehl, 1998). Los ensayos de aglutinación en látex están disponibles para la detección directa de antígenos de N. meningitidis en LCR, suero y orina. Como ya se comentó previamente (véase el apartado de Streptococcus dentro de este capítulo), la sensibilidad de estas técnicas parece ser menor o como mucho igual que la de la tinción de Gram; además, los resultados de estas pruebas parecen tener un efecto mínimo en lo que respecta a la atención que recibe el paciente (Bhisitkul. 1997: Granoff, 1986: Maxson, 1994; Perkins. 1995). Por tanto, muchos laboratorios han dejado de ofertar estas técnicas. Sensibilidad a los antimícrobianos. Algunos aislamientos raros de N. meningitidis son resistentes a la penicilina; por tanto, deben realizarse
CAPÍTULO 50
Tabla 50-15
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
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Características diferenciales de las especies del g é n e r o Haemophilus de importancia clínica
Especies H. H H H H. H.
•
influenzae haemolylicus ducreyi parainfluenzae par aphrophilus aphrophilus
Requiere factor X
Requiere factor V
Hemolisis
Catalasa
+ i +
+ +
+
i +
+ +
D
Crecimiento favorecido por el CO,
D + +
Para ver el significado de los símbolos utilizados, consúltese la Tabla 50-10 Adaptada de Campos J Haemophilus En Murray PR. Baron E Pfaller M. y col (eds 1 Manual of Clinical Microbiology. 7' ed Washington, DC. American Society for Microbiology. 1999. p 608. reproducida con permiso del editor.
pruebas para detectar actividad |i-lactamásica en estos casos (Saez-Nieto, 1992; Woods, 1994). Otros agentes antimicrobianos eficaces son las cefalosporinas de amplio espectro y el cloranfenicol. Para el tratamiento profiláctico del posible contagio dentro de los grupos familiares, pueden utilizarse la nfampicina, la minociclina y las fluoroquinolonas. Debido a que la resistencia de N. gonorrhoeae a la penicilina y la tetraciclína está muy extendida (Fox. 1997). las recomendaciones actuales para el tratamiento contemplan la administración de cefalosporinas de amplio espectro o de las nuevas fluoroquinolonas. Aunque no parece existir resistencia frente a las cefalosporinas, si se han descrito casos de resistencia a las fluoroquinolonas. En consecuencia, deben realizarse pruebas de sensibilidad si los síntomas persisten tras el tratamiento. La producción de |Mactamasa puede detectarse con nitrocefina. una cefalosporina cromogénica. Para determinar la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a las cefalosporinas, las quinolonas y otros agentes antimicrobianos, puede emplearse el método de difusión en disco, con agar GC enriquecido con un 1°o de suplemento de crecimiento Casi todas las cepas de M catarrhalis producen |5-lactamasa, cuya presencia puede ponerse de manifiesto con nitrocefina. Los aislamientos son, por lo general, sensibles a cefalosporinas, trimetoprim-sulfametoxazol y a combinaciones que incluyan un antibiótico |J-lactámíco y un inhibidor de |i-lactamasas. Prevención. Las vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C. Y y W135 de N. meningitidis han sido autorizadas en los EE.UU.. y su administración está recomendada en caso de militares, de personas que viven en áreas epidémicas de los países en vías de desarrollo y de individuos cuyo bazo no es luncional o que carecen de dicho órgano. La profilaxis con antibióticos debe limitarse a los casos de contados familiares y a aquellos que hayan podido estar en contacto con las secreciones orales de los enfermos. La nfampicina es el antibiótico de elección habitual en estos casos. La utilización de antibióticos antes de estar expuesto al contado con el microorganismo no está recomendada por los riesgos potenciales de sensibilización y aparición de cepas resistentes. La única excepción a esta regla es la aplicación de solución de nitrato de plata o de pomada de entromicina en los ojos de los recién nacidos para prevenir la oftalmía gonococica o por clamidias.
sadas por esta bacteria. Los anticuerpos van apareciendo con la edad, presumiblemente como consecuencia de una infección natural con H. iníluenzae o con otras bacterias que compartan homología antigénica con aquélla, por lo que la mayor parte de individuos mayores de 15 años poseen anticuerpos. Se desconoce cuáles de estos anticuerpos son protectores y a qué nivel actúan. Desde la introducción de la vacuna frente a H. intluenzae serotipo b a mediados de la década de los 80, ha habido un brusco descenso en la incidencia de las infecciones invasivas causadas por este microorganismo, tales como la meningitis y la epíglotitis (CDC, 1994). Las cepas no tipables de H. influenzae están más frecuentemente asociadas con la otitis aguda media o con las exacerbaciones agudas de la bronquitis crónica. H. parainfluenzae es usualmente una especie comensal de las vías respiratorias superiores, aunque puede provocar enfermedades graves como endocarditis. H. aphrophilus. otra especie comensal del tracto respiratorio superior, también puede producir endocarditis, asi como abscesos cerebrales, neumonía, meningitis y bacteriuria. H. ducreyi es el agente responsable de la enfermedad lamada chancroide (o chancro blando) Diagnóstico de laboratorio. Para el aislamiento de Haemophilus spp. es
necesaria la presencia de los factores X y/o V en el medio de cultivo. El primero de ellos es aportado al medio por los hematíes usados por efecto del calentamiento (p. ej., en el agar chocolate), aunque también puede ser proporcionado por glóbulos rojos intactos humanos, de cabalo o de conejo. El factor V es aportado generalmente por el extracto de levadura que se añade al medio o por una suspensión de estafilococos, que se siembra en una única estria sobre la superficie del medio y alrededor de la cual crecen las colonias de las cepas dependientes de factor V (fenómeno denominado satelitismo). Las caraderisticas diferenciales de las especies de este grupo se muestran en la Tabla 50-15. Los requerimientos de factor X y V se establecen determinando la capacidad de la cepa en cuestión para crecer o no en medios de cultivos que contengan dichos (adores. Una alternativa para establecer la dependencia del factor X es la prueba de la porfirina propuesta por Kilian (1974) y que determina la capacidad de las especies dependientes para utilizar el ácido ¿>-aminolevulínico en la síntesis de porfobilmogeno y porfirinas. La formación de portobilmógeno se puede detectar añadiendo reactivo de Kovac al medio y Haemophilus observando el desarrollo de una coloración roja en la fase acuosa Alternativamente, se puede demostrar la formación de porfirinas en la mezcla en reacCaracterísticas. Las especies de este género son bacilos y cocobacilos ción por la fluorescencia rojiza que aparece cuando se ilumina con una lámgramnegativos de pequeño tamaño, pleomórticos, anaerobios facultativos, oxidasa positivos y con requerimientos de hemina u otras porfirinas (factor X) para de Wood. Las propiedades hemoliticas de las especies de Haemophilus pueden determinarse en agar sangre de conejo o de caballo. y/o nicotinamina-adenina-dinucleótidos o trinucleótidos (factor V). A menudo debe diferenciarse a H. aphrophilus de otras especies como Manifestaciones clínicas y patogenia. La mayor parte de especies de Actinobacillus actinomycetemcomitans. Cardiobacterium hominis y Eikenella Haemophilus son habitantes habituales de las vías respiratorias superiores. corrodens (Tabla 50-15), todas las cuales se han asociado con endocarditis Algunas de ellas pueden encontrarse también en los tractos gastrointestinal y genitourinano. La diseminación de persona a persona se produce por inhalación bacteriana subaguda. de gotícuias de humedad liberadas con la respiración. Las infecciones causadas El cultivo de H. ducreyi a partir de lesiones chancroides ha sido problemático. por Haemophilus spp. van desde conjuntivitis y otitis media hasta meningitis y Un Irotis del material obtenido de la lesión teñido por el método de Gram puede endocarditis. Las especies consideradas como patógenos humanos habituales ser de ayuda si la observación revela la presencia de bacilos gramnegativos por son H. influenzae, H. parainfluenzae, H. ducreyi y H. aphrophilus. parejas o en filas ("bandadas de peces"). La muestra puede inocularse en medio basal GC enriquecido con hemoglobina (1%), suero bovino fetal (5%-10%), IsoEl principal factor de virulencia de H. influenzae es el polisacárido capsular, del VitaleX (1%; BBL Microbiology Systems) y vancomicina (3 tig/ml) o en agar Muecual exislen seis tipos antigénicamente distintos (serotipos del a al f). Las cepas ller-Hínton con sangre de caballo (5%), solución de enriquecimiento con cofacque carecen de cápsula se denominan como no tipables. H. influenzae no prolores, vitaminas y aminoácidos (1%) y vancomicina (3 LigVml). duce endotoxína. y esta especie es rápidamente fagocitada y destruida por los macrófagos. a menos que existan deficiencias en el funcionamiento de los antiSensibilidad a los antimicrobianos. En la actualidad, el NCCLS cuerpos de los fagocitos o del sistema complemento. Tampoco se sabe mucho (NCCLS. 2000a) recomienda levar a cabo pruebas de susceptibilidad frente sobre el papel de los anticuerpos en la inmunidad frente a las infecciones cau- a ampicilina, cloranfenicol. cefalosporinas de tercera generación y merope-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
nem en el caso de H. influenzae aislado a parlir de muestras de sangre o de LCR. Se ha observado resistencia a ampicilina y cloranfenicol, así como frente a trimetoprim-sulfametoxazol. tetraciclina y rifampicina, aunque con una menor frecuencia en estos casos. La resistencia a las penicilinas está generalmente determinada por la capacidad para producir |5-lactamasas: sin embargo, algunos aislamientos raros son resistentes debido a alteraciones en la permeabilidad de la membrana extema o en la afinidad de las proteínas que ligan penicilina (PBP). Las pruebas de sensibilidad para H. influenzae han de realizarse con un medio de cultivo especial (Haemophilus Test Medium).
Bordetella Características. Las especies del género Bordetella son bacterias muy pequeñas de morfología cocobacilar, aerobias estrictas, no fermentadoras, que necesitan ácido nicotinico, cisteina y generalmente metionina, pero no hemina (factor X) o coenzima I (factor V), para su crecimiento. Durante el mismo se produce un exceso de ácidos grasos que resultan inhibidores para un mayor crecimiento microbiano, razón por la que es preciso añadir sangre, carbón vegetal, almidón o resinas de intercambio iónico al medio para que adsorban selectivamente y eliminen dichos ácidos grasos. Tras subcultivos repetidos en medios artificiales tiene lugar un fenómeno de variación de fase de cepas lisas virulentas a rugosas avirulentas. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Bordetella se encuentran en las vías respiratorias de los animales de sangre caliente. S. bronchiseptica afecta primariamente a los perros (tos de la caseta del perro), y a algunos otros animales, y puede causar, aunque raramente, una enfermedad parecida a la tos ferina en huéspedes humanos inmunocomprometidos. 8. parapertussis, especie que infecta tanto al hombre como a los corderos, es un patógeno humano poco común. La infección por este microorganismo puede ser asintomática o provocar una enfermedad semejante a la tos ferina o. con mayor frecuencia, bronquitis. 8. pertussis, el agente causal de la tos ferina, sólo provoca enfermedad en el hombre. 8. pertussis. B. parapertussis y 8. bronchiseptica producen varios factores de virulencia. Entre ellos se encuentran una adenilato cíclasa que ejerce el papel de toxina (TAC), ya que inhibe diversas funciones celulares al provocar un aumento de los niveles intracelulares de adenosina 3', 5'-fosfato en las células afectadas. La citotoxina traqueal (CTT) causa la detención del movimiento de los cilios y la muerte celular. En la adhesión de las bacterias a los tejidos están implicadas una hemaglulinina filamentosa (HAF). la pertactina y las fimbrias. 8. pertussis produce, con carácter exclusivo, toxina diftérica (TD). que actúa inhibiendo los factores responsables de la transducción de señal a nivel intracelular, catalizando la transferencia de ADP a las proteínas G celulares. Se cree que durante la infección por 8. pertussis el microorganismo se fija inicialmente al epitelio ciliado de las vías respiratorias y a las células efectoras del sistema inmune, por medio de diferentes moléculas y estructuras que actúan como adhesinas (fimbrias, HAF, TD y pertactina). La TD y la TAC trabajan juntas para inhibir la respuesta del sistema inmune del hospedador, mientras que la CTT daña el epitelio respiratorio. Como resultado se produce una respuesta inflamatoria y necrosis celular, leucocitosis y linfocitosis, acumulación de secreciones, tos y, finalmente, bronconeumonia, episodios de hipoxia y encefalopatía. 8. pertussis posee un antígeno protector que al combinarse con el anticuerpo específico frente al mismo anula el carácter infectivo de la bacteria. Parece, sin embargo, que para lograr la erradicación del microorganismo son necesarias tanto la inmunidad humoral como la celular. Diagnóstico de laboratorio. La tasa de aislamiento de B. pertussis a partir de los pacientes disminuye con la duración de la enlermedad. El espécimen más adecuado es el material recogido de la nasofannge con un hisopo: en cualquier caso, los aspirados nasofaríngeos obtenidos mediante un catéter blando de goma también han permitido lograr, en las manos de algunos analistas, buenos porcentajes de aislamiento. También pueden utilizarse para el cultivo muestras obtenidas por métodos más agresivos, como es el caso del líquido de lavado broncoalveolar. En general, el material recogido con hisopo o los aspirados deben inocularse en un medio apropiado, como el agar Regan-Lowe, directamente en la cabecera de la cama del enfermo. En el caso de que sea necesario su envío al laboratorio de referencia, los medios inoculados deben incubarse durante al menos 24 horas antes de ser transportados, con objeto de permitir un cierto nivel de crecimiento inicial del microorganismo.
El examen directo de los frotis teñidos con anticuerpos mono o policlonales frente a 8. pertussis. conjugados con fluoresceina. puede permitir un diagnóstico rápido. Debido a que la inmunofluorescencia (DFA) tiene un bajo grado de sensibilidad, debe realizarse en paralelo el aislamiento y la identificación del microorganismo mediante cultivo. También pueden aparecer resultados falsamente positivos con la técnica DFA, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los cultivos deben incubarse en una atmósfera con un nivel elevado de humedad, pero sin CO , a 35'C. 8. pertussis es una bacteria de crecimiento lento y las colonias que forma pueden tardar entre tres y cuatro días en ser apreciables a simple vista. La incubación debe prolongarse hasta los 7-12 días antes de que los cultivos se descarten como negativos. ;
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Las colonias de 8. pertussis son pequeñas, redondas y brillantes y pueden tener el aspecto de gotas de mercurio. Los microorganismos presentes en una colonia con la morfología típica y que tengan el aspecto característico bajo tinción de Gram deben subcullivarse en agar sangre, para verificar su incapacidad de crecer en dicho medio. La identificación presuntiva de 8. pertussis se lleva a cabo determinando el carácter catalasa y oxidasa positivo y ureasa negativo del aislamiento en cuestión. 8. parapertussis crece más rápidamente que 8. pertussis. y además es capaz de hacerlo en agar sangre e incluso en agar MacConkey. Esta especie da negativa la prueba de la oxidasa negativa y positivas la catalasa y ureasa. 8. bronchiseptica crece bien tanto en agar sangre como en MacConkey, es bioquímicamente la más activa de las tres especies, da positiva las tres pruebas (catalasa, ureasa y oxidasa) y es capaz de reducir los nitratos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Los agentes antimicrobianos no desempeñan, probablemente, ningún papel en el tratamiento de la tos ferina, pero negativizan los cultivos nasofaríngeos en uno o dos días, lo que ayuda a impedir la aparición de complicaciones en los enfermos, así como la diseminación de la infección a individuos no inmunizados. En cualquier caso, no está indicada la realización de las pruebas de sensibilidad en el caso de 8. pertussis. La eritromicina es el antibiótico de elección tanto para el tratamiento como para la profilaxis; alternativamente, también se puede utilizar trimetoprim-sulfametoxazol.
Brucella Características. Las brúcelas son cocobacilos pequeños (0.5 um-0.7 pm de ancho por 0.6 pm-1,5 pm de largo), gramnegativos, que en las extensiones teñidas aparecen individualmente, en parejas o formando cadenas cortas. Estas bacterias son inmóviles, aerobias estrictas, catalasa positivas y, casi siempre oxidasa positivas. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia de CO¿ (5%-10%) en la atmósfera de incubación, y necesitan medios de cultivo complejos que contengan sangre o suero. Entre las especies conocidas, son patógenas para el hombre 8. melitensis. B. abortus. B. suis y B. canis. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Brucella son parásitos intracelulares capaces de infectar a una gran variedad de especies animales (incluyendo al hombre); han sido encontradas también en algunos insectos y garrapatas. Son patógenos importantes para el hombre y los animales. Los huéspedes preferidos son las cabras y las ovejas para 8. melitensis. el ganado ovino para 8. abortus los cerdos para 8. suis y los perros para 8. canis, aunque cada una de estas bacterias puede infectar ocasionalmente a otras especies animales. El hombre se infecta por inhalación, al entrar en contacto directo con material infectado, incluyendo cadáveres de animales, membranas fetales, exudados vaginales, fetos, piel o membranas mucosas, o por ingestión de leche no pasteurizada procedente de animales infectados o de productos lácteos derivados de aquélla. En los EE.UU. se declaran unos 100 casos de brucelosis al año. Un factor de riesgo muy común es el consumo de queso importado hecho a base de leche de cabra sin pasteurizar. A menudo se produce una linfadenopatia local con diseminación y localización secundaria del microorganismo en sistema reticuloendotelial, con formación de granulomas en el higado, bazo, huesos, sistema genitourinario, pulmones y tejidos blandos. Es posible observar a las bacterias en el interior de las células fagociticas. Con frecuencia, los signos y síntomas son variables e inespecílicos, con escalofríos, fiebre, sudoración y anorexia. Una característica de la fiebre es que aparece durante el día (fiebre ondulante). Diagnóstico de laboratorio. Las brúcelas se recuperan con mayor frecuencia a partir de sangre y médula ósea y con menor de muestras procedentes del bazo y de abscesos hepáticos. Estas bacterias crecen en medios estándar de laboratorio, incluyendo el agar Brucella, sangre, chocolate y tripticasa de soja. Algunas cepas pueden crecer en agar MacConkey. En general, estas bac-
CAPÍTULO 50
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
terias crecen en los medios utilizados para los hemocultivos. Muchos autores recomiendan incubar los hemocultivos durante 21 días, llevando a cabo subcultrvos a ciegas tanto al principio como al final del periodo de incubación. Sin embargo, ya no es preciso seguir estas recomendaciones con los nuevos sistemas automatizados para hemocultivo. algunos de los cuales han permitido la recuperación de Brucella spp. en cinco días o incluso menos, sin necesidad de realizar subcultivos a ciegas (Bannatyne, 1997: Yagupsky, 1997). Los medios sólidos deben incubarse en una atmósfera que contenga entre un 5% y un 10% de CO . Las brúcelas crecen lentamente, e incluso tras 48 horas de incubación las colonias son difíciles de ver. Los microorganismos pueden ser identificados presuntivamente como especies del género Brucella en base a su aspecto característico bajo tinción de Gram y a unos resultados positivos para las pruebas de la catalasa. oxidasa y ureasa. La actividad ureásica se manifiesta rápidamente (alrededor de 15 minutos) en el caso de B. suis y más lentamente (entre 2 y 24 horas) en el de B melitens'is y B. abortus. Debido a que la brucelosis puede adquirirse en el laboratono. el personal del mismo debe ser advertido si se sospecha la presencia de Brucella spp. en el espécimen, debiendo realizarse todas las manipulaciones en una cabina de biosegundad. ?
La identificación a nivel de especie implica la realización de pruebas adicionales, como son los requerimientos adicionales de CO „ la producción de H S, la hidrólisis de la urea, la sensibilidad a algunos colóranles y la sensibilidad a determinados lagos. La mayor parte de laboratorios hospitalarios solicitan a los departamentos estatales de salud o a los laboratorios de referencia la realización de estas pruebas complementarias. ;
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También es posible llevar a cabo el diagnóstico de la brucelosis mediante técnicas serológicas. Un título mínimo de 1:160 en la prueba estándar de aglutinación en tubo hace sospechar un diagnóstico positivo. Sin embargo, la evidencia de una brucelosis reciente sólo puede ser aceptada cuando se detecta un incremento de cuatro veces o superior en el título de anticuerpos específicos durante el primer o segundo mes de la enfermedad. En los pacientes con titulo elevados (1:640) de anticuerpos puede manifestarse un fenómeno de zona que inhiba la reacción de aglutinación, por lo que todas las muestras de suero de los pacientes en los que se sospeche la existencia de la enfermedad deben diluirse hasta un valor de 1:1.280 al menos. A veces se detecta una reactividad cruzada con Francisella lularensls y con Vibrio cholerae. incluyendo a las personas que han recibido la vacuna contra el cólera. Sensibilidad a los anlimicrobianos. El tratamiento consiste en la administración de combinaciones de antibióticos como tetraciclma. aminoglucósidos, nfampicina y trimetoprim-sulfametoxazol durante períodos prolongados. Aunque en ocasiones el tratamiento antimicrobiano falla, ello no es debido a fenómenos de resistencia, por lo que no es necesario llevar a cabo pruebas de sensibilidad para los aislamientos recuperados de los enfermos.
Pasteurella Características. Las especies del género Pasteurella son bacterias gramnegativas con morfologías muy variadas que van desde cocobacilos pequeños hasta bacilos largos y filamentosos, anaerobias facultativas, catalasa y oxidasa positivas e inmóviles. De las ocho especies conocidas con capacidad para infectar al hombre (P multocida. P. bettyae. P. cams. P. dagmatis. P. stomatis. P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes). P. multocida es el patógeno humano más importante. Las especies de Pasteurella son lenolípicamente muy semejantes a las del género Actinobacillus. habiendo demostrado los estudios de hibridación ADN-ADN y la comparación de los rARN de 16S que las especies P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes están más relacionadas con el género Actinobacillus que con el genero Pasteurella. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Pasteurella. especialmente P. multocida. se encuentran formando parte de la microbiota comensal de las vías respiratorias superiores de mamíferos y aves de corral, aislándose frecuentemente de las heridas causadas por mordeduras o arañazos de animales. Las mordeduras de gatos resultan infectadas con mayor frecuencia que las de perros. Las infecciones localizadas pueden hacerse sistémicas. habiéndose registrado casos de septicemia, osteomielitis y meningitis. Estas bactenas se han asociado con infecciones de las vías respiratorias, incluyendo sinusitis, abscesos periamigdalares. neumonía, empiema. bronquitis y bronquiectasias. generalmente en pacientes con afecciones pulmonares crónicas. Diagnóstico de laboratorio. Las pasteurelas crecen bien en agar sangre y sólo muy raramente son capaces de crecer en medios de cu.tivos selectivos
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para bacterias gramnegativas. como son el agar EMB o MacConkey El hallazgo de un bacilo gramnegativo que sólo crece en agar sangre, que es oxidasa e indol positivo, y que da negativa la prueba del ONPG. constituye una sólida evidencia presuntiva del aislamiento de P. multocida. la especie que se aisla con mayor frecuencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. Raramente se observa resistencia a los agentes antimicrobianos en los aislamientos de origen humano. Las pasteurelas son generalmente susceptibles a la penicilina y la tetraciclina. La penicilina es el antibiótico de elección.
Francisella Características. Francisella tularensis es una bacteria gramnegativa muy pequeña, aerobia estricta, que exhibe diferentes morfologías (desde cocos hasta bacilos pleomórficos) y que necesita cístina o cisteina para poder crecer. Cuando se tiñe con colorantes derivados de la anilina muestra una tinción bipolar débil. Manifestaciones clínicas y patogenia. F. tularensis se encuentra en animales tanto salvajes como domésticos, pájaros, artrópodos, agua, barro y heces. El reservono principal de esta bacteria es el conejo de cola de algodón. La transmisión al ser humano tiene lugar por la picadura de garrapatas, por inoculación directa a través de la piel o de la conjuntiva por contacto con un animal infectado, por inhalación o por ingestión de carne contaminada poco cocida o de agua contaminada. La enfermedad se manifiesta de varías formas, como son la ulceroglandular, glandular, oculoglandular. orofaríngea. intestinal, neumónica y tifoidea. Cada año se detectan entre 100 y 200 casos aproximadamente de tularemia en los EE.UU. La tularemia se manifiesta de varias formas tras un período de incubación que oscila entre 1 y 10 días. Algunos síntomas como cefalea, fiebre, escalofríos, vómitos y mialgias se presentan característicamente al principio. En la forma ulceroglandular aparecen linfadenitis y linfadenopatias en la zona de drenaje de la lesión primaria. La lesión es papular inicialmente y más tarde ulcerativa. La forma oculoglandular de la enfermedad se caracteriza por la inflamación de la conjuntiva y, generalmente, por la aparición de una pápula en el párpado inferior, con linfadenitis de los ganglios preauriculares, parotideos, submaxilares y cervicales anteriores. La forma intestinal de la tularemia se caracteriza por la presencia de lesiones ulcerosas en la boca, garganta y tracto gastrointestinal superior. La virulencia parece estar relacionada con la morfología lisa de las colonias. El subcultivo repetido conlleva una transición de la morfología colonial lisa a otra rugosa, concomitantemente con una pérdida de la virulencia. Las cepas fuertemente virulentas para el hombre presentan actividad citrulin-ureidasa y fermentan el glicerol, estando asociadas con la enfermedad en conejos transmitida por las garrapatas. No se ha detectado la producción de toxinas en esta bacteria. Puede sospecharse la existencia de tularemia en cualquiera que haya estado en un área donde la enfermedad tiene carácter endémico, haya entrado en contacto con animales silvestres o ganado, tenga un historial de picaduras por garrapatas, haya estado implicado en labores agrarias, haya bebido agua contaminada o haya estado expuesto a cultivos bacterianos o a animales de laboratorio infectados. Los tramperos, cazadores, trabajadores de la industria peletera y alimentaria, los agricultores y el personal de laboratorio están en situación de alto riesgo para contraer la enfermedad. Debido a sus manifestaciones tan diversas, la tularemia puede confundirse fácilmente con muchas otras enfermedades como la brucelosis, el ántrax, la esporotricosis. las fiebres tifoideas, la tuberculosis, la histoplasmosis y la sífilis. Diagnóstico de laboratorio. El tipo de muestra adecuado para el examen incluye los líquidos o legrados recogidos a partir de la lesión primaría, los aspirados de ganglios linfáticos regionales aumentados de tamaño, el esputo, los lavados faríngeos y los aspirados gástricos. El aislamiento de la bacteria es difícil porque tiene requerimientos nutricionales especiales y crece lentamente, lo que permite que otros microorganismos de crecimiento más rápido que puedan estar presentes en el espécimen enmascaren o dificulten su desarrollo. Los cultivos pueden realizarse en agar con glucosa y cisteina. enriquecido con un 5% de sangre de conejo desfibnnada, en agar chocolate con IsoVitaleX o en agar BCYE. Algunas cepas pueden crecer incluso en agar sangre estándar o en agar tripticasa de soja. Si la muestra clínica está contaminada por otros microorganismos (incluidos los hongos), debe añadirse al medio antibióticos, como penicilina, polimixina B y cicloheximida, para inhibir el crecimiento de éstos. Se debe
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
tener un cuidado especial con la manipulación del material infectado para evitar la formación de aerosoles o el contacto directo con la piel Los clínicos deben informar siempre al personal del laboratorio si sospechan de la existencia de F. tularensis en las muestras con objeto de que se adopten las medidas de seguridad apropiadas para evitar una exposición accidental al microorganismo. Los cultivos se incuban a 35"C en una atmósfera que puede contener o no CO,. Las colonias aparecen generalmente entre 2 y 4 días, y tienen un color que va de azul-grisáceo a blanco, son redondas, lisas y ligeramente mucosas. En un medio que contenga sangre, puede apreciarse una zona estrecha de (/-hemolisis alrededor de las colonias. Debido a que el trabajo con este microorganismo en el laboratorio es peligroso, cualquier aislamiento sospechoso debe enviarse a un laboratorio de referencia, como el CDC de Allanta, para su confirmación mediante una prueba de aglutinación en portaobjetos o de mmunofluorescencia directa. El diagnóstico de la tularemia también puede establecerse por técnicas serológicas. Un título de 1:40 en una reacción de aglutinación en ausencia de una infección previa tiene valor diagnóstico, y puede aumentar durante las tres primeras semanas hasta alcanzar un valor de 1:640 o incluso superior. Las aglutininas frente a Brucella spp. también aumentan de forma inespecífica. pero su titulo nunca alcanza valores tan altos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Para F. tularensis la estreptomicina es bactericida, mientras que las tetraciclinas y el cloranfenicol son bactenostáticos. Puesto que no son infrecuentes las recidivas después de un tratamiento con estos dos últimos, el antibiótico de elección es la estreptomicina.
Calymmatobacterium Características. C. granulomatis es un bacilo pleomórtico gramnegativo. inmóvil y capsulado que puede cultivarse en el saco vitelino de los huevos o en medios de cultivo artificiales que contengan yema de huevo fresca. Esta bacteria posee determinantes de virulencia semejantes a los que exhiben las especies de Klebsiella, lo que ha inducido a algunos expertos a clasificarla dentro de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones clínicas y patogenia. Esta bacteria no provoca enfermedades en los animales. En el hombre causa el granuloma inguinal, que se caracteriza por la aparición de lesiones ulcerogranulomatosas en la piel y las mucosas del área genital e inguinal. Diagnóstico de laboratorio. Un fragmento de tejido extraído del borde de una lesión ulcerosa se apneta y restnega sobre un portaobjetos de vidrio para obtener un frotis que se tjñe por el método de Giemsa o de Wnght. La detección de bacilos pequeños, pleomórficos, rectos o curvados, con los extremos redondeados, y granulos polares característicos en el interior de las células mononucleares es la manera más efectiva para llevar a cabo el diagnóstico. Sensibilidad a los antímícrobianos. Los antibióticos eficaces frente a C. granulomatis son las tetraciclinas. la eritromicina, la ampicilina y el cloranfenicol. La bacteria puede desarrollar resistencia a la estreptomicina.
Streptobacillus
endocarditis. El examen histopatológico es mespecifico y revela la existencia de una reacción inflamatoria crónica. Diagnóstico de laboratorio. Esla bactena crece en agar con infusión de corazón enriquecido con suero de caballo inactivado por calor y extracto de levadura. Una vez inoculados, los medios deben incubarse a 35'C en una atmósfera húmeda que contenga un 10% de CCy Las colonias que aparecen en medio liquido tienen aspecto de bolas esponjosas, mientras que las que se forman en agar son pequeñas y ligeramente translúcidas u opacas. Los variantes en lase L pueden aparecer eventualmente en los medios solidos. Debido a que es una bactena relativamente con poca actividad fisiológica, la identificación de S. monilitormis es compleía. Las pruebas bioquímicas deben realizarse utilizando como medio base caldo o agar con infusión de corazón enriquecido con suero de caballo y extracto de levadura. Sensibilidad a los antimicrobianos. S monililormis es sensible a la penicilina. También pueden utilizarse los aminoglucósidos o la tetraciclina para tratar las lormas L. Prevención y control. Puesto que entre un 10% y un 65% de las ratas están infectadas por el microorganismo, el control de estos animales y las precauciones para evitar sus mordeduras representan las únicas estrategias eficaces para el control y prevención de la enlermedad.
Bacterias anaerobias Es importante recalcar que las bacterias anaerobias representan el componente principal de la microbiota autóctona de la piel y de las membranas mucosas (véase Tabla 50-1). Por tanto, el aislamiento e identificación de estos microorganismos dependen en gran medida de la correcta selección y recogida de las muestras, asi como del transporte de éstas hasta el laboratorio en condiciones adecuadas. Las infecciones por anaerobios son con frecuencia polimicrobianas, ya que en las mismas pueden estar implicadas, simultáneamente, vanas especies de bacterias anaerobias, o bien de anaerobias con anaerobias facultativas. En consecuencia, la primera tarea a la hora de examinar un cultivo incubado en condiciones de anaerobiosis es poder diferenciar los microorganismos anaerobios estrictos de los facultativos, ya que todos ellos habrán crecido en esas condiciones. El analista experto puede reconocer las especies anaeróbicas que se aislan con mayor frecuencia, en base a las características morfológicas de las colonias y de los microorganismos observados bajo tinción, y llevar a cabo una identificación presuntiva mediante unas pocas pruebas adicionales. La identilicación definitiva se basa en la realización de pruebas bioquímicas adicionales, en la determinación de características genéticas y fisiológicas y en ensayos de patogenicidad y neutralización de toxinas. El grado de identificación de los microorganismos anaerobios varia de acuerdo con el equipo disponible y la experiencia, el interés del personal de laboratorio y del equipo médico y la utilidad clínica de la información disponible del laboratorio. Definiciones y características. Una bacteria anaerobia necesita una atmóslera con una baja tensión de oxigeno para poder crecer, y es incapaz de desarrollarse en la superficie de un medio sólido en una atmósfera ambiental normal enriquecida con un 10% de CO.. Un anaerobio facultativo es capaz de crecer en ambas situaciones. El término microaerótilo. que no tiene una definición estncta. se aplica a ciertas bactenas. normalmente las especies de los géneros Campylobactery Streptococcus, que sólo se desarrollan en una atmósfera con un bajo contenido en oxígeno y una concentración de dióxido de carbono aumentada.
Características. Streptobacillus moniliformis es una bactena gramnegativa de morfología bacilar, anaerobia facultativa, inmóvil y no capsulada, que aparece frecuentemente formando cadenas o largos filamentos, y que a menudo presenta una serie de engrasamientos ovales o alargados que confieren al conjunto un aspecto de rosario. La morfología varia con el tiempo, ya que en los cultivos jóvenes los microorganismos presentan un aspecto filamentoso bastante uniforme, mientras que a medida que el cultivo envejece aumenta la tendencia a la Patogenia y factores de virulencia. Excepto en el caso de los closlrifragmentación para dar lugar a lormas cocobacilares irregulares. Esta bacteria dios, se sabe poco sobre los factores que determinan la virulencia y la patoforma colonias L en agar. que tienen un aspecto que recuerda a un "huevo frito" genicidad de la mayoría de los microorganismos anaerobios En el caso de y pueden estabilizarse si se añade penicilina al medio de cultivo. los miembros de la familia Bacteroidaceae se han identificado diferentes actividades biológicas (endotoxina, proteasas. hepannasa) que podrian jugar un Manifestaciones clínicas y patogenia. S monililormis forma parte de papel en este contexto. El polisacárido capsular de Bacteroides Iragilis favola microbiota autóctona del tracto respiratorio superior de los roedores silvesrece la formación de abscesos. Por otro lado, las especies del género Ctostres y de laboratorio. La enfermedad que produce en el hombre (fiebre de la tridium producen exotoxinas muy potentes que incluyen factores letales y mordedura de la rala o enfermedad de Haverhill) es consecuencia de la mornecrotizantes. hemolisinas. lecitinasas, gelatinasas y hialuronidasas. dedura de roedores, de la ingestión de alimentos contaminados o de lesiones traumáticas. En un período de tiempo de unas tres semanas pueden apareMientras que las infecciones e intoxicaciones por clostridios pueden lener un cer una serie de manifestaciones clínicas como linfoangitis local y linfadeniongen tanto exógeno como endógeno, las causadas por otros microorganismos tis, seguidas por fiebre, escalofríos, malestar general y. más tarde, por un anaerobios se originan endógenamente, a partir de la propia microbiota anaeexantema morbidíforme generalizado, maculopapular o petequial Algunos robia normal presente en una membrana mucosa contigua, cuya integridad ha pacientes desarrollan poliartritis migratoria También se han descrito casos de sido dañada por una intervención quirúrgica, traumatismos, utilización de ms-
CAPÍTULO 50
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BACTERIOLOGÍA MÉDICA
Irumental medico o por un lumor. Para que se inicie el proceso infeccioso causado por anaerobios es esencial que el potencial de oxidorreducción disminuya en el te|ido afectado, lo que puede ser consecuencia de la interrupción del aporte sanguíneo o de la multiplicación de otras bactenas en la zona. Sin lugar a dudas, las infecciones e intoxicaciones por clostridios son de la mayor importancia, aunque recientemente se ha reconocido el papel que juegan otros microorganismos anaerobios como agentes causales de celulitis y mionecrosis. La mayoría de aislamientos de Clostridium pertringens efectuados en el entorno hospitalario son consecuencia de simples contaminaciones de heridas. En estos casos, las bacterias se multiplican en los restos celulares, en un hematoma o en tejido necrótico sin que se observe sintomatología clínica alguna. La celulitis anaerobia es una patología que produce necrosis en los tejidos blandos. Su inicio es gradual, pero puede extenderse rápidamente. Aunque se forma gas. la infección no afecta al tejido muscular. Además de clostndios, o en su lugar, en la celulitis anaerobia pueden estar implicados también cocos anaerobios y bacilos gramnegativos anaerobios. En contraste con la celulitis anaerobia, la gangrena gaseosa o mionecrosis clostridial es un proceso invasivo agudo y de rápida progresión que provoca grandes alteraciones en el músculo. Es de la mayor trascendencia el distinguir entre celulitis anaerobia y gangrena gaseosa para evitar la realización de intervenciones terapéuticas quirúrgicas agresivas y mutilantes, innecesarias en el primer caso. Los clostridios histotóxicos asociados con la gangrena gaseosa incluyen C. perlnngens. C. novyi. C. septicum, C. histolyticum. C. sporogenes y C. bifermentans. Mientras que C. pertringens es la especie que está implicada con mayor frecuencia como agente causal de gangrena gaseosa, la prevalencia de las otras variedades en el proceso varía ampliamente. El tétanos y el botulismo son intoxicaciones más que infecciones, debido a que las manifestaciones clínicas de ambas enfermedades están relacionadas con la elaboración de potentes neurotoxinas por parte de los microorganismos implicados en las mismas. El botulismo está relacionado muy a menudo con la ingestión de alimentos elaborados en casa que han sido preparados o envasados inadecuadamente; de todos modos, también se han detectado brotes esporádicos de la enfermedad asociados con la ingestión de alimentos preparados comercialmente o con la infección de heridas por el microorganismo (C botulinum). El período de incubación del botulismo es corto; los síntomas y signos clínicos aparecen entre 18 y 36 horas después de la ingestión del alimento contaminado. De los siete tipos de toxina botulínica conocidos, el tipo A es el más común, seguido por los tipos B, E y F en los casos de intoxicación alimentaria en EE.UU. La toxina es absorbida a nivel del tubo digestivo, y más raramente a partir de la herida infectada, fijándose en último término a las terminales nerviosas motoras, impidiendo la liberación de acetilcolina y la transmisión del impulso nervioso. El tétanos se presenta típicamente en personas no inmunizadas dentro de las dos primeras semanas siguientes al momento de haber sufrido heridas, pinchazos o abrasiones de origen traumático, aunque también se han descrito casos tras intervenciones quirúrgicas y dentales, después de un parto o un aborto, o en situaciones de estasis y úlceras de decúbito. La toxina, denominada tetanoespasmina, es transportada hasta los gangliósidos en el SNC por medio de los torrentes linfático y circulatorio, y por migración a través de los espacios penneurales de los nervios periféricos. Clostridium difficile es la causa principal de diarrea de origen nosocomial y el responsable primario de la colitis seudomembranosa. También provoca, aunque mucho más raramente, abscesos, infecciones de las hendas, osteomielitis, pleuritis, peritonitis, septicemia e intecciones de las vias urinarias. El porcentaje de portadores de C. difficile (y de las toxinas que produce) es elevado (50% o más) en neonatos, aunque los casos de enfermedad son raros (Bartlett, 1997). La colonización, con o sin producción de toxina, puede mantenerse durante varios meses, pero cuando la microbiota intestinal adulta se ha establecido entre los 6 y 12 meses de edad, los porcentajes de colonización caen drásticamente y sólo un 3% de los adultos sanos se encuentran colonizados por el microorganismo. Las personas hospitalizadas que están recibiendo tratamiento con antibióticos y resultan infectadas por C. difficile adquieren casi siempre el microorganismo tras una exposición directa o indirecta con algún reservorio humano o inanimado del mismo. Aunque las penicilinas y las cefalosporinas son los antibióticos que aparecen asociados más frecuentemente con esta situación, cualquier antibiótico puede, en potencia, desencadenar la
1117
patología asociada con C. difficile. Raramente la enfermedad aparece sin que haya existido un tratamiento previo con antibióticos, aunque se han descrito casos asociados con tratamientos con agentes antineoplásícos que poseen también actividad antimicrobiana. La colitis seudomembranosa es una enfermedad mediada por la acción de toxinas y en la que no parece existir invasión de la mucosa intestinal por el microorganismo. C. difficile produce dos toxinas diferentes. La toxina A, una toxina débilmente citopática, es responsable de la actividad enterotóxica de la bacteria. La toxina B. una potente cilotoxina. parece jugar un papel poco relevante en la enfermedad humana, aunque a partir de pacientes sintomáticos se han aislado cepas de C. difficile incapaces de sintetizar toxina A, pero que producen toxina B (Johnson, 1998). Como ya se ha mencionado previamente, otras bacterias anaerobias, particularmente los cocos anaerobios y los bacilos gramnegativos. se han asociado con la celulitis anaerobia además o en lugar de las especies histotoxicas de Clostridium. Estas bacterias forman parte de la microbiota autóctona de las membranas mucosas de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal y genitourinario. Como tales se encuentran en neumonías por aspiración, abscesos pulmonares, empiemas, abscesos e infecciones intraabdominales, abscesos pélvicos y cerebrales y bacteriemias. Las infecciones intraabdominales por anaerobios suelen aparecer como consecuencia de intervenciones quirúrgicas en abdomen y colon y se asocian con el grupo de Bacteroides fragilis. Las bacteriemias por anaerobios, clínicamente significativas, también son causadas frecuentemente por esta bacteria. Diagnóstico de laboratorio. La identificación de las bacterias anaerobias hasta el nivel de especie puede ser una tarea bastante compleja; sin embargo, el grado hasta el que debe caracterizarse un aislamiento de un microorganismo anaerobio varia ampliamente y puede limitarse a obtener tan sólo aquella información básica que sea de utilidad clínica. Por ejemplo, la microbiota mixta presente en una lesión como una úlcera de decúbito, una fístula perirrectal o un absceso intrabdominal puede caracterizarse simplemente como microbiota fecal mixta, sin necesidad de tener que identificar a cada uno de sus integrantes individuales. La identificación de un aislamiento hasta el nivel de especie puede circunscribirse exclusivamente a aquellos microorganismos que se obtienen en cultivo puro a partir de muestras y fluidos orgánicos procedentes de localizaciones del cuerpo habitualmente estériles, y puede llevarse a cabo con bastante facilidad mediante diversos sistemas comerciales de pruebas bioquímicas o utilizando la cromatografía de gasliquido. Hay que entender que el valor clínico de cualquier informe sobre la detección de bacterias anaerobias está directamente relacionado con la rapidez con la que dicho informe es remitido desde el laboratorio. Aquellos protocolos de identificación que necesitan una o dos semanas para completarse tienen, por lo general, un interés académico o básico solamente. Debido a la rapidez con la que progresan y a su considerable morbilidad y mortalidad, el diagnóstico inicial y tratamiento de las enfermedades causadas por las especies de Clostridium deben basarse en las manifestaciones y síntomas clínicos. En algunos pacientes de tétanos no es posible detectar la existencia de una herida primaria. Cuando existe una herida, raramente se observan microorganismos con la morfología típica de C. tetanien frotis teñidos, aun cuando la bacteria pueda recuperarse por cultivo. Además, debido a que este microorganismo está ampliamente distribuido en la naturaleza, su aislamiento a partir de una herida no implica necesariamente un diagnóstico positivo de tétanos. La confirmación del botulismo en el laboratorio requiere la detección de la toxina en el suero, las heridas, el contenido gástrico, las heces o el alimento sospechoso de haber causado la enfermedad. Los métodos para llevar a cabo la extracción de la toxina, así como las pruebas de neutralización en ratones, son técnicamente complejos: por tanto, es aconsejable que los especímenes apropiados sean enviados al CDCde Atlanta para su examen y análisis. En este caso debe hacerse una consulta telefónica previa para asegurarse de que las muestras han sido obtenidas y transportadas correctamente y que las autoridades sanitarias pertinentes han sido alertadas. En los casos en los que existe sospecha de una celulitis anaerobia o una gangrena gaseosa, el laboratorio puede ser una ayuda valiosa para el diagnóstico mediante el examen microscópico de las muestras de exudados o tejidos. El hallazgo de bacilos grampositivos grandes, en número elevado, con la típica morfología "boxear" (Lámina 50-6), permite una confirmación presuntiva del diagnostico. Los frotis teñidos pueden proporcionar también el diagnóstico de una miositis estreptocócica anaerobia. También deben realizarse cultivos a partir de
1118
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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Evancoe A. el al Evaluation of culture and the Gen-Prote Pace 2 assay lor detecton of Neissepruebas en estas circunstancias deben incluir a algunos miembros del grupo de ria gonorrhoeae intl СЫатуФа tiadmetis in endocervical specimens transported lo a state health laboratory. J Ctn Microbial 1992.30:1162. B. fragilis, otras especies de Bacteroides. algunas fusobacterias. C. períringens Linnan MJ, Mascola L, Lou XD. et al: Epidemic Islenosis associated with Mexican-style cheese. N Engl J Med 1988; y C. ramosum. Algunos agentes como el metronidazol, el cloranfenicol, el imi319:823. penem, la ampicilina-sulbactam y ticarcílina-clavulánico son casi siempre eficaLogan NA Tumbu« PCB: Saabs and recently derived genera. In Murray PR Baron EJ. Plate MA, ei al (eds) Manual ces frente a las bacterias anaerobias, por lo que no es necesario comprobar su ol Clinical Mercbiology. 7th ed Washington, DC, Amencan Society lor Microbiology. 1999. pp 357-369 tascn S. Lewno MJ. 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PA NCCLS, 2000a. referencia, las pruebas en el laboratorio clínico se llevan generalmente a cabo National Committee lor Oimcal Laboratory Standards (NCCLS). Methods lor Diwtion Antimicrobial Susceptibility Tests for Badena thai Grow Aerobcally; Approval Standard—Fifth Edition NCCLS Document M7-A5 Wayne. PA. NCCLS mediante microdilucíón o el método E-test. 2009b Parsoraiet J, Friedman GD, Vandersleen DP, el at Helicobacter pylon rietiion and the nsk ol gastnc carctema. N Engt J Med 1991; 325:1127. BIBLIOGRAFÍA Parson.net J. Hansen S. Rodriguez L. et al: Hefcobacfer pytori infection and gastnc lymphoma. N End J Med 1994; 33*1267. Bibliografía general Permer JL: The genus СатруШаег A decade ol progress. Clm Merobiol Rev 1988; 1:157 Bannatyne RM, Jackscn MC, Memish S: Rapid diagnosis ol Brucéa bacteremia by using ¡he BACIEC 9240 system. J Perkins MD Mutet! S. Refer LB: Rapid bactenal antigen detection is not clinically useful. 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El diagnóstico de laboratorio de la diarrea causada por C. difficile puede llevarse a cabo fácilmente, detectando la presencia de toxina directamente en la muestra de heces mediante enzimoinmunoensayo o bien por una prueba en cultivo de células. Alternativamente, puede comprobarse la capacidad del microorganismo aislado a partir de las heces para producir toxina.
CAPÍTULO
51
Pruebas de sensibilidad in vitro BiSr m a los antimicrobianos Michael B. Smith, M.D. Gail L. Woods, M.D.
DEFINICIONES
1119
ANÁLISIS DE ANTIMICROBIANOS
INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
1120
Recogida de muestras
SELECCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
1120
Métodos
MÉTODOS
1123
Interpretación
1127
Indicaciones
Método de dilución
BIBLIOGRAFÍA
1129
Método de difusión en disco E-test Consideraciones técnicas Sistemas de análisis PRUEBAS BACTERICIDAS
1125
Concentración mínima bactericida o letal Estudios de la tasa de muertes Estudios bactericidas del suero
La selección de un antimicrobiano depende de numerosos factores, entre los que se incluyen el lugar de la infección: diversos factores del huésped, como el estado de los mecanismos de defensa inmunológica, el estado de la función renal y/o hepática y la historia de reacciones alérgicas: las características de absorción del antimicrobiano y su vía de excreción: las propiedades farmacocinéticas y la posologia del antimicrobiano: la experiencia personal con respecto al antimicrobiano; la sensibilidad local y los patrones de resistencia; los costes de adquisición y la administración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo (rente al antimicrobiano. A pesar de que la selección del tratamiento inicial para una infección se efectúa a menudo de una manera empírica, la disponibilidad de pruebas de sensibilidad contribuye de modo adecuado al ajuste de la dosis inicial administrada o bien a la modificación del tratamiento existente por las siguientes razones: 1) el microorganismo infectante es resistente al antimicrobiano que se está administrando. 2) la dosis del antimicrobiano administrada inicialmente puede ser modificada y 3) el antimicrobiano puede ser reemplazado por otro igualmente eficaz pero de más bajo coste.
DEFINICIONES Existen diversas categorías de pruebas utilizadas para determinar la actividad antimicrobiana. La primera categoría está representada por la prueba de dilución y la prueba de difusión con disco, que valoran la actividad inhibidora de un antimicrobiano frente a un microorganismo determinado. En la segunda categoría se encuentran las pruebas que determinan la actividad letal de un antimicrobiano (bactericida o fungicida) frente a un determinado microorganismo. Una tercera categoría de pruebas se refiere a la determinación de la actividad (5-lactamasa en un determinado microorganismo, como elemento
pronóstico de su sensibilidad frente a algunos antibióticos |5-lactámicos. En la cuarta categoría se encuentran las pruebas para determinar directa o indirectamente la cantidad de antimicrobiano en un líquido biológico, habitualmente el suero. En esta categoría se incluyen las pruebas bactericidas séricas y los estudios específicos de antimicrobíanos. Las bacterias suelen describirse como sensibles, de sensibilidad intermedia o resistentes a los antimicrobianos. Las definiciones de estas categorías interpretativas han sido proporcionadas por los procedimientos recomendados para las pruebas de difusión con disco y de dilución, publicadas por el National Committee for Clinical Laboratory Standards {NCCLS M2-A6.1997; NCCLS M7-A4.1997). La sensibilidad implica que la infección producida por un microorganismo puede tratarse adecuadamente con la dosis del anlimicrobiano recomendado para este tipo de infección y de microorganismo infectante, excepto en aquellos casos en los que esté contraindicado por otras razones. Una sensibilidad intermedia supone que la infección debida a un microorganismo puede ser tratada mediante concentraciones alcanzables de determinados antimicrobianos cuando se administran éstos en dosis más altas o cuando las infecciones se encuentran en regiones del organismo donde se concentran los antimicrobianos (p. ej.. la orina). La categoría intermedia proporciona una "zona tampón" para impedir que se produzcan discrepancias importantes en la interpretación debidas a pequeños factores técnicos no controlados. La resistencia supone que la infección producida por un microorganismo no responderá o responderá de forma inadecuada al antimicrobíano. Hay que tener en cuenta que la actividad antimicrobiana m vivo depende de muchos factores, entre los que se incluyen la dosis, la vía de administración, los sistemas defensivos del huésped, el volumen de distribución del antimicrobiano. las características de absorción y de excreción del antimicrobiano, la existencia de una insuficiencia renal o hepática establecida o en desarrollo y las reacciones adversas al anlimicrobiano. Por consiguien-
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MICROBIOLOGIA MEDICA
te, las categorías de interpretación sólo proporcionan estimaciones de la actividad antimicrobiana in vivo.
A pesar de que se han descrito procedimientos para la valoración de la anfotericina B. la flucitosma y los azoles. no se han establecido los puntos de corte. Tampoco se ha establecido la utilidad clinica del estudio de la sensibilidad de levaduras y hongos filamentosos.
INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Las indicaciones para la realización de las pruebas de sensibilidad varían en función del microorganismo. Por ejemplo, el estudio de sensibilidad está indicado en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rápido, clínicamente significativas y con una sensibilidad imprevisible a los antimicrobianos de elección. En general, la prueba de sensibilidad no es necesaria cuando se sabe que el microorganismo es sensible al antímicrobiano de primera elección. En EE.UU., esto sucede con los aislamientos de Streplococcus pyogenes. que hasta la fecha son universalmente sensibles a la penicilina. Sin embargo, si el paciente es alérgico al antimicrobiano de elección, es razonable que se estudie su sensibilidad a antimicrobianos alternativos, como la eritromicina en el caso del S. pyogenes. El estudio de aislamientos que de modo característico son considerados "contaminantes" o "flora normal" es caro, conlleva mucho tiempo y puede dar lugar a una administración innecesaria de antimicrobíanos (Bates, 1991); por ello no se recomienda. De forma ocasional, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos, estos "contaminantes" son verdaderos patógenos, siendo importante que el clínico comunique estas circunstancias especiales al personal del laboratorio para que se estudien apropiadamente. Otras situaciones en las que los estudios de sensibilidad son útiles son los estudios epidemiológicos y las evaluaciones de nuevos antimicrobíanos. Debido a los patrones variables de sensibilidad de las bacterias anaerobias, el Working Group on Anaerobio Anlimicrobial Susceptibility Teslmg ol Ihe NCCLS ha recomendado que se estudie la sensibilidad de las bacterias anaerobias aisladas de los siguientes tipos de infecciones: abscesos cerebrales, endocarditis, osteomielitis, infecciones articulares, infecciones de prótesis implantadas e injertos vasculares y en las bacteriemias refractarias o recurrentes (NCCLS M11-A4, 1997). También deben estudiarse especies resistentes o especialmente virulentas, como Bacleroidesde\ grupo Iragilis, PrevotelialPorphyromonas sp.. algunas especies de fusobacterias y clostridios. Bilophilia wadsworthia y Bacteroides del grupo gracilis (NCCLS M11-A4. 1997). Por otra parte, el estudio de sensibilidad de las bacterias anaerobias debe realizarse periódicamente para monitorizar los patrones de sensibilidad en diversos centros y hospitales de EE.UU. y demás países, también para determinar la sensibilidad a nuevos antimicrobianos. Las indicaciones para el estudio de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis han cambiado debido al resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. y a la aparición de cepas multirresistentes. Actualmente se recomienda que los aislamientos iniciales de lodos los pacientes sean valorados y que el estudio se repita si la muestra de esputo continúa presentando un cultivo positivo tras tres meses de terapia (Tenover, 1993a). No existen pautas sólidas respecto al estudio de sensibilidad de micobacterias atípicas. Durante los últimos años se ha incrementado la prevalencia de las infecciones fúngicas sistémicas. sobre todo en inmunodeprimidos, y se han desarrollado nuevos antifúngicos. Por otra parte, se ha descrito la resistencia de ciertos hongos a la terapia tradicional (como Candida lusilanae, resistente a la anfotencma B): debido a un aumento en la utilización de los azoles. especialmente el fluconazol. han aparecido levaduras resistentes a estos antimicrobianos (sobre todo especies de Candida). Como resultado se ha incrementado el interés en el estudio de sensibilidad de los antifúngicos. Se creó el NCCLS Subcommitlee on Antiíungal Susceplibility Testing para evaluar la necesidad de una selección de paulas en la terapia antifúngica que ayude al laboratorio. Reuniendo datos se estableció una necesidad, ante la cual el subcomité desarrolló un método de referencia de macrodilución en caldo y una adaptación de microdilución para el estudio de levaduras (especies de Candida y Cryplococcus neoiormans) que producen infecciones sistémicas (NCCLS M27-A, 1997). De modo similar, para evaluar la sensibilidad a los antifúngicos se ha desarrollado un procedimiento de macrodilución en caldo y una adaptación de microdilución utilizando conidias o esporangiosporas de hongos filamentosos, como especies de Aspergillus. especies de Fusarium. especies de Rhizopus. Pseudoallescheña boydií y la forma micelar de Sporothrix schenckii (NCCLS M38-P. 1998).
SELECCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS La selección de anlimicrobianos para estudios de sensibilidad (Tabla 511) se ha complicado debido a la ampliación de su espectro de actividad y del número de compuestos dentro de las clases de antimicrobíanos del mismo espectro. |unto a las nuevas clases de antimicrobíanos (NCCLS M100-S9. 1999). El estudio de todos los compuestos disponibles no es necesario ni práctico. El proceso de selección comienza en el Pharmacy and Therapeulics Commitlee. que selecciona los antimicrobíanos para la guia de fármacos de uso hospitalario. El objetivo será coordinar los antimicrobianos de la guía que deben estudiarse o informarse. Esta coordinación tiene hoy en día una gran importancia por diversas razones. En primer lugar, la mayoría de los laboratorios utilizan paneles de microdilución preparados comercialmente para el estudio de la sensibilidad antibacteriana. Los fabricantes ofrecen una diversidad de paneles que se diseñan para corresponderse tanto como sea posible con los antibacterianos de las guías hospitalarias A pesar de la variedad de paneles disponibles, existe con frecuencia disparidad entre los antimicrobianos de los paneles y los de la guía hospitalaria, por lo que el laboratorio debe enfrentarse la tarea de estudiar más de un panel para un microorganismo determinado o pagar un precio suplementario para disponer de un panel, de acuerdo con las especificaciones del hospital. Sin embargo, en muchos casos se estudian más antimicrobianos de los disponibles en la guía del hospital, por lo que el laboratorio debe suprimir los resultados de los antimicrobíanos que no se encuentran en ésta. En segundo lugar, generalmente no es necesario informar los resultados de los estudios de sensibilidad de muchos compuestos que presentan el mismo espectro (p. ej., cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona), incluso aunque exista más de uno en la guia. En tercer lugar, existe con frecuencia un retraso entre la aprobación del agente para su utilización clínica y su incorporación en el producto comercializado de la prueba de sensibilidad, debido a que los fabricantes de sistemas de pruebas de sensibilidad antimicrobiana preparados comercialmente deben presentar los datos a la Food and Drug Adminislration (FDA). validando la exactitud de sus equipos frente a cualquier antímicrobiano aprobado recientemente. En consecuencia, puede ser aprobado un nuevo antimicrobiano para la guia del hospital antes de que el laboratorio tenga capacidad para estudiar su actividad in vilro. En las normas del NCCLS para el estudio de la sensibilidad por dilución y difusión en disco se enumeran antimicrobianos que deben considerarse para la valoración frente a enterobacterias, Pseudomonas. estafilococos, enterococos, estreptococos no enterococos y Haemophilus (NCCLS M2A6, 1997; NCCLS M7-A4, 1997): sin embargo, el número de compuestos enumerados en la agrupación primaria (grupo A) y en la agrupación secundaria (grupos B y C), que deben considerarse para las pruebas, sobrepasa a menudo el número de los que deben estudiarse en un laboratorio determinado. Los documentos del NCCLS enumeran la piperacilina. la mezlocilina y la ticarcilína en las agrupaciones primarias que deben estudiarse frente a Pseudomonas. Puesto que se recomienda que las penicilinas activas frente a Pseudomonas no deben utilizarse individualmente (Gribóle. 1983) y dado que ningún estudio clínico de pacientes con enfermedades graves (p. ej„ neutropenia febril) ha demostrado diferencias significativas en los resultados entre regímenes terapéuticos combinados de diversas penicilinas más un aminoglucósido, las diferencias en los grados de actividad in vilro de las penicilinas activas frente a Pseudomonas no son clínicamente importantes y la selección de una penicilina activa frente a Pseudomonas para la guia (y, por tanto, para el estudio de la sensibilidad in vilro) puede basarse en la lista de las indicaciones aprobadas para la utilización de un compuesto del mismo espectro y sus costes de adquisición y administración, relativos a cualquier otro miembro de la misma clase de espectro. El ácido clavulánico incrementa el espectro de la ticarcilína frente a enterobacterias y estafilococos productores de (Mactamasa mediada
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN varío A LOS ANTIMICROBÍANOS
por plásmidos. pero poco añade a la actividad antipseudomonas de la ticarcilína; no obstante, existen pocas diferencias entre las actividades antipseudomonas de la piperacilina y de la ticarcilína (con o sin ácido clavulánico) con respecto a la concentración mínima inhibitoria (CMI) recomendada por el NCCLS para definir la sensibilidad de Pseudomonas, es decir, menor o igual a 64 ug/ml (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Una posible consideración es que a pesar de que los costes de adquisición por gramo de ticarcilina-clavulánico pueden ser más elevados que los de una penicilina antipseudomonas. los costes de la administración de ticarcilina-
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clavulánico más un aminoglucósido pueden ser menores que los de una penicilina antipseudomonas más un aminoglucósido más oxacilina. Asi pues, los costes de la administración pueden pesar significativamente más que los costes de adquisición de un agente antibacteriano determinado. La farmacocinética de cualquier antimicrobiano afecta de manera evidente los costes de la administración, ya que un antímicrobiano con una vida media prolongada puede administrarse en un régimen de dosificación menos frecuente que otro antimicrobiano del mismo espectro antibactenano de actividad pero con una vida medía mas corta.
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Aunque en general existe consenso para estudiar la sensibilidad de estafilococos y estreptococos a penicilina, de enterococos y enterobacterias a ampicilina y de los estafilococos a oxacilina. hay menos acuerdo en lo que se refiere a las cefalosporinas que deben estudiarse frente a las bacterias gramposítivas y gramnegafivas. La cefalotina puede utilizarse como representante de las cefalosporinas de primera generación, incluyendo la cefazolina; sin embargo, se recomienda que la cefazolina no se utilice como representante de clase para la cefalotina y otras cefalosporinas de primera generación, debido a la inaceptable tasa de falsas sensibilidades para otras cefalosporinas, en especial por lo que se refiere a Eschetichia coli (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Por tanto, la cefazolina sólo debe estudiarse si es la clase representativa de la guia. Existe bastante controversia respecto a la necesidad de estudiar las cefalosporinas de segunda generación y, en caso de hacerlo, cuáles deben ensayarse frente a las enterobacterias. El cefotetán. la cefoxitina y el cefamandol. el cefonicid o la cefuroxima se enumeran como antimicrobianos primarios que hay que considerar para las pruebas en las instituciones en las que existe resistencia endémica o epidémica frente a antimicrobianos primarios (es decir, cefazolina o cefalotina) estudiados en la misma clase. Una vez más, la selección depende de la existencia en la guía y de las indicaciones que han sido especificadas por el Pharmacy and Therapeutics Commillee en cuanto a su utilización. Por ejemplo, el cefotetán o la cefoxitina pueden estar disponibles en el hospital para el tratamiento de infecciones por bacterias anaerobias y, en este caso, puede ser útil estudiarlas frente a cualquier enterobacteria que pueda estar presente en una infección mixta aerobía-anaerobía. Por otra parte, es posible que en el hospital se disponga de una o más cefalosporinas de segunda generación únicamente como profilaxis perioperatoria; en este caso, tal vez sea innecesario estudiarlas de forma sistemática. La selección de cefalosporinas de tercera generación para estudiar su sensibilidad no sólo se basa en las cefalosporinas que se encuentren en la guía, sino también en la equivalencia de actividad in vitro. Por ejemplo, entre cefoperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona y ceftazidima existen sólo pequeñas variaciones de actividad con respecto a las enterobacterias. Por consiguiente, incluso en el caso de que en la guía existan más de uno de estos compuestos, es posible estudiar sólo uno como representante de los demás frente a las enterobacterias. La única excepción posible a esta norma se refiere a las |5-lactamasas de espectro ampliado (ESBL) de Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias. Estas |$-lactamasas mediadas por plásmidos onginan resistencia a las cefalosporinas, aunque no a cefamicinas ni a imipenem (CTX-1 o TEM-3), o bien presentan actividad preferencial frente a la ceftazidima (CAZ-1 o TEM-5 y CAZ o TEM-6) (Jarlier, 1988; Sirot. 1988; Sougakoff, 1988). La resistencia cruzada entre cefalosporinas de tercera generación se observa también en mulantes gramnegativos desreprimidos de (J-lactamasa de clase I, dado que el inoculo se ha ajustado aproximadamente a 5 x 10" unidades formadoras de colonias (UFC)/ml y la prueba se incuba durante un mínimo de 6 horas (Washington, 1988). En muchos casos, en la guia del hospital se encontrará bien cefoperazona o bien ceftazidima para el tratamiento de Pseudomonas. Por tanto, la principal cuestión reside en sí ambos antimicrobianos deben ser estudiados en el laboratorio frente a las enterobacterias. con el fin de fomentar la limitación del uso de cualquiera de ambos en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas y reducir el riesgo de la aparición de resistencia. La aparición de |i-lactamasas mediadas por plásmidos con actividad preferencial frente a ceftazidima, así como las |i-lactamasas mediadas por plásmidos preexistentes con actividad frente a cefoperazona entre las enterobacterias, conducirá a una política de limitación de las pruebas de sensibilidad de cefoperazona o ceftazidima frente a Pseudomonas. Los laboratorios deberían considerar el estudio de sensibilidad de todos los aislamientos de enterococos (rente a vancomicina, dada la aparición de cepas resistentes (Livornese. 1992; HICPAC, 1995). No obstante, no todos los sistemas automáticos detectan con fiabilidad la resistencia de los enterococos frente a vancomicina: si se emplea uno de estos sistemas menos fiables, se recomienda la inclusión de un método alternativo (difusión en disco, estudio en agar o E-test) para asegurar unos resultados exactos (Sahm, 1991; Tenover, 1993b; Woods, 1993; Kohner, 1997; Endtz, 1998). Se deben
realizar estudios de resistencia elevada a gentamicina y a estreptomicina en todos los aislamientos de enterococos procedentes de zonas estériles del organismo, y debe informarse al clínico (quizás a través de un comentario adjunto a los resultados de las pruebas de sensibilidad) de que está indicada la terapia de combinación entre penicilina o ampicilina más un aminoglucósido en las infecciones graves por enterococos. como la endocarditis. Como sucede con la vancomicina, no todos los sistemas automáticos detectan con habilidad la resistencia elevada a los aminoglucósidos. pudiendo ser necesario investigar un método alternativo que se conozca que proporciona resultados exactos (Wiley, 1992). El NCCLS aconseja estudiar la producción de [i-lactamasa en los enterococos aislados de sangre y liquido cefalorraquídeo (LCR). Los antimicrobianos a considerar en el estudio de los aislamientos urinarios de enterococos son ciprofloxacína (o bien levofloxacina o norfloxacina), nitrofurantoína y tetracichna. Los resultados de las pruebas de sensibilidad de los enterococos frente a cefalosporinas. aminoglucósidos (excepto los estudios de resistencia elevada), clindamicma y Irimetoprim-sulfametoxazol pueden despistar y no deben informarse. El estudiar o no e informar de la actividad del aztreonam. la ciprofloxacína y el imipenem de forma periódica habitualmente reflejará su presencia en la guía del hospital y, en caso de encontrarse, cualquier restricción en su uso (p. ej., sólo mediante consulta de enfermedad infecciosa). En cuanto a Haemophilus influenzae, el grupo primario de antimicrobianos que hay que considerar en las pruebas de sensibilidad de los aislamientos de sangre y LCR está formado por ampicilina. una cefalosporina de tercera generación (cefotaxima. ceftazidima. ceftizoxima o ceftriaxona) y cloranfenicol. Si la muestra procede de una infección localizada, que no supone un riesgo para la vida, los antimicrobíanos a considerar incluyen ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol. amoxicilina-clavulánico (o ampicilina-sulbactam), cefaclor y tetraciclina. Los resultados de las pruebas de sensibilidad frente a ampicilina predicen la actividad de la amoxicihna. La resistencia a ampicilina puede delectarse en la mayoría de casos por el estudio de la producción de |5-lactamasa; sin embargo, existen cepas |5-lactamasa negativas con resistencia cromosómica a ampicilina (BLNAR) (Mendelman, 1984). Por tanto, si la prueba de la |3-lactamasa es negativa, la sensibilidad a ampicilina puede confirmarse mediante la prueba de dilución o difusión en disco si la incidencia de BLNAR es alta en la región del servicio de análisis. Debe estudiarse la resistencia a penicilina de todos los aislamientos de Streptococcus pneumoniae procedentes de zonas estériles del organismo. Si se realiza mediante la prueba del disco de oxacilina, los aislamientos con un diámetro de halo menor o igual a 19 mm deben evaluarse adicionalmente por un método de dilución para distinguir las cepas resistentes de las de sensibilidad intermedia. La consideración de otros antimicrobianos en el estudio de aislamientos procedentes de zonas estériles del organismo varía en función del método de prueba utilizado. En pacientes con infecciones que suponen un riesgo para la vida, como meningitis o bacteríemias, el NCCLS recomienda el estudio de penicilina, cefotaxima, ceftriaxona. meropenem y vancomicina. Se han proporcionado normas interpretativas sobre métodos de dilución para estos antimicrobianos: sin embargo, sobre métodos de difusión en disco sólo existen normas interpretativas para penicilina y vancomicina; por tanto, los métodos de difusión en disco sólo pueden utilizarse para estos dos últimos antimicrobíanos (NCCLS M100-S9,1999). Los antimicrobíanos que hay que considerar en el estudio de aislamientos procedentes de infecciones que no representan una amenaza para la vida incluyen penicilina (mediante la prueba del disco de oxacilina), eritromicina y trimetoprim-sullametoxazol. Con respecto a los estreptococos del grupo viridans. se debe analizar la sensibilidad frente a penicilina de cualquier aislamiento implicado en endocarditis bacteriana o, con menor frecuencia, en meningitis (Goldfarb. 1984; Oumn. 1988). Está justificado el estudio de sensibilidad de los estreptococos del grupo viridans frente a las cefalosponnas consideradas para la terapia, ya que pueden presentar resistencia relativa a las cefalosporinas de tercera generación (Wilcox. 1993). La vancomicina es la alternativa recomendada a los fármacos p-lactámicos, aunque no es necesario su estudio sistemático, dado que no se ha informado de resistencia a vancomicina en este grupo de microorganismos. Sin embargo, la valoración de la sensibilidad a vancomicina es útil para propósitos de identificación, pues la resistencia indicaría que el
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
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microorganismo no es un estreptococo del grupo viridans, sino más probablemente un miembro de los géneros intrínsicamente resistentes a vancomicina. como Leuconosloc o Pediococcus. Las pruebas habituales de sensibilidad de los aislamientos de Neissena gonorrhoeae no son necesarias. El estudio de la producción de |l-lactamasa en todos los aislamientos lúe importante en el pasado, pero no es muy recomendado, dado que ni la penicilina ni la ampicilina están incluidas en los regímenes terapéuticos recomendados para las infecciones gonocócicas por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC. 1993). Sin embargo, la determinación de la resistencia a penicilina puede ser útil para propósitos epidemiológicos. La prueba de la |i-lactamasa detecta la mayoría de aislamientos resistentes a penicilina, aunque no determina algunas cepas con resistencia cromosómica; por ello, la sensibilidad a penicilina de los aislamientos IWactamasa negativos se debe confirmar mediante una prueba adicional, como el método de difusión en disco.
placas de microdilución preparadas comercialmente sólo contienen una única concentración de antimicrobiano, que se utiliza para distinguir entre las categorías sensible y resistente. La mayoría de las cepas de referencia utilizadas para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad son muy sensibles a los antimicrobianos adecuados, por lo que la limitación de las concentraciones de los antimicrobianos plantea problemas extraordinarios en el control de calidad. En otras palabras, los intervalos aceptables de CMI para una cepa determinada de referencia frente a un antimicrobiano determinado pueden estar varias log de diluciones por debajo de la concentración más baja presente para ese antimicrobiano del sistema de la prueba de sensibilidad. Este problema aumenta la responsabilidad del fabricante en el control de calidad del sistema de la prueba de sensibilidad.
Se ha incrementado la resistencia de las bacterias anaerobias a los antimicrobíanos. Ejemplos de esto incluyen, entre otros, el aumento de resistencia de Bacteroides spp. frente a clíndamicina y a (Mactámicos. Las bacterias anaerobias todavía muestran un alto porcentaje de sensibilidad a metronidazol, cloranfenicol, imipenem. ampicilina-sulbactam y ticarcilinaclavulánico; no obstante, la decisión de estudiar una bacteria anaerobia frente a un determinado antimicrobiano debe hacerse en función de la especie bacteriana y de la situación clínica (NCCLS M11-A4.1997). No existe un acuerdo sobre la eficacia clínica de cieñas cefalosporinas nuevas ni sobre la posibilidad de evaluar in vitro la respuesta clínica (NCCLS M11-A4,1997). La prueba de la |J-lactamasa (cefalosporina cromogénica) se ha empleado para predecir la resistencia a penicilina y ampicilina. sin embargo, la resistencia frente a |i-lactámicos de algunas especies no está mediada por [ilactamasas. lo cual limita su utilidad para anaerobios. Los estudios con el propósito de establecer los patrones de sensibilidad local deben limitarse a los antimicrobianos de la guía.
En la prueba de difusión en disco, cuya utilización eslá en gran parte limitada a bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rápido, se aplica un disco de papel que contiene una cantidad especificada (no concentración) del antimicrobiano en una superficie de agar que ha sido recientemente inoculada con un microorganismo El antimicrobiano difunde en el medio a partir del disco, originando un halo de inhibición hasta el punto en el cual una concentración crítica del antimicrobiano inhibe el crecimiento del microorganismo en un tiempo determinado (habitualmente de 18 a 24 horas). Se mide el diámetro del halo de inhibición y se relaciona de manera inversa con la CMI (es decir, cuanto más grande es el diámetro del halo de inhibición, más baja es la CMI y viceversa). En condiciones ideales, la relación entre las dos pruebas puede ser expresada mediante una línea de regresión: los equivalentes de sensibilidad y resistencia del diámetro del halo para un antimicrobiano determinado pueden extrapolarse a partir de sus intercesiones en la línea de regresión con las correspondientes CMI utilizadas para definir la sensibilidad y la resistencia.
Los antituberculosos primarios que se deben estudiar en los aislamientos de Mycobacterium tuberculosis son isoniacida. rifampicina. etambutol y pirazmamida. Si se sospecha la resistencia a uno o más de estos fármacos, deben realizarse pruebas adicionales de sensibilidad frente a antimicrobianos, incluyendo estreptomicina, etionamida, canamicina. capreomicina, rifabutina, ofloxacina y cicloserina (Tenover, 1993a). Se recomienda el estudio de resistencia a macrólidos de los aislamientos clínicamente signilicativos de Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), sobre todo si el paciente ha recibido previamente terapia con macrólidos para una infección por MAI o no se conoce su terapia previa (Wallace, 1997). En cuanto a las levaduras, las normas del NCCLS incluyen información sobre el estudio de ciertos antifúngicos. aunque sólo se dispone de puntos de corte interpretativos en las pruebas de sensibilidad de especies de Candida frente a fluconazol y flucitosma (NCCLS M27-A, 1997).
MÉTODOS Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana pueden clasificarse de acuerdo al resultado final que hay que determinar. El resultado final de la mayoría de pruebas realizadas en el laboratorio clínico es la inhibición. Existen indicaciones limitadas para la determinación de actividad bactericida in vitro. La actividad inhibitoria normalmente se determina mediante una técnica de dilución o de difusión en disco.
Método de dilución En la prueba de dilución, el microorganismo es inoculado en una serie de tubos o pocilios que contienen una serie de concentraciones que suelen comenzar con una potencia de 2 (p. ej., 128 ug/ml) y disminuye en una base log., (p. ej., 64. 32. 16. 8, 4) hasta la concentración más baja estudiada. La concentración más baja que inhibe el crecimiento visible se denomina concentración mínima inhibitoria o CMI. Por conveniencia y economía, se ha hecho cada vez más frecuente limitar los intervalos de las concentraciones de cada antimicrobiano estudiado a aquellas concentraciones que comprenden las equivalentes a las categorías sensible y resistente En algunos casos, las
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Método de difusión en disco
E-test El E-test es un método de dilución basado en la difusión de un gradiente continuo de concentración de un antimicrobiano a partir de una tira de plástico en un medio de agar. La tira de plástico, que tiene una concentración predefinida de fármaco seco y estabilizado en una cara y una escala de CMI interpretativa en la otra, se coloca en la superficie del medio de agar inoculado con el microorganismo a estudiar. La placa se incuba según la atmósfera y el tiempo requeridos por el microorganismo en cuestión. Tras la incubación, se forma una elipse de inhibición del crecimiento alrededor de la tira: la CMI se lee en el punto de la escala donde la elipse cruza la tira Dado el coste de estas tiras, puede no ser práctica la selección del E-test como método pnmano para el estudio de sensibilidad. Sin embargo, el E-lest es una alternativa valiosa para el estudio de sensibilidad de bacterias de difícil crecimiento, como S. pneumoniae o Haemophilus influenzae, también de algunos antimicrobianos clave frente a anaerobios (Jorgensen. 1994; Sanchez. 1992).
Consideraciones técnicas Se lleven a cabo pruebas de dilución o de difusión, la estandarización de la técnica y el medio utilizado en ésta son de máxima importancia para obtener resultados exactos y reproducibles. En EE.UU., las organizaciones profesionales, la industria y el gobierno han trabajado de forma consensuada dentro del NCCLS con el fin de elaborar una serie de documentos que describen procedimientos estandarizados para estudiar la sensibilidad de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (NCCLS M2-A6. 1997; NCCLS M7-A4,1997), bacterias anaerobias (NCCLS M11-A4,1997). micobacterias (NCCLS M24-T, 1995) y hongos (NCCLS M27-A, 1997), Estas técnicas deben estar disponibles en los laboratorios clínicos de referencia y proporcionar los detalles técnicos concernientes a la realización de las pruebas de sensibilidad. El Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing revisa y modifica las tablas de los documentos cada año y los textos de los documentos cada tres años. Por tanto, los laboratorios deben asegurarse de que están empleando las tablas y los textos más actuales y de que las revisiones se incorporen a la práctica de laboratorio.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Medio Una variable importante de los estudios de sensibilidad es la composición del medio. En la actualidad, el NCCLS recomienda el medio Mueller-Hinton para el estudio de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, ya que presenta una buena reproducibilidad entre distintos lotes: tiene una concentración baja de inhibidores de sulfonamida, trimetoprim y tetraciclina y permite el crecimiento de la mayoría de patógenos bacterianos que no son de difícil crecimiento. Algunas bacterias, sobre todo estreptococos, no crecen bien en medios de Mueller-Hinton no suplementados, un problema que se supera mediante la suplementación con sangre desfibrinada de cordero, caballo u otro animal a una concentración final del 5% (v/V). Varios componentes o suplementos del medio Mueller-Hinton pueden afectar a los resultados de la prueba de sensibilidad. En los métodos de dilución y de difusión en disco, las variaciones en la concentración de cationes divalentes, sobre todo calcio y magnesio, afectan a los resultados del estudio de Pseudomonas aerugmosa frente a aminoglucósidos y colistína, así como de otras bacterias frente a tetraciclina. Una concentración catiónica elevada causa falsas resistencias, mientras que un contenido catiónico bajo presenta el efecto contrario (Barry. 1987, 1992: NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). El pH del medio debe estar entre 7,2 y 7,4. Un pH por debajo de este intervalo origina la pérdida de potencia de fármacos como los aminoglucósidos y los macrólidos, mientras que otros (p, ej., las penicilinas) aparentan tener una mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se produce el efecto contrario. En los métodos de dilución en caldo, se recomienda el suplemento del caldo Mueller-Hinton con NaCI al 2% para mejorar la detección de estafilococos resistentes a oxacilina (NCCLS M7-A3. 1993b). La detección de resistencia heterogénea en la que menos del 0,01% de las bacterias expresan el rasgo de resistencia se incrementa con la adición de sal al medio. Un método alternativo para la detección de resistencia a oxacilina de los estafilococos consiste en la utilización de agar Mueller-Hinton suplementado con NaCI al 4% y la incorporación de 6 ug de oxacilina por mililitro (Chambers. 1988). Otras cuestiones referentes a los medios están relacionadas con las pruebas de sensibilidad de H. influenzae. para el cual se recomienda el medio para pruebas con Haemophilus (HTM) (NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4, 1997), y las pruebas de N. gonorrhoeae. para el que se recomienda una base de agar GC. El medio Mueller-Hinton. tan desprovisto de timidina como sea posible, es importante para la determinación exacta de la sensibilidad bacteriana a trimetoprim/sulfametoxazol. Algunas especies pueden utilizar la timina o timidina del medio para evitar el mecanismo de acción del trimetoprim y las sulfonamidas, dando lugar a falsas resistencias. Se puede incorporar al medio timidina tosforilasa o sangre lisada de caballo para mejorar la fiabilidad del estudio de trimetoprim y sulfametoxazol. Con un medio libre de timidina se obtienen resultados exactos de las pruebas de sensibilidad con microorganismos distintos de los enterococos. Para anaerobios, la dilución en agar empleando agar Brucelia suplementado con sangre lacada y vitamina K (método Wadsworth) es el método de referencia (NCCLS. M11-A4,1997). Se ha seleccionado la sangre Brucelia en lugar del agar Wilkins-Chalgren empleado en el pasado, debido a su capacidad superior para permitir el crecimiento de anaerobios de dilícil crecimiento. Para el estudio de sensibilidad de anaerobios, no se recomiendan ni el método de difusión disco-placa ni los métodos de elución disco-caldo, ya que presentan una pobre correlación con el método de dilución en agar de referencia. El método de microdilución utilizando caldo de Schaedler, Brucelia, West-Wilkins, inlusíón cerebro-corazón o un caldo con la misma formulación que el agar Wilkins-Chalgren, pero sin agar. es más práctico para su empleo en el laboratorio clínico que el método de referencia (NCCLS, M11-A4.1997). También puede utilizarse el E-test. Existen otros factores relacionados con el medio que influyen sobre la difusión en disco. Por ejemplo, el grosor del agar debe ser de 4 mm. Si el agar es demasiado ancho puede originar falsas resistencias, mientras que si no lo es bástanle pueden aparecer falsos resultados sensibles. Las concentraciones de ciertos cationes divalentes pueden afectar los resultados de las pruebas de sensibilidad, como el magnesio y el calcio en el estudio de Pseudomonas aeruginosa frente a tetraciclina y aminoglucósidos. Cuando el agar MuellerHinton se suplementa con sangre, los diámetros de halo para oxacilina y meticilina pueden ser de 2 mm a 3 mm inferiores a los obtenidos sin el suple-
mento. La sangre de cordero puede causar diámetros de halo imprecisos alrededor de los discos de trimetoprim y sulfonamida o una película de crecimiento dentro del halo de inhibición.
Inoculo Las variaciones del tamaño del inoculo son responsables de las mayores variaciones diarias en los resultados de las pruebas de sensibilidad. La utilización del inoculo adecuado es especialmente importante en la delección exacta de resistencia a penicilina y oxacilina en los estafilococos, asi como a penicilinas de amplío espectro y cefalosporinas en mulantes gramnegativos con (Vlactamasa de clase I desreprimida (p. ej., Enlerobacter, Cilrobacter. Pseudomonas). El NCCLS recomienda una suspensión 0,5 de McFarland (18 2x10* UFC/ml) para la dilusión disco-placa y la dilución de una suspensión 0,5 de McFarland hasta una concentración linal de 5 x 10 UFC/ml para la dilución en caldo (NCCLS M2-A6.1997: NCCLS M7-A4,1997). En los laboratorios que utilizan sistemas de microdilución se observa a menudo una elevada tasa (del 20% al 40%) de sensibilidad de Enterobacter cloacae a ampicilina. Esta observación siempre se debe al empleo de una cantidad demasiado pequeña de inoculo. En consecuencia, es necesario que los usuarios de sistemas de microdilución incluyan entre sus métodos de control de calidad la cuantificación de su inoculo de una manera regular. La sensibilidad de Enterobacter cloacae a la ampicilina no debe ser en general superior al 5%. Un segundo factor relacionado con el inoculo es el método de preparación. Para muchas bacterias no es importante, pero para estafilococos (con el fin de garantizar la detección de resistencia a oxacilina) y para bacterias de difícil crecimiento, como S. pneumoniae, H. influenzae y N. gonorrhoeae, el inoculo debe prepararse a partir del crecimiento durante una noche (18 a 20 horas) en un medio de agar (Chambers. 1988; NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4,1997). S
Incubación Las condiciones de incubación también afectan a los resultados de la prueba de sensibilidad. Las recomendaciones generales son la incubación durante una noche (16 a 20 horas) en atmósfera aerobia a 35C: no obstante, existen excepciones. Los aislamientos de S. pneumoniae. H. influenzae y N. gonorrhoeae requieren incubación en atmósfera con un 5%-7% de C0 , además S. pneumoniae y N. gonorrhoeae deben incubarse hasta 2024 horas más. Los estafilococos y enterococos también deben incubarse durante 24 horas para garantizar la detección de resistencia a oxacilina y vancomicina, respectivamente. Los anaerobios y levaduras requieren 48 horas de incubación, aunque se recomiendan 72 horas para los aislamientos de Cryptococcus neoformans. Para más detalles sobre métodos de sensibilidad se recomienda consultar los documentos adecuados del NCCLS. 2
Sistemas de análisis De acuerdo con los resultados de los recientes programas de competencia del College of American Pathologists, la mayoría de los laboratorios de este país utilizan en la actualidad sistemas de microdilución. Una razón para pasar de la tecnología de difusión a la de dilución es la mayor eficacia de la inoculación replicada en sistemas combinados de identificación y pruebas de sensibilidad y a la gestión de datos mediante paquetes de software característicos de estos sistemas. Otras razones son a menudo inconsistentes y se basan en la falsa idea de que las CMI son más exactas y constituyen los datos que los médicos desean conocer. Dado que los resultados de las pruebas de dilución y difusión se correlacionan notablemente desde un punto de vista estadístico y puesto que la mayoría de los médicos que no son especialistas en enfermedades infecciosas tienen dificultades para interpretar las CMI, se requiere que los laboratorios informen de categorías interpretativas junto a las CMI; la elección entre las pruebas de difusión y las de dilución se realiza por motivos puramente económicos en casi todos los casos. Hoy en día, se dispone de numerosos sistemas comercializados entre los que se puede escoger. Antes de llevar a cabo la elección, el director del laboratorio debe considerar si las ventajas de la inoculación replicada y los sistemas de gestión de datos superan los costes añadidos de estos equipos, cuando se comparan con la simplicidad, la conveniencia y la economía
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
proporcionada por la prueba de difusión en disco. Existe entre el personal de laboratono una desafortunada tendencia a considerar la prueba de dilusión en disco anticuada y demasiado poco sofisticada para la práctica actual. Esta prueba todavía desempeña su papel de forma exacta y adecuada, ademas de ser económica Los resultados obtenidos son comprensibles para el médico y suficientes en casi todas las situaciones donde se aplica un tratamiento antimicrobiano. La difusión en disco también proporciona flexibilidad, ya que se pueden estudiar prácticamente todos los antimicrobianos simplemente seleccionando el disco adecuado. La selección de un sistema mecanizado o semiautomatizado debe basarse en numerosas consideraciones. Entre éstas se encuentran el número de muestras, la experiencia técnica, la necesidad de gestión de los datos, la utilización de un sistema común de identificación bacteriana y de pruebas de sensibilidad, la compatibilidad con los sistemas de información del laboratorio, los costes de adquisición o de arrendamiento del equipo, el coste de los suministros y reactivos fungióles, el coste de los contratos de servicios y la disponibilidad de espacio. En el sistema VITEK (bioMérieux, Hazelwood. MO). los antimicrobíanos se encuentran en pocilios dentro de una placa de plástico. Este sistema consta de un módulo llenador/sellador, un lector/incubador, un módulo informático, una terminal de datos y una impresora. Las placas se incuban en el módulo lector/incubador y los pocilios se monitorizan por densidad óptica. Los resultados se obtienen en cuatro horas: sin embargo, el tiempo medio de incubación para las pruebas de sensibilidad es aproximadamente de siete horas. Este tiempo de incubación es suficiente para proporcionar una detección exacta de mutantes desreprimidos para |i-lactamasas de clase I, estafilococos productores de penicilinasa y estafilococos resistentes a oxacilina. Existen ciertos sistemas de microdilución en los que los antimicrobíanos se proporcionan en estado congelado o liofilizado La selección entre estos sistemas no sólo se basa en la disponibilidad de espacio de congelación para el almacenamiento de las placas, sino también en la disponibilidad del tiempo que requiere cada sistema. La selección también puede basarse en la disponibilidad y la sofisticación de los sistemas de gestión de datos. En algunos casos, los resultados finales se leen de modo visual y se introducen manualmente con propósitos de informe y almacenamiento (p. ej., Pasco. Becton-Dickmson Diagnostic Systems. Sparks. MD). En otros casos, los resultados son leídos por el sistema fotométricamente (p. ej„ MícroScan WalkAway, Dade Behring. Inc; Aris. Trek Diagnostic Systems. Westlake. OH). Tanto el sistema MícroScan como el Ans poseen capacidad para estudiar la sensibilidad aproximadamente a las 5 horas de incubación o bien tras 18 horas de incubación De los sistemas disponibles actualmente, VITEK, MícroScan WalkAway y Aris ofrecen capacidades "walkaway". Debido a la escasez actual de londos para el equipamiento, cada vez más laboratorios utilizan sistemas de alquiler de equipos financiados a través del consumo de reactivos. Con el obieto de mantener el equipo y el software, suele ser necesario disponer de un contrato de servicio, cuyo coste básico es aproximadamente el 10% del valor de adquisición del equipo. Los fabricantes de sistemas fomentan la rapidez de las pruebas de sensibilidad, proporcionando las CMI en tres o cinco horas Sin embargo, estos sistemas no detectan con fiabilidad los estafilococos resistentes a penicilina o a meticilina. tampoco los bacilos gramnegativos desreprimidos para li-lactamasas de clase I, y parecen necesitar un mínimo de 6 horas para la detección de su resistencia a la mayoría de los antibióticos |i-laclámicos (Lampe. 1979; Washington, 1988) Incluso en el caso de que las pruebas sean exactas, ¿supone alguna ventaja el hecho de que sean más rápidas? En un estudio no aleatorizado. Matsen (1985) ha descrito los resultados tanto de un sistema rápido de 3 a 5 horas como de una prueba de difusión en disco, preguntando posteriormente a los clínicos hasta qué punto el hecho de recibir antes el resultado influía en su elección del tratamiento antimicrobiano, En el 31,7% de los casos los médicos indicaron que, basándose en el resultado rápido, iniciaban el tratamiento con un antibiótico distinto del que habrían utilizado en otras circunstancias; en otro 17% los médicos señalaron que "probablemente" habria influido. La mayoría de pacientes que participaron en el estudio tenían bactenuna. En un estudio prospectivo aleatorizado de 794 pacientes de cirugía general, Vmcent (1985) proporcionó resultados rápidos para la milad de los pacientes y resultados convencionales para la otra mitad. Observó que el tratamiento antimicrobiano se modificó en el 14.5% de ios casos en el grupo de pacien-
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tes para quienes se obtuvieron resultados rápidos y en el 8,8% de los casos en el grupo de pacientes para quienes se obtuvieron resultados convencionales (p <0,001); no obstante, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos con respecto a la duración de la estancia de los pacientes en el hospital. Doem y cois. (1994) evaluaron el impacto clínico de pruebas rápidas de identificación bacteriana y de sensibilidad frente a antimicrobíanos en pacientes hospitalizados en un centro médico de cuidados terciarios. Los tiempos medios de información de los resultados de identificación y sensibilidad fueron, respectivamente, de 9.6 y 11.3 horas en el grupo de pruebas rápidas y de 19.6 y 25,9 horas en el grupo convencional (p <0,0005) No hubo diferencias significativas entre los dos grupos con respecto a los descriptores demográficos, con excepción del tiempo de información de los resultados Los tiempos medios de hospitalización fueron los mismos para ambos grupos, aunque la tasa de mortalidad fue inferior en el grupo de pruebas rápidas (8.8% frente a 15.3%). Por otra parte, en los pacientes del grupo de pruebas rápidas hubo significativamente menos estudios de laboratorio, menos estudios de imagen, menos días de intubación y menos días de permanencia en una unidad de cuidados intensivos: el tiempo transcurrido previo a la modificación del tratamiento antimicrobiano fue más corto y el coste global de hospitalización de los pacientes fue significativamente más bajo. En un estudio similar. Barenfanger (1999) no encontró diferencias de mortalidad entre grupos donde estuvieron disponibles resultados rápidos de las oruebas de sensibilidad, cuando se compararon con pacientes a quienes se informaron los resultados de modo ordinario (diferencia media de 5,2 horas). No obstante, ellos observaron una disminución significativa en el tiempo de permanencia hospitalaria (diferencia media de 2,0 días, p - 0.0006) y en el coste total de la estancia en el hospital (diferencia media de 2.395 dólares. p = 0,04) en los pacientes donde estuvieron disponibles resultados rápidos de las prueóas de sensibilidad.
PRUEBAS BACTERICIDAS Existen tres categorias principales de pruebas bactericidas: 1) determinación de la concentración mínima requerida para que un antimicrobiano destruya un microorganismo, conocida como concentración mínima bactericida o letal (CMB o CML): 2) determinación de la tasa de muertes (tasa de muertestiempo o curva de letalidad) y 3) determinación de la dilución más alta del suero del paciente requerida para destruir un microorganismo, conocida como titulo bactericida o letal del suero (TBS o TLS). La utilización de cualquiera de estas categorias de pruebas depende de cuestiones relacionadas con las indicaciones, métodos e interpretación.
Concentración mínima bactericida o letal Con respecto a la CMB o CML, existe un acuerdo general en que esta determinación debe formar parte de la investigación inicial de un nuevo antimícrobiano. No obstante, la unanimidad es menor en lo que se refiere a la posibilidad de que la prueba esté indicada para aislamientos de estreptococos en pacientes con endocarditis, de estafilococos en pacientes con endocarditis u osteomielitis y de enterobacterias o Pseudomonas en pacientes con meningitis. La controversia se suscita en parte por las variables biológicas y técnicas que afectan a los resultados de las determinaciones de la CMB (NCCLS M26-A. 1999). Para determinar la CMB o CML se inocula el antimicrobiano en caldo, diluido de forma seriada (en una base logj con una suspensión estandarizada del microorganismo en estudio, según lo descrito para la determinación de la CMI. Tras su incubación a 35 C durante 24 horas, los tubos con caldo que no muestran crecimiento visible son subcultivados en un medio de agar libre de antibióticos. La CMB o CML se define como la menor concentración del antimicrobiano que es bactericida o letal para al menos el 99.9% del inoculo original. Entre las variables biológicas de la prueba se encuentran: 1) el fenómeno de persistencia, en el que un pequeño número de bacterias "persistentes" (habitualmenle <0,1%) del inoculo bacteriano sobreviven a la exposición del antibiótico, pero siguen siendo sensibles si se vuelven a estudiar frente al antibiótico, habítualmente un antimicrobiano activo frente a la pared celular: 2) el efecto paradójico, en
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
el cual la proporción de supervivientes se incrementa con la concentración de antibiótico, de nuevo con mayor frecuencia en los antibióticos activos frente a la pared celular y 3) tolerancia, un lenómeno mucho menos comprendido. Se piensa que tanto la "persistencia" como el efecto paradójico están relacionados con el enlentecimiento de la tasa de crecimiento de las bacterias por el antibiótico, lo que da lugar a una disminución del efecto de destrucción (NCCLS M26-A, 1999). Definidos estrictamente, los microorganismos tolerantes son aquellos en los que la viabilidad se pierde lentamente y aquellos en los que la respuesta bacteriostática-bacteriolitica frente a los antibióticos se modifica en la dirección de la bacteriostasia (Handwerger, 1985). Sin embargo, la tolerancia se ha definido también como una proporción CMB/CMI mayor o igual a 32, a pesar de los numerosos problemas técnicos que influyen en los resultados de la CMB y de las variaciones metodológicas en la determinación de las CMB (Sherris, 1986). Como ha señalado Sherris (1986). la CMB se define como la concentración menor de antibiótico que produce una supervivencia <0,1% en la zona de menor exactitud de la curva de letalidad (es decir, de 18 a 24 horas). El número de supervivientes tras una noche de incubación con un antibiótico activo frente a la pared celular es invariablemente mayor si el inoculo se encuentra en la fase estacionaria en lugar de en la fase logarítmica (Handwerger, 1985; Sherris, 1986). El problema técnico más frecuente que origina una mayor proporción de bacterias en la fase estacionaria es la utilización de cultivos que han estado creciendo más de ocho horas (NCCLS M26-A. 1999). Otros problemas técnicos adicionales incluyen la supervivencia de las bacterias en el condensado por encima del menisco del caldo que contiene el antibiótico, el volumen del subcullivo, el efecto remanente de antibiótico en los subcultivos y la reproducibilidad de la prueba. Asumiendo que sea posible conseguir el control de estos problemas técnicos, la determinación de un resultado definitivo (CMB) puede basarse en los criterios de rechazo publicados por Pearson (1980). La tolerancia se define por una tasa de muertes retrasada, por lo que el método más fiable para su detección consiste en un estudio simplificado de las muertes de los microorganismos en función del tiempo, comparando la cantidad de bacterias que permanecen viables tras cinco o seis horas de incubación en presencia de una concentración de antibiótico de cuatro a ocho veces su CMI, con la cantidad presente en las lecturas a las dos horas o en el tiempo cero (Handwerger, 1985; Sherris. 1986). Considerando todos los problemas biológicos y técnicos asociados con las pruebas bactericidas y la definición de tolerancia, no es sorprendente que la interprelación de los esludios clínicos publicados sobre infecciones causadas por microorganismos supuestamente "tolerantes" esté llena de dificultades, en especial respecto a los estafilococos, para los que las variables técnicas tienen consecuencias importantes (Handwerger, 1985). Por estos motivos, nuestra norma consiste en no determinar la CMB de los antibióticos activos frente a la pared celular para estafilococos. Existen datos procedentes de estudios de endocarditis producidas por estreptococos del grupo viridans en animales de experimentación que sugieren que la penicilina puede ser menos eficaz frente a la infección por cepas tolerantes que frente a la debida a cepas no tolerantes (Handwerger, 1985; Wilson, 1985): sin embargo, apenas existe información sobre el significado clínico de estas cepas (Wilson, 1985). Handwerger y Tomasz (1985) postularon que las bacterias no tolerantes podrían manifestar una respuesta fenotípicamente tolerante en una lesión endocárdica a causa de su elevada densidad, su disminuida actividad metabólica y su lenta velocidad de crecimiento en las vegetaciones. Dado que algunas cepas de estreptococos del grupo viridans son resistentes a penicilina (CMI >4 pg/ml). sin duda es necesario determinar la CMI de los aislamientos de estreptococos del grupo viridans de pacientes con endocarditis u otras infecciones que suponen un riesgo para la vida. Puesto que los pacientes con endocarditis causada por estreptococos del grupo viridans tolerantes pueden presentar un riesgo mayor de recidivas y requerir de 4 a 6 semanas de tratamiento con penicilina y un aminoglucósido (Wilson, 1985), tal vez sea aconsejable determinar la CMB de dichas cepas.
Estudios de la tasa de muertes La determinación de la tasa de muertes de un antibiótico es el mejor método para detectar no sólo la tolerancia, sino también la sinergia o anta-
gonismo entre dos o más antibióticos. Además, la actividad bactericida, más que la baclerioslática, parece ser un requisito para el tratamiento de la meningitis bacteriana (Sande. 1981). En la meningitis por bacilos gramnegativos (de etiología distinta a H. influenzae). las CMB de las cefalosporinas pueden tener poca correlación con el resultado, en contraste con los resultados de los estudios de 6 horas de la tasa de muerte-tiempo (Eng, 1987). Por tanto, cuando se necesita un tratamiento bactericida para la curación, los estudios de muerte-tiempo de los antimicrobianos, ya sea en administración única o en combinación, podrían tener mayor valor predictivo de los resultados que las CMB (Bayer. 1985: Drake, 1985; Eng, 1987). Los resultados de los estudios de combinación mediante el método muerte-tiempo también se correlacionan mejor con los resultados de los estudios de combinación en modelos de infección con animales de experimentación que los resultados de estos estudios obtenidos mediante el método del tablero (Bayer, 1985), quizás, una vez más, debido a que los resultados definitivos del método del tablero se determinan a las 18-24 horas, que representa la fase menos exacta de la curva de letalidad (Sherris, 1986). En los estudios de la tasa de muertes se realizan cultivos cuantitativos en diversos intervalos (p. ej., 0, 4. 8, 12 y 24 horas) tras la inoculación del medio que contiene el antibiótico. La actividad bactericida se delme como el 99,9% de muertes del inoculo final, determinado mediante la observación de una disminución >3-log de UFC/ml en la curva de muerte-tiempo trazada (NCCLS M26-A, 1999). Cuando se estudia una combinación de antimicrobianos, la sinergia suele definirse como una reducción >2-log,<, de UFC/ml entre la combinación y su constituyente más activo cuando se utiliza individualmente, suponiendo que al menos uno de los constituyentes no afecte a la curva de crecimiento del microorganismo estudiado. En el caso de enterococos, este requisito no supone dificultades, porque las concentraciones de penicilinas o aminoglucósidos alcanzables desde un punto de vista clínico no son bactericidas; sin embargo, puede suponer un problema en el estudio de otros microorganismos que pueden ser sensibles a cada uno de los antimicrobianos empleados en combinación. En este último caso, la sinergia sólo es definible cuando existe una reducción >2-log, de UFC/ml entre la combinación de ambos, presentes en concentraciones que representan una cuarta parte de sus respectivas CMB. en comparación con el constituyente individual más activo en una concentración de la mitad de su CMB (Hallander. 1982). Como ocurre con las determinaciones de CMB. el efecto remanente de los antimicrobianos en los subcultivos cuantitativos es problemático y requiere inactivar cualquier antimicrobiano presente o diluir las muestras para el subcultivo lo suficiente para eliminar, si es posible, los efectos remanentes del fármaco. Siempre que se produzca un efecto remanente, especialmente en concentraciones de la prueba mayores o iguales a 16 veces la CMI, puede corroborarse marcando una alícuota de 10 pl a 100 pl de una dilución de un subcultivo a través de una superficie de agar, permitiendo un tiempo de absorción de 20 minutos, marcando posteriormente toda la superficie de agar con el microorganismo de estudio y observando la inhibición del crecimiento en el sitio de la marca inicial tras su incubación durante 24 horas (NCCLS M26-A, 1999). Otro problema en la interpretación de los estudios cinéticos de letalidad es la aparición de recrecimiento entre las 6 u 8 horas y las 24 horas de incubación de la prueba. En estos casos, conviene determinar si se ha producido inactivación antimicrobiana o si la prolongada incubación ha seleccionado una subpoblación resistente. Mediante la determinación de la CMI a las 0 y a las 24 horas Irente a una cepa de relerencia de la American Type Culture Collection (ATCC), se puede deducir la inactivación del antibiótico si la CMI es marcadamente superior a las 0 que a las 24 horas (NCCLS M26-A. 1999). 10
Estudios bactericidas del suero El principal objetivo de la prueba bactericida del suero consiste en determinar la actividad de uno o más antimicrobianos presentes en el suero frente a un microorganismo que ha sido aislado del paciente. Empleando distintas modificaciones, se puede determinar la actividad bactericida relativa a la CMB (título bactericida del suero), la tasa de muertes en un determinado tiempo (tasa bactericida del suero) o la magnitud de la actividad bactericida y su duración (NCCLS M21-A, 1999). En la práctica, los títulos bactericidas del
CAPÍTULO 5 1
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBÍANOS
suero cuando la concenlración de antibiótico es máxima (pico) y cuando es mínima (valle) son los que se determinan más fácilmente. Esto se lleva a cabo obteniendo una muestra de suero del paciente durante los niveles previstos de pico y/o valle de los antimicrobíanos que está recibiendo el enfermo. Con posterioridad, la muestra de suero se diluye en caldo, en una mezcla de sueros humanos o en una mezcla de caldo y sueros humanos suplementados con cationes (cuando se estudian aminoglucósidos o fluoroqumolonas frente a Pseudomonas aerugmosa). Se añade luego una suspensión estandarizada del microorganismo al suero diluido senadamente y se incuban los tubos durante una noche a 35 C. El titulo inhibitorio del suero es la dilución más alta del suero que inhibe de manera visible el crecimiento del microorganismo. Se pueden realizar subcullivos de los tubos que contienen diluciones de suero sin crecimiento visible, con el fin de determinar la dilución más alta de suero que ha sido bactericida para el microorganismo estudiado. A pesar de que existe una fuerte controversia acerca del valor clínico de la prueba bactericida del suero, es evidente que todas las cuestiones técnicas implicadas en las pruebas bactericidas también afectan a esta prueba. Además, la prueba bactericida sérica implica dos variables adicionales: 1) el tiempo de recogida de la sangre y 2) el tipo de diluyente (es decir, caldo, suero o una combinación de ambos). Es difícil establecer una correlación entre los títulos bactericidas específicos y los resultados del tratamiento antimicrobiano, dadas las variaciones en el método y las variables técnicas que afectan a dichas pruebas.
ANÁLISIS DE ANTIMICROBIANOS El nivel de antimicrobiano en el suero u otros líquidos biológicos se puede determinar directamente mediante bioanálisis, inmunoanálisis o análisis cromatográfico. Al contrario del titulo bactericida sérico, los análisis proporcionan una determinación de la concentración de cada antimicrobiano que el paciente está recibiendo.
Indicaciones La determinación de la concentración de antimicrobiano está indicada cuando el agente a administrar posee un estrecho margen terapéutico (Tabla 51-2) y cuando determinados factores subyacentes del huésped alteran la farmacocinética del antimicrobiano. Los antimicrobianos con un estrecho margen terapéutico incluyen aminoglucósidos, vancomicina. cloranlenicol y flucitosina. Con estos antimicrobíanos existe un estrecho cociente tóxico/terapéutico. Debido a sus amplios márgenes terapéuticos, no se requiere el análisis de penicilinas y cefalosporinas, excepto: 1) cuando su vía de administración o la enfermedad subyacente pueden producir niveles séricos que difieran notablemente del intervalo habitual o 2) cuando la infección se encuentre en un espacio o líquido donde la penetración del antímicrobiano sea variable o dudosa. Los análisis de antimicrobíanos están indicados en pacientes con tratamiento antimicrobiano prolongado (más de 5 días), en enfermos que no responden al tratamiento y en pacientes que desarrollan signos o síntomas de toxicidad, como por ejemplo ototoxicidad o nefrotoxicidad durante la administración de aminoglucósidos. La determinación de antimicrobíanos está indicada especialmente en pacientes con deterioro o cambios rápidos de la función renal y en pacientes sometidos a diálisis. Otras indicaciones adicionales de los análisis de antimicrobíanos comprenden pacientes ancianos: pacientes con fibrosis quística, quemaduras, neumonía por gramnegativos. obesidad y con expansión del volumen del liquido extracelular; asi como pacientes que no cumplen las dosis prescritas por vía oral. Es importante comprender que los análisis de antimicrobianos con márgenes terapéuticos estrechos no sólo son necesarios para confirmar que estos antimicrobianos no se encuentran en concentraciones potencialmente tóxicas, sino también para comprobar que se hallan dentro del intervalo terapéutico. Por ejemplo, se ha observado que existe un efecto dosis-respuesta graduado entre un cociente creciente concentración máxima del pico/CMI de aminoglucósidos y la respuesta clínica (Moore, 1987).
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Recogida de muestras Debido a la corta vida media de la mayoría de los antimicrobíanos, la recogida de la muestra es esencial para una monitorízacion terapéutica adecuada. El suero es la muestra más apropiada para el análisis; sin embargo, el plasma es también satisfactorio en la mayoría de casos. Si se utiliza plasma para la determinación de aminoglucósidos. debe anticoagularse con ácido elilendiaminotetraacétíco (EDTA). ya que la heparina inactiva los aminoglucósidos. Los análisis de antimicrobíanos en orina rara vez están indicados, excepto con finalidades de investigación. Aunque para el análisis se prefiere la venopunción, se puede obtener sangre a partir de un catéter mtravascular. después de haber dejado fluir ésta y desechar la muestra sanguínea inicial. En general, para determinar la concenlración sanguínea máxima, las muestras deben recogerse a los 30 minutos de haber completado la perfusión intravenosa, a los 60 minutos Iras una dosis intramuscular y a los 60-120 minutos tras una dosis oral. Los niveles máximos varían de acuerdo con el antimicrobiano administrado, la vía de administración, la velocidad de administración, las características de absorción y el estado clínico del paciente. Los niveles mimmos de antimicrobiano son indicadores más sensibles de la disminución de su aclaramiento y de su acumulación hasta niveles potencialmente tóxicos. Por consiguiente, a menudo se recomienda que los aminoglucósidos se monitoricen tanto en niveles previos al pico como en niveles previos al valle, en el primer caso para establecer que se está consiguiendo un nivel terapéutico y en el segundo para comprobar que no se produce acumulación a causa de una disminución del aclaramiento. Sólo se garantiza una recogida exacta de la muestra cuando la misma persona que administra el antibiótico es la que extrae la muestra. De otra forma puede existir una considerable disparidad entre los tiempos registrados y reales de la administración del antimicrobiano. Asi pues, sí la sangre se recoge mediante un equipo de flebotomía que confia en el tiempo registrado de administración del antimicrobiano, los niveles determinados y posteriormente informados pueden interpretarse de forma incorrecta. Bajo estas condiciones de escaso control de la recogida de muestras, es posible recibir informes en los que el supuesto nivel minimo sea más elevado que el nivel máximo. En el peor de los casos, un supuesto pico puede parecer insuficiente para propósitos terapéuticos, incrementándose de forma inadecuada la dosis de un antimicrobiano con estrecho margen terapéutico, dando lugar a toxicidad provocada por niveles excesivos del antimicrobiano. Las muestras deben estudiarse inmediatamente o almacenarse a £-20 C durante un periodo máximo de 2 días. Algunas amino o ureidopenicilinas inactivan los aminoglucósidos durante un almacenamiento prolongado, por lo que debe añadirse |}-lactamasa al suero si se mantienen almacenadas durante largo tiempo. La interacción entre penicilinas y aminoglucósidos disminuye en el almacenamiento a -70X.
Métodos Históricamente, los análisis microbiológicos constituían los métodos más utilizados y representaban la mejor opción para la determinación sistemática de las concentraciones de antimicrobianos en los líquidos biológicos. Con la introducción de la gentamicina alrededor de la década de los setenta, se desarrollaron una serie de procedimientos de análisis que no dependían de una dosis-respuesta microbiológíca in vilro. Estos métodos proporcionan una exactitud y especificidad mayores que las que habían sido posibles con las pruebas microbiológicas. Los análisis microbiológicos se basan en una comparación de la respuesta de un microorganismo sensible a una concentración desconocida de antibiótico, con la respuesta de este microorganismo bajo condiciones idénticas de análisis con concentraciones conocidas del antimicrobiano. La prueba suele basarse en técnicas de difusión en agar, en las que el agar se siembra con una suspensión estandarizada del microorganismo a estudiar; en esta suspensión, los líquidos contienen concentraciones desconocidas de antibióticos y los patrones contienen concentraciones conocidas de antibióticos, repartidas en pocilios o en discos de papel en blanco. Después, las placas se incuban durante una noche y se realiza una curva de
CAPÍTULO 51
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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS
dosis-respuesta, determinando el diámetro del halo de inhibición correspondiente a cada concentración conocida del antibiótico utilizado en los patrones. Debe entenderse que el ensayo microbiológico mide los efectos de todos y cada uno de los antimicrobianos que pueden encontrarse presentes en el líquido biológico en estudio. Por tanto, si el paciente está recibiendo otros antimicrobianos además del que es ob|eto de la prueba, el diámetro del halo de inhibición reflejará los efectos combinados de todos los antimicrobianos presentes. En algunos casos, es posible determinar la concentración de un antimicrobiano en presencia de otro mediante la selección adecuada de un microorganismo de prueba sensible al antimicrobiano a determinar y resistente al que potencialmente interfiere con el antimicrobiano. En otros casos, es posible suplementar el medio de la prueba con sustancias que pueden neutralizar los efectos del antimicrobiano que interfiere. Por ejemplo, en el estudio de antibióticos |i-lactámicos. se pueden añadir cationes o polianetolsullonato sódico al medio de ensayo con el fin de neutralizar la actividad de los aminoglucósidos. En otras ocasiones simplemente no es posible determinar la concentración de un antimicrobiano en presencia de otro. Pese a estas limitaciones, las pruebas microbiológicas siguen siendo el "método de referencia" frente al cual se evalúan los análisis no microbiológicos; el motivo estriba en que la prueba microbiológica determina la actividad antimicrobiana total de un antimicrobiano, mientras que el análisis no microbiológico determina sólo un componente de un antimicrobiano estructuralmente complejo. Anhalt (1985) y Edberg (1986) proporcionaron descripciones detalladas de las pruebas microbiológicas. La cromatografía liquida, proceso para separar una mezcla compleja de sustancias y basado en la distribución diferencial de éstas entre una fase líquida móvil y una fase sólida estacionaria, ha demostrado ser una técnica sensible y específica para medir casi todos los antimicrobianos de muestras clínicas. La técnica conlleva la extracción del antimicrobiano a partir de la muestra o una precipitación de proteínas seguida de cromatografía del líquido extraído o libre de proteínas en una columna de fase inversa (Anhalt, 1985). Anhalt (1985) publicó detalles respecto a los análisis mediante cromatografía líquida. Los factores que afectan a la utilización actual de la cromatografía líquida son la disponibilidad de equipamiento para el análisis de fármacos distintos de los antibióticos, la falta de disponibilidad de equipos de reactivos para determinados antimicrobianos, el pequeño volumen de pruebas para algunos antimicrobianos y la necesidad de cuantificar los metabolitos e isómeros de los antimicrobianos. Los análisis mediante cromatografía líquida tienen la ventaia sobre otros métodos de poder mezclar un patrón con la muestra antes de la prueba, proporcionando un patrón interno. Las ventajas de la cromatografía liquida incluyen su versatilidad, el coste relativamente bajo del reactivo, el coste moderado del equipo y la no necesidad de derivación, la capacidad para manejar peticiones "estadísticas" y un consumo de tiempo mínimo. Las desventajas de la cromatografía liquida son el tamaño de la muestra relativamente voluminoso (500 pl), la necesidad de muestras pretratamiento, la necesidad de una diversidad de detectores, la extracción constante de muestras y el tiempo de entrenamiento requerido para el procesamiento exacto de las muestras. Los métodos de cromatografía líquida para el estudio de antimicrobianos se han sustituido en los laboratorios clínicos por los de inmunoanálisis. El radiommunoanálisis (RÍA) fue uno de los primeros inmunoanálisis disponibles para el estudio de aminoglucósidos. Los RÍA requerían sólo un pequeño volumen de muestra y podían manejar peticiones "estadísticas", eran especialmente capaces de realizar múltiples análisis por lote, proporcionaron automatización y eran sensibles y específicos. Las desventajas del RÍA consistían en la fecha de caducidad limitada de los reactivos radiactivos, los problemas de tratar con malerial radiactivo, el coste elevado de equipo y reactivos y la falta de versatilidad para el estudio de otros agentes antimicrobianos. En consecuencia, los RÍA han sido sustituidos casi por completo por inmunoanálisis no isotópicos, entre los que se incluyen la polarización, los sustratos marcados, la multiplicación enzimática y el fluoroanálisis de polarización (Edberg, 1986). La ventaja de estos inmunoanálisis homogéneos es el pequeño volumen de muestra requerido (aproximadamente 50 pl), no necesitar preparación de las muestras, el coste moderado del equipo, un tiempo de adiestramiento mínimo, la capacidad de los sistemas para manejar peticiones estadísticas y la disponibilidad de automatización. Sus desventajas incluyen el hecho de que a menudo sólo existe una fuente de reactivo y que éstos sue-
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len ser caros. No obstante, dada su comodidad y el poco tiempo que consumen, estos sistemas de inmunoanálisis son bastante utilizados. Edberg (1986) publicó una descripción detallada de los inmunoanálisis. Se han realizado una serie de estudios sobre aspectos técnicos y de exactitud de las pruebas microbiológicas, los radioinmunoanálisis, los inmunoanálisis no isotópicos y la cromatografía líquida de alta resolución. En general, los coeficientes de variación son comparables (del 7% al 9%). Las sensibilidades suelen ser también comparables (de 0.1 ugvml a 1 po/ml). La correlación de resultados entre los métodos es alta Los resultados de los inmunoanálisis no isotópicos y de la cromatografía líquida de alta resolución pueden estar disponibles en 1 hora, mientras que en 3 a 4 horas se dispone de los resultados de los RIA. Aunque la mayoría de las pruebas microbiológicas requieren una noche de incubación, se dispone de una serie de análisis microbiológicos rápidos (de 4 a 6 horas) para aminoglucósidos y vancomicina.
Interpretación La interpretación de los resultados de análisis de antimicrobianos requiere conocimientos acerca de las dosis de antimicrobiano administrado, el intervalo de tiempo entre la administración de las dosis y la recogida de la muestra de sangre, la sensibilidad del microorganismo infectante, la tolerabihdad de los niveles séricos alcanzables de antibiótico, el volumen de distnbucion y la via de eliminación del antibiótico, las características de absorción de éste y la experiencia clínica en el tratamiento de infecciones similares. Considerados estos requisitos, en la Tabla 51-2 se han enumerado los factores que afectan la monitorización de los antimicrobianos con estrechos márgenes terapéuticos (Anhalt, 1989).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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C A P Í T U L O
52
Infecciones por espiroquetas • Michael Smith, M.D. • Randall T. Hayden, M.D. • David H. Persing, M.D., Ph.D. • Gail L. Woods, M.D. FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA
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ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS
1136
Pinta
ESPIROQUETOSIS INTESTINAL
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Diagnóstico de laboratorio de las treponematosis
DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES
TREPONEMA Treponema
1131 pallidum
POR BORRELIAS
Tratamiento de las treponematosis
Enfermedad de Lyme
GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRÓNICA
1135
LEPTOSPIROSIS
1135
Las espiroquetas son bacterias finas con forma espiral que presentan una o más vueltas de hélice completas en el soma bacteriano. Son gramnegativas. pero sólo pueden visualizarse en preparaciones en fresco, mediante microscopía óptica de campo oscuro o contraste de fases, o por medio de tinciones por impregnación argéntica en secciones de muestras de tejidos. Unos orgánulos semejantes a los flagelos, denominados fibrillas periplásmicas o filamentos axiales, que surgen cerca de los polos de la bacteria, son responsables del movimiento característico de estos microorganismos, semejante al desplazamiento de un sacacorchos. Si bien existe un gran número de especies comensales, no patógenas, las especies de los géneros Treponema y Borrelia, así como Leptospira interrogans, y Spirillum minor causan enfermedades en el ser humano. Por otro lado, se han asociado algunas especies de los géneros Serpulina y Brachyspira con síndromes gastrointestinales, aunque no está universalmente aceptado que exista una relación inequívoca entre estas bacterias y la enfermedad.
TREPONEMA El género Treponema incluye dos especies que causan enfermedad en el hombre. La especie Treponema pallidum está subdivídida en tres subespecies. cada una de las cuales es el agente etiológico de una entidad clínica diferente: las subespecies pallidum, pertenuey endemicum causan, respectivamente, sifilis venérea, frambesia y sífilis endémica (bejel). La enfermedad denominada pinta está provocada por la otra especie patógena. T. carateum.
Treponema
1137
pallidum
Sífilis Descripción. T. pallidum subesp. pallidum, el agente etiológico de la sífilis venérea, es una espiroqueta muy delgada (0.2 um) y larga (de 6 itm a 20 um) que presenta entre 10 y 13 vueltas de hélice completas. Esta espiroqueta tiene la movilidad de sacacorchos característica, con una flexión ondulante de la parle central del cuerpo de la bacteria, y es rápidamente inactivada por el calor, el frío, la desecación, los desinfectantes y los cambios en la presión osmótica del medio exocelular. Epidemiología. El hombre es el único hospedador natural de T. pallidum subesp. pallidum. La transmisión se produce al entrar en contacto directo con lesiones infecciosas, principalmente a través de una relación sexual. La probabilidad de que una persona infectada le transmita la enfermedad a su pare-
Fiebre recurrente BIBLIOGRAFÍA
1141
ja es aproximadamente de un 30% a un 50% (Larsen, 1995: Tramont, 1995). Aunque con una frecuencia mucho menor, la infección puede transmitirse sin que exista contacto sexual con una lesión infecciosa, mediante una transfusión de sangre fresca (o de hemoderivados de la misma) procedente de una persona infectada (los microorganismos pueden sobrevivir de 24 a 48 horas, e incluso más, en las condiciones de almacenamiento que existen en los bancos de sangre), por una punción accidental con una aguja infectada o durante la manipulación de los especímenes de laboratorio. La incidencia de la sífilis venérea en EE.UU. descendió drásticamente con el advenimiento de la penicilina tras la segunda guerra mundial, y permaneció estable hasta 1980. momento en el que la prevalencia de la enfermedad aumentó, debido probablemente a la asociación entre el incremento en el uso de drogas y la promiscuidad sexual en determinados grupos de la población. Esta asociación ha tenido el desafortunado efecto adicional de provocar un incremento en la prevalencia de la sífilis congénita en los recién nacidos (CDC. 1989). Patogenia y patología. T. pallidum subesp. pallidum es capaz de penetrar por las membranas mucosas intactas o acceder a los tejidos a través de abrasiones o excoriaciones de la piel, tras lo cual se multiplica en el mismo punto en donde tuvo lugar la inoculación, teniendo lugar, a continuación, la diseminación del microorganismo por los sistemas circulatorio y linfático de la persona infectada. En los animales de laboratorio se ha logrado producir la infección con una dosis infectante tan baja como cuatro espiroquetas (Cumberland, 1949). Las lesiones clínicas aparecen cuando se alcanza localmente una masa crítica de microorganismos (aproximadamente 10' espiroquetas): por tanto, el período de incubación está directamente relacionado con el tamaño del inoculo inicial y varia entre tres días y tres meses (Magnuson, 1956), La respuesta inmune del hospedador frente a T. pallidum subesp. pallidum está influida por la propia estructura de la bacteria. La membrana externa de la envoltura celular bacteriana es una bicapa lipídica en la que existen pocos antigenos proteicos expuestos. Los antígenos más importantes en el contexto de la respuesta inmune del hospedador parecen ser los proteolipidos que se encuentran por debajo de la superficie celular del microorganismo (Chamberlain, 1989; Cox, 1992). Además, la bacteria parece ser capaz de recubrirse con proteínas del huésped. El resultado final es retrasar la respuesta inmune de tipo humoral, reduciendo la eficacia de la misma, debido a que las espiroquetas se localizan fuera de los vasos sanguíneos cuando se están produciendo los anticuerpos. Es más. se ha demostrado en modelos animales que hay una escasa estimulación de la respuesta inmune celular en el caso de la sífilis, a pesar de la ineficaz respuesta de tipo humoral (Fitzgerald, 1992).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Esta respuesta inmune retardada y atenuada permite a 7! pallidum subesp. pallidum diseminarse y producir una infección crónica. El curso de la sífilis puede dividirse en tres fases predecibles. La fase primaria, con el desarrollo del chancro, se manifiesta por término medio a las tres semanas, aunque no todos los pacientes desarrollan una lesión primaria (el chancro). En algunos casos, debido a su carácter indoloro, la lesión desaparece sin el que paciente llegue a darse cuenta. La cicatrización completa del chancro entre dos y ocho semanas después da paso a la fase secundaria, que se manifiesta por término medio unas seis semanas (con un rango de entre 2 y 12 semanas) después de la inoculación. Esta fase se caracteriza por una extensa diseminación de la bacteria por el torrente circulatorio, con afectación mucocutánea y a nivel de órganos y la aparición de síntomas constitucionales. La lase secundaria se resuelve y la infección entra, seguidamente, en un período de latericia durante el cual el paciente no muestra síntoma alguno de la infección. Los cuatro primeros años de esta fase se denominan período de latencia temprano, y es durante este tiempo cuando tienen lugar las recaídas, principalmente dentro del pnmer año Esta fase es seguida por el período de latencia tardío, durante el cual no se producen recaídas. En algún momento entre los 10 y 25 años después de la fase primaria, un tercio de los pacientes no tratados desarrolla la lase terciaria de la enfermedad, en la que tienen lugar graves manifestaciones clínicas a nivel de los sistemas cardiovascular y nervioso central (SNC). Sea cual sea el órgano afectado o la fase en la que se encuentra la enfermedad, la característica histológica distintiva de la sífilis es la endoarterilis oblilerativa, una proliferación endotelial y fibroblástica concéntrica con un infiltrado asociado de células mononucleares rico en células plasmáticas. La endoarterítis es consecuencia de la unión de las espiroquetas a las células endoteliales a través de moléculas de fibronectina que se han pegado a la superficie de las bacterias (Thomas. 1986). Los treponemas pueden visualizarse en las muestras de tejidos mediante técnicas de tinción por impregnación argéntica. A medida que la enfermedad progresa disminuye la intensidad de los infiltrados de células plasmáticas y la concentración de treponemas.
contrario, debido a que los antibióticos se administran en dosis insuficientes para atravesar la barrera hematoencefálica y alcanzar concentraciones bactericidas, la neurosifilis todavía aparece con cierta frecuencia (Mohr, 1976; Green. 1980) De esta forma de sífilis se han definido dos variantes, meningovascular o parenquimatosa, aunque es común que exista una solapación entre ambas. La sífilis meningovascular aparece entre los 5 y 10 años siguientes a la infección inicial y se manifiesta clinicamente en forma de ataques, derrames cerebrales y afasia. La causa principal son los microinfartos múltiples debidos a la endoarterítis característica a nivel del SNC. La neurosifilis parenquimatosa, que aparece entre los 15 y 30 años después de la primera infección, es un proceso degenerativo con pérdida de neuronas y segmentos mielmizados (desmielmización segmentaria) que provoca manifestaciones neurólogos y psiquiátricas complejas, incluyendo paresia generalizada y tabes dorsal. Algunos pacientes no muestran signos o síntomas clínicos, pero un análisis de su líquido celalorraquideo (LCR) revela anomalías tales como pleocitosis. incremento en la concentración de proteína y presencia de anticuerpos frente a T. pallidum. siendo posible que la prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) dé positiva, lo que indica la existencia de infección a nivel del SNC. Esta forma se ha denominado "neurosífilis asintomática" (Tramont. 1995). También existen dos formas clínicas de la sífilis congénita: una forma temprana o infantil y otra tardía, que se maniliesta tras un período de latencia que oscila entre 5 y 30 años. Aunque la idea tradicional de que la infección del feto sólo tiene lugar durante el segundo trimestre de gestación ha dejado de ser aceptada, la sífilis congénita causa con mayor frecuencia abortos en las etapas iniciales del embarazo que en las fases tardías del mismo (Blanc. 1981: Harter, 1976). La inflamación del cordón umbilical (lunisilis necrotizante) es característica de la sífilis congénita. En la forma infantil, son características una erupción difusa con desprendimiento de la piel y osteocondntis y periostitis: sin embargo, los recién nacidos afectados también pueden ser asintomátícos (Ikeda, 1990; Dorfman, 1990). Asimismo, se ha observado fibrosis difusa en el hígado (hepar lobalum) y el pulmón (neumonía alba) Tras un periodo de latencia. la lorma tardía se presenta en la niñez o en la edad adulta con una amplia variedad de signos o síntomas, aunque es clásica la tríada formada por la queratitis intersticial, los dientes de Hutchinson (dientes en tonel) y la parálisis del octavo par de nervios craneales (sordera). También se observa con frecuencia periostitis, arqueamiento de las tibias (tibia en sable) y deformidad de la nariz, que adquiere un aspecto de silla de montar
Manifestaciones clínicas. La sífilis es una infección crónica con múltiples manifestaciones relacionadas, pnmariamente, con la fase en la que se encuentra la enfermedad. El chancro primario aparece característicamente ulcerado, con los bordes elevados y duros, la base lisa, destacando la ausencia de exudado y dolor en el mismo. Aunque habitualmente es único, pueden aparecer múltiples chancros hasta en un tercio de los individuos infectados. Los pacientes con infección previa pueden presentar lesiones atipicas, como una pápula pequeña, La sífilis y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) e incluso pueden no desarrollar lesión alguna. En algunos pacientes puede apreaparecen frecuentemente en el mismo paciente, puesto que ambas enfermeciarse la existencia de linfadenopatía regional, con ganglios linfáticos moderadadades comparten factores de riesgo comunes. Los estudios efectuados sobre mente aumentados de tamaño, de consistencia gomosa y no supurativos. esta asociación no han revelado diferencias en la fase de presentación clínica entre los pacientes con sífilis y sida concomitantes y aquellos que no están La diseminación tiene lugar en la fase secundana, y los pacientes presentan afectados por el VIH (Hutchinson. 1991; Gourevitch, 1993) Existe controverlos signos y síntomas de una enfermedad sistémica. Más del 90% de los missia sobre el hecho de si el sida concomitante puede afectar el curso clínico de mos desarrollan una erupción que aparece inicialmente en el tronco y las extremidades (aunque cualquier parte del cuerpo puede verse alectada) en forma de las fases primaria y secundaria de la sífilis. Algunos expertos indican que existe una tendencia a que aparezca una erupción más grave y atipica, a que los máculas de pequeño tamaño que evolucionan hasta convertirse en pápulas, y síntomas constitucionales sean más intensos y, en general, a que la enfermeen algunos pacientes en pústulas, durante un periodo de varias semanas. El dad siga un curso más maligno en los pacientes con sida (Tramont. 1995) Sin aspecto de la erupción en la palma de la mano y la planta del pie es caracteembargo, otros autores han encontrado pocas diferencias en estas dos fases rístico, y el agrandamiento y la coalescencia de las pápulas da lugar a las plade la enfermedad entre los pacientes afectados y no afectados por el VIH (Hutcas blanquecinas del condiloma lata. Aproximadamente el mismo número chinson, 1991: Musher, 1990). Sobre lo que no existe duda alguna, en cual(90%) de pacientes manifiesta una linfadenopatia generalizada, y un 75% puequier caso, es sobre el hecho de que los pacientes con sida enfermos también de padecer fiebre, malestar, anorexia, artralgia, faringitis y pérdida de peso. En de sífilis tienen una mayor predisposición a desarrollar neurosililis, y a desun tercio de los casos pueden observarse placas mucosas. Alrededor de un arrollarla de manera más rápida que los sifilíticos que no están afectados por 40% de pacientes manifiestan síntomas de afectación del SNC. aunque tan el sida (Tramont. 1995; Musher, 1990: Johns. 1987) En este caso, se ha puessólo entre un 1% y un 2% desarrollan una meningitis aguda aséptica (Lukehart. to de manifiesto que existe una relación con el tratamiento con penicilina a 1988). El resto tiene dolor de cabeza y meningismo. uveitis. pérdida neurounas concentraciones insuficientes para atravesar la barrera hematica y accesensonal de la audición y afectación de los nervios craneales. der al lugar de la infección, el SNC (Berry, 1987). Además, en los pacientes con La destrucción de los tejidos en la sífilis terciaria se hace evidente entre los 10 sida hay una elevada incidencia de afectación ocular, siendo la uveitis anterior y los 25 años después de la infección primaria. La sífilis cardiovascular aparece la manifestación más común de la infección (Tramont, 1995). como consecuencia del debilitamiento de la túnica media, que produce un aneurisma en la aorta ascendente con insuficiencia de las válvulas aórticas y estrePian chamiento de la luz de las arterias coronaras. Los gomas sifilíticas (es decir, áreas de necrosis granulomatosa). cuyo tamaño puede variar desde dimensiones El pian (también denominado frambesia, parangi, paru. buba o bouba) es una microscópicas hasta tumores de gran tamaño, afectan frecuentemente a la piel enfermedad crónica causada por T. pallidum subesp. pertenue. Esta enfermeal sistema esquelético y a los tejidos mucocutáneos. aunque pueden aparecer dad, que ha afligido desde antiguo a las personas que viven en zonas tropicaen cualquier órgano. Tanto la sífilis cardiovascular como las gomas son mucho les, tiene una prevalencia significativa en áreas rurales de paises tropicales con menos frecuentes tras el advenimiento del tratamiento con antibióticos. Por el lluvias intensas. Tras un descenso alrededor de 1950 debido a las grandes
CAPÍTULO 52
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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
campañas emprendidas para el control de las treponematosis. la incidencia de la frambesia ha vuelto a aumentar en algunas zonas (Engelkens, 1991). La frambesia se contrae durante la niñez, antes de los 15 años, por contacto directo, a través de desgarros en la piel que permiten la entrada de los treponemas. Las lesiones iniciales aparecen, generalmente, unas tres semanas después de la inoculación, por término medio. Pueden aparecer pápulas en número variable (entre una y varias), con mayor frecuencia en las extremidades inferiores, que seguidamente se ulceran o evolucionan hasta convertirse en lesiones papilomatosas. En estas lesiones existen numerosos treponemas, Es normal que estas lesiones se resuelvan espontáneamente; sin embargo, también son frecuentes las recaídas que eslán precedidas por malestar, fiebre y una linfadenopatía generalizada seguida de lesiones diseminadas en la piel. Muchos pacientes entran en un periodo de latencia durante el que no hay signos o síntomas clínicos evidentes. En la mayor parte de ellos, la enfermedad no da manifestaciones de ningún tipo; sin embargo, un 10°-ó de los afectados desarrolla frambesia tardía, en la que son patentes las lesiones destructivas e irreversibles en los huesos, cartílagos, tejidos blandos y piel (Engelkens. 1991). También se han descrito lesiones cardiovasculares y en el SNC semejantes a las que se observan en los casos de sífilis (Román, 1986).
Sífilis endémica La sífilis endémica (bejel) es una enfermedad crónica no venérea, consecuencia de la infección por T. pallidum subesp. endemicum. La enfermedad es antigua y, aunque ya no está tan extendida como lo estuvo en un momento, todavía se dan casos en zonas con clima cálido y seco de Oriente Medio y África. La prevalencia de la enfermedad ha experimentado un aumento en la región africana del Sahel (Engelkens, 1991). La enfermedad se transmite por contado directo con lesiones activas, dedos contaminados y utensilios de comida y bebida. Las condiciones de hacinamiento e higiene escasa son típicas entre las personas afectadas. La infección primaría tiene lugar en niños con edades comprendidas entre los 2 y los 15 años, aunque la enfermedad también puede darse en los individuos adultos de la misma familia, y también los adultos que no han sufrido la enfermedad durante la niñez pueden ser infectados por sus niños. El tamaño del inoculo (dosis infectante) es pequeño y las lesiones primarias de la sífilis endémica temprana, que aparecen principalmente en la mucosa orofaríngea, son, a menudo, inaparentes. Frecuentemente, las manifestaciones clínicas iniciales de la enfermedad aparecen en una segunda fase y consisten en la aparición de placas mucosas, condiloma lata, estomatitis angular, linfadenopatía generalizada y osteoperiostitis dolorosa. Estos síntomas son seguidos por un periodo de latencia de duración variable. La fase tardía se caraderiza por la destrucción de tejidos en la piel, huesos y cartílagos, de manera preferente en la nariz y el paladar, con afectación de la laringe en algunas ocasiones.
Pinta La pinta (carate, mal de pinto, azul) es causada por T. carateum. La enfermedad es endémica en zonas rurales de áreas tropicales de América Central y del Sur y ha reaparecido, recientemente, en México y Colombia, dos países en los que había sido erradicada desde 1950 (Engelkens, 1991). Los individuos afectados primariamente son los niños con edades por debajo de los cinco años. Se cree que la inoculación tiene lugar por contacto no venéreo con la piel o mucosas. Es difícil caracterizar la patogenia de la enfermedad, ya que, a diferencia de otras treponematosis que afectan al hombre, no hay modelos animales disponibles y el treponema responsable no puede ser cultivado de forma continua. Como sucede en el caso de otras infecciones por treponemas, también existen en la pinta fases temprana y tardía, aunque en esta enfermedad es frecuente que exista un solapamiento entre ellas. Unos dos meses después de la inoculación, aparece una pápula primaria o placa en el lugar por donde penetró el microorganismo, que puede ir acompañada o no por una Imladenopatia localizada Esta lesión pnmaria se resuelve y, unos meses o años más tarde, aparecen las lesiones secundarias diseminadas, o "pintides", que persisten durante largos periodos o bien se resuelven para volver a reaparecer. En la pinta tardía, las lesiones, que pueden permanecer de por vida, muestran hipopigmentación, atrofia de la piel, e hiperqueratosis. La piel parece ser el único órgano afectado por esta enfermedad.
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Diagnóstico de laboratorio de las treponematosis Debido a que los agentes etiológicos de las treponematosis humanas no pueden aislarse por las técnicas habituales de cultivo microbiológico. su detección se lleva a cabo mediante visualización directa de los microorganismos en los especímenes procedentes de las lesiones o de forma indirecta por métodos inmunológicos. Cada fase de las treponematosis requiere una modalidad particular de prueba. En las fases tempranas, cuando las lesiones están presentes, se utiliza la microscopía directamente. En las fases tardías, se emplean las técnicas serológicas. Para el escrutinio preliminar se utilizan pruebas no específicas basadas en la detección de anticuerpos no treponémicos, mientras que la confirmación del diagnóstico se lleva a cabo con métodos que detedan anticuerpos treponémicos específicos. Es importante tener presente que ninguna de estas pruebas de laboratorio comúnmente utilizadas es capaz de distinguir entre especies que están intimamente relacionadas y las subespecies de los Ireponemas patógenos, por lo que la diferenciación debe establecerse basándose en las evidencias clínicas y epidemiológicas. Microscopía de campo oscuro. Cuando es posible obtener una muestra directamente de las lesiones, como sucede en las fases pnmaria y secundaria de la sífilis, asi como en la fase temprana de la sífilis congémta (chancros, placas mucosas, condiloma lata), la lesión debe limpiarse primero con agua estéril (sin jabón o antisépticos) y a continuación debe realizarse sobre la misma una suave abrasión. Seguidamente se aplica presión en la base de la lesión para oblener un exudado seroso que se acumula en ésta. Una gota de ese exudado se coloca en un portaobjetos y se deposita encima un cubreobjetos. La muestra debe examinarse inmediatamente, puesto que la visualización de la movilidad característica de los treponemas es un requisito necesano para la identificación definitiva. Debido a su extrema delgadez, los treponemas no pueden observarse mediante la microscopía óptica convencional. Es necesario utilizar la microscopía de campo oscuro, que emplea un condensador que hace que los rayos de luz incidan sobre los Ireponemas en ángulo oblicuo, provocando que la luz salga reflejada de éstos, con lo que las bacterias aparecen como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. El examen en campo oscuro puede arrojar resultados positivos incluso muchas semanas antes de que una prueba de lipo serológico sea positiva, y tiene una sensibilidad del 80% para el diagnóstico de la sífilis (Larsen. 1995). Debido a que puede haber una posible confusión con los treponemas comensales que existen en la boca, la observación en campo oscuro no está recomendada en el caso de muestras que se obtengan a partir de lesiones orales. Ademas, existen tres especies de Treponema. son habitantes normales de la región genital (T. phagedensis. T. refríngeos y T. mmutum). que potencialmente pueden confundirse con I pallidum en un examen con microscopía de campo oscuro. Una limpieza cuidadosa de la zona es importante para reducir las posibilidades de que se produzca esta confusión Microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos específicos frente a T. pallidum marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína) pueden utilizarse para la detección directa de treponemas en las muestras obtenidas de las lesiones, y evitan la necesidad de tener que observar la movilidad de las bacterias. La prueba puede realizarse sobre extensiones secas y lijadas de fluidos lisulares realizadas en un portaobjetos (fluorescencia directa con anticuerpos [DFA-TP]) o sobre secciones de muestras de tejidos incluidas en parafina (fluorescencia directa con anticuerpos sobre tejidos [DFAT-TPJ). Existen anticuerpos monoclonales disponibles comerciaimente, que pueden utilizarse en estas pruebas en lugar de los anticuerpos policlonales procedentes de conejos y seres humanos sifilíticos adsorbidos sobre la cepa Reiler de T. pallidum. que han sido empleados hasta ahora y son menos específicos. Cuando se utilizan para examinar exudados y fluidos procedentes de lesiones frescas, ambas técnicas (DFA-TP y DFAT-TP) tienen una sensibilidad de casi el 100%, comparadas con la tinción de impregnación argéntica de Stiener para la sífilis congémta (Larsen, 1995). Debido a que estas pruebas son especificas para los treponemas patógenos, deben utilizarse para el examen de muestras obtenidas a partir de lesiones en la boca. Métodos serológicos no treponémicos. Los ensayos no treponémicos detedan la presencia de anticuerpos que se generan frente a material de naturaleza lipoproteica liberado por las células dañadas y la cardiolipina de los treponemas (es decir, anticuerpos producidos como consecuencia de la respuesta del sistema inmune del huésped frente a lípidos tanto de él mismo como de las espiroquetas), y en consecuencia no son específicos de Treponema. De forma
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
colectiva, estas pruebas se conocen con el nombre de pruebas reagínicas. aunque el término reagina, aplicado al diagnóstico serológico de la sífilis, parece poco afortunado, ya que se puede confundir con los anticuerpos de la clase E (IgE), que también reciben el nombre de reaginas. Entre estas pruebas se encuentran el método VDRL (prueba de la reagina en portaobjetos), RPR (prueba rápida de la reagina en plasma con tarjeta circular), USR (prueba de la reagina en suero sin calentar) y TRUST (prueba de la reagina en suero sin calentar con roio de toluidina). Todos estos métodos utilizan un antigeno fosfolipídico (cardiolipina) reforzado con lecitina y colesterol en partículas coloidales. En todos los casos, la aglutinación de esas partículas se considera resultado positivo. Puesto que la aglutinación es el criterio utilizado para determinar la positividad de las pruebas, es prelerible utilizar en todas ellas suero en lugar de plasma; en el caso del método VDRL. el suero debe ser tratado con calor para eliminar reacciones inespecífícas. Para las pruebas RPR y USR. no es necesario someter a la muestra a calentamiento si se añade a la misma cloruro de colina. En el caso de las pruebas VDRL y USR. la reacción de aglutinación debe visualizarse microscópicamente (xlOO aumentos), mientras que la presencia de carbón y de cobrante en los métodos RPR y TRUST, respectivamente, hacen que la reacción sea macroscópicamente visible. Los anticuerpos detectados mediante todas estas pruebas aparecen generalmente enlre la primera y cuarta semanas después de la formación del chancro primario. Por tanto, el momento en el que la muestra es tomada en la lase primaria puede afectar a la sensibilidad del método. El titulo aumenta, se mantiene elevado durante el primer año. y luego comienza a disminuir. Las pruebas se negativizan espontáneamente en el 25% de los pacientes. Pueden darse resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. Los falsos negativos son consecuencia de un título elevado de anticuerpos en el suero (debido al fenómeno de zona) y se dan especialmente en el caso de la sífilis secundaria. Este problema puede solucionarse llevando a cabo una dilución de la muestra antes de realizar el ensayo. Los resultados falsos positivos pueden darse ocasionalmente en pacientes alectados por ciertas enfermedades agudas como la hepatitis, ciertas infecciones víricas y en mujeres embarazadas o con carácter crónico en el caso de individuos aquejados por enfermedades del tejido conectivo (Larsen 1995). Las pruebas positivas se titulan repitiéndolas con diluciones dobles senadas de la muestra. Los títulos se utilizan para determinar la eficacia del tratamiento. Un descenso de cuatro veces en el titulo de anticuerpos al cabo de 12 meses en el caso de la sífilis temprana, así como una disminución de cuatro veces a los seis meses y de ocho a los 12 en la sífilis tardía, es evidencia de que el tratamiento es adecuado (Romanowski, 1991). Aquellos pacientes tratados durante la fase temprana de la enfermedad tienen más posibilidades de revertir a negativo que los que son tratados en la sífilis tardía (Brown, 1985; Rumara. 1980). El rastreo de ciertos grupos de población para la detección de sífilis implica el empleo de muestras o procedimientos particulares. Por ejemplo, en el caso de la sífilis congenita, el suero de la madre es un espécimen mejor que la sangre del cordón umbilical o del propio neonato, muestras que han sido utilizadas en el pasado (USPHS, 1968). Otro ejemplo lo encontramos en el diagnóstico de la neurosífilis. que requiere resultados positivos tanto con las pruebas que detectan anticuerpos treponémicos específicos como con el método VDRL. a partir del liquido cefalorraquídeo. El test VDRL es muy específico, aunque poco sensible, para el diagnóstico de la neurosífilis. Puede dar resultados negativos en un 22% a un 69% de pacientes con neurosífilis activa, y su sensibilidad en el caso de neurosífilis inactiva puede ser tan baja como un 10% (Schmidt, 1980; MacLean, 1996). A pesar de esto, ninguno de los restantes métodos de tipo no treponémicos tienen utilidad para llevar a cabo la detección de esta complicación tardía de la sífilis y, por otro lado, las pruebas treponémicas adolecen de pérdida de sensibilidad, y dan falsos positivos debido al paso de anticuerpos a través de la barrera hemática en el cerebro. Se han descrito resultados aberrantes obtenidos con varias técnicas de tipo no treponémico en el caso de pacientes sifilíticos coinfectados con el VIH. incluyendo retrasos en la seroconversion: sin embargo, no es frecuente que en pacientes de sida se observe seronegatividad frente a la sífilis, en el caso de coinfección (Flores, 1995). La lasa de resultados falsamente positivos aumenta ligeramente en el caso de pacientes con sida (un 4% frente al 1% en individuos sin sida); sin embargo, al menos un estudio ha asociado el incremento en la tasa de resultados positivos con la adicción a las drogas por vía intravenosa, más que con la propia infección por el VIH (Larsen. 1995; Flores. 1995:
Hernández-Aguado, 1998). Los falsos negativos también aparecen en los pacientes con sida que tienen sífilis concomitante, debido a la respuesta exacerbada de anticuerpos no treponémicos que se produce en algunos sujetos, con el consiguiente efecto de zona (Gourevitch, 1993). Además, el título de anticuerpos no treponémicos no disminuye en algunos pacientes de sida con sífilis a pesar del tratamiento, aunque algunos autores piensan que esto está más relacionado con la fase de la enfermedad en la que se inició el tratamiento que con la infección por el VIH, puesto que un comportamiento parecido se ha observado también en enfermos sin sida (Larsen. 1995). Métodos serológicos treponémicos. Estos métodos detectan la presencia de anticuerpos frente a antígenos treponémicos y se utilizan para ratificar los resultados positivos obtenidos mediante las pruebas de tipo no treponémico, o para confirmar la infección en el supuesto de un resultado negativo con estas últimas en las fases tardía o de latencia de la enfermedad, lo que puede suceder en un 30% de pacientes con sífilis terciaria (Larsen, 1995). El test de absorción con anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS). una de las dos técnicas estándar treponémicas especificas, es una prueba de inmunofluorescencia indirecta. Se lleva a cabo con suero del paciente calentado y absorbido sobre antigenos de la cepa Reiter no patógena para eliminar los anticuerpos que produzcan reactividad cruzada, que se deposita sobre un portaobjetos sobre el que previamente se han fijado células de la cepa Nichols de T. pallidum subesp. pallidum, añadiéndose linalmente anticuerpos trente a inmunoglobulinas humanas marcados con isotiocianato de fluoresceina (FITC). La observación de treponemas visibles bajo microscopía de fluorescencia indica la existencia de anticuerpos frente a los treponemas patógenos en el suero del paciente. El segundo método, que es preferido en muchos laboratorios debido a su relativa sencillez de ejecución, es el de la microhemoaglulinación con Treponema pallidum (MHA-TP). En este caso, el suero absorbido se mezcla con eritrocitos de oveja sensibilizados con 7! pallidum (cepa Nichols), mediante sonicación en una placa de microtitulación. Si el suero contiene anticuerpos se observará la aglutinación de los glóbulos rojos. En general, ambos procedimientos (FTA-ABS y MHA-TP) son equivalentes excepto en la lase pnmana de la sífilis, en la que la prueba FTA-ABS muestra una mayor sensibilidad (Augenbraun. 1998: Han, 1980). En la Tabla 52-1 se muestran los valores de sensibilidad y especificidad de las diferentes técnicas de tipo no treponémico y treponémico (Larsen, 1995). Los anticuerpos treponémicos específicos aparecen durante la sífilis primaria y pueden seguir detectándose durante toda la vida del individuo con independencia del tratamiento, aunque hay excepciones. Los pacientes con sida muestran una mayor tendencia a convertirse en seronegativos tras la terapia antimicrobiana (Haas, 1990). La prueba FTA-ABS es la primera en dar resultados positivos, seguida por la MHA-TP y. linalmente. por los métodos no treponémicos, un poco después. Los métodos treponémicos no se utilizan para el escrutinio en el entorno clínico, puesto que aproximadamente un 1% de la población puede dar resultados lalsamente positivos con los mismos. Los falsos positivos con la técnica FTA-ABS se detectan entre los ancianos, las personas con enfermedades del tejido conectivo y en individuos intectados con bacterias relacionadas con los treponemas, como las especies del género Borrelia (Larsen, 1995). La frecuencia de falsos positivos con el método MHATabla 52-1
Sensibilidad d e los m é t o d o s serológicos para el diagnóstico de la sífilis en las diferentes fases de la e n f e r m e d a d ' Fase de la sífilis
Prueba
Primaria
Secundaria
Latente
Tardía
VDRI RPR FTA-ABS MHA-TP
78(74-87) 86(77-100) 84(70-100) 76(69-90)
100 100 100 100
95 (88-100) 98(95-100) 100 97(97-100)
71(37-94) 73 96 94
* Valores de sensibilidad expiesados como porcentajes. Los números entro paréntesis representan los rangos de los valores de sensibilidad en los esludios llevados a cabo en el Center loi Diseasc Control and Prevention VORI = Vcncreal Disease Research Laboralory. RPR = prueba rápida de la reagina; FTA-ABS = test de absorción con anticuerpos treponémicos lluorescenles; MHA-TP • ensayo de microhemoaglutinacion para anticuerpos frente a Treponema pallidum. Datos lomados de Larson SA, y cois Laboralory diagnosis and inrerpreíalion ol tests lor syphilis Clin Microbio! Rev 1995; 8:1
CAPÍTULO 52
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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
TP es menor que la que se encuentra cuando se emplea la inmunofluorescencia indirecta (FTA-ABS) (Larsen, 1995). Los ensayos de inmunoadsorción acoplados a enzimas (ELISA), que utilizan antigenos treponémicos específicos, han comenzado a estar disponibles para su empleo en los labóratenos clínicos. Ofrecen las ventajas de tener un formato que facilita la manipulación de un gran numero de muestras y una interpretación objetiva de los resultados. La sensibilidad y la especificidad de los métodos comerciales actualmente disponibles son comparables a las técnicas FTA-ABS y MHATP (Norgard, 1993: Lefevre. 1990). Estos métodos han sido utilizados para el escrutinio en situaciones especificas, como las de los donantes de sangre, y, junto con los métodos de tipo no treponémico, en los laboratorios que procesan un gran volumen de muestras en áreas donde existe población con una alta prevalencia (Aberle-Grasse. 1999: Reisner, 1997). Los enzimommunoensayos (EIA) que utilizan antigenos no treponémicos y los procedimientos específicos para la detección de IgM también están disponibles para el rastreo y el diagnóstico de la sífilis congénita, respectivamente (Hcoper. 1994: Stoll. 1993). Los métodos moleculares, como la transferencia o Western btot (WB) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). están disponibles en algunos laboratorios de referencia. El WB está recomendado para el diagnóstico de la sífilis congénita (Larsen, 1995). El uso de la PCR ha sido apoyado en el caso del diagnóstico de la neurosílilis, en especial en los pacientes con sida, aunque los esludios realizados no han demostrado que existan ventajas sustanciales sobre los métodos utilizados habitualmenle (Marra, 1995).
Tratamiento de las treponematosis Las subespecies de T. pallidum y 7! carateum son uniformemente susceptibles a la penicilina y otros antibióticos [i-lactámicos. El tratamiento de la sífilis primaria, secundaria y de la sífilis latente temprana consiste en una única inyección intramuscular de penicilina G-benzatina. La frambesia, la pinta y la sífilis endémica se tratan con el mismo antibiótico, aunque con una dosis más baja (Engelkens, 1991). Los contactos en el ámbito familiar con pacientes afectados por estas tres últimas enfermedades se tratan de igual forma. En el caso de personas alérgicas a la penicilina, se puede utilizar doxiciclina o tetracilina. Los macrólidos ya no están recomendados para el tratamiento, puesto que se ha observado que su eficacia es inferior al 90% (Schroeler, 1972). Para la sífilis latente tardía o sífilis de duración desconocida se administran dosis múltiples de penicilina G-benzatina. En el caso de la frambesia, la pinta o la sífilis endémica, la fase en la que se encuentra la enfermedad no afecta al tratamiento (Engelkens. 1991). Para el tratamiento de la neurosílihs y la sífilis congénita se administran por via intravenosa dosis elevadas de penicilina G en solución acuosa. El CDC de Atlanta no recomienda cambio alguno en las pautas de tratamiento establecidas en los pacientes con sida y sífilis concomitantes: sin embargo, otros autores sugieren que estos pacientes deberían ser tratados con dosis elevadas de penicilina, incluso para el tratamiento de la sífilis en fase primaria, dada la propensión que tienen los mismos para desarrollar neurosífilis (Tramonl. 1995; Musher, 1991).
GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRÓNICA Descripción. Un cierto número de espiroquetas no caracterizadas (espiroquetas relacionadas con patología oral [PROS]) y algunas especies del género Treponema (entre ellas, como más comunes. T denticola y T. socranskr) han sido aisladas cada vez con mayor frecuencia y en número elevado de las encías de los pacientes con gingivitis ulcerativa y periodontitis crónica, en comparación con lo que se observa en el caso de individuos con las encías sanas (Riviere, 1991,1995,1996). Patogenia. No ha podido establecerse una relación causa-efecto definitiva entre las espiroquetas y estas enfermedades; sin embargo, su presencia en número significativo solamente en el tejido enfermo sugiere que estas bacterias pueden jugar un papel como agentes responsables de la gingivitis/periodontitis Además, las PROS han mostrado reactividad cruzada con anticuerpos monoclonales frente a T. pallidum y. al igual que esta especie, tienen la capacidad de invadir las encias y el tejido de la pared peritoneal en ratones in vitro (Riviere, 1991,1996). Otras espiroquetas orales no poseen estas características Diagnóstico. Del mismo modo que las especies comensales del género Treponema que se encuentran en la zona genital, las especies orales de este
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género pueden cultivarse utilizando un medio especifico para el aislamiento de las mismas que contenga antibióticos y condiciones de incubación de anaerobiosis estricta (Smibert. 1993) Las PROS no han podido cultivarse m vilro. La detección se lleva a cabo con anticuerpos monoclonales contra T. pallidum. frente a los cuales estas bacterias exhiben reactividad cruzada.
LEPTOSPIROSIS Descripción. El género Leptospira incluye 11 genoespecies. siete de las cuales son patógenas, y más de 250 serovares (Gravekamp, 1993; de Caballero. 1994). Anteriormente, el género estaba formado por tres especies: L, interrogans (patógena), con 23 serogrupos y más de 200 serotipos, L. bitlexa y L. parva (ambas no patógenas). Las leptospiras son espiroquetas con las vueltas de hélice muy apretadas y con los extremos curvados, que tienen un grosor de 0.1 jim y entre 6 um y 20 um de longitud y que exhiben movilidad giratoria. Pueden sobrevivir en aguas dulces con pH alcalino, pero mueren en aguas saladas o con pH ácido y como consecuencia de la desecación. Epidemiología. La leptospirosis es una zoonosis con dislnbución mundial. Algunos serotipos se encuentran preferentemente en determinadas zonas geográficas. Muchos roedores, asi como otros animales tanto salvajes como domésticos, son portadores de estos microorganismos: en cualquier caso, las ratas son el reservorio más frecuente, representando una importante fuente de infección para el hombre. La forma más frecuente de infección es por contacto con agua contaminada con orina, lo que permite la entrada del microorganismo a través de heridas en la piel o directamente por las membranas mucosas. Algunas personas tienen un mayor nesgo de infección debido a su profesión (mineros, granjeros y agricultores, veterinarios, trabajadores de piscifactorías, empleados de plantas de depuración de aguas residuales) o a la práctica de ciertas actividades de recreo (por acampar en zonas próximas a cursos de agua infectados o por bañarse en los mismos). En EE.UU. se declaran entre 40 y 120 casos al año, aunque muy probablemente el número sea superior (Farr. 1995). Patología y patogenia. Tras penetrar en el torrente circulatorio, las bacterias se diseminan por localizaciones muy diversas del cuerpo, incluyendo el SNC y los ojos. Como consecuencia de las lesiones en el endotelio de los tejidos infectados se produce isquemia local y hemorragias. También pueden observarse daños hepatocelulares y en los túbulos renales. El hígado puede tener un color amarillo-verdoso característico, aunque los cambios histológicos detectados son inespecificos. incluyendo degeneración (redondeamiento o "balonización"). cuerpos de inclusión acidólilos. regeneración y colestasis. pudiendo encontrarse las leptospiras en aproximadamente un 25% de los casos (Dooley, 1976). El riñon muestra nefritis crónica intersticial, necrosis de los túbulos proximales y cilindros granulares o hialinos, con leptospiras mtratubulares en un 65% de los casos (Arean, 1962). También se han observado casos de miocarditis, meningitis/encefalitis y miositis (Arean, 1962). Los mecanismos responsables de los daños endoteliales. hepáticos y renales son desconocidos, aunque podrían tener una base inmunológica. Clínica. Típicamente, la infección por leptospiras se manifiesta como una enfermedad suave parecida a la gripe (forma anictérica); una minoría de afectados sufre una forma más grave de la enfermedad con ictericia, que tiene una tasa de mortalidad del 5% al 10% (forma ictérica o enfermedad de Weil). La leptospirosis es una enfermedad bifásica, que comienza tras un periodo de incubación variable (entre 2 y 20 días), con la aparición brusca de escalofríos, fiebre, dolor de cabeza, mialgias, dolor en la espalda y el abdomen, anorexia. nauseas y vómitos. Durante esta fase, denominada fase bacteriémica, tiene lugar una extensa diseminación de la bacteria por el cuerpo. La fase bacteriémica dura entre cuatro y siete días y es seguida por un corto periodo (varios días) durante el que los síntomas remiten, tras el que viene la fase de respuesta inmunológica caracterizada por la aparición de anticuerpos frente al microorganismo, meningitis, uveítis, sarpullido y daño hepático y renal. La erupción pretibial se ha asociado con la infección por el serovar autumnalis (fiebre de Fort Bragg). En muchos casos, la fase inmunológica es suave y dura entre uno y tres días solamente. Alrededor de la mitad de los pacientes muestran síntomas clínicos de meningitis y pleocitosis en el líquido cefalonaquídeo durante la segunda semana de la enfermedad. En el pequeño porcentaje de pacientes con enfermedad de Weil, las dos fases se fusionan, teniendo los afectados fiebre elevada persistente, ictericia y hemorragias, a lo que sigue fallo renal oligúrico, shock y miocarditis. (Arean. 1962; Edwards. 1960).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Diagnóstico de laboratorio. Las leptospiras pueden aislarse a partir de LCR. sangre y tejidos al principio de la fase bacteriémica (primeros 10 días), y de la orina durante la fase inmunológica (segunda semana y hasta los 30 dias). Para el cultivo es necesario un medio semisólido (medio de Fletcher o medio de Ellmghausen, McCullough, Johnson, Harris [EMJH]). que se incuba en la oscuridad a 25°C-30"C entre cuatro y seis semanas. La orina debe ser alcalinizada si no va a ser procesada inmediatamente. Las leptospiras crecen entre 1 cm y 3 cm por debajo de la superficie del medio, y pueden producir una zona de crecimiento en forma de disco lineal. Las muestras recogidas con periodicidad semanal de esa localización de los medios de cultivo deben examinarse mediante microscopía de campo oscuro para detectar las leptospiras con su movimiento giratorio y los extremos curvados. Los anticuerpos aglutinantes aparecen durante la primera semana de la enfermedad, alcanzan un máximo entre la tercera y cuarta semana y pueden persistir durante años. Los anticuerpos pueden detectarse por medio de aglutinación en tubo, microaglutinación en portaobjetos, hemoaglutinación o enzimoinmunoensayo (EIA), con antigenos bacterianos. La técnica de la microaglutinación utiliza bacterias vivas como suspensión antigénica, empleándose fundamentalmente en la investigación básica. La PCR se ha usado para detectar el ADN de las leptospiras en pacientes infectados (Vinetz, 1996). Recientemente se ha utilizado con éxito un test de EIA modificado (en forma de bastoncillo que se sumerge en la muestra de suero) que detecta anticuerpos específicos frente a Leptospira en situaciones en las que existe una infraestructura de laboratorio minima (Yersin, 1999: Gussenhoven, 1997). Tratamiento. La torma grave de la enfermedad necesita tratamiento por vía intravenosa con penicilina G o ampicilina en solución acuosa, mientras que la forma menos grave puede tratarse por vía oral con ampicilina. amoxicilma o doxicilina. La profilaxis con doxicilina suministra protección a las personas que se encuentran en ambientes en los que hay riesgo elevado de exposición a las bacterias (Farr, 1995). La vacunación de los animales domésticos y mascotas ha reducido el riesgo de infección a partir de estos animales en los individuos pertenecientes a los grupos de riesgo, como veterinarios y granjeros. De todas lormas, el riesgo no se elimina totalmente, ya que se han detectado casos de infección en animales inmunizados a partir de los que se ha transmitido la intección a humanos (Feign. 1973).
FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA Descripción. Spihllum minus es una bacteria gramnegativa, con las vueltas de espira muy juntas, que tienen un grosor de 0,5 um y entre 2 pm y 5 pm de longitud, y que posee penachos de flagelos bipolares. Epidemiología. La infección por S. minus en el hombre causa una fiebre recurrente denominada sodoku. muchos de cuyos casos se han descnlo en Japón, aunque también se han detectado en otras partes del mundo, con una distribución muy amplia. Esta bacteria forma parte de la microbiota del tracto respiratorio de las ratas y se transmite por una mordedura. La ingestión no parece ser una causa de infección en el ser humano La enfermedad es muy rara en EE.UU. Las personas que trabajan en los laboratonos de investigación son uno de los grupos de riesgo para contraer la infección (Anderson. 1983). Patogenia y patología. La patogenia de S. minus es poco conocida La diseminación de las bacterias tiene lugar muy poco tiempo después de la inoculación. Las pocas autopsias realizadas de los casos mortales han descrito necrosis epitelial y un infiltrado mononuclear en la dermis en el lugar de la mordedura original, un infiltrado mononuclear perivascular en la dermis en la zona de la erupción cutánea, hiperplasia de los ganglios linfáticos y necrosis en el hígado, bazo, riñon, miocardio y meninges (Washburn. 1995). Clínica. La herida de la mordedura cicatriza micialmente. pero entre una y cuatro semanas más tarde aparece una lesión indurada, que puede ulcerarse eventualmente, en el mismo lugar. El paciente sufre períodos febriles recurrentes separados por fases no febriles que duran entre tres y siete días. La fiebre puede estar acompañada de mialgia. dolor de cabeza y vómitos. La mitad de los pacientes tienen una erupción macular que puede formar grandes placas (Taber, 1979). Los síntomas desaparecen, generalmente, en un tiempo que oscila entre tres y ocho semanas, aunque pueden producirse recaídas y complicaciones como endocarditis, meningitis, micocarditis y
nefritis (Washburn. 1995). La mortalidad antes del advenimiento de los antibióticos oscilaba entre el 6% y el 10% (Washburn, 1995). Diagnóstico de laboratorio. S minus sólo puede cultivarse en animales (ratones o cobayas) mediante inoculación intraperitoneal de los mismos. La presencia de los microorganismos puede ponerse de manifiesto mediante tinción de extensiones de los exudados procedentes de las lesiones o los ganglios linfáticos, por el método de Wright-Giemsa o mediante observación en fresco bajo microscopía de campo oscuro. No existen métodos serológicos para el diagnóstico, aunque hasta un 50% de los pacientes pueden dar un falso positivo con los métodos no treponémicos para el diagnóstico de la sífilis (Taber. 1979). Tratamiento. La penicilina G en solución acuosa, administrada por vía intravenosa, es el antibiótico de elección. La tetraciclina es la alternativa en el caso de pacientes con alergia a la penicilina.
ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS Descripción. Anaerobiospihllum succiniciproducens es una bacteria gramnegativa, espiriforme, que tiene un grosor de entre 0,6 pm y 0,8 pm y entre 4 pm y 8 um de longitud. Exhibe una movilidad semejante a la de un sacacorchos al penetrar en el tapón y posee flagelos multitricos en ambos polos del soma bacteriano. Epidemiología. Esta bacteria anaerobia puede lormar parte de la microbiota comensal normal de gatos y perros sanos, habiéndose sugerido (aunque no se ha podido demostrar de forma definitiva) una asociación entre la enfermedad en humanos y el contacto con estas mascotas (Goddard, 1998; Malnick, 1990). A. succiniciproducens se ha asociado con una enfermedad diarreica en pacientes normales y con septicemia en individuos con una enfermedad de base que predisponga. Se piensa que el microorganismo penetra en el torrente circulatorio a partir del tracto gastrointestinal de estas personas (Tee. 1998; McNeil. 1987). La incidencia de la infección es ba|a. aunque se ha ido incrementando en los últimos años, debido probablemente a la mejora de las técnicas de detección mediante cultivo (Goddard, 1998). Clínica. Los pacientes con gastroenteritis sufren dolor abdominal, vómitos, y diarrea durante un tiempo que oscila entre tres y siete días; aquellos que no tienen enlermedad subyacente alguna se recuperan sin mayor problema (Malnick. 1990). Los casos de septicemia se dan entre individuos con patologías subyacentes, tales como alcoholismo, ateroesclerosis. tumores, diabetes mellitus y gingivitis (Goddard, 1998). Hasta un tercio de los afectados por la septicemia fallecen. Diagnóstico de laboratorio. A. succiniciproducens crece bien en los sistemas automatizados para hemocultivo (Tee, 1998). Tras el subcultivo en agar chocolate o agar sangre aparecen las colonias al cabo de 2-3 días, que tienen un aspecto húmedo y miden entre 1 mm y 2 mm de diámetro. Algunas características bioquímicas de utilidad para la identificación son la ausencia de catalasa, indol y oxidasa, la producción de ácido succinico y ácido acético a partir de la glucosa (puesta de manifiesto mediante cromatografía de gas-liquido) y la ausencia de crecimiento a 25'C o 42"C. Existe un medio selectivo para esta bacteria desarrollado por Malnick y sus colaboradores (Malnick, 1990). Tratamiento. Debido a la naturaleza poco común de esta infección, aún no se ha establecido una terapia óptima para el tratamiento de la septicemia. In vilro. la mayor parte de los aislamientos estudiados son sensibles a la carbenicilina, cefoxitina. cloranfenicol y metronidazol y resistentes a la vancomicina y clindamicina; sin embargo, los ensayos han tenido carácter limitado y no han sido estandarizados (Sales, 1982; McNeil, 1987).
ESPIROQUETOSIS INTESTINAL Descripción. Se han encontrado dos especies de espiroquetas en el colon de los seres humanos: Serpulma pilosicoliy Brachyspira aalborgi. Estos microorganismos son gramnegativos, con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 pm y 0.4 pm (diámetro) y 4 pm y 8 pm (longitud). Cerca de cada polo de las bacterias, en posición subterminal. hay entre 4 y 6 flagelos. Epidemiología y clínica. S. pilosicoli provoca la espiroquetosis intestinal porcina, una enlermedad de tipo diarreico que aleda a los cerdos jóvenes, y también se han recuperado cepas relacionadas con esta especie a partir de
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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
perros y otros animales (Trott, 1996). No se sabe si los animales actúan como reservónos en el caso de la infección en humanos. 8. aalborgi está peor caracterizada. El género contiene esta única especie, que fue denominada tras su aislamiento del colon de un paciente humano (Hovmd-Hougen. 1982). La asociación de las espiroquetas intestinales con la infección no está totalmente establecida, ya que las bacterias han sido identificadas en individuos tanto sintomáticos como asintomáticos. Parece que existe una mayor prevalencia en varones homosexuales que en otros grupos de población (Teglbjaerg, 1990). Los síntomas atribuidos a la espiroquetosis intestinal son diarrea, dolor abdominal y sangrado y descargas rectales (Teglb|aerg, 1990). Además. S. pilosicolise ha aislado de la sangre de pacientes críticos, aunque el significado de este hallazgo no está claro (Trott, 1997). Patología y patogenia. Las espiroquetas se pueden observar fácilmente en los especímenes obtenidos mediante biopsia, ya que torman una franja de color azul oscuro en la superficie de las células epiteliales del colon, sin afectar a las células en copa o globosas. Los métodos de impregnación argéntica también permiten una perfecta vísualización de los microorganismos. Las células epiteliales aparecen normales y no se detecta un incremento de la inflamación en la lámina propia. La microscopía electrónica revela que las bacterias se adhieren a la superficie del extremo superior de las células epiteliales del colon, quedando orientadas perpendicularmente hacia el lumen intestinal (Teglbjaerg, 1990). Se ha demostrado la invasión de los macrófagos epiteliales y de la mucosa en individuos tanto sintomáticos como asintomáticos (Teglbjaerg, 1990). No se ha establecido la patogenia. Diagnóstico de laboratorio. Las espiroquetas pueden detectarse en las heces mediante microscopía de campo oscuro y cultivarse a partir de las muestras de heces o de tejidos (obtenidas por biopsia) en agar tripticasa de soja con un 5%-10% de sangre de caballo o de ternero. La adición de espectinomicina y polimixina B confieren carácter selectivo al medio (Teglbjaerg, 1990). En los medios incubados anaeróbicamente las colonias son puntiformes y débilmente [{-hemoliticas, y aparecen en un período de tiempo que va desde los tres días hasta las cuatro semanas, dependiendo de la cepa. Tratamiento. Aunque se han publicado los datos relativos a la sensibilidad a los antimicrobianos para la especie tipo de S. pilosicoli, no se han descrito ensayos estandarizados para un número elevado de aislamientos (Trott, 1996). Los pacientes con síntomas de padecer espiroquetosis intestinal responden al tratamiento con metronidazol (Teglbjaerg, 1990).
DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES POR BORRELIAS Las especies del género Borrelia son bacterias helicoidales, microaerófilas, con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 um y 0,5 um (diámetro) y 5 um y 25 um (longitud), y que presentan entre 4 y 30 vueltas de hélice. Poseen una envoltura externa o membrana que rodea el cilindro protoplásmico en espiral, formado por la capa de peptidoglucano y la membrana plasmática que engloba al contenido citoplasmático de la célula. Entre 7 y 22 filamentos axiales (flagelos periplásmicos) son responsables de la movilidad de estas bacterias. Estos microorganismos se multiplican por escisión binaria y necesitan ácidos grasos de cadena larga para poder crecer. En esta sección se describe a Borrelia burgdorferi, el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, asi como otras especies de Borrelia relacionadas con la fiebre recurrente.
Enfermedad de Lyme La enfermedad de Lyme es una enfermedad inflamatoria multisistémica que se transmite por las garrapatas y que puede aparecer a cualquier edad en ambos sexos (Steere, 1997,1989). Su manifestación clínica más distintiva es una lesión expansiva de la piel, el eritema migrans (EM), que puede ser seguido, semanas o meses más tarde, por la aparición de problemas neurológicos, cardíacos o en las articulaciones. Las lesiones del tipo EM lueron ya descritas en Europa en 1910 por Arvid Afzelius (Afzelius, 1910). que asoció su aparición con la mordedura de la garrapata Ixodes reduvius. La mordedura de esta garrapata (o la de la especie relacionada, /. ricinus) fue asociada más tarde con la meningopolineuritis transmitida por garrapatas (síndrome de Garin-Bujadoux y Bannwarth). Sin embargo, no fue hasta mediados de la década de los 70 cuando Steere y sus colaboradores identificaron la enfermedad como una enti-
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dad clínica diferente, localizando su origen en una garrapata intimamente emparentada, /. dammini, que ahora se denomina /. scapularis (Steere, 1978). En 1982, Burgdorfer y sus colaboradores aislaron la espiroqueta que lleva su nombre (Borrelia burgdorferi) a partir de Ixodes dammini. recogida en Shelter Island (estado de Nueva York), asociándola con la enfermedad de Lyme en base a las evidencias de tipo inmunológico (Burgdorfer. 1986: Steere. 1983). En el periodo siguiente, este microorganismo fue aislado a partir de sangre (Steere, 1983: Benach, 1983: Berger, 1994; Nadelman, 1990), piel (Berger, 1992), liquido sinovial (Schmidli. 1998), iris (Preac-Mursic, 1993), miocardio (Stanek, 1990) y LCR (Steere. 1983; Schmidli. 1998» de pacientes detectándose respuesta inmune mediada por anticuerpos tanto del tipo igM como IgG. Hoy día. la enfermedad de Lyme esla reconocida como la infección transmitida por vector más frecuente en EE.UU.. siendo detectados más de 16.000 casos de la misma en el año 1996 (CDC, 1997).
Epidemiología y patogenia El agente causal de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi. ha sido caracterizado minuciosamente y subdividido desde el punto de vista filogenético en diferentes genoespecies. Actualmente, tres de estas especies están asociadas a la enfermedad de Lyme: 8. burgdorferi en sentido estncto (de distnbución mundial). 8. gariniiy B. atzelii (ambas asociadas con la infección en el continente euroasiático). Cada una de estas especies se ha relacionado, asimismo, con determinadas manifestaciones clínicas de la enfermedad de Lyme (véase al final de esta sección bajo el epígrafe Manifestaciones clínicas), aunque no está claro si estas diferencias se deben a las propias espiroquetas o a otros factores (Berglund. 1995; Postic. 1996; van Dam. 1993) La presencia de 8. burgdorfenen América del Norte está documentada, al menos en los últimos 100 años, mediante la técnica de la PCR aplicada al estudio de especímenes de museo de garrapatas del género Ixodes y de ratones de pala blanca (Persing. 1990: Marshall. 1994), Algunos estudios que han puesto de manifiesto la heterogeneidad genética de los aislamientos de 8. burgdorfenen EE.UU. (Mathiesen. 1997), apuntan también hacia la presencia de este microorganismo en la zona desde muy antiguo. Se han aislado espiroquetas identificadas como 8. burgdorferi a partir de roedores y garrapatas en muchas áreas no endémicas de EE.UU. Estos aislamientos muestran, a menudo, un nivel sustancial de heterogeneidad genética, y algunos de ellos parecen ser genoespecies únicas de 8. burgdorferi sensu lato. El ciclo enzoótico vital de Borrelia va en paralelo con el ciclo vital del insecto vector, que son los miembros del compleio Ixodes ricinus. Las garrapatas adquieren las espiroquetas típicamente durante la fase larvaria de desarrollo, mientras se alimentan de un animal infectado que actúa como reservorio de la bacteria. Las espiroquetas se encuentran en el intestino medio de la garrapata y son transmitidas a través de la saliva de ésta mientras se alimenta en las sucesivas fases de desarrollo, estando implicada la lase de ninfa en la mayor parte de casos de transmisión a humanos a partir de las garrapatas. En el este, medio oeste y sur de EE.UU.. 8. burgdorferi es transmitida al hombre principalmente por la mordedura de la garrapata del ciervo, que es responsable de la mayor parte de los casos que se detectan entre mayo y agosto. Ixodes paciticus es el insecto vector a lo largo de la costa oeste de EE.UU. (Dennis, 1998). Otras garrapatas pertenecientes al complejo /. ricinus son las que transmiten la bacteria en Europa, mientras que en China /. persulcatus es la garrapata que está implicada en el proceso (Anderson, 1993). Además de la transmisión por la mordedura de la garrapata, las espiroquetas adquiridas durante el embarazo pueden atravesar la placenta causando, aparentemente, infección congénita (MacDonald, 1989). En la naturaleza, la infección por 8. burgdorferi se mantiene por transmisión honzontal desde las ninfas infectadas de la garrapata hasta el vertebrado hospedador. Aunque el reservorio animal primario de 8 burgdorfen en Norteamérica es el ratón de patas blancas, Peromyscus leucopus, muchos otros mamíferos y pájaros pueden albergar, y en consecuencia transmitir estas espiroquetas mediante una garrapata vector (Anderson, 1993: Gern, 1998) Diferentes animales, incluyendo varias especies de pájaros, mamíferos y reptiles, pueden actuar como huéspedes para las especies de Ixodes. Muchas de estas especies anímales no son competentes para servir como reservorio de las espiroquetas del género Borrelia: sin embargo, un aumento en la población de aquéllas puede ocasionar, subsiguientemente, un aumento en la prevalencia de las garrapatas, lo que indirectamente puede ocasionar un incremento en la incidencia en la transmisión de la enfermedad. Se cree que este último escenario explicaría, al
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
menos en parle, el aumento de casos registrados de la enfermedad de Lyme en el nordeste de EE.UU., donde el ciervo de cola blanca parece ser el huésped primario de /. scapularis. Durante los últimos años se han hecho avances significativos en el conocimiento del ciclo de transmisión de la espiroqueta, que ha sido reconocida como un importante problema de salud pública. Aunque muchos aspectos de la enlermedad son todavía confusos, se han puesto de manifiesto aspectos clave sobre su patogenicidad. Tal como se ha descrito en recientes revisiones (Sigal, 1997a, 1997; Hu, 1997b; García-Moneo, 1997), la patogenia de la enfermedad de Lyme podría estar relacionada tanto con los efectos directos causados por el microorganismo como con efectos indirectos derivados de la respuesta del sistema inmunitario del hospedador. Las bacterias son inoculadas en la dermis por la mordedura de la garrapata y se diseminan hematógenamente a continuación, uniéndose a diferentes tipos de células a través de distintas clases de receptores de la superficie celular. Aunque todavía quedan muchos aspectos por elucidar, parece que durante la fase inicial de la infección existe tanto una respuesta ineficaz de los fagocitos como una respuesta inmunoblástica en la que están implicados componentes humorales y celulares (Hu, 1997). La liberación de citocinas durante esta respuesta puede ser responsable, al menos en parte, de algunas de las manifestaciones clínicas de la forma aguda de la enlermedad de Lyme. También es posible que se activen respuestas autoinmunes que podrían dar lugar a la forma crónica de la enfermedad, que es menos frecuente y no responde al tratamiento con antibióticos.
Manifestaciones
clínicas
El primer y más fácilmente reconocible síntoma de la enfermedad de Lyme es el eritema migrans (EM), que se manifiesta en un porcentaje elevado (entre el 63% y el 90%) de los individuos afectados, entre dos días y cuatro semanas después de la mordedura de la garrapata (Nadelman, 1995; Gerber, 1996). En el lugar de la mordedura aparece una mácula o pápula rojiza, indolora, que se extiende en círculo, dando lugar a una típica lesión plana con un diámetro que puede oscilar entre 3 y 70 cm (el tamaño medio es de 15 cm). con el borde de color rojo brillante y la parte central más clara. El aspecto de la lesión puede, sin embargo, variar; un eritema confluente o con aspecto de una diana suele ser bastante frecuente, y también pueden aparecer vesículas en el centro, así como necrosis. La diseminación hematógena del microorganismo tiene lugar muy pronto, produciendo fiebre, cansancio, dolor de cabeza, rigidez en el cuello, malestar, dolor musculoesquelético migratorio, lesiones del tipo EM secundarias y linfadenopatía generalizada, entre otros síntomas (Nadelman, 1996; Steere, 1997,1987; Berger, 1997).
miento con antibióticos (Steere, 1987,1995). Las manifestaciones neurológicas crónicas como la encefalopatía, la polineuropatía o la leucoencefalitis pueden aparecer al cabo de meses o incluso años después de la infección inicial (Logigian, 1990). La acrodermatitis crónica atrófica (ACÁ), una lesión cutánea atrófica que contiene espiroquetas de B. burgdorteri (Steere. 1989), ha sido detectada en pacientes al cabo de 10 años después del inicio de la enfermedad. Al igual que el linfocitoma por borrelia anteriormente comentado, la ACÁ parece afectar exclusivamente a pacientes europeos (Asbrink, 1986). Varios autores han indicado la existencia de diferencias geográficas en lo que respecta al espectro clínico típico de la borreliosis de Lyme (Nadelman, 1998). En concreto, los síntomas sistémicos agudos, así como la evidencia tardía de artritis, se observan con mayor frecuencia en los casos de Norteamérica. Los síntomas neurológicos y las lesiones cutáneas tardías descritas en el párrafo precedente se detectan más frecuentemente en pacientes europeos. Estas diferencias en las manifestaciones clínicas se han correlacionado con las diferentes especies de Borrelia que tienen prevalencia en los continentes de América del Norte y Eurasia (van Dam. 1993; Balmelli, 1995). Sin embargo, la localización anatómica de la mordedura de la garrapata puede tener también consecuencias en la afectación de órganos específicos; así, por ejemplo, la mordedura en zonas alrededor de la cabeza y del cuello se asocia frecuentemente con enfermedad a nivel del SNC (Berglund, 1995). Una complicación adicional del cuadro clínico está representada por los recientes informes sobre coinfección en los pacientes con borreliosis de Lyme por los agentes etiológicos de la ehriichíosis granulocílica humana y la babesiosis (Telford, 1996: Tang, 1997: Krause, 1996: Nadelman, 1997). Estas enfermedades comparten el mismo vector, y la coinfección de los pacientes en zonas donde las tres son endémicas puede dar lugar tanto a manifestaciones clínicas atípicas como a una enfermedad potencialmente más grave. El conocimiento de una posible reinfección es necesario a la hora de establecer el protocolo de laboratorio más apropiado, así como para el establecimiento de un tratamiento antimicrobiano eficaz en tales casos.
Diagnóstico de laboratorio
Métodos serológicos. Los avances en el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Lyme han retrasado la percepción del público sobre la gravedad y prevalencia de esta enfermedad. Utilizados inicialmente para confirmar tan sólo una opinión clínica, el aumento en la utilización, cada vez más generalizada, de los métodos disponibles comercíalmente para las pruebas serológicas de la enfermedad de Lyme ha conducido, cuando menos, a una situación de confusión en el diagnóstico (Luger, 1990). La mayor parte de la incertidumbre diagSin tratamiento, las lesiones en la piel desaparecen en tres o cuatro semanas nóstica que rodea a la enfermedad de Lyme es debida a que los síntomas son inespecíficos y, al margen de la lesión característica de la piel, el eritema (con un rango de tiempo que puede ir desde un día hasta 14 meses), aunque migrans (que aparece en muchos, pero no en todos, de los pacientes con la pueden aparecer subsiguientemente daños en uno o en varios sistemas princienfermedad de Lyme), hay muy pocas otras características con valor patognopales de órganos. En el 10% al 20% de pacientes no tratados en EE.UU., puemónico. En la década de 1980, las técnicas serológicas para B. burgdorteri se de producirse una afectación neurológica aguda (Nadelman, 1998), que normalmente se manifiesta dentro de las primeras cuatro a seis semanas del comienzo utilizaron primariamente en pacientes procedentes de áreas fuertemente endémicas del noreste de EE.UU. Sin embargo, la proliferación de técnicas serolóde la enfermedad. La parálisis de Bell (séptimo nervio) es la manifestación neugicas disponibles en el mercado, junto con un aumento en la sensibilidad y rológica más común; otras manifestaciones que también pueden producirse son conocimiento del público sobre la enfermedad, ha conducido a un notable increlas neuropatías periféricas, la meningitis linfocítica o la meningoencefalitis (Bermento en la frecuencia de utilización de estos ensayos. En muchos casos, las ger, 1997; Halpenn. 1998). La encefalomielilis se observa mucho menos fretécnicas de diagnóstico serológico se aplican como consecuencia de que detercuentemente, pero puede tener graves secuelas (Halpenn. 1998). La mayor parminados pacientes con ciertos síntomas, como cansancio inespecífíco y moleste de personas con manifestaciones de tipo neurológico muestran pleocitosis tias de tipo neurológico y/o reumatológico, exigen un diagnóstico concreto de linfocítica (alrededor de 100 células por mm) y una elevada concentración de sus dolencias. Dado que esos síntomas pueden ser debidos a causas muy proteínas en el LCR (Tumani, 1995; Pohl, 1987). Hasta en un 8% de los casos diversas, la prevalencia global de la enlermedad de Lyme en este grupo de perpuede haber afectación cardiaca aguda (Steere, 1989), que se manifiesta en sonas es, a menudo, menor que la tasa de falsos positivos que producen estos forma de diversos grados de bloqueo atriovenlricular, miocarditis o pericarditis. ensayos, lo que conduce a un número absoluto más elevado de resultados falTambién se ha observado una manifestación cutánea adicional de la enfermesos positivos en relación con los verdaderos positivos lAmerican Collage ol dad, el linfociloma por borrelia, pero sólo en pacientes en Europa. Physicians, 1997; Tugwell, 1997). Por otro lado, muchos de los métodos dispoLa fase crónica de la enfermedad de Lyme comienza a partir del momento nibles en la actualidad no son capaces de detectar la respuesta humoral muy en que aparece la respuesta inmunológica en el huésped y comienza a distemprana frente a B. burgdorteri (Agüero-Rosenfeld. 1993: Dressler, 1993); por minuir el número de espiroquetas. Los pacientes pueden entrar en una fase lo tanto, el diagnóstico de un paciente sin eritema migrans sospechoso de padede latencia; algunos de ellos pueden tener, más tarde, manifestaciones dercer enfermedad de Lyme en una fase muy temprana puede llegar a ser difícil. matológicas, reumáticas, cardiacas o neurológicas, mientras que otros pueden permanecer asintomáticos. Alrededor de la mitad de personas que no Como sucede con muchos métodos serológicos para el diagnóstico de reciben tratamiento en EE.UU. pueden experimentar episodios de artritis infecciones bacterianas, los resultados falsos positivos para anticuerpos frendurante dos o más años, y en el 10% de los casos la artritis se vuelve crónite a 8. burgdorteri pueden deberse a anticuerpos frente a otras bacterias, tales ca (Steere, 1987); en muchos casos, la artritis parece responder al tratacomo las espiroquetas que se encuentran formando parte de la microbiota ñor3
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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
mal de la boca, así como Treponema pallidum y Leptospira. que exhiben reactividad cruzada. Además, los pacientes con trastornos del tejido conectivo, como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y espondiloartrítis pueden dar también un resultado serológico falsamente positivo (Saulsbury, 1990; Magnarelli, 1990; Lovece, 1991; Fawcett, 1992). Los falsos negalivos pueden presentarse al principio de la infección, antes de que se produzcan anticuerpos en cantidades detectables (que pueden tardar hasta dos meses en aparecer), o en pacientes con inmunosupresión. A pesar de estas limitaciones, es un error asumir que las pruebas de tipo serológico existentes para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme sean completamente irrelevantes. Si los pacientes que están siendo analizados son seleccionados cuidadosamente en función de los síntomas que presentan (siempre que sean compatibles con la enfermedad de Lyme), y se tienen en cuenta aspectos y consideraciones de índole epidemiológica para realizar el diagnóstico, el valor predictívo positivo de los métodos serológicos puede ser bastante aceptable, especialmente si los resultados positivos de la serología se confirman mediante la técnica del Western blol (WB; inmunotransferencia) (Tugwell. 1997). Muchos de los problemas actuales en relación con las pruebas serológicas para la enfermedad de Lyme se deben, probablemente, a las diferencias entre laboratorios en lo que respecta a su capacidad para ejecutar estos ensayos con precisión (Bakken. 1997.1992). Ello puede estar relacionado con diversos factores, incluyendo los tipos de preparaciones antigénicas empleadas como sustrato y las diferencias en los métodos utilizados para la preparación de antígenos y otros procedimientos experimentales, así como en los criterios de interpretación Actualmente, varias instituciones (Centers lor Disease Control and Prevention, Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors. United States Food and Drug Administration [FDAj) recomiendan que se analicen las muestras de suero de pacientes con síntomas de la enfermedad de Lyme medíante un procedimiento en dos pasos (CDC, 1995). Este procedimiento debería comprender en primer lugar un test de escrutinio sensible para la detección de anticuerpos totales o específicos de clase frente a B. burgdorferi, lo que puede llevarse a cabo tanto por mmunofluorescencia (IFA) como por enzimoinmunoensayo (EIA). Aquellas muestras dudosas o positivas en el rastreo inicial deben analizarse complementariamente mediante inmunotransferencia (WB). utilizando una cepa de B. burgdorferi con bajo número de pases en laboratorio (p. ej.. la B31) que exprese cantidades adecuadas de proteínas con valor diagnóstico (enumeradas en los párrafos siguientes). La inmunotransferencia debe llevarse a cabo tanto para IgG como para IgM a partir de muestras de suero de los casos sospechosos que se presenten dentro de las primeras cuatro semanas desde el inicio de la enfermedad. En el caso de pacientes que se encuentren más allá de ese tiempo, sólo debe realizarse la ¡nmunotransferencia para IgG. puesto que el patrón de bandas reactivas frente a IgM que se detecta después de las primeras cuatro semanas del comienzo de la enfermedad es menos fiable. En el caso de pacientes con síntomas de la enfermedad de Lyme en fase temprana y que han dado resultados negativos en el análisis inicial, se recomienda realizar las pruebas serológicas a partir de una muestra de suero tomada durante la fase de convalecencia, entre dos y cuatro semanas después de obtenerse la primera muestra.
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con pacientes afectados por la borreliosis de Lyme, con historiales de un pronto tratamiento bien caracterizado, no se apreciaron diferencias en el estado serológico a largo plazo entre los pacientes en los que se suponía que habían sido tratados adecuadamente de sus síntomas tempranos y los que no (Plorer, 1993). Otros autores han observado que la seroconversion no se ve afectada por la elección del antibiótico utilizado. La ausencia de seropositividad en estos casos puede reflejar diferencias en la respuesta inmunológica de ios pacientes individuales, puestas de relieve por la composición antigenica empleada en los ensayos serológicos comúnmente utilizados (Agüero-Ftosenfeid. 1993; Ledue. 1996). La liberación y detección de anticuerpos específicos frente a B. burgdorferi a partir de inmunocomplejos obtenidos del suero de pacientes con enfermedad de Lyme seronegativos demuestra que el secuestro de los anticuerpos específicos en algunos pacientes infectados puede contribuir a la ausencia de anticuerpos detectables frente a la bacteria (Schutzer, 1990). Finalmente, la ausencia de una respuesta humoral específica frente a S. burgdorferi en algunos pacientes con aparente enfermedad de Lyme puede deberse a un diagnóstico equivocado de otras enfermedades (algunas de las cuales también pueden ser transmitidas por las garrapatas) que tengan una forma de presentación similar (Persing. 1995.1992: Bakken. 1994). El diagnóstico serológico de la enfermedad de Lyme se ha complicado en los últimos años debido a la introducción de la vacuna para la misma. Las vacunas aprobadas en la actualidad, y las que se encuentran en lases avanzadas de desarrollo, se basan en la proteina A (OspA) de la membrana externa de B. burgdorferi obtenida mediante técnicas de ADN recombinante Tras la vacunación, el aumento en el titulo de anticuerpos frente a la OspA es responsable de la seropositívidad que se detecta mediante los métodos convencionales basados en la técnica de ELISA (Zhang, 1997), Aunque la interpretación de los resultados de la inmunotransferencia (WB) puede servir de ayuda para distinguir entre infección verdadera y una respuesta inmunológica inducida por la vacunación (Gauthier. 1999). la variabilidad de estos ensayos, asi como su coste, son argumentos en contra de su utilización como métodos de escrutinio o rastreo primarios (Zhang, 1997: Golightly, 1997). Esto significa que los inmunoensayos de primera instancia recomendados habitualmente para el rastreo de la enfermedad de Lyme deben de ser cambiados. Por ejemplo, pueden reemplazarse con pruebas basadas en cepas de Borrelia que carecen de la proteína OspA (Zhang, 1997) Alternativamente, se podrían desarrollar enzimoínmunoensayos con proteínas recombinantes con el fin de poder detectar las variaciones de las respuestas inmunológicas entre los individuos vacunados y los que han sufrido una infección natural.
Los critenos utilizados para interpretar los patrones de inmunorreactividad frente a IgM obtenidos mediante ¡nmunotransferencia (WB) son los propuestos por Engstrom y sus colaboradores. En este contexto, un resultado positivo de existencia de enfermedad de Lyme implica que al menos dos de las siguientes bandas polipeptídicas, reactivas frente a las IgM del huésped, han de ser delectadas: antígenos de 24 (OspC). 39 y 41 (flagelma) kilodaltons (kDa) (Engstrom, 1995). En el caso de los patrones de inmunorreactividad frente a IgG, los criterios empleados para la interpretación han sido propuestos por Dressler y sus colaboradores. En este caso, un transiendo es positivo cuando en el mismo se detectan cinco de las siguientes bandas correspondientes a antigenos de 18.21 (OspC), 28.30.39,41 (flagelma), 45.58.66 y 93 kDa (Dressler, 1993).
Cultivo de B. burgdorferi. La mejoras introducidas en los medios artificiales para el cultivo de B. burgdorferi ofrecen actualmente la posibilidad de detectar directamente a este microorganismo. Ahora puede recomendarse el cultivo en el medio Barber-Stoenner-Kelly (BSK) (Barbour. 1984) como método habitual para el aislamiento a partir de muestras de piel de pacientes con lesiones cutáneas compatibles con el eritema migrans, ya que rinde una tasa de aislamiento superior al 80% (Berger. 1992). Las lesiones cutáneas no tienen, a menudo, el aspecto característico denominado "ojo de toro", ya que pueden ser alipicas o encontrarse en las etapas iniciales de su evolución. Diversos estudios han mostrado que una mayoría significativa de pacientes en areas endémicas que presentan un eritema migrans definido dan positivo en los cultivos si la muestra es obtenida antes de que haya comenzado a administrarse el tratamiento con antibióticos (Berger, 1992). En la Clínica Mayo. B. burgdorlenna sido recuperada en muchas ocasiones mediante cultivo a partir de las lesiones del eritema migrans. asi como de un paciente estadounidense con acrodermatitis crónica atrofica (ACÁ), que muy proóablemente se encontraba infectado hacía más de diez años. Estas observaciones han sido confirmadas por otros autores (Asbrink. 1985). El hemocultivo o el cultivo a partir de LCR y líquido sinovial dan resultados positivos con menor frecuencia, aunque pueden ser ocasionalmente alternativas útiles (Schmidíi. 1988; Karlsson. 1990: Wormser. 1998; Benach. 1983).
La existencia de síntomas clínicos que sugieren una posible enfermedad de Lyme en pacientes en los que no existe una respuesta humoral detectable frente a B. burgdorferi (la denominada enfermedad de Lyme seronegativa) representa una situación problemática. En algunos pacientes seronegativos con síntomas crónicos es posible demostrar la presencia de una respuesta blastogénica especifica por células T frente a B. burgdorferi. y este trastorno ha sido atribuido a la erradicación incompleta de las espiroquetas por el tratamiento antibiótico (Dattwyler, 1989). Sin embargo, en un estudio prospectivo
Reacción en cadena de la polimerasa. Las nuevas tecnologías diagnosticas, como la PCR, tienen también utilidad para detectar directamente el ADN específico de B. burgdorferi en las muestras clínicas. Algunos estudios han puesto de maniliesto que la PCR es la técnica más sensible y especifica para la detección de B. burgdorferi en muestras de líquido sinovial de pacientes con artritis de Lyme (Nocton. 1994). En un estudio retrospectivo ciego con cerca de 150 pacientes aquejados de artritis, la PCR tuvo una sensibilidad del 96% y una especificidad del 100% en la detección de B. burgdorferi en pacientes no trata-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
dos (Nocton, 1994). La mayor parte de enfermos que recibieron tratamiento antibiótico con las pautas recomendadas dieron resultados negativos con la técnica de la PCR y sus síntomas desaparecieron, lo que sugiere que dicha técnica puede tener utilidad para monitorízar la eficacia de la terapia y predecir el resultado de la misma. El estudio de las muestras de LCR obtenidas de pacientes con síntomas neurológicos ha revelado que el comportamiento de la PCR en el diagnóstico de la enfermedad de Lyme puede variar; la sensibilidad ha oscilado entre valores que van casi desde el 0% hasta el 100%, dependiendo de la metodología y del paciente seleccionado (Schmidt. 1997). Sin embargo, puesto que el cultivo a partir del LCR casi siempre es negativo, un resultado positivo por PCR se considera, generalmente, un indicador bastante preciso de la existencia de una infección activa (Luft, 1992). Además, teniendo en cuenta que puede haber una relación inversa entre un resultado positivo mediante PCR y la producción intratecal de anticuerpos (Keller, 1992), una prueba de PCR negativa junto con la ausencia de esos anticuerpos puede ser de utilidad a la hora de excluir la posibilidad de enfermedad de Lyme a nivel del SNC en la mayoría de los casos. Otros estudios han demostrado que la PCR ofrece una sensibilidad superior a la que posee la técnica de aislamiento por cultivo a partir de muestras de piel obtenidas por biopsia (Schwartz, 1992; Brettschneider, 1998). Además, esta técnica ha sido empleada para poner de manifiesto la presencia de material genómico de 8. burgdorferi en la orina de algunos pacientes que presentaban lesiones en la piel (Schmidt, 1996,1995). La detección del ADN de Borrelia en muestras de sangre y plasma de pacientes con EM ha tenido menos éxito (Wallach, 1993; Guy. 1991; Goodman, 1995). Las pruebas moleculares pueden ser especialmente útiles para el diagnóstico de pacientes seronegativos y para supervisar la eficacia del tratamiento con antibióticos (Schmidt, 1997). Se ha llevado a cabo la detección cuantitativa en tiempo real de 8. burgdorferi en modelos animales, habiéndose establecido una correlación aparente entre la carga bacteriana y la sintomatología clínica (Pahl, 1999). La PCR también ha sido utilizada para detectar y tipificar las borrelias presentes en las garrapatas aisladas a partir de la piel humana (Liebisch, 1998). En consecuencia, el uso de las técnicas moleculares promete no sólo aumentar nuestro conocimiento sobre la biología y epidemiología de la borreliosis de Lyme, sino que parece ser simplemente una cuestión de tiempo que estas técnicas ocupen un lugar en el diagnóstico ordinario, en especial a partir de muestras de líquido sinovial de pacientes con artritis.
Tratamiento y prevención La valoración de los regímenes terapéuticos utilizados para el tratamiento de la enfermedad de Lyme ha dependido, en general, de los signos y síntomas clínicos, así como de la información emanada de las técnicas de diagnóstico serológico, tanto para la definición de un caso como para evaluar la respuesta a la terapia. La sensibilidad de los métodos serológicos ha mejorado con el tiempo, aunque éstos continúan teniendo una baja especificidad. Confiar en los mismos para el diagnóstico puede implicar la instauración de un tratamiento innecesario. Además, las técnicas serológicas no proporcionan un indicador fiable de la respuesta a la terapia, ya que una reducción significativa en el titulo de anticuerpos puede preceder por muchos meses a la eliminación de los microorganismos. Como se ha indicado en los párrafos anteriores, los métodos de detección directa como la PCR pueden resultar útiles para determinar el resultado dei tratamiento en enfermos con artritis y, posiblemente, en pacientes neurológicos con la enfermedad de Lyme. En general, el empleo de estos métodos puede reforzar los estudios sobre la terapia de la enfermedad, al permitir la identificación de la bacteria en aquellos sujetos que tienen infección activa, y proporcionar una indicación del final de la terapia por su capacidad para valorar la erradicación de los microorganismos. Las terapias recomendadas para el tratamiento de la enfermedad de Lyme incluyen la administración de doxiciclina o amoxicilina por vía oral, en los casos tempranos y sin complicaciones, y ceftriasona intravenosa para las infecciones más consolidadas con afectación sistémica. Otras terapias que también han sido utilizadas son la eritromicina por vía oral (en el caso de mujeres embarazadas): formulaciones de acitromicina y cefalosponna oral para la enfermedad temprana; y penicilina intravenosa, particularmente para la neuroborreliosis. La evaluación inicial de la eficiencia del tratamiento con ceftriasona, utilizando modelos animales de la enfermedad de Lyme, ha puesto de manifiesto la desaparición de 8. burgdorferi. tanto por cultivo como por PCR, de casi todos los
tejidos en una o dos semanas de tratamiento (Malawista, 1994). Ensayos más recientes con seres humanos han corroborado estos resultados, evidenciando una respuesta clínica efectiva en la gran mayoría de pacientes afectados tanto de la enfermedad de Lyme en fase temprana como de neuroborreliosis. Aun cuando la mayor parte de pacientes con artritis de Lyme muestran mejoría con el tratamiento antimicrobiano (Steere, 1995,1994), en algunos de ellos los síntomas persisten. El aparente fracaso del tratamiento en estos casos se piensa que es debido a varios factores. Por ejemplo, las espiroquetas pueden resistir la terapia debido a una pobre distribución del antimicrobiano en el líquido sinovial. Otros pueden deberse a mecanismos de autoinmunidad, sobre los que muchos autores opinan que pueden tener un papel en el origen de la artritis de Lyme, particularmente de aquellos casos crónicos resistentes al tratamiento (Hu, 1997). Otra área de investigación se centra en la frecuencia de cotransmisión de otras infecciones de tipo zoonótico junto con 8. burgdorferi en zonas endémicas. Como se indicó anteriormente, el piroplasma Babesia microti y el agente de la ehrlichiosis granulocítica humana son transmitidos al ser humano por la misma garrapata (/. dammini) que actúa como vector en el caso la enlermedad de Lyme causada por 8. burgdorferi. Aproximadamente entre un 10% y un 15% de pacientes con enfermedad de Lyme de algunas del noreste de EE.UU. muestran evidencias serológicas de haber estado expuestos a 8. microti. Los estudios preliminares de seroprevalencia en pacientes de la parte superior del medio oeste sugieren una exposición frecuente, tanto a las especies de Babesia como de Ehriichia. entre aquellos que han mostrado seropositividad frente a 8. burgdorferi (Telford, 1996; Pancholi. 1995; Krause. 1996: Schwartz, 1997). Los estudios en pacientes que manifiestan una fatiga persistente tras ser sometidos a un tratamiento adecuado para la enfermedad de Lyme muestran que algunos de ellos están de hecho coinfectados con 8. microti (Krause, 1996). El tratamiento de la enfermedad de Lyme no tiene efecto sobre la infección subyacente por 8. mlcrotr. por tanto, síntomas como fatiga, mialgias, artralgias y similares que continúan manifestándose bastante tiempo después de un tratamiento contra la enfermedad de Lyme pueden ser debidos a otras causas, que deberían ser tenidas en cuenta en la evaluación clínica de los pacientes con tales síntomas. La infección por 8. microti se diagnostica preferentemente por métodos serológicos y por PCR, puesto que los frotis realizados a partir de sangre suelen dar resultado negativo en los pacientes que tienen el bazo normal. El riesgo de exposición a estas zoonosis puede reducirse evitando el contacto con garrapatas, lo que se consigue utilizando camisas de manga larga y pantalones largos, aplicando repelentes para insectos y controlando a las garrapatas a continuación de una posible mordedura o exposición. Las garrapatas adheridas deben ser inmediatamente retiradas y la zona de la mordedura ha de desinfectarse a fondo (Fish, 1995). Los estudios iniciales no han apoyado el empleo profiláctico de antibióticos para la prevención de la enfermedad de Lyme tras la mordedura de una garrapata (Shapiro, 1992; Warshafsky, 1996). La posibilidad de contraer la enfermedad de Lyme depende de la tasa de infección en las garrapatas (Shapiro, 1992) y del tiempo durante el cual el insecto está adherido a la piel (Piesman. 1987). Además, parece que el riesgo de reacciones adversas frente a los antimicrobianos puede pesar más que los beneficios potenciales, debido a que es muy bajo el número de casos de enfermedad de Lyme que pueden prevenirse de esta forma. Es concebible que el examen de las garrapatas pueda ser de utilidad algún día para predecir el riesgo de infección por 8. burgdorferi y otros agentes causantes de zoonosis. lo que permitiría, en consecuencia, un tratamiento profiláctico más selectivo. Recientemente se ha me|orado el potencial de prevención de la enlermedad de Lyme con el lanzamiento de la primera vacuna aprobada por la FDA para su empleo en seres humanos (CDC. 1999). Es una vacuna subunitaria, constituida por la proteína OspAde 8. burgdorferi, obtenida por técnicas de recombinación. La investigación sobre vacunas para el hombre se ha centrado en esta y otras proteínas de la superficie extema, tales como OspB y OspC. El calendario para la vacuna actual contempla la administración de tres dosis, que tiene una eficacia de entre el 60% y el 90% (Steere, 1998: Sigal. 1998). La duración de la protección que confiere la vacuna aún no ha sido establecida, y tampoco se conoce mucho sobre su seguridad o eficacia en niños menores de 15 años. La vacuna es. generalmente, bien tolerada; aunque se han observado reacciones locales y sistémicas suaves, no existe evidencia de que pueda provocar efectos a largo plazo, tales como afectación neurológica o musculoesquelética.
CAPÍTULO 52
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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
Esta vacuna está actualmente recomendada para aquellas personas que estén expuestas con frecuencia o durante mucho tiempo a las garrapatas en zonas donde la enfermedad de Lyme tiene carácter endémico (Hayes. 1998). Como se mencionó antes, el empleo extendido de la vacuna puede tener un efecto drástico sobre la utilidad de los métodos disponibles en la actualidad para el diagnóstico serológico de la enfermedad de Lyme.
Fiebre recurrente La fiebre recurrente es una enfermedad con distnbución mundial en zonas de climas cálidos y templados, con la excepción de unas pocas zonas en el sudoeste asiático, como Nueva Zelanda y Australia (Burgdorfer, 1986). La enfermedad, causada por Borrelia recurrenlis, se transmite por el piojo del hombre. Pediculus humanus. La enfermedad afecta predominantemente a las personas que viven en condiciones higiénicas deficientes que provocan un aumento en el número de piojos y favorecen la diseminación de los mismos. La enfermedad ya no existe en EE.UU., pero sigue siendo endémica en los altiplanos del centro y este de África y en el sur de la Cordillera de los Andes. La fiebre recurrente transmitida por garrapatas, una enfermedad con distribución mundial pero que se detecta muy esporádicamente, se transmite a los seres humanos que penetran en el habitat de las garrapatas del género Ornithodoros. representado por ambientes cálidos y húmedos como cuevas, madera en descomposición, madrigueras de roedores y refugios de animales que se encuentren en altitudes comprendidas entre 500 y 2.000 metros, aproximadamente. En EE.UU., las especies 8. hermsii. B. luricataey B. parkeri son los patógenos más comunes. Las garrapatas se infectan al alimentarse de los roedores con borreliosis o de otros animales de pequeño tamaño que actúan como reservorio natural de las espiroquetas. Los seres humanos contraen la infección a través de la mordedura de la garrapata o por contaminación de abrasiones de la piel con la hemolinfa de los piojos aplastados (Dworkin, 1998). Tras entrar en la corriente sanguínea, los microorganismos se multiplican, causando los síntomas y signos clínicos de la fiebre recurrente Las bacterias quedan acantonadas en órganos internos durante los periodos no febriles, en los que las espiroquetas circulantes son destruidas por los fagocitos en presencia de anticuerpos específicos. Las recaídas se producen cuando las bacterias acantonadas en los órganos y que han experimentado cambios en su composición antigénica superficial son liberadas de nuevo al tonente circulatorio (Barbour, 1990). Las manifestaciones clínicas de la fiebre recurrente transmitida por los piólos o por las garrapatas son semejantes, aunque en el primer caso la enfermedad es generalmente más grave (Dworkin, 1998; Bryceson, 1970; Horton, 1985; Rahlenbeck, 1995; Southern, 1969). La enfermedad primaria comienza, característicamente, tras un período de incubación de 4 a 18 días con fiebre, rigidez, dolor de cabeza, mialgias. artralgias, letargo, fotofobia, tos y dolor abdominal. Puede desarrollarse una hepatoesplenomegalia con ictericia, especialmente en el caso de la enfermedad transmitida por piojos, pudiendo existir afectación neurológica hasta en un 30% de los afectados en este supuesto, valor que desciende hasta el 10% en los casos causados por la mordedura de garrapatas. También se ha apreciado afectación respiratoria o cardíaca, linfadenopatía. daños oculares y otitis media. Durante la infección temprana puede producirse shock por hipotensión que puede ser mortal. Al final de la fase febril primaria de la enfermedad aparece con mucha frecuencia una erupción papular, macular o petequial en el tronco que dura uno o dos días. La fase primaria termina de forma brusca al cabo de unos tres a seis días. Por lo general las muertes se deben a arritmias cardíacas, hemorragias cerebrales y fracaso hepático. Normalmente, el individuo sobrevive y los síntomas reaparecen súbitamente entre 7 y 10 días después. En el caso de la enfermedad transmitida por las garrapatas son características las recaídas múltiples, cuya duración y sintomatología van disminuyendo a medida que se suceden las mismas. En la enfermedad transmitida por piojos sólo se dan una o dos recidivas. El diagnóstico de la fiebre recurrente se lleva a cabo demoslrando la presencia de las espiroquetas en sangre periférica mediante microscopía de campo oscuro. Alternativamente, se pueden realizar extensiones gruesas o finas que se tiñen por los métodos de Giemsa o de Wright y se observan con microscopia de campo claro, o mediante microscopía de fluorescencia después de teñir con naranja de acridína Estos métodos tienen una sensibilidad del 70%
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(Southern, 1969). Las técnicas serológicas están poco disponibles y tienen un valor diagnóstico limitado debido a la variación antigénica que experimentan estos microorganismos, así como a la reactividad cruzada con muchas otras especies bacterianas, incluyendo 8. burgdorferi(Dworkin, 1998). Los antibióticos de elección para el tratamiento de la fiebre recurrente son la tetraciclma o la eritromicma. El tratamiento se complica a menudo por la aparición de una reacción de Jarisch-Herxheimer, caracterizada por una sene de síntomas como fiebre, escalofríos, leucopenia e hipotensión. No existe vacuna contra la fiebre recurrente. La prevención se lleva a cabo evitando el contacto con los artrópodos vectores y que los roedores aniden en los albergues humanos, sobre todo en las áreas donde la fiebre recurrente transmitida por garrapatas es endémica. Se deben utilizar insecticidas en las casas y aplicar repelentes para insectos a la ropa de vestir. La mejor lorma de prevenir la enfermedad transmitida por piojos es mantener una higiene personal adecuada y, cuando sea necesario, aplicar técnicas para despiojar.
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SECCIÓN VI
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CAPÍTULO 52
•
INFECCIONES POR ESPIROQUETAS
1143
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C A P Í T U L O
53
Micobacterias • Gail L. Woods, M.D. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX
1144
Mycobacterium genavense Mycobacterium ulceraos
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis
MYCOBACTERIUM LEPRAE
1148
PRUEBAS CUTÁNEAS
1149
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
1149
Mycobacterium africanum MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS Mycobacterium
1146
avium-Mycobacterium
Muestras
intracellulare complex
Tinciones microbiológicas
Mycobacterium scrofulaceum
Métodos de cultivo
Mycobacterium kansasii
Test para la identificación de micobacterias
Mycobacterium fortuitum-Mycobacterium chelonae-abscessus complex
Test de sensibilidad
Mycobacterium xenopi
TRATAMIENTO
1154
PREVENCIÓN
1155
Mycobacterium szulgai Mycobacterium malmoense
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium simiae
Mycobacterium avium complex
Mycobacterium marinum
BIBLIOGRAFÍA
Mycobacterium haemophilum
Las micobacterias son bacilos aerobios, inmóviles, ácido alcohol resistentes, rectos o ligeramente curvos. Los organismos contienen en sus paredes ácidos micólicos de alto peso molecular (con 60 a 80 carbonos) que durante la pirólisis liberan cadenas rectas de ácidos saturados C- a C^ de cadena larga. La proporción de guanina-citosina en su ADN es de 62 mol a 70 mol%. Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum son los patógenos humanos que componen el término Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Estos organismos, 'bacilos de la tuberculosis", son los agentes etiológicos de la tuberculosis humana. Otras micobacterias diferentes de la MTBC son las denominadas "atipicas". porque difieren de los bacilos de la tuberculosis. Los términos "micobacterias no tuberculosas" y otras micobacterias diferentes del bacilo de la tuberculosis" son preferidos porque estos organismos no son atipicos. sino que simplemente tienen características diferentes de Mycobacterium tuberculosis. :
En 1957, Runyon propuso que las micobacterias no tuberculosas fueran divididas en cuatro grupos según la pigmentación de las colonias y la velocidad de crecimiento en un medio sólido (Tabla 53-1) (Runyon, 1959). Este sistema de clasificación tiene, no obstante, limitaciones Por ejemplo, Mycobacterium kansasii es un fotocromógeno. pero en alguna ocasión es no lotocromógeno o escotocromógeno. Mientras que miembros de Mycobacterium avium intraceIlutare complex (MAC) son no fotocromógenos en el esquema de Runyon, pero algunos aisladamente producen colonias débilmente pigmentadas, pudiendo causar errónea clasificación como escotocromógena. Mycobacterium szulgai es escotocromógena a 37 C y fotocromógena a 25 C. Más aún, cuando se usa un medio liquido para cultivo de micobacterias como está recomendado (véase más adelante), la tasa de crecimiento como factor de la clasificación usado por Runyon no es válida. Aquí se usa una clasificación de utHidad clínica de las
1155
micobacterias no tuberculosas basada en su patogenicidad en humanos ipotencialmente patógenos y raramente patógenos) (Woods, 1993). Mycobacterium leprae, que es única entre las micobacterias por su cualidad de no haber sido aún cultivada in vitro, se comenta separadamente.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Mycobacteríum
tuberculosis
Hoy día la tuberculosis es un problema global. Se estima que en todo el mundo existen entre 8 y 10 millones de nuevos casos de tuberculosis al año y de 2 a 3 millones de muertes son a causa de esta enfermedad cada año. En gran parte del mundo, la tuberculosis es el origen infeccioso más frecuente de muerte, siendo directamente responsable de aproximadamente el 7% de todas las muertes y del 26% de todas las muertes prevenibles en todo el mundo (Murray. 1990; Snider. 1994). En EE.UU.. la tuberculosis estaba a la cabeza de la causa de muerte al comienzo del siglo XX. La mortalidad decreció micialmente por el esfuerzo de la sanidad pública de alojar a los pacientes con tuberculosis en sanatorios para mejorar las nutrición y ventilación, y posteriormente gracias a los fármacos antituberculosos. Entre 1953 (cuando la tuberculosis empezó a registrarse en una base nacional) y 1984 la incidencia fue cayendo regularmente en torno a un 5%-6% cada año (Rieder. 1989). La proporción de descenso se frenó drásticamente entre 1984 y 1985, y después esta tendencia se invirtió. Desde 1985 a 1992 el número de casos de tuberculosis referidos a los centros para la prevención y control de enfermedades (CDC) incrementó en aproximadamente un 20%. es decir, se refirieron cerca de 51.000 casos más de
CAPÍTULO 53
Tabla 53-1
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MlCOBACTERIAS
Clasificación d e R u n y o n d e las micobacterias no t u b e r c u l o s a s
Clasificación Folocromógena
Escotocromógena No folocromógena De rápido crecimiento
D e s c r i p c i ó n de colonias No pigmentadas a menos que sean expuestas a la luz (óptimamente durante su crecimiento temprano y con buena ventilación de la superficie) Pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y a la luz No pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y a la luz Crecimiento en medio sólido en siete días o menos j
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sión de lisosomas con fagosomas que contienen bacilos dentro del macrófago, favoreciendo posiblemente la supervivencia del organismo dentro de la célula. La respuesta usual del huésped a la infección por M. tuberculosis es la activación de la inmunidad celular. Durante la infección primaria (inicial) los bacilos inhalados viajan a los espacios alveolares, donde son ingeridos por los macrófagos locales. Dichos macrófagos son incapaces de matar a las micobacterias, que se multiplican dentro de la célula durante los siguientes días tras la infección. Los macrófagos infectados con las micobacterias emigran a los ganglios linfáticos regionales y presentan los antigenos sensibilizantes a las células inmunocompetent.es. o bien pasan a la linfa o al torrente sanguíneo regresando a los pulmones (principalmente a las zonas apicales) y órganos a distancia, como son los ganglios linfáticos, los ríñones, la epífisis de los huesos largos, los cuerpos vertebrales y las meninges, donde los bacilos continúan multiplicándose hasta que se adquiere la respuesta inmune celular.
los esperables (CDC. 1993). En las áreas metropolitanas, el mayor incremento se dio en la ciudad de Nueva York. Los factores contribuyentes a este excesivo número de casos incluyen la extensión epidémica del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un deterioro en una infraestructura de los cuidados de salud y un incremento en el número de casos de personas sin hogar, trabajadores emigrantes, inmigrantes y pacientes que requerían cuidados crónicos, como en los centros disciplinarios y sanatorios (Ellner. 1993). Desde 1992, la incidencia de la tuberculosis declinó cada año (CDC. 1998). Además del resurgimiento de la tuberculosis en los EE.UU., otro acontecimiento reciente es la aparición de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB), definida como la enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis que es resistente a 2 o más antimicobacterianos de primera linea utilizados en los EE.UU. para tratar tuberculosis (véase más adelante, en Tratamiento). Desde 1988, el CDC investigo 7 epidemias de MDR-TB que afectaron a cerca 200 personas (predominantemente personas infectadas por el VIH) en hospitales y centros penitenciarios en Nueva York y Florida (Jacob. 1994). Sólo cuatro de estas epidemias fueron notificadas desde 1976 a 1987 y las personas afectadas eran personas sin infección por VIH. La mortalidad en las recientes epidemias tue alta (del 72% al 89%), con rápida evolución desde el diagnóstico hasta la muerte (con una media de 1 a 4 meses).
Las células T inmunocompetentes migran desde los ganglios linfáticos locales al punto de infección en el pulmón. Alli liberan atocinas quimiotáctícas. inhibidores de la migración y atocinas mitogenéticas que estimulan el reclutamiento de monocitos y linfocitos sanguíneos, la división ce macrófagos y de los linfocitos y la activación de los macrófagos. Los macrófagos archivados tienen una marcada actividad microbicida, produciendo atocinas como la mterleucina-1 (IL-1), el interferón-y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral (TNF) que estimulan o regulan otros componentes del sistema inmune, propiedades que ayudan en el control de la infección. Las citocinas y enzimas líticas liberadas por los macrófagos también contribuyen a la destrucción tisular local concomitante. Con el paso del tiempo, la población de células T activada va declinando y es reemplazada por células T de memoria que protegen contra las reinfección por M. tuberculosis y dan cierta protección cruzada contra infección por otras micobacterias. A pesar de frenar nuevas multiplicaciones de micobacterias en el foco primario y en los metastásicos gracias a la actividad de los macrófagos y de los linfocitos T de memoria, un foco de infección permanece en el pulmón indefinidamente (más frecuente en los vértices donde la presión de oxígeno es alta) y menos frecuente en los focos a distancia. Por tanto, la capacidad de reactivación de la enfermedad de ese foco latente existe durante períodos de mmunosupresión.
También se produjo la transmisión de MDR-TB a trabajadores de salud o guardias de las cárceles y al menos 9 desarrollaron enfermedad activa y 5 murieron. M. fuberculosis se transmite principalmente por vía respiratoria al inhalar residuos secos en pequeñas gotitas infectadas (de 1 pm a 10 um de diámetro), pero también por inoculación directa a través de la piel lesionada, lo que es más posible que se produzca cuando los patólogos u otros trabajadores del laboratorio manejen muestras infectadas. El foco de infección más importante son las personas con tuberculosis pulmonar cavilada sin diagnosticar (con esputo positivo). Las dosis mínimas infectivas en humanos permanecen desconocidas, pero existen datos que sugieren que la infección puede producirse tras inhalar tan sólo unos pocos organismos viables (Haas. 1994). El riesgo de padecer enfermedad pulmonar activa es bajo tras una exposición aislada, pero el riesgo aumenta bajo situaciones de estrés o en ambiente de conlinamiento, donde puede darse una repetida exposición al organismo. La mayoría de las personas que se inlectan con M. tuberculosis no llega a desarrollar la enfermedad activa. El riesgo de desarrollarla en personas inmunocompetentes es del 5% al 10%. Para personas infectadas por VIH, este riesgo asciende a 7%-10% al año.
El foco primario de infección pulmonar, llamado lesión de Gohn. suele ser subpleural en la pade inferior de los lóbulos superiores o en la parte superior de los lóbulos inferiores, correspondiendo a áreas de pulmón que reciben la mayor parte del flujo del aire inspirado. Las lesiones (tubérculos) son bien delimitadas, siendo áreas de consolidación blanco-grisáceo, de 1 cm a 2 cm de diámetro con centro necrótico. Una apariencia similar a los tubérculos lueron típicamente encontrados en los nodulos linfáticos regionales, los cuales, junto con la lesión pulmonar primaria, se denominan complejo de Gohn. Microscópicamente los tubérculos están formados por granulomas caseosos y no caseosos bien de limitados: los organismos pueden ser vistos en cortes teñidos con tinción ácido resistente. Con el tiempo esas lesiones son reemplazadas por fibrosis hialina y ocasionalmente se calcifican. Las lesiones de la tuberculosis miliar son pequeñas áreas de consolidación (de 1 mm a varios milimetros de diámetro) de color blanco amarillentas sin caseum que recuerdan a los tubérculos. La capacidad de formar un granuloma está en función de la inmunocompetencia de los huéspedes. Las personas infectadas con VIH, por ejemplo, pueden tener gran necrosis sin formar granulomas con algunos neutrofilos. microabscesos y numerosos bacilos ácido resistentes (BAAR).
Las estructuras especificas, antígenos y mecanismos responsables de la virulencia de M. tuberculosis son aún desconocidos, pero el factor cordal y las sulfatidas han sido asociadas con la capacidad de las cepas virulentas de producir la enfermedad. In vitro. el factor cordal es el responsable del aspecto morfológico con el que M. tuberculosis aparece en la célula, como un manojo de cuerdas serpenteantes puestas en paralelo. Este patrón de crecimiento se correlaciona con la presencia de trihalosa 6,6 -dimicolato en el bacilo. Cuando este glucolipido se inyecta en ratones, inhibe la migración de neutrofilos y favorece la formación de granulomas y estimula la protección contra infecciones virales. Su papel específico en la patogenia de la tuberculosis humana permanece, no obstante, desconocido. Las sulfatidas son unos glucolípidos situados periféricamente que inhiben la fu-
En EE.UU., la tuberculosis activa afecta al pulmón en el 85% de los casos. Las manifestaciones clínicas pueden variar. La presentación clínica puede ser insidiosa, con unos síntomas constitucionales progresivos de meses de evolución, cuadro catarral con tos productiva frecuentemente atribuible a un mal resfriado o bronquitis persistente, neumonía o cuadro seudogripal. liebre alta, dolores y tos. También puede aparecer esputo hemoptoico y dolor pleurítico. También puede localizarse extrapulmonarmente, pero lo más común es que afecte a múltiples órganos con o sin infección pulmonar concomitante. La tuberculosis multiorgánica, antiguamente una enfermedad de niños y jóvenes, predomina actualmente entre los más ancianos e individuos inmunocomprometidos, especialmente aquellos infectados con VIH y M. tuberculosis (Chaisson, 1987; Kim. 1990).
SECCIÓN VI
1146 Mycobacterium
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
bovis
Mycobacterium
Mycobacterium bovis puede ser transmilido a los humanos desde el ganado vacuno, bebiendo leche cruda contaminada o por exposición respiratoria al ganado infectado o a sus cadáveres. También puede ser transmitido de persona a persona por via respiratoria, de humanos a ganado por exposición a la orina de personas con infección del tracto urinario y de ganado a ganado probablemente por secreciones bronquiales. M. bovis también puede transmitirse a ganado desde los animales salvajes, por ejemplo, el tejón en Suiza y Gran Bretaña (Grange. 1987). Entre 1900 y 1930. M. bovis lúe el responsable del 6% al 30% de los casos de tuberculosis en EE.UU. y en el Reino Unido (Grange, 1987: Karlson, 1970), La tasa de tuberculosis humana causada por M. bovis descendió debido a la pasteurización de la leche y a los programas de inspección de ganado. Desde 1950, M. bovis ha producido menos del 1 % de los casos de tuberculosis humana en Norteamérica. La mayoría de las infecciones son extrapulmonares. afectando a los ganglios linfáticos cervicales y mesenléricos, el intestino, los huesos y los riñones. Infrecuentemente, la infección fue consecuencia de la instilación intravesical del bacilo de Calmette-Guénn (BCG) para tratamiento del carcinoma superficial de vejiga (Kristjansson. 1993)
intracellular
avium-Mycobacterium complex
Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellular tienen similares ca-
racterísticas de crecimiento y de comportamiento bioquímico que frecuentemente hacen difícil su diferenciación en el laboratorio de microbiología, por lo que el aislamiento de ambas especies se informa como MAC. El MAC contiene 28 serotipos. identificados por seroaglutinación según los antígenos localizados en la superficie celular o bien por cromatografía. Antes de la epidemia del síndrome de mmunodeficiencia adquirida humana (sida), el MAC era la segunda micobactena más frecuentemente aislada en EE.UU. tras M. tuberculosis. Entonces, el porcentaje de MAC aislado incrementó, igualando e incluso sobrepasando el número de M. tuberculosis aislados en muchas partes del pais. Los bacilos MAC están presentes en cualquier sitio del ambiente. Se han aislado en el agua, el suelo, el alimento, el polvo doméstico y en múltiples animales, pero la fuente ambiental especifica responsable de la infección al ser humano permanece aún desconocida (Inderlied. 1993). La puerta de entrada más probable es el tracto de gastrointestinal, pero la transmisión por vía respiratoria también es posible. Desde las zonas de colonización, los organismos pasan a la sangre e infectan muchos órganos, especialmente aquellos del sistema mielomonocítico. Mycobacterium africanum Durante muchos años la enfermedad pulmonar causada por MAC se dab a con mayor frecuencia en ancianos de raza blanca que padecían enferMycobacterium africanum. el bacilo del tubérculo "africano", fue el que primedades pulmonares crónicas o en gastrectomizados. pero en los pasados mero se aisló en personas del oeste de África (Castets, 1968). Aunque ha sido 10-15 años ha legado a ser común en personas sin tactores predisponenaislado principalmente en individuos de África, la prevalencia de la infección tes, especialmente mujeres ancianas (Prince, 1989; Dhillon. 2000). La enfercon M. africanum a lo largo del planeta es difícil de determinar, porque puede medad diseminada por MAC se da de un modo casi exclusivo en mmunosuno ser correctamente identificado en muchos laboratorios. Los mecanismos primidos. especialmente en personas con sida avanzado. En EE.UU.. el de transmisión y las manifestaciones clínicas de la enfermedad producida por MAC fue la causa más común de infección bacteriana sistémica en pacienM. africanum son las mismas que las producidas por M. tuberculosis. tes con sida a finales de los años 80 y en los inicios de los 90 (Horsburg, 1991). La incidencia de tales casos, sin embargo, descendió desde la existenci a de la terapia antirretroviral (CDC.1999). El principal factor de riesgo MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS para la enfermedad diseminada MAC en pacientes con sida es el grado de inmunosupresión, indicado por el recuento de linfocitos CD4+; tanto es así, En general poco se sabe acerca de los antígenos responsables de la viruque la enfermedad es infrecuente en individuos con linfocitos CD4* por encilencia de las micobacterias no tuberculosas: sin embargo, tales antígenos ma de 50. son. presumiblemente, los responsables de la persistencia de los organisEn EE.UU.. los serotipos 4 y 8 de M. avium son los más frecuentemente mos dentro del sistema mielomonocítico del huésped. La respuesta inmune aislados en la sangre de personas con sida. Los serotipos de M. intracellulaa la infección con estas micobacterias es también torpemente entendida. Los re son un pequeño porcentaje de los MAC aislados en personas con sida y se patógenos potenciales se revisan en las siguientes secciones. Las micobacaislan preferentemente en los esputos y con menos frecuencia en la sangre, terias raramente patogénicas y las infecciones con las que han sido asociadas se recogen en la Tabla 53-2 (Weinberger, 1992; Weitzman, 1981; Neely, 1989; lo que sugiere que raramente producen enfermedad diseminada en estos individuos (Yacrus, 1990; Guthertz, 1989). DeChairo. 1973; Edwards, 1978; Cianciulli. 1974; Blacklock, 1983: Tsukamura, 1975,1983: Casimir. 1982; Wallace. 1988: Smilh, 2000; Davison, 1988; Las manifestaciones de la enfermedad producida por MAC dependen del Butler. 1994: Chiodini. 1989). sitio y la extensión de la infección. La infección pulmonar puede ser asinlo-
Tabla 53-2
Micobacterias raramente p a t o g é n i c a s e infecciones a s o c i a d a s
Mycobacterium spp. M. gordonae
M M M M M M M M M M
thermoresistible terrae-triviale complex asiaticiim nonchromogenicum tlavescens shimoidei smegmalis neoaurum chelatum paratuberculosis
Infecciones asociadas
Comentarios
Meningitis en pacientes con shunt, e n f e r m e d a d h e p a t o r e n a l , peritonitis, endocarditis sobre válvula protésica, infección cutánea, enfermedad diseminada, enfermedad pulmonar (?) Infección pulmonar, infección cutánea Artritis séptica, osteomielitis, enfermedad diseminada ( ) Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Bacteriemia en inmunosuprimidos con catéter intravascular Enfermedad diseminada en pacientes con sida Enfermedad de Crohn (?)
Aislada en el suelo y en el agua ( b a c i l o del grifo") y contaminante habitual del laboratorio
Sióa síndrome de inmunodeficiencia adquirida; MAC: Mycobacterium avium complex.
9
Aislada de suelo M. terrae = bacilo del rábano
Enfermedad similar a la del MAC diseminado
CAPÍTULO 53
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mática o imitar a la tuberculosis. La enfermedad diseminada en personas sin sida se manifiesta con liebre, pérdida de peso, dolor de huesos, adenopatías. hepatoesplenomegalia y lesiones cutáneas. En aquellos con sida es más común la fiebre persistente, perdida de peso y diarreas. También se puede dar anorexia, debilidad, adenopatías o esplenomegalia (Inderlied, 1993). Los hallazgos del laboratorio son anemia y elevación de la loslatasa alcalina. Las adenopatias cervicales causadas por MAC suelen afectar a los niños, aunque también pueden darse en adultos. Otras manifestaciones de la infección por MAC son sinovitis, enfermedad del tracto genitourinario, lesiones cutáneas, infección de los tejidos profundos de la mano, osteomielitis, meningitis, ulceración del colon y peritonitis (Inderlied, 1993; Wolinsky. 1979; Woods, 1987). Los hallazgos histológico de las lesiones por MAC son variados. Granulomas caseosos con bacilos ácido resistentes indistinguibles de la tuberculosis, fibrosis pulmonar con neumonía organizada, vasculitis granulomatosa necrotizante similar a la granulomatosis de Wegener y especialmente en personas con sida, pueden verse agregados de macrófagos espumosos que contienen bacilos ácido resistentes en su interior.
Mycobacterium
scrofulaceum
Mycobacterium scrofulaceum fue el primer causante conocido de adenopatías cervicales en niños (Prissick, 1956). Desde el punto de vista antigénico es similar al MAC. y debido a su ocasional identificación como MAC mediante test bioquímicos, y viceversa. M. scrofulaceum se clasifica junto con el MAC como Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum complex. M. scrofulaceum se ha aislado en la leche cruda y en otros productos de consumo habitual, como ostras y agua. Se ha hallado también en el suelo. Habitualmente produce adenopatias cervicales en niños de 1 a 5 años, penetrando presumiblemente en el cuerpo a través de pequeñas heridas cutáneas o a través de la mucosa de la cavidad oral. La enfermedad suele ser unilateral, afectando a ganglios linfáticos altos del cuello o del ángulo de la mandíbula. Los niños infectados generalmente están con buen estado general, sin fiebre, y tienen mínimos dolores o molestias. Con la progresión, estos nodulos se reblandecen y se abren, pudiendo posteriormente cicatrizarse, librosarse y calcificarse. Las manifestaciones extraganglionares de la infección por M. scrofulaceum incluyen afectación pulmonar, enfermedad diseminada y. más raramente, conjuntivitis, osteomielitis, meningitis y hepatitis granulomatosa. Las lesiones por M. scrofulaceum son histológicamente indistinguibles de las producidas por M. tuberculosis.
MICOBACTERIAS
Mycobacterium
kansasii
Mycobacterium kansasii. inicialmenle descrito como el "bacilo amarillo", representaba el 3% de las micobacterias aisladas en EE.UU. en 1979 y 1980; las mayores cifras fueron descritas en Calilornia, Texas, Louisiana, Illinois y Florida (Buhler, 1953; Goods. 1982). El reservorio natural de M. kansasii es desconocido, pero se ha aislado partir de muestras de agua. La enfermedad pulmonar es más frecuente en varones entre 50 y 60 años que habitan en zonas urbanas y entre ciertos grupos laborales (mineros, soldadores, marineros y pintores) y entre individuos con neumoconiosis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La enfermedad diseminada suele afectar a personas con la alteración de la inmunidad celular. Las manifestaciones más frecuentes de la enfermedad producida por M. kansasii son lesiones crónicas pulmonares cavitadas que suelen afectar a los lóbulos superiores. Las manifestaciones extrapulmonares incluyen adenopatías cervicales en niños, enfermedades cutáneas, afectación músculo esquelética (síndrome del túnel del carpo, sinovitis, artritis, lendinitis, fascitis u osteomielitis), enfermedad diseminada, enfermedad aislada del tracto genitourinario y peritonitis. Los hallazgos histológicos de las lesiones producidas por M. kansasii son variables e incluyen granulomas caseosos y no caseosos y lesiones cutáneas, necrosis o locos de inflamación aguda y crónica sin formación de granulomas. Los bacilos ácido resistentes son frecuentes en los pulmones y en los ganglios linfáticos, pero menos en el resto de tejidos.
fortuitum-Mycobacterium
chelonae-abscesus
complex
Los miembros del grupo Mycobacterium fortuitum han sido aislados en el suelo, agua y polvo, y los de Mycobacterium chelonae-abscesus en el suelo, agua y aguas residuales. La mayoría de las personas infectadas con estos organismos han sufrido un daño penetrante (traumatismo o cirugía) con posible contaminación por tierra o agua. El comienzo de la infección con M. chelonae se ha asociado con la administración de la vacuna de la difteria-pertusis-tétanos-polio, inyecciones de histamina. administración de lidocaina con un inyector a presión, en hemodializadores contaminados y en el reemplazo de válvulas porcinas contaminadas (Wallace, 1983). La lesión cutánea principal causada por M. tortuitum o por M. chelonaeabscesus se manifiesta por celulitis local, abscesos o nodulos mínimamente dolorosos. Típicamente las lesiones se desarrollan entre tres semanas y doce meses (con mayor frecuencia entre 4 y 6 semanas) tras el daño penetrante en personas con el sistema inmune intacto. La osteomielitis es una complicación ocasional, especialmente tras heridas punzantes en los pies. Las infecciones posquirúrgicas se han caracterizado por heridas que no cicatrizaban o por dehiscencia de heridas cicatrizadas con drenaje seroso y con minimos síntomas sistémicos. Generalmente se desarrolla entre tres semanas y tres meses tras la intervención, especialmente tras esternotomia media, cirugía de aumento mamario o tras la inserción de catéteres percutáneos. La enfermedad diseminada que suele producirse en inmunodeprimidos (especialmente secundaria a terapia con corticoides) se manifiesta con abscesos cutáneos recurrentes y de los tejidos blandos. La principal fuente de infección sigue sin ser evidente. Es infrecuente una enfermedad pulmonar crónica similar a la producida por M. kansasii o por el MAC. a excepción de la cavilación. La endocarditis sobre una válvula protésica suele producirse tras cuatro a doce semanas después de la cirugía. Raramente el M. fortuitum o el M. chelonaeabscesus produce queratitis y ulceración de la córnea postraumática o adenopatías cervicales. Las lesiones producidas por M. fortuitum o por M. chelonae-abscesus, se caracterizan histológicamente por necrosis con una mínima caseificación y un infiltrado mixto inflamatorio compuesto por neutrofilos y granulomas de cuerpo extraño o de células de Langhans. Pueden verse de modo ocasional macrófagos cargados de lipidos. Se pueden encontrar grupos de bacilos ácido resistentes dentro de agregados de neutrofilos en menos de un tercio de los casos. En el tejido pulmonar son frecuentes los macrófagos espumosos, con un patrón similar a la neumonía lipoidea
Mycobacterium Mycobacterium
1147
xenopi
Mycobacterium xenopi se aisló por primera vez en un sapo en 1957 y fue reconocido como patógeno humano en 1965 (Costrinia, 1981). Se ha cultivado a partir de aguas residuales cálidas y trias, calderas de hospitales y tanques de almacenamiento y otras fuentes ambientales. En Gran Bretaña. M. xenopi se encuentra más frecuentemente en zonas costeras que en las del interior y los pájaros son un posible reservorio natural. La mayoría de las infecciones pulmonares causadas рог M. xenopi se han descrito en Europa y Gran Bretaña. Por el contrario, esta micobacteria es poco frecuente en EE.UU. La enfermedad se da sólo en adultos y más frecuentemente en varones que en mujeres La mayoría de las personas padecen enfermedad pulmonar preexistente u otro factor predisponente, como neoplasias extrapulmonares malignas, alcoholismo, diabetes mellitus o terapias inmunosupresoras. La enfermedad pulmonar puede ser crónica, subaguda o aguda. Los síntomas son indistinguibles de los asociados a la patología causada por M. kansasii. La infección local extrapulmonar (osteomielitis, artritis, adenopatías) y la enfermedad diseminada son infrecuentes, aunque se han descrito en pacientes con sida (Tecson-Tumang. 1984).
Mycobacterium
szulgai
Mycobacterium szulgai es un patógeno humano infrecuente localizado en cualquier parte del mundo, pero su reservorio natural es aún desconocido. La manifestación más frecuente de la infección es la enfermedad pulmonar eró-
SECCIÓN VI
1148
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
ruca, siendo esto más frecuente en varones de mediana edad. La afectación extrapulmonar es infrecuente, habiéndose descrito una bursitis de olecranon asociada a traumatismos de repetición o tras inyecciones de corticoïdes, afectación cutánea extensa en personas en tratamientos con corticoides. osteomielitis, tenosinovitis con síndrome de túnel del carpo, adenopatias cervicales y enfermedad diseminada (Woods, 1987).
Mycobacterium
malmoense
Mycobacterium malmoense se describió como una nueva especie en 1977, aunque su reservorio natural es aún desconocido (Schroder. 1977). La mayoría de las infecciones humanas se han descrito en Inglaterra. Gales y Suiza, mientras que en EE.UU. es infrecuente. La enfermedad pulmonar crónica es la manifestación más común de la infección por M. malmoense. afectando típicamente a hombres de mediana edad con neumoconiosis. También se han descrito adenopatias cervicales en niños y enfermedad diseminada en pacientes con sida (Henriques, 1993).
Mycobacterium
simiae
Mycobacterium simiae se aisló por primera vez en los monos de la India en 1965 (Karassova, 1965). Se encuentra en los monos y se ha aislado también en las aguas residuales de hospitales. Es un patógeno humano anecdótico, aunque se ha asociado con patología pulmonar crónica y enfermedad diseminada.
Mycobacterium
marinum
Mycobacterium marinum se reconoció como patógeno humano en 1951 (Norden, 1951). La infección humana suele adquirirse a través de la piel dañada en contacto con aguas no cloradas contaminadas, tanto dulces como saladas, aunque también puede transmitirse a través de vía traumática sin contacto con agua o bien por contacto con agua sin traumatismo precedente. Aparece una lesión única papulonodular a las 2-3 semanas tras la inoculación, siendo más frecuente en codo, rodilla, pie o dedos del pie o de la mano, y suele evolucionar a lesión verrugosa o ulcerada. Ocasionalmente se forma un absceso en el punto de inoculación y múltiples nodulos secundarios pueden aparecer y progresar centralmente a través de los linfáticos, simulando una esporotricosis (véase Cap. 54). Las lesiones cutáneas en inmunodeprimidos pueden ser diseminadas. Las manifestaciones extracutáneas son infrecuentes: destacan: smovitis. osteomielitis y lesiones oculares y laríngeas (Woods. 1987). La histología de las lesiones cutáneas varia según el estadio de la infección. En fases tempranas existe un agregado de neutrófilos rodeado por histiocitos. Más tarde se ven linfocitos. histíocilos y células de Langhs con focos de necrosis fibnnoide. En las lesiones de más de seis meses de evolución se pueden encontrar linfocitos en la dermis. Las tinciones para bacilos ácido resistentes suelen ser negativas, pero se pueden hallar los organismos en el interior de los histiocitos.
Mycobacterium
haemophilum
Mycobacterium haemophilum se describió por primera vez en 1978, pero probablemente fue el bacilo ácido resistente incultivable que se reconoció en úlceras cutáneas en 1972 y 1974 (Sompolinsky. 1978' Lomvardías. 1972: Feldman, 1974). Esta es la única de las micobacterias que requiere hemoglobina o hemina para su crecimiento. Las infecciones humanas por M. haemophilum son raras y suelen verse en personas con una inmunosupresión subyacente, como inmunosupresión tras trasplantes o sida, pero se han descrito algunos casos de adenopatias en niños sanos (CDC. 1991). La enfermedad se manifiesta más frecuentemente como múltiples nodulos cutáneos, úlceras o edemas acompañados de dolor que suelen afectar a las extremidades, pudiendo llegar a formar abscesos y fistulas abiertas que drenan un material purulento. Desde el punto de vista microscópico, se ven focos de necrosis sin caseificación rodeados por un infiltrado inflamatorio polimorfo con aparición ocasional de células de Langhans en la dermis profunda. Se pueden ver los bacilos ácido resistentes de un modo aislado o bien formando pequeños grupos dentro de las células.
Mycobacterium
genavense
Mycobacterium genavense es una nueva especie propuesta de micobactena que se ha obtenido en cultivos de sangre por primera vez y también en bazo o médula ósea de pacientes con sida (Coyle. 1992; Wald, 1992). Casi todos los pacientes tuvieron fiebre y malestar general, y algunos incluso síntomas abdominales. Algunos de los pacientes fueron coinfectados con otro patógeno, como el MAC. por lo que ha sido difícil determinar el papel de M. genavense en la patología. Desde el punto de vista histológico, las lesiones están formadas por agregados de macrófagos espumosos llenos de bacilos ácido resistentes (al igual que el MAC diseminado) (Maschek. 1994).
Mycobacterium
ulcerans
Mycobacterium ulcerans es endémico de las áreas de Zaire. Uganda. Nigeria, Ghana. Camerún, Malasia, Nueva Guinea, Guyana. México y Australia, quedando localizado entre los 25 grados de latitud norte y los 38 grados de latitud sur. Los niños de entre cinco y ocho años son los más frecuentemente afectados, aunque en un estudio de Australia la media de edad de personas afectadas fue de aproximadamente treinta años y un tercio de personas fueron mayores de 40 años (Wolinsky, 1979). En las zonas endémicas, la enfermedad es ligeramente más común en varones. El reservorio de M. ulcerans y la vía habitual de transmisión a los humanos permanece aún desconocida. Otros nombres con los que se conoce a la enfermedad son la ulcera de Bairnsdale. por el área de Australia, donde lúe reconocida por primera vez. y úlcera o enfermedad de Buruh. debido al área de Uganda que refiere la mayor parte de los casos. La enfermedad debuta como uno o. más raramente, múltiples forúnculos indoloros o nodulos subcutáneos en un área expuesta, como las piernas, donde posiblemente existió un traumatismo previo. Tras vanas semanas, los nodulos se ulceran y pueden surgir nodulos y úlceras satélites. Típicamente, los ganglios linfáticos suelen respetarse y los individuos afectados permanecen afebnles y sin síntomas sistémicos. salvo que se sobremfecten las lesiones por bacterias.
MYCOBACTERIUM LEPRAE Mycobacterium leprae es el causante de la lepra (también lamada enfermedad de Hansen). Aunque no pertenece a las MTBC. y por tanto puede considerarse una "micobacteria no tuberculosa", se estudia aparte, ya que es la única micobacteria que no se ha podido cultivar por el momento. Los animales útiles como modelos de infección son el ratón de pie almohadillado y el armadillo de nueve bandas. M. leprae se ha localizado en casi la totalidad del mundo en algún momento de la historia. Se estima que entre 10 y 15 millones de personas en todo el mundo padece lepra, y aproximadamente el 62% está en Asia y el 34% en África (Binford. 1982). Cerca de 6.000 personas en EE.UU. padecen lepra, la mayoría inmigrantes, y en algunos de los casos afecta a individuos de los estados de las costas del golfo de California y Hawai (Neill. 1985). La lepra afecta predominantemente a humanos, pero también es una infección natural de los armadillos salvajes en Lousiana y Texas, y se han descrito casos esporádicos en unos monos (Hastmgs. 1988). El mecanismo de transmisión es desconocido, pero se acepta la teoría de la transmisión de persona a persona a través de la aerosolización del organismo a partir de la nariz de la persona con lepra activa (véase más adelante) que contacta con la mucosa nasal de otro individuo. La transmisión también puede producirse a través de piel sana o por heridas penetrantes, como las producidas por espinas o picaduras de artrópodos. La leche de mujeres lactantes con la enfermedad lepromatosa contiene bacilos que pueden transmitirse a los niños, y también es posible una transmisión transplacentaria. También se han descrito casos de lepra en humanos que han tenido contacto con armadillos (Lumpkin, 1983). Además, el hallazgo de una enfermedad similar a la lepra en armadillos y el hecho de la aparición de casos esporádicos de lepra en personas sin contacto con afectados sugiere la existencia de fuentes de M. leprae atétenles a la humana (Blake. 1987).
CAPITULO 53
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La mayoría de las personas resisten de un modo efectivo la infección por M. leprae. La resistencia depende de una correcta inmunidad celular contra los antigenos de M. leprae. como sucede en la lepra tuberculoide. En personas en las que falla esa respuesta celular inmune específica a dichos antígenos, los bacilos se multiplican dentro de los macrófagos. pudiendo producir una rápida lepra lepromatosa diseminada. Los defectos de la inmunidad celular que pueden afectar a los linfocitos T o su interacción con los macrótagos son la causa que facilita la enfermedad. Las lesiones de lepra se desarrollan tras un período de incubación de 2 a 5 años, variando la presentación según la respuesta inmune del huésped. La lepra siempre afecta a los nervios periféricos, casi siempre a la piel y frecuentemente a las mucosas. Los tres signos cardinales de la enfermedad son lesiones cutáneas, áreas cutáneas de anestesia y una afectación de los nervios periféricos. El sistema desarrollado por Ridey y Jopling (presentado más adelante) se usa frecuentemente para clasificar el espectro clínico e histológico de las formas de lepra (Ridley, 1964). La lepra indeterminada, en las etapas tempranas, se caracteriza por una o más máculas hipopigmentadas en la piel con ligera pérdida de sensibilidad. En cerca del 75% de los casos la patología se cura espontáneamente, mientras que en el resto progresa frecuentemente tras un periodo largo. Los tipos extremos de lepra lepromatosa, la forma diseminada anérgica de la enfermedad y la tuberculoide o forma localizada, son formas clínicamente estables La lepra lepromatosa se caracteriza por distintas lesiones cutáneas que van desde una afectación cutánea generalizada hasta unos nodulos difusos y de distribución simétrica (llamados lepromas) repletos de organismos. Las lesiones afectan generalmente a las partes más frías de la superficie corporal, como el tercio anterior del ojo. la mucosa nasal y los troncos de los nervios periféricos superficiales. En la enlermedad avanzada las lesiones se acompañan de pérdidas sensitivas debido a la afectación de las fibras nerviosas dérmicas. Desde el punto de vista microscópico, las lesiones muestran histiocitos espumosos que contienen muchos bacilos ácido resistentes, ausencia o escaso número de linfocitos, mínima inflamación inlraneural y múltiples bacilos ácido resistentes en los nervios, perineuro, pared vascular y músculos. En la lepra tuberculoide se desarrollan una o varias máculas o placas anestésicas bien definidas, a veces acompañadas por un engrasamiento del nervio periférico cerca de la lesión cutánea. Desde el punto de vista histológico, las lesiones muestran granulomas no caseosos en los nervios y en la dermis que afectan a las capas básales de la epidermis, mientras que. si los hubiese, los bacilos ácido resistentes estarían en bajo número. La lepra bimorfa es una condición clínica inestable que comparte características de ambas formas extremas. Puede desarrollar características más cercanas a la tuberculoide, que denominaríamos progresión, o bien acercarse a la lepromatosa, denominándose entonces regresión.
PRUEBAS CUTÁNEAS Las pruebas cutáneas de la tuberculosis son de utilidad para identificar a personas infectadas con el MTBC. pero no diferencian enfermedad activa de infección. Las personas infectadas con MTBC desarrollan una reacción de hipersensíbilidad a las proteínas de los bacilos, en lo que toma su base el test cutáneo con un derivado proteico purificado (PPD). El método preferido de test cutáneo es el test de Mantoux. que se lleva a cabo mediante la inyección intracutánea de 0,1 mi de PPD-S de fuerza intermedia (5 unidades de tuberculina). La reacción se interpreta a las 48-72 horas midiendo el diámetro de induración en milímetros (Huebner. 1993). Una induración de 5 mm o mayor se considera como positivo en personas con VIH, en aquellos con reciente contacto íntimo con personas con tuberculosis contagiosa y en aquellos con hallazgos radiológicos de lesiones residuales tuberculosas. Un resultado de 10 mm o mayor, es positivo en aquellos que no cumplen esos criterios pero que tienen otros factores de riesgo para tuberculosis. Se incluyen en este grupo los extranjeros de países con alta prevalencia de tuberculosis (como África, Asia o América latina), los adictos a drogas por vía parenteral, poblaciones médicamente desatendidas o en declive, como
MICOBACTERIAS
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las minorías étnicas o raciales, residencias de cuidados crónicos y personas que tienen condiciones médicas asociadas a riesgo de tuberculosis (p. ej., silicosis, gastrectomizados. puentes yeyuno-ileales. personas por debajo del 10% de su peso ideal, insuficiencia renal crónica, diabetes mellitus. tratamiento con altas dosis de corticoides u otros fármacos inmunosupresores y neoplasias). Una reacción de 15 mm o mayor se considera positivo en el resto de las personas. Pueden existir falsos positivos en la reacción de PPD por infección con micobacterias no tuberculosas. Los falsos negativos se pueden deber a una mala técnica o a una mala conservación del derivado. Si se administra apropiadamente, los falsos negativos son raros en personas relativamente sanas, pero pueden producirse en aproximadamente el 20% de los individuos con tuberculosis conocida cuando se les realizó por primera vez. La mayoria de estos falsos negativos son debidos a una enfermedad y se convierten en positivos tras dos o tres semanas de tratamiento. Los factores causantes de un estado generalizado de anergia, como malnutnoón proteica, infección viral concomitante, sarcoidosis, neoplasias (como el linfoma). terapia con corticoides o ¡nmunosupresión e infección por VIH pueden ser responsables de un falso test negativo. El test de Mantoux suele permanecer positivo tanto tiempo como persista el acantonamiento del bacilo en un loco quiescente. No obstante, la reacción puede ir disminuyendo con el paso de los años, lo que ocurre con mayor frecuencia en aquellos que sobrepasan los 55 años. En estos individuos la reacción puede ser estimulada (o llegar a positivizarse) si se repite el test a la semana de realizarlo, reacción que se denomina efecto booster. Los compuestos preparados para test cutáneos para micobacterias no tuberculosas incluyen el PPD-A (Mycobacterium avium). PPD-B (Mycobacterium intracellulare). PPD-F (Mycobacterium fortuitum). PPD-G {Mycobacterium scrofulaceum) y PPD-Y {Mycobacterium kansasii). En EE.UU. estos compuestos se podian conseguir en el CDC, pero se interrumpió su administración, ya que esos antígenos no estaban estandarizados y las reacciones cutáneas eran de dificil interpretación.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Muestras Las muestras recomendadas para el diagnóstico de infección por micobacterias se recogen en la Tabla 53-3. Las muestras tomadas de sitios contaminados como esputo, otras secreciones respiratorias, secreciones gástricas, orina y las heces se deben descontaminar antes de su inoculación en el medio para prevenir un sobrecrecimiento de la llora normal que enmascare la presencia de las micobacterias. La concentración de las muestras tras su descontaminación aumenta la sensibilidad de las extensiones y cultivos. Las muestras tomadas de zonas de cuerpo normalmente estériles no precisan descontaminación previa al cultivo, como la sangre, el líquido cefalorraquídeo, el líquido pleural o peritoneal y los tejidos. El procesamiento e inoculación de las muestras para su cultivo deberían realizarse en una cabina biológica de segundad. El procesamiento con A/-acetil-L-ciste¡na (NALC)-hidróxido sódico (Fig. 53-1) es el método más comúnmente utilizado en el laboratorio clínico para licuar, descontaminar y concentrar muestras para la detección de micobacterias. Las muestras contaminadas deberían ser refrigeradas si no se pudiesen procesar inmediatamente. Antes de proceder al paso comentado en la Figura 53-1. se necesita un manejo adicional para algunas muestras. Las muestras de lavado gástrico se deberían procesar inmediatamente, pero si no se puede evitar una demora, se debería añadir hidróxido sódico al 10% hasta que el pH de la muestra (medido con papel de pH) sea neutro. Si se recogen más de 10 mi de secreciones gástricas, habría que centrifugar la muestra de 3.000 g a 3.600 g durante 20 a 30 minutos, desechándose el sobrenadante y progresando el sedimento como se indica en la Figura 53-1. Para las heces. 1 ó 2 g de muestra sólida o bien 5 mi de muestra liquida se colocan en un tubo de 50 mi y se añade agua estéril destilada hasta alcanzar un volumen de 10 mi. La suspensión se agita en un mezclador, se filtra a través de una gasa y se procesa como se indica. Las muestras de orina se dividen en dos a cuatro
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 53-3 Enfermedades causadas por micobacterias y muestras para el diagnóstico Enfermedad
Especie de Mycobacterium'
Pulmonar
tuberculosis, kansasu. MAC, malmoense. simiae
xenopi.
Diseminada Adenopatias Piel, tejidos blandos
tuberculosis. MAC tuberculosis. MAC, scrolulaceum ulceraos, lortuitum-chelonae. marinum, leprae
Músculo esquelético Sistema nervioso Genitourinario
tuberculosis, tuberculosis, tuberculosis
lortuitum-chelonae, leprae
Gastrointestinal Peritonitis Hepatitis Pericarditis
tuberculosis. tuberculosis tuberculosis. tuberculosis
MAC
Muestras
szuigai,
haemophilum.
marinum
MAC
Esputo (a primera hora de la mañana, tos profunda. durante tres días seguidos). BAL, contenido gastrico, tejido pulmonar, líquido pleural Sangre, médula osea, tejidos afectados Aspirado o biopsia de las adenopatias Aspirado o biopsias de la lesión (se deberían desechar los tapones) extensión de las secreciones nasales y corles cutáneos, biopsia de la lesión Líquido y vaina sinovial, hueso LCR. le|ido cerebral, biopsia de nervios periféricos Orina (a primera hora de la mañana durante tres días consecutivos), tejidos afectados (riñon, endometrio. trompa de Falopio, próstata, vesículas seminales, epididimo) Tejido, heces Biopsia penloneal. líquido ascitico Hígado Pericardio, liquido pencárdico
• Las especies enumeradas son patógenos potenciales MAC Mycobacterium avium complex: BAL lavado broncoalveolar: LCR: liquido cefalorraquídeo Modilicada de Woods GL: Mycobacteria En Woods GL. Gutierrez Y (eds.): Diagnostic Pathology of Infections Diseases. Filadellia. Lea 8 Febiger. 1993. p 378. con autorización.
tubos de 50 mi y se centrifugan a 3.000 g-3.500 g durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante dejando unos 2 mi de sedimento en cada tubo. Los tubos se mezclan con un mezclador y los sedimentos se combinan, y si fuese necesario se añade agua destilada hasta un volumen de 10 mi y entonces se descontamina como se muestra en la Figura 53-1.
Poner 10 mi (máximo) de esputo, orina u otros Huidos en un luho do centrifugado estéril de plástico de 50 mi
I Añadir el mismo volumen de NALt-2".. NaOll (preparado cada día) y tapar herméticamente
l Me/clar en el mezclador durante 15 a 30 segundos
Dejar reposar la me/ela a temperatura ambiente durante 15 mininos (45 minutos para muestra! fecales)
l Añadir 3(1 mi de lampón fosfato (pll ft.X): tapar los tubos y mc/clar i Centrifugar a 3.000-3.600 x % durante 15 minutos (o 2.500 x g . I . I I . I I I I , - 20 mininos)
. Decantar el sobrenadante; resuspender el sedimento en 1.5 ml-2 mi de agua estéril o lampón i Preparar extensión para leñir
1 Inocular en medio de cultivo
Figura 53-1. Protocolo para la descontaminación mediante el uso de hidróxido sódico rV-acelil-L-cisleina al 2%. y concentración de muestras para la determinación de micobacterias por extensión y cultivo.
Tinciones microbiológicas En extensiones teñidas con la tinción de Gram la mayoría de las micobacterias aparecen como unos bacilos grampositivos escasamente teñidos, pero a veces los bacilos no captan el violeta y aparecen como "gram neutro" o como "gram fantasma" (Lámina 53-1). Imágenes similares de fantasmas pueden encontrarse en los macrófagos obtenidos con las tinciones de Wnght o Papanicolau. En general, para mejorar la eficiencia, todas las muestras (menos la sangre) recogidas de personas con sospecha de infección por micobacterias se deberían examinar microscópicamente. Sin embargo, muchos laboratorios no preparan extensiones de muestras en las que los bacilos ácido resistentes raramente sean vistos, tales como líquido cefalorraquídeo, orina y médula ósea. Para preparar la extensión se extienden dos o tres gotas del sedimento concentrado de un modo uniforme en un portaobjetos y se fija a 80 C durante 15 minutos o bien de una a dos horas a 65 C-70 C en un calefactor eléctrico. Hay dos tipos de tinción que detectan los bacilos ácido resistentes: carbol-fucsina (la clásica tinción de Ziehl-Neelsen. que requiere calefacc en. y la tinción de Kinyoun) y las tinciones fluorocromas preferidas (auramina-rodamina y auramina-O), que son más sensibles. Las extensiones teñidas con la tinción de carbol-fucsina se examinan con un aumento de 800x a LOOOx (con aceite de inversión). Las extensiones teñidas con tinción fluorocroma se examinan con aumentos más bajos (250x y 400x) que permiten visualizar más campos en menos tiempo. Las células de M. lortuitumchelonae complex se tiñen escasamente con la tinción lluorocroma y pueden pasar desapercibidas, por lo que cuando se sospechasen (p. ej.. en infecciones de heridas quirúrgicas) las extensiones que resulten negativas sería conveniente teñirlas con carbol-fucsina. Los resultados se comunican tras ver 100 campos y debería ser incluido un informe indicando si la extensión se preparó directamente de la muestra o tras descontaminación y concentración. Las directrices para informar los resultados de las tinciones de muestras para bacilos ácido resistentes se muestran en la Tabla 53-4 (Kent. 1985). En las extensiones teñidas con carbol-fucsina, los bacilos ácido resistentes aparecen como unas varas ligeramente curvas de color púrpura-rojo (de 1 um a 10 jtm de largo y de 0,2 um-0,6 um de ancho) que frecuentemente son de forma arrosariadas y con bandas (Lámina 53-2), pero también pueden tener forma de coco o filamentosas. En general, el aspecto del bacilo ácido resistente no facilita la identificación de las especies, pero sin embargo las células de cieñas especies tienen características útiles para el diagnóstico. Por ejemplo, las células de M. kansasu Irecuenlemente aparecen como un bacilo rayado (Lámina 53-3) más largo que M. tuberculosis y similar a un cayado. Las célu-
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MICOBACTERIAS
dos son más sensibles que los sólidos y aportan una más rápida delección del crecimiento micobacteriano (Stager. 1991. Anargyros, 1990; Abe. 1992). Los sistemas líquidos actualmente disponibles sobre el sistema radiométrico N." de B A A R c o n N." de B A A R c o n son BACTEC 460TB (BD Biosciences). SEPTI-CHECK AFB (BD Biosciencarbol-fucsina (1.000x) f l u o r o c r o m o (450x) Informe ces), tubos indicadores de crecimiento de micobacterias BBL (MGIT: BD BioNo se ven BAAR 0 0 sciences), el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnóstico Trek) y el 1-2 en 70 campos Dudoso, repetir 1-2 en 300 campos BacT/Alert MB (Organon Teknika). El CDC también recomienda que los sis(un barrido y medio) (3 barridos) lemas de cultivos usados detecten el crecimiento de micobacterias dentro de 2-18 en 50 11 1-9 en 100 campos campos (un barrido) una media de 14 días. 1-9 en 10 campos 4-36 en 10 campos 2+ La composición de los medios sólidos habitualmente utilizados se describe 3+ 1 -9 por campo 4-36 por campo en la Tabla 53-5. Estos medios están disponibles en tubos de tapón de rosca 4+ >36 por campo >9 por campo y botellas de prescripción de 29,57 cm, el medio de base de agar también BAAR bacilos acido resistentes; Bamdo revision de loda la extension está disponible en las placas de Petri. Las botellas de prescripción se prefieModilicada de Kent PT. Kubica GP Public Health Mycobacteriology A Guide ren a los tubos con tapón de rosca por razones de seguridad y porque provefor the Level III Laboratory Atlanta, Department ol Health and Human Servi ces. 1985 con auto'i-raciön en una mayor superficie para el crecimiento de las micobacterias. Las muestras cutáneas deberían inocularse en un medio de huevo o de agar, y para asegurar la obtención de M. haemophilum (véase arriba) también debería depositarse en un medio de agar chocolate, agar-sangre de oveja de Colomlas de MAC suelen ser pleomórficas, ocasionalmente cocobacilares y se liñen bia al 5%, agar Mueller-Hinton con suplemento de Fildes o Lowenstem-Jencon el ácido peryódico de Schiff (PAS). Las células de M. marínum son típisen con citralo amonio férrico al 2%. Todos los cultivos deberían ser incubacamente más largas y más anchas que las de M. tuberculosis y suelen mosdos a 37'C en una atmósfera con el 5%-10% de CO„ y los medios de tubo trar rayas. Las células de M. leprae se tiñen más débilmente que la mayoría deberían incubarse en una posición inclinada con los tapones flojos durante de las otras micobacterias. al menos una semana para asegurar una correcta distribución del inoculo La especificidad de las tinciones para bacilos ácido resistentes es del sobre la superficie. Para muestras cutáneas, se debe hacer un segundo gru99% o mayor, y la sensibilidad es aproximadamente del 25%-75% (Murray, po de cultivos inoculando e incubándolos a 30C. ya que ciertas micobacte1980: Rickman. 1980; Strumpf. 1979). Los falsos positivos (tinción positiva rias crecen mejor a temperaturas más bajas (M. marinum. M. haemophilum. con cultivo negativo) pueden deberse a microorganismos no viables, como M. chelonae. M. ulcerans). Todos los cultivos deben ser examinados semapuede pasar en pacientes que están tomando el tratamiento antituberculonalmente al menos durante seis semanas. so, a una prolongada descontaminación que destruya tanto a las bacterias La mayor ventaja de los cultivos convencionales es que permiten la visuacontaminantes como a las micobacterias o bien a una contaminación duranlización de la morfología y la pigmentación de las colonias, lo que es útil para te el proceso de teñido. Los factores que influyen en la sensibilidad de los el diagnóstico, especialmente para diferenciar las colonias de M. tuberculoresultados son: 1) población de pacientes (las personas con lesiones cavitadas tienen más probabilidad de que tengan un esputo positivo que las que sis de aquellas micobacterias no tuberculosas. El aspecto y las características de crecimiento de las colonias de las micobacterias habitualmente hallano las tienen). 2) tipo de muestras (las respiratorias es más probable que das se recogen en la Tabla 53-6. Las desventajas de los medios sólidos son sean positivas que otras muestras), 3) el número de muestras examinadas, el prolongado tiempo de crecimiento de las micobacterias (las colonias no 4) el número de bacilos ácido resistentes presentes en las muestras (son son visibles generalmente en un medio sólido antes de 3-4 semanas) y su necesarios de 5.000 a 10.000 microorganismos/ml de muestra para un rebaja sensibilidad. La inoculación en discos de agar Middlebrook, examinánsultado positivo), 5) las especies presentes (las muestras con M. tuberculodose con el microscopio, permite una más rápida detección de colonias, pero sis o M. kansasii pueden ser más positivas que las que contienen otras su proceso es muy laborioso, no estando disponible en muchos laboratorios micobacterias), 6) la experiencia del observador. 7) la tinción usada. Las tinclínicos (Welch, 1993). ciones fluorocromas son más sensibles y fáciles de leer que las tinciones El sistema radiométrico semiautomatizado BACTEC TB460 utiliza un con carbol-fucsina y se recomiendan por los expertos del CDC (Tenover, 1993). Para poder detectar el resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. el medio líquido (uno para sangre [13 A.) y otro para el resto de muestras [12 B]) que contiene un sustrato de ácido palmitico marcado con C, Cada muestra CDC también sugiere que. para las muestras respiratorias, los resultados de las tinciones sean informados dentro de las 24 primeras horas de la recep- es inoculada en un vial y se le añade una mezcla de antibióticos, excepto a la de sangre. Se incuban a medio ambiente a 37 C durante 5-6 semanas. ción de la muestra, lo que significa tener que procesar las muestras todos Para asegurarse el aislamiento de M. genavense. los cultivos de sangre los días de la semana. (especialmente los que provienen de pacientes con sida) deben incubarse de 8 a 10 semanas. La multiplicación de los bacilos en un medio líquido y el uso Métodos de cultivo de sustrato marcado libera CO al espacio que queda encima del medio. Las botellas son manualmente cargadas en el BACTEC TB460, que mide la Para un óptimo aislamiento de las micobacterias a partir de las muestras cantidad de '"CO, y calcula el índice de crecimiento (Gl). Un Gl mayor de 10 clínicas, los expertos del CDC recomiendan la inoculación de las mismas a sugiere que hay micobacterias, y cuando el Gl alcanza entre 50 y 100 se un medio líquido y otro sólido (Tenover. 1993). En general, los medios líquiTabla
53-4
Directrices para informar las e x t e n s i o n e s para bacilos ácido resistentes
1
:
l4
s
Tabla 53-5
M e d i o s habitualmente utilizados para el aislamiento de micobacterias
Medio Lowenstein-Jensen Middlebrook 7H10 Midrllobrook 7H11 Selectivo 7H11 (medio de Mitchison)
^
_
Componentes Huevos coagulados, sales, glicerol. harina de patata Sales, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, dextrosa Sales, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, hidroxilato de caseína al 0,1% Sales, vitaminas, cofactores. ácido oleico, albúmina, catalasa. glicerol, dextrosa e hidroxilato de caseína
Agente(s) inhibidores 0.025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 50 pg/ml carbenicilma 10 (ig/ml anfoteriema B 200 unidades/ml polimixma B 20 pg/ml trimetroprim-laclato
j
1152
SECCIÓN VI
Tabla 53-6
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Morfología de las colonias y características del crecimiento de las diferentes micobacterias halladas en el laboratorio clínico Colonias
Especie d e Mycobacterium
Tasa de crecimento (semanas)'
Morfología
Pigmentación
M. tuberculosis M. bovis M. avium complex
Rugosa Rugosa, fina o Iransparente Lisa pequeña, fina, Iransparente o larga, opaca, abovedada ±rugosa
N (amarillento) N (incoloro) N
4-6 4-6 4-6
M.
Lisa, globulosa
S
4-6
P II s S a 37°C. P a 2S°C Incoloros P" P
4-6 4-6 4-6 2-3 4-6 2-3
Crece a 42T
N S P
4-6 4-6
Crecimiento óptimo a 20-32°C
<1
Crecimiento óptimo a 37-45°C, El pigmento es amarillo-naranja, llegando hasta marrón
N N S N (amarillento)
4-6 4-6 2-3
M. M. M M. M. M. M.
scrotulaceum kansasu lortuitum-chelonae xenopí szulgai malmoense simiae marmum
M M M
haemophilum gordonae Ihermoresislible
Rugosa, cristales de p-caroteno Lisa o rugosa Lisa, extensiones filamentosas ("nido de pájaros) Lisa o rugosa Lisa Lisa Arrugada, brillante, lisa, hemiesfénca (raro) rugosa, seca Rugosa. ±lisa Lisa Lisa o rugosa
M M M M
terrae-triviale nonchromogenicum flavescens smegmatis
Lisa (M. terrae) o rugosa (M. triviale) Rugosidad intermedia Lisa Rugosa. ±lisa
Coméntanos
El crecimiento requiere 8 semanas algunas colonias se vuelven levemente pigmentadas con la incubación prolongada El pigmento varia de amarillo claro a naranja oscuro Raras veces son N o S
£1
Crecimiento óptimo a 31-33°C
<1
• Promedio en un medio sólido " La producción de pigmento suele requerir una exposición prolongada a la luz N: no lotocromógena, S escolocromógena; P: fotocromOgena (véase Tabla 53-1); ±: ciertas especies tienen ocasionalmente la morfología indicada.
hace una extensión del medio para teñir bacilos ácido resistentes. Los viales que contienen bacilos ácido resistentes se subcultivan a su vez en un medio sólido y se hacen test directos para su identificación (se comenta en la siguiente sección). Para cultivos positivos para micobacterias en sangre de pacientes con sida, se debería hacer un subcultivo en agar Middlebrook 7H11 que contenga micobactm J, para obtener M. genavense si los subcultivos iniciales del medio liquido son negativos, o bien, si el medio liquido es positivo, se deberían mandar al laboratorio de referencia para hacer los test oportunos. El SEPTI-CHEK AFB es un medio de cultivo bifásico para micobacterias que consiste en un medio líquido y un medio agar en un canal cerrado, similar al cultivo bifásico de sangre descrito en el Capitulo 57. El medio se inocula con la mueslra, el canal se sujeta a la parte superior de la botella y el sistema se invierte para permitir que el liquido Huya por el medio del agar. El sistema se incuba de 6 a 8 semanas de 35 C a 37 C con un 5% a 7% de CO . y a intervalos regulares el líquido se subcultiva en el medio sólido por el canal al invertir el sistema. La sensibilidad de este sistema es similar al de BACTEC TB460 (Abe. 1992; D'Amato, 1991: Isenberg. 1991). El tiempo de detección de crecimiento es, sin embargo, más largo que en el BACTEC TB460, aunque más rápido que en un medio sólido convencional. El BBL-MGIT consiste en 4 mi de caldo 7H9 modificado y un indicador fluorescente metido en silicona en la óase de un tubo de vidrio de 16 x 100 mm. Los tubos se inoculan con la muestra, se añade una mezcla de antibióticos, para frenar el crecimiento de las óacterias contaminantes, y un enriquecedor del crecimiento de micobacterias, y los tubos se tapan y se incuban a 37C durante más de ocho semanas. Para detectar el crecimiento de las micobacterias, los tubos se colocan encima de un transiluminador de rayos ultravioletas de 365 nm o enfrente de una lámpara de Wood. La aparición de una fuerte fluorescencia en el sensor (un brillo de color naranja en la base del tubo) indica crecimiento De modo alternativo, los tubos se pueden incuban en el instrumento totalmente automatizado BACTEC 960. que monitoriza de un modo continuo la florescencia y las señales de aquellos que son positivos. El MGIT es lan sensible como el BACTEC 460 para la detección de mico-
bacterias, pero el tiempo medio de crecimiento es algunos días mayor con el MGIT (Hanna. 1999; Pfyffer, 1997; Cornfield, 1997). Además del BACTEC MGIT 960, hay otros tres sistemas totalmente automatizados de monitorización continua disponibles para el cultivo y detección de micobacterias: el sistema BACTEC 900MB (BD Biosciences) (Zanetti, 1 9 9 7 : Pfyffer, 1997), el sistema BacT/MB (Organon Teknika) (Brunello. 1999: Rohner. 1997) y el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnóstico Trek) (Tholken.1997. Woods.1997). Con cada sistema, las botellas se cultivan en el respectivo instrumento, donde se monitorizan los cambios de producción y consumo de diferentes gases, lo que indica el crecimiento de micobacterias u otros microorganismos. En general, estos sistemas son comparables al BACTEC 460TB y tienen las ventajas de ser totalmente automatizados y menos laboriosos.
Test para ia identificación de micobacterias La identificación de micobacterias se ha basado tradicionalmente en la tasa de crecimiento en medios sólidos, la morfología de la colonia, la pigmentación de la colonia con y sin luz y los resultados de los test bioquímicos. Los protocolos de identificación de micobacterias mediante estos factores en el laboratorio de microbiología se ilustran en las Figuras 53-2 a 53-3. Los lest bioquímicos específicos se describen con detalle en otros apartados (Kent. 1985). Aunque la mayoría de las especies se pueden identificar de este modo, los resultados no suelen estar disponibles hasta vanas semanas o meses tras el crecimiento de colonias en un medio sólido. Se recomiendan métodos más rápidos de identificación que permitan la identificación de MTBC antes de 21 días tras la recogida de las muestras (Tenover, 1993). Actualmente el método de diagnóstico de tuberculosis pulmonar más rápido es el uso de amplificación de ácidos nucleicos para la detección directa de M tuberculosis en muestras clínicas (Dalovisi, 1996: Ichiyama. 1996. Wobeser. 1996). En la actualidad, dos de estos test (test directo de Mycobacterium tuberculosis amplificado [GEN-PROBE Inc.) y test de Mycobacterium tuberculosis AMPLICOR [sistemas diagnósticos Roche Inc.]) están disponibles en
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MICOBACTERIAS
1153
Figura 53-2. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias no fotocromógenas. Obsérvese que aunque Mycobactenum simiae suele ser fotocromógeno. este hecho es inestable y puede resultar aparente únicamente tras la exposición a la luz durante un periodo largo. Algunas de las cepas de Mycobacterium bovis dan un positivo en la reacción con niacina. (De Woods GL. Gutiérrez Y: Diagnostic Pathology o! Infections Diseases. Filadelfia, Lea & Febiger. 1993, con autorización.)
todo el mundo y hay otro más que está en estudio (BDProbeTec ET System, BD Biosciences). El test amplicor está aceptado por la Food and Drug Administration para el análisis de muestras respiratorias BAAR positivas. El test Gen-Probe es aceptado para su uso con muestras respiratorias positivas y negativas para bacilos ácido resistentes. Datos recientes sugieren que los test podían ser de utilidad en muestras negativas para bacilos ácido resistentes en pacientes con alto riesgo de tuberculosis (p. ej., personas inlectadas con VIH y para personas encarceladas en centros penitenciarios), lo que permitiría un diagnóstico precoz y un rápido inicio del tratamiento (Gamboa, 1998; Bergmann, 1999). Los test aparecen para poder comparar las muestras de otros focos diferentes del respiratorio y. más aún. pueden ser útiles para el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar (Pfyffer. 1996; Gamboa. 1997).
El test BACTEC TB NAP (para-nitro-
M. s c r o / u l a c e i i n i
vi. marínum Figura 53-3. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias fotocromógenas. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2.'' edición. Nueva York. SpringerVerlag, 1985. con autorización. )
M. x e n o p i
Figura 53-4. Árbol de decisión para la identificación de las micobacterias escotocromógenas habituales. Obsérvese que Mycobactenum szulgai es fotocromógeno a 25' C y escotocromógeno a 35 C y que Mycobacterium xenopi crece bien a 42C. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory Procedures in Clinical Microbiology. 2.- edición. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorización.) :
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Test de sensibilidad Actualmente se ha desarrollado una normativa estandarizada de sensibilidades de micobacterias únicamente para M. tuberculosis aislado. El estudio puede realizarse con colonias aisladas o en los viales positivos BACTEC 12B (test indirecto) o de muestras de esputo con baciloscopia positiva (test directo). Tradicionalmente el método de proporción, un test modificado de dilución de agar. se ha utilizado para evaluar la sensibilidad de M. tuberculosis al tratamiento. Con este método los gérmenes aislados que muestren alguna resistencia mayor del 1% se consideran resistentes a esa concentración de fármaco. Los resultados están disponibles en un minimo de 21 días. El sistema BACTEC TB460 también puede ser utilizado para estudiar la sensibilidad de las MTBC. estando disponibles los resultados en 5-7 días. Una descripción más detallada de estos procedimientos se puede encontrar en otros textos (Hawkins, 1991). Acerca de la posibilidad de la multirresistencia de M. tuberculosis, expertos del CDC recomiendan que se informe del resultado de la sensibilidad en menos de 28 días tras la recepción de las muestras, un plazo que en la actualidad sólo puede ser logrado por el BACTEC TB (Tenover, 1993).
M. chelonae subespecie abscessus
V/. chelonae subespecie borstelense
Figura 53-5. Árbol de decisión para la identificación de micobacterias con un rapi do crecimiento con importancia clínica. Los asteriscos indican que se necesitan tesi bioquímicos adicionales para su diferenciación. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia En Washington JA II [ed.]: Labotatory Procedures in Clinical Microbiology. 2. ed. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorización.) 1
M. intracellulare. M. gordonaey M. kansasii están actualmente disponibles. Estos estudios requieren un equipamiento mínimo (p. ej.. luminómetro, estufa, etc.). Las desventajas de las pruebas incluyen errores en la identificación de un pequeño porcentaje de los MAC aislados (3%-5%) y resultados talsos positivos con la prueba de MTBC (Butler, 1994; Lebrun, 1992; Bull, 1992). La cromatogralía con gas líquido, la cromatografía con líquidos de alto rendimiento y la cromatografía de capa fina permiten identificar colonias de micobacterias en un medio sólido en 2-4 horas. Estas técnicas, dado que son complejas y requieren un equipamiento caro, suelen realizarse preferentemente en laboratorios de referencia o de investigación. Rara vez puede resultar imposible identificar una micobacteria por los métodos previos. Un ejemplo es M. genavense. cuya identificación requiere la determinación de las regiones hipervariables de los genes ARN ribosomales 16S. Estas pruebas altamente sofisticadas sólo se llevan a cabo en laboratorios de referencia o de investigación.
También se puede estudiar la sensibilidad de las micobacterias no tuberculosas que tengan importancia clínica (Wallace. 1997): sin embargo, para algunas especies puede existir cierta correlación entre los test de sensibilidad y la respuesta clínica al tratamiento. Además, no hay métodos de referencia estandarizados para estudio de sensibilidad de algunos de esos organismos. Los métodos usados son el método de proporción, ensayos radiométncos y microdilución del caldo de cultivo. Para M. lortuitum-chelonae complex aislado se recomienda hacer la microdilución y test con amicacina. celoxitma. ciprotloxacino, clarilromicina, doxiciclina, imipenem (sólo para M. lortuitum). sulfametoxazol y tobramicína (sólo para M. chelonae) (Woods, 1999). La dilución del caldo (tanto macrodilución como microdilución) debería ser usada únicamente para estudiar la sensibilidad de M. aviuma los macrólidos (clarilromicina yo acitromicina) (Inderlied. 1997: Wallace. 1997).
TRATAMIENTO Los aislamientos iniciales de Mycobacterium tuberculosis en todos los pacientes con tuberculosis deberían obligar a estudiar la sensibilidad a los tuberculostáticos de primera línea como isoniacida. rifampicina, piracinamida y elambutol. La sensibilidad deberia repetirse si el paciente continuase con esputo positivo tras tres meses de tratamiento (Tenover, 1993). Si el bacilo aislado es resistente sólo a rifampicina o a dos o más agentes de primera línea, también se debería evaluar la sensibilidad a los fármacos de segunda línea (estreptomicina, etionamída, kanamicína. capreomicina. ofloxacino y nfabutina). El régimen quimioterapéutico actualmente recomendado para el tratamiento de tuberculosis (Tabla 53-7) se debe iniciar antes de los resultados de sensibilidad, pero se debe alterar en función de los resultados si se demostrasen resistencias. La medicación se deberia administrar mediante observación directa. Los regímenes habitualmente empleados para el tratamiento de
CAPÍTULO 53
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la infección por micobacterias se recogen en la Tabla 53-7 (Inderlied. 1993; Wolinsky. 1979; Wallace, 1983, 1994, 1997; Horowictz, 1994). Para muchas micobacterias no tuberculosas la duración óptima del tratamiento se desconoce, pero los intervalos indicados en la Tabla 53-7 han sido exitosos en algunos casos.
MICOBACTERIAS
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la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de la vacuna BCG en los niños infectados por VIH al nacimiento o al poco tiempo del nacimiento. Está contraindicado su uso en niños con infección VIH asintomática o en poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es bap y en personas conocidas o con sospecha de estar infectadas por VIH (WHO. 1987).
Mycobacterium avium complex PREVENCIÓN Mycobacterium
tuberculosis
Se describen cuatro estrategias generales para el control de la tuberculosis (CDC. 1988). La más importante es la identiticación precoz y el adecuado tratamiento de personas con la infección tuberculosa. Esta medida hace que las personas infectadas dejen de ser contagiosas en pocas semanas y eventualmenle logra su curación. La segunda estrategia consiste en identificar y tratar a los individuos con tuberculosis no contagiosa: enfermedad extrapulmonar. enfermedad pulmonar primaria en niños, enfermedad pulmonar sin confirmación bacteriológica e infección por M. tuberculosis sin enfermedad (p. ej„ asintomáticos con test cutáneo positivo y radiografía de tórax normal). La tercera estrategia consiste en la creación de un ambiente de segundad en las situaciones en las que existe un alto riesgo de transmisión: salas de autopsias, habitaciones para recogida de esputo inducido, áreas de espera de pacientes respiratorios, centros penitenciarios, algunos refugiados sin hogar y los laboratorios de microbiología. Para llevar a cabo esto, se deben documentar muchos asuntos (Segal-Maurer, 1994). Las habitaciones de los pacientes infecciosos, o en las que las muestras infecciosas sean manejadas, deben estar a presión negativa y el aire que pueda contaminarse con microgotas infecciosas debe ser eliminado al exterior. Un sistema de ventilación de un solo paso (mejor mediante la colocación de unas salidas supletorias de aire en el techo y la entrada de aire cerca del suelo) es lo recomendable, con un mínimo de 6 recambios de aire por hora (12 recambios por hora en cuartos de autopsias). Deben seguirse estas precauciones universales cuando se manejan todas las muestras, y tanto las muestras como los cultivos se deben manipular en una cabina certificada de seguridad clase II. Además debe emplearse un respirador de partículas que filtre partículas entre 1 pm-5 pm de diámetro y se debe entrenar al personal dentro de un programa respiratorio. Las mascarillas quirúrgicas estándar no son adecuadas. La cuarta estrategia consiste en la vacuna del BCG, una vacuna atenuada derivada de una cepa de M. bovis de las francesas Calmette y Guérin. Su eficacia en la prevención de la tuberculosis es controvertida, pero un reciente metaanálisis de la bibliografía sugiere que reduce el riesgo de tuberculosis en un 50% (Colditz. 1994). En EE.UU. la vacuna BCG se recomienda sólo en niños con test cutáneo negativo y que pertenezcan a alguno de los siguientes grupos (CDC. 1988): 1) aquellos en contacto íntimo y prolongado con personas tratadas sin éxito o reticentes al tratamiento, con tuberculosis pulmonar contagiosa y que no se puede separar de la fuente de exposición y para los que el tratamiento preventivo a largo plazo no es posible, 2) aquellos expuestos continuamente a personas con tuberculosis por cepas resistentes a isoniacida y rifampicina. 3) aquellos grupos con una tasa de infección superior al 1% por año. y para los que los programas habituales de vigilancia y tratamiento han sido intentados pero no han sido viables. La vacuna BCG no se recomienda en los trabajadores de salud de EE.UU. La recomendación actual para la protección de los profesionales de la salud es una adecuada vigilancia que incluye períodos sistemáticos con test cutáneos (al menos anualmente, o más frecuentemente para los grupos de alto riesgo) y profilaxis con isoniacida para conversiones recientes del test de la tuberculina y para personas con test cutáneo positivo y que estén en contacto intimo con tuberculosos o que tengan patología médica como diabetes, insuficiencia renal o inmunosupresión patológica o terapéutica (CDC. 1988). La vacuna BCG no debe emplearse en inmunosuprimidos y debe darse con cuidado en aquellos con riesgo de infección por VIH. Se ha descrito enfermedad diseminada por M. bovis en pacientes con sida y adenopatías por M. bovis en niños infectados por VIH (CDC. 1985: Blanche, 1986). Sin embargo, la enfermedad diseminada por M. bovis no se ha descrito en pacientes con VIH asintomático. En poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es alto.
La enfermedad diseminada por MAC en pacientes con sida se asocia con gran morbilidad y una disminución de la supervivencia (Horsburgh. 1991: Nightingale, 1992). Más aún, lo más deseable seria la prevención de la entermedad. Dado que el MAC es ubicuo en el ambiente, la medida más razonable para la prevención es la inmunoregulación o la quimioprofilaxis. Actualmente, el Servicio de Salud Pública de EE.UU. y la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas recomiendan claritromicina o acitromicina de profilaxis en pacientes con sida con CD4- por debajo de 50 pl (CDC. 1997). La rifabutina es la alternativa para la profilaxis de la enfermedad por M. avium complex si ninguna de las previas fuese tolerable.
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CAPITULO 53
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C A P Í T U L O
54
Enfermedades micóh'cas Washington C. Winn, JR., M.D. M.B.A. Fred W. Westenfeld, MT(ASCP)SM
NOMENCLATURA, TAXONOMÍA Y TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
DERMATOFITOS 1159
Colonia de hongos Estructura de levaduras e hitas Pigmento de hifas Estructuras reproductoras asexuales
Inhibición por cicloheximida
CIGOMICETOS
Temperatura óptima para el crecimiento Dimorfismo Pruebas inmunologías 1166
Recogida de muestras Examen directo de muestras Aislamiento de hongos en cultivo Seguridad en el laboratorio Técnicas para el estudio morfológico de aislamientos fúngicos Test de sensibilidad de aislamientos fúngicos 1171
Género Candida Género Cryptococcus Género Malassezia Otras levaduras y patógenos semejantes a levaduras y saprofitos HONGOS DIMÓRFICOS
1184
Factores de nesgo y enfermedad clínica Patología de la infección por cigomicetos Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Especies de Rhizopus Otros cigomicetos
Pruebas bioquímicas
LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS
1185
Enfermedad clínica
Tasa de crecimiento
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Enfermedad clínica Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Especies de Microsporum Especies de Trichophyton Epidermophyton floccosum MOHOS DEMATIACENOS
Estructuras reproductoras sexuales
1181
1176
MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS) Factores de riesgo Enfermedad clínica Patología de la infección por hipomicetos Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Aspergillus fumigatus Aspergillus ftavus Aspergillus niger Otras especies de Aspergillus Especies de Fusarium Pseudallescheria boydii/Scedosporium apiospermum Especies de Penicillium Otros mohos hialinos INFECCIONEES CAUSADAS POR ALGAS ACLORÓFILAS
1190
PNEUMOCYSTIS CARINII
1191
Histoplasma capsulatum
Factores de riesgo
Blastomyces dermatitidis
Enfermedad clínica
Coccidioides immitis
Patogenia de las infecciones por Pneumocystis
Sporothrix schenckii
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones
Otros hongos dimórficos
La micologia médica se encuentra entre las diversas áreas de la microbiologia y enfermedades infecciosas que abarcan levaduras unicelulares y mohos filamentosos, agentes que causan infecciones superficiales de la piel y enfermedades sistémicas de localización profunda, patógenos históricos establecidos y hongos saprofitos que han alcanzado el estatus de patógeno por las enfermedades y tratamientos modernos. Para los patólogos que se han formado en patología quirúrgica, la micologia médica debería ser una adaptación natural. La identificación de hongos se logra en su mayoria por la
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BIBLIOGRAFÍA
1192
destreza humana en su observación mejor que con máquinas. El estudio macroscópico de la muestra quirúrgica se detiene en la morfología de las colonias de los hongos aislados en medio agar; mientras que en anatomía patológica, el análisis definitivo del problema debe esperar hasta que se observe al microscopio. La caracterización de la estructura molecular de las células para el uso de anticuerpos monoclonales no se ha desarrollado mucho en micología, pero se ha hecho una aproximación y el diagnóstico molecular será indudablemente de una gran importancia en el futuro.
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
El objetivo de este capítulo es presentar los lundamentos de la micologia médica, poniendo éntasis en los usos prácticos y los patógenos fúngicos que encontramos regularmente en el laboratorio. Llamamos la atención al lector de la existencia de algunos gérmenes potencialmente patógenos aislados con menor frecuencia. Hay varios textos de referencia excelentes que sirven de recurso para informarnos de hongos saprofitos no usuales que, cada vez más, están implicados en pacientes inmunodeprimidos como agentes causales (Kwon-Chung, 1992: Larone, 1995; Murray, 1999; Rippon, 1988; Sutton. 1998). Con el uso creciente de los protocolos inmunosupresores para trasplantes y quimioterapia de las enfermedades neoplásicas, todo hongo aislado debe considerarse como patógeno potencial. Hay que recordar que la infección invasiva puede producirse en personas que no están inmunodepnmidas, o incluso en aquellos que no tienen la enfermedad manifiesta. Los anatomopatólogos, micólogos médicos y los clínicos deben trabajar en equipo para proporcionar al paciente los mejores cuidados (Walker. 1982). Se produce una gran satisfacción en el equipo médico cuando se resuelve un problema clínico con un gran esfuerzo conjunto, pero el que más se beneficia de que exista una buena comunicación entre expertos es el paciente. El objetivo de este capítulo está en el laboratorio de micologia. Chandler y Watts (1987) han hecho un atlas de histopatologia de la infección fúngica que es excelente y comprensible. Las especies Prototheca son algas aclorófilas más que hongos. Se explican en este capítulo porque las características de las algas y las enfermedades que producen recuerdan más a los hongos que a cualquier otro agente infeccioso. El Pneumocystis cannii tiene características de protozoos y hongos. Aunque siempre se le ha englobado dentro de las enfermedades parasitarias, los estudios moleculares sugieren una relación más cercana a los hongos, por eso se le ha incluido en este capítulo.
NOMENCLATURA, TAXONOMÍA Y TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN El primer obstáculo para los micólogos principiantes es la nomenclatura y la taxonomía manual. Los miembros del remo de los hongos son células euca-
Tabla 54-1
rióticas que se reproducen de un modo tanto sexual como asexual. Se clasifican en función de la naturaleza de las estructuras reproductoras. Los estados sexuales de muchos hongos son desconocidos: estos organismos, conocidos como hongos imperfectos, se clasifican por sus estructuras reproductivas asexuales. Estos estados asexuales son, por supuesto, sólo imperfectos para los taxonomistas, la mayoría de los micólogos y. sin dudarlo, los hongos mismos son perfectamente felices con su estado incompleto. Una vez que la fase sexual, llamada teleomorfa, de los hongos se conoce, se reclasifica al organismo, aunque en la actualidad el nombre que antes se daba a la lase asexual imperfecta, llamada anamorfa. aún se conserva Por eiemplo. poca gente conoce Histoplasma capsulalum. Blaslomyces dermatitidisy Criptococcus neoformans por sus respectivos nombres teleomórficos, A/ellomyees capsulatus. Ajellomyces dermatitidis y Filobasidiella neoformans respectivamente. Por el contrario, la fase sexual Pseudatlescheria boydii y su fase asexual Scedosporium apiospermum sí que se reconocen en la práctica común. La mayor parle de la taxonomía de los hongos se debe a los detalles estructurales, porque la clasificación y la identificación en el laboratono dependen mucho de la morfología. En la Tabla 54-1 hay un resumen donde se explican los términos más importantes. En este capitulo nosotros rechazamos los complicados esquemas taxonómicos en favor de un concepto más simple de los patógenos que se encuentran habitualmente en el laboratorio. Para determinaciones prácticas, unas pocas características generales sirven como base para identificar los hongos en el laboratorio (Tabla 54-2). Como los micólogos están aprendiendo, día a día. más de hongos, la reclasificación de los organismos se produce de modo regular. McGinms (1999) ha resumido algunos de los cambios en la taxonomía y nomenclatura de los hongos importantes en el ámbito médico. La influencia de las técnicas moleculares sin duda irá creciendo de modo importante en la taxonomía de los hongos, como también lo hará el diagnóstico en un futuro cercano.
Colonia de hongos La característica más simple es la naturaleza de la colonia de hongos. Las levaduras son organismos unicelulares que por lo general se reprodu-
G l o s a r i o d e t é r m i n o s habituales e n micologia médica
Término Micelio aéreo Anamorla Ascoma Ascospora Ascos Clamidiospora Cleistoiecio Columela Célula conidiogénica Conidiofora Conidias Glabrosa Hifa Intercalaría Macroconidias Microconidias Moho Micelio Perilecio Pseudohifas Septo Esporangioforas Esporangiosporas Esporangios Telemorfa Terminal Micelio vegetativo Vesícula Levadura
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Definición Hila producida sobre la superficie del medio agar La forma asexual de un hongo La estructura que contiene un asco Hay muchos tipos de ascomas Espora sexual que contiene dentro un asco Estructura con forma de saco que contiene esporas sexuales También puede estar desnudo o contenido dentro de otra estructura Eslruclura superviviente Ascoma completamente encerrado, compuesto de capas de hitas Las ascosporas se libran por ruptura Extensión de esporangioforas en la base del esporangio La célula que produce conidias La estructura de la hifa especializada que lleva las conidias: es diferente de las células conidiogénicas Estructura reproductiva asexual formada de cualquier modo que no implica división Suave, referente a la morfología de las colonias La unidad vegetativa de moho; posee paredes paralelas Nacido dentro de una hifa La más larga de los dos lipos de conidias producida por el mismo modo La más pequeña de los dos tipos de conidias producida por el mismo modo Hongo filamentoso que se reproduce sexual o asexualmente Masa de hifas que adorna a un moho Ascoma cerrado con un poro en la parte superior, a través del cual las ascosporas son liberadas Serie de células levadunformes conectadas (blastoconidias) que recuerda a una hifa pero contiene áreas de estrechamiento entre células adyacentes Pared transversal en la hila Estructura de la hifa especializada que transporta el esporangio Espora asexual producida dentro de un esporangio Estructura con forma de saco en la que se desarrollan las esporangiosporas asexuales La forma sexual de un hongo Nacido en el final de una hifa Hifa que se ha producido en la superficie de un medio agar Célula alargada o hinchada, habitualmente en el final de una conidiofora o esporangiofora, pero puede hallarse dentro de una hifa Hongo de célula única que se reproduce por gemación o por fisión
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SECCIÓN VI
Tabla 54-2
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Características d e utilidad para la identificación d e h o n g o s
Característica Tipo de crecimiento microscópico Morfología de la levadura
Morfología de estructuras filamentosas
Pigmento de la hifa Morfología de las estructuras reproductivas asexuales Morfología de las estructuras reproductivas sexuales (demostrable sólo excepcionalmente) Tasa de crecimiento
Inhibición por cicloheximida Temperatura de crecimiento óptimo (ocasionalmente de interés)
Pruebas químicas
Conversión de fase moho a levadura Detección inmunología de antigenos o anticuerpos Característica molecular del ADN
Ejemplos Colonias de organismos unicelulares (levaduras) Colonias de organismos filamentosos (mohos) Gemación Gemación con pseudohifas Levadura redonda con capsula Levadura en gemación con collaretes Hitas verdaderas: septadas Hilas verdaderas no septadas o de septo escaso Pseudohifas No dematiaceno o hialino (ligero o moho pigmentado) Dematiaceno (oscuro) Conidias Esporas Ascos poras Cleistotecío Peritecio Lento (más de 10 días) Medio (de 5 a 10 días) Rápido (menos de 4 días) Muchos de los hongos saprofitos De 25"C a 30'C De 35°C a 37°C De 40°C a 42X De 5CTC a 58°C Asimilación Fermentación Degradación enzimálica (p. ej. ureasa) Aumento de crecimiento Feno-oxidasa (melanina) Sustiluida por mmunolusión o prueba de ADN en la mayoría de laboratorios Cryptococcus. Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces
cen de manera asexual por gemación para producir una célula hija. Como resultado, la masa de colonias de una levadura es una colección de organismos individuales distintos que, sin ser sorprendente, se parece a una colonia de bacterias en la superficie agar. Las colonias de levaduras por lo general son enteras (bordes regulares) y lisas. Cuando están amontonadas y apagadas, como es el caso de la Candida aibicans, las colonias pueden parecer de estafilococos. Las levaduras producen catalasa, por eso el microbiólogo imprudente que no haga una tinción de Gram o una preparación en fresco podría confundir una colonia de levaduras con una de bacterias y hacer un informe totalmente equivocado. Las levaduras encapsuladas. como el Criptococcus, pueden parecerse a bacterias encapsuladas. tal como Klebsiella pneumoniae. aunque equivocarse al identificadas en este caso es menos probable. Las pseudohifas de las levaduras por lo general son visibles al microscopio como extensiones filamentosas en los bordes de la colonia, y se conocen coloquialmente como "pies", como si la colonia fuera un ciempiés (Fig. 54-1).
je se ejemplariza por el hongo dimórfico. que exhibe una forma de moho bajo algunas condiciones y una forma diferente de moho en otras circunstancias. Los hongos dimórficos más importantes son patógenos sislémicos que se comportan como mohos en el ambiente y en el medio agar a 25"C-30°C. Por el contrario, en el tejido humano es una levadura o. en el caso del Coccidioides immilis, una esférula. Cuando se cultiva a 37 C, la forma del tejido se reproduce. Aunque estos patógenos clásicos es lo que por lo general entendemos por hongos dimórficos, otros agentes menos comunes también muestran dimorfismo. Por ejemplo, el Penicillium mametfei, un miembro distinguido de ese género tan extendido, crece como un moho en un medio de
Al contrario que las levaduras, los mohos son hongos filamentosos y multicelulares. La naturaleza filamentosa del moho da a las colonias una apariencia lanuda, de pelusa o aterciopelada, alguna vez puntual con un aspecto granular o de polvo, que se produce por la formación de estructuras reproductoras asexuales (Lámina 54-1). En otras ocasiones la colonia puede tener una apariencia glabrosa (lisa). La línea de diferenciación entre mohos y levaduras no está totalmente definida. Algunas levaduras también desarrollan un componente filamentoso que en algunos casos podría verse macroscópicamente. Ya se han mencionado antes las extensiones filamentosas de las colonias de C. aibicans. Otras levaduras desarrollan extensiones filamentosas desde la superficie de la colonia, siendo semejante al crecimiento de pelo de la cabeza de un científico loco. Las especies Trichosporon son levaduras que desarrollan extensiones filamentosas, mientras que la Exophiala ¡eanselmei es una levadura dematiacena que desarrolla un micelio según madura. Lo último en camufla-
Figura 54-1. Extensiones filamentosas desde la periferia de las colonias de Candida albicans que se conocen coloquialmente como pies
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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Figura 54-2. Hilas con ramificaciones septadas de Aspergillus lumigatus. Las Figura 54-4. Cadenas de una levadura alargada de Candida albicans que produramas de las hilas tienen ángulos agudos. Esputo expectorado (tinción de Gram). cen pseudohifas. La unión de las levaduras individuales es aún evidente en esta preparación. Adviértase que las paredes celulares de estas pseudohifas no son paralelas. (Tinción de Gram.)
laboratorio a 25"C-30"C, pero en los tejidos humanos lo encontramos como forma de levadura. Los cuerpos escleróticos que encontramos en los tejidos de los pacientes con cromoblastomicosis son una forma vegetativa detenida entre una forma moho/levadura de los hongos dematiacenos. que aparecen como mohos cuando crecen en un medio sólido a temperatura ambiente. El Cokeromyces recurvatus es un patógeno humano raro que tiene mortologia de levadura en infecciones humanas in vitro a 37 C, pero crece como moho a 25°C-30°C (McGough, 1990). La Malassezia fúrfures un ejemplo de dimorfismo reversible, que produce tanto células levaduras como hilas en las lesiones cutáneas de la pitinasis versicolor. En el laboratorio es raro encontrar la forma de hifa. salvo que haya unas condiciones de cultivo especiales (Marcon,1992).
Estructura de levaduras e hitas La mortologia (o ausencia) de formas filamentosas es una característica importante para la identificación de las levaduras y mohos. La estructura filamentosa de los mohos se relaciona con una hifa. Un conjunto de hilas se conoce como micelio. El micelio que crece en la superficie del agar o en el agar se conoce como micelio vegetativo, mientras que las extensiones filamentosas por encima de la colonia se llaman micelios aéreos. Las hifas verdaderas pueden tener paredes perpendiculares que contienen poros para la comunicación a través de las hifas o paredes perpendiculares completas que dividen a la hifa en múltiples células. Las hifas que tienen paredes perpendi-
culares están septadas (Fig. 54-2), mientras que aquellas sin paredes perpendiculares están sin septar (Fig. 54-3). Una vez más. la situación es una sombra gris más que blanca y negra. Algunos hongos que tienen hifas septadas también tienen hifas especiales septadas o sin septar (conidioforas) que tienen estructuras reproductivas asexuales. A la inversa, algunos hongos llamados hongos no septados tienen en ocasiones paredes cruzadas, y quizá debería llamárseles de septo escaso. Es importante, por tanto, evaluar el micelio integramente. La anchura de la hifa y el ángulo de las ramas son pistas importantes para identificar la cepa. Entre dos de los mohos patógenos no invasivos clásicos, los cigomicetos, como el Rhizopus spp., tienen hifas anchas con forma de cinta y sus ramas en ángulos rectos (véase Fig. 54-3), mientras que el Aspergillus spp. y la mayoría de los otros mohos hialinos tienen hifas más estrechas y ramas en ángulos agudos (dicotómicamente) (véase Fig. 54-2). Además, el incremento en el uso de terapias inmunosupresivas y la aparición de enfermedades inmunosupresivas, como el VIH, han aumentado la frecuencia con que los hongos saprofíticos comunes producen enfermedades invasivas (Ftinaldi. 1991). Determinar a un hongo como Aspergillus en función de la morfología de la hifa en una extensión o en una muestra de tejido es en realidad sólo una afirmación de las rarezas a pnori para este grupo de patógenos. Es mejor describir simplemente las características de la hifa. Cuando las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, la célula hija por lo general aparece al final de una célula levadura y con el tiempo se extiende hasta formar una nueva célula levaduriforme Si una serie de las células hijas no se separa enteramente de la célula original, se produce una pseudohila. Las pseudohifas se distinguen de las hifas verdaderas por la presencia de una estenosis en la unión de las células adyacentes, por la localización uniforme del septo en un punto de la rama del micelio y porque la talla de la célula hija llega a la de la madre o menos (Fig. 54-4). Por el contrario, las paredes de las hilas verdaderas son paralelas sin estenosis (véase Fig. 54-2). C. albicans y algunas cadenas de Candida tropicalis pueden producir tanto hifas verdaderas como pseudohifas, dependiendo de las condiciones de crecimiento, y diferenciar la Candida del Aspergillus en una muestra de tejido en ocasiones puede ser problemático. Por el contrario, el Cryptococcus spp. produce sólo levaduras gemadas y en raras ocasiones pseudohifas primitivas o rudimentarias, pero no forma verdaderas hifas.
Pigmento de hifas
Figura 54-3. Hifas anchas, no septadas, de un ogomiceto en tejido cerebral En la hila hay una rama en ángulo recto. (Hematoxilina-eosina.)
Las hifas del hongo dematiaceno contienen un pigmento de melanina que da coloración marrón a las hifas en las preparaciones microscópicas y hace que las colonias de los hongos parezcan verde oscuro, marrón o negro (Lámina 54-2). Los tintes que se utilizan para teñir las extensiones.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
las preparaciones frescas o las secciones histológicas pueden oscurecer el color parcialmente, lo cual puede demostrarse en preparaciones sin teñir. La apariencia macroscópica de los hongos dematiacenos varía desde el verde oscuro hasta el negro, pasando por gris. Estos hongos que carecen de pigmento hifal oscuro se llaman comúnmente hialinos (claros o incoloros). Algunas autoridades prefieren no utilizar este término, porque una pigmentación clara puede producir colonias de colores. Además, las estructuras reproductivas asexuales de algunos mohos hialinos pueden tener pigmentos verdes, marrones o negros que dan color a la superficie de la colonia una vez que se han formado las estructuras reproductoras, La apariencia real de estos mohos, por lo general, puede comprenderse al observar la parte de atrás de la colonia, que mantiene una coloración clara. Por el contrario, tanto la parte de delante (anverso) como la parte de atrás (reverso) de las colonias de dematiacenos suelen mostrar el pigmento oscuro. Aunque el C. neolormans no se considera un hongo dematiaceno. el que esta levadura produzca melanina nos da una pista para identificarlo. Las células de la levadura del C. neolormans no están pigmentadas, pero podemos encontrar melanina en la levadura y en las hifas pigmentadas de los hongos dematiacenos por el método de tinción Fontana-Masson para pigmentar melanina (Ro, 1987). En ocasiones, el pigmento marrón no lo encontramos en los hongos que consideramos dematiacenos. Es importante aclarar que, sin embargo, en ocasiones los hongos no dematiacenos pueden teñirse con el tinte Fontana-Masson, por eso es muy importante considerar otras características diagnósticas, incluyendo la morfología de las hifas (Kimura. 1998).
Estructuras reproductoras asexuales El primer punto para identificar los mohos es la caracterización de las estructuras reproductoras asexuales. En las levaduras, estas estructuras sirven como pistas auxiliares en la identificación. Las dos principales estructuras asexuales son las esporas y las conidias. Las esporas de modo natural pueden ser sexuales o asexuales, mientras que las conidias son siempre asexuales. Estrictamente hablando, las esporas asexuales siempre se producen por división dentro de una estructura que abarca que se llama esporangio y las esporas se llaman esporangiosporas (Fig. 54-5). Las conidias, que son mucho más diversas, se forman por la diferenciación de la punta o el lado de una hifa fértil, como la conidiolora. o por la diferenciación de la hifa misma. Desgraciadamente, el uso adecuado de los términos conidia y espora en la bibliografía, es muy pobre, y la coherencia es peor. Los términos espora y esporulación se usan como términos para reproducción asexual, y el término espora se usa algunas veces cuando hubiera sido más preciso usar conidia. Kwon-Chung y Bennet (1992) han señalado que el modo en que se produce la esporulación puede ser tan importante como la
Figura 54-5. Las esporangioforas de Rhizopus spp soportan esporangios, que contienen esporangiosporas. Los rizoides surgen de las hilas cercanas al origen de las esporangioforas (lactofenol algodón azul). (Fotografía cortesía del Centers lor Disease Control and Prevention.)
Figura 54-6. Levaduras en gemación y sin gemar de Candida albicans (tinción de Gram).
morfología de la conidia, y ponen como ejemplo la diferencia entre hongos dematiacenos, como Drechslera spp. y Helmlnihosporlum spp., que no son patógenos humanos, y Bipolaris spp., que en ocasiones es un patógeno humano. El principal mecanismo de reproducción asexual de las levaduras es la gemación. El proceso comienza como una suavización de la pared celular de la célula madre, seguida por una expansión de la pared celular (reventón). Un tabique cierra el límite entre la célula hija y la madre (Fig. 54-6). Si no hay separación, el resultado, como se dijo anteriormente, es una pseudohifa. Esta gemación clásica da como resultado una blastoconidia según Rippon, o una blastoespora según Kwon-Chung y Bennet. Menos corriente es la división transversa que se produce en P. marneffei. Los trozos de micelio vegetativo que se diferencian en conidias se llaman células conidíogénicas. Las hifas especializadas que sostienen las conidias se llaman conidioforas. que pueden ser tanto una célula conidiogémca que crece del micelio vegetativo como una hifa de soporte. En el caso del Aspergillus spp. la conidiofora. que está sin septar. alarga la cola hasta formar una vesícula hinchada (Fig. 54-7). De esa vesícula, las células conidíogénicas. que se llaman fiálídes. crecen para sujetar las cadenas de conidias. Algunas especies de Aspergillus producen una fila de fiálídes, que se produce en una hilera de células estériles, con las conidias que crecen de las fiálídes distales. Los cigomicetos producen estructuras de soporte llamadas esporangioforas, en las cuales los esporangios y las esporangiosporas se
Figura 54-7. Cabezas de Aspergillus lumigatus. Las conidioforas están aumentadas en el extremo formando una vesícula. Las fiálídes surgen de la mitad superior de la vesícula, y las cadenas de conidias se colocan paralelas al eje longitudinal de la conidiofora. (Lactofenol anilina azul.)
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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Figura 54-8. Las porciones de los micelios de Coccidioides immitis se nan díteFigura 54-10. Microconidias alargadas de Trichophyton tonsurans alineadas a lo rendado en artroconidias. Por olro lado, las artroconidias con lorma de barril están largo de la superficie de la hitas (lactofenol anilina azul), separadas por unas células vacias de pared fina (lactofenol anilina azul).
desarrollan en las colas (véase Fig. 54-5). Una extensión del ápex de la esporangiospora en el esporangio se denomina columela. La conidiogénesis lálica es un proceso en el que la conidia no se desarrolla hasta que se forma un tabique entre ésta y la célula madre. La conidia se origina de toda la célula madre. Los patógenos humanos más importantes que tienen una conidiogénesis tálica son los dermatofitos y los hongos dimórlicos C. immitis. Según progresa la conidiogénesis. la artroconidia producida por Coccidioides se rompe fácilmente, liberando un gran número de conidias en forma de barril que se diseminan fácilmente y que termina con un alto grado de infectividad que demuestra este importante patógeno humano (Fig. 54-8). La conidia tálica de los dermatofitos se divide en dos tipos según el tamaño: macroconidias grandes, que tienen septaciones (Fig. 54-9), y microconidias unicelulares, que son estructuras más simples (Fig. 54-10). El olro tipo de conidiogénesis es la blástica, en la que el protoplasma de la célula conidiogénica se rompe dentro de la conidia. La forma más simple de la conidiogénesis blástica es el método de gemación, por el cual se desarrollan muchas levaduras, incluida la Candida. Como con las conidias tálicas, dividimos las blastoconidias en dos tipos, dependiendo de si toda la pared se incluye en el proceso. Habría que hacer una división adicional entre las especies en las que la pared celular externa no participe en la conidiogénesis (enteroblástica). Las fiálides son células conidiogénicas
Figura 54-9. Múltiples macro conidias cortas, con forma de porra de Epidermophyton lloccosum. Alguna de las comdioforas están ramificadas, y las microconidias están ausentes. (Lactofenol algodón azul.) (Fotografías cortesía del Centers for Disease Control and Prevenlion.)
que tienen un collarete en los ápices, que se produce cuando la cola libera la primera conidia. El collarete puede ser una estructura con lorma de termo visible, como en la Phialophora spp., o una estructura invisible, como en el Aspergillus spp. Por el contrario, los anélidos son células conidiogénicas que se rompen para liberar un anillo de material celular en la base de la conidia cuando se separa de la anélida. La formación de conidias secuenciales en la base empuja a la célula mas vieja a la cola de la cadena, y así deja una sene de anillos o anelaciones en el ápex de la anélida. registrando sucesos anteriores, como anillos en un árbol. Es difícil ver algunos de estos pequeños detalles con la luz del microscopio. La diferenciación de varias estructuras de conidias es la clave para la adecuada identificación de las muestras aisladas. En algunos casos, las características morfológicas se comprenden fácilmente. Como en la patologia quirúrgica, reconocer el patrón es una herramienta importante para identificar la mayoría de los patógenos saprofitos. Es importante apreciar las características de la morfología de la totalidad de la preparación sin localizar en estructuras aisladas o aberrantes, lo mismo que es importante para el patólogo dedicarse al tejido patrón sin distraerse por células atípicas ocasionales. Las estructuras conidiales en desarrollo del Aspergillus o Paecilomyces. pot ejemplo, pueden parecerse a las estructuras del Penicillium. y el observador puede confundirse al pensar que hay dos mohos presentes. También hay que recordar la posibilidad de un cultivo mixto. Un micólogo con grandes conocimientos debe usar un objetivo de bajo aumento para la observación inicial. En todas las disciplinas morfológicas, sin embargo, el hallazgo de detalles celulares con el bajo aumento obliga a un análisis más detallado con mayor aumento. El excelente arte del diagnóstico micológico descansa en la apreciación y diferenciación de los detalles celulares y. en algunos casos, la tarea requiere una experiencia considerable. Algunas veces el aislado debe ser incitado a producir las estructuras necesarias para el diagnóstico por la selección del medio adecuado (Tabla 54-3). En general, el medio enriquecido favorece la preparación del micelio vegetativo, mientras que las estructuras reproductoras asexuales se fomentan en el medio basal. El subcultivo en agar agua o agar patata es una técnica usual para fomentar el desarrollo de las estructuras de las conidias. El agar zumo V-8 se ha usado para el estudio de estructuras de conidias en hongos dematiacenos y para el tomento de la formación de ascosporas en Saccharomyces. El color de las colonias de Aspergillus se estudia mejor en agar Czapek-Dox. mientras que el Trichophyton rubrum lo fomentamos para producir un pigmento rojo en agar patata o agar cornea con glucosa al 1%. Quizá lo último en un medio especial es agar de estiércol de pájaro filtrado, desarrollado por Staib y Blisse (1982) para estudio del C. neolormans. La experiencia también es importante para determinar si un subcultivo se ha incubado el tiempo suficiente para que se formen las estructuras diagnósticas. Las estructuras semejantes raices (rizoides) que se desarrollan
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 54-3 Medios suplementarios para la identificación de hongos Medio Agar córnea con Tween 80 Medio de ascosporas. agar V-8 Agar dextrosa patata con glucosa al 1% Agar patata Agar C/apek-Dox Agares de Trichophyton Agar de semilla de pájaro (negro) Infusión de corazóncerebro con sangre Agar urea Christensen Cullivo con diferentes agares
Función Visualizar la morfologia de la levadura Desarrollo de las ascosporas Desarrollo del pigmento do Trichophyton rubrum Desarrollo del pigmento de Trichophyton rubrum: morfología del moho Identificación de especies de Aspergillus Diferenciación de las especies de Trichophyton Demostrar la melanina en Cryptococcus neolormans Puede aumentar el aislamiento de hongos dimórficos Diferenciación de Trichophyton rubrum del Trichophyton mentagrophytes Estudio de la estructura microscópica y su origen
a partir de la hifa de algunos cigomicetos son características diferenciadoras importantes, pero no pueden detectarse si se hace una observación precoz. Debe admitirse que algunas de las técnicas para una diferenciación completa son difíciles, o están incluso por debajo de lo que la mayoría de los laboratorios alcanza. Por ejemplo, el patógeno dematiaceno Exophiala (Wangiella) dermatitidis produce conidias blásticas con fiálides y anélidas. Sin embargo, no se reconoció la presencia de anélidas cuando lo miraron con un microscopio de luz óptica, y este organismo ha sido alguna vez clasificado como Phialophora dermatitidis. El reconocer que las anélidas eran formadas por la muestra aislada condujo a asignar un nuevo género, Wangiella dermatitidis, que contenía fiálides y anélidas. Hay un desacuerdo entre si estas especies deberían estar en el género Exophiala o Wangiella (McGinnis, 1999). A pesar de lodos los esfuerzos, algunas cepas no producen estructuras reproductivas asexuales. En las colonias queda pelusa, y consiste sólo en hifas aéreas y vegetativas morfológicamente. Estas hifas se describen como hifas estériles o micelios estériles.
Estructuras reproductoras sexuales Las estructuras reproductoras sexuales en ocasiones son de valor en el laboratorio de micología para identificar patógenos comunes y saprofitos. Se pueden producir una gran variedad de estructuras sexuales, pero la mayoría de ellas no suelen encontrarse. Las dos estructuras más frecuentemente documentadas son ascis desnudos de Saccharomyces cerevisiae y el cleistotecio de Pseudallescheria boydii (la fase sexual de Scedosporium apiospermum). Aspergillus nidulans, o el grupo de Aspergillus glaucus. Los ascis desnudos del Saccharomyces recuerdan a células ovaladas de la levadura en las que hay de una a cuatro ascosporas individuales haploides (Lámina 54-3). La formación de ascosporas en Saccharomyces spp. puede fomentarse al incubarlo en cierto medio agar, como agar zumo V-8, pero este esfuerzo por lo general no es necesario, porque con los sistemas comerciales de identificación de levaduras pueden identificarse bioquímicamente. Las ascosporas pueden visualizarse en preparaciones frescas, pero se detectan de un modo más fiable con un tinte resistente al ácido.
para que aparezcan las colonias. El significado de las colonias de hongos de crecimiento rápido, que aparecen después de una incubación prolongada en el medio micológico. debe cuestionarse como posibles contaminantes. Sin embargo, hay excepciones para esta generalización. C. immilis, que es un patógeno clásico, crece relativamente rápido y podría incluso recuperarse en las placas de agar en el laboralorio bacteriológico si la incubación es grande. Aspergillus spp.. Scedosporium apiospermum, los cigomicetos y muchas levaduras crecen rápido. Entre los dermatofilos, el porcentaje de crecimiento es una característica importante y podría ayudarnos a identificarlos.
Inhibición por cicloheximida La falta de inhibición por la cicloheximida también es una pista útil para ver la presencia de patógenos, especialmente entre los hongos dimórficos y dermatofitos. El agar micosel y micobiótico. que se utilizan normalmente como medio para aislar, contienen 0,04%-0,05% de cicloheximida. Un hongo que tiene un crecimiento lento en un medio que contiene cicloheximida debería alertar al micólogo de la posibilidad de que esté presente un hongo dimóríico, o que, con una clínica compatible, se haya aislado un dermatofito. Una vez más, hay excepciones importantes para esta regla. Los cigomicetos y C. neolormans se inhiben completamente por la cicloheximida. Las especies de Aspergillus y algunas especies de Candida se inhiben parcial o totalmente.
Temperatura óptima para el crecimiento El crecimiento a temperatura elevada es en ocasiones una herramienta diferencial para identificar los hongos (Kwon-Chung, 1992). La mayoria de los hongos y levaduras crecen a 25°C-30°C. El patógeno más importante en el género Cryptococcus es el C. neolormans, que es, y no por coincidencia, el único que crece bien a 37 C. Como crece rápido, con frecuencia tiene que ser el primer patógeno en aislarse en las placas agar incubadas a 35"C-37"C en el laboratorio bacteriológico. El Trichophyton verrucosum produce distintas cadenas de clamidosporas cuando se incuba a 37 C. El crecimiento del Cladosporium trichoides (bantianum) a 42°C-43°C es un modo fiable para diferenciar estas especies de otros miembros del género. Asimismo, muchas Exiophiala dermatitidis aisladas crecen a 40' C, mientras que el E. jeanselmei, con una morfología similar, no crece a temperaturas por encima de 37°C. Determinar el rango de temperatura al que crecen es una medida útil para diferenciar entre algunos miembros de los cigomicetos (Kwon-Chung, 1992).
Pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas son las ideales para identificar las levaduras, y en ocasiones son útiles para identificar los mohos. La caracterización bioquímica puede acompañarse por un estudio de fermentación o asimilación de
Un cleistotecio es un cuerpo sexual en forma de fruta en el que están las ascosporas totalmente encerradas y sólo pueden liberarse por la ruptura de la pared del cleistotecio (Fig. 54-11). La pared se compone de una o varias capas de hifas especializadas. Un peritecio es similar a un cleistotecio. pero tiene una abertura en el ápex de la estructura en forma de pera.
Tasa de crecimiento La tasa de crecimiento de los hongos aislados proporciona una pista útil para posibilidades diagnósticas. En general, los hongos patógenos dimórficos y los dematiacenos crecen despacio, necesitando une. semana o más
Figura 54-11. Se pueden ver ascosporas dentro de un cleistotecio del grupo de Aspergillus glaucus (lactofenol anilina azul).
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
patrones, de los cuales la asimilación de patrones se usa exclusivamente en la mayoría de los laboratorios. La fermentación de los carbohidratos es el uso anaeróbico de los carbohidratos con la producción de gas. Esta técnica es válida para identificar las especies de Candida, pero no para las especies de Cryplococcus. La asimilación, que por lo general es un método que se aplica mucho, comprueba la capacidad de una muestra aislada para utilizar, como única fuente de carbón necesario para crecer, un carbohidrato o un nitrato, como la única fuente de nitrógeno. El método auxanográfico Wickerham utiliza un medio basal en el que un nitrato o un carbohidrato determinado sirven de nutrientes. El crecimiento de las levaduras es el punto final de un test positivo. Este método de referencia tan enrevesado no se explicará, porque en la mayoria de los laboratorios se ha sustituido por uno de los cinco sistemas de identificación comerciales: API 20C (BioMérieux. Hazelwood, MO), Sistemas Vitek (BioMérieux. Hazelwood. MO), MicroScan (Baxter Sistemas de Salud. Sacramento. CA). el Sistema UniYeastTek (Laboratorios Remel, Lenexa, KS) y el RapID Yeast Plus System (Sistemas de Diagnósticos Novedosos, Norcross, GA). Los cinco sistemas funcionan bien, según la bibliografía y los test de inspección profesional del College ol American Pathologists (Buesching. 1979: Fenn, 1994: Riddle, 1994: ElZaatari. 1990). El API 20C se ha visto que se puede comparar con los sistemas bioquímicos convencionales (Buesching. 1979). y ahora está considerado el de referencia entre los sistemas comerciales. Una evaluación de unos datos recientes para el sistema Vitek mostró una actuación idéntica para el API 20C (ElZaatari, 1990). El sistema Vitek tiene un pequeño margen, según han juzgado unas empresas profesionales, y será particularmente atractivo para laboratorios que usan esta metodología en su sección bacteriológica. El sistema RapID lo identifica en aproximadamente 4 horas (Kitch, 1996; Smith. 1999). Independientemente del sistema elegído. es importante estudiar la mortologia de las levaduras. Además de la fermentación y de los estudios de asimilación, hay un test secundario por el cual se estimula el crecimiento de unos componentes químicos para asi diferenciar ciertos Trichophyton spp. Incluir mositol y tiamina en varias combinaciones de medio agar (agar Trichophyton) permite hacer una valoración de las propiedades de estimulación del crecimiento. El punto final del test, crecimiento relativo en comparación con un medio basal. es subjetivo y se deben incluir tanto los controles positivos como los negativos. Tradicionalmente. la identificación de la fenol oxidasa era un test diagnóstico importante. La fenol oxidasa en el C. neoformans oxida los componentes difenólicos para producir un pigmento marrón. El sustrato original que se usaba para identificar esta característica era ácido cafeico en células de semillas negras (test Staib), aunque después se añadieron otros componentes, como la L-dopa y L- dopamina. El test de la oxidación del fenol no es suficiente él solo para identificar el C. neoformans, y con la introducción de sistemas de identificación comerciales, que son eficientes, se ha disminuido su uso en los laboratorios clínicos. Por el contrario, el test de producción de ureasa en los criptococos es de gran utilidad en el laboratorio clínico para diferenciar los Criptococcus de Candida spp.. particularmente en muestras respiratorias. El C. neoformans es un patógeno pulmonar sistémico. mientras que Candida spp. son habitantes frecuentes de las vías aéreas altas, pero no es causa común de neumonías primarias. La ureasa puede ser producida por otras especies no patógenas de criptococos, por especies de Rhodotorula y por algunos aislamientos de Trichosporon beigeliiy Candida krusei. La producción de ureasa puede comprobarse por la inyección de levaduras aisladas en una preparación con agar urea de Christensen o en caldo de urea. La alcalinización del medio después de la producción de NH, por parte de los organismos que producen la rotura de la urea se detecta al meter en el sistema un indicador de pH. Zimmer y Roberts describieron un método rápido que proporciona resultados fiables y útiles en 15 minutos para ir eliminando levaduras de un estudio más a fondo (Zimmer, 1979) (Tabla 54-4). Hay que tener mucho cuidado para no incluir las bacterias que rompen la urea en lo inyectado, como las de la especie Klebsiella. que encontramos ocasionalmente en muestras respiratorias. Las colonias que tienen pseudohifas vistas macroscópicamente (pies) o que crecen en un agar que tiene cicloheximina no necesitan analizarse, porque el criptococo no produce pseudohifas in vitroy no crece con la cicloheximida. Hay un lest de asimilación especial para el KN0 que es el que se utiliza en primer lugar para diferenciar entre las especies de los géneros dematiacenos. Exophiala (Sutton. 1998). 3
Tabla 54-4
1165
Prueba rápida de la ureasa para el screening de las levaduras aisladas de m u e s t r a s respiratorias
1 Colocar un tapón estéril en un caldo de ureasa. Apretar el tapón contra el lado del contenedor del caldo de ureasa antes de removerlo para eliminar el exceso de caldo El tapón debe saturarse, no motarse. 2 Tocar ligeramente todas colonias aisladas que se van a estudiar con el tapón saturado i 3 Colocar el tapón saturado en un tubo estéril etiquetado j 4 Colocar el tubo con el tapón en un baño de agua a 56°C durante 15 minutos j 5 Retirarlo del baño de agua y examinar la existencia de pigmento rosa, que indicarla que es positivo Se deben realizar controles positivos (especies de Cryplococcus) y negativos (Candida albicans) al mismo tiempo.
Los test bioquímicos tienen un papel auxiliar en la identificación de los mohos dermatofíticos. La producción de ureasa dentro de los cuatro primeros días ayuda a diferenciar el Trichophyton mentagrophytes (positivo para la ureasa) del 7! rubrum (ureasa negativo). El aislamiento debería ser subcultivado en una preparación agar ureico de Christensen e incubarse a 25 C-30 C durante al menos tres días. Una reacción positiva es una gran producción de ureasa, que se evidencia por una alcalinización del medio. Si los test bioquímicos son el corazón de los sistemas de identificación de las levaduras, la confirmación de la identificación a través del análisis de la mortologia de la levadura en un medio agar es el alma. Utilizar la observación morfológica como comprobante puede evitar grandes errores que se cometerían si se confiara enteramente en los sistemas automatizados.
Dimorfismo La demostración del dimorfismo es el acercamiento tradicional para identificar definitivamente un grupo de patógenos sistémaos. En la mayoría de los laboratorios el aislamiento inicial es la fase moho, porque las placas, por lo general, se incuban a 25°C-30°C. La conversión a fase tejido se acompaña por una incubación a 37'C de un subcultivo. La transición de la morfología moho a la de levadura puede producirse equivocadamente, y las formas de hifa generalmente se mezclan con las células de levaduras. Algunos aislamientos puede que nunca logren convertirse. Un medio rico, como agar infusión cerebro-corazón con suplemento sanguíneo, tendría que ser incluido, sobre todo cuando se trabaja con H. capsulatum. El agar infusión cerebrocorazón o agar algodón están recomendados para la conversión del B dermatitidis. Los medios para la conversión del C. immilis se han descrito, pero por lo general no se utilizan. De modo similar, la inoculación en animales es infrecuente que se utilice en laboratorios clínicos. La introducción del test inmunológico para exoantigenos lúngicos en cultivo, o caracterización molecular de ácidos nucleicos, ha simplificado considerablemente la tarea de la identificación definitiva y ha eliminado la necesidad de mostrar ambas fases en los hongos dimórficos. El test de exoantigenos para C. immitis. H. capsulatum y B. dermatitidis está disponible comercialmente. Los test de hibridación de ácidos nucleicos para estos tres patógenos dimórficos y para C. neoformans están comercializados por Gen-Probe, Inc (San Diego, CA). Estos test han sustituido la fase de conversión en muchos laboratorios. El sistema GenProbe se utiliza para detectar la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, o para la identificación de ciertos patógenos bacterianos, incluida la micobactena. En los laboratorios que utilizan la tecnología Gen-Probe, el acercamiento molecular podría proporcionar una alternativa atractiva a la inmunodilusión para identificar los aislamientos. Si la fase de levadura del patógeno se ha demostrado anteriormente o recientemente en extensiones directas, o en el laboratorio de patología quirúrgica, la conversión de la fase moho correspondiente en el laboratorio de micologia es superflua.
Pruebas inmunológicas Las pruebas inmunológicas son válidas para detectar antígenos y anticuerpos o para seleccionar patógenos fúngicos. Las pruebas serológicas clásicas han sido unos test de fijación del complemento contra los principales patógenos dimórficos. H. capsulatum. B. der-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
matitidis y C. immitis. Posteriormente se desarrollan test de inmunodifusión contra varios antigenos del H. capsulatum. El acercamiento serológico funciona mejor para el diagnóstico y pronóstico de la coccidioidomicosis. Las extensas reacciones cruzadas entre H. capsulatum y B. dermatitidts comprometen la efectividad de los test. La detección de anticuerpos para Aspergillus spp. en el suero ayuda en el diagnóstico de aspergillosis broncopulmonar alérgica, pero es de poca utilidad en el diagnóstico de enfermedad invasiva (Kurup, 1991). Los anticuerpos que más comúnmente precipitan se han detectado con la técnica de inmunodifusión. pero también se utilizan métodos más modernos, como el ensayo inmunosorbenle de la unión de enzimas (ELISA). Algunas autoridades han cuestionado la confianza de los reactivos disponibles comercialmente (Kwon-Chung, 1992). La detección de antígenos fungicos es el desarrollo más reciente. La aplicación más importante con diferencia ha sido detectar el antigeno del criptococo en el suero y en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Tenemos que considerar este test como una herramienta de diagnóstico principal junto con el cultivo, y ha sustituido al test de tinta china, que es menos sensible para el examen directo del LCR. Los inmunoensayos para los antígenos de Aspergillus han sido descritos pero no desarrollados comercialmente (Kurup, 1991). Un radioinmunoensayo para los antigenos H. capsulatum en orina es posible hacerte a través de un laboratorio de referencia (Laboratorio de Referencia Histoplasma. Indianapolis, IN), y está bien considerado, particularmente en pacientes con enfermedades sistémicas (Williams. 1994). Se detectó al antígeno en el 92°o de 108 pacientes con infección diseminada, pero sólo en el 39% de 70 pacientes con enfermedad autosuficiente. Los test cutáneos se han usado para estudios epidemiológicos de algunas infecciones, pero tienen una utilidad limitada para fines diagnósticos. En algunos casos, como histoplasmosis, los test cutáneos podrían complicar el diagnóstico del laboratorio al provocar una respuesta de los anticuerpos (Campbell, 1964). Por desgracia, ninguno de los test que existen para el diagnóstico de la infección por Candida tienen suficiente sensibilidad y especificidad para ser diagnósticamente útiles (de Repentigny. 1992).
Un resumen practico de hongos médicamente importantes es el que se representa en la Figura 54-12. Este esquema se presenta como un esqueleto organizador en el cual un micólogo principiante puede acercarse al diagnóstico etiológico de las infecciones por hongos.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Recogida de muestras La muestra correcta para llevar al laboratorio de micología depende de la presentación clínica y del órgano del sistema afectado. En la Tabla 54-5 encontramos un resumen de las principales categorías de enfermedades producidas por hongos y la muestra que se recomienda La nomenclatura de las infecciones por hongos importantes se ha resumido en un cuadro (Odds. 1992). Las levaduras, en particular Candida spp., pueden recuperarse en alguna ocasión de muestras recogidas con una torunda, sobre lodo de las lesiones purulentas. Las torundas deben usarse para recoger lesiones orales o vaginales sugestivas de candidiasis. y tienen que ser adecuadas para recoger muestras en pacientes con otitis exlerna crónica, donde solemos encontrar un gran número de conidias Aspergillus. Las torundas son. sin embargo, las peores herramientas para recoger muestras en la mayoría de las zonas de enfermedades infecciosas. Para el diagnóstico de inlecciones fúngicas en las que el tejido responsable es con frecuencia granulomatoso. son inútiles, e incluso pueden crear confusión y el médico interpretar un resultado negativo como la ausencia de infección. Una política firme de rechazar muestras de torundas debe acompañarse de esfuerzos educacionales persistentes. Las mejores muestras para el diagnóstico micológico son raspados, curetajes, aspiraciones y biopsia de las lesiones. Los pelos infectados con algunos hongos dermatofitos comunes (p. ej.. Microsporum canis) son fluorescentes bajo una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lámpara de Wood).
Figura 54-12. Esquema de organización para los patógenos fungióos humanos importantes.
CAPÍTULO 54
Tabla 54-5
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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S í n d r o m e s clínicos m a y o r e s y p a t ó g e n o s habitualmente asociados"
Presentación clínica o sistema
G r u p o d e pacientes
Piel, pelo o uñas
Todos los pacientes
Piel, dermis y tejido subcutáneo
Todos los pacientes
Pacientes con micetoma
Neumonía primaria
Todos los pacientes
Inmunodeficientes
Infección gastrointestinal
Inmunodeficientes
Infección del tracto urinario Endocarditis Meningitis
Todos los pacientes Todos los pacientes Todos los pacientes
Encefalitis y absceso cerebral
Inmunodeprimidos
Osteomielitis
Todos los pacientes
Queratitis
Todos los pacientes
Otitis externa
Todos los pacientes
Sinusitis
Todos los pacientes
Quemaduras
Vaginitis Infección de catéteres intravenosos Intección diseminada
Todos los pacientes
Pacientes inmunodepnmidos
" Pueden darse otias combinaciones y posibilidades j | menos común
Muestras
P a t ó g e n o probable Dermatofilos Candida Malassezia 1 Trichosporon\ \Scopulanopsis) 1 Fusarium] Coccidioides immilis Blastomyces dermatítidis Sporolhrix schenckii Pseudallescheria boydii Nocardia Streptomyces Actinomadura Histopiasma capsulatum Blastomyces dermatitídis C neoformans Aspergillus Cigomicetos Pseudallescheria boydii Pneumocystis carinii Candida Aspergillus Cigomicetos Candida Candida (mohos y hongos dimórficos) Cryptococcus neoformans Candida Cigomicetos Aspergillus Nocardia asteroides Ciadosponutn [Xylohypha] banltanum Otros hongos Coccidioides immitis Blastomyces dermatitídis Cryptococcus neoformans Moho Aspergillus Fusarium Aspergillus (lumigatus y niger) Aspergillus (lumigatus y niger) Fusarium Mohos demaliacenos Curvularia Bipolaris Aspergillus Cigomicetos Fusarium Pseudallescheria/Scedosporium Candida Candida Malassezia (recién nacidos) Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitídis Coccidioides immitis Candida Cigomicetos Aspergillus Fusarium Pseudallescheria/Scedosporium Cryptococcus neoformans Potencialmente algunos hongos
Raspado cutáneo Pelo Urta Recortes
Biopsia
Biopsia
Esputo Lavado bronquioalveolar Biopsia transbronquial Biopsia pulmonar abierta
Raspado Curetaje Biopsias Orma Sangre Líquido cefalorraquídeo Biopsia
Biopsia
Raspado Raspado Tapón Biopsia Curetaje
Biopsia
Tapón secreciones aspiradas Punta del catéter Sangre Sangre Biopsia Sangre Biopsia
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
y pueden ser seleccionados específicamente para ser analizados. Las lesiones cutáneas de los dermatofitos ("lombriz en anillo") se caracterizan por un borde activo que avanza, con una cicatriz central, por eso los raspados tienen que recogerse del borde de la lesión. Las muestras deben enviarse al laboratorio en un contenedor seco y limpio. Los pelos, uñas y raspados de piel tienen que guardarse en un sitio seco para evitar el crecimienlo bacteriano. Algunos médicos, como dermatólogos y oftalmólogos, prefieren inocular las muestras directamente en la superficie agar en el quirófano. Es importante desarrollar un método para monitorizar el medio en lugares fuera del laboratorio, porque las placas Petri con alguna muestra de agar seca aparecerán en el laboratorio sin un sistema fiable.
Examen directo de muestras Los raspados, curetajes y los pelos pueden examinarse directamente por un microscopio de luz. Las aspiraciones de pus o fluidos también pueden examinarse directamente; si el material es demasiado grueso para una observación sencilla, puede ser extendido en portas de cristal. Las extensiones impresas y las preparaciones tienen que hacerse de muestras de tejidos. Es útil preparar extensiones adicionales sin teñir, porque los análisis después pueden mostrar agentes infecciosos que inicialmente no se sospechaban. Preparación en fresco. El método más sencillo para el examen directo es la observación de una suspensión de la muestra en una solución salina estéril bajo un cubreportas. Para muestras que contienen tejido de desbridación y células, como secreciones vaginales, uñas y raspados de piel, debe usarse una solución de hidróxido de potasio (KOH) (Tabla 54-6). Tinción de Gram. Este tinte microbiológico usado comúnmente es útil particularmente para detectar levaduras. La mayoría de las levaduras, en especial las de Candida spp.. líñen parcial o complelamente grampositivos; puede apreciarse la presencia de bacterias contaminantes y puede valorarse la naturaleza de cualquier célula inflamatoria. Las hitas de los mohos aparecen grampositivas o gramnegativas por este tinte, pero la tinción es menos fiable que la de las células levaduriformes. Tinte de Giemsa o Wright. Si se sospecha histoplasmosis, estos tintes hematológicos son útiles para apreciar las células de las levaduras dentro de los macrófagos. Preparación con tinta china. Las cápsulas polisacáridas del C. neolormans pueden demostrarse por una tinción negativa de partículas de tinta china (Tabla 54-7). Algunos micólogos prefieren nigrosina porque las partículas son más homogéneas y es menos frecuente que artefacten. Cuando se examina con el microscopio de luz, la cápsula se queda en el exterior como un espacio en blanco alrededor de la célula fúngica, con partículas de tinta que salen despedidas del borde con un movimiento explorador (Fig. 54-13). Es importante diferenciar las seudocápsulas producidas por focos imperfectos alrededor del borde de los leucocitos o artefactos. Si se encuentran las células en gemación, nos aseguramos la especificidad del diagnóstico. Otros hongos potencialmente encapsulados. como las especies de Rhodotoruia y otras especies de criptococos. son patógenos tan infrecuentes que se puede eliminar la posibilidad de considerarlos. En muestras clínicas, las cápsulas son por lo general grandes, pero después de aislarlas en un medio agar, pueden hacerse más pequeñas y pueden ser más difíciles de demostrar. Por desgracia, algunas cadenas tienen una encapsulación pobre. La sensibilidad del test de tinta china es aproximadamente del 50% en pacientes que no están infec-
Tabla 54-6
;
Tabla 54-7
Preparación de tir
1. Centrilugar la muestra de liquido durante un mínimo de diez minutos. 2. Colocar una gota de tinta china en un porta de cristal limpio. 3. Mezclarlo con una gota del sedimento del centrifugado. 4 Buscar levaduras encapsuladas mediante el uso de un objetivo de 40x. ¡ 5. Las colonias que crecen en agar pueden también mezclarse directamente con tinta china en un porta para confirmar la presencia de capsulas.
tados por VIH (Diamond, 1974), mientras que la detección directa del antígeno en el LCR o suero tiene una sensibilidad del 90%-100%. La detección de polisacáridos criptococos por aglutinación de látex o por técnicas inmunoensayos de enzimas ha sustituido a la observación de cápsulas de uso habitual. La técnica de tinta china puede reservarse para usarla por la tarde y por la noche, cuando el test de antigenos no está inmediatamente disponible, y para examinar las cápsulas de colonias aisladas que sugieren C. neoíormans. Parece que el test de tinta china tiene mayor sensibilidad en pacientes infectados por VIH, quizá porque hay un gran número de células levaduras presentes (Chuck, 1989; Kovacs, 1985: Zuger. 1986). Tintes histioquímícos. El método ácido periódico de Schiff tiñe la pared de las células fúngicas y se utiliza en algunos laboratorios de micología. La técnica de la plata metenamlna se usa por lo general en laboratorios de histología para detectar hongos. Cuando este método se combina con eosinahematoxilina, puede estudiarse la morfología detallada tanto de los tejidos como de los hongos (Swisher, 1982). Estas dos técnicas tíñen también las bacterias, especialmente si el tiempo de tinción en el método de impregnación con plata es prolongado. Estas herramientas se han reemplazado por el simple y más rápido tinte de calcoflúor blanco. Calcoflúor blanco. Este componente es un blanqueador que se utiliza en las industrias de papel y textiles se une a las paredes de las células fúngicas y emite una fluorescencia blanca (Fig. 54-14) o verde manzana (dependiendo de las combinaciones de filtros que se usen) cuando se expone a una luz ultravioleta de longitud de onda corta (Tabla 54-8) (Hageage. 1984). Es necesario un microscopio de fluorescencia, pero esta herramienta tan importante para el diagnóstico también sirve para otras tareas, como para tinción con auramina-0 de micobacterias y para inmunofluorescencia. Recuperar los hongos de la sangre puede acompañarse por una inoculación de medio de caldo, utilizando un sistema bifásico caldo-agar o por la técnica de la lisis por centrifugación (Isolator, Wampole, Cranbury, NJ). El sistema Isolator consiste en un tubo que contiene una solución que produce la lisis de eritrocitos y leucocitos. Después de sacar la sangre por vacío del tubo, los contenidos Uticos, incluido cualquier microbio, se centrifugan y se depositan
Preparación KOH
1. Colocar una gota de KOH (hidróxido potásico con o sin calcoflúor) en un porta de cristal limpio. 2. Meter la muestra en la gota de KOH preparada en el porta. 3. Cubrirlo y calentar la mezcla de muestra/KOH pasando el porta a través de una llama de un mechero de Bunsen varias veces. No debe hervir. 4. Examinarlo con 10x y 40x. Las muestras excesivamente tenaces pueden requerir un calentamiento adicional 5. También puede utilizarse el KOH como medio simple, sin calentar.
Figura 54-13. La cápsula de polisacáridos alrededor de la levadura en gemación de Cryptococcus neoíormans se tiñe negativamente con partículas de tinta. Adviértanse la redondez y uniformidad de las células levaduriformes (preparaciones con tinta china).
CAPÍTULO 54
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Figura 54-14. El calcoflúor blanco emite una fluorescencia blanca en las paredes del hongo cuando se visualiza con microscopio de fluorescencia. Las hilas septadas y las ramificaciones de Aspergillus lumigalus se muestran de un modo óptimo
en la superficie de las placas agar. Un porcentaje alto de las funguemias causadas por levaduras pueden detectarse con uno de los sistemas de cultivo, como BACTEC (Becton, Dickinson. Sparks. MD) o BacT-Alert (Organon Teknika, Durham. NC). Las levaduras son organismos aeróbicos, por lo que deben emplearse botes para cultivo de aerobios. Se ha sugerido que los hemocultivos deben incluir de modo habitual dos frascos para aerobios por la importancia de la Pseudomonas aeruginosa y la Candida spp.. ambos son microbios aerobios, y que el frasco de los anaerobios sea inoculado sólo en determinadas situaciones, tales como enfermedades abdominales, donde la probabilidad de que existan patógenos bacterianos anaeróbicos es mayor (Morris. 1993). (Véase Cap. 57 para una explicación más detallada.) El método mas sensible para detectar la funguemia es el sistema Isolator (Jones, 1990). que es también el más susceptible para contaminarse, bien por el manejo del sistema durante el proceso, o bien por esporas que son transportadas por el aire y se colocan encima de las placas agar. Algunos informes más recientes documentan una representación equivalente para recuperar las levaduras entre sistemas de hemocultivos continuamente monitorizados, que primero fueron destinados para recuperar las bacterias, y el sistema Isolator de 10 mi (Wilson, 1993). En niños, un sistema de monitonzación continua se comparó favorablemente con el tubo Isolator 1.5 mi (pediátrico) para recuperar las levaduras de la sangre (Petti. 1996). Con esto es posible detectar las causas más comunes de infecciones sistémicas por hongos, sin utilizar más sangre o recursos de laboratorio que se requieren para detectar bacteriemia. Los mohos dimórticos y hongos filamentosos, sin embargo, se recuperan mejor con el sistema Isolator.
Aislamiento de hongos en cultivo Selección del medio. Todas las muestras deberían ser inyectadas en un medio elegido. El método tradicional es el agar dextrosa Sabouraud, que tiene un pH entre 5,5 y 5,6 y fue elegido para aislar los hongos dermatólicos. La modificación de Emmons del medio agar dextrosa Sabouraud contiene menos glucosa y un pH entre 6.8 y 7,0, y generalmente proporciona un agar más útil. Algunas autoridades prefieren el agar que inhibe los mohos o el agar dextrosa patata. Rinaldi (1982) ha descrito una modi-
ficación simplificada del agar dextrosa patata que utiliza una preparación de copos de patata que se encuentra en las tiendas de comestibles Es mucho más fácil de preparar que el método tradicional basado en patata y funciona igual. Estos medios están disponibles comercialmente y nos dan un balance razonable de, por una parte, la inhibición de bacterias contaminantes y, por la otra, de un estimulo de la morfología y color típico de las colonias. El agar copos de patata tiene ventajas para los hongos mohos, porque las estructuras reproductoras asexuales útiles para el diagnóstico se desarrollan mejor en este agar que en el medio dextrosa Sabouraud. Si la muestra es de una zona no estéril, o es probable que se contamine, es importante inyectar en una placa selectiva y en una no selectiva a la vez. Las placas selectivas que con más frecuencia se utilizan usan cicloheximida para inhibir los hongos saprofitos y agentes antibacterianos (por lo general cloranfenicol y gentamicina) para inhibir las bacterias. Para muestras de tejidos, especialmente cuando los hongos dimórficos pudieran ser los agentes etiológicos. debería añadirse antibiótico a un agar enriquecido, como un agar infusión cerebro-corazón con sangre. El medio agar puede echarse en tubos de tapa ancha o en placas Petn. Los IUOOS proporcionan un margen oe segunaaa para prevenir la mreccion oei personal y la contaminación de otros cultivos, pero los aislamientos son mucho más difíciles de manipular, y es prácticamente imposible crear colonias aisladas en situaciones donde esté presente una mezcla de hongos y mohos en la muestra. Además, el factor extremadamente importante como es el área de superficie se disminuye con los tubos. Los tubos deberían destaparse y dejarlos airear antes de incubarlos. Las placas Petri proporcionan una sensibilidad mayor y una superficie mejor, pero deben cerrarse y manejarse con cuidado. El agar que se echa en las placas debería doblar la profundidad normal (de 7 mm a 8 mm está bien) para que éste se deseque durante periodos de incubación largos. Las tapaderas deberían tener algo que permitiera pasar el aire. Inoculación e incubación. En algunas situaciones, sólo las colas que crecen de la hifa son víales y el resfo de la hifa vegetativa está enferma. Las muestras ordinarias en un homogenizador. al igual que se hace para el cultivo de bacterias, es muy desorganizado, y los aislamientos viables pueden perderse. Es mejor inyectar raspados o curetajes por encima y dentro del agar en varios puntos de la superficie agar. Los tejidos deben cortarse, después los fragmentos son inoculados de un modo similar. Hemos tenido la experiencia de no observar crecimiento en las placas cuando se agitaba el cepillo de las broncoscopias en el caldo, dejando caer un trozo en el medio agar. mientras que vimos el crecimiento de A. tumigatus en el cepillo original que se había dejado en el resto del Huido que se transportaba. Ahora inyectamos estas muestras colocando la aguja o el cepillo directamente encima de la superficie del agar principal aislado. Las placas o tubos deberían incubarse en el aire a 25C-30 C. La incubación o inoculación de muestras en una sala no es adecuada por la variabilidad de la temperatura en el ambiente. Es necesario un controlador de la temperatura de la incubación. No es necesario incubar placas paralelas o tubos a 37"C para recuperar la fase de levadura de los hongos dimórficos. porque los resultados nos proporcionan poco rendimiento. La mayoría de los hongos crecen en un periodo de incubación de dos semanas: entre los hongos que aislamos con más frecuencia, sólo los hongos dimórficos, como Histoplasma capsulalum y Blaslomyces dermatitidis. son con frecuencia detectados después de un periodo de incubación de 14 días (Morris, 1996; Hove, 1997). Las recomendaciones de estos autores son muy parecidas, podemos resumirlas en:
Tipo de muestra Tabla 54-8
Tinción c o n calcoflúor blanco
1. Colocar la muestra en un porta de cristal limpio. 2. Mezclarlo con calcoflúor blanco. 3. Examinar la preparación mediante el uso de un microscopio de fluorescencia 4 El calcollúor blanco se debe sustituir por lactofenol anilina algodón azul cuando se estudia la morlologia microscópica de los cultivos.
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
Tiempo de incubación
Dirigida a confirmar la infección por levadura 7 días (p. ej, boca, garganta, vagina) Orma 7-14 días Tejidos y fluidos corporales estériles diferentes de sangre 21 días Respiratorias, médula Osea y muestras de sangre 28 días Muestras donde se sospecha que hay un moho dimórfico 28 dias Resto de muestras 14 dias
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Las placas deben examinarse al menos dos veces durante la primera semana, cuando puede aparecer el crecimiento rápido, y al menos semanalmente después. Afortunadamente, es fácil conservar aislamientos fúngicos para futuros estudios o como control de calidad. Los mohos sobreviven un máximo de 12 años después de almacenarlos en agua destilada a temperatura ambiente (Qiangqiang, 1998). El aislamiento de levaduras puede mantenerse por congelación, como para las bacterias. Un método simple es cortar un pequeño bloque de agar que contenga colonias de levaduras y después colocar el bloque en un contenedor estéril y congelarlo a -20 C o menos. Los cultivos no necesitan ninguna condición especial para congelarse.
Seguridad en el laboratorio La inoculación de muestras y todas las manipulaciones de colonias de mohos deben realizarse en una cabina de seguridad de flujo laminar. Tanto el técnico como las placas de cultivo deben protegerse de la alta diseminación de conidias fúngicas móviles. Un experimento simple en el que tapemos un poco una placa que contenga una sola colonia de A. lumigatus en el laboratorio convencerá al observador escéptico del problema cuando aparezcan múltiples colonias de Aspergillus alrededor de la superficie de la placa. Para disminuir la dispersión de las conidias, se ha sugerido que los subcultivos de colonias que estén muy cargadas de conidias, como el Aspergillus. se realicen inundando la placa con agua estéril, y después de esto, las conidias que hemos sacado se aspiran y se colocan en la superficie de las placas agar recientes (McGinnis, 1980). No es obligatorio hacer esta maniobra, pero se debe tener gran cuidado para minimizar la manipulación de cultivos y la exposición de las placas al aire libre, incluso en la cabina de seguridad. Debería realizarse una atención y limpieza escrupulosas de las superficies, tanto de la cabina de seguridad como de la incubación. Separar las cabinas de seguridad para inoculación de muestras y estudio de mohos aislados puede reducir la contaminación de las muestras. El mayor riesgo para el personal del laboratorio viene del manejo de los cultivos de mohos de los patógenos dimórficos. particularmente C. immitis. Kwon-Chung y Bennet (1992) recomiendan inyectar en tubos sin rosca si se sospecha este patógeno, pero en la mayor parle del país el diagnóstico no se hace antes de aislar al patógeno. Podemos inundar la placa con un 4% de solución de formaldehído (10% formalma) y dejar a temperatura ambiente varias horas o toda la noche antes del examen microscópico. Como esto es obviamente irreversible, es mejor dejar otras colonias creciendo en placas y tubos de reserva. Es importante saber que la fase tejido de patógenos dimórficos no es infecciosa por vía aérea, por eso el riesgo biológico es poco o nulo al manejar muestras de tejidos de pacientes con histoplasmosis o blaslomicosis. Una excepción para esta regla seria C. immitis. que crece en su tase moho dentro de una cavidad pulmonar conectada con el árbol bronquial. Además, hay lesiones locales de Histoplasma o Blastomyces que han aparecido en zonas de inoculaciones accidentales.
probamos la información recibida de la máquina entre la morfología de las colonias y la morfología microscópica, al igual que las condiciones clínicas que conocemos, estamos haciendo un buen trabajo. Morfología de las levaduras. El test del tubo germinal es un paso inicial importante para identificar el aislamiento de levaduras. Los tubos germinales son alargados, con extensiones en forma de dedo de una célula de levadura; son el comienzo de una hifa verdadera (Fig. 54-15). Pueden diferenciarse de las pseudohifas por carecer de una constricción en la unión del tubo germinal y la célula levadura y por las paredes celulares paralelas en el tubo germinal. Los tubos germinales verdaderos son formados por C. albicans y Candida stellatoidea bajo las condiciones recomendadas, permitiendo una identificación temprana de las levaduras patógenas más comunes e importantes. Candida tropicalis puede producir hifas verdaderas y tubos germinales bajo condiciones especiales, pero generalmente no dentro del periodo de incubación abreviado que se dice en el test del tubo germinal estándar. Es necesario limitar la incubación del test del tubo germinal de dos a cuatro horas, porque si la incubación se prolonga, otras especies pueden empezar a formar estructuras que se parezcan al tubo germinal (Dolan, 1971). En realidad, estos son los comienzos de una seudohifa. y una observación cercana revelará la constricción entre el llamado tubo germinal y la célula levadura La identificación puede confirmarse por la documentación de clamidosporas. Las clamidosporas son estructuras que tienen una pared gruesa, que. más que desempeñar un papel reproductivo, sirve como reserva alimentaria (Fig. 54-16). Pueden estar terminales, como en C. albicans. dentro de la hila (intercaladas), como en los dermatofitos. Hablando de manera estricta, no son esporas, pero la larga tradición probablemente asegure que el nombre permanezca. Los tubos germinales verdaderos y las clamidosporas se producen por C. albicans y C. stellatoidea. una especie poco frecuente que muchos micólogos creen que es una variante sucrosa negativa de C. albicans. El test del tubo germinal tradicional incluye la inoculación de un tubo de suero (Tabla 54-9). Se ha descrito un test para la formación del tubo germinal en la superficie de una infusión agar de crema de arroz con Tween 80 y oxgall (Beheshti. 1975). Después de observar el aislamiento de los tubos germinales a 37°C. se continúa la incubación para posterior estudio de la morfología de las hifas y la formación de clamidosporas a 25 C-30 C. De este modo, toda la información necesaria se puede recoger de una vez. El agar cornea puede sustituirse, pero, a pesar del medio usado, las condiciones de incubación tienen que ser controladas cuidadosamente, y el test monitorizado con controles para obtener buenos resultados. La típica técnica de Dalmau para demostrar las clamidosporas en el agar cornea se detalla en la Tabla 54-10 (McGinnis, 1980). Morfología de los mohos. El método más simple para analizar los mohos es la técnica de la cinta de celofán. Es importante que la cinta sea
Técnicas para el estudio morfológico de aislamientos fúngicos Algunos de los estudios morfológicos necesarios para identificar los aislamientos fúngicos pueden lograrse con colonias de las placas de aislamientos originales, pero con frecuencia es necesario transferir porciones de colonias a medios nuevos o diferentes (subcultivos) para identificar las estructuras diagnósticas (véase Tabla 54-3). El agar cornea junto con Tween 80 para analizar los aislamientos de levaduras y el agar copos de patata para mohos son unas opciones excelentes. Estos medios pueden prepararse en el laboratorio o comprarse en los comercios (Laboratorios Remel. Lenexa. KS; BBL. Cockeysville. MD). La frecuencia de los subcultivos se reduce si utilizamos como medio principal los copos de patata. Las pruebas bioquímicas son importantes para la información bioquímica, especialmente si se ha utilizado un sistema de identificación comercial. Un trabajador del laboratorio que coloca el aislamiento en un aparato y. sin revisarlo, se cree el resultado está realizando una mala tarea. Cuando com-
Figura 54-15. Los tubos germinales se han extendido desde las células levaduriformes de Candida albicans. No hay estrechez en la unión de las células levadunformes con el tubo germinal. Las paredes del tubo germinal son paralelas. El suero humano fue incubado durante dos horas a 37 0
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
Tabla 54-10 Test d e la morfología d e las levaduras Morfología de las levaduras en agar 1. Extender un inoculo de levadura en una sección de agai córnea/Tween 80 2. Cubrir el área inoculada. 3. Incubarlo de 25°C a 30°C. 4. Observar la morfología microscópica a las 24-72 horas.
medir el inoculo de conidias de Aspergillus o de las cadenas de Candida blastoconidia en una seudohila? Los estudios de correlación entre los resultados in vitro e in vivo son difíciles. El desarrollo de muchos antifúngicos nuevos (Fromtlin. 1988) y el posterior desarrollo de resistencia entre las levaduras patógenas han añadido nuevos impulsos para el desarrollo y estandarización de los test para que se guíen los laboratorios de la quimioterapia antilúngica (Terrell, 1992; Rex. 1993). El Figura 54-16. Las clamidosporas producidas por Candida albicans son estructuras Comité Nacional de Estándares para Laboratorios Clínicos (1992) ha prode pared gruesa que habitualmenle aparecen en los extremos de las hitas. Las cla- puesto un método de referencia para los test de sensibilidad antimicrobiana midosporas son considerablemente más alargadas que el diámetro de la hila (lacde las levaduras patógenas usando caldo diluido o una variedad de microditofenol algodón azul). lución. Existen métodos más modernos para determinar concentraciones inhibitorias mínimas de antibióticos para patógenos bacterianos, como el Etest (AB Biodisk, Piscataway. NJ). que están siendo estudiados pero que requieren más evaluaciones antes de que sean adoptados como un medio estándar clara. Las preparaciones deben cerrarse con esmalte de uñas para retardar (Colombo, 1995; Sewell, 1994). Ahora es posible para los laboratorios que tieque se sequen, y es esencial examinar pronto la muestra. Si no se obsernen que hacer un número elevado de test para aislar levaduras realizar pruevan las estructuras diagnósticas, se puede alargar la incubación y repetir el bas de sensibilidad. Si sólo tenemos que analizar aislamientos de manera proceso. El método tradicional para observar la morfología de los mohos es ocasional, lo mejor es enviarlo a un laboratorio de referencia. separar el micelio con agujas y examinar la hita que hemos separado en El test de sensibilidad de mohos está peor estandarizado. Estos test se salino, calcollúor blanco o lactofenol, con o sin anilina azul. Se prefiere la realizan mejor en laboratorios de referencia. anilina azul mejor que el algodón azul, porque es menos tóxico. En ocasiones es necesario realizar un cultivo para evitar que las estructuras de las conidias se rompan fácilmente en su forma original. El acercamiento clásico incluye cortar cuadrados en un medio agar apropiado, LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS que se colocan en un plano inclinado que se sujeta con las varillas de cristal en una placa Petri, donde añadimos agua estéril para mantener la humedad Otra alternativa puede ser utilizar una placa agar que se comerGénero Candida cialice y que se haya diseñado para cultivos inclinados (Laboratorios Las especies de Candida son las levaduras patógenas más importantes. Renet, Lenexa. KS). Como la terapia inmunosupresiva ha llegado a ser muy común y los antibiótiSi sospechamos que un aislamiento de mohos puede tener hongos dimórficos de amplio espectro, como las celalospormas de tercera generación, se cos (p. ej.. crecimiento en un medio que contenga cicloheximida), no debería usan con mucha frecuencia, las levaduras ocupan un gran lugar entre los realizarse el cultivo de este modo, y el test de la tira de celofán debe analizarpatógenos nosocomiales. En 1994, sólo los estafilococos, E coli. Klebsiella se sólo después de puesta la preparación en una cabina de seguridad de flujo spp. y los enterococos superaban a Candida como causa de infección sanlaminar. El lactofenol azul anilina es fungicida, por lo que proteger la muestra guínea en la universidad de Hermont. con esmalte de uñas antes de observarlo nos da mayor protección. También se puede cubrir el cultivo con formalina al 10% (4% solución formaldehído) e incubar a temperatura ambiente toda la noche antes de manipular el moho. Factores de riesgo
Test de sensibilidad de aislamientos fúngicos Durante muchos años había muy pocos agentes antifúngicos quimioterápicos que fueran útiles: la anfotericina B era el único agente efectivo contra la mayoría de los patógenos sistémicos. Este potente agente antifúngico era con frecuencia tóxico, pero por fortuna era rara la resistencia. El desarrollo de los test de sensibilidad para los antibióticos m vilro fue interrumpido por dificultades para estandarizar las condiciones de inoculación y crecimiento. ¿Cómo
Tabla 54-9
Test d e l t u b o g e r m i n a l - s u e r o
1. Colocar de un modo aséptico varias colonias de levaduras a un tubo de test de 1? x 75 mm que contenga aproximadamente 0,5 mi de suero (humano feto de ternero, de oveja o conejo) 2 Incubar el tubo a 37 C. 3. Después de 2 a 4 horas, colocar una gota de la mezcla en un porta de cristal limpio. 4 Buscar tubos germinales mediante el uso de un objetivo de 40x.
Las infecciones por Candida tienen una extensión y una gravedad limitadas si el huésped es normal. La terapia antibiótica de amplio espectro trastorna el balance de la llora colonizante en las membranas mucosas de la cavidad oral y del tracto gastrointestinal al eliminar la flora bacteriana predominante. En algunos lugares, como el aparato genital femenino, la causa de una interrupción en el balance normal en la flora puede no ser obvia. En zonas cutáneas, tales como las ingles y los pliegues inframamarios. una humedad excesiva predispone a una infección por Candida. La gravedad y la invasión de la enfermedad aumenta cuando el huésped tiene menos defensas (Fraser, 1992). La diabetes, las enfermedades o terapias inmunosupresivas y la neutropenia son factores de riesgo comunes. Las infecciones sanguíneas, incluida la endocarditis fúngica, se fomentan por inyección de drogas ilegales por via parenteral (Bisbe. 1992: Weems. 1992) y por usar vías intramusculares, como generalmente requieren los pacientes hospitalizados (Curry. 1971).
Q
Manifestaciones
clínicas
El patógeno más común con diferencia en el género Candida es C. albicans. La frecuencia con que se aislan otras especies varía en función de la
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SECCIÓN VI
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MICROBIOIOGÍA MÉDICA
institución. Candida (Torulopsis) glabrata. С parapsilosis у С tropicalis son los siguientes patógenos más frecuentes (Pfaller, 1998) С Iropicalis se en cuentra en pacientes inmunodepnmidos que tienen enfermedad diseminada. C. parapsilosis puede producir también enfermedad diseminada, particularmente cuando el paciente ha abusado de las drogas o ha tenido catéteres intravenosos (Weems. 1992). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata) también causa funguemias (Harón. 1993; Marks. 1970). Se ha asociado con infecciones del tracto urinario y vaginal (Kauffman, 1974; Sobel, 1986). C. kruse/'es una causante menos común de infección diseminada que se parece a la producida por C. Iropicalis (Goldman, 1993). Continúan asociándose muchas especies con las infecciones humanas, como C. zeylanoides (Levenson. 1991). demostrando una vez más que la capacidad de los hongos para producir infecciones humanas es inexhaustible si las condiciones clínicas son adecuadas. La resistencia a los antibióticos imidazólicos (p. ej., cetoconazol. fluconazol o ilraconazol) desafortunadamente está aumentando en los aislamientos de especies de Candida. С glabrata y C. krusei en particular son intrínsecamente más resistentes a estos antifúngicos que C. albicans (Pfaller. 1988). Candida lusitaniae. un patógeno aislado con poca frecuencia, es propensa a desarrollar resistencia a la anfotericina in vivo (Blinkhorn. 1989; Hadfield, 1987). La frecuencia con que se aislan varias especies varia de una institución a otra. La enfermedad cutánea como más frecuentemente se ve es como lesiones erilematosas de la piel, algunas veces acompañadas de un exudado blanco cremoso o escamas. La humedad es una precursora de la infección, por ejemplo, eritema del pañal en niños o infección de los pliegues cutáneos (intertrigo) en adultos. Las zonas comunes son las ingles (en forma de picor), entre los dedos de las manos y pies, debajo del pecho en las mujeres y en las axilas. Los trabajadores que tienen que meter las manos en el agua durante periodos de tiempo largos tienen un gran riesgo de infección de la piel de las manos, uñas (onicomicosis) o paroniquia. También podemos encontrar las lesiones en la piel de los muslos y nalgas, aunque son zonas donde no es corriente la infección. Una enfermedad cutánea crónica es una manifestación poco común de infección por Candida en pacientes con una inmunidad celular defectuosa (Kirkpatrick. 1971). La candidiasis oral por lo general se manifiesta como unas placas blancas por encima de la mucosa oral entematosa. Los síntomas son mínimos, pero puede haber una disfagia importante si la infección es grave. Es común que aparezcan fisuras en las comisuras de la boca (queilitis angular) y esto suele ser la primera manifestación. La candidiasis oral es una infección inicial común en pacientes infectados por VIH (Gottlieb. 1981; Klein. 1984). La candidiasis oral y la infección por Pneumocystis y eran las dos pistas iniciales para identificar la presencia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). La candidiasis gastrointestinal se produce más comúnmente como esofagilis (Haulk, 1991) y menos comúnmente como gastritis (Katzenstein. 1979). Las erosiones del esófago distal y del estómago provocan un dolor retroestemal. que empeora al tragar. A veces, por endoscopia, vemos unas placas blancas cubriendo la lesión. El diagnóstico diferencial incluye la infección por el virus del herpes simple, y los des procesos pueden coexistir. Las especies de Candida son flora frecuente del tracto gastrointestinal bajo (Cohén, 1969), haciendo complicada la valoración del significado de las levaduras en las muestras de heces. Una infección invasiva verdadera del tracto intestinal bajo es mucho menos común que la enfermedad del tracto alto, aunque el crecimiento de Candida spp. en las heces debe acompañarse de tratamiento antibiótico. Se ha descrito enteritis por Candida, рею carece de documentación histológica (Kane. 1976; Kozinn, 1962). La vulvovaginitis afecta a las mujeres pospuberales. La diabetes, el tratamiento antimicrobiano, los embarazos y la actividad sexual son condiciones predisponentes. Una quemazón vaginal, picor, dispareunia y una secreción de color crudo se asocian con una infección que puede ser aguda o crónica y difícil de erradicar (Sobel, 1986). La infección del tracto urinario es difícil de diagnosticar, porque es frecuente que encontremos especies de Candida en la orina por una contaminación vaginal o colonización de la vejiga en pacientes con catéteres intravasculares. especialmente cuando se han administrado antibióticos por vía sistémica (Goldberg, 1979). La infección grave del tracto urinario alto, incluida la necro-
sis de la papila renal, es una complicación seria de las infecciones del tracto bajo, y se produce generalmente en pacientes que tienen una uropatía obstructiva. Los cultivos no son útiles para valorar el significado de las especies de Candida en el tracto urinario (Goldberg, 1979). La candidiasis diseminada es una enfermedad nosocomial seria, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos que están neutropénicos (Fishman, 1972: Klein. 1979). Del 10% al 15% de las infecciones del torrente sanguíneo las causan las levaduras. Las lesiones focales en cualquier órgano pueden ser el resultado de una diseminación hematógena. Es raro que se produzca endocarditis (Johnston, 1991) en pacientes que abusan de drogas (Bisbe, 1992: Weems, 1992). Desafortunadamente, muchos hemocultivos con frecuencia son negativos en las candidiasis diseminadas (Jones, 1990). Es importante retirar los catéteres infectados (Edwards. 1992). Muchos especialistas de enfermedades infecciosas recomiendan una terapia empírica para la infección hongos si el tratamiento que hemos utilizado para los patógenos bacterianos no ha funcionado, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos con neutropenia (Pizzo. 1989: Walsh. 1999). La mayoría de las infecciones pulmonares se presentan como parte de una infección diseminada. La neumonía primaria por Candida puede producirse, pero no es lo habitual (Harón, 1993; Ramírez, 1967). El valor predictivo para la neumonía por levaduras identificadas o especies de Candida aisladas de muestras respiratorias es muy bajo, porque pueden estar contaminadas con secreciones del tracto respiratorio alto. Un acercamiento razonable de costebeneficio para las levaduras del tracto respiratorio es informar de su presencia como formas levaduriformes después de eliminar la posibilidad de que sea un criptococo con un rápido test de ureasa (Murray, 1977). Las infecciones del sistema nervioso por Candida son poco corrientes (Bayer. 1976; Parker, 1981), Pueden producirse como una parte de una infección diseminada o pueden resultar de una inoculación directa.
Patologenia de la infección por Candida La reacción histológica a la infección por Candida es por lo general purulenta, asemejándose a las lesiones de las infecciones bacterianas. Encontramos generalmente abscesos. En ocasiones, la reacción a la infección por Candida es granulomatosa. En tejidos, podemos encontrar levaduras gemando, pseudohilas e hitas verdaderas. El aforismo que tanto se repite de que las pseudohifas en una superficie mucosa indican un infección invasiva deriva de los estudios clínicos de enfermedad gastrointestinal (Kozinn, 1992). pero esta teoría ya se ha rechazado en el momento actual (Odds, 1994). Cuando predominan las pseudohifas o las hilas verdaderas, hay que diferenciar las levaduras de los mohos patógenos invasivos, como el Aspergillus. La invasión vascular no es común en infecciones por levaduras, como sucede con el Aspergillus o los cigomicetos. Con frecuencia se muestran levaduras en las partes teñidas con hematoxilina-eosina, pero también hay que utilizar la tinción de Gram de tejidos, el tinte de metenamina plata y la técnica del ácido periódico de Schiff.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Las muestras para cultivo deben tomarse de los órganos afectados y de lesiones donde puedan visualizarse. Como se ha explicado antes, el sistema Isolator es el método más sensible para detectar bacteriemia (Jones. 1990). pero los sistemas modernos de monitorización continua de hemocultivos, que en principio se usaban principalmente para detectar la bacteriemia, detectan la mayoría de los aislamientos de levaduras clínicamente significativos (Wilson, 1993; Petti, 1996). Las muestras de tejidos, raspados o exudados de boca o vagina tienen que inocularse en un medio de aislamiento primario con y sin cicloheximida. Si en presencia de la ocloheximida hay buen crecimiento, es una pista preliminar de la presencia de Candida albicans, aunque C. guilliermondii. C. kefyr (formalmente pseudotropicalis) y algunas cepas de C. iropicalis pueden encontrarse también en este medio. La presencia de extensiones filamentosas de los bordes de la colonia (pies) es una indicación macroscópica de que se están produciendo pseudohifas (Fig. 54-1). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata) y Cryptococcus spp. in vitro no forman pseudohifas, y otras especies de Can-
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
dida. como C. lusilamae y C. guilliermondii, puede que no formen muchas pseudohifas. La extensión de la evaluación micológica depende del marco clínico y del tipo de muestra. Los tractos urinario y respiratorio son dos sistemas orgánicos impodantes donde aislar Candida frecuentemente, pero es difícil de interpretar, como ya se ha explicado. La identificación completa de aislamientos de estos sitios sólo debería terminarse después de consultarse con el médico responsable. Aunque la práctica clínica normalmente no se altera por identificar especies de Candida aisladas, pensamos que los aislamientos de sangre u otros tepdos y fluidos estériles deberían examinarse enteros cuando las levaduras son el patógeno predominante o el único. Del mismo modo, identificamos los aislamientos cuando se ha pedido analizar los hongos en un marco donde se espera encontrar Candida, como vaginitis o muguet oral. La importancia puede ser útil para el epidemiólogo del hospital para el estudio de las infecciones nosocomiales. Un grupo de investigadores ha sugerido que el porcentaje de recurrencia y cronicidad de la vulvovaginitis son mayores cuando el patógeno es C. Iropicalis que cuando es C. albicans (Horowitz, 1985), pero se necesitan más estudios. Cuando aislamos una levadura en el laboratorio bacteriológico, o está presente en una infección polimicrobiana, informamos de su presencia, y antes de hacer más estudios pediremos una consulta. Es muy poco frecuente que tengamos estas peticiones. Tenemos que expedir un informe preliminar de C. albicans si el test del tubo germinal es positivo (Fig. 54-15). Si hacemos el estudio de la morfología de las levaduras utilizando un agar córnea para confirmar la presencia de clamidosporas. la identificación por lo general puede terminarse en una sola placa de agar en 24-48 horas; en ocasiones, a las 72 horas para que el cultivo se complete (Fig. 54-16). Si no se demuestra el tubo germinal ni las clamidosporas. la identificación primaria o presuntiva de las especies de Candida puede hacerse si las pseudohifas están presentes o no hay artroconidias. Una pequeña fracción de Candida aisladas no producen pseudohifas. tubos germinales o clamidiosporas. Una identificación completa necesita un test de asimilación, pero las observaciones morfológicas auxiliares son necesarias (Tabla 54-11). Algunos laboratorios usan los lest de fermentación para ayudar a identificar las especies de Candida, pero no se piden. En el momento actual no se recomiendan los test ¡nmunológicos para diagnosticar candidiasis (de Repentigny. 1992). Continua la investigación de los métodos para detectar antígenos. que podrían proporcionar un test útil y rápido para la infección invasiva.
Género
cryptococcus
El patógeno principal dentro de este género es el Cryptococcus neoíormans. Existen dos variedades: C. neotormans variante neotormans y C. neotormans variante gattii. La última variante se encuentra predominantemente en los trópicos y subtrópicos, y es raro aislarla en los laboratorios clínicos en EE.UU. (Levitz, 1992). Ambas variantes tienen dos serotipos. pero la determinación serológica sólo es de interés epidemiológico. El estado sexual del C. neotormans es un basidiomiceto, Filobasidiella neotormans. pero el teleomorto no se aisla en laboratorios clínicos. Otros criptococos y Rhodotorula spp. en ocasiones se aislan en zonas no estériles, pero es raro que estén implicados en enfermedades humanas, si se encontrasen alguna vez (Horowitz, 1993; Kiehn, 1992; Sinnott, 1989). La fuente ambiental primaria del C. neotormans son los excrementos de palomas o. menos comúnmente, de otras aves. El suelo contaminado también puede esconder los hongos.
Factores de riesgo El tratamiento inmunosupresor o la enfermedad es un factor de riesgo para la criptococosis (Williams, 1976). Antes de que apareciera la infección por VIH. del 30% al 50% de los pacientes con infección por Cryptococcus eran inmunológicamente normales, medidos con parámetros adecuados. Entre los factores de riesgo para los pacientes que no están infectados por VIH se incluyen neoplasia, diabetes, terapia inmunosupresiva o enfermedades inmunológicas (Hajjeh, 1999). La criptococosis es una de las infec-
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ciones que definen el VIH que ha llegado a ser el factor de nesgo más importante Es animoso que la incidencia de esta infección oportunista parece disminuir entre pacientes con sida en algunas ciudades (Hajjeh. 1999).
Enfermedad
clínica
Neumonía. La puerta de entrada de todas las infecciones criptocócicas es el pulmón, aunque la enfermedad pulmonar sintomática puede no estar presente en el momento que se reconozca la enfermedad extrapulmonar (White. 1994). La neumonía criptocócica nuestra una amplia variedad de presentaciones. Los pacientes inmunocompetentes pueden no mostrar síntomas, a pesar de la presencia de los criptococos en el Irado respiratono bajo (Randhawa, 1977). La neumonía puede ser lenta y prolongada, tardando mucho en resolverse. La infección puede ser difusa o localizada, incluida la presencia de lesiones nodulares que no suelen calcificar. La infección es más grave en pacientes inmunocomprometídos. y con frecuencia se acompaña por otros agentes infecciosos, en particular Pneumocystis cannii y citomegalovirus. La enfermedad extrapulmonar puede aparecer semanas después de haber encontrado una infección pulmonar (Kerkering, 19811 Infección cutánea. Las lesiones cutáneas por lo general son el resultado de la diseminación hematógena desde el tracto respiratorio (Pema, 1994). Se presentan como pápulas simples o múltiples, que aumentan y se ulceran, produciendo un pequeño exudado que contiene las levaduras. Infección articular y ósea. Una vez más el foco primario de infección es el tracto respiratorio, desde donde se disemina el cnptococo: lo más común es a la columna vertebral (Behrman. 1990). Se producen lesiones osteolíticas. Los abscesos llamados fríos en el tejido suave adyacente producen un exudado fino que contiene gran número de criptococos. Con menos frecuencia incluye los espacios articulares. Infección del sistema nervioso central. Los focos más frecuentes y peligrosos de infección criptocócica diseminada son las meninges y el parénquima cerebral (Chuck, 1989; Kovacs. 1985; Lewis. 1972; Zuger. 1986). El comienzo de la enfermedad suele ser agudo, pero la presentación puede ser insidiosa y la progresión lenta. Las cefaleas y cambios en el estado mental y de personalidad con frecuencia dominan el cuadro clínico. La meningitis basilar, afectación de los nervios craneales, y la invasión de la parte de debajo del córtex. producen una hidrocefalia y disminuyen la agudeza visual. Si hay fiebre, es febrícula, y los signos típicos de irritación meníngea, como rigidez de nuca y los signos de Kernig y Brudzmski, están ausentes.
Patología de la infección por Cryptococcus La respuesta histológica depende del grado de encapsulación de la cadena infectada. Lo más común es que no haya respuesta inflamatoria o que sea pequeña, correspondiendo al exudado fino visto clínicamente. Meior dicho, las células del tejido normal están separadas por un gran número de criptococos encapsulados. Cuando examinamos el LCR, las únicas células presentes pueden ser las levaduras, que podían malinterpretarse como células huéspedes mononucleares si por la clínica no sospechamos la infección. En las tinciones de tinta china positivas encontramos cápsulas grandes. En los tejidos seccionados es raro que encontremos pseudohifas cortas y rudimentarias de C. neotormans (Freed, 1971). Las cadenas del C. neotormans pobremente encapsuladas producen una respuesta granulomatosa inflamatoria, y las levaduras las encontramos predominantemente en el citoplasma de los macrófagos (Farmer. 1973) Pueden confundirse con las células del Blastomyces dermatitidis o incluso con espórulas inmaduras del C. immitis. Se han descrito confusiones entre levaduras pequeñas criptocócicas con el H. capsulatum, pero la diferenciación por lo general no es difícil (Gutiérrez, 1975). La dilerenciación en los Irozos de tejido puede terminarse al teñir los mucopolisacáridos de criptococo con tintes de mucina, o al demostrar el pigmento de melanina con el tinte de Fontana-Masson. El tinte de melanina es ventajoso cuando la cadena infectada tiene poco material capsular (Ro, 1987) Las combinaciones del tinte Fontana-Masson y varios tintes para mucopolisacándos, como mucicarmma o azul alcián se han utilizado para
Tabla 54-11
Detalles auxiliares útiles para la Identificación de levaduras
Organismo
Crecimiento con cicloheximida
Candida albicans Candida tropicalis
Candida parapsilosis Candida krusei Candida kelyr (pseudotropicalis) Candida guilliermondii
Tubos „ . ... _. germinales Pseudohifas P.gmento ro,o
+ -(+)
+ -
+ +
+
-
+ + +
+
-
+ (-)
Ureasa
Artroconidias _
•i
-
-
-
Cryptococcus neoformans
_
_
Especies de Rhodotorula
-
-
-
+
Malassezia fúrfur
_
_
_
_
—
_
_
-
-
+ (->
+ +
Especies de Trichosporon Geolrichum candidum
+ H
-
Saccharomyces cerevisiae (): Reacción menos frecuente. EMB eosina azul de metiieno.
-
-
-
-
-
—
—
—
-(+)
-
-
-
—
-
-
-
Comentarios
_
+
+
+
Ascosporas
-
_
Malassezia pachydermatis
c o n | i p ¡ d o s
-
Candida (Torulopsis) glabrala Candida lusitaniae
+
.. Crecimiento Clarmdosporas
-
-
+
-
Pseudohifas bien desarrolladas, rara producción de tubos germinales Pseudohifas en cepillo Colonia plana y seca Pseudohifas en "tronco en arroyo"; verde brillante en agar EMB Las pseudohitas pueden estar ausentes o en poco número; colonia vitrea Levaduras pequeñas (de 2uma5 pm) Las pseudohilas pueden estar en el escaso número Capsula polisacárida presente, células levaduriformes redondas La cápsula polisacárida puede estar presente Levaduras pequeñas con lorma de termo Levaduras pequeñas con forma de termo
-
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No blastoconidias, artroconidias germinales a partir del ángulo de la célula Las pseudohilas pueden ser raras
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
avanzar, pero no suelen ser necesarios (Lazcano. 1993). Blastomyces dermatitidis se tiñe muy poco con los linles de mucina en raras ocasiones. El Rhinosporidium seeberies positivo para la mucina. no se ve en climas templados y se diferencia fácilmente de los criptococos en cuanto a la morfología. Las células que vemos en la cromoblastomicosis contienen melanina. pero se diferencian en la morfología y no reaccionan con tintes de mucina. El tamaño variable (3 pm-10 pm) y la naturaleza redonda de la levadura in vivo y son pistas para identificarlas correctamente, a pesar del grado de encapsulación y respuesta histológica. Un complejo primario de granulomas en la periferia del pulmón y en nodulos linfáticos regionales, que recuerda a los que nos encontramos en tuberculosis e histoplasmosis. probablemente se produce con más frecuencia de la que lo reconocemos (Salyer. 1974).
Identificación en el laboratorio y otras investigaciones Los posibles criptococos siempre deben identificarse como especies para determinar si el C. neotormans está o no presente. Las pistas para ver la presencia de este hongo son un buen crecimiento en placas de agar de sangre incubados en el laboratorio bacteriológico a 35'C-37 C. las colonias tienen apariencia mucoide (Lámina 54-4), apariencia redonda de las células de levadura en las preparaciones en fresco o preparaciones teñidas y ausencia de crecimiento en un medio que contiene cicloheximida (Tabla 54-11). Podemos obtener una supuesta identificación de un modo rápido examinando una preparación de tinta china para las cápsulas (Fig. 54-13) (Tabla 54-7) o realizando un test rápido de ureasa (Tabla 54-4). o ambos. Las cápsulas pueden diseminarse incluso en cadenas fuertemente encapsuladas una vez que se han aislado en medio agar. Hemos encontrado varios aislamientos de C. neotormans del tracto respiratorio que eran no mucoides y que se parecían a Candida spp. en la morfología de las colonias. El subcultivo de los aislamientos puede restaurar la cápsula mucoide. La identificación definitiva se lleva a cabo por un test bioquímico. La determinación de la actividad de la fenol oxidasa puede incluirse, pero no es necesario si se utiliza uno de los sistemas de identificación de levaduras que se comercializan. El antígeno polisacárido del C. neotormans puede encontrarse en el LCR y el suero: lo más común es por una aglutinación de látex. La sensibilidad del test supera el 90%. pero los equipos comerciales varían considerablemente en sensibilidad y especificidad. El factor reumatoide puede dar falsos positivos (Dolan. 1972). y deben incluirse controles para la antiglobulina en los test (Bennett. 1971). Las infecciones grupo DF-2 (Capnocytophaga canimorsus). los bacilos gramnegativos no fermentativos (Westerink, 1987) y T. beigehi pueden causar falsos positivos, pero éstas son infecciones poco comunes. Otras causas ocasionales de falsos positivos son poco comprensibles. La frecuencia de resultados erróneos puede disminuir tratando las muestras de suero con pronasa (Hamilton, 1991; Stockman, 1982). Los falsos positivos parece que son menos comunes en pacientes infectados por VIH. quizá porque hay presente un gran número de organismos (Berlín, 1989). La titulación de los resultados positivos se ha hecho de modo adicional para valorar el pronóstico y como una base para seguir los efectos del tratamiento. Un gran número de antigenos y la persistencia del antigeno siguiendo tratamiento son pequeños signos de pronóstico en pacientes que no están infectados por VIH (Diamond, 1974). Por el contrario, no se ha demostrado que estos parámetros sean útiles de manera uniforme en pacientes con VIH, que en la actualidad son el grupo de mayor nesgo (Chuck. 1989; Kovacs, 1985; Zuger. 1986). La medida del antígeno en el suero parece ser el test más sensible en pacientes inlectados por VIH, más que el análisis de LCR. Tanto el suero como el LCR deben analizarse para una buena sensibilidad. En algunos informes, aislar el C. neotormans de un sitio de fuera del SNC se ha asociado con un pronóstico pobre en pacientes infectados con VIH. Un test negativo para la tinta china en el LCR es un signo de buen pronóstico en pacientes no VIH, pero no tiene la misma implicación en pacientes con sida.
Género Malassezia Las dos especies más importantes dentro del género Malassezia son M. furtury M. pachydermatis (Marcon, 1992). M. fúrfures con diferencia el patógeno humano más común. M. pachydermatis, micialmente aislado de un rinoceron-
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te indio, se ha encontrado en muchos animales, especialmente en las orejas de los perros, y en ocasiones de los humanos. El nombre formal del M. turtur es Pityrosporum ovale o P. omiculare. dependiendo de la morfología de la levadura.
Factores de riesgo M. fúrfur se encuentra en la piel de más del 90% de los individuos (Roberls. 1969b. 1969c), y la enfermedad cutánea se produce en huéspedes normales. Puede haber un aumento de sensibilidad a la enfermedad en pacientes que suden mucho (Roberls, 1969a) o en pacientes que tienen un nivel de corticoesteroides elevado debido al tratamiento (Boardman, 1962) o una producción endógena, como en la enfermedad de Cushing (Cañizares. 1959). La infección sistémica se produce principalmente en neonatos y se asocia con una hiperalimentación intravenosa con soluciones lipidicas (Powell. 1986). Aunque M. fúrfur no suele estar presente en la piel de los neonatos sanos, se ha encontrado la levadura en la piel del 37% de los niños que estuvieron en la unidad de cuidados intensivos (Powell, 1987). Los factores de nesgo para la infección por M. pachydermatis en humanos son similares (Mickelsen, 1988).
Enfermedad
clínica
Pitiriasis (tina) versicolor. Esta infección común de la epidermis termina en una hiperpigmentación o hipopigmentación de la piel, sobre todo en el tronco y parte alta de los brazos (Powell. 1986). Las máculas marrones es la presentación más común, pero las lesiones despigmentadas son más obvias en personas de piel oscura, y pueden utilizarse sustancias para acentuarlas en individuos de piel clara. Los efectos de la enfermedad son puramente cosméticos, pero pueden ser considerablemente problemáticos. Las lesiones hipopigmentadas deben diferenciarse del vitíligo. El tratamiento consiste en una aplicación tópica de cremas fungicidas o enjuagues. Infección sistémica. La infección sistémica se produce en casi todos los niños que han recibido infusiones intravasculares de lípidos. Aunque las soluciones lipidicas por sí solas no apoyan el crecimiento de las levaduras, las soluciones lipidicas diluidas apoyan el crecimiento de M. fúrfur abasteciendo la cadena larga de ácidos grasos que también se encuentran en la piel, y deben abastecerse en laboratorio para aislarlas (Powell, 1986). Los niños infectados por lo general están asintomálicos. pero la fiebre, la leucocitosis y la trombocitopenia pueden estar presentes. La neumonía es la manilestación sistémica más importante de la enfermedad, probablemente a causa de una embolia de catéteres intravenosos infectados. El tratamiento es quitar el catéter infectado.
Patología de la infección por Malassezia fúrfur El diagnóstico de pitiriasis versicolor por lo general se hace clínicamente o demostrando levaduras o formas cortas de hifas (parecidas a los espagueti) en preparaciones de KOH de raspados de piel. Añadir calcoflúor blanco u otros tintes fúngicos aumenta la detección porque las células fúngicas son pequeñas y es difícil verlas cuando no están teñidas (Fig. 54-17). Cuando se hace la biopsia puede verse hiperqueratosis. acantosis y unos infiltrados dérmicos mononucleares. Se sabe poco de la patología de la infección sistémica de M. luriur, porque es raro hacer biopsias y la infección letal no es común. En casos extremos, las lesiones se han descrito en muchos órganos, incluidos pulmón, hígado y riñon (Shek, 1989). También se observaron vasculitis. endocarditis, infartos sépticos e inflamación granulomatosa.
Identificación del laboratorio y otras investigaciones En enfermedades cutáneas es raro que se pida un cultivo para M. luriur, y la observación directa de las levaduras en preparados de KOH por lo general se hace en el despacho del médico. Esta levadura debería verse en cultivos de sangre y en la punta de catéteres intravenosos en neonatos. Antes de inocularla, se añade una gota estéril de aceite de oliva a la superficie de un medio agar válido, como el agar Sabouraud dextrosa o el agar
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
sangre de oveja. En nuestro laboratorio utilizamos aceite de cacahuete, que también funciona bien. Dentro de los dos o tres primeros días, las colonias aparecen en marrón claro y por lo general tienen una apariencia muy seca en el aceite subyacente (Lámina 54-5). Una pista inicial es la taita de crecimiento por la presencia de un aceite. Debería haber suficiente lipido en la sangre o en la punta de catéter, sin embargo, para mantener el crecimiento inicial en las placas que no contienen aceite. M. pachydermatis no es dependiente de la cadena larga de ácidos grasos para crecer. La identificación del aislamiento puede confirmarse por un examen microscópico de las células de levadura, que miden de 3 pm a 7 pm. El proceso de gemación en la Malassezia es inusual, porque se produce como un proceso enteroblástico con la formación de fíálides. La gemación tiene una amplia base y los collaretes de las fiálides podrían observarse con el microscopio de luz como un anillo oscuro distinto que separa la célula madre de la hija (Fig. 54-18).
Otras levaduras y patógenos semejantes a levaduras
Figura 54-18. Células levadurilormes en gemación de Malassezia luriur que dan la clásica forma de termo.
y saprofitos 7! beigelii produce una infección del pelo conocida como piedra blanca y puede producir infección sistémica (Hoy. 1986: Ogata, 1990). El Blastoschizomyces capitatus (formalmente Trichosporon capitalum) ha causado casos raros de infección diseminada semejante a la candidiasis (Liu, 1990). Un hongo morfológicamente similar, Geotrichum candidum, es también una causa rara de enfermedad pulmonar o diseminada (Fishbach, 1973; Jagirdar. 1981). Geotrichum y Trichosporon producen colonias lisas y parecidas a las levaduras que después desarrollan micelios aéreos, como un pelo que nace de una cabeza calva (Lámina 54-6). Ambas especies producen artroconidias que rompen las células disyuntoras vistas en el C. immitis (Fig. 54-19). Saccharomyces cerevisiae (Clemons. 1994; Sobel. 1993), especies de Rhodotorula (Píen. 1980) y las especies de Hansenuta son levaduras saprofíticas que en raras ocasiones pueden producir infección. Encontrar levaduras en los tejidos o aislarlas en múltiples muestras, incluso de zonas estériles, es necesario para informar del papel de las levaduras en un proceso infeccioso. Saccharomyces cerevisiae es la levadura de los panaderos y a lo mejor es más conocida por los estudiantes de micología por sus efectos saludables en malta y lúpulos.
HONGOS DIMÓRFICOS Los hongos dimórficos son los organismos patógenos más importantes encontrados en un laboratorio de micología clínica. En EE.UU.. los patógenos más importantes son H. capsulatum. Blastomyces dermatitidis. C. immitis y
Sporothrix schenckii. El Sporothrix se distribuye a través de lodo el mundo. Los oíros organismos se encuentran predominantemente en América del Norte, donde tienen distintas distribuciones geográficas (Fig. 54-20). La enfermedad epidérmica es más común con Histoplasma y Coccidioides y menos común con Sporothrix y Blastomyces. La fase de tejido de Coccidioides es la esférula. El otro género produce una fase levadura in vivo y puede también crecer como una levadura si se incuba a 37'C m vitro.
Histoplasma
capsulatum
Factores de riesgo El principal tactor de riesgo para adquirir la infección es vivir en una de las regiones endémicas de EE.UU.. en una zona que se localice en el curso de los ríos Ohio y Missíssíppi. así como en los valles de las montañas Appalachian. En algunas zonas, más del 90% de la población tiene un resultado positivo en los test de piel de histoplasmina. El crecimiento de H. capsulatum se estimula por el pájaro guano, aunque los hongos no crecen en los mismos pájaros. Una típica historia de una histoplamosis aguda está representada por el paciente que ha limpiado recientemente un gallinero. Las enfermedades epidémicas se han producido después de hurgar en los nidos de los pájaros durante proyectos de construcción (Tosh. 1966). De
Figura 54-17. Raspado cutáneo de una lesión de tina versicolor. Son características las formas levadurilormes e hifas cortas de la Malassezia íuriur. Estas formas Figura 54-19. Las artroconidias y la especie Trichosporon no están separadas por se han descrito como "espagueti y albóndigas" (método PAS). células disyuntoras (lactofenol algodón azul).
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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suelve completamente. Si ha habido una inflamación granulomatosa local, la calcificación del foco puede deiar una lesión nodular perfectamente definida que puede verse en la radiografía de tórax. Las lesiones cutáneas del eritema nodoso y del eritema multiforme pueden acompañarse de una infección pulmonar aguda (Medeiros. 1966). Pericarditis y mediastinitis. La inflamación granulomatosa del pericardio y la mediastinitis se han atribuido al H. capsulatum. con más frecuencia en terreno serológico (Loyd, 1988; Schowengerdt. 1969). La inflamación crónica puede terminar en fibrosis y pericarditis constrictiva. Es raro ver levaduras en las lesiones y es raro encontrarlas en el cultivo. H i s t o p l a s m o s i s crónica pulmonar. Esta enfermedad debilitante se produce principalmente en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La mayoría de ellos suelen ser hombres de mediana edad (Goodwin, 1995). Puede calcificarse y producirse una cavitación. El diagnóstico diferencial incluye tuberculosis pulmonar crónica y neoplasia pulmonar. H i s t o p l a s m o s i s d i s e m i n a d a . La diseminación de las levaduras a través del sistema reticuloendotelial puede ser como una parte de una histoplasmosis pulmonar aguda, terminando en granulomas cicatrizados que con frecuencia se calcifican, especialmente en el bazo (Johnson. 1988; Kauffman, 1978; Nightingale, 1990; Reddy, 1970). La enfermedad diseminada clínicamente se produce en dos clases de pacientes. El primer grupo son individuos en edades extremas que no tienen una condición inmunosupresiva reconocida, pero pueden tener el sistema inmune que no está completamente desarrollado, o que ha disminuido por la edad de un modo que no se entiende. El segundo grupo son pacientes con una enfermedad o tratamiento inmunosupresivo que está reconocido. Antes de 1980, las enfermedades eran predominantes en neoplasias hematológicas; en la actualidad, la infección por VIH es el factor de nesgo más importante (Johnson, 1988; Wheat, 1990). El avance de la enfermedad puede ser rápido o insidioso.
Coccidioidomicosis Figura 54-20. Distribución geográfica de las infecciones fúngicas dimórficas en Estados Unidos. Se ilustran las áreas de mayor endemicidad (sombra oscura) y las de menor endemicidad (sombra clara). Pueden producirse casos esporádicos en otras áreas fuera de las endémicas. La histoplasmosis y la blastomicosis se extienden en el sur de Canadá, mientras que la coccidiomicosis se da en Centroamérica y Sudaménca.
modo irónico, el comienzo de una histoplasmosis se produjo en el 40% de los estudiantes y facultativos que participaron en un día de limpieza en el colegio (Brodsky. 1973). La histoplasmosis pulmonar crónica es una enfermedad particular con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La infección diseminada normalmente se asocia con deficiencias inmunológicas, especialmente del sistema inmune celular. La infección por VIH se ha convertido en el factor de riesgo más importante para la diseminación de la enfermedad (Johnson, 1988).
Enfermedad
clínica
Infección pulmonar aguda. La mayoría de los individuos inmunocompetentes desarrollan una infección asintomática o subclínica acompañada de una respuesta inmunológica (Goodwin. 1973,1978). Los pacientes sintomáticos desarrollan un síndrome parecido a la gripe que puede acompañarse de dolor pleurítico o retroesternal. Los pacientes más gravemente afectados pueden estar enfermos durante varias semanas, pero por lo general se re-
La infección del sistema reticuloendotelial puede terminar en linfadenopatia, hepatoesplenomegalia o trombocitopenia. La destrucción de la corteza suprarrenal por el proceso granolumatoso puede ser suficientemente extensa como para causar una insuficiencia hormonal. La infección del SNC puede manifestarse como meningitis crónica, granulomas intracerebrales o ambos. La infección endovascular incluye la endocarditis con unas vegetaciones grandes y voluminosas. Puede afectarse cualquier parte del tracto gastrointestinal, y macroscópicamente las lesiones ulceradas pueden sugerir una neoplasia. La afectación de la piel es menos común que con otros hongos dimórficos (Studdard, 1976). En pacientes infectados con VIH. los síntomas de la histoplasmosis diseminada pueden parecerse a esos producidos por el virus, incluyendo fiebre, linfadenopatia, anemia, leucopenia. trombocitopenia, pérdida de peso y fatiga. Las lesiones cutáneas solitarias son raras; pueden seguir a la introducción directa de hongos.
Patología de histoplasmosis Como un patógeno facultativo intracelular, H. capsulatum se asocia particularmente con macrófagos. Las lesiones patológicas consisten en recogidas de macrófagos infectados, granulomas no caseosos o granulomas caseosos. Las lesiones histopatológicas son muy parecidas a esas que se producen por Mycobacterium tuberculosis, y debería pensarse en estos dos patógenos a la vez. Las levaduras intracelulares por lo general se muestran bien por una tinción de hematoxilína-eosina (Fig. 54-21). Las técnicas de ácido periódico de Schilf y de plata metenamina son más frecuentes, y el tinte de plata es necesario para demostrar las células de levaduras en granulomas cicatrizados. Estas levaduras, que presumiblemente no son viables más tiempo, pueden alargarse y retorcerse. El diagnóstico diferencial de las formas de levaduras es con formas pequeñas de B. dermatitidis. En el marco clínico adecuado, debemos considerar P. marnettei y las especies de Leishmania o Candida spp., en especial C. glabrata La talla mayor de las células de levadura de Candida (distinta de C. glabrata) o la presentación clínica por lo general sugiere el diagnóstico adecuado.
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SECCIÓN VI
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nologías o moleculares. El agar de sangre cisteína glucosa o el agar infusión de cerebro-corazón con sangre de oveja se incuban a 37 C. Si se ha demostrado la fase levadura en muestras de tejidos, la conversión del moho in vitro es académica. El diagnóstico serológico de la histoplasmosis tiene un papel secundario en el diagnóstico y no debe sustituir los intentos para cultivar los hongos (Walter, 1969). La fijación del complemento y las técnicas de inmunodilusión es lo que se utiliza más frecuentemente. La sensibilidad del serodiagnóslico no es mayor del 50% al 85% en enfermedad pulmonar crónica, y desafortunadamente es mucho menor cuando la enfermedad diseminada se produce en pacientes inmunocomprometidos. Una seroconversión retardada y unas reacciones cruzadas numerosas además comprometen este acercamiento diagnóstico (Terry. 1978). Cuando se trabaja en un área endémica, la observación de uno de nosotros (WW) de que aumentaba la fijación del complemento al B. dermatltidis era indicación de que el paciente probablemente tuviera toxoplasmosis. Figura 54-21. Células levaduriformes de Histoplasma capsulalum dentro de los macrófagos. Los núcleos son únicos. Las células están separadas de las demás por un espacio que es un artefacto de la fijación con formalina. Los hongos se consideraron originalmente como unos protozoos tisulares, y el espacio claro se consideró como una cápsula (tinción de nematoxilma-eosina).
Las levaduras de H. capsulatum en granulomas caseosos son lo suficientemente distintas para proporcionar un diagnóstico posible, pero tienen que diferenciarse de las presentaciones granulomatosas inusuales del Pneumocystis carinii.
El test cutáneo de histoplasmina ha sido muy úlil para estudios epidemiológicos, pero no debería usarse nunca para diagnóstico. La alta frecuencia de test positivos en zonas endémicas no sólo entorpece la interpretación, sino que el test cutáneo puede producir seroconversión, confundiendo además el tema (Campbell. 1964). Se ha desarrollado un radiommunoensayo urinario para el anligeno del Histoplasma y está disponible desde un laboratorio de referencia sencillo (Laboratorio de Referencia del Histoplasma. Indianápolis. IN). Como ya se comentó anteriormente, este test parece ser de gran uso en el diagnóstico en pacientes con enfermedad diseminada (Williams. 1994).
Blastomyces
dermatltidis
Factores de riesgo Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Cualquier consideración de este patógeno fúngico principal debe llevarse hasta el final. La forma de levadura en el tejido puede demostrarse histológicamente o en preparaciones de secreciones respiratorias, fluidos, sangre periférica, médula ósea o tejidos impresos. Tienen que usarse preparaciones frescas y calcoflúor blanco, pero la morfología del tejido y las células levaduriformes se ven mejor con la tinción de Giemsa, porque se pueden valorar los detalles de la morfología nuclear. La medida de las células es de 3 pm a 5 pm. tienen un núcleo sencillo y un brote con un cuello estrecho. Si se sospecha una infección diseminada, en particular en pacientes infectados VIH, deben realizarse hemocullivos para Histoplasma. La técnica Isolator parece ser la más sensible para recuperar la fase levadura de la sangre (Paya, 1987). Si se sospecha H. capsulatum, debería inyectarse un agar enriquecido tal como un agar de infusión cerebro-corazón con suplemento de sangre de oveja. Las placas tienen que incubarse a 30"C; la incubación del primer aislamiento en placas a 37'C no es necesaria. Las colonias de H. capsulatum que se aislan a 25°C-30°C son vellosas y varían de color blanco a marrón (Lámina 54-7). Algunas cadenas crecen más despacio y necesitan varias semanas para desarrollar las colonias. Las formas de diagnóstico asexual incluyen microconidias y macroconidias. Las microconidias. que se producen primero, son muy parecidas a las estructuras producidas por B. dermatltidis. Las macroconidias más características han incrementado la aspereza de los salientes de la periferia de la conidia, una configuración parecida a un tubérculo (Fig. 54-22). Las macroconidias de una saprofita. Sepedonium. deben diferenciarse del Histoplasma. La apariencia macroscópica de las colonias, el porcentaje de crecimiento, el crecimiento del H. capsulatum en un medio que contenga cicloheximida, la presencia de formas de levadura en los tejidos y la historia clínica generalmente son suficientes para diferenciar hongos. La configuración final de la identificación se realiza cuando se produce la conversión de la fase moho a la fase levadura a 37 C. para el test del exoantigeno. o por la hibridación de ácidos nucleicos La conversión a fase levadura algunas veces es excesivamente difícil y se ha cambiado en muchos laboratorios per técnicas inmu-
La mayoría de los casos de blastomicosis son esporádicos, y no suele encontrarse una fuente ambiental Se producen pequeñas epidemias y se ha llevado a cabo el aislamiento de hongos del suelo en las zonas de brote (Klein. 1986). No hay factores de riesgo específicos reconocidos para la blastomicosis. aunque se ha descrito una infección grave y diseminada en pacientes infectados por VIH (Harding, 1991). La blastomicosis pulmonar primaria se ha descrito en un trabajador de laboratorio que ha estado expuesto en la fase moho (Baum, 1970).
Enfermedad
clínica
La puerta de entrada es a través del tracto respiratorio, donde la infección puede ser asintomática. transitoria (Sarosi. 1974; Witorsch, 1968) o avanzar
Figura 54-22. Las macroconidias luberculadas de Histoplasma capsulatum son características. También suelen estar presentes las microconidias en las comdioloras cortas (lactofenol algodón azul).
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ENFERMEDADES MICÒTICAS
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insidiosamente. La blastomicosis pulmonar crónica con febrícula, pérdida de peso infiltrados pulmonares localizados puede sugerir enfermedad neoplasia, para la que tienen que llevarse a cabo estudios diagnósticos, incluido lavado alveolar. PAAF del pulmón o una biopsia pulmonar. La diseminación de las levaduras desde el pulmón casi siempre termina en una infección cutánea u ósea El SNC y el sistema genitourinario es menos frecuente que se incluyan. Las lesiones cutáneas son con frecuencia hipertróficas, fúngicas o ulcerativas, y pueden ser localmente destructivas. Las lesiones pueden confundirse con células escamosas del carcinoma de piel. También hay un compromiso secundario de la piel por encima de las lesiones óseas.
Patología de la blastomicosis La respuesta histológica característica de B. úermatittdis es una mezcla de inflamación aguda, incluidos microabscesos. inflamación granulomatosa. En lesiones cutáneas, es característico una hiperplasia seudoepitehomatosa de la epidermis por encima de la inflamación. Las células de las levaduras las encontramos más frecuentemente en los microabcesos o dentro de las células gigantes mullinucleadas. Podemos encontrarlas frecuentemente con el tinte hematoxilina-eosina, pero el ácido periódico de Schiff o la metenamina plata deben emplearse si no encontramos los hongos en las secciones realizadas. Las células levaduriformes de pared gruesa miden de 8 pm a 15 pm y mantienen la base ancha durante el proceso de gemación. Una separación, debida a un artefacto, del citoplasma de la pared celular en preparaciones fijadas con lormalma puede dar la apariencia errónea de una pared doble. Pueden verse núcleos múltiples en algunas células de levaduras con la tinción hematoxilina-eosina. Se deben distinguir las células de levaduras no geminadas de las de C. neolormans y de las esférulas en desarrollo de C. immitis. Las tinciones de mucina pueden teñir la pared celular de Blastomyces ligeramente de manera ocasional, pero la diferenciación con respecto a C. neoformans debería ser posible empleando criterios morfológicos.
Identificación de laboratorio y otras investigaciones La demostración directa de las células de levadura puede llevarse a cabo en secciones de tejido o preparaciones en fresco o fluidos aspirados y muestras de tejidos (Fig. 54-23). La tinción con calcoflúor blanco aumenta la detección de levaduras. El crecimiento es algo más rápido que el del Hlstoptasma, de aspecto desde blanco velloso a colonias de color que con frecuencia no pueden distinguirse de H. capsulatum. y por lo general aparecen dentro de la primera o segunda semana. Las microconidias se parecen a las del H. capsulatum (Fig. 54-24), pero no se forman macroconidias. Un hongo saprofítico, Chrysosporium, se parece al Blastomyces, pero no desarrolla una fase levadura y no crece en un medio que contenga cicloheximida. La conversión a la fase de levadura puede producirse en un medio ordinario incubado a 37 C, pero para este propósito se han utilizado específicamente agar de sangre glucosa cisleina o agar de semilla de algodón. Una vez más. demostrar la forma levadura en los tejidos sirve como un sustituto razonable para la demostración del dimorfismo en el laboratorio. El test del exoantígeno y la hibridación de ácidos nucleicos, son los métodos preferidos para confirmar los aislamientos en muchos laboratorios.
Figura 54-23. Las células levadurilormes en gemación de Blastomyces dermatitidis tienen una pared gruesa y una base ancha entre las células madre y la hija. Cuando se utilizan tinciones nucleares como la hematoxilina-eosma. se pueden demostrar múltiples núcleos en los células levadurilormes (lactofenol algodón azul).
ejemplo clásico de coccidioidomicosis epidémica se produjo en un grupo de estudiantes de arqueología en una cueva en el norte de California. Al menos 61 estudiantes lueron infectados por artroconidias en el suelo de la zona de la excavación, y el 77% de los individuos estaban sintomáticos (Werner, 1972). En EE.UU., los hongos se concentran en el suroeste. Se ha llamado fiebre del valle o liebre del valle de San Joaquín. La incidencia de la coccidioidomicosis ha aumentado considerablemente en California durante el comienzo de los 90 (Pappagianís. 1994). Una de las posibles explicaciones de este aumento es la sequía prolongada seguida de periodos de lluvia, la construcción de nuevos edificios y el aumento del número de individuos susceptibles a esta infección (Pappagianís. 1994) Sin embargo, los pacientes con coccidioidomicosis pueden encontrase por todo el país, por la frecuencia de viaje y la alta mfectividad de la artrocomdia para los individuos que entran en áreas endémicas (Pappagianís, 1993). Se han descrito casos en los que la infección se ha originado por material importado del suroeste de EE.UU. En una ocasión recuperamos el C. immitis de un perro que había nacido en Arizona y después se había llevado a Vermont La inlección de laboratorio es un riesgo serio, y este patógeno debería tratarse con gran respeto. Se han descrito ejemplos ocasionales en los que el desarrollo de la lase moho in vitro ha producido después infección.
n
El test de fijación del complemento es el test serológico más comúnmente utilizado para el diagnóstico de blastomicosis. Como se ha mencionado con la histoplasmosis, este test tiene limitaciones considerables y sólo debería usarse adjunto al cultivo de hongos.
Coccidioides
immitis
Factores de riesgo Residir en una zona endémica es el principal factor de riesgo para desarrollar la infección, porque la artroconidia de la fase moho se disemina fácilmente por el aire (Ampel. 1989: Pappagianis. 1993: Stevens. 1995). Un
Figura 54-24. Conidias características en una conidiofora de Blastomyces dermatitidis (lactofenol algodón azul).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Hay sugerencias de que los factores genéticos influyen en la frecuencia de la diseminación y de la gravedad de la infección, pero la naturaleza de la asociación no se conoce completamente. La infección diseminada es más común en individuos filipinos y de raza negra que en los de raza blanca. Los asiáticos, americanos nativos y mexicanos pueden tener también mayor riesgo. Las mujeres adultas desarrollan un eritema nodoso más comúnmente que los hombres, en respuesta a una infección primaria de Cocadioides, pero la infección diseminada se produce con más frecuencia en hombres adultos que en mujeres. La infección inmunosupresiva o la enfermedad es un factor de riesgo importante para la infección diseminada. Los pacientes infectados con VIH tienen un riesgo particular para infección diseminada (Bronnimann, 1987: Fish, 1990; Galgani, 1990).
Enfermedad clínica La coccidioidomicosis primaria es con frecuencia asintomálica, como se indica por la alta prevalencia de resultados positivos de los test cutáneos para los antígenos fúngicos en zonas endémicas. La enfermedad sintomática, por lo general, se manifiesta como fiebre con tos o dolor torácico, o ambos, y podría imitar clínicamente a una neumonía bacteriana (López, 1993). El eritema nodoso y el eritema multiforme, que pueden acompañar a la infección primaria, son signos de buen pronóstico. Los nodulos pulmonares solitarios pueden persistir como consecuencia de la infección pulmonar primaria. La infección diseminada afecta más frecuentemente a la piel, al sistema esquelético y a las meninges. Las lesiones cutáneas incluyen pápulas, úlceras, senos drenantes y abscesos subcutáneos. La artritis, por lo general, resulta del compromiso de huesos adyacentes. La meningitis puede ser aguda, pera es más común que sea lenta y crónica.
Patología de la coccidioidomicosis La respuesta del tejido a C. ¡mmitis es granulomatosa, con o sin caseificación. Las esférulas desarrolladas es típico encontrarlas en macrófagos y células gigantes multinucleadas. Las endoesporas dentro de las esférulas miden de 2 pm a 5 um. Las esférulas miden de 10 pm a 80 um, y las esférulas desarrolladas tienen un gran rango de tallas. El diagnóstico diferencial de las esférulas desarrolladas primariamente incluye formas no gemadas de B. dermatitidis o C. neolormans. Las esférulas deben diferenciarse de las formas fúngícas en adiaspíromicosis y rinosporidiosis; ambas son infecciones muy poco comunes en EE.UU.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Como con otros hongos dimórficos, la posibilidad de esta infección debe seguirse hasta el final. Las esférulas pueden demostrarse en los esputos
Figura 54-25. Dos esférulas de Coccidioides immilis en la muestra de esputo Preparación sin teñir (fotografía cortesía de Centers for Disease Control and Prevention)
Figura 54-26. Las colonias blancas y vellosas lijadas con tormalina del Coccidioides immitis pueden tener áreas de coloración gris (agar Sabouraud con cicloheximida incubada a 30°C).
o. más comúnmente, en lavados broncoalveolares (Fig. 54-25), pero la sensibilidad de los métodos citológicos es sólo aproximadamente del 50% (DiTomasso, 1994). Se utilizan las preparaciones frescas y el tinte calcoflúor blanco. La digestión con 10%-30% de KOH puede ser necesaria para eliminar elementos que sobran de tejido. Si está presente la enfermedad cavitaria, las hifas pueden estar presentes en las muestras clínicas. Al contrario que otros patógenos dimórficos, existe la posibilidad de comunicación de la artroconidia directamente de la muestra. C. immitis crece relativamente rápido (en menos de una semana) y puede incluso aparecer en las placas agar sangre en el laboratorio bacteriológico. La infección de los trabajadores del laboratorio es la preocupación principal, por eso los cultivos inoculados deben manejarse con gran cuidado en una cabina de seguridad de flujo laminar. Las sugerencias del manejo de estas muestras se explicó antes. Todo el trabajo debe llevarse a cabo en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar. Si se han inoculado placas de Petri, deben taparse con cuidado para evitar que la tapadera se salga accidentalmente. Las colonias de C. immitis son extremadamente variables en la apariencia, variando desde aterciopeladas o algodonosas a granulosas o polvo (Fig. 54-26). La morfología de la colonia puede cambiar según la colonia y el desarrollo de la artroconidia. La mayoría de los aislamientos son blancos, pero puede observarse una gran variedad de colores, y puede producirse un pigmento difuso por algunas cadenas. Los cultivos con frecuencia se convierten en más grises con el tiempo. En particular, debe considerarse la posibilidad de que este riesgo biológico pudiera haber sido aislado, cuando en un medio que contenga clicloheximida encontremos un hongo de rápido crecimiento. Si se sospecha C. immitis, algunos micólogos prefieren esterilizar el cultivo antes de examinar las colonias, llevando el contenedor con formalina al 10%, seguido por una incubación durante toda la noche. Las artroconidias en forma de barril con células de unión vacías son distintivas (Fig. 54-8). pero deben diferenciarse de otros organismos que producen artroconidias, como Trichosporon (véase Fig. 54-19), Geotrichum y algunos miembros de la familia Gymnoascaceae, por el test del exoanlígeno o por la hibridación de ácidos nucleicos, Al contrario que la histoplasmosis y la blastomicosis. el análisis serológico con el test de fijación del complemento es útil para valorar la extensión y el pronóstico de la coccidioidomicosis (Pappagianis, 1990). Se han utilizado varias técnicas serológicas, de las cuales se ha estudiado de un modo más extenso la lijación del complemento. Los anticuerpos se detectan aproximadamente en 2 a 6 semanas después de la infección. La cuantificación de título es indicador de la enfermedad diseminada y un título creciente es poco esperanzados al contrario que la situación normal, en la que la aparición de anticuerpos refleja el control de la infección. El test de piel no confunde el diagnóstico por producir una seroconversión, como en la histoplasmosis, pero
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
la alta prevalencia de una positividad del test cutáneo disminuye la utilidad del test. Los pacientes con enfermedad diseminada pueden mostrar anergia al antigeno del test cutáneo.
Sporothrix
schenckii
Factores de riesgo S. schenckii se encuentra normalmente en la vegetación alrededor de todo el mundo, aunque no parece que sea un patógeno de plantas. Las epidemias se han causado por una exposición a productos de plantas, como el musgo sphagnum utilizado en jardinería (D'Alessio, 1965; Grotte, 1981). Los patógenos lúngicos de plantas y ambientales en ocasiones cruzan los caminos. Asi como H. capsulatum estuvo implicado en el día de la limpieza de tierra, el S. schenckii causó infecciones en el día de la celebración de Arbor (Cote. 1988). Hubo una epidemia inusual entre miembros de un colegio de fraternidad en Florida, que estaban haciendo un muro con ladrillos empaquetados en paja contaminada mientras bebían gran cantidad de cerveza (Sanders, 1971). El único factor predisponente que se ha identificado con frecuencia es el consumo de alcohol. También se ha informado de la transmisión del S. schenckii de gatos infectados a humanos (Reed, 1993). Se ha observado infección diseminada en pacientes inmunodeprimidos (Lynch. 1970). La puerta de entrada por lo general es una entrada traumática por la que los hongos pasan a través de la piel, como ocurrió con los estudiantes, que tenian las manos dañadas por coger ladrillos contaminados. El estereotipo de paciente con riesgo de esporotncosis es un jardinero de rosas alcohólico.
Enfermedad clínica La lorma clínica que sin duda predomina de esporotricosis es la cutánea o linfocutánea. Una pápula en la puerta de entrada puede ulcerarse. La rapidez del patógeno a través de los linfáticos regionales puede terminar en una serie de lesiones que avanzan en el miembro afectado. La esporotricosis sistémica. que no es común, podría ser por la inhalación de esporas en el tracto respiratorio bajo (Pluss, 1986). El sistema esquelético, que incluye huesos (Lynch. 1970) y articulaciones (Crout. 1977), es el más afectado.
Patogenia de la esporotricosis Las respuestas histológicas al Sporothrix y Blastomyces son similares (Lurie. 1963). La inflamación granulomatosa puede acompañarse de pequeñas colecciones de neutrófilos polimorfonucleares. En la piel, es común la hiperplasia seudoepiteliomatosa. Las células levaduras del S. schenckii son pleomórficas. redondas o alargadas, y se han comparado con cigarros, pero rara vez se ven en el tejido. Una reacción del tejido al hongo puede terminar en radiar material eosinófilo de un grosor mayor de 10 pm alrededor de la célula levadura; este fenómeno se conoce como Esplendor Hoepph. Desafortunadamente, esta reacción tan distintiva del tejido no puede verse y no es específica para la esporotricosis. El diagnóstico diferencial de las lesiones culáneas es, en primer lugar, una infección micobacteriana, especialmente Mycobacterium marinum (granuloma de las piscinas), en EE.UU., y una leishmaniosis cutánea en los trópicos.
П81
conidias de pared ancha, oscuras, que son las responsables del color oscuro que vemos macroscópicamente, que están sujetas directamente a las hifas (Sutton, 1998). Las microconidias de pared fina nacen de las conidioforas que crecen de los ángulos rectos de las hifas; pueden organizarse alrededor de una vesícula expandida en la punta de la conidiofora formando una estructura que ha sido denominada racimo (Fig. 54-27). Las especies de Acremonium producen estructuras similares, que raramente se han descrito como una causa de enfermedad humana, y también son producidas por un saprofito que rara vez es aislado. Ophiosloma stenoceras. Estos mohos se diferencian del Sporothrix por la ausencia de crecimiento en un medio agar con cicloheximida y por la ausencia de fase levadura. La conversion de la fase moho a levadura se finaliza por la incubación del aislamiento a 37 С en un medio rico, como el agar de infusión cerebro-corazón o el agar sangre glucosa cisteína. Los test cutáneos y ensayos serológicos para el diagnóstico de la esporotricosis han sido descritos pero aún no están disponibles.
Otros hongos dimórficos El H. capsulatum variante duboissi causa enfermedades cutáneas y sistémicas en África. Las levaduras son más grandes que las del H. capsulatum variante capsulatum. y las paredes son más gruesas, recordando a las células del B. dermatitidis. pero sin los bordes de base ancha. El Paracoccidioide brasiliensis produce infecciones cutáneas, diseminadas y pulmonares en América Central y del Sur (Londero. 1972: Restrepo, 1970). Hay pocos casos importados de paracoccídioidomicosis, que se producen ocasionalmente en EE.UU. (Murray, 1974). Las células levaduriformes características del Paracoccidioides tienen múltiples brotes periféricos, dando una apariencia que se ha comparado con una rueda marina. La infección por P. mametlei se caracteriza por células intracelulares parecidas a las levaduras que recuerdan al H capsulatum en macrófagos. Esta infección es endémica en el sureste asiático, pero se han descrito casos importados en pacientes inmunocomprometidos que regresaron a EE.UU.
DERMATOFITOS Los hongos dermatofitos son causas comunes e importantes de morbilidad humana, pero no producen infecciones que pongan en peligro la vida (Hay. 1992; Midgley, 1994; Odom. 1994: Weitzman, 1995). Se reconocen tres géneros: Microsporum. Trichophyton y Epidermophyton. Las especies de Acremonium, especies de Fusarium. Scytalidium spp. y las especies de Scopulanopsis en ocasiones han estado implicadas en enfermedades de las uñas (onicomicosis). Los hechos ocasionales de un papel etiológico para otros hon-
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones La muestra preferida es una aspiración, un curetaje o una biopsia de la lesión cutánea. S. schenckii crece bien en un medio de aislamiento primario incubado a 25C-30 C. Es resistente a la cicloheximida. Las colonias, que pueden ser lisas o húmedas (glabrosas), al principio son por lo general de color banco (Lámina 54-8), y pueden volverse más oscuras con el tiempo. El S. schenckii. produce dos tipos de conidias: conidias hialinas de pared lina, que se organizan como una roseta alrededor del ápex de la conidiofora. y las
Figura 54-27. Las conidias de Sporothnx schenckii nacen en grupos en los extremos de las conidioforas laterales (lactofenol anilina azul).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
gos saprofíticos son difíciles de evaluar por la existencia común de estos mohos como colonizantes o contaminantes de la flora. Como un grupo, los hongos dermatofitos se distribuyen alrededor del mundo, pero las especies individuales pueden tener una distribución geográfica más restringida (Aly, 1994). Los dermatofitos pueden encontrarse asociados con humanos (antropofílicos), con animales (zoofílicos) o con tierra (geofilicos). Los factores de riesgo incluyen el contacto con la fuente de infección, que nos puede dar una pista para el diagnóstico. Por ejemplo, la infección de la cara en granjeros que se apoyan en las vacas mientras las ordeñan es característicamente causada por el T. verrucosum. un dermatofito zoofílico que se encuentra en el ganado. La importancia de la variación geográfica en los patógenos dermatofíticos se ilustra en un estudio de una epidemia de infección cutáneo fúngica entre tropas americanas durante la guerra de Vietnam (Alien. 1973). La mayoría de las infecciones fueron causadas por una variante con gran esporulación del T. mentagrophytes, que no se había reconocido en EE.UU. Las tropas americanas tuvieron mucho mayor nesgo de infección que los vietnamitas. Epidemiológicamente, las foliculitis y lesiones anulares se asociaban con el tiempo de servicio en Vietnam y el tiempo pasado en una patrulla. La infección se producía de modo predominante en la estación de lluvias, y la única fuente que no fuera humana de los hongos eran las ratas. Las asociaciones medioambientales de los hongos dermatofíticos aislados con mayor frecuencia se resumen en la Tabla 54-12.
Enfermedad clínica Los dermatofitos producen infección de la epidermis, del pelo y de las uñas (Hay. 1992). La infección de la dermis y tejido subcutáneo se produce rara vez. La infección del pelo y la piel por lo general se refieren como una imagen en lombriz anular, un nombre derivado del avance serpíginoso de
Tabla 54-12
las lesiones. La terminología clínica utiliza el nombre latino linea seguido de la parte del cuerpo afectada, como linea capitis (cabello), linea barbae (barba), linea corporis (tronco y miembros), linea pedis (pie de atleta) o linea cruris (Inguinal). En ocasiones excepcionales, el Epidermophyton floccosum infecta sólo la piel. Microsporum spp. y Trichophyton spp. afectan al cabello, así como a la piel fina. El Trichophyton spp. produce infección de las uñas (onicomicosis), así como del cabello y la piel. I tonsurans es la causa más común de infección del pelo en EE. UU. M. canis es una causa común de infección del cuero cabelludo, sobre todo en niños. Cuando hay una infección profunda del folículo del pelo, se produce un proceso inflamatorio llamado querión. El T. mentagrophytes y el T. verrucosum se asocian particularmente con querión. T. mentagrophytes, T. rubrum y M. canis se encuentran normalmente en la linea corporis y linea pedis. Las lesiones producidas por T. rubrum por lo general son crónicas e intratables. El E. floccosum es una causa común de linea cruns y tinea pedís. Las enfermedades dermatofiticas se limitan a la epidermis. Sólo raras veces hay una invasión más profunda por los mohos. La diseminación de la infección es poco corriente y, por lo general, se produce cuando la inmunosupresión es grave (Porro, 1997).
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones El tratamiento de las infecciones dermatofiticas no se dirige por la identificación específica del aislamiento, por eso la demostración de hífas en los raspados de piel es importante para el inicio del tratamiento (Fig. 54-28), La talla y morfología de las hitas sugiere la inclusión de los dermatofitos en la infección. La confirmación de la identificación específica generalmente no es necesaria, pero es útil para confirmar que las hitas, en realidad, pertenecen a los hongos dermatofíticos, para valorar la fuente probable de infección y
Características de los m o h o s dermatofíticos
Dermatofito Microsporum audouinii Microsporum canis
Microsporum gypseum
Ecología
Tasa de crecimiento
Estructuras d i a g n ó s t i c a s
Antropolílico
Lento
Raramente observadas
Zoofílico
Moderado (6-10 días)
Rugosa o espinosa, de pared gruesa, macroconidias de contorno espinoso: 2-14 septos; microconidias con forma de porra Suave o finamente rugosa, macroconidias de pared gruesa. 4-6 septos, microconidias con forma de porra Microconidias típicamente redondas y agrupadas en ramas de conidioforas (racimos de uvas): puede tener forma de lágrima: macroconidias de pared fina y lorma de cigarrillo Microconidias con lorma de lágrima ("pájaros en una verja"). Puede formarse en macroconidias; macroconidias más largas y estrechas que las del Trichophyton mentagrophytes Microconidias pequeñas y delicadas; ocasionales macroconidias finas (en cola de rata)
Geofilico
Moderado
Trichophyton mentagrophytes
Zoofílico, antropofilico
Moderado
Trichophyton rubrum
Antropofilico
Lento (hasta 14 días)
Trichophyton verrucosum
Zoofílico
Lento
Trichophyton tonsurans
Antropofilico
Lento
Epidermophyton floccosum
Antropofilico
Moderado
Microconidias con forma de lágrima o de porra con un tamaño muy variable, raras macroconidias Macroconidias caracteristicas. no microconidias
Test auxiliares
Z o n a s más frecuentes
Lámpara de Wood del pelo Lámpara de Wood del pelo: pigmento brillante amarillo limón
Cuero cabelludo
Colonia en estallido de estrella; color desde marrón a canela
Cuero cabelludo, piel
Penetración del pelo positivo; ureasa positiva; a veces puede producir pigmento rojo
Piel, cuero cabelludo, barba
Pigmento rojo intenso que puede ser incrementado en medios especiales, como el agar patata; ureasa negativa; penetración del pelo negativa Cadenas de conidias a 37°C; mejor crecimiento en agar T3 o en agar T3 yT4 Mejor crecimiento en agar T3 y T4
Piel, uñas
Cuero cabelludo, piel
Ninguno
Pie
Cuero cabelludo, piel
Barba, cuero cabelludo, piel
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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macroconidias, que diagnósticamente no son útiles. M. audouinii, un agente antropolilico clásico de forma anular, produce pocas, o ninguna, estructuras diagnósticas. Afortunadamente, en la actualidad no se aisla con frecuencia, quizá porque hay mayor higiene. Las características de las estructuras diagnósticas producidas por los patógenos más comunes se resumen en la Tabla 54-12. M. canis. las especies que con mas frecuencia se aislan, produce un pigmento amarillo limón característico (Lamina 54-9) que se intensifica por el crecimiento en agar copos de patata. Las macroconidias de estas especies se muestran en la Figura 54-29. Las macroconidias del M. gypseum. las especies geofílicas mas comúnmente aisladas, se muestran en la Figura 54-30.
Especies de Trichophyton
Figura 54-28. Las hifas de un dermatolilo se demuestran en un raspado de una lesión de liña. La presencia de estas hifas finamente segmentadas establece el diagnostico de dermatomicosis. aunque no define la especie etiológica (preparación con KOH). (Fotografía cortesía de Centers for Disease Control and Prevention.)
para valorar el incremento de parecido para infecciones crónicas y recaídas cuando aislamos T. rubrum. Los raspados de piel, uñas y pelos pueden examinarse en preparaciones de KOH, que puede incorporar calcoflúor blanco para facilitar la detección de hifas. Los fragmentos de tejidos, fibras y los cristales de colesterol pueden ser confundidos con hifas por un observador inexperto. Los pelos infectados deben seleccionarse para analizarlos. Cuando el hongo que infecta es H. audouinii. M. canls o M. ferrugineum. el pelo flúoresce con una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lámpara de Wood). M. canis es el único miembro de este trio de patógenos que se aisla normalmente en EE.UU. El examen microscópico de la relación de los hongos con el pelo infectado puede usarse para estrechar el diagnóstico diferencial del agente etiológico: esporas en el exterior del pelo (entothrix), esporas dentro del pelo (ecdolhrix), hifas sin esporas dentro del pelo, o que no haya invasión del pelo. El análisis de los pelos infectados requiere una experiencia considerable y una práctica regular. Los pelos infectados, raspados de uñas o raspados de los bordes de las lesiones cutáneas deben llevarse al laboratorio en un recipiente limpio y seco o ser colocados en la superficie de un medio de aislamiento primario suministrado por el laboratorio. Se ha sugerido picar los recortes de uñas en un homogeneizador como un aumento de las levaduras de los dermatolilos. El agar de dexlrosa Sabouraud (ue elegido para recuperar los hongos dermatofíticos, y también es efectivo para aislar Candida spp., especialmente C. albicans, la cual puede producir infecciones similares de la piel y uñas. La cicloheximida no inhibe los dermatofitos, pero si inhibe muchos hongos saprofíticos. El medio del test dermatofito, que produce un pigmento rojo en la alcalinización, es utilizado normalmente por los dermatólogos para demostrar la presencia de un dermatofito, que por lo general no se estudia más. Desafortunadamente, el medio del test de dermatofitos no es específico para dermatofitos. Otros organismos, incluido H. capsulatum, pueden alcalinizar este medio, y no es el medio de aislamiento preferido por los laboratorios clínicos.
El género Trichophyton incluye los hongos dermatofíticos importantes: 7! tonsurans (Fig. 54-10 y Lámina 54-10). T. rubrum (Lámina 54-11), T. verrucosum y I mentagrophytes (Lámina 54-12 y Fig. 54-31). Las colonias pueden tener apariencia de pelusa, granular o, menos comúnmente glabrosa. Las macroconidias, que son extremadamente útiles para la identificación, pueden ser producidas por este género, en especial en cadenas que producen colonias en polvo, pero desafortunadamente suelen estar ausentes. Las microconidias se forman con más frecuencia. Las microconidias tiene pared fina, lisa, y tienen un número variable de septos. La apariencia clásica de las estructuras diagnósticas en las especies que se aislan más comúnmente se resumen en la Tabla 54-12. En el mundo real, la interpretación de la morfología microscópica en algunos aislamientos puede ser muy difícil, porque con frecuencia se forma un solapamiento. Afortunadamente, los test adicionales son útiles para hacer diferenciaciones especificas dentro del género (Tabla 54-12). En particular, los agares Trichophyton son útiles para la caracterización de los requerimientos nutricionales entre los miembros del género (Fig. 54-32). Se han descrito siete medios, de los cuales hemos encontrado los cuatro primeros medios a base de ácido casamino como los más útiles. En combinación, estos medios permiten la valoración de la dependencia en inositol, liamina o ambos componentes juntos. La diferenciación de T. mentagrophytes y 7! rubrum se facilita por varios test no morfológicos (Tabla 54-12). Un pigmento difusible puede ser producido por ambas especies, pero el pigmento rojo intenso del T. rubrum se fomenta por el cultivo en agar copos de patata o agar córnea con dextrosa al 1%. La producción de ureasa dentro de los tres o cinco días por T. mentagrophytes. pero no por T. rubrum, ayuda a diterenciar estas dos especies. Por ultimo el test de penetración del pelo puede utilizarse como un test diferencial. T. mentagrophytes produce defectos en forma de cuña en los pelos in vitro (Fig. 54-33), mientras tanto T. rubrum crece fuera del pelo sin pene-
Todos los hongos dermatofíticos tienen septos, hifas hialinas. Producen macro y microconidías de vanas combinaciones. También pueden producirse artroconidias y clamidiosporas. pero la morfología de las macroconidias y especialmente, la de las microconidias es más importante para la identificación. Se ha identificado el estado sexual de muchos dermatofitos, pero no se han encontrado en el laboratorio clínico.
Especies de
Microsporum
Las especies de Microsporum producen macroconidias características. Figura 54-29. Macroconidias de pared gruesa, rugosas y afiladas de Microsporum que son las estructuras diagnósticas clave. En algunos casos se producen canis e hifas finas segmentadas (lactofenol anilina azul).
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 54-30. Macroconidias lisas de pared gruesa del Microsporum gypseum (laclolenol algodón azul).
Figura 54-32. Agares de Trichophyton. El crecimiento del Trichophyton verrucosum se aumentaba en agar T (contiene tiamma e inositol) en comparación con los agaresT. yT, s
trar en él. El uso de ambos acercamientos, morfológico y no morfológico, proporciona la identificación más exacta de los aislamientos suficientes para proporcionar experiencia continua con las características diagnósticas de estos mohos.
Epidermophyton
floccosum
colonias, que en principio son marrones amarillentas, grises o marrón caqui, a medida que maduran se vuelven aterciopeladas y se pliegan. E. lloccosum no produce microconidias. pero unas macroconidias distintivas proporcionan las pistas para la identificación (Fig. 54-11). Estas estructuras tienen paredes externas lisas, más de cuatro paredes cruzadas y forma de palo.
El único patógeno dentro del género Epidermophyton es un hongo antropofilico. que es una causa importante de Tinea cruris y linea pedis. Las
MOHOS DEMATIACENOS
Medio
Constituyentes
T1
Medio basal
T2 T3
Inositol + liamina
T4
Tiamina
Inositol
Interpretación del Crecimiento estimulado Agar con el que se comparan otras formulaciones Estimulado con mositol solo Estimulado solo cuando están presentes los dos compuestos Estimulado con tiamina sola
Figura 54-31. Gaipos de microconidias y macroconidias de pared fina de 7richophyton mentagrophytes (laclofenol algodón azul) (Fotografías cortesía de Centers lor Disease Control and Prevention.)
Los mohos dematiacenos son un grupo fascinante y complejo de hongos que producen enfermedad debilitante de la piel y del tejido subcutáneo y pueden invadir profundamente. Las infecciones se encuentran más comúnmente en los trópicos y subtrópicos, aunque la infección diseminada puede raramente encontrarse en EE.UU.. especialmente entre pacientes gravemente inmunocomprometidos. La clasificación de estos mohos ha registrado cambios según se ha ido refinando el entendimiento de la conidiogénesis (Larone, 1989). Se muestra un resumen breve de las formas clínicas de enfermedad producidas por especies patogénicas, pero la descripción detallada de la micología está más allá del propósito de este capítulo. La mor-
Figura 54-33. Penetraciön del pelo por Trichophyton mentagrophytes El pelo es penetrado por las hilas por los lados (Fotografia cortesia de Centers for Disease Control and Prevention)
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
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en la que las hilas pueden estar dentro de los senos o. menos comúnmente, extenderse a través de las paredes oseas para invadir el tejido adyacente. Entre las especies que producen esta infección, se encuentran S/polaris spp., Curvularia spp. y Alternaría spp. Los hongos dematiacenos son causas raras de queratomicosis. La característica diagnóstica de la feohilomicosis. es una pigmentación marrón de la melanina de las hifas. El color generalmente puede percibirse en trozos sin teñir. Las cadenas poco pigmentadas pueden reconocerse al aplicar un tinte para la melanina. como la técnica Fontana-Masson.
CIGOMICETOS
Figura 54-34. Cadenas de conidias producidas por especies de Cladosporium, un germen aislado en el medio ambiente de los laboratorios clínicos. Las hilas son septadas Tanlo las hitas como las conidias están pigmentadas de color oscuro (lactolenol anilina azul).
Los cigomicetos son causas importantes de infecciones fungicas en huéspedes comprometidos (Williams, 1976). El patógeno más común es el Rhizopus. Otros mohos que han estado implicados en la enfermedad humana son Absidia. Rhizomucor, Mucor y Cunnmghamella (Bergman. 1969). La enfermedad invasiva causada por estos hongos se ha llamado históricamente mucormicosis. En vista de que las especies Mucor son causas poco comunes de infecciones, un término clínico mejor, es cigomicosis.
Factores de riesgo y enfermedad clínica fologia de las especies de Cladosporium. mohos saprofíticos comunes que frecuentemente encontramos en laboratorios clínicos, se muestra en la Lámina 54-2 y en la Figura 54-34. El crecimiento lento y el crecimiento en presencia de cicloheximida. el aislamiento del tejido y los hallazgos histológicos compatibles y/o historias clínicas son pistas que pueden encontrarse en las especies patógenas. Es importante comentar con los médicos las características clínicas del caso antes de catalogar estos mohos como insignificantes.
Enfermedad clínica El Micetoma es una infección crónica indolente de la piel y del tejido blando que se desarrolla en el lugar de la inoculación de una variedad de hongos o bacterias. La infección puede extenderse profundamente, incluso llegar al hueso, y por lo general se desarrollan senos drenantes. La infección la encontramos más frecuentemente en los trópicos y subtrópicos, pero pueden encontrarse en el sur de EE.UU. Madurella mycetomatis es el patógeno dematíaceno más común. Hay lesiones parecidas que pueden producirse por otros hongos (p. ej., Acremonium. Pseudallescheria boydti. Fusanum). por actinomicetos aeróbicos (Nocardia. Slreptomyces. Actinomadura) y ocasionalmente por bacterias (botriomicosis).
Hay dos presentaciones clínicas comunes de la cigomícosis. y los factores de riesgo son algo diferentes entre ambas (Straatsma. 1962). Una infección invasiva que empieza en los senos paranasales se conoce como cigomícosis rinocerebral o craneofacial. La infección comienza como una sinusitis indiferenciada. pero las hifas rápidamente atraviesan las paredes finas del seno y se extienden por la órbita, avanzando hasta la piel de la cara e introduciéndose en la cavidad craneal. El factor de riesgo para este tipo de infección es predominantemente la diabetes mellitus, y la mayoría de los pacientes presentan cetoacidosis en el momento en que la infección se desarrolla (McNulty, 1982). La enfermedad rinocerebral puede avanzar rápidamente y. por lo general, suele terminar en la muerte. Puede producirse una trombosis de la arteria carótida o del seno cavernoso. La segunda presentación principal de la cigomícosis es la enfermedad pulmonar, que puede seguirse de una diseminación hematógena. La infección comienza con una neumonía no diferenciada que puede complicarse con hemoptisis y cavitación. La diseminación de la infección es común y el
La cromoblastomicosis es una infección crónica, de avance lento, de la piel y del tejido subcutáneo que se produce principalmente en pacientes que viven en los trópicos. Se producen algunos casos aislados ocasionalmente en el sur de EE. UU. Las lesiones pueden ser únicas o múltiples, y pueden parecerse a las lesiones cutáneas de blaslomicosís. La característica que la distingue es la presencia de células redondas, no hítales y marrones (cuerpos muriformes) en los tejidos (Fig. 54-35). Estas estructuras, que se dividen por seplación, son diagnósticas, aunque no proporcionan una pista para identificar el moho. Los agentes etiológicos de la cromoblastomicosis son Phialophora verrucosa. Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea compacta. Rhinocladiella aquaspersa. Cladosporium carnonii. E. jeanselmei y E spinilera. Feohilomicosis es un término utilizado para describir la infección del tejido cutáneo y subcutáneo, y de los órganos sistémicos, particularmente el sistema nervioso central. Estas infecciones oscilan entre lesiones subcutáneas indolentes, probablemente como resultado de la inoculación directa de hongos de la zona, y una infección devastadora y destructiva que casi siempre es mortal. Los aislamientos más frecuentes han sido E. jeanselmei. E. dermalitidis. Cladosporium bantianum (trichoides). especies de Fonsecaea y especies de Bipolaris. Una entidad clínica distintiva es la sinusitis crónica.
Figura 54-35. Cuerpos muriformes de un hongo dematíaceno en una lesión de cromoblastomicosis. Las células oscuramente pigmentadas están sutnendo seplación. En la lesión están presentes macrófagos y células gigantes multmucleadas (tinción hematoxilina-eosma).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
desenlace casi siempre latal. Los factores de riesgo para la infección pulmonar son neutropenía e inmunosupresión. particularmente por malignidad hematológica (Meyer. 1972). Otros factores de riesgo que se han observado son una sobrecarga de hierro, abuso de drogas intravenosas y uremia (Kwon-Chung, 1992). La diabetes con cetoacidosis está presente en algunos pacientes. Una presentación menos común de la cigomicosis es la infección de la piel y de los tejidos blandos (Meyer, 1973a). Las hifas pueden alcanzar la piel por vía hematógena, por una extensión directa de un foco profundo o por introducción del exterior. Un comienzo drástico de enfermedad del tejido blando se produjo en pacientes que estaban contaminados con esporas Rhizopus (Gartenberg, 1978). Antes de que se hiciera el potencial de infección, los fabricantes no siguieron los pasos para la esterilidad de los vendajes. Las heridas por arma blanca y otro tipo de heridas traumáticas también son zonas de entrada de estos hongos comunes en el ambiente (Cocanour. 1992). La enfermedad pulmonar limitada con cavitación es una presentación poco usual de la cigomicosis en individuos inmunológicamente competentes (Record, 1976).
Figura 54-36. Una coloma gris vellosa de Rhizopus llena el espacio de la placa de Petri (lid lifters) (fotografia cortesia de Centers for Disease Control and Prevention).
Patología de la infección por cigomicetos La histopatologia está dominada por la necrosis del tejido, sin reparar en la zona de infección (Straatsma. 1962). La propensión de estos mohos para invadir a través de las paredes de las arterias y venas, produciendo trombosis agudas, conducen a necrosis coagulativa extensa. Las hifas aparecen como cintas de hifas anchas que por lo general están torcidas y plegadas (Fig. 54-3). Los septos están esparcidos y por lo general no se observan en el tejido, pero un londo compuesto de las paredes exteriores de las hifas plegadas puede confundirse con septos. Los segmentos hinchados de las hifas y las hifas cortadas en perpendicular pueden ser malinterpretadas por células levaduriformes. Las ramificaciones tienen tendencia a producirse en ángulos rectos. Las hitas de estos mohos con frecuencia se tiñen mejor con hematoxilina-eosina que con la técnica de ácido periódico de Schiff o incluso el método de plata metenamina.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Los cigomicetos con frecuencia están considerados como contaminantes comunes (Kwon-Chung. 1992). Las implicaciones clínicas potenciales de los aislamientos deberían investigarse cuidadosamente antes de que sean tachadas de saprofitos. La demostración de hifas en el tejido nos proporciona una evidencia importante de que un moho aislado estuvo presente in vivo y no es un contaminante medioambiental. Las hifas anchas y con septos esparcidos pueden demostrarse en trozos de tejidos o en extensiones impresas de tejido usando el tinte de calcoflúor blanco. El tejido debe ser corlado, mejor que sea homogeneizado. después de lo que se inyecta en la superficie de un aislamiento agar primario. Los cigomicetos se inhiben por la cicloheximida. Los aislamientos crecen rápido y producen abundantes hifas aéreas que rápidamente alcanzan la tapg de las placas Petri "lid lifters". Los cigomicetos producen cigosporas sexuales in vilro. pero las estructuras reproductivas asexuales son más útiles para la identificación. La identificación de especies es difícil, y para la mayoría de los propósitos clínicos no es necesaria.
Especies de Rhizopus Los Rhizopus crecen rápidamente, llenando las placas de Petri dentro de las 48-72 horas con hifas blancas y como de lana, pasando de gris a negro según se desarrollan las esporas (Fig. 54-36). Los esporangios diagnósticos se encuentran mejor en los bordes o en el centro del cultivo, donde pueden verse como puntos negros. Las hifas son anchas (de 6 pm a 15 pm de diámetro), raramente septadas e hialinas. Las esporangiosporas no tienen ramificaciones y sostienen esporangiosporas redondas (de 60 pm a 350 LIm) con una columela elipsoidal. Las esporangiosporas (5 ppm) son
ovales o romboidales y pueden tener un pigmento marrón (Fig. 54-5). Una característica diagnostica importante es la presencia de estructuras hialinas parecidas de raiz marrón (rizoides), que se desarrollan en el punto donde crecen las esporangiosporas (Fig. 54-5). Se ha inlormado de que el 60% de los casos de cigomicosis y el 90% de los casos de enfermedad rinocerebral son causadas por el Rhizopus arrhizus (citado en KnownChung, 1992)
Otros cigomicetos A diferencia de Rhizopus. los rizoides de las especies de Absidia surgen de los estolones de las conidioforas. Las esporangiosporas de Absidia tienen forma de pera más que redondas, y se ve un collarete alrededor de la columela cuando los esporangios se desintegran. Las especies Mucor no producen rizoides. Las conidioforas generalmente están más ramificadas que otros cigomicetos, y no hay crecimiento por encima de 37 C. El Rhizomucor. que es morfológicamente intermedio entre Rhizopus y Mucor. tiene rizoides rudimentarios y conidioforas ramificadas, y crece a temperaturas de hasta 58 C. Uno de los patógenos principales en el género Mucor (Mucor pusillus) se ha translerido al género Rhizomucor. Cunninghamella produce vesículas hinchadas en la punta de las conidioforas. Desde las vesículas, múltiples esporangiolas unicelulares crecen en tallos pequeños.
MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS) Este gran grupo de hongos saprofitos se encuentra con frecuencia en el laboratorio clínico y contiene algunos de los mohos patógenos más importantes. En esta sección consideramos Aspergillus, Fusanum. Penicillium. Paecilomyces y Pseudalieschezria. Pseudallescheria boydii. el patógeno más común en este género, tiene una fase asexual llamada Scedosporium apiospermum, y el moho puede encontrarse de cualquier forma. Este moho se considera generalmente como un organismo hialino (Sutton, 1998). aunque algunas autoridades lo han colocado en el grupo de dematiacenos (Larone, 1992). Cualquiera de los miembros de este grupo puede ser patogénico bajo las condiciones clínicas adecuadas. Debería intentarse una correlación clínica cuidadosa antes de descartar aislamientos de tejidos y fluidos como contaminantes. Por otro lado, es un error aceptar sin criticar el aislamiento de un patógeno no común como evidencia de que no se ha determinado la etiología de la infección. Son de utilidad múltiples aislamientos de mohos, y una documentación de patogenicidad requiere una correlación patológica.
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICOTICAS
Factores de riesgo Los hipomicetos son hongos ubicuos a los que todos nosotros estamos expuestos de manera regular. Residen en todo tipo de vegetación. Aspergillus fumigatus está presente en hojas de vegetales y se ha descrito la enfermedad alérgica en pacientes que estuvieron expuestos a excrementos de abonos (Kramer. 1989). A. fumigatus y A. Nigerse aislaron en una planta en la habitación de un paciente con aspergillosis (cita de Know-Chung, 1992). y los comienzos han coincidido con la construcción del hospital (Amow. 1978; Sherertz, 1987). Será prudente, por tanto, evitar la exposición de los pacientes más gravemente inmunocomprometidos. En un estudio epidemiológico, no hubo ningún caso de aspergillosis invasiva en 39 pacientes que residían en habitaciones con un filtro de aire HEPA. mientras que hubo 14 infecciones invasivas en 74 pacientes similares que estaban en habitaciones convencionales (Sherertz. 1987). Los factores de riesgo más importantes para la infección invasiva por hipomicetos son enfermedad inmunosupresiva o quimioterapia (Scherr, 1992: Walker, 1978: Williams. 1976). La neutropenia también es un factor predisponente importante (Young. 1989). Es importante reconocer, sin embargo, que puede haber una enfermedad invasiva grave en pacientes que no están inmunodeprimidos por la quimioterapia o por enfermedad maligna (Rosenberg, 1982; Smith. 1982). Es rara, sin embargo, la enfermedad invasiva en individuos totalmente normales. Las infecciones locales superficiales, que pueden extenderse a estructuras más profundas o diseminarse a otros órganos, pueden terminar en quirófano (Stern, 1986) o habrá que usar medicaciones, especialmente corticoesteroides, por una infección local o una aplicación tópica. Las infecciones de las heridas han sido un problema en pacientes con quemaduras extensas y en individuos expuestos a materiales contaminados con conidias, una situación típica de los cigomicetos (McCarty. 1986). Las bolas de hongos en los pulmones se producen en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquiectasias y con cavidades antiguas causadas por tuberculosis. En los senos paranasales también existen bolas de hongos causadas tanto por especies hialinas como por dematiacenos.
Enfermedad clínica Infecciones ótica y ocular La queratomicosis por lo general es consecuencia de un traumatismo del ojo, especialmente en pacientes que han sido tratados con esteroides tópicos. El dolor y la visión borrosa siguen al traumatismo, y si no se trata adecuadamente, la infección puede extenderse a la cámara anterior. Si el proceso no se comprueba, puede ser necesaria una enucleación. A. fumigatus (Gingrich, 1962) y Fusarium sotaní son agentes etiológicos comunes (Liesegang, 1980). La otomicosis es una infección del oído extemo, causada generalmente por A. niger o A. fumigatus. Dolor, pérdida de audición y disfunción se acompañan de un crecimiento de una pelusa verde o negra en el canal de la oreja. La extensión más allá del oído externo es rara (Phillips. 1990), pero puede producirse en pacientes inmunodeprimidos.
Infección
cutánea
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(Conlan. 1987). La invasión a través de las paredes de los senos paranasales es la complicación más seria de la enfermedad de vía aérea alta, y es de gran importancia en los pacientes infectados por VIH (Meyer. 1994). La colonización endobronquial también se produce en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica y en pacientes con fibrosis quistica que puedan tener bronquiectasias (Gilligan, 1991; Nelson, 1979). A. fumigatus es el moho más común aislado en pacientes con fibrosis quistica. pero hemos encontrado otros mohos, como las especies de Penicillium. las especies de Paecilomyces y S. apiospermum. El curso clínico de la mayoría de los pacientes con fibrosis quistica no parece modificarse por la presencia de Aspergillus en los pulmones, pero se ha descrito una aspergillosis alérgica broncopulmonar en parte de estos individuos, que desarrollan hipersensibilidad a los antigenos fúngicos (Nelson, 1979). A. fumigatus y A. niger son mohos comunes encontrados en las bolas fungicas pulmonares. A fumigatus. A. flavus y Fusarium spp.. al igual que los hongos dematiacenos. se encuentran normalmente en los senos paranasales. La aspergillosis broncopulmonar alérgica es una complicación en pacientes que tienen una diátesis alérgica (Ahmad, 1984; Golbert, 1970). Las hifas colonizan el tracto respiratorio bajo, pero no invaden el tejido. La detección de anticuerpos precipitantes en el suero es útil, pero algunos investigadores no consideran que los reactantes disponibles comercialmenle sean validos (Kwon-Chung. 1992). Las manifestaciones clínicas incluyen asma, infiltrados pulmonares y, al final, fibrosis pulmonar en algunos pacientes. Las especies de Aspergillus son los agentes incitanles más comunes. Un proceso similar puede incluir los senos paranasales (Katzenstem, 1983).
Infección pulmonar y enfermedad invasiva La neumonía puede ser difícil diferenciarla de un proceso bacteriano, pero la tos y la producción de esputo son con frecuencia menos marcados que en la mayoría de las neumonías bacterianas (Mehta, 1984). La progresión hasta la cavitación y la falta de respuesta a los antibióticos son pistas que deberían considerarse en la infección fúngica. Un aislamiento repetitivo del mismo moho de muestras clínicas aumenta la probabilidad de que el hongo sea un colonizador o patógeno invasivo más que un contaminante de laboratorio. La demostración de hifas en muestras clínicas indica que el moho está presente in vivo. La caracterización definitiva del proceso infeccioso puede precisar una correlación clínica cuidadosa y con frecuencia un estudio morfológico de las muestras de tejido. La diseminación desde el pulmón u otras zonas puede incluir cualquier órgano (Meyer, 1973b). La propensión de las hifas para invadir las estructuras vasculares y causar trombosis conduce a infartos y abscesos en múltiples órganos. A. fumigatus y A. flavus son las especies que con más frecuencia se aislan, pero otras especies de Aspergillus. como A. terreus. también producen neumonía e infección diseminada (Tritz. 1993). A. niger rata vez lo encontramos en enfermedad invasiva, pero virtualmenfe cualquier hongo puede producir infección diseminada si las condiciones clínicas y medioambientales son adecuadas.
Patología de la infección por hipomicetos
Bolas de hongos
La respuesta histológica a estos agentes puede ser granulomatosa. pero normalmente está más dominada por los neutrófilos polimorfonucleares, a menos que el paciente esté gravemente neutropénico. La invasión vascular, la trombosis y el infarto con frecuencia son características importantes. Las hifas son delgadas (de 2 jim a 5 uní), septadas y ramificadas en ángulos agudos (dicotomos) (Fig. 54-2). El tinte hematoxilina-eosina con frecuencia colorea bien las hifas. pero, para avanzar, puede verse la morfología con las técnicas del ácido periódico de Schiff o la técnica de plata metenamma. Es importante darse cuenta de que es imposible identificar el moho por la morfología de las hifas. ¡Ramificación dicotómica, hifas delgadas y septadas no siempre es igual a Aspergillus.'
Las dos zonas más comunes para esta infección son los senos paranasales y las cavidades pulmonares (Dar. 1984: Meyer. 1994). En los senos, los signos y síntomas son los de la sinusitis crónica. Las bolas de hongos pulmonares con frecuencia son asintomáticas, pero pueden producir hemoptisis
Cuando el proceso patológico es una bola de hongos, las hilas que presumiblemente están muertas pueden teñirse pobremente con todos los tintes. Cuando la cavidad está en contacto con el aire, como en el pulmón o en los senos, pueden desarrollarse unas cabezas afrutadas, un suceso que
Las especies de Aspergillus pueden infectar la piel después de la diseminación desde otra zona, por lo general pulmonar, tanto en pacientes infectados por VIH como en pacientes no infectados. Es menos común que haya una infección cutánea primaria en cualquier grupo. Entre los factores de riesgo reconocidos está la inmunosupresión. pero también son importantes los factores de riesgo que disminuyen los mecanismos de defensa de la piel. Los ejemplos incluyen quemaduras y heridas quirúrgicas, especialmente si están presentes vendajes oclusivos (van Burik, 1998).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
permite la asignación de un género especifico, tal como Aspergillus (Fig. 54-37). Las conidioforas, que no están septadas y que pueden ser más anchas que las hitas vegetales, no deben contundirse con los cigomicetos. Las células Hülle de pared gruesa y los cleistotecios se han descrito In vivo. Los cristales de oxalate demostrables con filtros polarizantes, pueden encontrarse en las bolas de hongos producidas por A. niger (Louthrenoo, 1990: Staib, 1979). Cuando el paciente es inmunocompetente y la respuesta histológica es granulomatosa, las hifas pueden fragmentarse y reducirse a citoplasma de macrófagos y células gigantes mullinucleadas (Ahmad. 1981). La respuesta granulomatosa al Aspergillus en el pulmón puede confundirse con una granulomatosis broncocéntnca (Bosken, 1988; Nagata, 1990), por lo general en pacientes que tienen enfermedad alérgica. En las aspergillosis alérgicas son comunes la mucosidad impactada con eosinófilos y los cristales Charcot-Leyden (Bosken. 1988). La infección alérgica por Aspergillus en los senos paranasals se parece a la enfermedad broncopulmonar (Katzenstein, 1983).
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones Estos mohos son hongos saprofitos, algunos de los cuales se aislan comúnmente en los laboratorios clínicos. Sin embargo, nunca deberían ser descartados de contaminantes sin determinar la situación clínica. El aislamiento de una zona estéril o varios aislamientos obliga a llamar al médico. Las hifas tienen que ser demostradas directamente en las muestras clínicas, en las preparaciones fijadas o preparaciones en fresco. Una vez más, el calcoflúor blanco es útil para demostrar los mohos. La presencia de hifas en una muestra siempre es más significativa que aislar los mohos solos. Sin embargo, en las secreciones respiratorias, incluso aunque encontremos hifas, no se define la naturaleza de la interacción entre hongos y huéspedes. Una correlación clínica detallada y, algunas veces una biopsia son necesarias para la determinación final. Es importante obtener tejidos, raspados, fluidos o curetajes para analizar, con la excepción de la otomicosis por Aspergillus. El tejido tiene que ser preparado e inoculado directamente en la superficie de un medio de aislamiento. Estos mohos crecen rápidamente, pero la mayoría se inhiben parcial o totalmente por la cicloheximida. La identificación específica de las especies la hacemos por el estudio de: Células pie Color de la colonia Morfología de la cabeza colonial
Número de fiálides Morfología de las colonias, incluido el tamaño Presencia y forma de las células Hülle Presencia de cleistotecios El color y morfología de las especies de Aspergillus se estudian correctamente en el agar Czapek-Dox. El reverso de las colonias de hipomicetos es de color claro, pero puede tener pigmentación amarilla, marrón o roja. Las hifas vegetales son delgadas, septadas y ramificadas. Las colonias de muchos de estos mohos rebosan de conidias. Para evitar la contaminación del trabajador y de otros cultivos, debe manipularse con cuidado en una cabina de seguridad de flujo laminar, y después las superficies de las cabinas tienen que limpiarse con una solución fungicida. Mantener los mohos aislados en bolsas de plástico mientras continúa la incubación también reduce la probabilidad de contaminar otros cultivos. Como ya se dijo antes, delectar los anticuerpos de las especies de Aspergillus puede ser diagnósticamente útil, especialmente para aspergillosis alérgica broncopulmonar (Kurup, 1991).
Aspergillus
fumigatus
A. fumigatus es uno de los más comunes, si no el más común, aislado en los laboratorios de micología. Las colonias crecen muy rápidamente, produciendo una apariencia de pelusa. El desarrollo de cabezas afrutadas concede una apariencia azul-verdosa a la colonia (Lámina 54-1). Examinar la colonia con un microscopio de disección nos muestra las conidioforas con sus vesículas expandidas como globos pequeños protegiendo por arriba el micelio vegetativo. La conodiolora es lisa, relativamente corta (de 300 um a 500 um). y se extiende en una vesícula en forma de frasco. Las fiálides se desarrollan en una hilera única (uniseriada), y lo más común es que se desarrollen sólo en los dos tercios superiores de las vesículas paralelas al eje de la conidiofora (Fig. 54-7). Las conidias son rugosas (equinuladas) y de forma redonda u oval.
Aspergillus
flavus
El segundo patógeno más importante en el género Aspergillus es A. flavus. Las colonias crecen rápidamente y, una vez que las cabezas afruladas se desarrollan, tienen una apariencia aterciopelada de amarillo a verde (Lámina 54-13). Las conidioforas son largas (de 400 pm a 700 pm), terminando en una vesícula que puede ser elíptica o redonda. La conidiofora es rugosa o achaparrada. Una hilera sencilla o doble (biseriada) de las fiálides se produce sobre toda la vesícula o los tres cuartos superiores (Fig. 54-38). Las conidias de redondas a ovales parecen amarillas verdosas en masse y miden de 3 um a 4,5 pm. Las estructuras de descanso (esclerotia) se encuentran en las hifas vegetales de algunos aislamientos.
Aspergillus
niger
Este saprofito común se aisla con frecuencia del canal auditivo externo. Tiene una apariencia colonial espectacular, con cabezas afrutadas negras contra un fondo de micelios vegetales blancos como la nieve (producen una apariencia de sal y pimienta) (Lámina 54-14 y Fig. 54-39). Las conidioforas son lisas y largas (de 1,5 pm a 3,0 pm). sosteniendo una vesícula redonda con fiálides biseriadas, que se irradian fuera desde la vesícula entera. Las conidias marrones y rugosas son redondas y miden 4 pm. Puede estar presente esclerotia.
Figura 54-37. Se demuestra la cabeza de Aspergillus niger dentro de un micetoma pulmonar (bola de hongos). Se observan bien las tiálides y las conidias. Aunque las hifas de Aspergillus no son diagnósticas, la demostración de dicha cabeza demuestra la presencia de este género (hematoxilina-eosina).
Otras especies de Aspergillus El grupo A. glaucus consiste en mohos de color verde con manchas amarillas que crecen rápidamente. Las conidioforas son lisas y las fiálides unise-
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ENFERMEDADES MICOTICAS
Figura 54-38. La cabeza de Aspergillus tlavus es unísenada y biseriada. Las IiáliFigura 54-40. Conidias de la especie Fusarium con lorma de piragua Las conidias des se extienden alrededor de muchas de las vesículas. Puede verse la apariencia generalmente son septadas. (Lactofenol algodón azul.) rugosa de las conidioforas. (Lactofenol anilina azul.)
nadas. Normalmente están presentes cleistotecios (Fig. 54-11). Aspergillus terreus produce una colonia marrón canela, conidioforas cortas (<250 um) y fiálides biseriadas. A nidulans produce colonias entre verde y verde oliva oscuro, conidioforas onduladas cortas (<150 um) y fiálides biseriadas. La formación de cleistotecios de la etapa sexual se realza por el cultivo en agar Czapek-Dox. Los cleistotecios, que miden de 100 um a 300 um, son redondos y marrón rojizo Están rodeados por una capa marrón-amarillenta de hifas que contienen células Hülle redondas. Ocasionalmente se encuentran otras especies.
Especies de Fusarium Este género está altamente implicado en la queratomicosis, en quemaduras y en la enfermedad diseminada en pacientes inmunocomprometidos (Anaissie, 1992; Nelson, 1995; Wheeler, 1981). Las colonias se desarrollan rápidamente, produciendo un micelio aéreo como pelusa, que con frecuencia es de color rosa, lavanda o salmón. Unos pigmentos difusos pueden verse en los alrededores del agar. Las fiálides simples o ramificadas se desarrollan directamente de la hila sin una conidiofora que las separe. Pueden producirse macroconidias cortas ovaladas, pero la estructura distintiva es
una macroconidia con forma de canoa o semicírculo que puede tener uno o más septos.
Pseudallescheria
boydii/Scedosporium
apiospermum
P boydii es la fase sexual de esle patógeno, mientras que S. apiospermum es la fase imperfecta, asexual. El moho crece rápidamente en un medio de aislamiento, produciendo una colonia vellosa que evoluciona de color marrón grisáceo a gris oscuro ("ratón") después de incubarlo durante varios días. El cultivo se oscurece más aún con una incubación continuada (Lámina 54-15). Este moho puede crecer en un medio que contenga más de 8 mg/ml de cicloheximida. La fase asexual se caracteriza por agrupaciones simples o pequeñas de aneloconídias en una conidiofora recta o ramificada que puede crecer terminal o lateralmente de la hifa vegetativa Las conidias son de marrón claro y tienen una morfología oval parecida al esperma (Fig. 54-41). En la fase sexual, los cleistotecios marrones contienen ascosporas (Fig. 54-42). Los cleistotecios, que se encuentran más preparados en los bordes de la colonia, se desarrollan mejor en un medio nutricional deliciente. como el agar cornea. Estrictamente hablando, la cepa debe referirse como P. boydn si se demuestran cleistotecios. y como
Figura 54-41. Las microconidias de Scedosponum apiospermum con forma de Figura 54-39. Las cabezas de Aspergillus niger se demuestran con un microsco- renacuajo o de espermatozoide dan al organismo su nombre. (Lactofenol algodón pío de disección (Preparación sin teñir.) azul.)
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Figura 54-42. Un asco de la lorma sexual Pseudallescheria boydiivene un exterior rugoso causado por hitas especializadas.
Figura 54-44. La septación de las células algiformes de Prototheca wickerhamn produce muchos cuerpos mtracelulares y estructuras conocidas como mórulas (hematoxilina-eosina).
S. apiospermum si las conidias asexuales son las únicas estructuras diagnósticas observadas.
Otros mohos hialinos
Especies de
Penicillium
Este hongo saprofito se aisla comúnmente en el laboratorio de micologia. por lo general sin ninguna enfermedad clínica asociada. Las especies comúnmente aisladas crecen bien en un medio de aislamiento fungico, pero se inhiben por la cicloheximida. La colonia es aterciopelada, y se desarrolla una apariencia verde, en ocasiones con un borde blanco (Lámina 54-16). La estructura diagnóstica es el penicilo, que recuerda la mano de un esqueleto con cadenas de conidias creciendo desde la punta de los dedos (Fig. 54-43). Las especies de Penicillium tienen que dilerenciarse de las Paecilomyces spp. que son morfológicamente similares. P. mameflei es un miembro poco normal del género que es dimórfico y regularmente produce enfermedad humana sistémica (KwonChung. 1992). Esta especie es endémica en el sureste asiático, y la mayoria de los casos en EE.UU. se han producido en pacientes inmunodeprimidos que han viajado a Asia (Phiehl, 1988) La infección por P. mame/Ye/puede parecerse clínicamente a la tuberculosis, moluscos contagiosos, histoplasmosis o cnptococosís (Cooper. 1997). A 25 C-30 C. las colonias de mohos son grises con un pigmento rojo soluble; según maduran las conidioforas, el color de las colonias se vuelve verde. Las células de levadura se producen a 37"C o en los tejidos, pero la división es por septación o fisión más que por gemación.
Figura 54-43. El penicilo de las especies de Pénicillium está compuesto de cadenas de conidias nacidas de fiálides que han sido comparadas con los huesos del esqueleto de la mano El género Paecilomyces. que posee más fiálides. puede ser confundido con el Penicillium (lactofenol algodón azul).
Hay una gran lista de mohos hialinos que son saprofitos del ambiente, o de virulencia baia. y por lo general no se asocian con enfermedad clínica cuando se aislan en el laboratorio de micologia. Como ya se ha dicho antes, cualquiera de estos mohos puede ser patogénico ba)0 condiciones adecuadas. En la mayoria de los casos, las defensas del huésped están deprimidas de algún modo, o el hongo se introduce en el cuerpo por un traumatismo o manipulaciones médicas. Como ejemplo. Paecilomyces lilacinus es un moho hialino que se parece morfológicamente a las especies Penicillium (Westenleld, 1996). Este moho fue considerado hasta hace poco como un contaminante de laboratorio. Un gran número de documentos cuentan la capacidad de los llamados contaminantes para producir infecciones del tejido profundo y de los órganos sistémicos. La demostración de hifas en el tejido es extremadamente importante para averiguar la patogenicidad del aislamiento.
INFECCIONES CAUSADAS POR ALGAS ACLORÓFILAS Prototheca wickerhamii y P. zopfii son dos especies de algas que no producen clorofila. Producen en ocasiones infecciones humanas, y se consideran en este capitulo porque se parecen a las infecciones de enfermedades fúngicas (Sudman, 1974; Tindall, 1971). Los Prototheca se encuentran en aguas frescas y marinas, y probablemente entran en el cuerpo a través de heridas superficiales. Algunos pacientes son inmunocompetenles, pero algunas enfermedades subyacentes, como diabetes mellitus, o terapias inmunosupresivas con frecuencia predisponen a los pacientes a la infección por este patógeno. Otros pacientes han recibido inyecciones de corticoesteroides en la zona de infección o han tenido infección musculoesquelética. sobre todo con afectación de los tendones. Las infecciones normalmente afectan a la piel y al tejido subcutáneo, y después afectan a los tendones y las articulaciones (Holcomb, 1981; Nosanchuk. 1973). Son crónicas e intratables, y puede ser difícil eliminarlas sin dañar las estructuras que están debajo, particularmente en la mano (Lee. 1975). La diseminación de la infección es rara (Cox, 1974). Las algas crecen en medios fúngicos de aislamientos preparados que no contienen cicloheximida. y las colonias se parecen a las de las especies Candida (Lámina 54-17). Las células de las algas tienen una apariencia característica, en la que múltiples células hijas (esporangiosporas) se desarrollan dentro de la célula madre (esporangio), recordando a una esférula (Chandler, 1978; ElAni. 1967). También podemos encontrar estas estructuras en secciones histológicas, donde deben ser diferenciadas de hongos dimórficos (Fig. 54-44). Pueden verse en las preparaciones de hematoxilina-eosina y se tiñen bien con el ácido periódico de Schiff o métodos de plata matenamma. Las especies de Prototheca se incluyen en la base de datos
CAPÍTULO 54
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ENFERMEDADES MICÓTICAS
de los sistemas de identificación de levaduras comerciales, tales como API 20C (BioMerieux. Hazelwood. MO) y sistemas Vitek (BioMéneux, Hazelwood, MO).
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se produce por los hongos, más que por una reacción del tejido especifico para el pulmón.
Diagnóstico de laboratorio y otras investigaciones PNEUMOCYSTIS CARINII Hace pocos años, este importante patógeno hubiera sido incluido en el capítulo de parasitología. El organismo tiene características peptónicas. tanto de protozoos como de hongos, pero los estudios moleculares han establecido su relación con los hongos ascomicetos (Edman, 1988).
Factores de riesgo Pneumocystis cariniies un patógeno de humanos (Bartlett, 1991: Masur. 1989; Walzer. 1974: Watts, 1991). Organismos morfológicamente similares causan infecciones en especies de roedores. Primero se reconoció en los comienzos de la enfermedad pulmonar entre niños malnutridos en el este de Europa durante y después de la Segunda Guerra Mundial. No se conoce ninguna fuente en el medio ambiente conocida para los hongos. Podemos comprobar que la mayoría de los individuos se infectaron asintomáticamente en la infancia por análisis serológicos (Maddison. 1982: Peglow, 1990). También se han encontrado infecciones asintomáticas o ligeramente sintomáticas en adultos (Sheldon. 1959). Hay una evidencia sugerente de que los hongos pueden colonizar el tracto respiratorio bajo, produciendo una infección activa cuando interviene un tratamiento o enfermedad inmunosupresiva. La neumocistosis es una enfermedad de individuos comprometidos inmunológicamente (Walzer, 1974). El tratamiento con corticoesteroides y malignidad hemalológica fueron los principales factores de riesgo antes de que apareciera el VIH, que se ha convertido en el principal factor de riesgo (Phaír, 1990). El sida se descubrió por la apariencia de esta enfermedad en hombres jóvenes que previamente estaban sanos en Los Ángeles y Nueva York (Gottlieb. 1981: Masur, 1981). y la infección por Pneumocystis carinii ha sido una de las infecciones que se encuentran en los comienzos del síndrome. La incidencia ha descendido en estos años, quizá por la introducción de un tratamiento retroviral efectivo y el uso extensivo de antibióticos profilácticos que son activos contra los hongos (Kovacs, 1992; Sehonanda. 1996).
Enfermedad clínica La neumonía es la manifestación más común de la enfermedad y el pulmón era el único órgano afectado antes de la aparición del VIH. El comienzo puede ser agudo o insidioso y predomina la disnea. Con frecuencia los infiltrados son mucho más extensos de lo que se pensaría por el grado de los síntomas (Dee, 1979) Es normal que haya infección concurrente con otros agentes, sobre todo con citomegalovirus y C. neoformans. La infección con frecuencia es mortal en pacientes no tratados, inmunodeprimidos que mueren de un fallo respiratorio progresivo. La diseminación de los hongos más allá del pulmón es común en pacientes infectados por VIH. pero no es común en pacientes con otros factores de nesgo (Telzak, 1990).
Pneumocystis carinii ha sido cultivado en cultivos celulares, pero no se ha acompañado de un mantenimiento senado de los subcultivos (Latorre. 1977; Pifer. 1977). Por tanto, el diagnóstico es morfológico y. más recientemente, inmunológíco. El ciclo vital del Pneumocystis carinii afecta al desarrollo de los esporozoitos dentro de quistes, después de lo cual los esporozoitos se liberan. El lavado broncoalveolar nos proporciona la fuente más fiable para material diagnóstico (Kelley. 1978), y la biopsia pulmonar rara vez tiene que realizarse. En pacientes con VIH se produce un número de microorganismos suficientes para que con un esputo inducido con salino pueda proporcionarnos el diagnóstico. La experiencia con los esputos ha variado, sin embargo, en diferentes centros y el rendimiento es muy bajo en pacientes que tienen otras infecciones aparte del VIH (Lau. 1976). La tinción con Giemsa nos muestra bien los esporozoitos. pero las estructuras pequeñas son más difíciles de detectar que los quistes. El tinte comercial Diff-Quik (Corporación de Salud Baxter. McGaw Park, IL) es el que se utiliza normalmente. El tinte de plata metenamina, modificado para Pneumocystis, se utiliza normalmente en laboratorios de patología quirúrgica (Fig. 54-45). El azul de toluidma 0 ha sido empleado en muchos laboratorios de microbiología (Gosey, 1985). El calcofiUor blanco también tiñe los quistes y se ha utilizado con éxito en algunos laboratorios (Baselski. 1990). Los quistes, que miden 5 um son redondos, pero las formas plegadas son comunes. Los quistes plegados con forma de casco y los engrasamientos de las paredes del quiste que recuerdan a las comillas en preparaciones teñidas con plata, son característicos, pero no diagnósticos. Los quistes deben diferenciarse de otros hongos, en particular de H. capsuiatum. El uso de tintes para quistes y trolozoitos, separados o combinados, nos da una gran sensibilidad (Bartlett, 1991; Blumenfeld. 1988). La llegada de anticuerpos monoclonales combinados con fluoresceína para P. carinii nos ha proporcionado un método específico para identificarlo. La técnica de la inmunolluorescencia. según algunos artículos, ha sido más sensible en tintes histoquímicos (Baughman. 1989; Kovacs, 1988). pero la destreza y el cuidado de los observadores sin duda tienen un papel importante al comparar la sensibilidad de las técnicas (Bartlett, 1991; Cregan. 1990). El Pneumocystis encontrado en las ratas no se tiñe con el monoclonal para quistes humanos (Bauer, 1993). pero la especificidad de estas especies es un problema sólo en la competencia de los test de las muestras. Debe decirse que los quistes del P. carinii en ocasiones pueden encontrarse en las preparaciones teñidas con Gram (Fig. 54-46). aunque esta técnica no es un método sensible para detectarlos. La detección
Patogenia de infecciones por Pneumocystis La presentación patológica inicial en niños malnutridos fue una neumonía intersticial grave con un infiltrado molecular que tenia un gran componente de células plasmáticas (neumonía de células del plasma). El patrón histológico clásico es un exudado alveolar espumoso que puede calcificarse (Weber. 1997). Un daño alveolar difuso con membranas hialinas es una presentación menos específica pero común (Askin. 1981). Se han descrito, aunque son menos comunes, enfermedad granulomatosa, enfermedad cavitaria y necrosis coagulativa que se parece a los infartos. Las lesiones extrapulmonares son mínimamente inflamatorias, y consisten en cúmulos focales de exudado espumoso en el que se encuentran células fúngicas. Los estudios ultraestructurales de los organismos cultivados (Murphy, 1977) y la histología extrapulmonar apoyan la evidencia ultraeslructural de que el exudado espumoso
Figura 54-45. Los quistes de Pneumocystis carinii pulmonar son redondos o colapsados y lienen un engrasamiento focal en la pared del quiste que le da una apariencia de paréntesis (tinción con plata metenamina).
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CAPiTuio 54
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Parasitología médica • Thomas R. Fritsche, M.D., Ph.D. • James W. Smith, M.D.
MÉTODOS DE LABORATORIO
1198
HELMINTOS INTESTINALES
Examen de sangre
Nematodos
Examen de muestras fecales
Cestodos
Examen de muestras urogenitales y otras muestras
Tremátodos
(expustos, aspirados y biopsias)
HELMINTOS TISULARES
Técnicas de cultivo parasitario
Nematodos
Métodos de inmunodiagnóstico
Cestodos
Métodos de diagnóstico molecular
Tremátodos
Control de calidad, de mejora y seguridad PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES
ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA 1204
Malaria
1228
1231
Características biológicas Mecanismos de lesión
Babesiosis
Aproximación de laboratorio a la identificación de artrópodos
Hemoflagelados
Insectos
Toxoplasma gondii
Arácnidos
Amebas oportunistas de vida libre PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES
1221
Clases de menor importancia médica 1211
Amebas y Blastocystis hominis Flagelados
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUÉSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS
1237
BIBLIOGRAFÍA
1237
Ciliados Coccidios Microsporidios
El estudio de la parasitología ha ganado renovada importancia en un mundo cada vez más pequeño debido al rápido desplazamiento de la gente, especialmente viajeros y emigrantes de áreas endémicas para enfermedades parasitarias, y por la aparición de patógenos que surgen y resurgen en individuos inmunodeprimidos por diferentes razones. Las enfermedades parasitarias de los humanos y animales domésticos tienen un gran peso en las áreas de recursos de salud limitados, y afectan de un modo adverso al desarrollo social y económico de muchos países en todo el mundo. Mientras que los organismos clasificados como parásitos constituyen un gran grupo, los que afectan a los humanos son más limitados en número y están compuestos mayoritariamente por protozoos, helmintos y artrópodos (Tabla 55-1). Médicos de EE.UU. y otros lugares se están encontrando con un creciente número de problemas en el diagnóstico de las enfermedades parasitarias. También los laboratorios han cambiado con el desarrollo de nuevas tecnologías para diagnosticar, rápidamente y con precisión, parásitos como Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayelanensis, Toxoptasma gondii y
microsporidios tanto en inmunocompetentes como en immunosuprimidos. El resurgimiento mundial de la malaria y otras enfermedades parasitarias ha requerido también un mayor esfuerzo de los laboratorios para detectar protozoos y helmintos sanguíneos, intestinales y tistulares. Una vez diagnosticados, pueden surgir problemas adicionales en su tratamiento debido a la falta de terapias efectivas o al incremento de las resistencias a las terapias tradicionales. Muchos parásitos precisan de un vector artrópodo para su transmisión, y el uso irregular de los esfuerzos erradicadores de los vectores ha producido, en muchas ocasiones, una aparición de resistencias a los insecticidas. La malaria está resurgiendo en muchas áreas debido a un descuido en las medidas de control, así como por la aparición de parásitos resistentes a los fármacos y mosquitos resistentes a los insecticidas. La esquistosomiasis se ha extendido a nuevas zonas debido a un aumento de la irrigación a causa del crecimiento de la población, que necesita una expansión de la agricultura. Debido a la naturaleza crónica de muchas enfermedades parasitarias, asi como a los largos períodos de incubación (tiempo entre la infección y la aparición de estadios diagnósticos), los médicos pueden no considerarlas en el
CAPÍTULO 55
Tabla 55-1
•
PARASITOLOGÍA MÉDICA
1197
R e s u m e n d e los parásitos m á s f r e c u e n t e m e n t e hallados e n h u m a n o s y s u principal zona d e infección S u b r e i n o de los protozoos
S u b r e i n o d e los m e t a z o o s
Filo Sarcomarligophorea Sublilo Sarcodina (amebas) £.
histolytica (I)'
£ d/spar(l) £
hartmanni (I)
£ coft'(l) lodamoeba butschlii (I) Endo/imex nana (I) Nacglcria fowleri(T. C)* Acanthamoeba spp (T. C, E)" Balamulhia mandrillaris (T, C)* Blastocystis hominis (I) Subfilo Mastigophora (flagelados) Giardia lamblia (I)* Dienlamoeba fragihs (I)' Chilomasyix mesniii (I) Relor ¡amonas intestinalis (I) Enteromonas hominis (I) Trychomonas hominis (I) Ttychomonas vaginalis (V)" Leishmania tropica (T) L. major (T) L aethiopica (T) £.. mexicana (T)" /.. braziliensis (T) L. donovan/(T) Trypanosoma gambiense (B, 7" rhodesiense (B. C)
C)
7" CYÍ/;>7(B. T)'
Filo Ciliophora (ciliados) Balanlidium coli (I)* Filo apicomplexa (apicomplejos) Clase Sporozoea Subclase Piroplasmea Babesia spp. (B)° Subclase coccidios Plasmodium falciparum (B) P malariae (B) P ova/e (B) P wvax (B) Cryptosporidium parvum (I)" Cyclospora cayetanensis ( I ) Isospora belli (I)* Toxoplasma gondii (T)' Filo Microspora (microsporidios) Encephalilozoon spp. (E, H, T)* £ intestinalis (I. T)' Enterocytozoon bieneusi (I)' -
Filo Platelmintos (gusano plano) Clase ceslodos (lenias) Diphyllobothrium spp. (I)' Dipylidium caninum (I)* Echinococcus granulosus (H)" £ multilocularis (H)' Hymenolepis nana (I)' H. diminuta (I)' Taen/a saginata (1)" 7 solium (I. T)" Clase Tremátodos (lombrices) Clonorchis sinensis (H) Fasciola hepática (H)* Fasciolopsis buski(i) Heterophyes heterophyes (I) Metagonimus yokagawai(I) Nanophyetus salmincola (1)" Opistorchis viverinni (H) Paragonimus spp (L)* Schistosoma haematobium (B) S japonicum (B) S. mekongi (B) S. manson/(B) Filo Nematodos (gusanos redondos) Clase Adenophoros (aplasmidios) Trichinella spiralis (T. 1)" Trichuris trichiura (I) Capillaria philippinensis (I) Clase Secernentia (plasmidios) Enterobius vermicularis (I) Ascaris lumbhcoides (I)' Ancylostoma duodenale (I) Necator amencanus (I)* Strongyloses stercoral (I) Trichostrongylus spp. (I)' Amsaki spp. (1)" Wucfiereria bancrotli (T, B) Brugia malayi (T. B) Loa toa (T, B) Onchocerca volvulus (T) Mansonella perstans (TB) M. ozzardi (T. B) M streptocerca (T) Dracunculus medinensis (T) Angiostrongylus cantonensis (T) A costaricencis (T) -
-
* Parásitos patógenos naturales de Estados Unidos B sangre. C liquido cefalorraquídeo: E 0|0: H: hígado: I: intestino L pulmón T: tejidos; V: vagina Adaptada de Murray PR Barron EJ Pfaller M. y cois. Manual of Clinical Microbiology, 6a ed Washington DC ASM Press. 1995
diagnóstico diferencial a menos que el paciente aporte información voluntariamente o se le interrogue específicamente sobre la historia de viajes u otras exposiciones. La malaria es una de las patologías parasitarias que cursa con un cuadro febril agudo, que puede tener consecuencias letales a menos que se la considere en el diagnóstico diferencial y se recoja una historia de viajes a una zona endémica. Se han hecho varias estimaciones de la prevalencía y mortalidad de las infecciones parasitarias en todo el mundo (Tabla 55-2). Se desconoce la incidencia actual de las infecciones por parásitos en los EE.UU. porque la mayoría no se declaran a las oíicmas de salud pública. Giardia lamblia.
otros protozoos intestinales y los gusanos redondos intestinales son los más frecuentemente declarados (7,2%. 10% y 3.5%, respectivamente) por los laboratorios, pero probablemente son más comunes otros parásitos, entre los que se incluyen Cryptosporidium. Cyclospora y los microsporidios, aunque están infradiagnosticados (Kappus, 1994). Este capítulo hace una revisión del abordaje general de los laboratorios para la detección y el reconocimiento de los protozoos y helmintos en las muestras humanas. Se necesita una descripción de las distintas especies de parásitos para tener una información clínica y biológica esencial para el diagnóstico y tratamiento. Para una mayor descripción de los parásitos.
1198
SECCIÓN VI
•
MICROBIOLOGÍA MÉDICA N
Tabla 55-2 Prevalencia mundial e s t i m a d a para las infecciones parasitarias Población estimada N. anual afectada de muertes Enfermedad Protozoos Amebiasis Tripanosomiasis africana Tripanosomiasis americana Giardiasis Leishmaniasis Malaria Helmintos Ascariasis Ceslodos ClonorquiasisOpistorquiasis Dracunculosis Fasciolopsiasis Filarías linfáticas Uncinanas Oncocercosis Paragonimiasis Esquistosomiasis millón Estrongiloidiasis Tricoeslrongiliasis Tncunasis
Aprox. 10% de la población 100.000 nuevos casos al año 24 millones 200 millones 1.2 millones 400-490 millones 1.3 billones 65 millones 13.5 millones < 100.000 10 millones 128 millones 1,3 billones 17.7 millones 2.1 millones 150 millones
40.000-110.000 5.000 60.000
2.2-2.5 millones 1 550
cuencia de muestras necesarias para el diagnóstico. También son útiles en muchas ocasiones los métodos de diagnóstico inmunológico y molecular, y a veces pueden ser los únicos métodos de diagnóstico disponibles. Se puede encontrar una descripción completa de los procedimientos de laboratorio general para la delección e identificación de los parásitos en distintas fuentes a las que nos remitimos (Ash. 1987; Balows, 1 9 8 8 : Beaver. 1984; Garcia. 1997.1999: Isenberg. 1992; Murray. 1999: Price. 1994). La familíarización con la calibración y el uso de un micrómetro ocular es necesaria para llevar a cabo cualquier examen parasitológico en cualquier laboratorio. La medición del tamaño de los trolozoítos de los protozoos y los quistes, así como de los huevos de los helmintos y las larvas, es algo muy necesario para una rápida identificación. Diferenciar entre amebas patógenas y no patógenas (concretamente entre Entamoeba histolytica y E. hartmanni) sólo puede realizarse con seguridad a través de la cuidadosa medición del tamaño. Igualmente, los huevos de Diphyllobothrium spp., Paragonimus westermani y Fasciola>Fasciolopsis pueden distinguirse según su tamaño (Smith, 1979).
Examen de sangre
500 000-1
35 millones 5,5 millones 900 millones
Adaplada de Marken EK. John DT Krotoski WA Marken and Voge's Medical Pa rasilology 8 ed Filadelha. WEt Saunders Company. 1999
Los parásitos que se pueden detectar en muestras de sangre son los agentes de la malaria (Plasmodium spp.). babesiosis (Babesia spp.), tripanosomiasis (Trypanosoma spp.) y leishmaniasis (Leishmania donovam) y filanasis (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi. Loa loa y Mansonella spp.). Las técnicas más importantes que debe realizar el laboratorio para el diagnóstico de los parásitos sanguíneos son la preparación, la tinción y el examen de las extensiones gruesa y fina de sangre. Otras técnicas menos frecuentes son aquellas de concentración reservadas para la detección de microfilarias (National Committee tor Clinical Laboratory Standards [NCCLSj, 2000).
Frotis sanguíneos gruesos y finos nos remitimos a un gran número de textos disponibles (Beaver. 1984; Cook. 1996: Garcia. 1997. 1999; Goldsmith. 1989: Kettle, 1995; Lañe. 1993; Markell. 1999: Strickland, 2000; Warren. 1990: entre otros) Una importante fuente de información la tenemos también en los atlas de parasitología para todo laboratorio que trabaja con parásitos, y que debe estar disponible para consulta (Ash, 1987. 1997; Brooke, 1984; Isenberg, 1992: Murray, 1999; Peters, 1989: Spencer, 1982; Sun, 1988). En otros textos se documentan aspectos específicamente patológicos de la inlección parasitaria (Binford, 1976; Connor, 1997; Gutiérrez, 2000; Orihel, 1995; Marcial Rojas, 1971; Sun, 1982; Von Lichtenberg, 1991; Woods, 1993). Las infecciones parasitarias en los mmunodeprimidos también han sido objeto de revisión (Walzer. 1989)
MÉTODOS DE LABORATORIO Se han descrito numerosos métodos para la detección e identificación de parásitos en las muestras clínicas, algunas de las cuales son útiles para detectar distintas especies, mientras que otras detectan una única especie en particular. Es preferible para el laboratorio ofrecer un número limitado, pero competente, de procedimientos a llevar a cabo, en vez de proporcionar una gran variedad de pruebas poco empleadas que puedan resultar problemáticas. Los análisis de sangre y heces comprenden la mayoría de los requerimientos clínicos para un estudio parasitológico. Otras muestras son de uso menos frecuente, como las urogenitales, el esputo, los aspirados y las biopsias. Como cada vez hay nueva información disponible de algunos de los llamados parásitos emergentes, los laboratorios pueden necesitar desarrollar y usar métodos adicionales altamente específicos o encontrar laboratorios de referencia competentes donde llevar a cabo las pruebas. Las muestras recogidas para la valoración del laboratorio dependen de la especie y del estudio del parásito sospechado. El conocimiento del ciclo de vida del parásito da información de la determinación del tipo, número y fre-
Es necesario el examen de frotis sanguíneos teñidos para la identificación de la mayoría de los parásitos sanguíneos. Los frotis finos se preparan igual que los usados en el diagnóstico diferencial hematológico: la sangre se extiende sobre un portaobjetos en una fina capa evitando la superposición de los elementos celulares. Es importante la integridad de las membranas celulares para determinar la naturaleza mtracelular o exlracelular de la inlección. En el frotis grueso, la sangre se concentra en un área pequeña en la que muchas células yacen en el fondo. Durante la tinción, los eritrocitos pierden la hemoglobina, de modo que sólo son visibles los núcleos leucootarios. las plaquetas y los parásitos (si estuviesen). Se prefiere el uso del frotis grueso para el diagnóstico, ya que posee entre dieciséis y treinta veces más sangre por campo que el frotis fino, incrementándose asi la posibilidad de detectar parásitos reduciendo el tiempo necesario de examen. La cantidad de sangre estudiada en un frolis grueso en cinco minutos, usando un objetivo de aceite de inversión (100 x), requeriría al menos treinta minutos si se examinase la misma cantidad en un frotis fino. Mientras que la probabilidad de detección de una infección aumenta con el frotis grueso, la identificación de la especie se realiza mediante examen del frotis fino, ya que así la morfología es más definida, especialmente para la malaria Para el examen ordinario, se deberían preparar ambos tipos de frotis. Preparación de las extensiones, La sangre para examen puede obtenerse por punción en el dedo, en el lóbulo de la oreja o por punción venosa. La sangre de la punción del dedo debe dejarse salir libremente para evitar su dilución con los líquidos titulares y no debe ser contaminada con alcohol desinfectante, sino que primero se debe dejar que ésta se seque. Si se obtiene por punción venosa, se usará la primera gota de sangre (sin anticoagulante) para preparar el frotis a la cabecera del paciente. El uso de anticoagulantes está contraindicado en la sospecha de malaria porque pueden distorsionar la morfología de los parásitos e interferir en su tinción. En la práctica, no obstante, la sangre suele remitirse al laboratorio con anticoagulante, ya que puede ser el único modo de asegurar que se puedan preparar las extensiones. El anticoagulante más utilizado, en tales
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
casos, es el ácido etilendiaminoletraacético (EDTA). pero debe ser llevado al laboratorio en menos de una hora para evitar el deterioro de la morfología de los organismos. Los anticoagulantes no interfieren en la tinción de las microfilarias. Tanto el frotis fino como el grueso se deben preparar en un porta limpio y sin grasa. Los frotis gruesos se preparan poniendo unas cuantas gotas de sangre en una zona de 1,5 cm de diámetro y dejándolos secar a temperatura ambiente, casi siempre por la noche. Un frotis grueso debe ser lo suficientemente fino para que se pueda leer un periódico a su través; si fuese demasiado grueso, el frotis puede escurrirse por el portaobjetos. El exceso de calor podría fijar los eritrocitos y evitar su deshemoglobinización. Tinciones. La sangre empieza a perder su afinidad por las tinciones en unos tres dias y los Irolis gruesos más antiguos no pierden bien la hemoglobina. Los mejores resultados de la tinción se logran con el uso de la tinción de Giemsa. ya que la cromatina de las células y la del parásito se tiñe con viveza, mientras que la hemoglobina de los eritrocitos queda de color rojo pálido. Es la única tinción que permite ver el punteado entrocitario que se produce en la infección por algunos parásitos de la malaria. La tinción de Wright puede usarse para frotis finos, pero tiñe los parásitos peor que el Giemsa y tiñe los eritrocitos, dejando un fondo poco nítido. Debido a que la tinción de Wright lleva alcohol como fijador, los frotis gruesos se deben lisar con agua antes de ser teñidos. El proceso de tinción con Giemsa requiere mayor atención a la hora de preparar los activos y de realizar el protocolo de tinción, mientras que en el caso de la tinción de Wright suele estar todo automatizado. Generalmente, el colorante de Giemsa fresco se debe hacer cada día, usando una solución diluyeme con agua tamponada con fosfato. Para lograr una adecuada tinción, incluyendo la aparición del punteado de Shüflner, el agua tamponada se debe mantener con un pH entre 6,8 y 7.2. Se debe revisar cada lote de Giemsa para determinar el tiempo de tinción óptimo y su dilución, ya que hay algunas variaciones de lote a lote (NCCLS. 2000). Examen de las extensiones. Tanto los frotis gruesos como los linos se examinan en su totalidad bajo un objetivo de bajo aumento (10x) para detectar microfilarias, que no suelen estar en gran número. Particularmente se deben examinar los bordes del frotis fino, ya que las microfilarias se desplazan allí frecuentemente durante la preparación del frotis. El examen con aumento de 50x en aceite de inversión puede usarse para la búsqueda de protozoos en frotis sanguíneos, aunque es aún necesario el examen en objetivo de aceite de inversión 100x para detectar los parásitos más pequeños, como Plasmodium spp.. Babesia spp.. y Leishmania spp. Nuevamente, el examen de los bordes es importante, puesto que los eritrocitos son desplazados a una capa de células, permitiendo la evaluación de su morfología y la existencia de protozoos mtracelulares. Un experimentado microscopisla antes de dar un resultado negativo debe examinar como poco cien campos con aceite de inversión en frotis gruesos (dedicando cerca de cinco minutos) y doscientos campos en un frotis fino (dedicando al menos quince minutos) usando un objetivo de cíen aumentos (Ash, 1987).
Técnicas de concentración Se han descrito una variedad de técnicas especiales para la concenlración de parásitos sanguíneos, especialmente para leishmanias. tripanosomas y microfilarias. Los detalles se pueden encontrar en otros textos (Ash, 1987; Beaver. 1984; Garcia, 1997.1999: Isenberg. 1992; NCCLS, 2000). La preparación de extensiones tamponadas, que puede realizarse con los recursos existentes en la mayoria de los laboratorios, es útil para detección de Leishmania donovani, tripanosomas y microfilarias. Tras la centrifugación de una muestra de sangre con anticoagulante, la capa de células que queda entre el plasma y los eritrocitos es recogida y usada para preparar frotis sanguíneos para teñir o para hacer una preparación en fresco para detectar organismos móviles (Ash. 1987; Strickland. 2000). Para la detección de microfilarias, es útil la concentración de Knott o la filtración de membrana, especialmente cuando la densidad de microfilarias en sangre periférica es baja. En la técnica de Knott, la sangre anticoa-
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gulada se lisa con formalma al 2% y se centrifuga para concentrar las microfilarias en el sedimento, que puede ser posteriormente examinado como una preparación en fresco, o bien se tiñe con Giemsa o hemaloxilina. En el proceso de filtración de membrana la sangre es lisada y pasada a través de un filtro de membrana de 5 pm, que posteriormente es teñida con hematoxilina para detectar alguna microfilaria (Ash, 1987; NCCLS, 2000). El uso de naranja de acridina-fluorocromo en un formato de microhematócrito (OBC. método de detección de parásitos sanguíneos. Becton Dickinson, Franklin Lakes. NJ) permite la delección de parásitos sanguíneos y parece ser más sensible que los tradicionales frotis grueso y fino. Los laboratorios que detectan malaria infrecuentemente pueden tener dificultades para la interpretación de los resultados con este método, pero sin embargo se les anima a conservar la experiencia en la realización de las técnicas con los tradicionales frotis sanguíneos (NCCLS. 2000).
Examen de muestras fecales La identificación de parásitos intestinales se realiza a través del examen directo de la deposición usando heces acuosas, técnicas de concentración, tinciones permanentes y, menos frecuentemente, cultivos. Se han hecho populares los nuevos métodos de inmunoensayo mediante anticuerpos específicos para detectar antígenos de Giardia lamblia. Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica. Los estadios de helmintos más frecuentemente vistos son los huevos y larvas, aunque ocasionalmente pueden verse gusanos enteros o porciones. La infección por protozoos intestinales se diagnostica por la detección de trofozoítos. quistes u ooquistes. Los métodos habituales para la identificación de huevos y parásitos (examen O/P) deberían incluir procedimientos que permitiesen detectar tanto protozoos como helmintos, dejando el uso de técnicas especiales sólo para solicitudes especificas. Como existen pocos laboratorios dedicados al examen parasitológico, deben estar capacitados para realizar un examen directo de heces frescas acuosas, técnicas de concentración y técnicas de tinción. Muchas infecciones por protozoos pueden no detectarse a menos que se realicen exámenes con tinción permanentes (García, 1979,1997; NCCLS. 1997; Price, 1994: Smith, 1996).
Recogida, manejo y conservación de muestras Una correcta detección e identificación de los parásitos de las muestras fecales requiere una adecuada recogida y manejo de las mismas. Las muestras antiguas, mal conservadas o contaminadas son de escaso valor. Las muestras no se pueden recoger en la semana que sigue a la ingestión de sustancias que dejen residuos cristalinos, como componentes antidiarreicos no absorbibles, antiácidos, bismuto, bario o agentes antimaláricos. Los laxantes oleosos, como el aceite mineral, también pueden interferir en el examen. El uso de antibióticos o los medios de contraste pueden disminuir el número de organismos en el tracto digestivo, especialmente protozoos, durante varias semanas (Ash. 1987). Las muestras se deben remitir al laboratorio mientras están frescas o con los conservantes apropiados. Todas las muestras frescas se deben examinar en la primera hora tras ser remitidas, y las muestras líquidas deben examinarse en menos de treinta minutos o ser puestas en conservantes para mantener el máximo rendimiento. Estas estrategias aseguran que los frágiles protozoos y trofozoítos no sean destruidos inadvertidamente. La muestra que no se procese inmediatamente se debe dejar en una habitación a temperatura ambiente o refrigerada y nunca colocada en una incubadora, ya que peligraría la integridad de los parásitos. Las muestras deben ser pasadas directamente a un cartón seco y limpio o que el paciente defeque sobre un papel encerado y se transfiera una parte a un recipiente. Las muestras liquidas pueden también ser recogidas en una cuña limpia. Los contenedores deben tener una tapa hermética y se deben colocaren una bolsa de plástico antes de llevar al laboratorio. La mezcla inadvertida de orina o de agua del inodoro con la muestra puede destruir los protozoos y trofozoitos, por lo que se debe evitar. También la contaminación con
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 55-3 Fijadores de muestras fecales y técnicas de examen Técnica de examen Fijadores Ninguno (heces Irescas) Formatina al 10% Fluido de Schaudinn Alcohol polivinilo (PVA)' PVA modificado' Mertiolato-yodo-formalina (MIF) Acetato sódico-lormalina (SAF)
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" Aunque las técnicas de concentración con PVA se ha descrito, no son totalmente usadas debido al problema de reconocimiento de algunos organismos. ' El sulfato de cobre o el sulfato de cinc sustituyen al cloruro de mercurio. Las extensiones preservadas con MIF se deben teñir con policromo IV. :
agua o tierra puede introducir accidentalmente organismos de vida libre que se pueden confundir con los parásitos. Hay equipos que contienen viales de conservación apropiados para el examen de extensiones teñidas que están disponibles en el mercado a bajo precio. Se debe poner inmediatamente una parte de la muestra fresca en estos viales y mezclarlos completamente. Estos equipos son especialmente útiles para aquellos pacientes a los que es imposible extraer una muestra fresca en el plazo requerido o para los que han de recoger varias muestras en días consecutivos. Con la técnica de los dos viales, una parte se fija en tres porciones de formalina tamponadas al 5%-10% y otra parte en otras tres porciones de alcohol polivinilo fijador (PVA). Otros sistemas de conservación disponibles son: mertiolato-yodo-formalina (MIF) y acetato sódico-formalina (SAF) (Tabla 55-3). El SAF tiene la ventaja de que puede usarse para tinciones permanentes, para el estudio en fresco y para procedimientos de concentración y además no contiene mercurio, que sí está presente en los fijadores de Schaudinn y PVA. Además de ser venenoso, el mercurio puede presentar problemas de eliminación en muchos estados. Sin embargo, la calidad de las tinciones permanentes con el SAF no es tan buena como con los fijadores de Schaudinn y del PVA. El PVA con base de sulfato de cinc y otros nuevos productos comerciales van ganando popularidad y su uso está indicado cuando los componentes con mercurio no se puedan utilizar (García. 1993, 1997: NCCLS, 1997). El examen de tres muestras recogidas en días alternos es el mínimo necesario para realizar una adecuada evaluación E/P (NCCLS, 1997: Smith. 1996). Este procedimiento asegura un intervalo óptimo de recogida de aquellos parásitos que poseen una eliminación cíclica, especialmente Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis. El uso de purgantes puede dar una sensibilidad adicional para detección de parásitos como E. histolytica. El laboratorio debe ser avisado antes del comienzo de la purga para tener personal disponible para el proceso. Las muestras han de recogerse en contenedores diferentes y ser remitidas al laboratorio en pocos minutos. Se recomiendan purgantes como el sulfato sódico o el fosfato sódico tamponado.
Examen
macroscópico
Se debe examinar de un modo general la consistencia de las heces (formadas, blandas, acuosas, descompuestas) y si hay presencia de moco, sangre, larvas o gusanos adultos y proglótides. Los protozoos y trofozoítos se encuentran fácilmente en muestras acuosas o descompuestas, mientras que los quistes predominan en las muestras blandas o formadas. Los helmintos o sus huevos se pueden encontrar en cualquier tipo de heces. La mayoría de los parásitos se distribuyen de modo uniforme en
la muestra, aunque algunos huevos (especialmente esquistosomas) pueden pasar al torrente fecal en el colon descendente y el recto y distribuirse irregularmente, como puede ocurrirle a los huevos de Taenia spp. Los trofozoílos de los protozoos pueden ser más numerosos en la parte final de la deposición y deberían ser buscados específicamente en la mucosidad (Smith, 1996).
Examen
microscópico
Las muestras se deben examinar microscópicamente por examen directo de material fresco o conservado, por examen de los concentrados o con tinción permanente. Cada procedimiento tiene sus ventajas e inconvenientes. La humidificación de las heces frescas con suero salino permite la detección y observación de trofozoítos móviles de protozoos y larvas de helmintos, El estudio de heces conservadas puede permitir la detección de parásitos que no se concentren bien. Los procesos de concentración son de mayor rentabilidad para la detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos, así como de larvas, pero no es satisfactorio para la detección de trofozoítos de protozoos. Las tinciones son útiles para la delección y el examen morfológico de los trofozoítos de los protozoos y los quistes. Las circunstancias para llevar a cabo cada procedimiento dependen del tipo de muestra (formada, blanda, descompuesta, acuosa). Generalmente, las muestras frescas blandas, descompuestas o acuosas deben tener los tres procedimientos de manejo (Smith, 1996). Las muestras acuosas se deben concentrar por centrifugación simple mejor que por flotación o concentración con formalina-etil acético. El estudio directo se puede omitir si la muestra llega con conservantes (NCCLS, 1997). Como mínimo, las muestras tomadas se deben estudiar por un proceso de concentración, aunque se ha demostrado un gran rendimiento cuando se emplea una tinción (García, 1979,1997). Estudio directo en fresco. El estudio directo es uno de los más fáciles de realizar entre los estudios parasitológicos, aunque la correcta interpretación requiere un examen cuidadoso y gran experiencia en el uso del microscopio. Es más útil cuando las muestras frescas se examinan para trofozoítos móviles o larvas de helmintos (especialmente residuos líquidos o aspirados duodenales). Una pequeña cantidad de muestras se mezcla con una gota de suero salino al 0,85% y se cubre con un cubreobjetos. La preparación ha de ser lo suficientemente densa para permitir leer un periódico a su través. El examen de la totalidad del portaobjetos se ha de hacer sistemáticamente con el objetivo de bajo aumento (10x), con el diafragma del microscopio cerrado para aumentar el contraste. Los objetos sospechosos y aquéllos retráctiles, como los quistes de los protozoos, se deben examinar con el objetivo de gran aumento (40x). La detección del movimiento de amebas de movimiento lento requiere un examen durante al menos 15 segundos. En ausencia de imágenes sospechosas, por lo menos se ha de examinar un tercio de la preparación con el objetivo de 40x. El uso del objetivo de aceite de inversión no se suele utilizar a menos que el cubreobjetos se haya sellado con esmalte de uñas o vaspar (una mezcla al 50:50 de jalea de petróleo y parafina). Se debe hacer una segunda preparación igual salvo que se añada una gota de yodo Lugol al 1:5, o una preparación equivalente, en vez del salino, El uso de yodo Lugol o yodo Gram produce la agrupación del material, por lo que se desaconsejan. El yodo es útil para incrementar la visibilidad de las estructuras nucleares en los quistes de protozoos y para la detección de inclusiones de glucógeno. Entre sus limitaciones se incluye una pérdida de la motilidad de los trofozoítos y de la refractilidad de los quistes, así como la dificultad para reconocer los cuerpos cromatoides. Técnicas de concentración. Las técnicas de concentración, que se pueden realizar con material fresco conservado (Tabla 55-3), son más sensibles que el estudio directo para detectar quistes de protozoos y huevos de helmintos y sus larvas, debido a que disminuye el material de desecho en las preparaciones y, en la mayoría de las ocasiones, se concentran los organismos. Aunque se han descrito gran variedad de métodos y modificaciones, algunos son útiles sólo para parásitos específicos (Ash,
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
1987: Barnes, 1984; García, 1997, 1999; Melvin. 1982: NCCLS, 1997) Para el uso sistemático, se debe seleccionar un método que permita la detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos. Los métodos de concentración se basan en los principios de sedimentación y flotación. En la sedimentación, los parásitos más pesados emigran al fondo debido a la gravedad o por centrifugación. En la flotación, los quistes y huevos más ligeros suben a la superficie de una solución de alta densidad. Los dos procesos de concentración más usados en los EE.UU. son las técnicas de flotación centrífuga con sulfato de cinc (técnica de Faust) y la sedimentación con éter-formalina (técnica de Ritchie o modificaciones). En la práctica, el etil acético ha sustituido al éter en el último método debido al peligro de su uso y a unos resultados superpombles (Truant. 1981). La concentración con formalina-etil acético es una técnica de sedimentación básica que es eficiente en la recuperación de la mayoría de los quistes de protozoos, larvas y huevos de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo, y tiene una moderada efectividad para los huevos de esquistosomas. Con esta técnica se consigue menos distorsión de los quistes que con la flotación con sulfato de cinc. Sin embargo, los huevos de Hymenolepis nana se pueden perder y la concentración de G. lamblia y de los quistes de lodamoeba bütschlii puede ser defectuosa. Para una correcta concentración de ooquistes de coccidios y esporas de microsporidios se debe prestar atención a la velocidad y tiempo recomendado de centrifugación (Isenberg, 1992; NCCLS. 1997). A pesar de estos problemas, la técnica es comúnmente empleada por su simplicidad y su disponibilidad en la mayoría de los laboratorios. Con la técnica de flotación de sulfato de cinc, la muestra fresca se procesa usando sulfato de cinc con una densidad específica de 1,18, y la muestra lormalinizada se procesa con una solución de una densidad de 1.20. Los elementos parasitarios se recuperan de la capa superficial de la solución Iras la centrifugación. Esto produce una preparación más limpia que la de formalina-etil acético, pero es inútil para la detección de larvas de nematodos, huevos inlértiles de Ascaris y huevos de la mayoría de los tremátodos y de las tenias. También puede haber problemas con las muestras que contienen gran cantidad de grasas. El uso de material formalinizado en vez de fresco ayuda a limpiar los muestras y previene la apertura de los que opérculos y la distorsión de los parásitos (Bartlett, 1978). Tinciones permanentes. El uso de preparaciones teñidas permite guardar permanentemente las muestras y su revisión por distintos médicos cuando aparezcan dificultades de identificación. De todos los métodos descritos para el estudio de las muestras fecales, únicamente la tinción permanente es la diseñada para el uso del objetivo de aceite de inversión (100x). La tinción es más útil para la detección de trofozoítos y quistes de protozoos, que pueden reconocerse cuando la preparación en fresco y los concentrados sean negativos. Aunque no suele ser úlil para la detección de huevos o larvas de helmintos, las tinciones son más sensibles para detectar inlección por protozoos y se recomienda su uso para todas las muestras remitidas para estudio de O/P (NCCLS, 1997). Se han descrito una gran variedad de técnicas de tinción y sus modificaciones con todas sus ventajas y desventajas. La tinción de tncromo de Wheatley y la tinción de hierro-hematoxilina son métodos que permiten detectar amebas y flagelados. Desafortunadamente, la detección de la mayoría de las infecciones humanas por coccidios y microsporidios requieren tinciones especiales. Pueden aparecer muchos problemas técnicos a la hora de realizar la tinción. La mayoría dependen del tiempo transcurrido tras la toma de la muestra, de la extensión y de la fijación, asi como de la calidad de los reactivos. Se deben realizar controles positivos de extensiones conocidas con cada batería de extensión. Esto es especialmente cierto para la realización de tinciones más especificas para coccidios y microsporidios. Otros tintes menos comúnmente usados, como la tinción policroma IV, usados con muestras preservadas con MIF y la tinción de negro clorazol E para muestras en fresco no se revisan aquí y los detalles se pueden encontrar en otros textos (García, 1997). Tinción de tricomo de Wheatley. En los EE.UU. la modificación de Wheatley del método de tricromo sigue teniendo gran aceptación por su sim-
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plicidad, fiabilidad y su bajo coste. Los detalles de su realización se pueden encontrar en muchos textos (Isenberg, 1992; Melvin, 1982: NCCLS, 1997; Price, 1994). Con tricromo se pueden teñir muestras que se han lijado con el fijador de Schaudinn o PVA o muestras conservadas con SAF o MIF, pero los resultados son menos satisfactorios. Tinción de hierro-hematoxilina. Esta técnica es mas difícil de llevar a cabo que el tricromo. pero tiene mejores resultados debido a que incrementa la definición del núcleo y las características del citoplasma (Price, 1994). Una tinción modificada del hierro-hematoxilina que puede ser útil es la que incorpora carbol-fucsina, permitiendo la tinción de organismos ácido resistentes, como Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora (NCCLS. 1997; Palmer. 1991). Las muestras fijadas con SAF. Schaudinn y PVA pueden teñirse con hierro-hematoxilina (tinción preferida para el SAF). Tinciones ácido-resistentes modificadas. Los ooquistes de Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora son difíciles de reconocer en extensiones teñidas con tricromo o hierro-hematoxilina. pero se pueden detectar con la técnica de tinción acido-resistente. como la modificada Kinyoun. la modificada de ácido-resistente dimetil-sulfóxido (DMSO) o la auramina-0 (Bronsdon, 1984; Current, 1991: Ma, 1983: NCCLS, 1997). Las tinciones ácido-resistentes son sensibles y eficientes para la detección de estos protozoos, pero pierden especificidad. Se debe prestar especial atención a los criterios morfológicos cuando se usan estas tinciones y es obligatorio el uso de controles positivos Para aquellos laboratorios en los que Cryptosporidium se aisla, rara vez se recomienda el uso de reactivos de alta especificidad y sensibilidad. Las muestras biliares, los esputos, las heces en fresco o fijadas con formalina o SAF se deben teñir con tinciones ácido-resistentes. Tinciones para microsporidios. Los microsporidios (específicamente Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestmalis. junto con un gran número de otras especies) se han implicado como agentes comunes de procesos diarreicos, especialmente en inmunosuprimidos, aunque su detección ha sido problemática. Aunque la biopsia y la microscopía electrónica han sido una clave de sus diagnósticos, se han descrito procedimientos de tinción para ser llevados a cabo en el laboratorio. Una tinción del tricromo modificada con una concentración aumentada (diez veces) y 2F¡ cromotropo con un incremento en el tiempo de tinción ha ganado aceptación como estudio para la identificación de esporas de microsporidios (Weber, 1994). Las técnicas de tinción fluorescente mediante el uso de agentes blanqueantes ópticos como el Uvitek-2B y el calcoflúor blanco también son útiles para el screening rápido y sensible de heces y otras muestras (DeGirolami. 1995: Didier. 1995: Luna. 1995; van Gool. 1993). El pequeño tamaño (1,5 pm-3 pm) de estos organismos hace su detección difícil, y estos estudios no deberían realizarse sin una adecuada comparación con el control.
Técnicas adicionales para el examen de parásitos entéricos Técnica de papel de celofán para oxiuros. La hembra del oxiuro, Enterobius vermicularis. emigra desde el colon a la piel penanal, donde deposita sus típicos huevos fecundados. Los huevos, y a veces los gusanos adultos, se pueden detectar por el examen de un trozo de adhesivo de celofán o con los equipos comerciales de recolección de pegado en la piel perianal. Los huevos o los adultos no suelen encontrarse en las heces, por lo que se considera una muestra inapropiada para la detección de este parásito. Las muestras se deben tomar por la noche, cuando los gusanos son activos, o a primera hora de la mañana, antes de la ducha o de la deposición. Se deben examinar vanas muestras de diferentes días antes de descartar infección. Estudio de los huevos. La estimación de la carga de gusanos es a veces necesaria para evaluar la eficacia terapéutica o la tasa de reinfección por nematodos intestinales (Ascaris. Trichuris y uncinarias) y. ocasionalmente, esquistosomas. Los procedimientos incluyen el método de extensión
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
directa de Beaver. recuento de huevos con la dilución de Stoll, frolis grueso de Kato y diversas modificaciones (Ash. 1984; Beaver. 1984: García, 1997). Hay grandes variaciones en los resultados con estos estudios, y la significación clínica del nivel de recuento de huevos varia según la especie infectante, la edad de la persona y el estado nutricional (Beaver, 1984). Los métodos de incubación de huevos se usan para detectar la presencia de esquistosomiasis en infecciones leves y para determinar su viabilidad. Los huevos fecundados de esquistosomas contienen un miracidio que se incuba en varias horas tras ser colocados en agua sin cloro. En la práctica, la orina o las heces se mezclan con diez partes de agua y se colocan en un matraz de Erlenmeyer. La parte superior del vaso se tapa con papel de plata y se coloca bajo una lámpara de mesa. Los miracidia incubados son muy fototrópicos y se acumulan cerca de la luz. Los huevos, si los hay. pueden ser examinados por su viabilidad, mediante el estudio de los movimientos ciliares dentro de las células llama (excretoras). Cultivo de nematodos y técnicas de detección. Se usan muchas técnicas de cultivo (coprocullivos) para la detección e identificación de los distintos nematodos infectantes, entre los que se cuentan el cultivo con filtro de papel Harada-Mori, el cultivo en filtro de papel inclinado y el cultivo en carbón vegetal (Ash, 1984; Beaver 1984: Garcia, 1997). La diferenciación entre lombrices y tricostrongiles según la morfología de los huevos es difícil, mientras que la larva en fase infectiva es mas fácilmente identificable. Tales técnicas de cultivo pueden también ser útiles para la detección de larvas de Strongyloides. que pueden estar en escaso número, y para diferenciarlas de las lombrices uncinarias. Con todos los métodos de cultivo, las heces son incubadas en un ambiente húmedo que permite lograr la incubación de los huevos. En las técnicas de arada-Mori y del filtro de papel inclinado, las larvas emigran desde las heces a la fase acuosa, donde se pueden detectar con más facilidad. En el cultivo del carbón vegetal las larvas migran primero a una gasa húmeda que se coloca en agua, permitiendo su colonización. La técnica de Baermann es una técnica sensible y fiable para la delección de Strongyloides y otras larvas de nematodos a partir de muestras fecales. En esta técnica, las heces se colocan en varias capas de gasas en la parte superior de una pantalla de alambre que se suspende en un embudo. El extremo del embudo está cerrado con una abrazadera y se añade agua hasta el nivel de la gasa. Las larvas emigran activamente a través de
Tabla 55-4
O b j e t o s e n c o n t r a d o s e n las m u e s t r a s fecales q u e p u e d e simular parásitos entéricos
Tipo de artefacto
Semejanza
Neutrófilos Macrófagos Células del epitelio columnar Células del epitelio escamoso Levaduras
Quisles de Entamoeba histolytica Trofozoilos de Entamoeba histolytica Trofozoilos de amebas
Conidias do hongos Esporas de champiñón Células de plantas Hebras de plantas Polen Diátomos Granulos do fécula, gotas de grasa, burbujas de aire, moco Huevos de ácaros ingeridos Huevos ingeridos de nematodos de las plantas Larvas ingeridas de nematodos de las plantas
Trofozoílos de amebas Quistes de protozoos (especialmente Endolimax nana) Huevos de helmintos Huevos de helmintos Quistes de protozoos, huevos de helmintos Larvas nematodos Huevos de helmintos (Ascaris o huevos de tenia) Huevos de helmintos Quistes de protozoos
Huevos de helmintos Huevos de helmintos Larvas de nematodos
Adaptada de Isenberg HE (ed): Clinical Microbiology Procedures Handbcok. vols t y 2. Washington. DC. American Society for Microbkxógy, 1992
las gasas y se depositan en la base del embudo, donde se pueden recoger para su examen. La recuperación de larvas puede ser superior a la técnica de cultivo, ya que examina una gran cantidad de heces. En las infecciones latentes por Strongyloides. en las que hay pocas larvas, pueden requerirse varios exámenes a lo largo de una semana para demostrar la infección (Ash. 1987).
Objetos semejantes a parásitos entéricos Hay una gran variedad de objetos que pueden parecerse a diferentes parásitos y que se pueden ver en las heces y en otras muestras enviadas para examen. Es necesaria una cuidadosa diferenciación de estos objetos para evitar un innecesario o inadecuado tratamiento. Los leucocitos, los macrófagos y las células epiteliales, escamosas y columnares se pueden asemejar a las amebas; la levadura y los granulos de fécula pueden parecerse a quistes de protozoos; las conidias fúngicas y pólenes pueden confundirse con huevos helmintos: las fibras o la piel de las plantas pueden simular larvas de nematodos, y los trozos de vegetales parecerse a gusanos adultos o proglótides. (Tabla 55-4). Los ejemplos de artefactos y seudoparásitos se pueden revisar en otros textos (Ash, 1997; Garcia. 1997; Isenberg, 1992; NCCLS, 1997).
Examen de muestras urogenitales y otras muestras (esputos, aspirados y biopsias) Los productos vaginales y uretrales, secreciones prostáticas u orina se pueden remitir a laboratorio para la detección de Trichomonas vaginalis. El método más rápido y efectivo es la preparación de varias extensiones con una gota de muestra (se debe centrifugar la orina) diluida con una gota de suero salino y cubriendo con un cubreobjetos. Se examina con un objetivo de bajo aumento (10x) en condiciones de poca luz para ver los trofozoítos móviles, que poseen un movimiento espasmódico. Los exámenes con gran aumento pueden revelar el movimiento de los flagelos y las características ondulantes de las membranas. El uso de cultivo, anticuerpos fluorescentes, o técnicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) aumenta la sensibilidad si es necesario (Briselden, 1994). Se precisan cultivos de los organismos para demostrar las resistencias a los fármacos imidazólicos (Meri, 2000). En el esputo se pueden hallar un gran número de protozoos y helmintos, y la técnica a usar depende del organismo sospechado. Generalmente la técnica requerida para detectar un parásito en su sitio habitual se aplica al esputo. Cuando se sospechan amebas, se deben hacer tinciones permanentes. Son apropiadas las tinciones ácido-resistentes o anticuerpos específicos para Cryptosporidium. mientras que las tinciones tricromo o lluorocromo se deben emplear para detectar esporas de microsporidios. Las técnicas de identificación para Pneumocystis carinii se describen en otro apartado. Para el examen de aspirados se necesita el empleo de las tinciones adecuadas para el germen implicado. Además de los métodos utilizados para espulo, la tinción de Giemsa es habitualmente apropiada para el examen de protozoos, especialmente los hemoflagelados. Los biopsias se deben remitir para estudio histológico tras haberse hecho extensiones y tras ser preparadas para la tinción con Giemsa u otros tintes permanentes. El cultivo para leishmanias y tripanosomas también puede hacerse en tejidos y puede ser importante para demostrar estas infecciones. Las biopsias cutáneas mandadas para Onchocerca o Mansonella deben separarse en salino y ser examinadas a los 30 y 60 minutos para microfilarias. La biopsia muscular para las larvas de Trichmella spiralis se debe examinar mediante la colocación de las muestras frescas en dos portas de cristal o para estudio histológico habitual. Las biopsias de recto o vejiga se pueden examinar para buscar huevos de esquistosomas.
Técnicas de cultivo parasitario Se han descrito métodos de cultivo para una gran variedad de protozoos, pero pocos laboratorios químicos se toman el esfuerzo debido a su
CAPÍTULO 55
Tabla 55-5
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
P r u e b a s de anticuerpos, antigenos y A D N para el diagnóstico de e n f e r m e d a d e s parasitarias*
Enfermedad parasitaria Protozoos Amebiasis Babesiasis Enfermedad de Chagas Criptosporidosis Giardiasis Leishmaniasis Malaria Toxoplasmosis Trichomoniasis Helmintos Triquinisosis Toxocariasis Estrongiloidiasis Filariasis Cisticercosis Equinococosis Esquistosomiasis Paragonimiasis
Métodos serológicos
DD, EIA, IHA IFA
Método de detección de antigenos o A D N EIA
CF, EIA, IFA, IHA EIA. DFA. IFA EIA. DFA, IFA CF IFA IFA EIA. IFA, IHA
IC DFA. IP EIA, DFA. prueba de ADN
EIA. BF, IHA EIA EIA IHA EIA, IHA EIA, IHA. IB IHA. IEP. DD (arcS), IB EIA. IB EIA. IB
" Equipos disponibles en comercios o en laboratorios de referencia o de salud publica. BF lloculacion do benlonila. CF fijación de complemento. DA aglutinación directa; DD difusión doble: DFA: anticuerpos de fluorescencia directa; EIA: enziomoinmunoensayo; IB mmunoblotl, IC inmunocaplura: IHA hemaglutinacion indirecta; IFA: anticuerpos de fluorescencia indirecta, IP inmunoperoxidasa: IEP: inmunoeleclroloresis Adaptada de Wilson M, y Schantz P. Pieniazek, N Diagnosis ol parasitic infections: Inmunologic and molecular methods En Murray PR. Barron EJ. Pfaller y cois (eds ) Manual of Clinical Microbiology, 6 ' ed Washington, DC. ASM Press. MA. 1995. p 1.159.
escaso empleo y a la pobre familiaridad con dichos métodos. Cuando se hace una petición de cultivo suele ser para Trichomonas vaginalis. Leishmania spp., Trypanosoma cruzy, Enlamoeba histolytica. Acanlhamoeba spp o Naeglena lowlen. Además, ocasionalmente se pide a los laboratorios cultivos para Toxoplasma gondii. Una revisión de los métodos se puede encontrar en otros textos (Ash. 1987; Fritsche, 1989a: Garcia. 1997: Isenberg. 1992; Murray. 1999: NCCLS. 1997).
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mosis o la toxocariasis no se pueden diagnosticar fácilmente por criterios morfológicos, y los estudios invasivos no se recomiendan en primera medida. Las diarias, los esquistosomas y Strongyloses pueden permanecer subclinicas debido a infecciones leves o al estadio de la latencia clínica. En esas circunstancias, la evaluación serologica puede resultar útil, especialmente en individuos que han viajado a zonas endémicas sin residir en ellas. Ya que los test serológicos se piden rara vez, las muestras se remiten a laboratorios de referencia (centros para el control y prevención de enfermedades [CDC]). Algunos de los tesl más comúnmente usados pueden estar disponibles en centros locales, entre los que se incluyen toxoplasmosis, amebiasis y triquinosis. Los criterios de interpretación vienen establecidos por los fabricantes, y los reactivos pueden variar en los diterentes centros. Las peticiones individuales de estos test deben cuestionarse acerca de las características de realización, incluyendo sensibilidad y especificidad, y deben estar sobre aviso de que pueden producirse reacciones cruzadas. Además, las serologías de las enfermedades parasitarias no diferencian entre infección activa e infección pasada, punto impodante cuando se estudia a alguien que ha residido en áreas endémicas. Hay métodos de detección antígena disponibles para muchas enfermedades parasitarias que incluyen amebiasis, criptosporidiosis, giardiasis, malaria, y tricomoniasis (Tabla 55-5) y pueden ser útiles en aquellos casos en que los test tradicionales son negativos y persiste una alta sospecha clínica Estos estudios tienen la ventaja de detectar la infección actual y pueden ser realizados por personas sin demasiada experiencia (Wilson, 1995).
Métodos de diagnóstico molecular El uso de métodos diagnósticos mediante la amplificación de ADN y ácidos nucleicos se ha descrito para la mayoría de las enfermedades parasitarias más frecuentes y tiene una gran sensibilidad y especificidad (Persing, 1993; Weiss, 1995; Wilson, 1995). Sin embargo, la mayoria de estas técnicas han permanecido para un uso de investigación y no están disponibles para uso habitual (Bendall. 1993). Como dato, el equipo y otros materiales necesarios, incluido el personal entrenado en biología molecular, han permanecido fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios de diagnóstico debido a limitaciones fiscales. Aunque hay gran variedad de equipos disponibles para el diagnóstico de bacterias y virus, sólo un equipo ha recibido la aprobación para un parásito como es Trychomonas vaginalis (Briselden. 1994). Los métodos moleculares pueden tener una gran importancia en la identificación de los vectores de los parásitos y contribuir a la prevención mediante programas de control contra dichos vectores (Weiss. 1995).
Métodos de inmunodiagnóstico Control de calidad, de mejora y seguridad Los métodos de inmunodiagnóstico para la detección de anticuerpos o antigenos en las enfermedades parasitarias son muchos, pero tienen gran variabilidad de sensibilidad y especificidad, así como de disponibilidad. El tema está más allá del propósito de este capítulo, pero se puede encontrar una revisión asequible (Wilson, 1995). Los test disponibles para uso sanitario, hospitalario o comercial se resumen en la Tabla 55-5. Históricamente, los procedimientos serológicos para enfermedades parasitarias eran desestimados por su baja sensibilidad y especificidad, debido principalmente a la compleja naturaleza antigénica de los parásitos y la posibilidad de reacciones cruzadas entre las especies descritas. La introducción de nuevos test, combinados con el uso de componentes altamente antigénicos. está dando mejores resultados con grandes valores predictivos. La mayoría de los nuevos test utilizan el enzimoinmunoensayo (EIA) o el inmunoblot (Western blot), aunque aún son populares la inmunofluorescencia indirecta (IFA), la hemaglutinación indirecta (IHA). la fijación de complemento (CF) y la lloculacion de bentonita (BF). El uso de test serológicos en el diagnóstico de enfermedades parasitarias es un suplemento a los métodos habituales de diagnóstico que intentan detectar el parásito de un modo directo en las heces, la sangre, los tejidos o los Huidos corporales. Ciertas infecciones como la toxoplas-
El programa de segundad para la sección de parasitología del laboratorio es semejante al de otras secciones del laboratorio, cubriendo todos los aspectos esenciales del trabajo, incluidos, entre otros, un manual del proceso completo que debe ser revisado anualmente, guias de mantenimiento de todas las muestras y de recogida de datos, así como de los resultados, programa completo de control de calidad con la apropiada supervisión técnica y revisión, y la participación en programas de competencia. Los laboratorios también necesitan centrarse en la satisfacción del cliente, mediante la participación en el equipo de trabajo con cuestionarios de opinión, en la identificación de problemas y en la generación de soluciones para la mejora de calidad. Para el rendimiento de la sección de parasitología, se deben monitorizar periódicamente muestras desconocidas, tanto internas como extemas, y se debe actualizar la competencia, especialmente en aquellos laboratorios con escaso volumen de muestras. Debe existir un material de referencia disponible para el uso del laboratorio que incluya muestras positivas, atlas impresos y atlas de preparaciones. Se deben considerar potencialmente infecciosas las muestras sin preservar. Toda la sangre y fluidos corporales se deben manejar de acuerdo
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
con las normas universales de precaución realizadas por la administración de salud y seguridad laboral (Federal Register, 1991). Además de los virus de transmisión sanguínea, los parásitos de la malaria y los hemoflagelados también pueden ser infecciosos. Una gran cantidad de parásitos pueden seguir siendo infectivos en muestras de heces frescas, como los quistes de protozoos entéricos, los huevos de Taenia sotium. Enterobius vermicularís H. nana, y las larvas de Strongyloides stercoralis. Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides y las uncinadas pueden persistir infectivas en muestras antiguas, y los huevos de Ascaris pueden sobrevivir en formalina al 5%. Las muestras fecales también pueden contener patógenos como Salmoneiia, Shigella o virus, Es esencial una observación cuidadosa del manejo de las muestras. También es necesaria una especial atención al lavado de las manos. En uso de etil acético en vez de éter en las técnicas de concentración es recomendable para evitar la posibilidad de explosión (Truant, 1981).
PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES Malaria La malaria (del italiano malaria, que significa mal aire) es una infección aguda y a veces crónica del torrente sanguíneo que se caracteriza por fiebre, anemia y esplenomegalia, y es provocada por parásitos apicomplejos del género Piasmodium. Los hallazgos clínicos defimloríos de un ataque de malaria consisten en escalofríos, fiebre (mayor de 40 C), diaforesis generalizada, seguidos por el cese de la fiebre. Las crisis se producen cada 610 horas y se desatan por la ruptura sincrónica de eritrocitos, de los que se libera una nueva forma infecciosa conocida como merozoito. La enfermedad se produce generalmente entre los 45" norte y 40° sur de latitud (WHO, 1987) y se transmite únicamente por mosquitos Anopheles hembra. Las cuatro especies de Piasmodium que producen la malaria humana son P. vivax. P. lalciparum. P. malariae y P. ovale. La infección por P. falciparum se da principalmente en zonas tropicales de todo el mundo, mientras que las infecciones por P. vivax se producen tanto en zonas tropicales como templadas. P. malariae también se da en todo el mundo, pero mucho menos extendido que P. lalciparum o P. vivax. P. ovale es el menos frecuente de la malaria, siendo la mayoría de los casos en el oeste de África, India y Sudamérica. 1
Dado que la infección de la malaria es potencialmente tratable, se debe considerar en el diagnóstico diferencial de la fiebre de origen desconocido y en historia de viajes a zonas endémicas. En una era de creciente empleo de los viajes por todo el mundo, el riesgo de contraer malaria no es insignificante, y la rápida extensión de las resistencias a los fármacos se debe considerar a la hora de valorar una profilaxis o un tratamiento. La evaluación del laboratorio ante la sospecha de la malaria sigue basándose en el examen de los frotis grueso y fino de la sangre, para objetivar los parásitos intraeritrocitarios. Aunque su aproximación diagnóstica es sencilla, la realización de estas técnicas puede ser problemática. La identificación de este organismo requiere un entrenamiento continuo para mantener la experiencia, por lo que los laboratorios que no suelen ver muchos casos pueden optar por mandar las muestras a laboratorios de referencia. Otros métodos más avanzados de laboratorio, incluidas la tinción naranjaacridína (véase Métodos de laboratorio) o la detección del ADN específico (Lanar, 1989; Persing. 1993; Weiss, 1995), dan una mayor sensibilidad y especificidad pero no suelen estar disponibles en laboratorios pequeños. El reciente desarrollo de los ensayos inmunológicos para la detección de lactato deshidrogenasa específica de Piasmodium parece dar una alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de la malaria. Uno de estos test, realizado con una tira de reactivo, es especialmente prometedor en aquellas situaciones donde la facilidad de la realización de los estudios es crítica y hay escasez de medios (Piper, 1999; Palmer. 1998). Ciclo vital. Los parásitos de la malaria tienen una fase sexual (esporogonia) en el mosquito Anopheles. que produce esporozoítos infecciosos, y un estado asexual (esquízogonia) en los humanos que deriva en esqui-
zontes y merozoítos (Fig. 55-1). En el torrente sanguíneo algunos merozoítos se diferencian en gametocitos (gametogonias), que. cuando son digeridos por un mosquito hembra de Anopheles, maduran a microgametos masculinos y macrogametos femeninos. La lusión de un microgameto y un macrogameto da lugar a un oocineto móvil que emigra a través de la pared de estómago y forma un ooquiste. Dentro del ooquiste se forman numerosos esporozoítos móviles. La ruptura del ooquiste maduro en la cavidad corporal libera esporozoítos que emigran a través de los tejidos de las glándulas salivares, desde donde pasan a huéspedes vertebrados cuando el mosquito se alimenta. El tiempo requerido para el desarrollo en el mosquito es de 8-21 días. Los esporozoítos en los vertebrados alcanzan las células hepáticas en pocos minutos e inician una fase de proliferación conocida como esquízogonia exoeritrocitaria. La liberación de merozoítos tras la ruptura de los esquizontes hepáticos o la ruptura de esquizogonias eritrocitarías produce la infección del torrente circulatorio, causando la clínica de la malaria. P. vivax y P. oválese diferencian de P. lalciparum y de P. malariae en que las recaídas por especies antiguas pueden producirse semanas o meses después tras el primer brote. Esto es consecuencia de la renovación de las esquizogonias exoeritrocilarias, y a veces eritrocitarías. a partir de esporozoítos hepáticos latentes que se conocen como hipnozoitos (Krotoski, 1982). Las recurrencias debidas a P. lalciparum o P. malariae, llamadas recrudescencias, se deben a un incremento en el número de formas sanguíneas hasta niveles clínicamente detectable, no a formas hepáticas persistentes. Los hepatocitos se infectan sólo por esporozoítos a través del mosquito, de este modo la infección por P. vivax o P. ovale adquiridas por transfusión no recidivan. Los merozoítos liberados de los hepatocitos afectados infectan a los eritrocitos. La consiguiente amplificación del parásito en el torrente sanguíneo durante un tiempo y su aparición sincrónica desata las crisis de malaria. Los parásitos de P. vivax y P. ovale infectan a los eritrocitos jóvenes, mientras que P. malariae infecta a los viejos y P. falciparum a los eritrocitos de cualquier edad. Los estadios morfológicos observados en los eritrocitos incluyen trofozoitos (formas en crecimiento), esquizontes (formas en división) y gametocitos (formas sexuales) (Láminas 55-1 a 55-4). Los trofozoítos más jóvenes tienen un contorno globuloso o con una vacuola central, una masa de cromatina roja y un citoplasma azul. En frotis teñidos, los trofozoítos se asemejan a anillos de sello y se describen como anillos o con forma anular. Los trofozoítos en crecimiento tras la fase de anillo mantienen una única masa de cromatina, pero tienen un citoplasma abundante que puede ser compacto o ameboide (irregular). Los trofozoítos maduros aún poseen una única masa de cromatina y un grandísimo citoplasma que rellena parcialmente el eritrocito. El pigmento hemozoína (hematina), un derivado de la hemoglobina, es característico de todos los eritrocitos que contienen formas maduras de la malaria, pero no se detecta en las formas anulares. Los esquizontes inmaduros tienen dos o más masas de cromatina y un citoplasma sin dividir, mientras que los maduros poseen tanto el citoplasma como la cromatina divididos, de tal modo que los merozoítos son evidentes. Los esquizontes maduros rompen el eritrocito, liberando merozoítos e iniciando un nuevo ciclo de infección. El ciclo eritrocitario se realiza en 48 horas aproximadamente (periodicidad terciana) para P. falciparum. P. ovale y P. vivax, y en 72 horas (periodicidad cuartana) para P. malariae. En algunos momentos de la infección una subpoblación de merozoítos se transforma en gametocitos. Los de P. vivax, P. malariae y P. ovale son redondeados, mientras que los de P. falciparum son alargados (forma de salchichas). Característicamente, los macrogametocitos (femeninos) poseen una masa compacta de cromatina, mientras que los microgametocitos (masculinos) la tienen más dispersa. Los gametocitos en desarrollo son más compactos que los trofozoítos en crecimiento. Epidemiología. La transmisión endémica de la malaria requiere un reservorio, un mosquito vector y un huésped susceptible. El control de la malaria se dirige a la eliminación del mosquito, al tratamiento de los casos activos y a la profilaxis de personas susceptibles. Sin embargo, la aparición de resistencias a los insecticidas por parte de los mosquitos y de la resistencia al tratamiento y profilaxis por parte de P. falciparum. y recientemente por P. vivax (Murphy, 1993), y la falta de recursos hacen difícil el control en muchas zonas.
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Figura 55-1. Ciclo de vida del parásito de la malaria (Cortesía del CDC. Parasitology Training Branch. Atlanta. GA.)
Los negros con anemia falcilorme son menos susceptibles a la malaria por P. falciparvm. y las personas que carecen del grupo sanguíneo Duffy están protegidas contra la infección por P. vivax (Miller. 1976). El déficit de glucosae-fosfato deshidrogenasa (G6PD) se ha asociado a una protección contra la malaria, pero la evidencia está menos demostrada que con las otras anomalías hereditarias. La malaria secundaria a transfusión puede producirse cuando el donante padece una malaria subclínica. y puede resultar mortal para el receptor. Del mismo modo, puede darse una malaria congénita en niños nacidos de madres de zonas endémicas. Los niños la adquieren durante el nacimiento a causa de la rotura de los vasos placenlarios en una transfusión malerno-fetal. Ni en
la malaria congénita ni en la secundaria a transfusión se esperaba que existieran recaídas, ya que no se forman esquizogonias exoeritrocitarias El número de casos de malaria en EE.UU. aumentó de 151 en 1970 a 1.838 en 1980, pero descendió a 1.411 en 1993 (CDC. 1988,1993). Las especies causantes de la infección en 1987 fueron P. vivax (44%), P. falctparum (43%), P. malariae (4%). P. ovale (3%) y un 6% indeterminado. El intervalo entre la llegada a EE.UU. y el desarrollo de la enfermedad fue menos de un mes para el 25% de los casos de P vivax y del 80% de los casos por P. lalciparum. Sólo un 3% de los pacientes desarrollaban la enfermedad tras un año. Los ciudadanos de EE.UU. adquirieron la infección en África (63%), Asia (18%). hemisferio occidental (14%) и Oceanía (4%).
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Enfermedad clínica. La mayoría de los pacientes con infección por P. lalciparum desarrolló los síntomas en menos de un mes tras la exposición, mientras que esto podía ser mayor de seis meses con otras especies de Plasmodium. Los síntomas comunes de malaria incluyen escalofríos y fiebre, que suele asociarse a esplenomegalia. En los estadios precoces, los episodios febriles son irregulares, pero luego se van haciendo más sincrónicos, tomando la periodicidad terciana (P. vivax. P. falciparum y P. ovale) o cuartana (P. malaria). Los pacientes pueden tener anemia y otras manifestaciones como diarrea, dolor abdominal, cefalea y mialgias. La malaria por P. falciparum puede producir mucha parasitemia (50%). llegando a producir hemolisis grave, hemoglobinuria y gran anemia. Los eritrocitos infectados por trofozoítos en crecimiento y esquizontes de P. falciparum tienden a ser secuestrados en capilares, pudiendo llegar a ocluirlos, causando clínica asociada y anoxia tisular. La afectación cerebral se conoce como malaria cerebral, produciendo desorientación, delirio, coma y. frecuentemente, la muerte. En las infecciones graves por P. falciparum las transfusiones pueden salvar la vida (Nielson. 1979; Organización Mundial de la Salud [OMS], 1987). La evolución de la malaria sin tratamiento depende de la especie causal. La mayoria de los casos fatales se deben a P. falciparum. En los restantes casos, las crisis febriles pueden ir siendo progresivamente menos graves y desaparecer gradualmente. Los pacientes con infección por P. vivax o P. ovale pueden sufrir recaída tras meses o incluso tras años. Los pacientes con infección por P falciparum y P. malariae pueden tener períodos asintomáticos y sufrir recaída debido a la presencia de parasitemia de bajo grado. Las recaídas y reagudizaciones se pueden asociar con cambios en la inmunidad del huésped o con cambios antígénicos en los parásitos. Las extensiones periféricas pueden mostrar leucocitos con pigmento malárico. Un aumento del número de reticulocitos se debe al rápido recambio eritrocitario. Se puede detectar la presencia de grandes plaquetas alargadas en la sangre periférica debido a un rápido recambio, secundario a un secuestro esplénico, La infección por malaria puede interferir con otros test serológicos, produciendo falsos positivos, especialmente con los de la sífilis. El tratamiento y profilaxis de la malaria puede ser difícil debido a aparición de resistencias a la cloroquina por P lalciparum. así como otros antipalúdicos, y a la menos extendida resistencia a la cloroquina por P. vivax. También, personas que han adquirido P. vivax o P. ovale, o que han pasado mucho tiempo en zonas muy endémicas para estos parásitos, requieren tratamiento con primaquína para erradicar los hipnozoítos y prevenir así las recaídas. El uso de primaquína puede ser peligroso en los déficit de G6PD y se debe realizar un screening previo antes de empezar el tratamiento. Diagnóstico. Se debe incluir a la malaria en el diagnóstico diferencial de fiebre en pacientes que han viajado o residen en zonas endémicas, drogadictos o gente que ha recibido transfusiones. El diagnóstico suele hacerse por la detección de parásitos en frotis de sangre finos y gruesos. Las muestras de sangre se deben tomar preferiblemente justo antes del pico febril o tras el pico febril. A veces es necesaria la toma de muestras separadas varias horas para detectar la infección e incluso la especie, ya que el número y fase de los parásitos varían según el ciclo. Un cuidadoso examen de los frotis gruesos revelaría la presencia de parásitos en casi todos los pacientes con clínica de malaria. La identificación de parásitos de la malaria en los frotis finos requiere un abordaje sistemático. Hay tres factores principales a tener en cuenta: la aparición de eritrocitos infectados, la aparición de parásitos y los estadios hallados. En la Tabla 55-6 se resumen las características diagnósticas de las especies que se ilustran en las Láminas 55-1 a 55-4. Los eritrocitos infectados por P vivax o P ovale suelen estar aumentados de tamaño en comparación con los que les rodean, mientras que los parásitos P. malariae y P. falciparum suelen encontrarse en eritrocitos de un tamaño normal. Más del 20% de los eritrocitos con P. ovale pueden ser ovales o con fimbrias (proyecciones irregulares en los márgenes de la célula), mientras que menos del 6% de los eritrocitos infectados por P vivax son ovales. Pueden verse numerosos granulos rosas uniformes dentro del eritrocito (granulos
de Schüffner) en las células infectados con P vivax y P. ovale, aunque pueden no ser evidentes en las células infectadas con formas tempranas o en extensiones que no se han teñido al pH apropiado (véase previamente en Métodos de laboratorio). La presencia de granulos de Schüffner es útil, ya que no se ven en P malariae y P falciparum. Mientras los trofozoítos crecen en las células infectadas, la cantidad de hemoglobina en el eritrocito disminuye y se acumula pigmento de hemozoína. La cantidad y aspecto del pigmento varían según la especie. Las formas anulares de todos los parásitos pueden ser similares si solo se encuentran formas anulares, impidiendo diferenciar las especies. Los anillos jóvenes de P. falciparum son más pequeños que los de las otras especies (un sexto del diámetro de la célula roja, en comparación con un tercio del diámetro de la célula roja de las otras especies). Los anillos de P. falciparum que han crecido son similares en tamaño a los de oirás especies. Los trofozoítos que yacen en la superficie del eritrocito o que protruyen se denominan formas apliqué o accolé. y se ven más frecuentemente en infecciones por P. falciparum. La presencia de células doblemente infectadas y doble punteado de cromatina en los trofozoítos en anillo es más frecuente en P falciparum. pero puede producirse en las demás especies. Los trofozoítos en crecimiento de P vivax tienen una forma irregular y se denominan ameboideas. Los de P. malariae y P. ovale permanecen compactos. Los trofozoítos y esquizontes maduros de P. falciparum suelen ser secuestrados en el lecho capilar por adherencia a las células endoteliales. por lo que no se ven en sangre periférica excepto en infecciones graves. Cuando se detectan esquizontes en la sangre periférica, la determinación del número de merozoítos puede ser útil para dilerenciar las especies. Los gametocitos de P. falciparum son fácilmente identificables por su forma característica en salchicha. Los gametocitos de P. vivax, P. malariae y P. ovale son similares y difíciles diferenciar, aunque las características de la célula roja infectada pueden ayudar. La variedad de los estadios en la sangre penférica puede ser útil. En la detección de infecciones por P. falciparum predominan las formas en anillo, y el hallazgo de numerosas formas en anillo sin otras formas maduras es una evidencia de infección por P falciparum. En las infecciones por P. vivax. P. malariae y P ovale se encuentran diferentes estadios de parásitos con algún predominio, dependiendo de la fase del ciclo. Para la detección de la malaria se prefieren frotis gruesos, ya que se examina mayor cantidad de sangre (véase previamente en Métodos laboratorio). Las formas en anillo suelen tener la apariencia de signos de puntuación más que de anillos completos, y debe buscarse la presencia de cromatina roja y citoplasma azul para identificarlos como parásitos. Los granulos de Schüffner pueden ser útiles para la identificación y se deben reconocer alrededor de los trofozoítos en crecimiento como un halo rosa. El carácter ameboide de los trofozoítos de P vivax no es tan evidente en los frotis gruesos, pero es útil el número de merozoítos en los esquizontes maduros. Los macro y microgametocitos pueden no ser diferenciabas. La forma distintiva en salchicha de los gametocitos de P falciparum es aún evidente, sin embargo puede ser más estirado que en los frotis finos. Los gametocitos de otras especies se pueden detectar y diferenciar fácilmente de los núcleos celulares por la presencia de pigmento de hemozoina de refracción. Pueden producrise infección mixta (en aproximadamente el 5% de las veces), pero se debe ser prudente a la hora de hacer el diagnóstico, a menos que exista evidencia de dos poblaciones claramente separadas de parásitos. La mezcla más común es la infección por P falciparum y P. vivax. El hallazgo de gametocitos de P falciparum en una persona claramente infectada con P. vivax es diagnóstico. Hay múltiples artefactos que pueden simular parásitos en el frotis. Los más frecuentes en los frotis finos son las plaquetas superpuestas a los glóbulos rojos. Estas plaquetas se pueden identificar fácilmente porque no tienen una auténtica forman anillo y no muestran diferencia de la cromatina y de citoplasma y, además, no contienen pigmento. Se pueden confundir grupos de bacterias o plaquetas con esquizontes. A veces, masas de plaquetas pueden asemejarse a gametocitos de P. lalciparum, pero no muestran el colorante diferencial o el pigmento. También se pueden confundir con parásitos los grumos de colorante, las bacterias contaminantes o las esporas.
Tabla 55-6 Comparación de las especies de Plasmodium que afectan a los humanos Apariencia del eritrocito Especies Plasmodium vivax
Plasmodium malariae
Plasmodium ovale
Plasmodium falciparum
Tamaño
Aumentado. La talla máxima alcanzada por los trofozoítos y esquizontes puede ser 1-2 veces el diámetro normal Normal
Granulos del eritrocito En todos los estadios excepto en las formas precoces de anillo (Rara vez se ven los puntos de Ziemann)
Aumentado. Tamaño máximo + V*-V veces el diámetro En todos los estadios excepto del eritrocito. en las formas de anillo Aproximadamente el 20% o más tempranas de los eritrocitos infectados son ovalados y/o fimbriados el borde tiene proyecciones irregulares Normal. Los eritrocitos infectados son normales (Ocasionalmente se ven puntos de Maurer)
Apariencia del parásito Citoplasma
Pigmento
Número de merozoitos
Estadios hallados en sangre periférica
Irregular, ameboide en los trofozoítos. Tiene apariencia "extendida"
Marrón dorado, poco llamativo
12-24, la media es 16
Todos los estadios La mayoría de los estadios pueden verse en el mismo frotís
Redondo, trofozoítos compactos con citoplasma denso. Trofozoítos con forma de banda ocasionalmente
Marrón oscuro, basto, llamativo
6-12, promedio Todos los estadios. La gran de 8: a veces variedad de los estadios se ven esquizontes no suele verse. Relativamente pocos anillos en "roseta o gametocitos presentes
n > c
Redondo, trofozoítos compactos Marrón oscuro. A veces levemente ameboide. llamativo Los trofozoítos en crecimiento tienen grandes masas de cromatina
Los anillos jóvenes son pequeños, delicados y frecuentemente con doble punteado de cromatina Los gametocitos están alargados
6-14, promedio de 8
Negro. 6-32. Basto y llamativo promedio 20-24 en los gametocitos
r-
o en C7!
>
Todos los estadios 9 O
Anillos y/o gametocitos. Otros estadios se desarrollan en los vasos sanguíneos u órganos internos, pero no en la sangre periférica, excepto en infecciones graves
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De Smith JW Melvm DM. Onhel TC. y cols.: Diagnostic Parasitology-Blood and Tissue Parasites Chicago. American Society of Clinical Pathologists. 1976. con autorizaciOn
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Los test serologicos para malaria son específicamente útiles para estudios epidemiológicos y para la detección de donantes de sangre infectados. No obstante, estos test no están capacitados para diferenciar entre infección actual o pasada. Hay test sensibles y específicos disponibles en el CDC de IFA que utilizan antígenos para las cuatro especies humanas (Wilson. 1995).
Babesiosis Como el parásito de la malaria, los agenles de la babesiosis o piroplasmosis son protozoos apicomplejos extendidos por todo el mundo que infectan eritrocitos, produciendo enfermedades febriles de gravedad variable. A diferencia de la malaria, se transmite por garrapatas y hay una gran variedad de animales que actúan como reservorio. La infección en EE.UU. se produce principalmente en estados del noreste y del medio oeste, donde el parásito de los roedores Babesia microli es el responsable de la infección (Herwaldt. 1995). /. capulahs es la garrapata vector. Estudios recientes han implicado a otra especie de Babesia, aun sin nombre (por el momento conocida como WA1), como causante de la enfermedad en el oeste de EE.UU. Se cree que este parásito, asociado con la enfermedad en Washington y California, se transmite por la garrapata de patas negras. Ixodes paciticus (Persing, 1995: Quick. 1993). En Europa, es el parásito canino Babesia divergens. transmitida por Ixodes ricinus. el que infecta a los humanos. El espectro clínico varía desde enfermedad latente y subclínica a hemolisis fulminante. Se han descrito fatalidades, especialmente en espleneclomizados o inmunosuprimidos. Las personas mmunocompetentes pueden tener sintomas similares a la malaria, como fiebre, escalofríos, malestar general y anemia, aunque sin la característica periodicidad. La investigación de un brote por Babesia microli en la isla de Nantucket, en Nueva Inglaterra, mostró que algunos pacientes sinlomálicos portaron el parásito durante meses,
y otros mostraron evidencia serológica de infección sm historia de enfermedad clínica (Ruebush, 1980). Otra evidencia es que la infección crónica subclínica puede ser infrecuente (Persing, 1995). El parásito se multiplica en los eritrocitos como esquizogonias, pero no produce gametocitos. Aunque los trofozoitos de muchas especies tienen forma de pera, en algún momento de su desarrollo los de S. microli suelen parecerse a delicadas formas anulares que pueden confundirse con las de la malaria, especialmente P. falciparum (Lámina 55-5A) (Healy, 1980). Los trofozoitos de Babesia se pueden diferenciar de los de la malaria por la presencia de múltiples anillos en una célula que pueden formar una tetrada (cruz de Malta) y por la ausencia de trofozoitos grandes en crecimiento y de los gametocitos. También, las células de los infectados por Babesia carecen de pigmento de hemozoina, que está presente en las células infectadas por Plasmodium. La historia de residencia o viaje en zonas endémicas, o picadura reciente por garrapatas, puede sugerir infección por Babesia. Hay disponibles test serológicos (IFA) para Babesia microtiy WA1 en el CDC con referencia a los departamentos de salud estatal. Los test serológicos de malaria son negativos en la babesiosis. aunque pacientes con malaria pueden tener actividad cruzada con las serologías de Babesia (Wilson. 1995).
Hemoflagelados Los hemoflagelados de humanos y animales son miembros del orden de los Kinetoplastida y se caracterizan por la presencia de un gran mitocondrión conocido como cinetoplasto, que contiene suficiente ADN para ser visto por microscopio de luz cuando se tiñen con Giemsa. Los dos géneros importantes en la patología humana son Trypanosoma y Leishmania. Ambos se transmiten por artrópodos y tienen huéspedes animales como reservónos.
Figura 55-2. Morfología de los hemoflagelados.
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
Los cínetoplástídos tienen diferente morfología dependiendo de su presencia en huéspedes vertebrados, incluidos los humanos, o en sus vectores (Fig. 55-2). El estadio amastigote es esférico, de 2 urn a 5 pm de diámetro, y posee un núcleo y cinetoplasto. Por definición le falta un flagelo externo, aunque a nivel ultraestructural es aparente un axonema (parte inlracelular del flagelo) Los amastigotes se pueden encontrar en huéspedes humanos o animales infectados con T. cruzío Leishmania spp.. donde se multiplican únicamente dentro de las células. El promastigote es un organismo alargado y delgado con un núcleo central, un cinetoplasto anterior y un axonema. y un flagelo libre que va desde el extremo anterior. Esta fase se da en el insecto vector de Leishmania y es la que se detecta en los cultivos. El epimastigote es similar al promastigote. pero el cinetoplasto está más cerca del núcleo y posee una pequeña membrana ondulada que acaba en un flagelo libre. Todas las especies de Trypanosoma que infectan a humanos toman la forma de epimastigote en el vector o en el cultivo. En el tripomasligote, el cinetoplasto está en el extremo posterior y el flagelo forma una membrana ondulada que se extiende a lo largo de la célula, acabando como un flagelo libre en el extremo anterior. La forma de tripomastigote se da preferentemente en el torrente sanguíneo en el huésped de mamíferos infectados con Trypanosoma spp. Las fases infecciosas encontradas en los vectores formados a partir de epimascigotos se conocen como tnpomastigotes metacíclicos
Trypanosoma Las infecciones por Trypanosoma incluyen las causadas por T. brucei (tripanosomiasis africana o del Viejo Mundo) y T. cruzi (tripanosomiasis americana o del nuevo mundo o enfermedad de Chagas). Ambas son de gran importancia en zonas endémicas, pero rara vez pueden verse en EE.UU. Una tercera especie. T. rangeti, se ha descrito en humanos en América, pero no produce de enfermedad clínica. El tripomastigote del torrente sanguíneo del grupo T. brucei (Lámina 55-5B) es mayor de 30 um de longitud, con unas curvas graciosas y un pequeño cinetoplasto. Los del T. cruzi son más pequeños (20 um), tomando formas de S y C en los frotis teñidos, y poseen un cinetoplasto más largo. En África ecuatorial, los parásitos del grupo T. brucei infectan tanto a humanos como a animales y se transmiten por la picadura de la mosca tsetse, del género Glossina. La proliferación de los organismos en el punto de punción produce un chancro transitorio. En el este de África, la tripanosomiasis es causada por I brucei rhodesiense, que tiene un gran número de huéspedes animales como reservónos. La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril agudo rápidamente progresivo y adenopatias. La muerte del paciente se da tras la afectación del sistema nervioso central. La infección en África occidental es debida a T. brucei gambiense, que es el causante de la clásica enfermedad del sueño africana. La enfermedad posee un curso crónico que empieza con fiebre intermitente, sudoración nocturna y malestar. Pueden ser llamativas las adenopatias, especialmente las cervicales (signo de Winterbottom). Con el tiempo, acaba afectando al sistema nervioso central: somnolencia, confusion, fatiga y estupor progresivo, coma e incluso muerte. Los humanos son el principal reservono ante esta enfermedad (OMS. 1986). El diagnóstico se debe sospechar con la historia geográfica y los hallazgos clínicos. Se observa un aumento en la IgM total en sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR). Existe pleocitosis con 50-500 células mononucleadas/microlitro en el liquido cefalorraquídeo. El diagnóstico se confirma por la demostración de los parásitos en frotis sanguíneos, tanto gruesos como finos, extensiones, aspiraciones de adenopatias o de la médula ósea, o en el centrifugado de líquido cefalorraquídeo teñido con Giemsa (Cattand, 1988; Van Meirvenne, 1985). Los cultivos o la inoculación en animales también pueden ser útiles si estuviesen disponibles. La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas está causada por T. cruzi. En su forma selvática, se da en EE.UU., Centroamérica y. sobre todo, en Sudamérica. La infección humana es común en zonas de México, Centroamérica y Sudamérica, donde se transmite por chinches de la familia de los Reduviidae. Los géneros y especies implicadas en la transmisión varian de un país a otro y según los diferentes nichos ecológicos. Algunas de las chinches son responsables de mantener el ciclos selvático en los reservónos animales, mientras que otras están acostumbradas a la
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vida doméstica, donde infectan a casas de pobre construcción, especialmente en zonas rurales. A la hora de alimentarse, las chinches defecan. Las heces contienen tripomastigotes infectivos que tras el rascado entran en el cuerpo por el punto de la picadura a través de la mucosa intacta de la boca o la conjuntiva. La forma infectiva entra activamente cerca de las células tisulares, donde se transforman en amastigotes en división. Cuando las células infectadas se llenan de amastigotes, se transforman en tripomastigotes, seguido de la rotura celular. Los tnpomastigotes se liberan en la sangre periférica alcanzando los tejidos distantes, donde comienza el ciclo reproductivo de novo. La enfermedad de Chagas puede causar infección aguda o crónica. La aguda es más frecuente en niños menores de cinco años y se caracteriza por malestar, escalofríos, fiebre, hepatoesplenomegalia y miocarditis. El edema palpebral (signo de Romana) puede presentarse si la inoculación se produce en la cara. El edema tisular en otras partes, tras la picadura de las chinches infectadas, se llama chagoma. En personas ancianas, el curso agudo es leve o frecuentemente asintomático. En ambos casos, el paciente estará afectado de por vida Las manifestaciones crónicas de la infección, incluido el megaesófago, el megacolon y las alteraciones de la conducción miocárdica. son debidas a la destrucción de las células efectoras del sistema parasimpático por autoanticuerpos. La infección se puede transmitir por transfusiones, y las infecciones latentes pueden exacerbarse por ¡nmunosupresión. El diagnóstico en el estadio agudo se hace demostrando el parásito en frotis gruesos o finos de sangre, extensiones o en aspirados de los chagomas o de las adenopatias. Estas muestras también se pueden cultivar con el uso del medio Novy-MacNeal-Nicolle (Ash, 1987; Garcia, 1997; Vísvesvara, 1992c). En las áreas endémicas se puede usar el xenodiagnóstico (examen de contenido gástrico de chinches a las que se les ha permitido picar a un paciente). En los estudios en los estadios crónicos, el diagnostico serológico es el método de elección. El EIA. IFA y el test de CF están disponibles, aunque no permiten diferenciar entre enfermedad aguda o crónica y pueden tener reacción cruzada con pacientes con leishmaniasis.
Leishmania La leishmaniasis es una enfermedad del sistema reticuloendotelial producida por protozoos cinetoplástidos del género Leishmania. Todas las especies que infectan a humanos tienen reservónos anímales y se transmiten por moscas que pertenecen a género Phlebolomus en el Viejo Mundo y Lulzomyia en el Nuevo Mundo. Los parásitos toman la forma de amastigotes en los mamíferos y la forma de promastigotes en los insectos vectores. Las especies de Leishmania no se pueden diferenciar por examen de otros amastigotes o promastigotes. La leishmaniasis puede lomar diferentes formas clínicas: la forma cutánea, mucocutánea y visceral son las más conocidas. La forma y gravedad varían según la especie infectante, el estado inmune del huésped y la exposición previa (Peters. 1987: Strickland, 1999). Leishmaniasis cutánea. La leishmaniasis cutánea del Viejo Mundo (llaga oriental) se produce en el sur de Europa, norte y este de África, Oriente Medio. Irán, Afganistán y el sur de Rusia. Las infecciones están producidas por L tropica. L. major y L. aethiopica. aunque L. donovam y L. infantum también pueden producir lesiones cutáneas. L. tropica causa la úlcera urbana o seca, que es más duradera que la rural o la úlcera húmeda de L. major. Estas úlceras suelen producirse en una zona expuesta del cuerpo y se cura espontáneamente. La infección deja inmunidad duradera. L. tropica puede llegar a ser viscerotrópica. tal como se demostró recientemente en personal militar que participó en la operación Tormenta del Desierto (Magill, 1993). L. aethiopica produce una infección cutánea más agresiva, que en algunos casos puede producir lesiones mucosas a distancia o leishmaniasis cutánea difusa, cuyo extremo se caracteriza por múltiples módulos cutáneos que se asemejan a la lepra lepramatosa. La leishmaniasis cutánea del Nuevo Mundo es causada por muchas especies, incluidos L. mexicana. L. braziliensis. L. amazonensis. L vene-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
zuelensis. L. garnhami, L. pifanoi. L. peruviana. L. panamensis y L. guyanensis. Las lesiones causadas por L. mexicana pueden afectar al lóbulo de las orejas (úlcera del chiclero), siendo autolimitada, y se desconoce su afectación a distancia de las mucosas. Sin embargo, L. mexicana y L. amazonensis pueden causar lesiones cutáneas difusas similares a las de L aethiopica. Existe un foco de leishmaniasis cutánea en el sur de Texas, donde las infecciones están causadas por una o más especies (Gustafson, 1985). L. peruviana, hallada en las pendientes occidentales de los Andes peruanos, causa una infección llamada uta. una lesión cutánea benigna que se da preferentemente en niños. L. peruviana se adquiere en las casas, donde los principales reservorios son los perros domésticos. Esta situación epidemiológica contrasta con otras leishmaniasis cutáneas que suelen adquirirse en los bosques y tienen animales salvajes como reservónos. Leishmaniasis mucocutánea. La Leishmaniasis mucoculánea (espundia) es provocada por L. braziliensis y rara vez por otras especies causantes de lesiones cutáneas más agresivas, y a veces se disemina a membranas mucosas, especialmente la nasal, la oral y la faríngea. En estas zonas puede producir lesiones desfigurantes por erosión de las partes blandas y de los cartílagos. L. braziliensis se distribuye en México, América central y Sudaménca.
res. incluidos células levaduriformes de Histoplasma capsulatum y los trofozoitos de Toxoplasma gondii. Leishmama spp. tiene un cmetoplasto y no posee pared celular. En contraste, Histoplasma pierde el cinetoplasto. y la pared celular se tiñe con ácido periódico de Shifl (PAS) y con plata metenamina. De acuerdo con un estudio (Weigle, 1987), la sensibilidad de las secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina es del 14%. las impresiones del 19%. de los cultivos del 58%. y de todos los métodos combinados del 67%.
Toxoplasma
gondii
Toxoplasma gondii es un parásito protozoo del filo Apícomplexa con una distribución mundial en el ser humano y en los animales tanto domésticos como salvajes, especialmente carnívoros. La infección en inmunocompetentes suele ser asintomática o leve, pero en los mmunocomprometidos puede traer serias complicaciones. La infección in útero puede producir una infección congénita grave con secuelas o causar la muerte letal (Remington, 1990).
Leishmaniasis visceral. La leishmaniasis visceral del Viejo Mundo se produce esporádicamente a lo largo de toda la geografía y es causada bien por L. úonovanio por L. infantum. L. donovanies predominante en África. Asia y la India y L. infantum predomina en las regiones mediterráneas y en el Oriente Medio, aunque existen superposiciones. La leishmaniasis visceral del Nuevo Mundo está producida por L. chagasiyse produce esporádicamente en América central y Sudamérica. Algunas especies que producen enfermedad cutánea también pueden ser responsables, en ocasiones, de enfermedad visceral, como se demostró recientemente en algunos grupos que participaron en la operación Tormenta del Desierto (Magill. 1993). En algunas áreas los humanos pueden servir de reservorios. aunque suelen ser diversos animales, incluidos perros y gatos, los que toman este papel.
El estadio sexual del ciclo vital de este parásito coccidio se completa en el epitelio intestinal de los gatos y otros felinos, que le sirven exclusivamente como huéspedes definitivos. Durante este ciclo, pueden formar esquizogonias asexuales y gametocitos sexuales, dirigidos al desarrollo de los ooquistes inmaduros que pasan a las heces. Los ooquistes maduran a una fase infectiva (que contiene dos esporoquistes y cuatro esporozoítos cada uno) en el plazo de 2 a 21 días. La ingestión de estos ooquistes puede conducir a la infección de una gran variedad de vertebrados susceptibles en los que los trofozoitos en crecimiento (taquizoitos) pueden infectar activamente cualquier célula nucleada. La proliferación de los taquizoitos produce la muerte celular. Una vez que se desarrolla la inmunidad, los organismos forman quistes tisulares que pueden contener cientos o miles de bradizoítos de crecimiento lento. La presencia de quistes tisulares es característica de las infecciones crónicas. Todos los estadios del ciclo vital se producen en los felinos, pero sólo los estadios de trofozoitos y quistes se producen en humanos y otros huéspedes intermediarios.
La infección suele ser benigna y a veces subclínica, aunque algunos individuos, especialmente chicos |óvenes e individuos mal nutridos, tienen marcada afectación visceral, especialmente hígado, bazo, médula ósea y ganglios linfáticos. En algunos casos la muerte se produce tras meses o años, a menos que se les trate adecuadamente. La infección se llama Kala-azar en la India, por el oscurecimiento que toma la piel La leishmaniasis visceral es también una infección oportunista en individuos inmunosuprimidos (VIH), como mala respuesta a tratamiento (Medrano, 1992).
Los humanos adquieren la infección por Toxoplasma gondii por la ingesta de carne mal cocinada, especialmente cordero o cerdo, que contiene quistes tisulares, o por la ingesta de ooquistes inactivos de material contaminado por heces de gato. Los brotes pueden producirse por la inhalación de polvo contaminado en el interior de establos (Teutch, 1979) y por beber agua contaminada o leche sin pasteurizar (Benenson. 1982: Sacks. 1982). También puede producirse por la transmisión por transfusión o por trasplantes
Diagnóstico de leishmaniasis. El diagnóstico se realiza habitualmente por la visualización de los amastigotes en las extensiones o en las biopsias, o por el crecimiento de los promastigotes en cultivos. En la leishmaniasis tegumentaria, el borde de la lesión (que es más activo) debe ser biopsiado y se debe emplear en fresco para hacer muestras. También se debe preparar una extension haciendo una incisión de 2 mm a 3 mm en el borde de la ulcera y cogiendo pequeña cantidad de tejido de la superficie tras cortar la superficie con la hoja del bisturí. Tanto la extensión como la muestra de la biopsia se deben tratar con Giemsa. Las muestras que se deben tomar cuando se sospecha leishmaniasis visceral incluyen preparaciones teñidas, aspirados de adenopatías o de médula ósea y biopsias de bazo o hígado.
La mayoría de las infecciones agudas son asintomáticas o similares a otras enfermedades en las que destacan la fiebre y las adenopatías. La infección congénita puede producirse cuando la madre tiene infección aguda durante la gestación. El riesgo de inlección en neonatos no se relaciona con la presencia o ausencia de síntomas en la madre, sino que la gravedad de la infección depende del estadio de la gestación. Si se contrae en la primera mitad del embarazo, puede aparecer muerte intrauterina, microcefalia o hidrocefalia con calcificaciones intracraneales. Si se da la infección en la segunda mitad del embarazo, suelen ser asintomáticos al nacimiento, aunque puede aparecer fiebre, hepatoesplenomegaha e ictericia. La coriorretmitis, el retraso psicomotor y las convulsiones pueden aparecer meses o años después.
El cultivo es deseable, ya que es más sensible y permite determinar las especies y subespecies. práctica que puede ayudar al tratamiento clínico del paciente. Las biopsias y aspirados recogidos asépticamente se cultivan en el medio de Novy-MacNeal-Nicolle o en el medio de Drosophila de Schneider suplementado con suero fetal de carnero (Visvesvara, 1992c). Los cultivos suelen empezar a mostrar promastigotes de 2 a 5 días, pero se debe esperar al menos cuatro semanas.
En inmunosuprimidos, especialmente aquellos con sida, las infecciones por Toxoplasma gondiiduelen presentarse con afectación de líquido cefalorraquídeo (Luft. 1988). Otras posibles manifestaciones clínicas y patológicas son neumonitis. miocarditis, retinitis, pancreatitis y orquitis (Luft, 1989; Schnapp, 1992). La toxoplasmosis puede ser difícil de diagnosticar clínicamente y a veces se descubre en las autopsias (Gutiérrez, 2000). Estas infecciones suelen ser resultado de la reactivación de infecciones latentes, adquiridas meses o años antes, pero ocasionalmente pueden ser infección primaria.
Los amastigotes hallados en las biopsias, extensiones y secciones tisúlares se reconocen por su tamaño (de 2 pm a 4 pm), por su citoplasma, por el núcleo y un cmetoplasto (Lámina 55-5C). En las secciones tisulares pueden parecer mas pequeños debido a su reducción de tamaño durante la fijación. Los amastigotes deben diferenciarse de otros organismos mtracelula-
El diagnóstico de toxoplasmosis se puede establecer por el examen de tejidos, sangre o fluidos corporales. El hallazgo de taquizoitos o quistes tisulares es definitivo, pero puede existir dificultad para demostrarlo en las tin-
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
clones con hematoxilina-eosina; las tinciones fluorescente o con inmunoperoxidasa suelen ser útiles. El Giemsa es bueno para la tinción de extensiones de fluidos corporales y tejidos. Los organismos se pueden demostrar inoculando material adecuado en cultivo de tejido o en un ratón. La recuperación en cultivos virales también se ha descrito, pero requiere una incubación prolongada (Shepp, 1985). El aislamiento de los organismos a partir de la sangre o fluidos corporales es evidencia de infección aguda, mientras que su obtención en tejidos puede significar infección crónica. En las extensiones, los taquizoítos son ovalados o en forma de media luna, midiendo aproximadamente 3x7 um; los quistes miden más de 30 urn de diámetro y suelen ser esféricos, excepto en las fibras musculares, donde están alargados (Láminas 55-50. E y F). El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es de alta sensibilidad y especificidad para su detección en la encefalitis por Toxoplasma, enfermedad diseminada e infección intrauterina (Cazenave. 1991; Grover, 1990. Parmley. 1992; Weiss. 1995). Estos procedimientos no están completamente disponibles, sin embargo requieren un control de calidad cuidadoso para evitar resultados falsos positivos. La serologia permanece en primera linea para el diagnóstico por Toxoplasma (Wilson. 1995). El test de Sabin-Feldman y el test de IFA son los estándares con los que se comparan los otros métodos, aunque el primero es llevado a cabo sólo en algunos centros. Muchos de los test EIA están disponibles a la venta y generalmente dan un resultado similar al del IFA Los anticuerpos aparecen en una o dos semanas y los titulos pico entre la sexta y octava semanas. Los test para los anticuerpos IgM específicos son especialmente útiles para diagnóstico de infección aguda e infección congenita, pero el conocimiento de las limitaciones (especialmente de los falsos positivos) es de gran importancia. La persistencia de anticuerpos IgM en ocasiones durante un año o más, es también problemático y se debe interpretar en conjunto con los resultados de la IgG. Debido a que muchas personas han tenido infecciones asintomáticas, los titulos bajos de IgG tienen poco significado. Los títulos en pacientes con infección crónica ocular también pueden ser bajos. Los inmunosuprimidos, como los pacientes con sida que tienen infecciones activas por Toxoplasma, casi siempre tienen anticuerpos IgG existentes, aunque los títulos pueden ser bajos y la actividad de IgM rara vez es detectada. La interpretación de los titulos de IgG e IgM varía según el método usado y quien lo haya llevado a cabo. El laboratorio que lo hace debe dar los criterios necesarios para su interpretación.
Amebas oportunistas de vida libre Las amebas de géneros Naegleria. Acanthamoeba y Balamuthia habitan en la tierra, el agua y otros substratos ambientales, donde se alimenta de otros organismos microscópicos, especialmenle bacterias y levaduras. Los tres géneros se han asociado con infecciones oportunistas del sistema nervioso central, y la infección por Acanthamoeba causa queratitis (Kilvmgton. 1994: Marciano-Cabral. 1988; Martínez. 1985: Ubelaker. 1991; Visvesvara. 1999). La memngoencefalitis causada por el ameboflagelado Naegleria lowleri suele afectar típicamente a niños y jóvenes adultos que han estado nadando o buceando en lagos o piscinas de aguas dulces calientes. Los ameboflagelados entran en el cerebro a través de la lámina cribiforme y del bulbo olfatorio, alcanzando los lóbulos frontales, donde produce una meningoencefalitis aguda hemorrágica que suele ser latal en el plazo de una semana Iras el comienzo de los síntomas. Tiene un malísimo pronóstico a pesar del tratamiento vigoroso. El diagnóstico suele establecerse por autopsias al encontrar trofozoítos (los quistes no se suelen ver) en los cortes histológicos (Lámina 55-6/1). El diagnóstico en vida se hace ocasionalmente al ver trofozoítos típicos en el líquido cefalorraquídeo, bien sea en examen directo o en preparaciones teñidas o en cultivo. Los trofozoítos miden de 10 pm a 35 pm, y tienen cariosomas largos, redondeados y centrales: si se ponen en agua destilada templada, se convierten en formas flageladas en una o dos horas. Los quistes son esféricos y miden de 7pm a 15 pm de diámetro. El cultivo se suele hacer en placas de agar no nutriente (1,5% agar, 0,5% cloruro sódico. pH 6.6-7,0) sem-
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brado con un tapiz de E. col! viva o muerta con calor (Visvesvara. 1999). Las amebas digieren las bacterias, dejando huellas en el tapiz de bacterias, que pueden ser vistas con bajo aumento utilizando poca luz (Lámina 55-60). La meningoencefalitis amebiana granulomatosa (GAE) puede ser causada por varias especies de Acanthamoeba. incluidas A. castellao!. A. culbertsoni. A. polyphaga y A. astrnyxis entre otras Suele ser una infección oportunista subaguda o crónica de pacientes con enfermedades crónicas debilitantes e inmunosuprimidos. causando la muerte en semanas o meses tras el inicio de los síntomas. Se cree que la infección se extiende por vía hematógena a partir de un foco primario de la piel, la faringe o de tracto respiratorio. Pueden producirse infecciones sistémicas en personas con sida y presentarse como lesiones cutáneas o ulcerativas, abscesos subcutáneos o nodulos eritematosos (Lámina 55-6C) (Tan, 1993). No es necesaria la exposición al agua, ya que los quistes de Acanthamoeba son llevados fácilmente por el aire y pueden hallarse en la nariz y la garganta (Lawande, 1979; Wang. 1967). La reacción tisular consiste en granulomas con trofozoítos en los tejidos viables y quistes en las áreas de necrosis. El diagnóstico se suele hacer en autopsias, pero se pueden ver organismos en las biopsias cerebrales mediante técnicas de cultivo descritas para Naegleria. Los trofozoítos de Acanthamoeba son algo más grandes que los de Naegleria, midiendo entre 15 pm y 45 pm, y poseen unas proyecciones filamentosas similares a agujas, conocidas como acanlopodios. Los quistes miden de 10 pm a 25 pm y tienen doble pared: una externa rugosa (ectoquistes) y otra interna poligonal estrellada o redondeada (endoquistes) (Lámina 55-60). La identificación de las especies es problemática y refleja la incertidumbre a la hora de reconocer las dieciocho o mas especies descritas. El uso de técnicas de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa puede resultar útil para diferenciar especies y están disponibles por el CDC (Visvesvara, 1999). La GAE puede ser causada por amebas leptomyxldes, especialmente Balamuthia mandrillaris (Visvesvara. 1993). Morfológicamente. Balamuthia no se puede diferenciar de Acanthamoeba por la histología habitual, aunque se pueden detectar diferencias a nivel ultraeslructural. Estos organismos son antigénicamente diferentes y se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en ensayos con inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (Visvesvara, 1999). Balamuthia no crece en las placas de agar usadas para Naegleria y Acanthamoeba, pero se puede hallar en cultivos de tejido usando lineas celulares de mamíferos. La queratitis por Acanthamoeba es una dolorosa infección de la córnea cada vez más frecuente y que es más habitual que se produzca en personas que usan lentes de contacto blandas o que sufren un traumatismo en la córnea (Anuran. 1987: Kilvington, 1994). La desinfección incompleta o infrecuente y el uso de suero salino casero son factores de riesgo conocidos para sufrir la infección (Stehr-Green, 1990). La enfermedad se caracteriza por el desarrollo de un infiltrado en anillo en el estroma corneal que progresa a ulceración y riesgo de perforación con pérdida del ojo. La infección se puede confundir con una queratitis fúngica. bacteriana o herpética que característicamente es refractaria a los antimicrobianos más habituales. Se ha empleado la queratoplastia en el tratamiento de esta enfermedad, aunque se han descrito avances recientes en la terapia médica (Varga, 1993). El diagnóstico se establece por la demostración de trofozoítos amebianos o quistes en los raspados o biopsias corneales (Lámina 55-6E). Se pueden usar un gran número de tinciones, incluidos el Giemsa, el PAS y el tricromo. El uso de fluorocromo-calcoflúor blanco es especialmente útil en la detección de quistes de amebas (Lamina 55-6F) (Marines. 1987). Los cultivos (descritos previamente) aumentan la sensibilidad.
PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES Los grupos de protozoos que habitan el tracto intestinal en humanos incluyen las amebas, flagelados, ciliados, coccidios y microsporidios, sin ser todos ellos patógenos. En una revisión de muestras fecales enviadas a los laboratorios del departamento estatal de salud, Giardia lamblia estaba presente en
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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un 7,2%, £ histolytica en un 0,9%, Dientamoeba tragilis en un 0.5% y Cryptosporidium spp. en un 0.2% de las muestras. Los protozoos no patógenos se encuentran en aproximadamente el 10,7% de las muestras (Kappus, 1994). La mayoría de las infecciones intestinales son adquiridas por vía fecal-oral, tanto directamente, desde manipuladores de alimentos, como indirectamente, a través del agua contaminada. Para la mayoría de los laboratorios, la identificación de los protozoos intestinales es uno de los aspectos más difíciles de la parasitología. Los protozoos son pequeños y las especies patógenas se deben diferenciar de las no patógenas y de las células inflamatorias, de las células de endoteliales, de las levaduras, de los pólenes y de otros objetos. Hay un número de características que ayudan para la identificación de los protozoos intestinales. El tamaño es útil (Fig. 55-3) y un adecuado micrómelro ocular debe estar disponible. La diferenciación de amebas de los flagelados en muestras húmedas o material fresco es relativamente fácil por los seudópodos típicos de las amebas, mientras que los flagelados se mueven más rápidamente, de un modo que se asemeia a una hoja cayendo. El número y el tamaño de los núcleos y el patrón de la cromatina. visto en preparaciones con tinción permanente, son también útiles. Las características del citoplasma incluyen fibrillas y otras estructuras típicas de los flagelados, material ingerido en los trofozoitos amebianos y la masa de glucógeno y cuerpos de cromatina en quistes de amebas. Los flagelados suelen estar agrandados y con forma de huso, con uno o varios núcleos en un extremo. Cuando se examina por cualquier método, las características nucleares y citoplasmáticas se deben determinar a partir de un número de organismos para completar la identificación. Cuando se informa de la presencia de dos o más especies en una muestra, el observador debe ser capaz de definir las diferentes poblaciones para evitar confundir algún organismo con apariencia atípica. Los trofozoitos predominan en las heces líquidas, pero degeneran en menos de una hora a menos que se pongan conservantes. Los quistes predominan en las heces formadas y son más resistentes a la degeneración. Ambas formas se pueden ver en el examen directo a partir de heces frescas. La formalina no conserva bien los trofozoitos, y se pueden perder a menos que se preparen extensiones con tinciones permanentes. Para la
40
(.0
M
Figura 55-3. Rangos de los tamaños de los protozoos intestinales. (Los trofozoitos de B. cotí pueden medir hasta 200 pm.)
identificación definitiva se debe hacer un examen de muestras con tinción permanente.
Amebas
y
Blastocystis hominis
Los tres géneros de amebas que pueden habitar el tracto intestinal humano son: Entamoeba. Endolimax y lodamoeba. Los quistes se digieren y se exquistan en el intestino delgado. El resultado es la proliferación de trofozoitos por fisión binana en la luz del colon. Tanto los quistes como los trofozoitos pueden salir con las heces, pero sólo los quistes maduros son infectivos. Entamoeba histolytica es la única especie de ameba capaz de invadir tejidos y producir enfermedad. El género Entamoeba, caracterizado por la presencia de cromatina de la membrana nuclear, incluye E. histolytica, el agente de la amebiasis; E. dispar, una especie no patógena idéntica a E. histolytica; E. hartmanni y £ coli. que se encuentran habitualmente como especies comensales: y £ polecki que se encuentra a veces en personas que tienen contacto con cerdos (Fig. 55-4) (Gay, 1985: Levin, 1970). £ gingivaiis. que no tiene un estadio quistico conocido, puede habitar en la boca de individuos con pobre higiene bucal (Dao, 1983). £ polecki y £ gmgivalis se ven rara vez y no se describen más adelante. Endohmax nana e /. bütschlii son especies no patógenas. Dientamoeba fragilis se reconoce actualmente como flagelada, aunque pierde su flagelo externo y se explica en el texto dentro de los flagelados, pero puede ser encontrada con las amebas en las tablas y figuras debido a sus similitudes morfológicas. Entamoeba histolytica. Esta ameba puede producir diversas enfermedades, siendo las más comunes la disentería amebiana, la colitis amebiana y a abscesos hepáticos (Beaver, 1984; Ravdin, 1988: Strickland, 1999). Los mecanismos de defensa del huésped, el contacto previo con el parásito, la alimentación y la cepa de Entamoeba histolytica son los responsables de la gravedad de la infección. Los análisis de los patrones de isoenzimas han mostrado que sólo ciertas cepas son invasivas y que la mayoría de las infecciones no se detectan (Bruckner. 1992; Murray 1999). Las diferencias genéticas y bioquímicas entre las cepas invasivas y no invasivas se han identifica-
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MEDICA
do, y se ha propuesto que se denomine a la cepa no patógena Entamoeba dispar (Diamond, 1993). La disenteria amebiana, que es rara en EE.UU.. es una enfermedad aguda que se caracteriza por diarrea sanguinolenta con calambres abdominales. Se produce una invasión de la mucosa intestinal, causando ulceración que puede conducir a perforación y peritonitis. La forma más común de la enfermedad vista en este país es la colitis amebiana, que puede simular una colitis ulcerosa y otra forma de enfermedad inflamatoria intestinal. Los síntomas suelen ser menos graves que en la disentería amebiana, pero pueden incluir diarrea no sanguinolenta, estreñimiento, dolor abdominal y pérdida de peso. Se pueden formar pequeñas ulceraciones de la mucosa y extenderse dentro de la submucosa formando úlceras. Se puede afectar todo el colon o una parte, más frecuentemente el ciego, el recto-sigma o el colon ascendente. Los abscesos hepáticos por amebas son la forma extraintestinal más frecuente de amebiasis, dándose aproximadamente en el 5% de los pacientes que presentan amebiasis intestinal. Se caracteriza por fiebre y dolor en el hipocondrio derecho. Estos abscesos hepáticos se suelen diagnosticar por escáner, ecografía y test serológicos. Las amebas están presentes en las heces en menos de la mitad de los pacientes en el momento de la detección del absceso hepático. La hepatitis amebiana. caracterizada por un aumento doloroso del hígado en personas con amebiasis intestinal, también puede producirse. Su patogénesis es aún poco conocida. Rara vez pueden aparecer abscesos amebianos en otros órganos como pulmón, cerebro o piel, bien por diseminación hematógena desde el intestino o bien por continuidad desde abscesos hepáticos. Se pueden formar masas de tejido granulomatoso (amebomas) como respuesta a la presencia de amebas, pudiendo causar en el intestino una lesión en servilletero que podría simular un carcinoma. Epidemiología. La mayoría de las infecciones por E. histolytica se adquieren por ingesta de agua o alimentos contaminados, aunque un brote se produjo por una irrigación colónica contaminada (Istre, 1982). Se pueden ver seudoepidemias a causa de la confusión en el laboratorio de las
* inrrt-cuentc. prohuhli'im'ntt- di-
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células inflamatorias, otras amebas o restos fecales como si fuesen E. histolytica (CDC. 1985; Krogstad, 1978). Aunque £ histolytica es un parásito endémico de Estados Unidos, muchas personas lo adquieren durante viales o viviendo en países extranjeros. Diagnóstico. El examen de una serie de muestras fecales puede ser suficiente para el diagnóstico de amebiasis intestinal en la mayoría de los casos. Si se han administrado antibióticos o medios de contraste, la infección puede ser enmascarada durante una temporada. El material aspirado de un absceso hepático puede mostrar trofozoítos al microscopio. La última porción del aspirado es la que más trofozoítos suele contener y puede usarse para el examen microscópico directo o para tinción permanenle. Si hubiese tejido disponible, la sección puede mostrar organismos que se tiñen mucho con PAS (Lámina 55-7C) Los cultivos (Diamond, 1988; Visvesvara. 1992a) no tienen un empleo muy extendido para diagnóstico, pero son útiles para la investigación y esenciales para determinar la patogenicidad basándose en las ¡soenzimas Los test de detección de antigenos por EIA son específicos, sensibles y capaces de diferenciar a Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar y están disponibles en el mercado (Wilson, 1995; Murray, 1999; Rosenblatt, 1995). En uso de las técnicas de PCR y de ADN también es útil para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar (Bendall, 1993; Samuelson, 1989; Weiss, 1995), pero no están comercializadas. Los test serológicos (Tabla 55-5) son los más útiles para el diagnóstico de infección extraintestinal, ya que aproximadamente el 95% de los pacientes con abscesos hepáticos son seropositives. Esto disminuye al 70% para la infección intestinal y al 10% para los portadores asintomátícos. Los titulos detectables pueden durar meses o años tras el tratamiento correcto (Wilson, 1995). Los trofozoítos de Entamoeba histolytica miden de 10 pm a 60 pm de diámetro; la forma comensal suele medir de 15 pm a 20 pm y las formas invasivas unas 20 pm (Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5; Lámina 55-7), En el examen directo, los trofozoítos muestran una movilidad progresiva gracias a la rápida formación de un pseudópodo hialino que tiene una clara dife-
u n g e n aniíiKil.
Figura 55-4. Amebas halladas en las muestras fecales humanas. {Dientamoeba Iragilis es un flagelado.)
to
Tabla 55-7 Morfología de los trofozoítos de las amebas intestinales
Especies
Tamaño (diámetro o longitud)
Núcleo
Citoplasma
Motilidad Número
:
Cromatina periférica
Cromatina cariosómica
Apariencia
Inclusiones
Entamoeba histolytica/ E. dispar
10-60 um; talla habitual, Progresiva, con 15-20 (im en la forma pseudópodos hialinos comensal', en torno a como dedos 20 pm para las formas invasivas'
1 No visible sin teñir
Granulos finos Habitualmente distribución y tamaño regular
Entamoeba hartmanni Entamoeba coli
5-12 pm; habitualmente Habitualmente no progresiva. de 8-10 (im pero a veces puede ser progresiva 15-50 um; Como una babosa, no progresiva, lo habitual 20-25 um pseudópodos abruptos
Similar a la Entamoeba Pequeño, discreto. histolytica Irecuentemente excéntrico Granulos bastos de tamaño Grande, discreto, y distribución irregular habitualmente excéntrico
Finamente granular
Endoiimax nana
6-12 pm; lo habitual 8-10 (tm
Ninguno
Grande irregular
Granular, vacuolado
lodamoeba bütschiii
8-20 pm; habitualmente 12-15 pm
1 No visible sin teñir 1 Frecuentemente visibles en preparación sin teñir 1 A veces visible en preparaciones sin teñir 1 No suele ser visibie sin teñir
Ninguno
Grande, habitualmente central. Bastamente granular, Rodeado por granulos refráctiles vacuolado y acromáticos. Estos granulos no suelen verse en las preparaciones teñidas
Bacterias, levaduras u otro material
Ninguno
Grandes acúmulos de 4-8 granulos Finamente granular, vacuolado
Bacterias
Dientamoeba fragilis*
5-15 pm. habitualmente 9-12 pm
Como una babosa habitualmente no progresivo, pseudópodos abruptos Como una babosa, habitualmente no progresiva
Los pseudópodos son angulares, aserrados o lobulados y alineados, casi transparentes
2 (En el 20% sólo hay un núcleo.) Son invisibles en preparaciones sin teñir
Pequeño, discreto Habitualmente central pero a veces excéntrico
'Habitualmente hallado en casos as¡niomáticos o crónicos, puede contener bacterias. 'Usuaimente hallado en casos agudos; con frecuencia contienen glóbulos rojos. 'Visible en material sin (¡jar Los núcleos se pueden ver a veces en material lijado '•Flagelado (véase texto) Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages Of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. Publicación n.- 1.966. 1969
Finamente granular
A veces eritrocitos en las formas invasivas— Las no invasivas contienen bacterias Bacterias
Basto, frecuentemente Bacterias, vacuolado levaduras y otros materiales Bacterias
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MEDICA
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I nuiiiwbjvu.il
bniumijcbu Insilili Ltv'j
Figura 55-5. Núcleos de amebas. Este dibujo muestra algunas de las distintas apariencias de los núcleos de las amebas en las preparaciones teñidas. (Dientamoeba Iragilises un flagelado: véase texto.)
renciación entre el endoplasma y el ectoplasma: el núcleo no es visible. En la enfermedad invasiva algunos trofozoítos contienen eritrocitos sin digerir (Lámina 55-7C), una característica de la infección por E. histolytica. En las preparaciones teñidas, la cromatina nuclear periférica suele distribuirse a lo largo de la membrana nuclear como finos granulos. El cariosoma es pequeño y a veces centralmente emplazado, con finas fibrillas que no suelen ser visibles y que lo sujetan a la membrana nuclear. Pueden existir variaciones en la estructura nuclear, pudiendo estar algunos cariosomas localizados excéntricamente y la cromatina periférica distribuida irregularmente. La única característica que es patognomónica de E. histolytica es la fagocitosis de eritrocitos, que rarísima vez se produce en otras especies, El citoplasma es finamente granular y en los organismos invasivos no hay inclusiones, o bien únicamente inclusiones de eritrocitos. En los organismos no invasivos pueden verse bacterias ingeridas. En los organismos en degeneración, el citoplasma puede ser vacuolado y el núcleo puede tener cromatina anormalmente agrupada. Los quistes de E. histolytica son esféricos y miden de 10 pm a 20 pm (habitualmente de 12 pm a 15 Jim) de diámetro (Tabla 55-8; véanse Figs. 55-3 a 55-5: Lámina 55-7). La fase de prequiste tiene un núcleo único y carece de pared refráctil. Cuando madura, desarrolla otros núcleos, siendo cada uno aproximadamente 1/6 del diámetro del quiste. Los núcleos son similares a los de los trofozoítos, pero su tamaño menor les hace menos Utiles como característica dílerenciadora. El citoplasma puede contener vacuolas de glucógeno y cuerpos cromaloides de extremos romos o agudos. El numero y el tamaño de los núcleos, así como el aspecto de los cuerpos cromatoides, son criterios importantes para la identificación de los quistes. En los laboratorios que no usan alguno de los métodos inmunológicos o moleculares para diferenciar E. histolytica de E. dispar y que cuentan únicamente con análisis morfológicos, se deben usar formatos de informes que tengan en consideración las tecnologías de diferenciación. Asi, un informe de E. histolytica/E. dispar sería lo más apropiado en última instancia. Amebas no patógenas. El microbiólogo debe estar capacitado para diferenciar las amebas no patógenas o comensales de la £ histolytica/ E. dispar y de D. Iragilis (un flagelado), que son potencialmente patógenos. Las características de identificación, que se ven mejor en cortes teñidos permanentemente, se resumen en las Tablas 55-7 y 55-8 y en las Figuras 55-3 a 55-5. La identificación de trofozoítos se basa en el tamaño y las características del núcleo y del citoplasma: la identificación de quistes se basa en el tamaño, numero y características del núcleo y en la presencia de los cuerpos de cromatina. así como en sus características, sin olvidar las masas de glucógeno. £ hartmanni tiene características morfológicas similares a las de £ histolytica, excepto en que los trofozoítos tienen un diámetro máximo de 12 pm,
y los quistes de 10 pm. teniendo los quistes a veces un núcleo único. Históricamente. E. hartmanni tue llamada la raza pequeña de £ histolytica. Su diferenciación requiere cuidadosas mediciones con un micrómetro ocular bien calibrado. Entamoeba coli. una habitante habitual del lumen, puede ser difícil de diferenciar de E. histolytica. El citoplasma se tiñe algo más oscuro que el de E. histolytica y es más vacuolado. conteniendo numerosas bacterias ingeridas, levaduras y otros materiales. Aunque las características nucleares difieren de las de Entamoeba histolytica (Fig. 55-5). puede existir una superposición significativa, especialmente en muestras que no se han conservado debidamente. Los quistes maduros de £ coli contienen ocho núcleos, aunque pueden llegar a tener 16 o más. Los quistes inmaduros, que son poco comunes, tienen cuatro núcleos (un cuarto del diámetro del quiste) mayores que los de E. histolytica (un sexto de diámetro del quiste) y pueden contener glucógeno. La distribución de la cromatina periférica y los cariosomas no tiene gran importancia en la identificación de los quistes de Entamoeba. Los cuerpos cromatoides, cuando se presentan, son irregulares, con extremo desflecado, mientras que los extremos romos se ven en £ histolytica. Entamoeba nana es la ameba más pequeña que inlecta a los humanos. Los trofozoítos con frecuencia tienen un núcleo atípico que contiene una masa de cromatina triangular, una banda de cromatina que atraviesa el núcleo o dos masas discretas de cromatina en los lados opuestos de la membrana nuclear (Fig. 55-5). Un halo claro o espacio cariolinfoide rodea el cariosoma y se extiende a la membrana nuclear. La forma nuclear atipica puede ser útil en la diferenciación de £ nana de /. bütschlii que es de una apariencia similar pero más larga. Los quistes de Endolimax suelen contener cuatro núcleos, aunque se pueden ver con menos núcleos. El glucógeno, cuando está presente, se dispone difusamente por el citoplasma en vez de en masas. Los quistes se diferencian fácilmente de las otras amebas, pero se pueden confundir con Blastocystis hominis. El núcleo del Blastocystis hominis pierde el halo que se veía en los quistes de £ nana. El núcleo de los trofozoítos de /. bütschlii y sus quistes tienen un cariosoma grande y central frecuentemente rodeado por granulos acromáticos que pueden no ser diferentes, pero aparecen sólo como un halo o espacio cariolinfoide. En algunos núcleos, el halo es claro sin granulos acromáticos, haciendo al organismo indistinguible de £ nana. Los quistes de /. bülschliicontienen un núcleo único en el que el cariosoma suele ser excéntrico, con unos granulos acromáticos en media luna (véanse Figs. 55-3 a 55-5). Los quistes se caracterizan por una vacuola prominente de glucógeno que se tiñe de marrón rojizo en las muestras frescas teñidas con yodo, de ahí el nombre del organismo. El glucógeno se disuelve con los fijadores acuosos y puede no ser visible en el material almacenado.
Tabla 55-8 Morfología de los quistes de a m e b a s intestinales Especies
Núcleo
Tamaño
Contorno
Entamoeba histolytica/ E. dispar
10-20 urn; habitualmente 12-15 pm
Entamoeba hartmanni
5-10 urn riabitualmente 6-8 pm
Entamoeba colt
10-35 urn; Habitualmente esférico. 8 en los quistes maduros habitualmente 15-25 urn Ocasionalmente ovaiado. Ocasionalmente quistes muy triangular u otro contorno nucleados con 16 o más Los quistes inmaduros tienen 2 o más
Endolimax nana
5-10 pm; habitualmente 6-8 urn
lodamoeba biitschlii
5-20 pm; Ovalado, elíptico, triangular 1 en los quistes maduros habitualmente 10-12 urn u otro contorno
Citoplasma
Número
Cromatina periférica
Cromaiina cariosómica
Cuerpos cromatoldes
Habitualmente esférico
4 en los quistes maduros. 1 ó 2 en los quistes inmaduros
Cromatina periférica. Granulos uniformes. finos y homogéneos
Pequeña, discreta y habitualmente central
Presente. Barras alargadas con extremos desflecados
Habitualmente esférico
4 en ios quistes maduros Similar a Entamoeba 1 ó 2 en los quistes inmaduros histolytica
Similar a Entamoeba histolytica
Presente. Barras alargadas con extremos desflecados
Esférico, ovalado o elíptico
4 en los quistes maduros. A veces se ven quistes inmaduros con menos de 4 núcleos
Glucógeno Habitualmente difuso. Frecuentes masas concentradas en los quistes jóvenes Se tiñen de marrón rojizo con el yodo Similar a Enthamoeba histolylica
Cromatina periférica. Grande, discreto. Presente. Habitualmente Habitualmente difuso, Bastos granulos habitualmente excéntrico. con extremos castigados pero a veces masas irregulares en tamaño y pero a veces central bien definidas en los distribución, pero quistes inmaduros. frecuentemente son más Se liñe de marrón uniformes que los que se rojizo con el yodo encuentran en los trofozoitos Ninguno Grande, habitualmente Ocasionalmente, granulos Habitualmente dituso. central pequeños o masas ovaladas Frecuentes masas pero no están presentes en concentradas en los los cuerpos vistos en quistes |óvenes. Entamoeba Se tiñe de marrón rojizo con el yodo Ninguno Grande, habitualmente Granulos a veces presentes. Masas compactas excéntrico. Granulos pero los cuerpos vistos en bien definidas. 'elráctiles. acromáticos Enlamoeba no están Se tiñen de marrón en uno de los lados del presentes oscuro con el yodo cariosoma
Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. PuDlicacion n " 1 966 1969.
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
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Figura 55-6. A. Ciliados, coccidios y Blaslocyslis spp. hallados en muestras tecales humanas. B, Flagelados hallados en muestras tecales humanas. (Adaptada de Brooke MM. Melvin DM: Morphology ol Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man (Publicación n. [CDC] 848116.) Washington, DL, Departamento de Salud y Recursos Humanos de los Estados Unidos, 1984. ?
Blastocystis hominis. Blastocystis hominis es un protozoo similar a la ameba que habita en el intestino y se encuentra frecuentemente en muestras fecales de individuos asintomáticos. Algunos estudios han relacionado la enfermedad intestinal sintomática con infección grave, aunque esto es controvertido (Markell, 1986; Miller 1988: Sheehan, 1986; Stenzel, 1996: Zierdt, 1991). Los quistes pueden tomar una de las siguientes tres formas: vacuolada, que es la más común, ameboide o granular. La vacuolada también se conoce como forma vacuolada central, que suele ser esférica y de tamaño variable (de 5 pm a 20 pm), con un área central clara y de dos a cuatro núcleos periféricos (Fig, 55-6A; Lámina 55-8G). Las formas ameboides de contornos atípicos pueden predominan en infecciones graves. La presencia de Blastocystis se debe informar, especialmente cuando son numerosos (cinco o más por campo de 400x) (Sheehan. 1986; Stenzel. 1996).
Flagelados Dientamoeba fragilis. Dientamoeba tragilis es un patógeno ameboide que infecta el colon y se asocia a diarrea, especialmente en niños jóvenes
(Preiss. 1991: Spencer, 1979; Tumer, 1985: Yang, 1977). Aunque es parecido a las amebas. Dientamoeba se ha reclasificado como un flagelado basándose en los detalles ultraestructurales y la similitud antigénica. No se le conoce un estadio de quiste. Debido a la similitud de Dientamoeba a las amebas en el microscopio de luz óptica, estas especies se han incluido tradicionalmente en las tablas y figuras de las amebas (véanse Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5: Lámina 55-7H). Los síntomas incluyen diarrea y distensión abdominal Recientes investigaciones sugieren que la dientamebiasis es una causa de diarrea más frecuente de lo que se pensaba; el 4,3% de los pacientes en un estudio podaban este organismo (Spencer, 1979: Murray, 1999). Aproximadamente el 25% de las personas infectadas presentaban síntomas. En contraste con la amebiasis, esta infección no suele asociarse con otros protozoos fecales, pero muestra una asociación entre diez y veinte veces mayor de lo esperado con enterobiasis (infección por oxiuros, analizado más adelante). Esta asociación sugiere que la infección por D. tragilis puede estar difundida por la ingesta de huevos de lombrices infectadas con D. tragilis (Burrows. 1956). La infección por D. tragilis pasará desapercibida a menos que se examinen preparaciones con tinción permanente. Pueden necesi-
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
tarse muchas muestras, ya que la eliminación varia día a día. Cuando se preparan extensiones, la última parte de las muestras fecales debe ser la examinada, ya que es donde mayor número de parásitos se pueden encontrar. De 2/3 a 4/5 de los organismos contienen dos núcleos que constan de un grupo de cuatro a ocho granulos cariosómicos que pueden formar un cariosoma grande e irregular (Fig. 55-5), Se puede confundir con trofozoítos de Enlamoeba nana o de /. bütschlii. El citoplasma es finamente granular y suele contener bacterias ingeridas. Los trofozoítos son delicados y pueden pasarse por alto fácilmente, de modo que la preparación teñida se debe examinar cuidadosamente. Se ha descrito un método de inmunofluorescencia que puede ayudar a su detección pero que no está comercializado (Chan, 1993). Giardia lamblia. G. lamblia es un protozoo patógeno intestinal que produce endemias y epidemias por todo el mundo, y en EE.UU. es especialmente problemática para los viajeros, campistas y homosexuales (Wolfe, 1992), Frecuentemente produce enfermedad en personas que beben agua contaminada, y se ha descrito un gran número de epidemias a partir del agua en lugares como Aspen, Colorado. Leningrado. Rusia, Roma y Nueva York (Craun, 1986). Los protozoos patógenos no mueren por las concentraciones habituales de cloro de las aguas municipales, y así, salvo que se filtre, puede actuar de fuente de infección, como ya sucedió en las epidemias de Roma y Nueva York. Los trofozoítos de G. lamblia se multiplican en el intestino delgado y atacan la mucosa mediante una ventosa ventral cóncava. Puede ser asíntomática o producir patología que va desde diarrea leve con vagas molestias abdominales hasta un síndrome de malabsorción con diarrea y esteatorrea, parecido a esprúe. La patogenia no está totalmente comprendida, aunque puede darse una interrupción de la integridad del borde en cepillo de la mucosa, produciendo déficit de disacaridasas debido al efecto directo o indirecto del parásito (Wolfe, 1992). La giardiasis se debe considerar en todo paciente con diarrea de más de diez días de duración. El diagnóstico se hace demostrando los trofozoítos o quistes de Giardia en las muestras fecales. Los trofozoítos suelen estar en las heces díarreicas, mientras que los quistes están en las heces formadas. La eliminación de los organismos varía de día en día, por lo que puede ser necesario el examen de diferentes muestras en diferentes días. El examen directo suele ser especialmente útil para el hallazgo de los trofozoítos con su motilidad en "caída de hoja". Los quistes se pueden ver tanto en examen directo como en concentraciones, y tanto quistes como trofozoítos se pueden ver en tinciones permanentes. En algunos casos no se pueden hallar en muestras fecales y son necesarios pequeños aspirados intestinales o muestras del test de la cuerda. El laboratorio debe ser avisado de antemano para que el personal esté disponible para la realización de un examen directo nada más recibir la muestra. Muchos métodos de detección de antígenos por inmunofluorescencia o por EIA están comercializados (Wilson, 1995; Wolfe, 1992; García, 1997). Parecen tener buena sensibilidad y especificidad y pueden detectar algunas infecciones no detectadas por el examen de las heces. También pueden ser especialmente útiles en investigación epidemiológica, pero no reemplazan la necesidad de los tradicionales estudios morfológicos para detectar otros parásitos. Los trofozoítos de Giardia mirados desde el exterior tienen una torma de pera con extremo posterior en forma de huso y poseen dos núcleos que les da el aspecto de una cara sonriendo con ojos prominentes (Tabla 55-9: véanse Fig. 55-68 y Lámina 55-8C a E). Cuando se ven desde un lado, el extremo anterior es más grueso y ahusado posteriormente: la mitad anterior consta de una ventosa en la cara ventral. Los cuatro flagelos laterales, los dos ventrales y los dos caudales no suelen ser evidentes en las muestras frescas o en las preparaciones teñidas. Los quistes son ovales y suelen ser tener cuatro núcleos. Bajo el núcleo, los cuerpos medios oscuros con fibrillas se cruzan longitudinalmente, dando unas características internas distintivas. El citoplasma suele estar apartado de la pared de los quistes. Chilomatix mesnili. C. mesnili (Tabla 55-9; Fig. 55-68; Lámina 55-8F) es un flagelado habitual del lumen no patógeno, que se debe distinguir de los tro-
fozoítos de las amebas y de Giardia en las preparaciones. La localización del único núcleo en uno de los extremos y la forma de huso del otro extremo es útil. Si se examinan varios organismos, serian visibles el citoplasma y el surco espiral en algunos de ellos. Los tres flagelos externos no suelen ser visibles en preparaciones teñidas o fijadas con formalina. Los quistes con forma de limón contienen varias fibras citosomales curvas con un aspecto parecido a un imperdible. Pentatrichomonas hominis. P. hominis. conocida antiguamente como Trichomonas hominis (Tabla 55-9; Fig. 55-68) es un raro flagelado intestinal no patógeno que se puede confundir con Entamoeba hartmanni o los pequeños trofozoítos de Entamoeba histolytica. No se tíñen especialmente bien y frecuentemente se distorsionan en las preparaciones. Hay que examinar muchos de ellos en las preparaciones teñidas para lograr ver el núcleo único similar al de Entamoeba. la membrana ondulada y los flagelos. Un objeto prominente similar a una vara, el axostilo, atraviesa el organismo y protruye en el extremo posterior. No se han descrito estadios quisticos. Trichomonas vaginalis. Trichomonas vaginalis es una causa frecuente de vaginitis, caracterizada por inflamación, prurito, flujo vaginal y. a veces, disuria. Se suele transmitir por relación sexual, frecuentemente por varones que tienen una infección asíntomática. A veces los hombres pueden padecer una prostatitis o una uretritis. Trichomonas vaginalis se suele diagnosticar en el mismo despacho del médico mediante un examen directo del flujo vaginal o del prostético, o bien del sedimento de orina. Morfológicamente, Trichomonas vaginalis se asemeja al P. hominis. pero es más grande (cerca de 23 pm) y la membrana ondulante se extiende sólo hasta la mitad del cuerpo. Debido a la diferencia en el habitat, no suele ser necesario diferenciar estas Trichomonas morfológicamente. El examen directo puede ser insensible y el uso de cultivo o las técnicas de inmunoensayo se recomiendan cuando el diagnóstico no es fácil (García, 1997; Visvesvara, 1992b; Wilson, 1995). Los cultivos tienen una sensibilidad de aproximadamente el 90% (Beal, 1992; Krieger, 1988; Schmid. 1989), así como las técnicas inmunofluorescentes y el EIA que usan anticuerpos monoclonales (Kreiger, 1988; Lisi, 1988; Wilson, 1995). La tinción de Papanicolaou puede revelar T. vaginalis en ocasiones, pero tiene baja sensibilidad y especificidad. Otros flagelados. Enteromonas hominis y Retortamonas intestinalis son flagelados intestinales pequeños, no patógenos, que se ven rara vez y que cuando están presentes pueden darse en gran número. Las características morfológicas se revisan en la Tabla 55-9 (véase también la Fig. 55-68). Trichomonas tenax son unas tricomonas que veces se aislan en la cavidad oral, pero no causan enfermedad.
Ciliados Balantidium coli. B. coli (Fig. 55-6A; Lámina 55-8H) puede causar un síndrome similar a la disentería con úlceras en el colon similares a las de las amebas, pero no produce abscesos hepáticos u otras lesiones sistémicas. La inlección humana, rara en EE.UU., se puede adquirir de los cerdos, que son los habitualmente infectados. 8. coli es el protozoo más grande que infecta a los humanos. Los trofozoítos van desde 40 pm hasta cerca de 200 pm en su mayor tamaño (la mayoría son de 50 pm a 100 pm) y están cubiertos uniformemente con cilios que son ligeramente más largos en el extremo anterior, adyacente al citostoma. Hay un gran núcleo que se ve tácilmente en las preparaciones, y un micronúcleo más pequeño que rara vez es visible. En el citoplasma hay numerosas vacuolas alimenticias y vacuolas contráctiles. Los quistes son redondos, midiendo de 50 pm a 70 pm de longitud. En los quistes más jóvenes se pueden ver cilios y las características nucleares son similares a las de los trofozoítos. Las muestras fecales contaminadas con agua estancada pueden contener ciliados de vida libre que pueden diferenciarse de 8. coli por el patrón ciliar.
Tabla 55-9 Morfología de los flagelados intestinales Especies
Forma
Motilidad
Forma de pera
Rápida, en sacudidas
Tamaño
Trofozoítos Pentatrichomonas lodo hominis'
8-20 LUTI;
Forma de pera
Rotatoria, rígida
Forma de pera
Caída de hoia
Oval
En sacudidas
No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir 2 No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir
habitualmente 10-15 um Giarda lamblia
10-20 (im; habilualmente 12-15 u.m
Enteromonas hominis
4-10 um; Relorlamonas intestinalis
N° de flagelos' 3-5 anterior.
habilualmente 11-12 um 6-24 urn
Chilomastix mesnih
U.- de núcleos
Forma de pera u oval En sacudidas habilualmente 8-9 um
1 posterior 3 anterior, 1 en el citostoma 4 lateral 2 ventral. 3 caudal. 3 anterior. 1 posterior 1 anterior, 1 posterior
4-9 um, Especies Quistes Chilomastix mesnih Giardia lamblia
habitualmente 6-7 (jrn 6-10 jim; habilualmente 8-9 um Tamaño 8-13 ym;
?
Forma
N. de núcleos
Forma de limón con unos botones hialinos anteriores o "pezón' Oval o elíptico
1 No visible en preparaciones sin teñir Habitualmente 4 No diferenciabies en preparaciones sin teñir Habitualmente localizados en un extremo 1 -4 habitualmente 2 en el extremo opuesto del quiste, no visible en preparaciones sin teñir
habilualmente il-i2u.m Enteromonas Retortamonas
hominis intestinalis
4-10 um; habitualmente 6-8 ym 4-9 um. habitualmente 4-7 um
Alargado u oval Forma de pera o similar a un limón
'No es practico para la identificación de especies en el examen ordinario 'Pentatrichomonas hormnis no tiene forma guistica. Adaplada de Brooke MM Melvm MD Morpnology of Diagnostic Stages of Intestir
Otras características Membrana ondulada que se extiende a lo largo de el cuerpo Citostoma prominente que se extiende un tercio o la mitad Surco espiral a lo largo de la superficie ventral Ventosa que ocupa la mitad o tres cuartos de la superficie ventral Un lado del cuerpo es plano. Flagelo posterior que se extiende libremente hacia el posterior o el lateral Citostoma prominente que se extiende aproximadamente hasta la mitad del cuerpo Otras características Citostoma con fibrillas de soporte. Habitualmente visible en preparaciones teñidas Fibrillas o flagelos longitudinales en el quiste Citoplasma frecuentemente apartado a una porción de la pared del celular Se asemeía al quiste de E. nana. Los flagelos o fibrillas no suelen verse
•
No visible en preparaciones sin teñir
Se parece al quiste de Chilomastix. Sombra exterior al citoplasma con fibrillas de soporte que se extienden sobre el núcleo
is of Mai USDHEWPHS Publicación n.1.966 1969
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Coccidios Los coccidios comprenden un gran grupo de parásitos apícomplejos que tienen una lase sexual en el intestino de los vertebrados e invertebrados. Algunas especies pueden también desarrollarse asexualmente en zonas extraintestinales en los tejidos del huésped. Los géneros infectantes del intestino humano, como Isospora. Sarcocystis. Cryptosporidium y Cyclospora suelen producir una diarrea autolimitada en personas inmunocompetentes. Se puede desarrollar una diarrea grave en inmunosuprimidos tras la infección de Isospora. Cryptosporidium y Cyclospora. Isospora belli. Isospora belli sufre un desarrollo sexual y asexual en el citoplasma de las células epiteliales del intestino delegado (Lámina 55-9/4). El desarrollo sexual produce ooquistes. que pasan a las heces y maduran a fase infectiva en el medio ambiente. La infección humana causa diarrea y malabsorción. que suele ser autolimitada. En pacientes con sida u otra inmunosupresión, la enfermedad puede durar meses o años y podría causar la muerte (DeHovitz, 1986; Mannheimer. 1994). El diagnóstico se hace hallando ooquistes no esporulados de 12 x 30 pm en las heces, habitualmente en examen directo o en preparaciones concentradas (Lámina 55-9S). Si la muestra sin fijar se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas, se produce la esporulación. Los ooquistes infectivos contienen dos esporoquístes, cada uno de los cuales tiene cuatro esporozoitos (Fig. 55-6/4) Los ooquistes. como los de Cryptosporidium, se tiñen con tinción ácido resistente. Sarcocystis spp. Las especies de Sarcocystis son coccidios de doble huésped en los que la lase sexual se da en el intestino de carnívoros y la asexual o extraintestinal se da en los músculos y tejidos de huéspedes intermediarios. Los humanos pueden servir como huéspedes intermedios o como huéspedes definitivos, dependiendo de la especie de Sarcocystis. La infección intestinal con S. hominis y S. suihominis se adquiere por ingesta de carne poco hecha (vaca o cerdo) respectivamente, que contiene los quistes tisulares (sarcoquisles), La infección suele ser asmtomática, pero algunos pacientes desarrollan diarrea pasajera, dolor abdominal o anorexia. La infección intestinal es autolimitada, ya que la multiplicación asexual se produce en el huésped intermediario y no se repite en el huésped definitivo. La producción de ooquistes se limita por el número de organismos ingeridos como sarcoquistes. El diagnóstico se hace al detectar los esporoquistes esporulados de 25 x 33 pm en las heces (Fig. 55-6A). Cada esporoquiste maduro contiene cuatro esporozoitos. La pared de los ooquistes es fina y no suele verse o se rompe liberando dos esporoquistes. Estas formas, que se ven mejor en examen directo o en tinciones ácido resistentes, parecen más grandes que los ooquistes de Cryptosporidium, y la tinción de tricromo es de poco valor en la detección de estos parásitos. Los hombres también puede servir de huésped intermediario en muchas especies innominadas de Sarcocystis (conocidos colectivamente como S. lindemannt), en cuyo caso los quistes se encuentran en los músculos esqueléticos y cardíacos (Beaver. 1979: Strickland, 1999). Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum utiliza un único huésped en su ciclo vital, pero puede infectar a humanos y a una gran variedad de animales, incluidos los de ganado vacuno y ovino. Los parásitos se desarrollan en el borde en cepillo de las células endotelíales del intestino y a veces se extienden a otras zonas como la vesícula biliar, el páncreas o el tracto respiratorio (véanse Fig. 55-6A y Lámina 55-9Cy 0). Cryptosporidium es una causa frecuente de diarrea aguda autolimitada en personas sanas, especialmente en niños. La epidemiología es similar a la de Giardia. Uno de los mayores brotes conocidos transmitido por agua se produjo en Milwaukee y Wisconsin en el año 1993. En este brote, más de 400.000 personas cayeron enfermas por beber agua contaminada con vertidos de granjas tras unas fuertes lluvias (McKenzíe, 1994). Como los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium son resistentes a la cloracíón habitual del agua potable, y a menos que el agua comunitaria se filtre, pueden darse epidemias. En pacientes con sida, Cryptosporidium puede producir diarrea secretora crónica que puede durar meses o años y puede acarrear la muerte. El período de
incuóación es aproximadamente de ocho días, y en personas previamente sanas puede durar de 9 a 23 días. Los pacientes pueden tener malestar, liebre, anorexia, calambres abdominales y diarrea (Current, 1991; Mannheimer, 1994). El diagnóstico se suele hacer examinando las heces. Existen varios métodos de concentración que son buenos, incluidas la sedimentación con formalina-etil acético y la flotación en azúcar de Sheather (García, 1983). La disponibilidad del método de formalina-etil acético hace a esta técnica muy atractiva, aunque se deben incrementar al máximo el tiempo y la velocidad de centrifugación para maximizar el rendimiento (NCCLS, 1997; Isenberg. 1992), Se prepara una extensión con el sedimento y se tiñe con tinte ácido resistente o reactivos inmunolluorescentes. Se han evaluado muchos métodos de tinción ácido resistente, incluida la auramina-O, pero el que tiene un uso más extendido es el método de Kinyoun modificado. Los ooquistes esféricos miden de 4 pm a 6 pm de diámetro y cuando se tiñen de este modo se tornan a un fucsia profundo, aunque hay algunas irregularidades en la intensidad de la tinción y puede variar el porcentaje de los quistes que se tiñen. Se debe usar un control positivo en cada preparación. Son especialmente buenos los reactivos de inmunofluorescencia y de EIA, con alta sensibilidad y especificidad (Arrowood. 1989; Murray. 1999; Rosenblatt, 1993; Rusnack, 1989), para los laboratorios donde es poco habitual el hallazgo de Cryptosporidium y donde hay dificultad para la interpretación de las tinciones ácido resistentes. La necesidad de examinar heces para Cryptosporidium depende de la población a cubrir, de los objetivos, de los intereses y de la habilidad del personal del laboratorio. Algunos laboratorios realizan exámenes para Cryptosporidium sólo si se pide específicamente y otros examinan todas las muestras de los inmunosuprimidos. Cyclospora cayetanensis. Cyclospora cayetanensis es un parásito coccidio de reciente descripción responsable de enfermedad diarreica en inmunocompetentes e inmunosuprimidos (Ortega, 1994: Murray. 1999). Se ha deteclado en pacientes de diferentes países, incluido Estados Unidos, y fue inicialmente descrito como un alga verde-azulada, similar a un cuerpo parecido a una cianobacteria, o como un coccidio (Ortega. 1993). La infección produce un cuadro seudogripal, con náuseas, vómitos, pérdida de peso y diarrea acuosa explosiva que dura de una a tres semanas. Los ooquistes no esporulados son esferas no retráctiles de 8 pm a 10 pm que contienen un acumulo de glóbulos refráctiles englobados dentro de una membrana cuando son vistos al microscopio de luz óptica. Se requieren de una a dos semanas para su esporulación, después los ooquistes maduros contienen dos esporoquistes, cada uno con dos esporozoitos. En las tinciones de tricromo los ooquistes aparecen como objetos claros, redondos y algo arrugados. Los ooquistes autofluorecen desde un verde brillante a un azul intenso bajo la epifluorescencia ultravioleta y las técnicas de tinción con colorante ácido resistente modificado o auramina-O. Se deben diferenciar de los ooquistes de Cryptosporidium, que se tiñen de igual forma pero son más pequeños (de 4 pm a 6 pm) (Lámina 55-9E).
Microsporidios Los microsporidios son unos parásitos protozoos lormadores de esporas, intracelulares estrictos, del filo Microspore que infectan a variedad de animales, incluidos los humanos (Franzen. 1999: Shadduck. 1989). Hay importantes patógenos en los huéspedes inmunosuprimidos, especialmente en aquellos con sida, siendo responsable en ellos de un gran porcentaje de diarreas inexplicables por otra causa (más del 30% en algunos estudios) (Curry, 1993). Enterocytozoon bieneusiy Encephalitozoon intestinalis, las dos especies más frecuentemente implicadas en la infección intestinal humana, pueden producir diarrea y pérdida de peso en los pacientes con sida, similares a las causadas por Cryptosporidium. E. intestinalis también puede producir enfermedad diseminada (Cali, 1993; Willson, 1995). Los organismos se multiplican mtracelularmente (merogonia) y forman esporas resistentes (esporogonia) que rompen ocasionalmente la célula
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
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Figura 55-7. Tamaños relalivos de los huevos de helmintos. (Del CDC. Rama de Entrenamiento Parasitológico, Atlanta. GA.)
huésped e infectan las células adyacentes o se eliminan al exterior. La esporas contienen un túbulo enrollado que se refuerza por el apropiado estimulo ambiental y penetra la membrana de las células receptoras. El esporoplasma del parásito se inyecta a través del túbulo al citoplasma de la célula huésped, donde se multiplica. Los reservónos no se han identificado. A veces ha habido pacientes que han sido infectados por otros géneros de microsporidios, incluidos Encephalitozoon (hepatitis, infección ocular, enfermedad del sistema nervioso central). Nosema (infección diseminada) y Pleistophora (miosiüs) (Curry. 1993: Shadduck. 1989). entre otras (Franzen. 1999).
hasta cerca de 10 m de longitud, y para los huevos de 25 pm a 150 pm (Fig. 55-7). Es importante una comprensión de los ciclos vitales de los helmintos y de su distribución geográfica para el conocimiento de las fases parasitarias que pueden encontrarse ante una sospecha, qué órganos o tejidos pueden afectarse y cuándo se puede esperar que aparezcan los diferentes estadios tras la exposición. Aunque el diagnóstico suele depender del hallazgo e identificación de un estadio del desarrollo (huevo, larva o adulto), algunas infecciones se puede diagnosticar principalmente por la clínica o los datos serológicos, o ambos.
Hasta hace poco, el diagnóstico requería el examen de los tejidos al microscopio de luz óptica (Lámina 55-9Fy G) y al microscopio electrónico. El desarrollo de una tinción de tricromo modificada para el examen de muestras fecales para esporas ha resultado un importante avance en el diagnóstico (Weber. 1992). Con este método, las pequeñas esporas elípticas (de 1,5 pm a 3 pm) se tiñen de rojo sobre un fondo débilmente verde, y algunas poseen una característica banda cruzada (Lámina 55-9H). También se han descrito modificaciones de este método. Las tinciones fluorocromas, así como la Uvitex 2B y la calcotlúor blanco, parecen ser más sensibles en la detección de esporas y pueden ser útiles en el screening inicial de la muestra (DeGirolami, 1995: Luna, 1995: van Gool, 1993). El pequeño tamaño de las esporas hacen de su detección todo un reto.
Ciertas especies tienen ciclos de desarrollo donde los estadios infecciosos se pueden transmitir directamente de persona a persona (Enterobius y H. nana). En otros (Trichuris. Ascaris y Trichostrogylus) se requiere un periodo extra de maduración en el extenor del huésped antes de que el huevo o la larva sean infecciosos. La ingesta de los estadios infecciosos puede ser accidental por el parásito vector iDipylidium. Hymenolepis). plantas (Fasciolopsis. Fasciola) o tejidos animales (Trichinella, Taenia. Diphyllobolhrium. Clonorchis. Opisthorchis. Paragonimus. Heterophyes. Melagonimus y Nanophyelus). En algunos casos las larvas pueden penetrar directamente la piel (uncinarias. Strongyloides y esquistosomas).
HELMINTOS INTESTINALES Los helmintos intestinales aquí tratados incluyen nematodos (gusanos redondos), cestodos (tenias) y tremátodos (lombrices), que residen como adultos en el tracto de gastrointestinal o en otras localizaciones (hígado, pulmón o sangre) y que producen huevos que salen dei cuerpo humano por vía intestinal. Los tamaños para los helmintos adultos van desde 1 mm
La detección e identificación de los huevos y larvas en heces, orina o esputo requieren una sistemática aproximación y el entrenamiento adecuado del personal. El tamaño de los huevos y de las larvas es una característica especialmente importante, y con frecuencia se requiere el uso de un micrómetro ocular calibrado. Se debe prestar atención a las características externas de los huevos, incluida la forma, el grosor de la pared, la presencia o ausencia de cubierta mamelonada. opérculos, hombros operculares. botón, tapón polar o espinas. También se debe observar el desarrollo de los huevos (embrionados o sin embrionar) la presencia o ausencia de ganchos, que caracterizan a los cestodos. El examinador también necesita conocer la gran variedad de artefactos que se detectan en las heces y que pueden simular huevos o larvas (Tabla 55-4).
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Nematodos Enterobius vermicularis. La infección por Enterobius u oxiuros es la infección helmíntica más frecuente en niños de todos los estratos sociales en EE.UU. Aunque es principalmente típica de los niños, la rápida maduración de los huevos permite que sea fácilmente transmitida de niño a niño y a adultos tanto en familias como en instituciones. Los gusanos machos o hembras viven principalmente en el ciego y en las áreas adyacentes. Las hembras miden más de 13 mm y tienen un extremo posterior puntiagudo que da pie a su nombre, oxiuro. Ambos sexos tienen prominentes alas laterales que se ven en una sección axial y un bulbo esofágico prominente (Lámina 55-1OA a C). Aunque los machos rara vez son vistos, las hembras se pueden encontrar en la superficie de las heces o en la piel perianal, especialmente por la noche, donde deposita sus huevos; éstos son incoloros y ovoidales con un lado aplanado y miden entre 20 pm y 40 pm de ancho y de 50 pm a 60 pm de largo (Lámina 55-106). Se hacen infectivos en horas y Iras ser ingeridos completan el desarrollo hasta adultos grávidos en un mes (período de latencia). Aunque la infección puede ser asintomática. los niños frecuentemente tienen prurito anal, irritabilidad e insomnio. La infección por Enterobius debe ser descartada en todo estudio de enuresis. Los gusanos adultos pueden migrar a zonas inusuales, como la vagina, la trompa de Falopio o la cavidad peritoneal. Su muerte en estas localizaciones puede producir una reacción inflamatoria granulomatosa (Symmers. 1950). La detección de los huevos y. a veces, de los gusanos adultos en la piel perianal se hace mediante la técnica de papel de celofán durante el sueño o a primera hora de la mañana (Ash, 1987; García, 1997). En el examen habitual de las heces sólo se detecta del 5% al 10% de los casos. Se requiere un examen de muestras tomadas en diferentes días para poder detectar los huevos (Sadun, 1956).
un grueso caparazón con estrías radiales y tapones mucosos que son poco llamativos. Ascaris lumbricoides. Este es el nematodo más largo que afecta al tubo digestivo humano y probablemente el gusano intestinal redondo más frecuente, puesto que infecta a aproximadamente 1,3 billones de personas en todo el mundo (Markell, 1999). Afecta principalmente a regiones con pobre higiene y, como el Trichuris, es más común en niños, siendo, a su vez, los más predispuestos a las infecciones graves. Ascaris adulto vive principalmente en el duodeno y en el yeyuno proximal. Las hembras miden más de 35 cm de largo por 6 mm de diámetro. El macho es algo más pequeño y tiene un extremo curvado ventralmente, a diferencia de la hembra (Lámina 55-10F). Tanto los inmaduros como los adultos se pueden identificar por la presencia de tres labios prominentes en su porción anterior. Las hembras producen unos 2.000 huevos al día, que están sin embrionar y requieren de 4 a 6 semanas en un ambiente óptimo para que sean infectivas. Posteriormente, al ingerirlos alcanzan el intestino y las larvas penetran en la mucosa llegando al torrente circulatorio. De ahí son transportados a los pulmones, donde maduran rápidamente en el lecho capilar alveolar y luego pasan al alvéolo. Los mecanismos de aclaramiento mucociliar los arrastran hasta la epiglotis y nuevamente son ingeridos y se hacen adultos en el intestino. Desde que son huevos hasta que alcanzan el estadio adulto pasan aproximadamente dos meses. La clínica de la ascariasis va desde la infección asintomática a la enfermedad grave. El paso de las larvas por los pulmones puede causar una neumonitis por Ascaris o un síndrome de Lóffler, caracterizado por infiltrados pulmonares difusos bilaterales y bronquitis con eosinofília asociada. Este síndrome es infrecuente y habitualmente se produce en individuos previamente expuestos a los antígenos de los Ascaris.
La presencia de escaso número de gusanos en el intestino no suele advertirse, mientras que la infección grave produce diferentes grados de diarrea y dolor abdominal. También puede producirse una obstrucción Trichuris thchiura. La infección por Trichuris es típica de las zonas trointestinal con una masa de gusanos, especialmente en niños. Incluso con picales y subtropicales. Los gusanos adultos se hallan en el intestino y espepoco número de gusanos, hay que estar alerta, ya que tienen facilidad para cialmente en el ciego, pero las infecciones graves se pueden ver en el colon invadir sitios ectópicos, como la vía biliar y el hígado, el apéndice y el y en el recto. Los machos y hembras miden más de 50 mm de longitud y perestómago. La fiebre y el tratamiento pueden favorecer su migración. En las manecen en la mucosa por el extremo anterior, que es fino, mientras que el zonas endémicas con frecuencia se usan antihelmínticos antes del uso de otro extremo, más grueso, cuelga libremente en la luz. La hembra es alargaanestesia en la cirugía. da, mientras que la cola de los machos es enrollada (Lámina 55-10D). TriEl diagnóstico se realiza al visualizar los huevos en las heces o por la churis tiene un ciclo vital en el que los huevos salen con las heces sin detección de un gusano adulto en el vómito o en las heces. Un recuento embrionar y tarda varias semanas, en las adecuadas condiciones de la tiemenor de 20 huevos por extensión (2 mg de heces) indica infección leve, y rra, en madurar a un estadio infectivo. Cuando se digieren huevos embriosi es mayor de 100 huevos, por extensión, indica infección grave. nados, se liberan larvas y maduran en el colon, donde se fijan y viven más Los huevos fértiles de Ascaris pueden ser redondos o ligeramente ovales, de diez años. con una cubierta irregular externa, mamelonada, amarilla-marrón y con un Las infecciones leves suelen ser asintomáticas, pero cuando hay muchos caparazón grueso. Los huevos que pierden su cubierta se llaman decorticaparásitos (más de 300 gusanos) pueden aparecer diarrea o síntomas de dos y pueden asemejarse a los de las uncinarias. Se eliminan sin embrionar disentería junto con deshidratacíón y anemia (Beaver, 1984; Strickland, 1999). y miden aproximadamente de 55 pm a 75 pm de largo por 35 pm a 50 pm de Una posible complicación en niños con infecciones graves es el prolapso recancho (Lámina 55-10G y H). Las hembras pueden producir huevos sin fertilital (Cooper, 1988). zar, que son más largos y más alargados (más de 90 pm de longitud) y tienen El diagnóstico se hace al hallar los huevos en las muestras fecales o una cubierta más fina y con mamelones irregulares. Estos huevos están llecon técnicas de conservación. Los huevos son como barriles, con unos nos de gotas de grasa irregulares. tapones refráctiles en ambos extremos, y suelen medir de 50 pm a 55 pm Trichostrongylus spp. La enfermedad humana causada por Trichosde largo por 22 pm a 24 pm de ancho (Lámina 55-10E). A veces, los trongylus spp. representa una infección zoonótica, ya que infecta principalhumanos se pueden infectar por el gusano del perro, T. vulpis, que posee mente a herbívoros como la oveja, la vaca o las cabras. Hay distintas espeunos huevos más grandes y anchos que los de Trichuris trichiura. A veces cies que pueden infectar a humanos como, T. colubriformis. T. orientalis. T. pueden ser necesarias técnicas de cuantificación de los huevos para valoaxei y T. brevis, que se encuentran en muchas partes del mundo. Los gusarar la intensidad de la infección, la eficacia del tratamiento y la tasa de nos adultos habitan en el intestino y producen huevos que maduran en el reinfección. exterior. Las larvas salen y se colocan entre la tierra y la vegetación, donde pueden ser ingeridos por sus huéspedes definitivos. A diferencia de las unciCapillaria philippinensis. Este parásito, que normalmente se narias. no invaden la piel directamente ni poseen una fase migratoria por los encuentra en pájaros que se alimentan de peces, afecta a humanos que pulmones. Las infecciones suelen ser leves y asintomáticas, pero las graves comen pescado crudo y que contiene larvas. Aunque se describió en pueden dar diarrea y dolor abdominal, habitualmente con eosinofília. Los huepersonas de Filipinas, y luego en Tailandia, a veces se ven casos en vos son semejantes a los de las uncinarias pero más largos y estrechos, de otras partes de Asia. Oriente Medio y Sudamérica (Cross, 1992). Puede 78 pm a 98 pm por 40 pm a 50 pm y ligeramente ahusados en un extremo. producir diarrea crónica y los infectados pueden eliminar huevos, larvas y gusanos adultos en las heces. Los huevos son similares a los de TriUncinarias. Las uncinarias, que están entre los helmintos que con más churis, aunque miden de 36 pm a 45 pm de largo y 21 pm de ancho, con frecuencia afectan a los humanos, se dan en regiones tropicales y subtropi-
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secundaria. Por cada adulto de A. duodenale se pueden perder entre 0.15 I y 0.25 mi de sangre al día. comparado con los 0,03 mi de cada N. americanus. El crecimiento del niño puede verse afectado con la infección crónica. La pérdida de sangre y el número de uncinarias se correlacionan con el numero de huevos por gramo de heces, lo que puede a ayudar a determinar cuándo empezar el tratamiento en pacientes en áreas endémicas (Layrisse, 1964a, 1964b). El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos de cubierta fina en las heces. Éstos son parcialmente embrionados cuando se eliminan y miden de 58 um a 76 pm de longitud por 36 pm a 40 pm de ancho (Lámina 55-11/4). Los huevos embrionados o de larvas rabdiformes libres pueden encontrarse en muestras sin conservar que no se examinan en su momento. Las uncinarias rabdiformes pueden distinguirse de las de Strongyloides slercolans. ya que las primeras tienen una cámara bucal más grande y un primordio genital que no llama la atención (Fig. 55-8). La maduración de las larvas tiene como consecuencia la aparición de filarías infectivas, que tienen un extremo puntiagudo y un esófago que mide aproximadamente un cuarto de su longitud. Los huevos de uncinarias se deben diferenciar de los de Trichostrongylus spp. (que son más largos y más picudos) y de los de los nematodos de las plantas, especialmente Heterodera spp. (que son más largos, con el extremo romo, que pueden ser asimétricos) (Lámina 55-116). Aunque los adultos se pueden diferenciar según las partes de la boca y la bolsa copulatoria de los machos, los huevos de las uncinarias humanas son indistinguibles. En el examen directo, un recuento de menos de cinco huevos por portaobjetos denota infección leve, que raramente puede producir anemia, mientras que más de 25 indica infección grave y que fácilmente puede asociarse a síntomas. Figura 55-8. Larvas de uncinarias y de Strongyloides slercolans A. Larva rabdiloiStrongyloides stercolaris. La infección por Strongyloides se da en de de S. slercolans en heces humanas. Obsérvese el corto tamaño de la cavidad muchas zonas de los trópicos y subtrópicos, pero la infección también se bucal y el gran primordio genital (GP). 6, Larva rabditoide de uncinarias vista en las produce en zonas templadas y que históricamente fueron áreas endémicas heces dejadas 24 horas a temperatura ambiente. La cavidad bucal es más larga y del sureste de los Estados Unidos. Las hembras adultas miden de 2 mm a el primordio es más corto 3 mm y viven unidas a la mucosa del duodeno, donde se reproducen por padenogénesis (Lámina 55-11C), Los machos no se dan en los vertebrados. Los huevos se abren en el intestino, liberando la lase inicial o larvas rabditoides que salen en las heces (los huevos casi nunca se hallan). En este ciclo directo las larvas rabditoides se transforman en diarias infectivas de tercer estadio en el suelo. Estas larvas infectivas penetran con facilidad la piel de los individuos y migran a los pulmones por vía circulatoria, y de ahí al árbol bronquial, siendo nuevamente deglutidas. Es entonces cuando se completa el desarrollo a estadio adulto. Bajo unas condiciones de suelo adecuadas con gran humedad, se puede dar un ciclo indirecto transitorio cales y en algunas zonas templadas. Necaloramericanus se halla en EE.UU. en el que las nuevas larvas evolucionan a una generación de vida libre y en otras partes del mundo, superponiéndose su distribución con la de consistente en machos y hembras reproductivas. Los huevos asi formados Ancylostoma duodenale. que no se da en EE.UU. desarrollan larvas filariformes que infectan de nuevo a los humanos. Una Las hembras adultas miden más de 12 mm y los machos un poco metercera variante del ciclo de vida de Strongyloides consiste en autoinfecnos. Los machos se diferencian por la bolsa copulatoria con forma de abación. en la que la maduración del estadio filariforme se completa en el tracnico en su extremo posterior. En el extremo anterior tienen una cápsula to intestinal, con la consiguiente reinvasión de la mucosa intestinal o de la bucal que contiene dientes o láminas cortantes. Ambos sexos se fijan a la piel perianal. mucosa intestinal, donde pueden vivir más de dieciocho años (Beaver, 1988). Los huevos se eliminan por las heces y se desarrollan rápidamente según las condiciones. Las larvas rabdiformes se liberan y se hacen infectivas en su estadio de filarías en unos siete dias. Cuando contactan con el huésped apropiado, las larvas penetran la piel y posteriormente acceden a la circulación llegando a los pulmones, desde donde suben por el árbol bronquial hasta ser nuevamente deglutidas. Cuando maduran en el intestino, comienzan a poner huevos. Aunque poseen ciclos de vida similares, Ancylostoma puede madurar directamente en el intestino si se ingiere la larva infectiva. Las uncinarias pueden causar patología cutánea en el sitio de entrada de la larva. Esto se caracteriza por inflamación, eritema y ampollas con gran picor. Su paso por el pulmón puede causar síndrome de Lóffler, como se describió para Ascaris. Dependiendo de la carga de gusanos, la infección intestinal puede dar gastroenteritis con dolor abdominal, diarrea y nauseas. Sin embargo, las uncinarias son más conocidas por su capacidad para causar pérdida crónica de sangre con anemia ferropénica
La clínica es variable y depende de la cepa adquirida (Genta, 1989). La migración de las larvas de tilarias puede causar irritación, eritema y prurito en el punto de entrada, mientras que una emigración tardía por los pulmones puede producir síndrome de Lóffler (Purtilo. 1974). La clínica intestinal se asocia a la intensidad de la infección, pudiéndose producir síntomas de ulcera péptica, dolor abdominal y diarrea. Se han descrito una infección crónica con un síndrome de malabsorcion. La capacidad del parásito para autoinfectar puede perpetuar la infección durante décadas, como se observó en tropas aliadas que estuvieron prisioneras en la guerra del sudeste de Asia durante la Segunda Guerra Mundial (Gilí, 1979). Por otra parte, en pacientes sanos, la autoinfección puede causar larva currens (lesiones urticariformes lineales). En pacientes inmunosuprimidos, alcohólicos o desnutridos la autoinfección puede acabar en una hiperinfección con riesgo vital por una reproducción rápida del parásito (Genta. 1992; Maaen, 1987). A veces, una forma de presentación de la hiperinfección es una neumonitis grave, seguida de diarrea, enteritis y septicemia. En los pacientes de las áreas endémicas se
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debe descartar Strongyloides antes de terapias inmunosupresoras (Stickland. 1999). El diagnóstico se hace por el hallazgo e identificación de las típicas larvas rabdiformes en las heces, aunque el examen O/P no siempre logra revelarlas (Lámina 55-110) (Genta. 1989; Pelletier, 1988). Las larvas rabdiformes de Strongyloides se deben diferenciar de las de las uncinarias. y se caracterizan por una cavidad bucal corta y un primordio genital prominente (Fig. 55-8). Las larvas filariformes de Strongyloides tienen una cola con una muesca y un esófago que mide aproximadamente la mitad de su cuerpo. Ambos estadios larvales pueden verse con lacilidad en muestras frescas con bajo aumento. Si se detectan larvas filariformes infectivas en una muestra reciente, es diagnóstico de superinfección (Eveland. 1975). El examen del aspirado duodenal o de las muestras del test de la cuerda puede ser útil en las sospechas con un examen de ordinario negativo. El método de concentración del embudo de Baermann o una de las técnicas de coprocultivos (véase previamente en Métodos de laboratorio) pueden demostrar también la infección (Ash, 1987; García, 1999; Genta, 1989). Las larvas pueden hallarse en el espulo o en otras muestras pulmonares, especialmente en los síndromes de hiperinfección. Los test serológicos son útiles cuando se sospecha la infección, pero no se logra demostrar por otros métodos. El EIA y otros test poseen buena sensibilidad y especificidad aunque pueden existir reacciones cruzadas con las filarías y otras infecciones por nematodos. Estos test no suelen distinguir entre infección pasada y actual, pero son útiles para ver la respuesta al tratamiento (Wilson, 1995). Anisakiasis. Véase más adelante en Helmintos tisulares.
Cestodos Los cestodos o gusanos planos son platelmintos similares a cintas que viven en el tracto intestinal de los vertebrados como adultos, y en los tejidos o cavidades corporales de diferentes huéspedes intermediarios, como larvas. Se unen a la mucosa intestinal por un escólex. o un órgano de sujeción, en el extremo anterior, que puede tener ventosa, surcos (botrios) o un róstelo con garfios según las especies. El cuerpo del gusano, o estróbilo, se compone de una región cervical de crecimiento activo y una serie de proglótides que se desarrollan secuencialmente a lo largo de los estadios inmaduro, maduro y, finalmente, grávido en el extremo posterior. Cada proglótide posee tanto gónadas femeninas como masculinas, y está capacitada para producir huevos fértiles. Los huevos de la mayoría de los cestodos son infecciosos (excepto los de Diphyllobothrium) y pueden diferenciarse fácilmente de los de otros helmintos por la existencia de un embrión con seis ganchos. Según las especies, los huevos se eliminan con las heces o se liberan como proglótides. No es infrecuente para algunas especies con gran longitud de estróbilos que éstas se eliminen intactas o que las proglótides migren activamente por el ano. Las especies largas de Taenia y Diphyllobothrium pueden llegar a medir más de 762 cm y vivir unos 20 años.
Las larvas de cestodos se hacen infectivas tanto en los cuerpos de los huéspedes vertebrados como de los invertebrados, según las especies, y completan su ciclo vital cuando son digeridos por un huésped definitivo. Las larvas de muchas especies pueden infectar a humanos, produciendo cisticercosis. hidatidosis. esparganosis y cenurosis. Estos cuadros se explican más adelante bajo el epígrafe de Helmintos tisulares Taenia saginata. Los humanos son los únicos huéspedes definitivos de Taenia saginata, el gusano plano de la vaca. Aunque su distribución es mundial, son especialmente comunes en Oriente Medio, África. Europa. Asia y América latina. En EE.UU. es esporádico. Los cisticercos larvales (Cysticercus bovis) se desarrollan en los tejidos del ganado que pasta en tierras contaminadas con desechos humanos. Cuando los humanos comen carne de vaca cruda o poco hecha, los cisticercos se transforman en un adulto fértil dentro del intestino en un plazo de dos a tres meses. Los síntomas son infrecuentes, pero pueden incluir malestar abdominal y diarrea. A diferencia de 7! solium. los huevos de I saginata no son infectivos para los hombres y su ingesta no provoca cisticercosis. El diagnóstico se realiza al encontrar los huevos en las heces con técnicas directas o de concentración, o en los pliegues perianales mediante la técnica de papel celofán. Los huevos son esféricos y miden de 31 pm a 43 pm de diámetro (Lámina 55-12A). La cubierta es gruesa y radialmente estriada, con embriones con seis garfios. Los gusanos de la especie Taenia son indistinguibles y deben informarse únicamente como huevos de Taenia. La identificación de las especies se debe hacer recuperando las proglótides o, a veces, los escólex. Las proglótides tienen una característica protuberancia lateral conocida como poro genital. La inyección de tinta china por dicho poro usando una aguja fina puede lograr definir el útero. El útero grávido de 7aen/'a saginata tiene de 15 a 20 corchetes laterales, mientras que el de T. solium tiene de 7 a 13 (Fig. 55-9: Lámina 55-126). Las proglótides también pueden ser aclaradas por la noche en glicerol o teñidas con carmín o hematoxilina mediante las técnicas descritas (Ash. 1987). Si se aisla, el escólex de T. saginata se puede identificar por la presencia de cuatro ventosas y la ausencia de garfios en la corona o róstelo. Taenia solium. Taenia solium. el gusano plano del cerdo, es más frecuente en Europa, especialmente en Europa del este, América latina, China, Pakistán y la India. Ocasionalmente puede verse en los Estados Unidos, principalmente en inmigrantes. La infección con el gusano adulto se adquiere por la ingesta de cerdo poco hecho o crudo que contiene cisticercos (C. cellulosae). Cuando hay síntomas, éstos son idénticos a los de la infección por T. saginata. Un dato importante es que la ingesta de huevos de T. solium, bien a partir de un gusano adulto o bien por comida contaminada, puede acabar en cisticercosis (Schantz, 1992). Se pueden encontrar más detalles en Helmintos tisulares. Los procedimientos para el diagnóstico de infección intestinal por T. solium son los mismos que los usados para T. saginata, aunque son aparentes ciertas diferencias morfológicas. En el escólex de T. solium existen
Figura 55-9. Proglótides grávidas de distintos gusanos planos humanos. 1, Taenia saginata. 2, Taenia solium. 3. Dipylidium caninum. 4, Diphyllobothrium latum. 5. Hymenolepis spp.
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
cuatro ventosas y, a diferencia de T. saginata. el róstelo tiene dos filas de garfios. Las proglótides grávidas tienen de 7 a 13 corchetes uterinos laterales (Fig. 55-9). Hymenolepis nana. H. nana, conocida como el gusano plano enano, tiene una distribución mundial y es la especie de cestodos más frecuentemente hallada en EE.UU. Es un parásito común en ratones y el más pequeño que infecta a los humanos, midiendo hasta 4 cm de largo. El escólex tiene un róstelo armado, y las proglótides tienen dos polos genitales localizados en el mismo lado del estróbilo (Fig. 55-9; Lámina 55-12F). El ciclo vital puede ser tanto directo, a través de la ingesta de los huevos, como indirecto, a través de la ingesta de huéspedes intermediarios (habitualmente por el escarabajo del grano), que contienen larvas cisticercoides. En primera instancia, los huevos se pueden pasar directamente de persona a persona, habitualmente entre niños, o ser ingeridos en la alimentación, especialmente productos de grano contaminados con excrementos de roedores. Los huevos se anclan en el intestino y el embrión penetra la mucosa, en donde pasa la larva cisticercoide. Posteriormente emergen y se vuelven a anclar en la pared intestinal, donde completan su desarrollo a adultos en dos a tres semanas. La ingesta de escarabajos con lanzas es mucho menos (recuente. La autoinfección interna puede producirse en algunos individuos en los que los huevos se anclan rápidamente tras ser puestos por el adulto e invaden rápidamente la pared intestinal sin abandonar el cuerpo. Tal mecanismo es el responsable de los casos esporádicos de infecciones masivas. La infección sintomática, caracterizada por dolor abdominal, diarrea, anorexia e irritabilidad, se da en pacientes con gran número de gusanos. El diagnóstico se hace por el aislamiento en las heces de los huevos ovales de pared fina e incoloros, que miden de 30 um a 47 pm de diámetro (Lámina 55-12D). Contienen un embrión con seis garfios (oncosfera) centralmente localizados separados de la pared por un espacio claro. El embrión posee dos engrasamientos polares de los que surgen finos filamentos que se extienden en el espacio claro hasta alcanzar la pared. A veces se pueden detectar estróbilos intactos si se examinan las heces detenidamente. Hymenolepis diminuta. El gusano plano de la vaca. H. diminuta, tiene una distribución cosmopolita y. a veces, infecta a los humanos. La infección, sin embargo, es infrecuente, ya que necesita un huésped artrópodo intermediario en el que las larvas cisticercoideas se desarrollen. La infección humana suele producirse por ingesta accidental de escarabajos infectados, que contaminan los productos de grano o cereales. Los gusanos adultos se desarrollan en el intestino, donde pueden crecer hasta 60 cm. Al igual que los de H. nana, las proglótides tienen poros genitales en un único lado, pero se diferencian de estas especies en que el escólex carece de róstelo armado. Las infecciones suelen ser asintomáticas debido al pequeño número de gusanos que suelen infectar a una persona, aunque se han descrito síntomas intestinales. El diagnóstico se obtiene por el hallazgo en las heces de huevos de pared gruesa, ligeramente ovoides, de color amarillo-marrón, que miden de 70 pm a 85 pm por 60 pm a 80 pm (Lámina 55-12E). Los huevos son los que más fácilmente se confunden con los de H. nana pero se diferencian porque no poseen filamentos polares. Diphyllobothrium spp. Los humanos se pueden infectar por una de las variadas especies de gusanos planos del pescado llamado Diphyllobothrium. que suelen infectar a mamíferos que se alimentan de peces y. posiblemente, a pájaros (Connor, 1997; Curtís, 1991). Estos parásitos se dan en las zonas templadas, especialmente en el norte de Europa, Escandinavia, la antigua URSS y Japón, La infección también se produce en Canadá y en los estados centrales del norte de la costa pacifica y en Alaska. Aunque Diphyllobothrium latum es la especie conocida que con más frecuencia infecta a humanos, su diferenciación no se puede basar en la morfología de los huevos. El parásito habita en el intestino, donde puede llegar a medir 10 m y persistir durante años. Los huevos se eliminan por las heces sin embrionar y deben alcanzar un arroyo o un lago para desarrollarse. En las siguientes semanas surge una forma de larva ciliada, el coracidio de los seis garfios, y
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es ingerido por un tipo de zooplancton. El coracidio se desarrollará en una larva procercoide. que es infectiva para el segundo huésped intermediario, un pez. En éste, el procercoide migra a los tejidos y se transforma en larva de pleurocercoide. Los pleurocercoides pueden escalar la cadena alimenticia y afectar a peces más grandes. Los humanos lo adquieren a través de la ingesta de pescado poco hecho o crudo que ha pasado al menos parte de su vida en agua dulce. Los gusanos adultos maduran y se inician en la producción de huevos en un mes. La infección puede ser asintomática. con la eliminación de trozos de estróbilos como manifestación inicial. En otros, puede presentarse un grado variable de molestias abdominales y diarrea. Raras veces puede producirse una obstrucción intestinal. En las áreas endémicas del norte de Europa, un pequeño porcentaje de pacientes desarrolla un déficit de vitamina B,, con anemia megaloblástica. El diagnóstico se hace al hallar los típicos huevos marrones, ovalados y operculados en las heces mediante las técnicas habituales. Éstos miden de 58 pm a 76 pm por 40 pm a 51 pm y, además del opérculo, poseen una proyección abotonada pequeña y redondeada en el extremo (Lámina 55-12F). La presencia del opérculo es la única entre los cestodos que infecta a humanos y se debe tener cuidado para no confundir los huevos con los de los tremátodos, especialmente con el Paragommus o Nanophyetus. La identificación del género es posible cuando una porción de estróbilo o un gusano intacto es eliminado. El escólex es alargado y posee un par de surcos longitudinales conocidos como botrios, que suplen a las habituales ventosas. Las proglótides grávidas son más anchas que largas y tienen sus poros genitales colocados en mitad de la cara ventral, adyacentes al útero con forma de roseta que se halla en el centro (Fig. 55-9; Lámina 55-12G). Dipylidium caninum. D. caninum es un gusano liso frecuente de perros y gatos en la mayor parte del mundo y no es raro que afecte a humanos, especialmente a niños. En su habitual ciclo de vida, los huevos se ingieren por las larvas de pulga, que infestan las áreas frecuentadas por perros o gatos. Las larvas cisticercoideas persisten hasta que la pulga pasa al estado adulto. La ingestión accidental de pulgas adultas que contienen el cisticercoide produce la infección. Los niños tienen el mayor riesgo de infección, ya que están en gran contacto con animales. Los gusanos maduran en el intestino y crecen hasta 70 cm de largo. La infección tiene pocos síntomas, generalmente causados por las proglótides que se mueven activamente. La detección se basa en el hallazgo de los huevos típicos, paquetes de huevos o proglótides en las heces. Los huevos son esféricos y contienen un embrión con seis garfios. Miden de 24 pm a 40 pm de diámetro y aparecen aislados o formando paquetes (Lámina 55-12H). El escólex es alargado, con cuatro ventosas y un róstelo retráctil y pequeño. Las proglótides tienen forma de barril y dos poros genitales, uno en cada lado, lo que le da el nombre común de gusano plano de doble poro (Fig. 55-9).
Tremátodos Los tremátodos, o lombrices, son helmintos dorso-ventralmente aplanados (platelmintos) que incluyen tanto formas hermafroditas (lombrices intestinales, hepáticas y pulmonares) como otras con diferenciación de sexos (lombrices sanguíneas o esquislosomas). Todas las especies de los humanos se caracterizan por una ventosa oral, por la que se abre al tracto digestivo, y otra ventosa para su fijación. Los adultos miden desde 1 mm (Metagonimus) a 70 mm (Fasciola gigantica). Los huevos llegan al exterior eliminados por las heces, el esputo o la orina, según las especies. Los hermafroditas producen huevos operculados que no están embrionados (Clonorchis y Opisthorchis son excepciones). Los huevos de esquistosomas no son operculados y cada uno contiene una larva madura cuando se elimina. La larva trematodo. o miracidia. es ciliada y capaz de penetrar los tejidos de un molusco. Cada especie de trematodo usa algún tipo de caracol como primer huésped intermediario. Un proceso de multiplicación asexual compleja dentro de caracoles produce un gran número de larvas que nadan libremente y se llaman cercarías.
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MICROBIOLOGÍA MEDICA
Las cercarías de esquistosomas son capaces de penetrar la piel humana directamente, produciendo esquistosomiasis. Las lombrices hermafroditas enquistan en la vegetación acuática o invaden los tejidos de un segundo huésped, como un pez o un cangrejo, según las especies. La ingesta de estas larvas enquistadas, llamadas metacercarias, produce infección humana. La infección se produce en muchas zonas tropicales y subtropicales. Su presencia depende de la ausencia de tratamiento de las aguas residuales, de la disponibilidad de los huéspedes intermediarios apropiados y, en el caso de las especies hermafroditas. de las costumbres dietéticas asociadas a la ingesta de metacercarias. Alguna de estas enfermedades, especialmente la esquistosomiasis, se están extendiendo debido al incremento del uso de irrigaciones en las áreas endémicas. La clínica varía según el número de gusanos parasitarios, los órganos afectados y la respuesta del huésped. Muchas infecciones son asintomáticas. El diagnóstico se hace identificando los huevos típicos en heces, esputo, orina y, a veces, tejidos. Los métodos directos y los de concentración con lormalma-etil acético son más útiles para el aislamiento de estos huevos, mientras que los métodos de flotación con sulfato de cinc son menos satisfactorios. Fasciolopsis buski. Es el trematodo intestinal más largo que infecta a humanos, variando de 20 mm a 75 mm de largo y de 8 mm a 20 mm de ancho. Se da en China, sudeste de Asia y la India, hallándose con frecuencia en cerdos como reservorio natural. Se adquiere por la ingesta de metacercarias de las plantas acuáticas, como el castaño de aguas. Los gusanos se unen a la pared del duodeno y del yeyuno, donde maduran a adultos en tres meses. Los síntomas incluyen diarrea, dolor epigástrico y náuseas, si hubiese suficientes gusanos como para producir ulceración de la mucosa. Puede existir eosinolilia incluso en los asintomáticos. El diagnóstico se hace al ver los huevos largos (de 130 pm a 140 um por 80 pm a 85 pm), marrones, ovales y de pared delgada (Lámina 55-13/4). El opérculo puede pasar desapercibido y los huevos ser eliminados sin embrionar. La diferencia con los huevos de Fasciola no suele ser posible, aunque las infecciones pueden diferenciarse basándose en la historia geográfica y en la clínica. Los huevos de tremátodos equinostomas. cuando afectan a humanos, son similares pero más pequeños (Beaver. 1984). Heterophyes y Metagonimus. Estos dos géneros incluyen un número de especies de minúsculos gusanos intestinales (de 1 mm a 3 mm de longitud) que infecta a humanos. Heterophyes heterophyes y Metagonimus yokogawai son parásitos comunes en Asia, pero, (unto con otras especies, se encuentran también en otras partes del mundo. La infección se adquiere por la ingesta de metacercarias en pescado de agua dulce poco hecho. Aunque son de poca importancia médica, pueden producir diarrea y dolor abdominal. La infección es autolimitada, ya que los gusanos tienen una vida de tan sólo unos pocos meses. El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos embrionados y operculados que miden de 20 pm a 30 pm de largo por 15 pm a 27 pm de ancho (Lámina 55-138). La diferenciación de estos huevos de los de Clonorchis y Opisthorchis es difícil, aunque el opérculo es más profundo en Opisthorchis. No obstante, tal distinción puede ser importante por razones médicas. Nanophyetus salmincola. Nanophyetus salmincola es un pequeño gusano intestinal (de 0,8 mm a 1.1 mm) descrito en el este de Siberia y en el noroeste de la costa pacífica de EE.UU. (Eastburn, 1987: Fristche. 1989b). Estos gusanos se adquieren por la ingesta de salmón crudo o poco cocinado o bien ahumado, o por truchas con metacercarias infecciosas. Los sintomas están en función del número de gusanos y puede incluir dolor abdominal, diarrea y, a veces, eosinofilia. Los huevos, de 60 pm a 80 pm por 34 um a 50 pm son ovoidales. operculados y de un color marrón amarillento (Eastburn, 1987). Hay un engrosamiento en el extremo de la pared que lo diferencia de botón visto en los huevos de Diphyllobothrium. Fasciola hepática. Las vacas, las ovejas y las cabras de muchas partes del mundo están infectadas con la lombriz hepática Fasciola hepática y, menos Irecuentemente, con especies de Fasciola giganiica. Los parásitos adultos habitan en el árbol biliar y de|an huevos que se eliminan por las
heces. Las cercarías eliminadas a partir de los caracoles huéspedes se enquistan en la vegetación acuática, donde las metacercarias quedan a merced de los huéspedes herbívoros. Los humanos lo adquieren al comer berros. Una vez ingeridas, las larvas pasan la pared intestinal y migran por el peritoneo hasta el higado. Atraviesan la cápsula hepática y el parénquima, llegando a alojarse en el interior de los conductos biliares, donde la puesta de huevos comienza en aproximadamente dos meses. La migración a través de higado provoca una reacción inflamatoria dolorosa en el parénquima y. posteriormente, en los conductos biliares, pudiendo acabar en fibrosis. Las manifestaciones clínicas incluyen cólico, ictericia obstructiva, dolor abdominal, colelitiasis y eosinolilia. El diagnóstico se realiza al hallar los huevos en las heces. Los huevos operculados. sin embrionar. son de un color marrón amarillento, de 130 pm a 150 um por 63 pm a 90 pm, pudiendo ser difíciles de distinguir de los de Fasciolopsis (Lámina 55-13A). Falsas infecciones, como la producida por la ingesta de higado de vaca u oveja infectados, se diagnostican mediante una buena anamnesis y realizando un seguimiento del examen de las heces para buscar la eliminación de los huevos. Clonorchis sinensis y opisthorchis viverrini. Clonorchis sinensis. la lombriz hepática oriental, y una especie cercana. Opisthorchis viverrini. habitan el sistema biliar de los humanos y de otros piscívoros, incluidos gatos y perros. C. sinensis se da principalmente en China, Taiwan, Corea, Japón y Vietnam, mientras que Opisthorchis viverrini se halla en el sureste de Asia, especialmente en el norte de Tailandia. También se conoce la infección humana por O. lelineus en Europa y por Amphimerus pseudolelineus en Ecuador (la misma que O. guayaquilensis). Todos estos parásitos se adquieren al ingerir las metacercarias en pescado crudo o poco cocinado. Las lanzas emigran a la via biliar, donde viven más de 20 años y crecen hasta 25 mm (Lámina 55-13C). Producen huevos que se eliminan en la bilis y posteriormente en las heces. Con frecuencia las infecciones son asintomáticas, aunque gran número de lombrices e infecciones de repetición pueden producir inflamación biliar y posterior hiperplasia fibrosa y cirrosis hepática. Se ha descrito el desarrollo de un colangiocarcinoma en las infecciones mantenidas. El diagnóstico se realiza al aislar los huevos operculados en las heces. Estos huevos son pequeños, marrones y embrionados (Lámina 55-13D) Los huevos de Clonorchis no pueden ser diferenciados fácilmente de los de Opisthorchis. Ambos miden de 25 pm a 35 um por 12 pm a 20 pm y tienen un opérculo prominente y un pequeño botón en el extremo. Éstos son difíciles de diferenciar de los del grupo de Heterophyes'Metagommus. aunque estos últimos carecen de opérculo y del botón del extremo. Cuando no se logra una identificación, en el laboratorio deberá reflejarse (p. ej.. catalogándolos como huevos de Clonorchis/Opisthorchis/Heterophyes/ Metagonimus). Paragonimus spp. Muchas especies de Paragonimus pueden parasitär los pulmones de gatos, perros y otros carnívoros, incluidos los hombres. P westermani es problemática en muchas áreas de Asia, mientras que en América del Sur y América Central se han implicado diferentes especies, incluidas P. mexicanus. P. caliensis y P. ecuadoriensis. P. kellicotti se ha implicado en ocasiones en casos en Norteamérica, y se han descrito otras especies en África (Mariano, 1986; Pachucki, 1984; Strickland, 1999). Los gusanos adultos miden hasta 12 mm por 6 mm y Irecuentemente se hallan por parejas en el parénquima pulmonar, donde residen en una cápsula librótica causada por el huésped (Lámina 55-13E). La cápsula comunica con los bronquios, pudiendo eliminar los huevos en el espulo o en las heces. Aunque es un caracol el que sirve de primer huésped intermediario, los cangrejos de agua dulce sirven como segundos intermediarios para las metacercarias. La ingesta de crustáceos crudos o marinados puede causar la infección. Las larvas se liberan en el estómago y migran a través de la pared intestinal al peritoneo, alcanzando, a veces, los pulmones a través del diafragma. La maduración tarda aproximadamente de cinco a seis semanas y los gusanos pueden vivir durante años. Los síntomas, cuando existen, se pueden deber a la migración de las larvas a través de los tejidos o ser causados por los adultos asentados en el pulmón. No es infrecuente que los gusanos se desarrollen en zonas ectó-
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
picas como el peritoneo, tejido subcutáneo o el cerebro. La afectación de los pulmones suele asociarse con fiebre, escalofríos y eosinofília. Una vez estabilizado, los síntomas incluyen tos crónica con abundante expectoración y episodios de hemoptisis. La radiografía puede mostrar infiltrados nodulares, calificaciones o infiltrados parcheados. Los huevos que permanecen en los pulmones o en sitios ectópicos pueden producir reacción granulomatosa extensa. El diagnóstico se hace al encontrar los típicos huevos en las heces, en el esputo o en los tejidos. Los huevos de las diferentes especies de Paragonimus no se pueden distinguir fácilmente y se deben deducir según el área de origen. Los huevos, operculados y sin embrionar, miden de 80 pm a 120 pm por 45 pm a 70 pm y poseen una capa externa moderadamente gruesa de color marrón amarillenta (Lámina 55-13F). El opérculo es aplanado y suele sobresalir del resto de la pared por unos prominentes hombros. El extremo operculado está algo endosado pero carece de botón. Los huevos de Paragonimus se pueden diferenciar de los de Diphyllobothrium y Fasciola/Fasciolopsis por el tamaño. Schistosoma spp. La esquistosomiasís, o bilharziasis, está entre las más importantes enfermedades parasitarias del mundo, afectando entre 200 y 300 millones de individuos. Los machos adultos y hembras habitan en las venas mesentéricas o de la vejiga. Las especies más importantes para los humanos son S. imansoni, S. japonicum, S. mekongi. S. intercalatum y S. haematobium. Las otras especies infectantes de humanos son menos frecuentes. Los esquistosomas adultos y hembras son más finos y miden cerca de 26 mm por 0,5 mm. Los machos, que son algo más cortos, se abrazan a la hembra con unos márgenes laterales del cuerpo (el canal ginecóforo) para fecundarla. Cuando se examinan in situ, los esquistosomas son encontrados frecuentemente copulando. En este sitio de asiento producen poca o ninguna respuesta inflamatoria. Los huevos se depositan en las vénulas, donde pueden causar una gran respuesta inflamatoria que resulta en una expulsión de los huevos a la luz intestinal o a la luz de la vejiga. La patogenia está en función del sitio, el número de huevos y la respuesta de los huésped a los antígenos de los huevos. Los huevos están totalmente embrionados cuando se eliminan y listos para eclosionar cuando se depositan en agua dulce. El miracidio penetra en un caracol apropiado, donde sufre una transformación y una extensa división asexual. Tras cuatro semanas, un gran número de cercarías de cola bífida emergen del molusco. Éstas nadan durante horas y penetran fácilmente en la piel del huésped susceptible, incluidos los humanos. Tras la penetración, las cercarías, llamadas ahora esquistosomulas, pasan a la circulación atravesando los pulmones antes de llegar a los vasos mesentéricos-porta. La clínica se produce en primer lugar por la penetración de la cercaría (dermatitis cercarial). por el inicio de la puesta de huevos (esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama) y como una complicación tardía de la proliferación tisular y reparación (esquistosomiasis crónica). Tras la penetración de la cercaría, puede aparecer un exantema papular con prurito en cuestión de horas. Este es un fenómeno de sensibilización producido por una exposición previa a los antígenos de cercaría. La forma más grave de dermatitis se da en individuos que tienen una exposición repetida a esquistosomas de cercarías. La dermatitis por cercarías o picor del nadador se produce en todo el mundo y es una entidad bien conocida en EE.UU. (Hoeffler, 1974). El comienzo de la puesta de huevos por adultos entre las cinco y siete semanas puede producir una esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama, un síndrome similar a la enfermedad del suero que se da en las infecciones primarias graves, especialmente en las del S. japonicum. La respuesta al antígeno es a través de la producción de inmunocomplejos (Boros, 1989). La infección crónica produce puesta continua de huevos, pudiendo permanecer algunos en el cuerpo. Alrededor de esos huevos se producen granulomas en el intestino y en la vejiga y se van sustituyendo por colágeno pudiendo causar fibrosis y cicatrización. Los huevos atrapados en el hígado pueden causar fibrosis con obstrucción del flujo portal. A veces, los huevos se depositan en lugares ectópicos, como la médula espinal, los pulmones o el cerebro.
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El diagnóstico se hace viendo los huevos en las heces u orina por examen directo o métodos de concentración con formalina-etil acético. La concentración con sulfato de cinc no es satisfactoria para detección de los huevos pesados de esquistosomas. Los huevos también pueden detectarse en las biopsías de recto, vejiga y, a veces, del hígado (Lámina 55-14). El uso de métodos de eclosión de huevos puede emplearse a veces para determinar su viabilidad o, menos frecuentemente, para detectar la enfermedad leve. La mezcla de heces con agua destilada se coloca en un frasco cubierto por papel de aluminio para protegerlo de la luz, exponiendo a una luz brillante sólo el cuello o un lateral. Los miracidios, si estuviesen presentes, nadarían hacia la luz y se podrían detectar con una lupa. Los test serológicos pueden ser útiles para el screening en personas que han viajado a zonas endémicas y que. aun teniendo orina o heces negativas, tienen el riesgo de infección, o para monitorízar la respuesta al tratamiento. Aunque no está totalmente disponible, hay laboratorios de referencia y el CDC puede realizarlo. Generalmente, los test serológicos varían según el antígeno empleado y la metodología usada. El CDC usa el test del screening de Falcon. una técnica inmunoabsorbente con enzima fijadora (FAST-ELISA). Aquellos que son positivos en el screening se evaluarán posteriormente por inmunoblot para aumentar la especiticidad (Wilson, 1995). Schistosoma mansoni. S. mansoni se da en África, especialmente en áreas tropicales y en el delta del Nilo, Sudáfrica y Madagascar, Brasil, Venezuela, Surinam y algunas islas del Caribe, incluido Puerto Rico. Los adultos de S. mansoni viven principalmente en la vena porta y en la mesentérica inferior. La puesta de huevos en el intestino produce dolor abdominal y disentería, con abundante aparición de sangre y moco en las heces. En este momento se pueden detectar huevos en las heces. La infección crónica puede acabar produciendo fibrosis hepática e hipertensión portal, según el número de gusanos. Los huevos son más difíciles de encontrar en esta fase. Los huevos, que miden de 116 pm a 180 pm por 45 pm a 58 pm, son ovalados, con una espina lateral larga que sale del huevo cerca del extremo (Lámina 55-14A y S). Si la espina no se viese, el huevo podría estar rotado en el cubreobjetos. En el caso de que la larva sea viable, puede ser evidente el movimiento del miracidio dentro de los huevos en las muestras sin fijar. Se pueden necesitar técnicas de concentración para detectar huevos, ya que los individuos con exposición limitada o con infección crónica pueden eliminar pocos. Schistosoma japonicum. Schistosoma japonicum. que se da en China, sureste de Asia y Filipinas, produce una patología que es similar a la de S. mansoni. pero frecuentemente más grave porque se producen más huevos (aproximadamente diez veces más). Esta enfermedad ha sido erradicada en Japón, aunque aún existen reservónos animales. Los gusanos adultos viven en el territorio de la vena mesentérica superior y los huevos alcanzan fácilmente el hígado, causando fibrosis e hipertensión portal, siendo la complicación más frecuente de la infección crónica. El menor tamaño de los huevos predispone a su diseminación, especialmente al cerebro y la médula espinal. Los huevos suelen ser ovalados, de entre 75 pm y 90 pm por 60 pm a 68 pm, con una espina lateral que pasa desapercibida, por lo que es difícil de demostrar (Lámina 55-14C y D). Schistosoma mekongi. Esta especie se da en reservónos humanos y en animales de países a lo largo del río fvlekong, especialmente Camboya y Laos (Bruce, 1980). Es similar al S. japonicum, pero se diferencia por varias características biológicas y por los huevos más pequeños (de 60 pm a 70 pm por 52 pm a 62 pm), que de otro modo serían indistinguibles de los de S. japonicum. Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis urinaria se da en muchas partes de África. Oriente Medio y Madagascar. Los parásitos emigran por vía hemorroidal al plexo venoso de la vejiga, la próstata, el útero y la vagina. Uno de los síntomas más comunes y tempranos es la hematuria, especialmente al final de la micción. La enfermedad crónica puede causar dolor pélvico y cólico vesical con tenesmo vesical. El acumulo de huevos en los tejidos puede producir hipertrofia del urotelio, metaplasia escamosa y fibrosis, que puede progresar a obstrucción y, finalmente, fracaso renal. La
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
esquístosomíasís urinaria se ha asociado también a carcinoma escamoso de vejiga (Badawi. 1992). Los huevos se aislan de la orina mediante el examen del sedimento. Éstos son alargados, de 112 pm a 180 iim por 40 pm a 70 pm con una característica espina terminal (Lámina 55-14£). A veces se detectan en las heces o en la biopsia del recto. Schistosoma intercalatum. Esta especie se da en muchas partes de Álrica central y en África occidental y produce esquistosomiasis intestinal. Los huevos tienen una espina terminal similar a la del S. haematobium, pero se dan principalmente en las heces y son más largos (de 140 pm a 240 pm por 50 pm a 85 pm).
HELMINTOS TISULARES Nematodos Filarías Los nematodos filariales son parásitos comunes de los vertebrados transmitidos por artrópodos. Los adultos son largos y finos, midiendo cerca de 100 mm. y es sabido que afectan distintos tejidos, como el subcutáneo, linfáticos, vasos sanguíneos, espacio pleural y peritoneal, corazón y cerebro. Todos producen larvas denominadas microfilarias, que pueden detectarse en la sangre o en la piel, según las especies. Las microfilarias de algunas especies circulan por la sangre con una periodicidad bien definida (tanto diurna como nocturna), mientras que otras no. Las microfilarias siguen su desarrollo sólo en el apropiado artrópodo vector, usualmente un mosquito o una mosca, donde maduran a la fase infectiva. Cada larva es entonces depositada en los tejidos de un huésped definitivo cuando el vector se alimenta de sangre.
do evolucionar a linfedema y fibrosis obstructiva (Lámina 55-15A). La afectación grave de los miembros inferiores y de los genitales produce elefantiasis. En la mayoría de las áreas, las microfilarias circulan por la sangre periférica con una periodicidad nocturna que corresponde con las actividades alimenticias de los vectores habituales (mosquitos Culex. Aedes y Anopheles). La infección del pacífico Sur suele ser sin periodicidad. Los microfilarias están envainadas, aunque esto puede no ser evidente con la tinción de Giemsa. La cola es punteada y no hay núcleos en la punta. El espacio cefálico no es tan largo como ancho y los núcleos de la columna nuclear son diferenciales (Fig. 55-10; Lámina 55-15S). Pueden ser necesarias técnicas de concentración para su aislamiento, ya que las microfilarias suelen estar en pequeño número. Brugia malayi. Esta especie produce una enfermedad similar a la de W. bancrofti. aunque suele ser más moderada y con mayor frecuencia afecta a los linfáticos de los miembros superiores. Se da principalmente en la India, sudeste de Asia, Corea, Filipinas y Japón. La infección humana por especies zoonóticas se encuentran periódicamente en EE.UU. La microfilaria circula por la sangre de un modo periódico. Sus vainas se tiñen bien con Giemsa. La punta tiene un ensanchamiento con dos núcleos solitarios al final de la columna nucleada (llamados núcleos subterminal y terminal). El espacio cefálico puede ser más largo que ancho (Fig. 55-10; Lámina 55-15C). B. timones otra especie que se da en el este del archipiélago indonesio, especialmente en las islas de Timor y Flores. Sus microfilarias son muy similares a las de la B. malayi, aunque algo más largas.
El diagnóstico se hace por el hallazgo de microfilarias en la sangre o en la piel, ya que los estadios adultos son habitualmente secuestrados en los tejidos. El uso del Irotis sanguíneo grueso teñido con Giemsa o hematoxilina es la técnica habitual, aunque suelen requerirse otros procedimientos más sensibles, como un filtro de membrana, la concentración de Knott o análisis por saponificación (García, 1997). Las microfilarias pueden verse moviéndose en el examen directo de la sangre o de los fluidos tisulares. La identificación de las especies es importante debido a su diferente patogenicidad. La característica principal usada para la identificación de microfilarias incluye la presencia o ausencia de vaina, así como sus características de tinción, la morfología de la cola y la distribución de los núcleos celulares en su interior, y el tamaño del espacio cefálico, asi como la apariencia de su columna nuclear. Ya que las microfilarias de Wuchereha y Brugia suelen poseer una periodicidad nocturna, la sangre de los pacientes en los que se sospecha debe recogerse entre las 10 de la tarde y las 2 de la madrugada. Loa loa posee un periodo diurno, por lo que la sangre debe recogerse en torno al mediodía. M. ozzardiy M. Persians carecen de periodicidad. Las microfilarias de M. streptocerca y Onchocerca volvulus están presentes en la piel y se detectan por examen de biopsias. Los test serológicos para el diagnóstico de filarías linfáticas pueden ser útiles en pacientes seleccionados, especialmente en los no nativos de áreas endémicas. Tales métodos son limitados en su capacidad para diferenciar entre exposición pasada o actual y además pueden existir reacciones cruzadas con otras especies de nematodos. Los test de detección de antigenos también pueden ser útiles para la filariasis linfática, pero no suelen estar disponibles (Wilson, 1995). Wuchereria bancrofti. Esta especie, responsable de la filariasis bancroftiana, es la filaría que más frecuentemente infecta a los humanos. Las zonas endémicas son África central. África del Norte, la India, sureste de Asia y ciertas islas del Pacifico Sur, así como partes de Centroamérica y Sudamérica y las Indias occidentales. Los gusanos adultos residen en el sistema linfático, donde producen adenopatias y linfangitis crónica, pudien-
Figura 55-10. Exiremos anterior y posterior de las microfilarias más frecuentemente encontradas en humanos. í, Wuchereria bancrofti. 2. Brugia malayi. 3. Onchocerca volvulus. 4. Loa loa. 5. Mansonetla perstans. 6. Mansonella ozzardi.
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
Loa loa. Conocido como el gusano del ojo. Loa loa vive en el tejido subcutáneo. Los nematodos están migrando continuamente produciendo una reacción inflamatoria local transitoria (de 2 a 3 dias) conocida como Calabar. La aparición ocasional en la conjuntiva permite su extirpación. La loasis se da principalmente en África occidental y central, donde las moscas ciervo del género Chrysops sirven como vector. El parásito provoca una gran eosinofilia y se le ha visto a veces en EE.UU. en gente que viajó a África. La microfilaria, que circula por la sangre con una periodicidad diurna, está envainada, pero esta vaina no es visible con Giemsa. Los núcleos de la cola llegan hasta la punta redondeada. La columna nuclear es distintiva y el espacio cefálico es más corlo (Fig. 55-10: Lámina 55-150). Onchocerca volvulus. La infección por Onchocerca es una de las primeras causas de ceguera en las zonas endémicas, como África central. América central (México y Guatemala) y el norte de Sudaménca. Los vectores son las moscas negras del género SimuHum. Los gusanos adultos viven en nodulos subcutáneos fibrosos y en el tejido más profundo, pudiendo crecer hasta 40 mm de diámetro (Lámina 55-15f). Los nodulos suelen darse en la mitad superior del cuerpo de las personas infectadas en Centroamérica y en la mitad inferior del cuerpo en las personas afectadas de África. Los gusanos adultos producen microfilarias que emigran por la piel. Las complicaciones son secundarias a dicha migración, causando múltiples formas de dermatitis. Los movimientos de las microfilarias por la superficie del ojo pueden causar queratitis, opacidad corneal y daños en las cámaras del iris causando asi ceguera por infecciones repetidas. El diagnóstico se hace al hallar las típicas microtilarias en los raspados cutáneos o biopsias cutáneas, preferiblemente de la región escapular o de la cresta iliaca. Como alternativa se puede examinar el exudado de la piel cicatricial o el aspirado de los nodulos (Beaver. 1984). Las microfilarias en las preparaciones teñidas pierden tanto la vaina como los núcleos de la cola (Fig. 55-10). Mansonella spp. Hay muchas especies de Mansonella que infecta a los humanos, pero se las considera como mínimamente patógenas. Sin embargo, las microfilarias se deben diferenciar de las auténticas filarias patógenas. M. ozzardi se halla en el centro de América y Sudamérica y en algunas zonas del Caribe. Los parásitos adultos residen en los tejidos subcutáneos. M. perstans se da en áreas de África tropical y. a veces, en Sudamérica. Se cree que los adultos residen principalmente en las cavidades corporales y mesenténcas. Los microfilarias carecen de vaina y circulan por la sangre sin evidencia de periodicidad. La microfilaria de M. ozzardi tiene una cola fina, afilada, sin núcleos, mientras que la cola de M. Persians es ancha y abrupta, con núcleos que llegan hasta la punta (Fig. 55-10; Lámina 55-15F). M. streptocerca, que se halla en África tropical, se puede confundir con O. volvulus, ya que tanto los adultos como las microfilarias se localizan en la piel y en los tejidos subcutáneos. También pueden causar dermatitis. Las microfilarias que se encuentran en las muestras cutáneas carecen de vaina y poseen un pliegue en la cola con núcleos hasta la punta. Todas las especies de Mansonella se transmiten por mosquitos del género Cuhcotdes. Filarias zoonóticas. Ciertos nematodos filanales de los géneros Dirolilaria y Brugia, que habitualmente parasitan a mamíferos salvajes y domésticos, pueden afectar a humanos. Dirofilaria immitis está muy extendida y la infección humana está bien documentada. La larva transmitida por mosquito migra hasta el lado derecho del corazón. Cuando el gusano muere, se transporta hasta una arteriola pulmonar, causando un nodulo granulomatoso que puede verse como una lesión con forma de moneda en la radiografía de tórax. El diagnóstico suele hacerse por histología de dicho nodulo. Otras especies de Dirofilaria como D. tenuis. D. repens y D. ursi suelen producir nodulos subcutáneos. Estos nodulos se han descrito en múltiples sitios del cuerpo, como la cara, la conjuntiva y la mama y se suelen quitar con cirugía. El examen histológico muestra una gran reacción inflamatoria mixta rodeando a un gusano muerto. Los criterios para identificar las filarías zoonóticas en la histología se pueden encontrar en otros textos (Connor, 1997; Ohnel, 1995: Gutiérrez, 2000).
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Otros Dracunculus medinensis. Los gusanos adultos viven en el tejido subcutáneo y se hacen clínicamente evidentes cuando la hembra migra a la superficie cutánea y produce ampollas, habitualmente en los miembros inferiores. Cuando las extremidades se meten en el agua, las ampollas se rompen y liberan múltiples larvas móviles. El zooplanclon ingiere las larvas, que después maduran a estadios infectivos y se transmiten nuevamente a humanos al tragar accidentalmente el zooplancton del agua. Es endémico de áreas de África, Oriente Medio y Asia y puede causar cicatrices cutáneas desfigurantes con riesgo de sobreinfección bacteriana grave posterior. Se han hecho grandes esfuerzos de control en los últimos años para erradicar este parásito (CDC, 1992). El diagnóstico se hace al ver a la hembra en la superficie cutánea y las larvas en el Huido de las ampollas. El gusano puede ser cuidadosamente extraído en varios días, pero procurando no dañarlo. La muerte de un gusano in situ produce gran reacción inflamatoria y posterior sobreinfección bacteriana. Angiostrongylus cantonensis y Angiostrongylus costaricencis. La menmgoencefalitis eosinofílica humana producida por A. cantonensis se produce tanto en epidemias como esporádicamente en áreas del sur del Pacífico, sudeste de Asia y Taiwan. Los parásitos maduros se suelen encontrar en las arterias pulmonares de las ratas. Las larvas migran hasta la traquea, donde se eliminan con las heces. Se transforman en infectivas dentro de babosas o caracoles terrestres y. cuando son comidas por un huésped roedor, emigran por el cerebro antes de madurar en las arterias pulmonares. Los humanos lo adquieren al comer caracoles o cangrejos o camarones crudos, que pueden actuar de huéspedes transportadores, así como vegetales contaminados con moluscos infectados. En los humanos, las larvas de A. cantonensis migran al sistema nervioso central, causando una meningitis con gran eosinofilia en el líquido cefalorraquídeo (Alicata. 1991). El diagnóstico se hace tanto por la clínica como por la anamnesis, aunque la larva se ha aislado ocasionalmente en el liquido cefalorraquídeo (Kubersky, 1979). A. costaricencis se da en América central y Sudamérica (LonaCortez. 1980). El parásito, responsable de la forma intestinal de la angiostrongiliasis. suele residir en las arterias mesentéricas del íleon y del ciego de los roedores. La infección humana se da en esas mismas localizaciones, causando inflamación granulomalosa y abdomen agudo. El diagnóstico se hace por el examen histológico de la pieza quirúrgica y el hallazgo de huevos en los tejidos (Strickland. 1999). Trichinella spiralis. La infección por Trichinella humana se da en todo el mundo, aunque su incidencia en EE.UU. está actualmente descendiendo, con menos de cien casos al año. Los humanos adquieren la infección por la ingesta de carne de cerdo cruda o, a veces, con la carne de oso, que posee larvas infectivas. Los gusanos ingeridos maduran en el intestino y producen nuevas larvas en dos a tres semanas. Durante esta fase aparecen síntomas gastrointestinales que duran varios dias. Posteriormente las larvas pasan a los linfáticos y vénulas, alcanzando así la circulación sistémica. Invade principalmente los músculos esqueléticos, donde sufre el desarrollo y se encapsula. Durante la fase de migración y encapsulación puede aparecer fiebre, dolor muscular, dificultad respiratoria, edema periorbital y eosinofilia. dependiendo de la cantidad inoculada. Tras enquistarse, los síntomas son mínimos. Asi, pueden persistir viables durante años, aunque a veces se calcifican. El diagnóstico se hace con la anamnesis y la clínica, y se confirma mediante la biopsia del músculo esquelético, especialmente del gastrocnemio o del deltoides (Lámina 55-11E y 11F). Los test indirectos incluyen la medición de la creatina fosfocinasa, que suele estar elevada, y la detección de anticuerpos por floculación con bentonita o con EIA. De éstos, el más específico es la creatina fosfocinasa y el EIA es el más sensible (Wilson, 1995). Larva migratoria. La larva migratoria se produce por la migración de larvas de ciertas uncinarias, ascáridos y especies de Strongyloides a través de los tejidos. El síndrome varia según la especie causante, el número de gusanos y los tejidos afectados.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
La larva migratoria cutánea (CLM), o picor del suelo, se produce por la migración cutánea de uncinarias de perros o gatos del género Ancylostoma, que penetra la piel pero no puede tener el habitual patrón de maduración. Aparecen en la piel tractos serpiginosos, eritematosos y pruriginosos en zonas expuestas al contacto con el suelo. Especial problemática surge en los climas húmedos y cálidos, donde los huevos y larvas de estas uncinarias viven más tiempo. Algunas especies de Strongyloides que parasitan animales salvajes pueden causar una dermatitis similar. La larva visceral migrans (VLM) suele estar causada por el áscaris canino Toxocara canis y, en menor grado, por Toxocara cali, del gato doméstico. Los niños suelen infectarse por la ingesta accidental o intencional de tierra contaminada con heces de perros o gatos. Tras la eclosión de la larva, ésta es incapaz de completar su ciclo vital y comienza una migración prolongada a través de diferentes órganos y tejidos. Los niños pueden debutar con retraso del crecimiento y aparición de fiebre, hepatomegalia, neumonilis, eosinofilia e hipergammaglobulinemia. Una reacción inflamatoria en la retina puede simular un retinoblastoma, un tumor maligno con el que se debe hacer el diagnóstico diferencial. El diagnóstico de VLM se suele realizar mediante los hallazgos clínicos, ya que el parásito raramente se consigue aislar. Los test serológicos pueden ser útiles para confirmar la sospecha y actualmente se recomienda el EIA, que usa los antígenos de la fase larval (Wilson, 1995). Un síndrome similar al VLM puede ser causado por especies de Gnathostoma. que inlectan el estómago de mamíferos. La infección humana es más frecuente en el sudeste de Asia, pero también se han descrito casos en México y Ecuador. Este parásito utiliza un cefalópodo como primer huésped intermediario y peces y anfibios como huéspedes secundarios. También pueden servir como huéspedes diferentes clases de reptiles, pájaros y mamíferos. Las larvas pueden migrar a través del tejido subcutáneo, produciendo inflamación transitoria y, ocasionalmente, invasión del sistema nervioso central. La existencia de lesiones migratorias y una historia de ingesta de pescado crudo pueden ayudar para el diagnóstico clínico. Capillaria hepática. Aunque suele parasilar roedores, a veces causa enfermedad en humanos, especialmente en niños, en los que puede simular una VLM, hepatitis, absceso amebiano hepático u otras enfermedades patológicas. En el huésped roedor, los huevos se digieren y producen una larva migratoria que llega al higado, donde madura y pone huevos en el parénquima. Cuando el hígado es ingerido por un depredador, los huevos se eliminan en las heces y contaminan el suelo. Los niños están en riesgo para adquirirlos si ingieren la suciedad. En las áreas endémicas el diagnóstico se hace por el examen de biopsia hepática o por autopsias. Los huevos son fácilmente reconocibles en la biopsia al tener paredes estriadas gruesas. Anisakis. Pseudoterranova y Eustrongyloides spp. La ingesta de pescado crudo, aunque se considere una exquisitez en algunas partes del mundo, tiene como resultado un incremento en el número de casos de inlecciones por nematodos del pescado. Anisakiasis y Pseudoterranova son parásitos comunes gastrointestinales de mamíferos marinos, y las fases infectivas se encuentran en diferentes peces de agua salada, salmón y calamares como huéspedes intermediarios. Los pequeños crustáceos similares al camarón sirven como primer huésped. Cuando se digieren, esta larva penetra la pared gástrica o del intestino, produciendo dolor abdominal agudo. La infección por Anisakis se puede diagnosticar por presunción basándose en una anamnesis y hallazgos clínicos, y se puede confirmar mediante el aislamiento de un gusano en la endoscopia o por la presencia de un granuloma eosinólilo que contenga un nematodo en una de las piezas quirúrgicas. Las especies de Anisakis tienden a ser más productoras de enfermedad invasiva, mientras que Pseudoterranova spp. tienden a ser tosidas o vomitadas intactas (Lámina 55-11 £7 y 11H) (Sakanari. 1989). La larva de Anisakis es difícil de identificar (Binford, 1976). Se han descrito escaso número de infecciones por Eustrongyloides spp. en personas que ha comido sushi casero. Estos parásitos suelen infectar pájaros que se alimentan de pescado, pero en humanos la larva rojo brillante invade la cavidad abdominal, precisando tratamiento quirúrgico (Wittner. 1989).
Cestodos Son muchas las especies de cestodos que afectan a humanos en sus estadios de larva y pueden causar seria enfermedad. Las más habituales son fácilmente distinguibles de las otras y tienen patrones de transmisión únicos Cuando se ven en secciones tisulares, las larvas y adultos contienen cuerpos laminados basofilos conocidos como corpúsculos calcáreos, importantes para su identificación. Cisticercosis. La infección humana con la (ase larval del gusano plano del cerdo, Taenia solium. se da en todo el mundo tras la ingesta accidental de huevos de un adulto. Es especialmente prevalente en México y el resto de América latina, Europa, la India y Asia. La mayoría de los casos en EE.UU. se originan en zonas endémicas, aunque en los últimos años el número de casos de origen local ha aumentado (Richards, 1985). Los huevos se pueden ingerir accidentalmente con comida contaminada o con agua; posteriormente eclosionan en el tracto gastrointestinal penetrando los embriones en la mucosa intestinal, que diseminan posteriormente por el torrente sanguíneo a sitios a distancia, especialmente el músculo esquelético y también al corazón, cerebro u ojos, donde la clínica inflamatoria puede ser muy evidente. Una complicación frecuente en áreas endémicas son las crisis y frecuentemente es el síntoma de presentación (Lámina 55-16/1). El diagnóstico suele hacerse con los hallazgos clínicos en las zonas endémicas, pero puede ser más difícil en áreas no endémicas. El uso de la tomografía computanzada (TC) es muy útil, pero no suele estar disponible en la mayoría de las áreas endémicas. La radiografía es útil para ver la existencia de quistes calcificados, pero no para el diagnóstico de infección reciente. El aislamiento de cisticercos intactos mediante cirugía confirma el diagnóstico. El cisticerco, o gusano vesiculado, es un saco lleno de líquido translúcido, oval que contiene un único escólex que mide 5 mm o más de diámetro (Lámina 55-16S). Entre los test serológicos, el inmunoensayo con glucoproteinas disponible por el CDC tiene alta sensibilidad y especificidad, superando al EIA (Díaz. 1992). Desafortunadamente, estos test no diferencian entre infección activa e inactiva, por lo que no son útiles para monitorizar la respuesta al tratamiento. La existencia de cisticercosis en personas de un área no endémica y sin clara historia de viaje obliga a la investigación de la exposición de los manipuladores de alimentos relacionados con el paciente, o de la posibilidad de infección con una especie diferente de Taenia (Schanz, 1992). Hidatidosis. La infección humana con estadios larvales de gusanos planos del género Echinococcus puede tomar una de estas tres formas: hidatidosis unilocular causada por E. granulosus. hidatidosis multilocular o alveolai causada por E. multilocularis e hidatidosis poliquística causada por E. vogeli (Thompsom. 1995). Los huéspedes definitivos de estos minúsculos gusanos son los perros. Lo que pierden de tamaño, lo ganan en número de individuos, con varios cientos o miles de gusanos que ponen gran número de huevos en un solo huésped. Los huevos se eliminan por las heces y se digieren por huéspedes intermediarios, como la oveja, la vaca, el cerdo, los roedores y otros herbívoros. Los humanos, especialmente los niños, se infectan tras la ingesta accidental de huevos. Los huevos se rompen en el intestino y el embrión penetra la pared intestinal y pasa a la sangre. Aunque la mayoría de las hidátides se desarrollan en el higado, algunas se diseminan a otros sitios. El desarrollo de los quistes es lento y puede durar años para lograr un tamaño de 10 cm o 15 cm de diámetro. En el huésped secundario, los quistes contienen numerosos protoescólex, que proliferan a partir de la membrana germinal. E. granulosus es el más importante causante de patología humana, especialmente en áreas de cuidadores de ovejas o vacas, incluidos los EE.UU. donde los perros son los huéspedes definitivos. La hidatidosis unilocular se desarrolla como un quiste único en el higado y, posteriormente, en el pulmón u otro sitio. Los quistes están llenos de un liquido claro que contiene capsulas germinales y numerosos protoescólex pudiendo llegar a ser miles (Lámina 55-16C y D). La clínica es la derivada del lento crecimiento de la masa, aunque la infección en el sistema nervioso central se hace aparente antes que en otras zonas. El diagnóstico se basa en la presentación clínica y la his-
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
toría junto con el uso de radiografía o TC y la ecografía. Los test serológicos son muy útiles para confirmar el diagnóstico y constan de un test de screening como EIA o el IHA seguido, si fuese positivo, de un test de confirmación como el inmunoblott o el gel de difusión (Wilson. 1995). La sensibilidad va desde el 60% al 90% según cada caso. Los falsos positivos se pueden dar en la cisticercosis, aunque la presentación clínica debería evitar la confusión. La aspiración de contenido de los quistes es potencialmente peligrosa, ya que el vertido de su contenido puede producir diseminación o riesgo de shock anafiláctico, pero si se realiza, revelaría una mezcla de protoescólex, cápsula germinal, garfios y corpúsculos calcáreos. E. multiloculans causa hidatidosis multilocular o alveolar en las regiones del norte de Europa y Rusia, y en Alaska. Canadá y el norte de EE.UU. Los huéspedes miermediarios incluyen una variedad de pequeños roedores; los zorros, los lobos y los perros son los huéspedes definitivos. La infección humana se da en el hígado, donde las hidátides se desarrollan como un quiste invasivo que se introduce en el tejido con un patrón alveolar. Aunque la membrana germinal prolifere en el hígado, los protoescólex carecen de desarrollo, La imagen puede asemejarse a la de un hepatocarcinoma. Los test serológicos que usan los antígenos de E. granulosus son útiles para el diagnóstico. El uso diferencial de antigenos de ambos parásitos parece tener un gran potencial para la diferenciación entre estas dos enfermedades (Wilson, 1995). £ vogeli produce un quiste hidatidico poliquíslico que es invasivo, pero se diferencia de £ multilocularis en que £ vogeli produce tanto membrana germinal como protoescólex. La enfermedad está limitada a Latinoamérica, donde los roedores completan el ciclo vital (D'Alessandro. 1979). La hidatidosis poliquíslica en Sudamérica puede también ser causada por E. oligarlhus, un parásito de felinos y roedores. Esta especie es morfológicamente similar a £ vogeli y en el pasado se confundieron casos (D'Alessandro. 1995). Esparganosis. La esparganosis está causada por la larva del género Spiromelra. emparentada con Diphyllobothrium spp. Habitualmente parásita perros y gatos y están en Asia (Spirometra mansoni) y Norteamérica ¡Spirometra mansonoides). Los ciclos vitales son similares a los de Diphyllobothrium. los cefalópodos sirven como primer huésped intermediario para la larva procercoide y el pescado como segundo huéspedes para la larva pleurocercoide. Los humanos se infectan con estos estadios larvales a través de la ingesta de cefalópodos en el agua o con el pescado crudo o poco cocinado. El uso de ranas o serpientes como cataplasmas también puede transferir larvas. La esparganosis se suele presentar como un edema local o migratorio a nivel subcutáneo junto con eritema y dolor; a veces se da una infección cerebral. La exploración quirúrgica puede revelar un delicado gusano, delgado y de color marfil y de escasos centímetros de largo. Los cortes axiales demuestran un grueso tegumento con profundos pliegues y un parénquima con marcadas fibras musculares. No se han visto cavidades corporales en los nematodos y los corpúsculos calcáreos son numerosos (Lámina 55-16F) (Orihel, 1995; Gutiérrez, 2000). Coenurosis. La tenia intestinal de perros y gatos (principalmente T. muíticeps y T. serialis) produce una larva en los huéspedes intermediarios conocida como coenuro. Este estadio consta de un largo saco transparente (de unos 10 cm) que contiene muchos escólex que surgen de una membrana germinal que se invagina en quistes llenos de líquido (Lámina 55-16E). Las ovejas son los huéspedes intermediarios de T. multiceps. y los roedores, liebres y conejos lo son para T. serialis. aunque los humanos juegan este papel por la ingesta accidental de huevos producidos por gatos y perros domésticos. Como un cisticerco. el coenuro puede desarrollarse en cualquier órgano causando una enfermedad similar. El diagnóstico se suele hacer por el examen de quistes extirpados o en secciones tisulares. La presencia de múltiples escólex invaginados en una sola vesícula lo diferencian del resto de los cestodos larvales.
Tremátodos Todos los tremátodos que habitan en el hígado, el pulmón y la sangre y que maduran en humanos producen huevos que generalmente salen del cuerpo
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por las heces, la orina o el esputo. Dada su localización extraintestinal, estas lombrices y sus huevos se pueden encontrar en los tejidos, como hallazgo o asociados a clínica. Los adultos de F. hepática. C sinensis y O. vivernm se pueden hallar en el hígado y en las vías biliares y. a veces, en sitios ectópicos. La presencia de los típicos huevos, tanto libres en los tejidos como dentro del útero de los helmintos, frecuentemente facilita la identificación definitiva. El adulto de Paragonimus spp. es el que reside principalmente en el pulmón, pero puede hallarse en sitios ectópicos como el cerebro y el tejido subcutáneo, produciendo abscesos frecuentemente asociados con una gran producción de huevos. Los esquistosomas adultos viven en los vasos sanguíneos, principalmente en el territorio de la vena mesentérica interior (S. mansoni). vena mesentérica superior (S. japonicum y S. mekongi) y en el plexo vesical (S. haematobium). Aunque los adultos no suelen encontrarse en las biopsias tisulares. los huevos pueden encontrarse en gran número de tejidos del intestino, del hígado y de la vejiga (Lámina 55-14 B, Dy F). Los huevos pueden diseminarse por la sangre a otros locos, incluidos el cerebro, la médula espinal, los pulmones, el corazón, los ríñones y el bazo. Los huevos de S. japonicum tienen tendencia especial a diseminarse debido a su pequeño tamaño y al gran número de huevos producido. La identificación de los huevos depende del reconocimiento de su tamaño típico y de su morfología en los tejidos adecuados.
ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA
Los artrópodos comprenden un gran y diverso grupo de organismos, algunos de los cuales tienen una gran importancia clínica o económica. Esto es debido a que son una importante causa de morbimortalidad en los humanos y para sus animales domésticos, con serias pérdidas económicas para la agricultura. Aunque quizá los artrópodos son más conocidos entre los clínicos por su capacidad para transmitir agentes infecciosos, como son virus, bacterias (Rickettsia, espiroquetas y otros), protozoos y algunos helmintos, éstos también pueden causar patología directamente por invasión tisular. envenenamiento, formación de vesículas, pérdida de sangre y reacciones alérgicas. El miedo exagerado a artrópodos (entomofobia) y los delirios de infestación (delirio de parasitosis) son neurosis no infrecuentes que pueden afectar a algunos individuos. Las especies que directa o indirectamente causan enfermedad humana son representativas de todas las clases de artrópodos (Tabla 55-10). En esta sección, se presenta una aproximación que se puede usar en el laboratorio clínico cuando se evalúan muestras con artrópodos, seguida por una breve descripción de cada grupo de artrópodo con relevancia médica. Existe una variedad de textos generales y especializados disponibles para una completa cobertura del campo de la entomología (Beaver. 1984; García. 1997: Goddard. 1996: Harwood. 1979; Kettle. 1993; Lane, 1993; Centro Nacional de Declaración de Enfermedades, 1969; Strickland, 1999).
Características biológicas Los artrópodos se caracterizan por una simetría bilateral y un cuerpo segmentado, varios pares de apéndices articulados y un caparazón rígido que se va modificando durante el crecimiento. El desarrollo va desde huevos hasta adultos a través de una metamorfosis gradual (huevo, ninfa y adulto) o completa (huevo, larva, pupa y adulto). Las chinches, los revúviros, los piojos y las cucarachas son ejemplos de insectos que sufren una metamorfosis gradual. La mosca, el mosquito, las pulgas, las hormigas, las abejas y las avispas, asi como los escarabajos, sufren una metamorfosis completa. Las formas larvales similares a los gusanos se hacen pupa y luego adultos. Los arácnidos sufren cambios de desarrollo muy similares al proceso gradual de metamorfosis. Las larvas de estos artrópodos, que con frecuencia, sufren una metamorfosis completa, suelen ser los más difíciles para identificar y se deben enviar a un especialista.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 55-10 Clasificación de los artrópodos de importancia médica Clase Insecia (insectos) Orden Anopleura (piojos) Orden Siphonaplera (pulga) Orden Diclyoplera (cucarachas) Orden Hemiptera (chinches, revúviros) Orden Hymenoplera (hormigas, avispas, abejas) Orden Coleóptera (escarabajo) Orden Lepidoptera (orugas, mariposas, polillas) Orden Díptera (moscas, ácaros. mosquitos) Clase Aracnida (arácnidos) Subclase Scorpiones (escorpiones) Subclase Araneao (arañas) Subclase Acari (garrapatas, ácaros, ninguas) Clase Diplopoda (milpiés) Clase Chilopoda (ciempiés) Clase Crustácea (crustáceos) Orden Copepoda ( c e f a l ó p o d o s ) Orden Decapoda (cangrejos) Clase Pentastomida (gusanos de la lengua)
Mecanismos de lesión Invasión tisular directa. La invasión de la superficie de tisular (conocida como inlestación) se produce con gran variedad de artrópodos, de los que los ácaros, la pulga y algunas larvas de dípteros son los más comunes. La invasión de tejidos profundos y las cavidades (referidos como infección) se da principalmente con los gusanos y. rara vez. con las larvas de pentastómidos. La invasión por larvas de dípteros, llamada miasis. puede darse en tejidos vivos o desvitahzados según las especies. Envenenamiento. Muchos artrópodos pueden inyectar saliva o veneno con sus mordiscos o picaduras. Para la mayoría de las personas produce sólo una reacción local tisular. pero puede producir serias reacciones, como anafilaxia debido a una previa sensibilización a la toxina en cuestión. Las picaduras de heminópteros (hormigas, abejas y avispas) y las de escorpiones son las más agresivas (Reisman, 1994). Las mordeduras de ciertos artrópodos, especialmente los ciempiés, los mosquitos, las moscas, las chinches, los revúviros, las chinches asesinas, los piojos, las pulgas, las garrapatas y los ácaros, también pueden ser tóxicas, causando reacciones locales o sistémicas. Casi todas las arañas son venenosas, pero sólo un pequeño grupo (arañas viudas, arañas violín y algunas tarántulas) pueden causar peligro para la salud humana. Causas de envenenamiento menos (recuentes pero también descritas son motivadas por la exposición a los pelos urticantes de ciertas orugas o larvas de escarabajos.
biana, giardiasis y gusanos. Los mecanismos que intervienen en la transmisión biológica varían desde la simple amplificación en el artrópodo vector hasta cambios más complejos del ciclo vital del parásito. Tanto garrapatas como ácaros intervienen en la transmisión de ciertas bacterias (Rickellsia. Ehrlichia. espiroquetas y otras), protozoos (Babesial y virus. Entre los insectos, los piojos transmiten bacterias {Rickettsia, Bartonella y Borrelia): los revúviros transmiten Trypanosoma: las pulgas transmiten agentes de peste, tifus y gusanos planos caninos; y los dípteros transmiten arbovirus. malaria. Trypanosoma, Leishmania. filarías y bacterias. Reacciones de hipersensibilidad. La mayoría de las reacciones graves de las picaduras suelen ser producidas por hipersensibilidad alérgica. Las picaduras de heminópteros son las responsables de la mayoría de las muertes por artrópodo y suelen ser por hipersensibilidad tras una exposición repetida al veneno (Reisman. 1994). La alergia también puede exacerbarse tras la exposición a la saliva, excrementos o partes del cuerpo de los ácaros. garrapatas, piojos, chinches, orugas, polillas y mariposas. Se puede producir asma y fiebre elevada como respuesta a estos alérgenos en el ambiente (Frazier, 1980). Manifestaciones psicológicas. La entomofobia se define como un irrazonable o excesivo miedo a la vista o al contacto con artrópodos Aunque esto puede causar alteraciones en las actividades habituales de una persona, rara vez es incapacitante. El delirio de parasitosis es un trastorno emocional más serio por el que una persona está convencida de que estaba infectada con parásitos o artrópodos a pesar de la evidencia objetiva de lo contrario. Si esto progresase, podría resultar en una pérdida de empleo, divorcio, abuso de pesticidas y mudanzas repetidas. Las visitas a los servicios de salud suelen ser numerosas, aunque insatislactoñas. El problema puede empezar tanto en el hogar como en el trabajo y se puede transferir del uno al otro. El delirio puede ser tan convincente que puede ser creído por otros miembros de la familia o amigos o tomarse como propio. El paciente puede remitir muchas muestras, como piel, pelo, mocos o pelusa al laboratorio. Es obligación del laboratorio examinar dicho material para descartar una auténtica infestación. El misterio de la irritación y el picor puede deberse a picaduras de ácaros, piojos, pulgas o chinches no reconocidas o bien a insectos y ácaros traídos por un roedor o pájaros en el área habitada por el paciente. Antes de descartar tales causas, se deben buscar y excluir su presencia (Lynch. 1993).
Aproximación de laboratorio a la identificación de artrópodos
Vesiculación. Algunos de los milpiés más largos son capaces de rociar o lanzar una sustancia química vesicante (productoras de ampollas) desde unas glándulas localizadas en cada segmento del cuerpo. Esto es especialmente irritante si alcanza la conjuntiva. Los escarabajos vejiga son llamados así por su capacidad de descargar fluidos vesicantes (cantaridina. el ingrediente aclivo de la mosca afrodisíaca española) cuando se les manipula.
Las muestras de artrópodos son frecuentemente dirigidas al laboratorio clínico tanto por médicos como por pacientes con la esperanza de que sean identificados, pero pocos trabajadores de los laboratorios reciben algo más que un entrenamiento superficial en entomología. Sin embargo, los especialistas pueden tener acceso a textos y claves que permiten una identificación de los grupos encontrados con más frecuencia, especialmente los ectoparásilos (pulgas, ácaros. piojos y garrapatas). De mayor importancia es la capacidad del personal del laboratorio para reconocer las raras situaciones en las que se debe buscar la opinión de un experto. Esto es de especial relevancia en las ocasiones en las que se están lomando importantes decisiones terapéuticas y de pronóstico. Los laboratorios de salud pública local o estatal suelen tener expertos disponibles o conocen a personas entrenadas en entomología médica en institutos educacionales, o museos u oirás agencias, incluido el CDC.
Pérdida de sangre. Los artrópodos responsables de causar pérdidas de sangre a los hombres o animales domésticos incluyen chinches, revúviros. pioios. pulgas, moscas, mosquitos, garrapatas y ácaros. Aunque no suele suponer un nesgo para la vida, tiene el riesgo de transmisión de agentes infecciosos.
Las muestras recibidas en el laboratorio suelen ser organismos intactos, raspados cutáneos, tejidos, esputos, orina o heces. También se pueden remitir objetos personales como plantillas, agua, ropa, ropa de cama y alfombras, entre otras. No es raro que se remitan artrópodos hallados en el inodoro tras la micción o la deposición. En la mayoría de los casos, la presencia de estos organismos es coincidencia y no implica infección.
Transmisión de agentes infecciosos. Muchos artrópodos juegan un papel muy importante en la transmisión mecánica o biológica de agentes infecciosos. La mosca doméstica puede ser responsable de la transmisión del agente de disenteria bacilar, cólera, tifus, diarrea viral, disentería ame-
La correcta muerte y conservación de los artrópodos es importante para preservar sus características, que luego serán necesarias para su identificación. Los artrópodos pequeños, sin alas, especialmente los ectoparásitos (piojos, pulga, garrapatas y ácaros). larvas (gusanos, orugas, larvas), arañas
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PARASITOLOGÍA MEDICA
y escorpiones se deben colocar directamente en alcohol etílico al 70%-80%. Las grandes formas larvales se matan mejor en agua caliente (sin hervir), para que sus cuerpos se extiendan sin contraerse antes de meterlos en alcohol. Los tejidos afectados u otros escombros se deben manipular con delicadeza o lavar antes de conservarlos. Las formas más pequeñas (acaras, pequeñas garrapatas, pulgas, moscas de arena) se deben preparar como muestras permanentes. Los insectos alados, especialmente los mosquitos adultos y moscas, se deben matar exponiéndolos a humos de etil acético o cloroformo y preservarlos en seco para mantener la información taxonómica recogida en las escalas corporales y de las alas. Tales artrópodos suelen pinchar y secar, seguido por un almacenamiento en cajas herméticas protegidas con naftalina o diclorobenceno. Más detalles de la recolección, preservación y preparación de las muestras artrópodos se pueden encontrar en otros textos (Beaver. 1984; García. 1993; Lañe, 1993; Steyskal, 1987).
Insectos Los insectos comprenden más del 90% de todas especies de artrópodos descritos, aunque sólo algunas especies son responsables de patología humana. Los miembros de esta clase se diferencian de los demás artrópodos por poseer el cuerpo dividido en tres partes (cabeza, tórax y abdomen), un par de antenas, tres pares de patas y uno, dos o ningún par de alas. Es la única clase de artrópodos en los que se ha desarrollado el vuelo. Piojos. Los piojos están aplanados dorso-ventralmente, sin alas, con unas características pinzas en el final de cada pata que les permite fijarse a los pelos o a la ropa (Lámina 55-17/1 y S). Todas las especies se alimentan de sangre intermitentemente y pueden causar una dermatitis poco explicada. Los huevos, conocidos como liendres, se depositan en los pelos o en la ropa, según la especie. Aunque se les nombra según su principal localización, no siempre están confinados a esa localización. El piojo de la cabeza, Pediculus capitis. y el de cuerpo, Pediculus humanus. son indistinguibles por personal no especialista. Son más largos que anchos y miden hasta 3 mm. La dilerencias biológicas son aparentes. P. humanus es el único que transmite el agente del tifus, la fiebre de las trincheras y la fiebre recurrente (Kim. 1986). La infestación por ambos tipos se da en gente acinada y con poca higiene. Los niños en edad escolar tienen mayor riesgo para adquirir el piojo de la cabeza, al compartir gorros, ropa y peines (Orkin, 1985). Las liendres de piojo de la cabeza se colocan principalmente en el eje del pelo, y las del corporal se colocan en la ropa. Los productos de cuidado del pelo, las micosis del pelo, así como otros objetos, pueden simular liendres y su diferenciación es importante. Las liendres miden 1 mm y, cuando aún no han eclosionado, poseen un opérculo intacto (Lámina 55-17C). La transmisión se da principalmente al compartir ropa infestada, así como ropas de cama, ya que el piojo corporal tiende a poner los huevos en racimos especialmente a lo largo de las costuras o dobleces de la ropa. El piojo del pubis. Phlhirus pubis, es diferente de los otros. Es más redondeado (mide hasta 2 mm de diámetro), y el abdomen es más parecido al de un cangrejo. Su primer par de patas es mayor y más largo que las demás patas (Lámina 55-17S). Estos piojos y sus liendres se hallan principalmente en el vello púbico. pero pueden extenderse al tórax, las axilas y a la cara. La transmisión suele producirse durante el acto sexual. Pulgas. Las pulgas son pequeños ectoparásitos (de 1 mm a 2 mm). sin alas y lateralmente aplanados que se alimentan de sangre (Lámina 5517D). Sus largas y musculosas patas están adaptadas para saltar de grandes distancias. Todas las pulgas que alectan a humanos son parásitos de otros mamíferos o aves de corral. La infestación se produce por la exposición a animales domésticos y mascotas. Las especies más nocivas son la pulga del perro (Ctenocephalides canis). la del gato (C. Felis), y la humana (Pulex irrilans). Algunas personas crean alta sensibilización a las mordeduras de las pulgas, mientras que a otras casi no les afecta. Las pulgas de gatos y perros también son huéspedes intermediarios de gusanos pla-
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nos de D. caninum y, menos frecuentemente, de H. diminuta y H. nana. Ya que las larvas de estas especies frecuentemente se dan en los lechos de los animales, alfombras y muebles, su erradicación puede requerir la fumigación y su limpieza. La pulga de la rata oriental. Xenopsyila cheopis. es una especie muy importante, ya que transmite el bacilo de la peste y el agente del tifus murino. Aunque parásita en muchas especies de ratas, estas pulgas atacan con facilidad a humanos. La pulga ningua o de las arenas (Junga penelrans) se halla en América central y Sudamérica y regiones de África tropical. La pulga hembra se une a la piel especialmente entre los dedos del pie y bajo las uñas, donde crecen hasta el tamaño de un pequeño guisante. Tras la puesta de huevos, la pulga muere, produciendo una respuesta inflamatoria con el riesgo de una sobreinfección bacteriana. La tungiasis se diagnostica al identificar la porción oscura del abdomen de la pulga saliendo de la piel en una lesión alargada (Beaver, 1984; Goddard, 1996: Lañe, 1993). Cucarachas. Las cucarachas se han adaptado rápidamente a la vida de los humanos compartiendo nuestra comida, cobijo y nuestro calor. Aunque son unos compañeros algo pesados, éstos son potencialmente transportadores de patógenos lecales debido a su capacidad de moverse rápidamente desde los desagües a las cocinas o despensas. Además de transmitir bacterias, pueden extender poliovirus. virus de la hepatitis, protozoos intestinales, incluida Entamoeba histolytica. y muchas especies de nematodos entéricos. También se pueden dar alergias y asma en algunos individuos tras la exposición a excrementos, caparazones o partes del cuerpo de las cucarachas (Goddard, 1996). Chinches y revúviros. Las chinches (familia Cimidiae) y los revúviros (familia Reduviidae) son insectos chupadores de sangre con probóscides largas y estrechas que las doblan bajo el cuerpo cuando no las usan. Las chinches (Cimex lectulanus y Cimex hemipterus) son marrones rojizas, aplanadas dorso-ventralmente, sin alas, de unos 5 mm de longitud (Lámina 55-17£). Tienen una distribución cosmopolita y atacan a la mayoría de los mamíferos, alimentándose principalmente por las noches. Durante las horas del día se esconden ba|o los colchones, el papel de las paredes las tablas del suelo. Aunque no se les conocen como transmisores de enfermedades, sus mordiscos pueden ser dolorosos, con ampollas, según la sensibilidad del individuo a su saliva. Los revúviros (Tnatoma. Rhodnius. Panstrongyius) tienen una cabeza con forma de cono con un cuello estrecho y un abdomen que se ensancha en su mitad. Estos son negros o marrones y algunos tienen marcas naranjas o negras en el abdomen. Suelen medir de 1 cm a 3 cm y, a diferencia de las chinches, tienen unas alas bien formadas para volar. Al igual que las chinches, se alimentan en vertebrados y causan similares reacciones cutáneas. En México y América central y Sudamérica transmiten el agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzí. en las heces, que posteriormente se introducen en la piel mediante el rascado (Goddard, 1996; Lañe, 1993). Abejas, avispas y hormigas. Los heminópteros son insectos sociales que hábilmente defienden sus nidos cuando se les molesta. En las hembras no reproductoras, el órgano ponedor de huevos se modifica como un aguijón capaz de inyectar veneno para capturar presas o para defenderse. El veneno de la abejas, avispas y avispones causa sólo una inflamación dolorosa temporal en la mayoría de las personas, pero pueden causar a veces reacciones sistémicas, como anafilaxia en personas sensibilizadas (Reisman. 1994). Cerca de cien personas mueren cada año en EE.UU. por este motivo. La abeja de la miel africana se encuentra ahora en Norteamérica tras su introducción en Brasil en 1956. Estas abejas, que son fácilmente más provocadas por otras abejas, muestran un masivo comportamiento a la hora de picar. Muchas especies de hormigas son problemáticas para los humanos por su capacidad de morder, y algunos grupos, como las hormigas segadoras y las hormigas del fuego, son capaces de producir picaduras dolorosas. Escarabajo. Aunque quiza son con frecuencia conocidos como provocadores de plagas en los campos de agricultura, algunos tienen unas mordeduras dolorosas y otros, especialmente los escarabajos vejiga, pueden exudar un líquido vesicante (cantaridina) que produce dermatitis o ampollas.
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Las larvas de ciertos escarabajos poseen pelos urticantes que producen dermatitis o, si se ingieren, irritación del tracto gastrointestinal. Las larvas y los adultos de los escarabajos del grano pueden actuar como huéspedes intermediarios para los gusanos planos H. diminuta y H. nana de los roedores y humanos. Polillas y mariposas. Algunas larvas (orugas) de lepidópteros poseen pelos urticantes o espinas que inyectan veneno al manipularlas. Aunque la mayoría de los efectos de estas toxinas pueden quedar en la piel, se han descrito efectos sistemáticos, incluidos shock y parálisis (Goddard, 1996). Los adultos de la polilla gitana y de montecillo de hierba poseen pelos urticantes que pueden causar dermatitis, conjuntivitis o irritación de la vía aérea, especialmente en trabajadores forestales (Shama. 1982). Moscas y mosquitos. Los dípteros se caracterizan por poseer un par de alas membranosas. Entre todos los artrópodos, son los responsables de la mayor parte de las enfermedades humanas producidas al alimentarse de sangre, transmisión de agentes infecciosos y la invasión directa de tejidos por sus larvas (miasis). Las picaduras suelen causar irritación local debido a la sensibilidad a la saliva y, en algunos individuos, reacciones sistémicas. Además de su acción de sangre, los repetidos ataques pueden producir daños físicos y psicológicos. Ciertas especies chupadoras de sangre son también responsables de la transmisión de patógenos: malaria, filariasis y arbovirus por mosquitos; las oncocercosis por la mosca negra; loiasis por la mosca ciervo; leishmaniasis y bartonellosis por la mosca de la arena; tripanosomiasis africana por la mosca tse-tsé. Otros agentes virales, bacterianos o parasitarios se transmiten con facilidad de modo mecánico por las moscas no picadoras, como la mosca doméstica o la mosca de la carne que pueden contaminar fácilmente el alimento. La miasis puede producirse de un modo accidental, facultativo u obligatorio. La mosca doméstica no tiene la necesidad de desarrollarse en los tejidos de mamíferos, aunque puede hallarse a veces en tejidos muertos. Este tipo de miasis accidental no es infrecuente, pero no suele tener relevancia clínica. La miasis facultativa es causada más frecuentemente por la mosca de la carne, que suele alimentarse de tejidos muertos pero puede ir a los tejidos viables adyacentes. La miasis obligatoria se produce por especies que se desarrollan sólo en tejidos vivos. Estas especies tienen un origen zoonótico. La mosca humana. Dermatobia hominis. se desarrolla en lesiones subcutáneas como forúnculos, con el extremo posterior apareciendo por la superficie cutánea (Lámina 55-17F). Estas especies se encuentran más frecuentemente en personas que ha estado algún tiempo en América Central o Sudamérica, o con menos frecuencia en África. Es raro que los huevos sean transportados al huésped por otros insectos, habitualmente mosquitos. La mosca Cordyiobia anthropophaga. hallada en África subsahariana, también causa una miasis foruncular. Sus huevos se suelen poner en el suelo o en las ropas tendidas y la larva penetra rápidamente al contacto con la piel. La miasis obligatoria grave es la causada por Chrysomya bezziana y por Cochlimyia hominivorax. Estas especies ponen sus huevos en el ganado vacuno, habitualmente en las heridas o cerca de la nariz. Las larvas se mueven y se alimentan activamente a través de los tejidos vivos. Las infecciones humanas pueden ser especialmente destructivas y afectar al 0|0, a la nariz o a la boca. Otras especies también pueden ser causantes de miasis obligatorias en los humanos (Lane. 1993).
grejo, y una cola segmentada con un aguijón globuloso en el extremo (Lámina 55-18A). Tienen una naturaleza depredadora, paralizando a sus víctimas con su veneno del aguijón, aunque también puede usarlo para fines defensivos. La toxicidad humana varía según las especies. Pueden no producir más daño que la picadura de una abeja, pero algunos son mortales, causando cerca de mil muertes al año. Las especies venenosas se dan en el hemisferio oeste, Europa, África y Oriente Medio (Beaver, 1984; Goddard, 1996). Arañas. Las arañas carecen de cola con aguijón, pero a cambio poseen quelíceros parecidos a colmillos en su zona bucal, a través de los cuales pueden inyectar veneno. Aunque la mayoría son venenosas, tan sólo unas pocas tienen quelíceros capaces de penetrar la piel humana. La mayoría de las picaduras producen sólo irritación y dolor temporal. Las arañas viudas (género Lactrodectus) son uno de los grupos responsables de síntomas sistémicos gracias a la acción de una potente neurotoxina capaz de producir somnolencia, dolor muscular, parálisis, convulsiones y, a veces, la muerte. La tasa de mortalidad publicada varía del 1% al 6%. Se han descrito cinco especies en EE.UU., siendo la viuda negra (Lactrodectus mactans) la más extendida. Las hembras de la viuda negra poseen un color negro brillante con una característica marca rojo-naranja en la parte inferior del abdomen y tienen una envergadura de 3 cm o 4 cm. Viven en localidades protegidas, como cobertizos, bosques y sótanos (Strickland, 1999). Las arañas violin (género Loxosceles) son causantes del aracnidismo necrótico. En EE.UU., el recluso marrón (Loxosceles reclusa) es el que más frecuentemente afecta, aunque hay otras especies. Esta especie mide de 1 cm a 2 cm, con un color entre canela y marrón oscuro, con una marca oscura en forma de violin orientada hacia la parte delantera en el dorso del cefalotórax. Cuando se halla en los hogares está recluida en su guarida, prefiriendo zonas tranquilas como armarios, sótanos o porches. Su picadura es indolora y con frecuencia no se descubre hasta horas después, cuando se forma eritema, edema y dolor. El veneno es dermonecrotizante y hemolítico, causando necrosis cutánea durante varios días. La lesión puede tener dificultad para cicatrizar y puede sobreinfectarse. Son raras las reacciones sostenidas, como la hemolisis y el fallo renal agudo. Otros géneros también se han implicado en aracnidismo necrotizante (Fisher, 1994). Garrapatas. A diferencia de las arañas y escorpiones, las garrapatas tienen un cefalotórax fusionado con el abdomen y un característico hipostoma para alimentarse. Se desarrolla en cuatro fases: huevo, larva, ninfa y adulto. Tras anclarse, necesita alimentarse de sangre para su desarrollo. Los humanos la adquieren en las áreas de arbustos o de hierba en las cercanías de los huéspedes animales. Son ectoparásitos que necesitan alimentarse de sangre y son importantes vectores de patógenos virales, bacterianos y protozoos, tanto para hombres como para animales domésticos. Su alimentación también causa daño local y pérdida de sangre, especialmente al ganado y a la fauna, o la parálisis de la garrapata que es un síndrome causado por una neurotoxina secretada por las glándulas salivares que causa parálisis flácida ascendente y toxemia. La clínica puede asemejarse al síndrome de Guillain-Barré, a la poliomielitis o al botulismo. La resolución de los síntomas se da en tan sólo unas horas o días tras quitar la garrapata.
Los arácnidos de importancia médica son los escorpiones, las arañas, las garrapatas y los ácaros. Los escorpiones y las arañas poseen dos segmentos corporales, el cefalotórax y el abdomen, mientras que las garrapatas y los ácaros sólo tienen uno. Poseen cuatro pares de patas, tanto de ninfas como de adultos. La larva de garrapata y de ácaros tiene tres pares de patas. Todos carecen de antenas, mandíbulas y alas. Los escorpiones y las arañas son más conocidos por su capacidad de inyectar veneno, mientras que las garrapatas y los ácaros son conocidos por actuar como vectores de patógenos virales, bacterianos y protozoos.
Las especies que afectan a humanos son los miembros de la familia Ixodidae (garrapatas duras) y Argasidae (garrapatas blandas). Las duras tienen el aparato bucal dirigido hacia delante y un caparazón escleroso en el dorso llamado scutum. Este caparazón cubre la totalidad del dorso del macho, pero sólo la porción anterior de la hembra, permitiendo que se hinche cuando engorda (Lámina 55-186 y C). Las garrapatas Argasidae tienen un cuerpo blando que carece de caparazón y el aparato bucal está dirigido ventralmente, siendo invisible cuando se la observa desde arriba (Lámina 55-180). Las garrapatas sin engordar miden de 2 mm a 5 mm pero crecen varias veces tras engordar. Las garrapatas duras engordadas pueden asemejarse a las blandas, por lo que se debe tener cuidado a la hora de su identificación (Sonenshine, 1991,1993).
Escorpiones. A diferencia de otros arácnidos, los escorpiones sólo tienen un par de pinzas delanteras, que les da un aspecto similar a un can-
La mayoría de garrapatas observadas libres o unidas a la piel son duras. Las blandas suelen alimentarse brevemente por la noche. Las especies de
Arácnidos
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MEDICA
garrapatas duras importantes en América del Norte son Dermacentor variabais (garrapata canina americana). D. andersoni (garrapata de la madera de las Montañas Rocosas). Amblyomma americanum. Rhipicephalus sanguineus (garrapata canina marrón). Ixodes escapularis (garrapata de palas negras) e /. pacificus (garrapata de patas negras del oeste). A Dermacentor y Amblyomma se les llama también garrapatas adornadas por las marcas blancas en sus caparazones. Las otras carecen de adorno. Las garrapatas Dermacentor transmiten la liebre manchada de las Montañas Rocosas y posiblemente la tularemia y liebre Q. Ixodes son vectores de la enfermedad de Lyme. babesiosis y ehrlichiosis, y en otras partes del mundo transmiten ciertos arbovirus. Amblyomma es capaz de transmitir la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y también una tularemia y la enfermedad de Lyme. Todos estos géneros pueden causar la parálisis de la garrapata. Rhipicephalus se ha implicado en la transmisión de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y en ehrlichiosis del norte de América, y la fiebre botonosa en el área mediterránea. Las garrapatas blandas del género Ornithodoros se dan en muchas zonas del mundo, incluido EE.UU. y son importantes vectores de fiebres recurrentes por espiroquetas (Borrelia recurrentis y las formas relatadas) (Spach. 1993; Murray, 1999). Ácaros. Los ácaros son arácnidos microscópicos (menores de 1 mm) ampliamente distribuidos en el ambiente. Las especies con importancia médica pueden afectar a los hombres, actuar de vectores o causar alergias al polvo. Los hombres son con frecuencia infestados tanto por Demodex tolliculorum como por Demodex brevis. ácaros de los forúnculos, y Sarcoptes scabei. el acaro de la sarna. Los ácaros del folículo son minúsculos (0,1 mm a 0,4 mm) y alargados, con patas achaparradas con las que se pueden asir de los folículos del pelo y de las glándulas sebáceas (Lámina 55-18F). Suelen ser hallazgos incidentales en las preparaciones histológicas cutáneas. Aunque su presencia se ha asociado a varias condiciones cutáneas, son frecuentemente hallados en individuos sanos, lo que hace su trascendencia incierta (Burns, 1992).
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Clases de menor importancia médica Milpiés. Los milpiés son artrópodos similares a los gusanos con numerosos segmentos, cada uno de los cuales posee dos pares de patas que pueden encontrarse en y bajo la vegetación. Aunque carecen de aparato bucal mordedor, algunas especies producen secreciones vesicantes desde las glándulas colocadas en los segmentos. Cuando se les agrede, las largas especies tropicales pueden lanzar un liquido a una distancia de varios centímetros. La exposición de la piel o mucosas a estos líquidos causa quemazón y ampollas. Ciempiés. Estos animales son más planos que los milpiés y tienen sólo un par de patas por segmento; poseen largas antenas. Tienen un movimiento rápido y pueden causar picor con un par de pinzas frontales que están modificadas a partir del primer par de patas. Aunque no suelen causar serios daños, las especies más grandes (26 cm a 45 cm) del sur de EE.UU. y de las regiones tropicales son capaces de penetrar la piel al locarla, produciendo un picor urente y doloroso con inflamación local. Aunque podrían existir reacciones sístémicas en personas sensibilizadas, esto es raro (Goddard. 1996). Crustáceos. Los crustáceos de importancia médica son principalmente los que sirven de huéspedes a larvas de diferentes helmintos. Muchos géneros de cangrejos son huéspedes intermedianos de diferentes especies de lombrices {Paragommus spp.) en todo el mundo. Los cefalópodos son zooplancton microscópicos que a veces sirven como huésped intermediario para los nematodos D. medinensis y Gnathostoma spinigerum y para los cestodos Diphyllobothrium y Spirometra.
Sarcoptes scabieies el acaro de mayor importancia médica dada su capacidad para crear túneles serpigmosos por la capa superior de la epidermis. Se transmite por contacto personal y se puede encontrar principalmente en los espacios interdigitales, la cara flexora de las muñecas y los antebrazos y, menos frecuentemente, en otras zonas como las mamas, las nalgas y los genitales externos. La inflamación y el prurito intenso son secundarios a la creación de los túneles y la producción de excrementos y huevos. La clínica varía según la sensibilización a los parásitos y a sus productos. Las lesiones se sobreinlectan con frecuencia. La aparición de una dermatitis generalizada debida a la existencia de miles de ácaros en ancianos o inmunosuprimidos se conoce con el nombre de sarna noruega. El diagnóstico se hace colocando los raspados cutáneos de áreas afectadas en hidroxido potásico al 20% o en aceite mineral para su aclaramiento y su examen al microscopio. La detección de huevos, larvas de seis patas o ninfas de ocho patas o adultos es diagnóstico, pero a veces puede resultar difícil (Fig. 55-11: Lámina 55-18E). El diagnóstico de sarna en una institución o en una escuela puede causar seudoepidemias, en las que muchos desarrollan picores sin evidencia de enfermedad. Se debe tener cuidado para diagnosticarlos adecuadamente, para diferenciar los casos reales de las parasitosis psicógenas o ilusorias (Lynch. 1993; Orkin. 1985). Un número de ácaros animales pueden afectar a humanos para alimentarse de sangre, tanto como larvas como por adultos, cuando no tienen otros mamíferos o pájaros disponibles. Las larvas de las ninguas (familia Trombiculidae) son un problema en muchas partes del mundo, ya que sus salivas pueden causar grandes reacciones inflamatorias con gran prurito. Estas larvas de seis patas, frecuentemente de color rojo, se unen a la piel en zonas donde la ropa aprieta, como es en los tobillos, caderas y muñecas o axilas. En áreas de Asia y Australia los ácaros Trombiculidae son vectores del agente del tifus de la maleza (Lañe. 1993). Ciertos ácaros no mordedores juegan un papel en la rinitis alérgica, asma y ciertas lesiones cutáneas. Las secreciones, excrementos y partes del cuerpo de Dermatophagoides larinae y de D. pteronyssinus son potentes alérgenos que se dan en el ambiente doméstico (Frazier, 1980). Los test ordinarios realizados por un alergólogo pueden identificarles.
Figura 55-11. Sarcoptes scabiei. Diagrama de un surco subcutáneo. (Ad = hembra adulta; E = huevos; £e = huevos embrionados; Ex = excrementos; Es = cascara de nuevo: So • orificio de entrada.) (Atter Railliet fn Brumpt.)
1236 Tabla 55-11
SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Infecciones parasitarias en huéspedes comprometidos
Infección Protozoos intestinales Criptosporidiosis
Anomalías predisponentes Sida (especialmente CD4 + < 200/u.l). trasplantes y quimioterapia
Isosporiasis
Sida, trasplantes y quimioterapia
Ciclospondiasis
Sida, probablemente otra inmunosupresión
Microsporidiosis
Sida, probablemente otra inmunosupresión grave
Giardiasis
Inmunodef¡ciencia común variable, agammaglobulimemia ligada al cromosoma X
Protozoos sanguíneos y tisulares Encefalitis granulomatosa amebiana
Sida y otros estados de inmunosupresión
Comentarios
Diarrea grave (mayor 17 litros/dia). Puede tener afectación extraintestinal incluidos páncreas, tracto biliar y pulmones Terapia limitada, no curativa Diarrea grave, afectación extraintestinal (adenopatías). existe tratamiento disponible Diarrea grave similar a la criptospondioso e isosporiasis. Respuesta al Trimetroprima sulfametoxazol Varios síndromes: 1. Enfermedad mullisistémica 2 Enteritis con diarrea grave (más frecuente) 3 Infección ocular 4. Síndrome hepatobiliar con granulomas, necrosis hepática, colangilis 5. Enfermedad del músculo esquelético El examen de sedimentos de orina con una corréela tinción permite el diagnóstico de síndrome extraintestinal y algunos casos de enfermedad intestinal Diarrea crónica, malabsorción. Sida no es una condición predisponente
Referencias
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Thielman y Guerraní (1998)
Habilualmente causada por el género de la Martinez y Visvesvara (1997) Acanthamoeba o Balamuthia. Causa infección subaguda o crónica del sistema nervioso central, pero puede ser aguda en los huéspedes inmunodeprimidos con diseminación Habitualmente especies o reactivación de McCabe y Chirurgi (1993) quistes de infecciones previas. Con frecuencia enfermedad diseminada con afectación multiorgánica o lesiones del sistema nervioso central multifocal. Puede causar neumonitis similar a la del Pneumocystis carinii. Puede dar coriorretinitis. Puede producirse tras trasplantes de médula ósea. El trasplante cardíaco de donante seropositivo y receptor seronegativo puede dar una toxoplasmosis fatal Limitada influencia de la leishmaniasis cutánea Herwaldt (1999) Susceptibilidad a leishmaniasis visceral, pero no aumenta la gravedad. Mayor lacilidad de recaída tras el tratamiento
Toxoplasmosis
Sida con CD4+ habitualmente < 100/(jl y otros estados de inmunosupresión, trasplantes cardiacos, donante seroposilivo y receptor seronegativo
Leishmaniasis
Sida, otra inmunosupresión
Tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas)
Sida, linfoma linfoblástico, trasplantes cardíacos, otras inmunosupresiones
En sida, frecuentemente se afecta el sistema nervioso central, el miocardio y la piel
Markell y cois. 1999). Mileno (1998)
Babesiosis
Esplenectomia
Habilualmente hay infección subclinica en los inmunocompetentes. Los esplenectomizados suelen desarrollar enfermedad clínica que puede ser latal Por automfección endógena; puede darse hipennfección o inlección diseminada y presentarse como neumonía o enfermedad iniestinal grave. Puede aparecer sepsis por gramnegalivo o meningitis con gramnegalivo por la translocación bacteriana causadas por la larva invasora. Se debe descartar esta inlección antes del tratamiento inmunosupresor en las áreas altamente endémicas
Markell y cois. 1999). Mileno (1998)
Helmintos Estrongiloidiasis
Artrópodos Sarna
Inmunosuprimidos por trasplantes o quimioterapia, corticoïdes o linloma, El sida noes el mayor factor predisponente
Neoplasias, inmunodeprimidos por trasplantes, quimioterapia, sida
Deriva a una sarna noruega con afectación general de la piel. A veces tiene gran prurito. Los pacientes tienen muchos ácaros y son muy contagiosos. Pobre respuesta al tratamiento
Markell y cois. (1999). Mileno (1998)
Markell y cois 1999). Mileno (1998)
CAPÍTULO 55
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PARASITOLOGÍA MÉDICA
Pentastómidos. Los pentastómidos. o gusanos de la lengua, son artrópodos que pierden las características morfológicas típicas. Los adultos son como gusanos que viven en las fosas nasales de ciertos reptiles, pájaros y mamíferos. Las larvas se parecen a ácaros y residen en roedores, herbívoros y peces de agua dulce. Se han descrito inlecciones hepáticas y pulmonares en el hombre tanto en Asia como en África. Se han hallado adultos en la nasofaringe de personas en Oriente Medio y África, donde causan una rinopatía obstructiva conocida como halzún (Beaver. 1984: Strickland, 1999).
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUÉSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS Los huéspedes inmunosuprimidos padecen anomalías en su sistema inmune humoral o celular secundario a enfermedad, tratamiento o causa congenita. La malnutrición grave también puede comprometer a las defensas. En la mayoría de los casos suelen deberse a alteraciones celulares (células T) secundarias a sida, neoplasias, quimioterapia, trasplantes, corticoides o a la combinación de varias de ellas. Para la giardiasis, el factor predisponente es el defecto inmune humoral, y para la babesiosis es la esplenectomia. Con la pandemia del VIH y el sida especialmente grave, en países subdesarrollados con alta incidencia de parásitos como la malaria, esquistosomiasis, ascariasis. amebiasis y filariasis, es una suerte que estas infecciones no causen especial gravedad en pacientes con sida. Algunas enfermedades parasitarias, como las causadas por Cryptosporidium. Toxoplasma y Slrongyloides. son más graves en inmunosuprimidos, pero hay diferencias. Por ejemplo, mientras que la infección por Cryptosporidium y por Toxoplasma son particularmente problemáticas en personas con sida, la infección por Slrongyloides no lo es, pero es un problema en los receptores de trasplantes y en los que reciben quimioterapia, La Tabla 55-11 recoge las infecciones parasitarias más graves y/o más frecuentes en los inmunosuprimidos. Las manifestaciones clínicas pueden ser distintas de las de la población normal, como se cita en dicha sección.
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SECCIÓN VI
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
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CAPÍTULO
56
Patología molecular de enfermedades infecciosas Martin G. Cormican, M.D., Ph.D. Michael A. Pfaller, M.D
APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Detección de patógenos sin amplificación de diana
ESTANDARIZACIÓN, CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
1250
Pruebas de ADN para identificación de cultivos
BIBLIOGRAFÍA
1251
1241
Amplificación del ADN para diagnóstico Epidemiología molecular
En la pasada década, las técnicas de biología molecular han contribuido enormemente para que podamos entender la patogenia y epidemiología de las enfermedades infecciosas. Como las técnicas se han vuelto más accesibles y refinadas, las que se ocupan del diagnóstico y tratamiento de la infección humana han buscado dirigir el desafío de adaptar estos métodos para resolver los problemas clínicos habituales, esto es, para el diagnóstico de la enfermedad, para orientar el tratamiento y para el control infeccioso y epidemiológico hospitalario La patología molecular representa, cada vez más, una parte del servicio diagnóstico que una diversión esotérica para entusiastas. Como las técnicas moleculares se han vuelto sistemáticas, las preguntas del coste y potencial para contribuir al cuidado del paciente necesitan ser dirigidas en cada caso. En cuanto al valor del método, está en función del grado en que facilita el trato con los problemas clínicos, no de la elegancia de la técnica. Por tanto, el diagnóstico molecular es el más apropiado para agentes infecciosos que son difíciles de detectar, o para identificar o determinar la sensibilidad antimicrobiana en un tiempo rápido, comparado con métodos convencionales. Los principios de la biología molecular relacionados con el diagnóstico de laboratorio se comentan con detalle en los Capítulos 58, 59. 63. 66 y 68.
el coste puede estar justificado por una mejoría de las medidas de control para la infección para proteger a los pacientes y cuidar la salud de los trabajadores. La epidemiología molecular puede hacer una verdadera contribución a la detección y control de la extensión de la infección, con capacidad para reducir los porcentajes de infección nosocomial y la petición de antibióticos caros utilizados para tratar organismos resistentes En este punto, sin embargo, la mayoría de la justificación del gasto en diagnóstico molecular y epidemiología es especulativo: sin embargo, los costes del equipamiento, reactivos y expertos son sustanciales, y el director del laboratorio debe también considerar las cuestiones económicas (Kant, 1995). El nivel de inversión justificada debe determinarse en una institución dada, y en algunos casos usar el servicio de laboratorio de referencia puede presentarse como la opción más eficaz.
El diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas tiene una gran base de ácidos nucleicos y necesita el aislamiento de ácidos nucleicos de los microorganismos y material clínico, y el uso de enzimas endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Cada vez más se están utilizando técnicas más modernas para amplificación de ácidos nucleicos para material clínico. El análisis de la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) se ha ido automatizando. Aunque por el momento no es de uso general en el laboratorio, el análisis secuencial proporciona el último resultado de los organismos caracterizados, y cuando se acompaña con técnicas de amplificación, nos ha dado las directrices con las que hemos podido identificar a los microorganismos que no han podido cultivarse y que antes eran desconocidos en enfermedades infecciosas (Amann, 1994; Wilson, 1994). La tecnología del trozo del gen también parece ofrecer un potencial considerable en el futuro para la caracterización de microorganismos en el laboratorio clínico.
El uso de métodos moleculares para la identificación y detección directa de los microorganismos en la microbiología clínica se está desarrollando gradualmente y ya hay varios productos disponibles comercialmente (Tablas 56-1 a 56-3). Los usos prácticos incluyen el uso de pruebas de ácidos nucleicos para una detección directa de organismos en el material clínico o para la identificación de organismos previamente aislados. Además, las técnicas basadas en la amplificación pueden utilizarse para la detección e identificación y para definir características selectas (p. ej., genes resistentes a los antibióticos) de organismos. Finalmente, los métodos moleculares proporcionan un gran significado de caracterización de organismos, asi como a nivel de subespecies. en investigaciones epidemiológicas.
Una consideración importante en la aplicación general de las técnicas moleculares es el coste. En el área de diagnóstico de enfermedades infecciosas, la mejoría del paciente y la reducción del coste de los antibióticos pueden hacer pesar más que el aumento de los costes del laboratorio. En la actualidad no se han demostrado esos ahorros en muchas aplicaciones diagnósticas de métodos moleculares. En el caso de enfermedades transmisibles.
APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Detección de patógenos sin amplificación de diana La detección de microorganismos patogénicos por la prueba del ADN, directamente a partir de muestras, ha sido ampliamente investigado usando una variedad de formatos de hibridación y generadores de señales. El desarrollo de productos comerciales se ha focalizado en el diagnóstico directo de enfermedades transmitidas por vía sexual y patógenos respiratorios utilizando pruebas de hibridación fase solución y pruebas etiquetadas con éster acridina (Tabla 56-1).
SECCIÓN VI
1242 Tabla 56-1
MICROBIOLOGÍA MÉDICA
P r u e b a s d e A D N para la detección de p a t ó g e n o s *
Organismo
Formato de h i b r i d a c i ó n
Virus del papiloma humano
Fase solución
Virus del herpes simple Citomegalovirus Virus de la hepalitis B
Fase solución Fase solución Fase sólida Placa microtiter Fase solución Fase solución Fase sólida Placa microtiter Fase sólida Placa microtiter
Chlamydia Neisseria
•
trachomatis gonnorrhoea
VIH Virus de la hepatitis C
Sistema informador
Estado
Hibridación ADN/ARN y quimioluminiscencia Slot blot con digoxigenina Hibridación Hibridación Cadena ramificada de ADN
Comercial' Comunicado Comercial' Comercial Comercial''
Ester acridina Ester acridina Cadena ramificada de ADN
Comercial*' Comercial" Comercial''
Cadena ramificada de ADN
Comercial'
1
1
'La tabla contiene ejemplos de métodos disponibles y no pretende ser exhaustiva. Las páginas web de los principales labricantes son una fuente útil paia una mloimacion actualizada Oigene. Silver Spring. MD Murex/Abbol. Abbott Park, IL. ''Chiron. Emeryville, CA "Gen-Probe, Irte., San Diego. CA. :
Un diagnóstico directo por una prueba de hibridación es rápido y está libre de los problemas de contaminación asociados con la amplificación de dianas y es menos susceptible a la inhibición que otros muchos procedimientos de amplificación. Una limitación de la prueba de hibridación estándar es el requerimiento para detectar 10' o más copias. Para algunas aplicaciones, se debe valorar un método rápido, conveniente, y que no se base en el cultivo con este nivel de sensibilidad, y las estrategias de señales de amplificación pueden detectar números tan bajos como 500 genes/ul (Shan, 1994; Murphy, 1999). Incluso los formatos de amplificación de señales más sofisticados no parecen mejorar la sensibilidad analítica de los métodos basados en la amplificación de dianas, que pueden detectar menos de 50 copias de genes/ml (Erali. 1999). La gran sensibilidad de los ensayos de amplificación parece ser la venlaja en ensayos de calidad; sin embargo, la tecnología de pruebas sensibles se está utilizando para muchos ensayos. En enfermedades infecciosas, la prueba de hibridación basada en la membrana (Southern blot, ranura/punto blot) parece improbable que sea una herramienta significativa en el diagnóstico del laboratorio en un futuro. El formato basado en la membrana es quizás el más aplicable para el análisis de un gran número de muestras asi como para buscar aplicaciones. La clasificación del virus del papiloma humano (HPV) y la detección segura del HPV
Tabla 56-2 P r u e b a s c o m e r c i a l e s d e A D N para la identificación de cultivos* Organismo
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium-intracellulare Mycobacterium gordonae Mycobacterium kansasii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Blastomyces dermatitidis Cryptococcus neoformans Neisseria gonnorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Haemophilus influenzae Especies de Enterococcus Streptococcus agalactiae
Formato de h i b r i d a c i ó n
Sistema informador
En solución
Ester acridina
En solución En solución
Ésler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina
En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución
Ester acridina Ésler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina
'Las pruebas recogidas han sido desarrolladas por Gen-Probe Inc . San Die- | go. CA La tabla contiene ejemplos de las pruebas descrilas sin pretender sei exhaustiva. Las páginas web de los principales fabricantes son una fuente útil para una información actualizada. J
en pruebas diagnósticas fue posible al principio por pruebas de ADN. Una variedad de todas las pruebas genómicas y pruebas de oligonucleotides para los tipos más comunes de HPV (p. ej.. tipos 16 y 18 comúnmente asociados con carcinoma uterino cervical y los tipos 6 y 11 asociados con enfermedad benigna) han sido descritas y se han utilizado tanto el titulaje isotópico como el no isotópico (Faulkner-Jones, 1993; Lorinez, 1992; Ángel, 1992). Los formatos Southern blot y ranura/punto blot también se han investigado para el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral y malaria falciparum entre otros, pero aún no han sido utilizados en los laboratorios diagnósticos. Los sistemas comerciales han utilizado la hibndación de fase solución con un titulaie no isotópico. Aquellos que no utilizan señal de amplificación serán considerados en primer lugar. Los productos titulados con éster acridina PACE 2 (Gen-Probe) con una detección quimioluminiscente son quizá los más utilizados. Otras técnicas para la aproximación diagnóstica son los sistemas de ensayo de captura de híbridos (HCA) (Digene y Murex). Tanto el Gen- Probe como los ensayos de captura de híbridos usan un titulaje con prueba no radiactiva que permite una larga vida. Además, el formato es relativamente sencillo y puede utilizarse para un número pequeño o grande de muestras. Las pruebas Gen-Probe (titulación con éster acridina) para la detección de la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae están disponibles comercialmente. Se puede utilizar una muestra clínica para detectar ambos patógenos. El proceso entero se realiza en un único tubo, y la señal quimioluminiscenle se lee en un luminómetro y se interpreta relativamente para un control positivo o negativo. La liabilidad del equipo Gen-Probe para detectar C. trachomatis en muestras clínicas se ha evaluado en luncion del cultivo celular y métodos inmunológicos. Al igual que los métodos inmunológicos, pero a diferencia del cultivo, el método no depende de la viabilidad de los patógenos. En un estudio comparativo reciente, el método Gen-Probe era más sensible que el enzimoinmunoensayo Chlamydiazima (EIA). pero menos sensible que un ensayo comercial de amplificación de dianas (AMP-CT, Gen-Probe) (Wylie. 1998). El ensayo GenProbe para N. gonorrhoeae se ha evaluado en un número de estudios que recientemente han sido revisados con exhaustividad (Koumans. 1998). Los supervisores dicen que el ensayo puede ser más útil en situaciones donde la optimización del cultivo es difícil. Un punto significativo adicional es el requerimiento continuo de cultivo para propósitos médico-legales. Los HCA para detectar el HPV. el virus del herpes simple (VHS) y el citomegalovirus (CMV) ya han sido descritos. Los ensayos HCA se han descrito como más sensibles que los cultivos para detectar tanto el VHS como el CMV. Unas modificaciones recientes del ensayo HPV están dirigidas a mejorar la sensibilidad. El sistema HC es. sin embargo, menos sensible que la amplificación de ácidos nucleicos (Barret-Muir. 1958: Cope. 1997: Cullen. 1997: Poljiak. 1999). Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas (Chiron) y Q|3 replicasa (Gene-Trak) (Shan, 1994) representan test de estrategias diagnósticas que incorporan una amplificación de señal. Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas se han desarrollado para la detección y cuantificación del virus de la
CAPÍTULO 56
Tabla 56-3
•
PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
S i s t e m a s diagnósticos comerciales d e amplificación de ácidos nucleicos*
Organismo
Técnica de a m p l i f i c a c i ó n
Detección de la a m p l i f i c a c i ó n
Virus de la hepatitis C
Transcnplasa inversa y PCR NASBA
Prueba de captura microtltulo' Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético
VIH
PCR y transcriptasa inversa
Prueba de captura microtltulo
NASBA
Prueba del oligonucleótido sujeto ai abalorio magnético
PCR
Prueba de captura microtitulo'
NASBA
Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético
Cilomegalovirus
Mycobacterium tuberculosis
1
1
1
1
PCR
Prueba de captura microtltulo'
SDA
Prueba de captura microwell'
TMA
Prueba do éster acridina"'
LCR
Captura de anticuerpos del producto etiquetado
PCR
Prueba de captura microtltulo'
LCR
Captura de anticuerpos de producto etiquetado
1
NASBA
Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético
TMA
Prueba del éster acridina"
PCR
Prueba de captura microtitulo' Captura de anticuerpos de producto etiquetado |
1
Neisscria gonnorrhoeae
LCR
tivo por hibridación no depende de la capacidad para detectar cantidades pequeñas de ácidos nucleicos. La ventaja de la identificación basada en la prueba sobre métodos no moleculares es mejor para organismos de crecimiento lento, como las micobacteñas u organismos para los que no hay sistemas de identificación disponibles en el mercado. En este punto, la identificación por hibridación es relativamente cara, porque en muchos sitios los aislamientos para identificarlos se hacen de manera individual y hay que hacer un gran número de controles para cada aislamiento clínico. En este capítulo se comentarán algunas de las pruebas descritas o disponibles en el mercado. La identificación de las micobacteñas cultivadas por un método convencional es lenta, tarda mucho tiempo. Las pruebas de titulación con éster acridina para el complejo Mycobacterium tuberculosis complex. Mycobacterium avium-intracellulare. M. gordonae y M. kansasii están comercialmente disponibles (Gen-Probe. San Diego, CA). El uso de estas pruebas permite la identificación del cultivo en un día de trabajo, y la especificidad y sensibilidad son excelentes (99% y 95,5%, respectivamente) (Goto. 1991: Walton, 1991; Richter. 1999). En algunas ocasiones, alguna variedad de M. tuberculosis puede no reaccionar con la prueba del complejo M. tuberculosis, y parece que hay subespecies de M. kansasii que no reaccionan con la prueba M. kansasii(Badak, 1999; Niemann, 1999).
1
Chlamydia trachomatis
1243
1
"La tabla contiene eiemplos de las pruebas descritas, sin pretender ser exhaustiva Las paginas web de los principales fabricantes son una luente útil para una información actualizada 'Roche. Indianapolis. IN 'Organon Teknika. Durham NC ^Becton Dickinson Cockeysville. MD "Gen-Probe, Inc.. San Diego. CA "Abbott. Abbotl Park. IL PCR: Reacción en cadena de la pohmerasa: NASSA amplificación basada en I la hebra de ácido nucleico. SAD amplificación por desplazamiento de hebra: ! TMA amplificación mediada por transcripción; LCR: reacción en cadena de la | ligasa.
hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) (Urdea. 1991; Heerman, 1999). el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Murphy 1999) y para la detección del gen mecA. asociado con resistencia a la oxacilina en estafilococos (Kolbert, 1998). Este ensayo de hibridación se presenta en un formato similar al del inmunoensayo de enzimas. La prueba para hibridación de dianas se da en una solución, y después se captura el híbrido para el microtítulo por una prueba adicional unido al microtitulo. El límite de detección de ácidos nucleicos diana no es tan bajo como el conseguido con la amplificación de la diana (Lunel, 1999; Yen-üeberman, 1996; Zaaijer, 1994). Los resultados cuantitativos en un rango alto de concentraciones de dianas pueden ser útiles para detectar la carga viral, el pronóstico y monitorizar la respuesta al tratamiento en muchas infecciones virales (Heerman, 1999; Yen-Lieberman.1996; Lunel, 1999).
Pruebas de ADN para identificación de cultivos Las pruebas de ADN tienen unas reglas establecidas para la identificación de cultivos de microorganismos (Tabla 56-2). La identificación del cul-
Los métodos de identificación del cultivo de Histoplasma capsulatum. Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Cryptococcus neolormans también están disponibles (Stockman. 1993). Las evaluaciones indican que la especificidad es del 100% y la sensibilidad del 97% o más para todas las especies excepto para B. dermatitidis (87.8%) Al repetir el test, la sensibilidad aumentó al 97.3% para B. dermatitidis y el 100% para otras especies. El sistema Gen-Probe N. gonorrhoeae se ha utilizado para la identificación de cultivos N. gonorrhoeae, además del uso para su aplicación directa en especímenes clínicos (AccuProbe) se compara favorablemente con un sistema comercial de utilización rápida de carbohidratos (Quadferm. bioMérieux) y un sistema de coaglutinación (Phadeback Monoclone GC test) para identificación de N. gonorrhoeae cultivadas. Las pruebas de ADN tituladas con éster acridina son válidas para la identificación de cultivos de Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae. Escherichia coli. Haemophilus influenzae, Enterococus spp., Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes. Estas pruebas se han utilizado para identificar organismos cosechados en los botes de hemocultivo que hayan sido positivos por centrifugación (Davis, 1991). La identificación se realiza en treinta minutos y es sencilla.
Amplificación del ADN para diagnóstico La amplificación de ácidos nucleicos tiene el potencial para superar la principal limitación de la hibridación ampliando selectivamente las dianas específicas que están presentes en concentraciones bajas para niveles detectables. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Sistemas Moleculares Roche) fue la primera técnica de amplificación desarrollada y permanece como el método más conocido y empleado. Nuevas tecnologías de amplificación, la reacción en cadena de la ligasa (LCR. Laboratorios Abbott), la amplificación de hebras de ácidos nucleicos (NASBA, Organon Teknika), la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA. Becton y Dickinson) y la amplificación mediada por transcripción (TMA. Gen-Probe) forman las bases de los sistemas de diagnóstico adicionales que están disponibles en la actualidad. El desarrollo de los productos comercializados se ha centrado principalmente en sistemas para detectar infecciones virales especificas (virus de la hepatitis C. virus de la hepatitis B, CMV, VIH), en los agentes principales de las enfermedades de transmisión sexual (N. gonorrhoeae y C. trachomatis) y en el complejo M. tuberculosis. Los productos comerciales se diseñan con vista a que el usuario los acepte, prevenir la contaminación, estandarización de reactivos y potenciales condiciones de reconversión. No está claro a qué nivel las diferencias son significativas entre los niveles de delección logrados utilizando diferentes estrategias de amplificación. Se ha informado de un número de estudios comparando dos o más métodos de amplificación para patógenos particulares (Brown. 1999; Griffith. 1997; Schepetiuk, 1997: Slary. 1998) y. en general, ninguno de los nuevos métodos ha demostrado un nivel de sensibilidad mayor que la PCR. Los factores para elegir entre los sistemas pueden incluir el porcentaje de productos disponibles, el coste y la conveniencia de
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
que pueda hacer en laboratorios individuales. Probablemente es más práctico para un laboratorio elegir un sistema de amplificación sencillo que les pueda proporcionar todos los test que ellos piden. En la Tabla 56-3 se resumen algunos de los patógenos que han recibido mayor atención, y los métodos de amplificación que se han utilizado. El número de sistemas diagnósticos disponibles está constantemente aumentando, y las páginas web de algunos de los principales fabricantes dan información útil y actualizada de los productos disponibles o en desarrollo. En la actualidad, los métodos moleculares tienen una regla establecida para el diagnóstico clínico y la dirección de un número de ¡nlecciones virales, y puede volverse también valioso en el screening de donaciones de sangre (Roth, 1999). En el caso de algunos patógenos bacterianos, la evaluación de la regla de los métodos moleculares relacionados con el cultivo o métodos inmunológicos puede ser difícil de valorar. En la mayoría de los estudios hay un numero de muestras que son positivas para los test de ensayos basados en la amplificación, pero negativas por métodos inmunológicos o de cultivo. La clasificación de los resultados de estos test son falsos positivos por amplificación o falsos negativos por cultivo/detección de antígeno, tienen implicaciones importantes para los propósitos de calcular la sensibilidad y especificidad de los ensayos basados en la amplificación y en juzgar los méritos relacionados con las diferentes actitudes para el diagnóstico de laboratorio. Muchos investigadores han intentado tratar el problema utilizando la técnica de análisis diferentes. El valor y limitaciones de los análisis diferentes crea controversias: los que la proponen la consideran como la actitud disponible más práctica (Schachter. 1998). mientras que los que se oponen creen que el proceso tiende a predisponer resultados a favor de los ensayos basados en la amplificación (Hadgu, 1996; Miller, 1998). Una dificultad adicional en la toma de decisiones concerniente al papel de ciertos ensayos, basados en la amplificación, en el laboratorio clínico debe expresar las reservas en una revisión, considerando la calidad de muchos estudios publicados (Koumans, 1998).
Diagnóstico de infección viral La identilicación del VHC ha sido posible gracias a las técnicas de biología molecular: por tanto, no es sorprendente que la PCR y otros métodos moleculares tengan un papel importante en su diagnóstico. La serologia nos permite detectar una infección previa por VHC, pero no permite diferenciar entre la infección actual y una curación espontánea. Como el VHC es un ARN-virus, la transcripción inversa en cADN es un paso preliminar necesario para la amplilicación por PCR. Ya se han descrito una variedad de reacciones PCR utilizando la transcnptasa inversa y la ADN-polimerasa. El mercado de Roche Diagnostic comercializa un producto (Amplicor RT-PCR) en el que la transcriptasa inversa y la amplilicación se realizan por la misma enzima, la de Tth del Thermus thermophilus. y este proceso ha sido automatizado (COBAS Amplicor System) (Poljak. 1997). La detección del virus por métodos moleculares confirma la infección reciente y tiene establecida una regla en el diagnóstico clínico de la infección por VHC y en una respuesta monitorizada para el tratamiento. Para el diagnóstico de infección por VIH se detectan anticuerpos específicos para el virus con un test serológico, y como la acreditación espontánea del VIH no es anticipada, generalmente se acepta la detección de estos anticuerpos inequívocamente como una evidencia de infección actual. En el caso de recién nacidos, la detección de anticuerpos puede reflejar una transferencia transplacentaria de anticuerpos maternos, y se requiere un período prolongado de seguimiento (mas de 18 meses) para confirmar la infección sólo por métodos serologicos. La detección de virus por métodos moleculares tiene una regla para resolver el estado de esos niños y también para dirigir a esos pacientes de quienes el suero es, en repetidas ocasiones, indeterminado en los test serologicos. El VIH existe en la sangre como ARN-virus y como ADN-proviral incorporado en el genoma de células mononucleares de sangre periférica. La transcriptasa inversa no es necesaria para detectar el ADN-proviral, pero se necesita para la detección o cuantificación de ARN-VIH libre. Se ha publicado que el ensayo Amplicor Monitor es más sensible que el A DNramificado o el NASBA para la detección del VIH (Bootman. 1999). y niveles de detección tan bajos como 20 copias de ARN-VIH/ml de plasma pueden conseguirse mediante el uso de protocolos de extracción específicos para el ARN (Fischer, 1999).
La PCR también ha sido ampliamente estudiada para el diagnóstico de la infección por CMV en pacientes trasplantados, y se ha descrito un sistema comercial para la delección de CMV por PCR (Long. 1998). Los problemas del diagnóstico de enfermedad por CMV difieren del VHC y del VIH en que el virus es ubicuo, y por tanto su detección en sangre por cualquier método no confirma la enfermedad clínica per se. El desafio en el diagnóstico de CMV ha sido distinguir a los pacientes inmunocomprometidos que tienen o van a desarrollar la enfermedad relacionada con el CMV de aquellos en los que la infección por CMV no es clínicamente signilicativa. Por estas razones, el CMV estaba entre los primeros virus en los que la cuantificación del virus por la PCR fue investigada (Gema, 1994). Más recientemente, la detección del ARN-mensajero CMV. que representa la evidencia de una transcripción activa del genoma viral, ha sido utilizada para detectar la enfermedad por CMV y valorar las respuestas al tratamiento con informes micialmente favorables (Aono. 1998). La cuantificación de los virus por métodos moleculares ha sido reconocida ahora como de importancia significativa en relación con VHC, VIH y VHB y, posiblemente, también con aquellos como el virus Epstein-Barr asociado con enfermedad linfoproliferativa En test de PCR cuantitativos, una cantidad conocida de una diana alterada por PCR o unas series de concentraciones conocidas de dianas alteradas se añaden a las reacciones de PCR que contienen dianas de ADN nativo a partir de una muestra de un paciente. Las cantidades relativas generadas a partir del nativo y una diana alterada o un patrón interno reflejan las cantidades relativas generadas en el sustrato de amplificación, y esto permite su cuantificación. El sistema de detección del generado se debe diferenciar de los originados del nativo y de la secuencia alterada del patrón estándar. Esto puede acompañarse por el uso del microtitulo wells que contengan tanto una prueba especifica para el tipo nativo como una prueba especifica de diana modificada. Una aproximación más actual de la PCR cuantitativa es la tecnología Taqman. que explota la actividad de la exonucleasa 3 -5 de la enzima polimerasa (Kimura. 1999). En adición a los primeros, la mezcla de la reacción contiene una prueba interna que se degrada durante el primer paso de extensión de cada ciclo de PCR La degradación de la prueba interna causa un aumento de la señal fluorescente en la mezcla amplificada. La señal fluorescente puede monilonzarse continuamente a través del proceso de amplificación, y la intensidad de la señal en relación con el número de ciclos de amplificación realizados es en función del nivel de templados presentes al principio. Esta aproximación puede proporcionar una cuantificación más exacta sobre un rango más amplio de concentración inicial de dianas que la PCR cuantitativa convencional, en la que la concentración del generado se determina en un punto del tiempo determinado en un número definido de ciclos. La cuantificación del VHC puede ser importante en el pronóstico y monitorización del tratamiento, y una vanedad de sistemas para la cuantificación del VHC están disponibles o han sido descritos. Los más estudiados han sido quizá los métodos RT-PCR (Roche, Monitor) y el ADN-ramilicado (Chiron, Quantiplex) (Hawkins, 1997; Jacob, 1997: Lu, 1998); sin embargo, el NASBA (Organon) y la tecnología PCR cuantitativa nueva (Roche Taqman) se han descrito más recientemente (Lunel. 1999; Martel. 1999). La variedad de sistemas y el desarrollo crean los estatus definitivos acerca de los valores de la dificultad de los diferentes sistemas. Algunos asuntos importantes para tener en consideración son el registro dinámico de los sistemas disponibles (el registro de concentraciones de genomas virales dentro del cual el método es más exacto y reproducible). la variación en la capacidad para detectar y cuantificar los diferentes genotipos virales VHC y las dificultades del desarrollo de un patrón adecuado para la calibración. La cuantificación del virus VIH se utiliza mucho para el pronóstico y evaluación de la respuesta al tratamiento de la elevada actividad antirretroviral (HAART) (Ledergerber. 1999). Los acercamientos técnicos y los problemas asociados con la cuantificación de ARN-VIH son por ío general parecidos a esos que hemos comentado antes para el VHC (Erali. 1999; Triques. 1999). También se ha publicado una aproximación alternativa interesante para la cuantilicación del VIH basada en la medición de la actividad enzimática de la transcriptasa inversa en el plasma (García-Lerma. 1998). La PCR ha sido estudiada y/o utilizada para el diagnóstico de una variedad de otras infecciones virales, incluidas la infección por enterovirus (Pozo, 1998:
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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Rotbart. 1994). VHS (Tremblay. 1997), virus JC (García de Viedma. 1999) y parvovirus (Jordán. 1998). Los mélodos basados en la amplificación pueden llegar a aumentar su importancia en el diagnóstico y tratamiento de la infección viral, como parece que aumenta el número de infecciones virales inlluidas por agentes antivirales específicos y, particularmente, en situaciones criticas, como en la infección del sistema nervioso central (Read. 1997).
Detección de patógenos bacterianos En estos últimos años se han evaluado un gran número de ensayos de amplificación para la detección del M tuberculosis complex (MTBC) en muestras respiratorias y no respiratorias. En general, la sensibilidad de estos ensayos es excelente (del 95% al 100%) para muestras en las que la extensión para bacilos ácido-resistentes (BAAR) es positiva, pero es más baja para muestras donde la extensión es negativa (con frecuencia del 50% al 80%) (leven, 1997; Piersimoni, 1998; Pfyfler, 1999; Tortoli, 1999), En métodos de PCR que utilizan varios métodos para la preparación de las muestras y dianas para amplificación, se asocian con falta de estandarización, como lo ilustra Noordhoek (1994), que encontró grandes variaciones en la capacidad de los laboratorios para detectar MTCB en muestras ciegas y para informar las muestras negativas correctamente. Para los laboratorios clinicos, los problemas de una estandarización pobre parecen reducirse por el uso de ensayos comerciales con un control central de la calidad de los reactivos y los procedimientos operantes. En general, los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para la detección de MTBC son más sensibles que las extensiones BAAR, pero menos sensibles que el cultivo. En la actualidad, los ensayos comerciales están aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) sólo para los test de las extensiones BAAR positivas en muestras respiratorias. Aunque un número de estudios han comparado dos o más métodos basados en la amplificación (Brown, 1999; Piersimoni. 1998; Tortoli. 1998). ninguno de los estudios hasta el momento ha sido lo suficientemente exhaustivo como para lograr sacar una conclusión firme. El cultivo conserva su papel central en el diagnóstico de la tuberculosis porque los ensayos de amplificación existentes no detectan todas las muestras positivas para cultivo, y es necesario aislar el organismo para un test de sensibilidad (y su tipificación epidemiológica, si estuviese indicada). Los métodos de amplificación son altamente específicos en distinguir MTBC de otras micobacteñas que MTBC (MOTT) en muestras BAAR de extensiones positivas, esto nos permite iniciar un tratamiento adecuado y un control de la infección. En la actualidad, los test de amplificación no pueden sustituir la extensión BAAR, porque el último se utiliza para determinar el nivel de mfectividad de los pacientes (los pacientes con una extensión positiva son mucho más infecciosos que los de extensión negativa) y para juzgar la respuesta inicial al tratamiento. No hay un contexto similar en el que interpretar los métodos basados en la amplificación. Además, los métodos de amplificación responden una pregunta mucho más específica (¿está el MTBC presente'') que la extensión (¿están presentes BAAR?). En la actualidad, el papel de los ensayos de amplificación se complementa con los de microscopio y cultivo. La amplificación de ácidos nucleicos también se ha aplicado para otros patógenos bacterianos del tracto respiratorio. Legionella pneumophila es un patógeno enrevesado para el que un diagnóstico rápido puede ser de una gran importancia. El sistema Legionella EnviroAmp (Perkin Elmer) puede tener aplicaciones para una detección rápida de Legionella es muestras óroncoalveolares (Weir. 1998). De modo similar. Bordetella perlussis, Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumomae presentan dificultades particulares para el diagnostico de laboratono, que tiene que ser dirigido por PCR (Farrell. 1999; Grondahl. 1999: leven, 1997). Pueden ser prometedores para el futuro múltiples ensayos de PCR capaces de detectar y discriminar entre un gran número de patógenos respiratorios potenciales (virales y bacterianos) (Grondahl, 1999). El diagnóstico de las enfermedades de transmisión sexual también ha sido un área importante para el desarrollo de los ensayos de amplificación. N. gonorrhoeae crece rápidamente en una agar convencional apropiado, y el cultivo tiene una alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones óptimas (Koumans. 1998). N. gonorrhoeae es difícil de detectar, sin embargo, una adecuada recogida y transporte y condiciones de cultivo son criticas y puede que no sea fácil realizarlas en cualquier lugar. El cultivo de C. trachomalis
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también es exigente, ya que requiere facilidades para el cultivo de tejidos, por tanto, los métodos que no son de cultivo para la detección del anlígeno de Chlamydia han sido muy utilizados durante vanos años. Casi lodos los métodos de amplificación se han descrito o desarrollado para la detección de C. trachomatis (Morre, 1998: Pasternack, 1999: Schepetiuk, 1997, Stary, 1998; Vincelette. 1999), En general, las evaluaciones publicadas indican que los métodos basados en la amplificación son específicos y más sensibles que el cultivo celular o los métodos inmunológicos (Schepetiuk. 1997: Stary. 1998; Vincelette. 1999; Wyiie. 1998). En un estudio multicéntrico reciente del automatizado test COBAS Amplicor CT/NG (Roche), la sensibilidad y especificidad variaban con el tipo de muestra (Vincelette. 1999). Para muestras uretrales de hombres, se publicó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,5%: para muestras endocervicales la sensibilidad era del 96.5% y la especificidad del 99,4%. y para la orina, la sensibilidad variaba del 94,4% al 95,1% y la especificidad del 99.8% al 100%. La realización de ensayos de amplificación de las muestras de orina puede facilitar el screening para la infección del C. trachomatis. La remisión de muestras de orina parecen ser más aceptables que los métodos de recogida de muestras más invasivos. Se han publicado comparaciones de diferentes métodos de amplitícación (Pasternack. 1999: Schepetiuk, 1997; Stary, 1998), pero en la actualidad no hay suficientes datos para determinar los méritos de cada uno de los diferentes sistemas. Ambos, tanto la PCR como el LCR. pueden también utilizarse para detectar N. gonorrhoeae: hay que examinar una sola muestra para ambos patógenos, y está disponible un ensayo PCR múltiple para la detección, tanto del patógeno N. gonorrhoeae como de C. trachomatis (Vincelette. 1999). El LCR ha sido publicado como más sensible que el cultivo (Kehl. 1998). y puede tener posibilidades para ser aplicado en muestras de orina en el screening para N. gonorrhoeae en poblaciones de bajo riesgo (Kacena, 1998). Las limitaciones de algunos estudios de ensayos de amplificación para la detección de N. gonorrhoeae se han resumido (Koumans. 1998). y esto, junto con la posibilidad de resultados falsos positivos con el Amplicor PCR con Neisseria subflava, enfaliza la necesidad del refinamiento de estas nuevas tecnologías (Farrel, 1999). Aunque los patógenos específicos que causan infección de los tractos respiratorio y urogenital han recibido mucha atención, los ensayos de PCR tienen también su utilidad. Se han descrito ensayos de PCR que son también capaces de amplificar los genes ribosomales rARN de prácticamente cualquier bacteria y de un gran número de muestras clínicas Una rápida secuencia de los productos amplificados y la comparación de la secuencia de datos con las secuencias en una base de dalos ADN puede permitir la identificación de una amplia variedad de organismos (Goldenberger, 1997: Tang, 1998). Esta aproximación también ha sido útil en buscar publicaciones para la detección e identificación de patógenos que antes eran desconocidos o incultivables (Fredericks, 1996). El desarrollo de la tecnología de trozo de gen puede aumentar el potencial de esta aproximación a la amplificación de un gen diana presente en todos los patógenos potenciales, seguido de una caracterización rápida del producto amplificado por hibridación entre un margen amplio de pruebas específicas de las especies (Belgrader, 1998: Marshall, 1998).
Detección de hongos La infección fúngica invasiva es un problema creciente en muchos países (Pfaller, 1994). Candida spp. están entre las causas que encabezan la infección nosocomial del torrente sanguíneo en EE.UU., y la aspergillosis es una causa significativa de mortalidad en pacientes trasplantados y otros pacientes inmunocomprometidos La infección fungica sislémica es diticil de diagnosticar a tiempo y puede que esto contribuya a una mortalidad elevada. La PCR ha sido estudiada para su posible uso en el diagnóstico de candidemia (Bougnoux. 1999) y aspergillosis invasiva (Latge, 1999), y recientemente se ha descrito un test de PCR con una amplia especificidad para una variedad de patógenos fúngicos (Van Burik, 1998). La aplicación clínica de la PCR para el diagnóstico de aspergillosis pulmonar invasiva es complicada por una alta frecuencia de muestras de lavados broncoalveolares positivos (BAL) de sujetos sanos, debido a la presencia transitoria de conidias en el tracto respiratorio. Es preferible utilizar el suero del plasma, dado que es menos probable la contaminación con conidias. Se ha publicado recientemente que un test de PCR progresivo puede ser más sensible que la delección de galactosa por el
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
análisis de immunoabsorción enzimálica (ELISA) para el diagnóstico precoz de la Aspergillosis invasiva (Kawamura, 1999). Como las bacterias, la combinación de un amplio espectro de PCR para amplificar un producto de todos o de la mayor parte de los hongos asociados con infección humana es una estrategia potencialmente importante (Van Burik, 1998). La amplilicación podría seguirse de una hibridación del producto amplificado para una serie de especies. En la actualidad, aunque parece que se van a publicar artículos promeledores. la PCR para el diagnóstico de infección lúngica invasiva no se ha utilizado mucho y no ha sido convincente que pueda compensar las limitaciones del cultivo en un diagnóstico rápido de infección fúngica invasiva en huéspedes inmunocomprometidos.
527-bp de la región 16S rARN con análisis de ordenador pueden servir para identificar bacilos gramnegativos aeróbicos inusuales, y pueden tener también más aplicaciones (Tang. 1998). Se ha hecho énfasis en la necesidad critica de generar y completar bases de datos genéticas para asegurar la asignación apropiada de las especies basada en la secuencia del gen 16S rARN, (Fredericks, 1996; Tang. 1998). El potencial para la identificación de organismos mediante el uso de textos universales para obtener un generado seguido por un uso rápido de una extensa serie de especies, o incluso pruebas especificas de subespecies para definir las especies'subespecies. puede aumentar mucho mediante el desarrollo de la tecnología de los genes (Troesch, 1999).
Detección de resistencia antibiótica Detección de parásitos En los laboratorios clínicos, el diagnóstico de infecciones con muchos parásitos protozoos depende de las heces vistas al microscopio, de una extensión de sangre o de médula osea, o de tejido. La detección del antigeno en las heces en el caso de la Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum es una alternativa. El examen microscópico de las muestras implica dedicarle mucho tiempo, requiere una gran habilidad y tiene una sensibilidad limitada para muestras que tengan pocos microorganismos. Por estas razones, la PCR puede mejorar la detección de parásitos protozoos en los laboratorios clínicos. En un estudio, el ensayo PCR amplificando la subunidad pequeña rARN de Plasmodium fue más sensible que el examen microscópico de un frotis grueso de sangre durante veinte minutos realizado por microscopistas entrenados en diagnosticar la malaria falciparum y para monitorizar la respuesta al tratamiento (Cicerón. 1999). Se han obtenido resultados alentadores también para la delección de Babesia spp. en sangre y parásitos de Leishmania en sangre y médula ósea (Katakura. 1998; Krause, 1996). La detección en el líquido amniótico del ADN de Toxoplasma gondii puede facilitar un diagnóstico rápido para la toxoplasmosis congenita (Gratzl. 1998). y se ha usado en el líquido cefalorraquídeo (LCR) para el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral. También se ha descrito su uso para detectar Entamoeba histolytica. Cryptosporidium parvum y Microsporidium (Haque, 1998; Morgan, 1998). Los sistemas de amplificación comerciales para detectar protozoos aún no están disponibles, así como otros patógenos han superado la calidad de la PCR para la detección de 7! gondii (Pelloux, 1998).
Identificación de cultivos La sensibilidad de métodos basados en la amplificación facilita su aplicación para una detección directa de genomas de patógenos específicos en material clínico, pero también son valiosos para la identificación de microbios cultivados. Una reacción de amplificación específica para las especies puede identificar especies sencillas de particular importancia, como MTBC. De modo alternativo, una reacción de amplificación puede destinarse a una diana de un género especifico o una diana 'universal" y restringir la digestión mediante endonucleasa o hibridación con múltiples pruebas, o puede utilizarse una determinación secuencial del generado para identificar y discriminar entre una variedad de especies. Inicialmente se utilizaba la identificación de cultivos por amplificación para micobacterias de crecimiento lento, pero también tiene aplicaciones para otros patógenos inusuales. Es lógico y conveniente para un laboratorio utilizar la amplificación para una detección directa para usar la misma tecnología para la identificación de cultivos donde sea posible. La amplificación de especies especificas se ha utilizado para una identificación rápida de M. tuberculosis. M. avium y M. intracellular cultivados (Ninet, 1999: Tortoli, 1998). La aplicación de esta aproximación a viales BACTEC positivos con un índice de crecimiento bajo puede reducir dos o tres días el tiempo para la confirmación de una diana de todos los miembros del género Mycobacterium, y la generación de patrones específicos para las especies mediante la digestión del generado con endonucleasas de restricción es un método alternativo que puede discriminar entre más de 30 especies de micobacterias (Devallois, 1997). Recientemente se han publicado múltiples pruebas de PCR para una diferenciación entre MTBC. M. avium y otras micobacterias (Cormican, 1995; Kulski, 1995). También se han utilizado múltiples PCR para una confirmación rápida de toxigenicidad en los hallazgos de E. coli citotóxico (Patón, 1988). La amplificación y la determinación secuencial de una región
La resistencia a los agentes microbianos es uno de los principales problemas de salud en esta década. Los métodos moleculares han contribuido sustancialmente para que podamos entender la genética de la resistencia antimicrobiana y la expansión de determinantes de la resistencia. También tienen la posibilidad de contribuir a detectar pronto la resistencia en el marco clínico (Tabla 56-4) (Bergeron. 1998). Los test convencionales estandarizados de sensibilidad antibiótica dependen del crecimiento Inicialmente. se necesita un cultivo puro del patógeno y, un día más como mínimo para el test de susceptibilidad. Con métodos de test de sensibilidad automatizados, como Vitek, los resultados pueden estar disponibles en unas horas para ciertos organismos. Los métodos rápidos que dependen del crecimiento pueden ser menos aplicables para la detección de mecanismos de resistencia, en los que es necesario un período de inducción en presencia de antibióticos antes de que se manifieste la resistencia. En el caso de resistencia meticilina/oxacilina en estafilococos, la resistencia puede expresarse de varias maneras, particularmente en el estafilococo coagulasa negativo (CNS), de modo que la resistencia antibiólica clínicamente relevante puede ser difícil de detectar por los test de sensibilidad estandarizados, incluso después de 48 horas de incubación. Por todas estas dificultades, la detección molecular del gen mecA está siendo cada vez más aceptada como método de referencia entre los métodos fenotípicos que han sido comparados. La PCR y, más recientemente, las pruebas de ADN ramificado han sido ampliamente investigadas para la aplicación para una detección rápida del estafilococo resistente a la meticilina (Kolbert, 1998; Marshall, 1997: Ramotar. 1998; Vannuffel, 1995). En el caso de los patógenos de crecimiento lento, especialmente MTBC. pueden pasar semanas entre el envío de las muestras y el informe final de la sensibilidad microbiana. Este retraso no fue considerado un gran problema durante años porque había disminuido la incidencia de tuberculosis y la resistencia antibiótica era infrecuente. Los test de sensibilidad eran realizados principalmente para confirmar la sensibilidad y para monitorizar la potencial aparición de resistencias. Desde finales de los años 80, los consejos del tiempo de laboratorio en relación al tratamiento de tuberculosis se han vuelto más esenciales por una sene de razones. Éstas incluyen el resurgimiento global de la tuberculosis (incluso en países desarrollados), el surgimiento y la expansión de la resistencia antibiótica para MTBC y la aparición de una población no despreciable con el síndrome de mmunodeficienaa adquirida (sida), en la que la tuberculosis puede progresar rápidamente hasta producir la muerte si no se pone el tratamiento adecuado. La amplificación de PCR de las secuencias de ADN del rpoB (resistente a la rifampicina) y los genes katG. mhA y ahpC (resistente a isoniacida), seguidas por la detección de mutaciones asociadas con resistencia mediante el polimorfismo conformacional de la hebra simple (SSCP). tiene una sensibilidad alta para la detección de resistencia a la rifampicina (>96%) y la isoniacida (87%) (Telenti. 1997). Ha sido recientemente publicado el uso de pruebas de ADN de alia densidad en combinación con PCR para detectar mutaciones en el gen rpoB. Este método tiene la posibilidad de detectar la resistencia a la rifampicina en pocas horas (Troesch, 1999) y podría, en principio, ser aplicado directamente a las muestras sin cultivo previo. Un reconocimiento rápido de las cadenas de MTBC resistentes a los antibióticos es importante para prevenir la expansión de la infección con esas cadenas en pacientes susceptibles y personal sanitario. Los métodos moleculares tienen también aplicaciones para la detección de la resistencia a las medicinas en un gran espectro de organismos. Se ha publicado la detección de resistencia a la vancomicina en enterneceos, neumococos resistentes a la penicilina y en el gen b/a , |5-lactamasa del Hae;u
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PATOLOGÌA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
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Tabla 56-4 Detección d e los p r o b l e m a s d e resistencia a los antibióticos por m é t o d o s moleculares Gen
Agente Meticilina
Prueba de ADN estándar Prueba de ADN ramilicada PCR
Estafilococos
vanA. B. C. D'
Prueba de ADN estándar PCR Prueba estándar PCR y RFLP PCR y secuencia PCR y secuenciamiento
Enterococos
Oxacilina Vancomicma Bela-lactámicos
Ouinolonas
Mutaciones en gyrA. gyrB. parC y parE
Rifampicina
Mutaciones puntuales en rpoB
Isoniacida Etambutol Estreptomicina
Mutaciones puntuales en katG, inhA, ahpC Mutaciones puntuales en embB Mutaciones puntuales en rpsL y rrs Mutación/deleción en el gen TK" Mutaciones puntuales en gen ADN-polimerasa Mutaciones puntuales en el gel RT*
Aciclovir/lármacos relacionados Foscarnet inhibidores transcriptasa inversa Inhibidores proteasa
Organismos
Método de detección
mecA"
Mutaciones puntuales en el gen PROT"
-
PCR y SSCP PCR y secuencia trozo de ADN PCR y PCR y SSCP PCR y secuencia PCR y RFLP PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y LIPA PCR y secuenciamiento
Haemophilus influenzae Enterobacteriaceae N gonorrhoeae Enterobacteriaceae y cocos grampositivos Mycobacterium tuberculosis'
M tuberculosis^ M tuberculosisM tuberculosis'* Herpes virus" Herpes virus" VIH VIH'
"El mecA codifica la proteina PBP2a' ligada a penicilina alterada, los métodos fenotipicos pueden requerir 48 horas de incubación o mas para detectar las resisten cias y poseen una sensibilidad menor del 100%. La detección de mecA tiene una potencial aplicación clínica para circunstancias especificas 'La resistencia a vancomicina en enterococos puede ser descrita en uno de cada cualro genotipos de resistencia, de los cuales vanA y vanB son los de mayor importancia. La deteción genotipica de la resistencia es útil en la validación de los métodos lenotipicos. La base genética de la resistencia a |i-lactámicos es extremadamente compleja. El bla y el bla son los dos grupos mas comunes de plásmidos codificados que codifican la resistencia a las celalosporinas de tercera generación y a los monopenémicos. •'Mycobacterium tuberculosis es un organismo de crecimiento muy lento Pueden ser necesarias cuatro o más semanas para lograr los resultados del test de susceptibilidad fenotípica La detección de los genes de resistencia en M. tuberculosis tiene potencial aplicación clinica a corlo plazo. "TK: timidina cinasa 'No hay métodos fenolipicos suficientemente prácticos para la delección clinica sistemática de la resistencia a los antivirales. Los métodos genolipicos representan un método práctico habitual para detección de resistencias antivirales 'RT transcriptasa inversa •"PROT proteasa. PCR reacción en cadena de la polimerasa; RFLP: polimorlismo en el Iragmento de restricción. SSCP: polimorfismo en la conlormacion de la hebra simple LIPA: ensayo de la prueba lineal !
nu
mophilus inlluenzaeen el líquido cefalorraquídeo (Bergeron. 1998; Cockerill. 1999; Jones. 1997: O'Neill. 1999; Tenover. 1994). También está cobrando importancia la detección de resistencia en los agentes antivirales desde que la resistencia a los medicamentos se ha reconocido como una barrera significativa para una quimioterapia efectiva de un número de infecciones virales. La detección fenotípica de resistencia a medicamentos en el VIH es compleja, requiere una gran dedicación de tiempo y, por tanto, es poco práctica para propósitos clínicos. Las mutaciones especificas en el gen transcriptasa inversa VIH-1 y el gen polimerasa se asocian con resistencia a los agentes antirretrovirales y pueden detectarse por una gran variedad de métodos moleculares. La detección de mulaciones en el genoma del VIH se relaciona con la detección de resistencia por test lenotípicos (Tedder, 1998). Un ensayo comercial, ensayo de la prueba lineal (LIPA), diseñado para detectar mutaciones en seis codones importantes en el gen transcriptasa inversa, asociadas con resistencia a los fármacos, se ha desarrollado en un intento de facilitar una detección más rápida; sin embargo, su realización puede no ser la adecuada para todas las mutaciones significativas (PuchhammaerStockl, 1999). Como en muchas otras circunstancias, donde se necesita hacer el screening de un gran número de mutaciones posible en el producto amplificado, el conjunto de pruebas de alta densidad (trozos de gen) puede ser útil en el futuro (Gunthard. 1998). Los métodos moleculares no parecen ser los sustitutos para una detección fenotípica de resistencia en la mayoría de las situaciones clínicas en un futuro previsible. Estos métodos pueden aplicarse directamente para muestras clínicas, y pueden, por tanto, ser apropiados para bacterias de crecimiento lento, sobre lodo en situaciones clínicas urgentes, y para la detección de
¡tN
resistencia en virus. Además, son aplicables a organismos no viables y pueden reducir los riesgos biológicos asociados con la manipulación de patógenos viables, como M. tuberculosis. Los métodos moleculares también pueden tener ventajas particulares en relación con los mecanismos de resistencia que se expresan sólo después de un período de incubación largo, desde que los métodos fenotípicos pueden no ser lo sulicientemente fiables a que no estén a tiempo en tales casos. Los métodos moleculares para la detección de resistencia antimicrobiana están limitados en muchos aspectos (Bergeron, 1998). Primero, la ausencia de un gen de resistencia conocido no excluye la posibilidad de resistencia por otro mecanismo. En términos prácticos, la detección molecular se basa en la detección de genes individuales bien caracterizados en especies o generos en los que se espera que se produzca. Los métodos moleculares no detectan los mecanismos de aparición de nuevas resistencias, y no es probable que se apliquen para la detección de la expresión de genes resistentes en especies en las que no se ha observado previamente. Una segunda limitación es que la presencia de un gen para resistencia antimicrobiana no obliga la expresión del fenotipo resistente. Por ejemplo. E. coli tiene un gen cromosómico para una |i-lactamasa similar a AmpC. pero, casi nunca se expresa. En principio esta limitación no es insalvable sí se utilizan preferentemente los ensayos para detectar mARN mejor que para detectar el gen cromosómico. Dadas estas limitaciones, parece probable que por el momento los métodos moleculares para detectar la resistencia antimicrobiana se vayan a quedar como herramientas de laboratorios de referencia, útiles en la monitorización a gran escala de los mecanismos de resistencia, y como estudios de la realización de los métodos fenotípicos.
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 56-5 Métodos de epidemiología molecular* Ejemplos
Método
PCR y productos de secuenciamiento
Mycobacterium tuberculosis Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Clostridium difficile Staphylococcus aureus Stenotrophomonas mallophilia Candida albicans Enterobacter cloacae Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Candida albicans Enterobacter cloacae Acinetobacter baumanii Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Virus de la hepatitis C Staphylococcus aureus Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis C
PCR y polimorfismo conformacional de la hebra simple
Virus de la hepatitis B
Electroforesis de proteina en gel de poliacrilamida
Clostridium difficile Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Entamoeba histolytica
Polimorfismo de los fragmentos de restricción Enzimas cortantes frecuentes
Enzimas cortantes infrecuentes
Riboescritura
Prueba de hibridación de elementos repetitivos PCR y productos de electroforesis
PCR y productos de prueba de hibridación PCR, digestión de productos y electroforesis
Electroforesis de enzima multilocus
Comentario Gran número de bandas Ahora poco empleado Escasas bandas Electroforesis de pulso de campo Aplicación muy amplia Escasas bandas Automatizado Escasas bandas Perfil basado en secuencias específicas RAPD y otros Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Permite una detección de cambios de la secuencia menor en un área especilica Ahora poco empleado Útil para la amplia definición de las relaciones dentro de una especie
•La labia contiene eiemplos de métodos disponibles y aplicaciones y no pretende ser exhaustiva. ——__
Epidemiología molecular La variedad de herramientas disponibles en la aclualidad de epidemiología molecular es considerable (Tabla 56-5), y en particular ha existido una proliferación de métodos basados en la amplificación. Un análisis exhaustivo de los méritos relativos de estos métodos de aproximación diagnóstica está más allá del propósito de este capítulo. Es importante destacar que no hay una técnica universalmente aplicable y que la opción de un uso particular depende de las especies estudiadas, de aquello a lo que la petición hace referencia y de la conveniencia de la técnica. Las técnicas moleculares son útiles para responder preguntas de una clínica presente y para el control de infecciones, y no están limitadas para usos de investigación. Los ejemplos incluyen clarificar el significado de múltiples aislamientos de Staphylococcus epidermidis de un paciente particular y predecir una respuesta para el interferon en la infección por el virus de la hepatitis O La evidencia molecular de identificación del S. epidermidis realizada en diferentes momentos sugiere que el hallazgo es clínicamente significativo, y los genotipos VHC 1a y 1b parece menos probable que respondan al interferon que otros genotipos (MartinotPeignoux. 1998; Vandelli. 1999). Las técnicas moleculares también sirven de ayuda para detectar la emergencia y extensión de las cepas de un organismo con resistencias poco usuales a los fármacos usados, asi como la patogenicidad para determinar la eficacia de los procedimientos de control de la infección, y en la definición de la fuente de epidemias o infección debida a la comida o productos terapéuticos.
Métodos de tipificación molecular ADN-dependientes La bibliografía relativa a la tipificación molecular ADN-dependiente, y en particular a la tipificación por amplificación, se ha convertido en un laberinto de acrónimos y variaciones sutiles. Para poner algún orden en esta área, es útil considerar dos aspectos de cada método: el método técnico (amplificación, restricción de enzimas, prueba o una mezcla de todas eHas) y el princi-
pio (una imagen del cromosoma o foco en secuencias que evolucionan rápidamente). Los métodos de tipificación basados en el ADN. se basan en la divergencia progresiva que se produce en la secuencia de células bacterianas idénticas sobre un gran número de generaciones de división celular. Cuanto más parecida es la secuencia entre dos organismos aislados en pacientes distintos, más probable es que lo se originó fuera de una fuente común en el pasado. El grado de divergencia entre organismos puede advertirse en la secuencia entera de los cromosomas. El grado de resolución más alto para el método requeriría la secuencia de todos los cromosomas, pero esto no es práctico. Por tanto, la mayoría de los métodos desarrollados intentan identificar la variación de la secuencia en puntos distribuidos de manera aleatoria por todo el cromosoma. Esta imagen es la base para el polimorfismo en el fragmento de restricción (RFLP), electroforesis en gel por campo pulsado (PFGE), y la tipificación usando textos arbitrarios. La divergencia de la secuencia no se produce igual en todos los puntos del cromosoma. Algunos elementos específicos del cromosoma se alteran más rápidamente con respecto a otra secuencia de nucleótidos, o con respecto al número de copias del elemento y la distribución de las copias por lodo el cromosoma. Los ejemplos de secuencias de rápido desarrollo, incluidas las secuencias de inserción (IS), transposones (Tn), secuencias tándem repetidas e integrones (In). Un grupo de métodos de tipificación ha empleado estas secuencias altamente variables para estudiar la relación entre los microbios. Algunos métodos utilizan una combinación de la digestión total del cromosoma seguida de una búsqueda de secuencias repetidas. Algunas variables a tener en consideración para elegir un método de tipificación para una aplicación particular son su reproducibilidad (tanto en el propio laboratorio como en otros laboratorios), capacidad disenminativa, rapidez y relación beneficio-coste. Cada vez más, la inspección visual y la evaluación cualitativa de los patrones de unión logrados por muchos de estos métodos de tipificación están siendo complementadas por el uso de análisis cuantitativos monitorizados. y están apareciendo estudios de los métodos de análisis disponibles (Gener-Smidt, 1998; Olive, 1999). La
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capacidad para Transferir rápidamente las imágenes dígitalizadas de patrones de unión a un laboratorio central con la posibilidad de una comparación rápida de cadenas, y la adaptación de consensos a la asignación de los tipos, es lo deseable para aumentar la capacidad de estas técnicas para seguir la pista de la evolución y expansión de cadenas específicas a nivel nacional e internacional. Las dificultades que hay que superar en los métodos de tipificación moleculares son considerables (Van Belkum, 1997). El análisis estándar RFLP con enzimas cortantes frecuentes puede generar un gran número de bandas en el gel de electroforesis. El método ha sido útil en la tipificación de una gran variedad de organismos. Por ejemplo, Bingen (1991) utilizaba RFLP para demostrar que el Enterococcus faecium resistente a la vancomicína aislado de un hospital francés no presentaba la extensión de una cadena sencilla resistente. Por la complejidad de los patrones de unión que hacen difícil el análisis, este método ha sido suplantado. Una solución para la complejidad de los patrones es identificar y analizar sólo un grupo que tenga una secuencia específica en múltiples copias en el genoma. Esto se consigue por una trasferencia de bandas de ADN del gel de electroforesis a una membrana (Southern blot) y la consiguiente aplicación de pruebas de ADN a la membrana. La secuencia multicopia que generalmente usamos es el gen ARN ribosómico. Este proceso, conocido como nbotipificación, ha sido utilizado para estudiar las relaciones entre cadenas de muchas especies, y se han publicado estudios comparativos del valor del ribotipificación en relación con los métodos de tipificación tradicionales para algunas especies. Un sistema totalmente automatizado y un sistema rápido para la realización de la ribotipilicación con una interpretación asistida por ordenador (Ribopnnter. Quahcon. Wilmington. DE) está ahora comercialmente disponible. El Ribopnnter ha sido presentado para ser más discriminatorio que la PCR para Salmonella entérica (Hilton, 1998); sin embargo, comparando el Ríboprinter con la PFGE para la tipificación de E. coli y Pseudomonas aeruginosa. éste era menos discriminatorio que la PFGE (Pfaller. 1996). Se ha sugerido que el Ribopnnter puede ser útil como una herramienta de tipificación de primera linea, pero que las cadenas que aparecen indistinguibles en la ribotipificación pueden ser distinguidas en diferentes grupos en la PFGE. De un modo similar se utilizan las pruebas que hibridan las secuencias multicopias diferentes de 16S rARN. Entre las aplicaciones mejor estudiadas está el uso de una prueba para la secuencia de inserción IS6110 para el tipo MTBC. Este método es relativamente lento y tiene un poder discriminatorio limitado para las cadenas de MTBC con pocas copias de la secuencia IS6110 (Yuen, 1993). Está bien estandarizado y ha sido muy informativo para definir la epidemiología de la tuberculosis (Bradford. 1998; van Embden, 1993). Más recientemente se han descrito un número de diferentes métodos de tipificación para MTBC para suplementar o sustituir el IS6110. La comprobación de las partes digeridas por RLPF con las secuencias ricas en GC polimórficas multicopia (PGRS) puede ser utilizada para suplementar la tipificación IS6110 para cadenas con un número bajo de copias IS6110 (Bradford, 1998). Un número adecuado de bandas para el análisis de la mayoría de los organismos (de 10 a 20 bandas) también puede conseguirse por PFGE (Allardet-Servent, 1989). PFGE utiliza la restricción de enzimas para cortar el ADN en secuencias, lo que ocurre poco frecuentemente, produciendo un número limitado de fragmentos de ADN grandes. Este método requiere que las fuerzas que causan las roturas aleatorias en el cromosoma bacteriano se eviten durante la preparación del ADN para la digestión. Esto se acompaña de la inmersión de la bacteria en tapones de agar antes de la digestión de la pared celular. También se debe emplear un sistema de electroforesis capaz de separar los grandes fragmentos de ADN. La separación de los fragmentos grandes es posible gracias a una alteración periódica de la dirección del campo eléctrico utilizado en la cámara de electroforesis. La PFGE permite la separación de cromosomas enteros, por lo que para las levaduras, que son eucarióticas, debe generarse un cariotipo sin la digestión de la enzima de restricción. La PFGE está considerada por algunos como el método más aplicable y el más aceptado para la tipificación molecular. Los principios para la interpretación de los geles de PFGE han sido propuestos, y para muchos organismos es el estándar de fado pata la tipificación molecular entre otros métodos que han sido comparados (Tenover, 1993). Las limitaciones principales de PFGE son que es un método relativamente lento y costoso; sin embargo, se ha avanzado al desarrollar protocolos rápidos de PFGE (Matushek. 1996). La PFGE es aplicable al estudio de la epidemiología de
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muchos patógenos, incluido S. áureos resistente a la meticilina (van Belkum, 1997), E faecium resistente a la vancomicína (Fridkin, 1998), Streptococcus pneumoniae penicilin resistente a la penicilina (Rudolph, 1998). Klebsiella pneumoniae productora de |í lactamasa de amplio espectro (Lin. 1998). E. CO//0157 (Grif. 1998). Stenotrophomonas maltophilia (Sader. 1994) y especies Candida para las que se puede utilizar tanto el cariotipo como el análisis RFLP (Cotmican. 1996). La amplificación ADN por PCR se aplica para la tipificación molecular en una variedad de modos. Una ventaja de las estrategias de tipificación utilizando PCR es que sólo se necesitan cantidades de ADN pequeñas. De modo adicional, el ADN templado puede ser una preparación bastante ordinaria, que generalmente no es el caso de los sistemas digestivos de enzimas de restricción. De modo más sencillo, las tipificaciones basadas en PCR incluyen el uso de uno o varios principios genéricos que terminan en la amplificación de varios fragmentos de varios tamaños. El número y tamaño de los fragmentos amplificados depende de la secuencia del genoma microbiano, y se revela un patrón de unión especifico para el tipo de electroforesis en gel (NiRiain, 1994). Este método de variaciones, con una titulación aleatoria de la amplificación del ADN polimorfo (RAPD) o amplificación de la huella dactilar de ADN (DAF). tiene una gran aplicación para una variedad de patógenos actuales, incluidos Enterobacter cloacae y Neisseriae meningitidis (NiRiain, 1994; Barí. 1998; Woods, 1994). La reproducibilidad de los patrones de unión utilizando textos genéricos puede ser problemática. Las uniones débiles pueden aparecer y desaparecer fácilmente; sin embargo, parece que algunos grupos han superado estas dificultades (Barí. 1998). Por lo general, estas técnicas puede que sean más aplicables a una caracterización rápida y preliminar de un número pequeño de cadenas dentro de una institución sencilla. También está surgiendo una variedad de aplicaciones de PCR para la tipificación de bacterias que usan la diversidad de secuencias repetitivas, como el consenso intergénico repetitivo de enterobacterias (ERIC-PCR) y las secuencias repetidas extragénicas palindrómicas (REPS). Estos empleos han sido válidos para tipilicar Acinetobacter spp. y otras muchas especies gramnegativas (Vila, 1996). La PCR también se ha utilizado en combinación con la digestión de la endonucleasa de restricción de todo el ADN cromosómico como polimorfismo amplificado de la longitud de los fragmentos (AFLP) tipificados. En esta técnica, se amplifica un subgrupo de los fragmentos generados por una digestión de ADN cromosómico con frecuentes enzimas cortadoras. En el caso de E. coli, la utilización de cebadores con titulaciones fluorescentes necesita conocer el tamaño de lodos los fragmentos en un secuenciador automatizado de ADN. y la disponibilidad de la secuencia completa del genoma E. coli K-12 ha resultado ser un método muy sofisticado (Arnold. 1999). El conocimiento de la secuencia del genoma del Haemophilus influenzae cadena Rd ha sido explotado de un modo similar para desarrollar un método de tipificación de PCR basado en el número variable de secuencias en tándem repetidas (VNTR) (van Belkum, 1997). El test de tipificación de MTBC es otro método que se asemeja bastante a la PCR. basada en la amplificación de las secuencias espadadoras no repetidas situadas entre las pequeñas unidades repetidoras (Sola. 1998). La PCR también se utiliza para amplificar zonas del genoma microbiano que evolucionan rápidamente, de modo que la conexión puede valorarse por una evaluación de los producios para una variación de la secuencia. Las zonas diana incluyen las regiones de espacio entre genes para ARN ribosómico en Aspergillus fumigatus y el gen coagulasa de S. aureus (Hookey. 1998: Radford. 1998). La variación de la secuencia puede verse por la evaluación de los patrones de unión producidos en la digestión del producto amplificado con enzimas de restricción o secuenciación del producto de PCR. Métodos de tipificación similares han servido para clasificar virus. La tipificación del VHC es de particular interés, asi como un genotipo viral es significativo para predecir una respuesta parecida al tratamienlo con interlerón-«. La realización del genotipo del VHC se basa Irecuentemenle en la detección de la variación de la secuencia en la región 5 conservada sin traducir del genoma por RFLP. hibridación para pruebas específicas del genotipo (Line Probé Assay. Innogenetics). por secuenciación o por polimorfismo de la longitud de los fragmentos (Davidson, 1995; Murphy. 1994; Seme, 1997: Sreevatsan, 1998: Stuyver, 1996). Se ha reconocido la posibilidad de una clasificación errónea de algunas cadenas donde la distinción se basa
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
en una sola diferencia de los nucleólidos. y puede que sea necesaria la determinación de la secuencia en la región central para algunos subtipos (Seme, 1998). La secuenciación directa del producto PCR obtenido con el equipo Roche Amplicor ha sido publicada y puede ser un acercamiento coste-beneficio para la determinación del genotipo VHC (Holland, 1998). Unos métodos similares han entrado en vigor para tipificar VIH y otros virus (Peltola. 1998). Los perfiles del plásmido se utilizan hoy día mucho menos que antes para la tipificación molecular, aunque el estudio del resto del ADN del plasmado es importante para definir la epidemiología de la difusión de los mecanismos de resistencia antimicrobiana. El estudio de los perfiles del plásmido conjuntamente con la tipificación basada en el ADN cromosómico ha revelado que en algunos casos la propagación nosocomial de las resistencias antimicrobianas puede reflejar la propagación simultánea de las resistencias ocultas en un plásmido y su facilidad de difusión (Liu, 1998).
Tipificaciones moleculares no ADN-dependientes Se han utilizado varios métodos de tipificación no basados en ácidos nucleicos para estudios epidemiológicos. La electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (PAGE) se ha utilizado para muchas bacterias, pero ya no se utiliza (Mulligan. 1988). La electroforesis enzimática multilocus (MLEE) se basa en la movilidad electrotorética de un número de enzimas informativas. Las variaciones en la movilidad de las enzimas es la base de la tipificación. La MLEE es demandada técnicamente y puede verse como un modo de examinar las relaciones entre organismos en una escala de tiempo de evolución más larga que la que se proporciona por una inspección visual de los patrones de unión en muchos de los métodos de tipilicación basados en ADN. El estudio de la motilidad electrotorética de las enzimas informativas puede sustituirse por la determinación de la secuencia de los fragmentos amplificados de los genes codificando las respectivas enzimas, una técnica conocida como una secuencia tipificada multilocus (Vogel, 1998). Con el uso de los análisis asistidos por ordenador de los patrones de unión obtenidos por métodos de tipificación basados en el ADN o de una secuencia de datos de ADN. se pueden definir los grados de relación durante una escala de un periodo de evolución grande de modo similar a MLEE (Arnold, 1999: Bart, 1998).
ESTANDARIZACIÓN. CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Como para todo diagnóstico, la calidad de los resultados comienza con el acierto de la petición de la prueba y la calidad de la recogida de las muestras y su transporte. El laboratorio deberá dar al médico las directrices para saber qué muestras se pueden permitir, cómo recogerlas y cómo conservarlas, así como el tiempo necesario para ser remitida al laboratorio (véanse Caps. 1 y 57). En el laboratorio, el primer escalón en la valoración de la calidad es la adecuada validación de un test particular antes de su uso diagnóstico y. cuando se emplee, se debe prestar mucha atención para mantener los estándares de calidad. Estas directrices se han estipulado en recientes publicaciones de la Association for Molecular Pathology (1999) y del National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1995). Pueden surgir problemas a diferentes niveles. El diseño de los test puede no ser capaz de distinguir toda la diversidad genética de los taxones (clasificación errónea del VHC subtipo 2c como 2b [Seme, 1987]) o bien solapar las características con taxones conocidos (falsos positivos de MTBC en pacientes con infección pulmonar por M. kansasiiy M. avium [Jorgensen. 1999]). Los problemas en el diseño pueden no ser reconocidos y su realización puede ser sobrestimada en las evaluaciones que no empleen adecuados test de referencia (Koumans. 1998). Un reciente informe de la pobre concordancia entre los laboratorios es el estudio de muestras ciegas para MTBC y para VHC mediante PCR (Noordhoek. 1994; Zaaijerr. 1993). donde se sugieren problemas operacionales en el diagnóstico de laboratorio. En un estudio más reciente. 4 de cada 15 laboratorios informaron de uno o más falsos positivos en el diagnóstico de toxoplasmosis med'ante prueba de
PCR (Pelloux. 1998). y lo mismo pasaba con la detección de enterovirus (Muir, 1999). El potencial de incrementar la concordancia entre los laboratorios gracias a la estandarización de los reactantes y a los protocolos se enfatiza en un informe para lograr una realización satisfactoria de la PCR para Chlamydia trachomatis (Mahony, 1994) y el mayor empleo de los sistemas comerciales con reactivos estandarizados, asi como de los análisis automatizados, pudiendo. en un futuro, reducir estos problemas. La preparación de las muestras es un asunto critico en el que se busca un equilibrio entre la simplicidad de la preparación (para lograr ser prácticos y disminuir los riesgos de contaminación) y la profundidad (para asegurar la liberación de los ácidos nucleicos y la eliminación de las sustancias inhibidores). Los controles se deben hacer para detectar la contaminación (p. ej.; el examen por duplicado, controles negativos múltiples) y para monitorizar la degradación de la diana o la existencia de inhibidores (control positivo en los límites de detección, estándar interno para la amplificación). El número adecuado de controles negativos es esencial y se deben llevar a cabo durante el proceso de preparación de las muestras. Tan sólo una parte de una muestra negativa es adecuada para este fin. La selección de controles y normas es muy problemática cuando el agente infeccioso diana es muy diverso (VIH y VHC) y cuando se requieren muchos resultados. La complejidad de estos asuntos es evidente en publicaciones de sistemas comerciales para la cuantilicacion de VHC en que pueden no detectar los genotipos 2 y 3 de un modo tan eficiente como el genotipo 1 (Hawkins, 1997) y en las diferencias en la eficiencia de la hibridación de clones de viriones derivados de ADN en ensayos para la cuantificación de ADN VHB (Heerman, 1999). Una evaluación detallada de parámetros que afectan el resultado de los ensayos para la cuantificación ARN VIH está disponibles, y muchos de los principios identificados son por lo general aplicables (Lew. 1998). Para asegurarse de que ios reactivos son de una gran calidad y están libres de contaminación, es conveniente comprar lampones preparados en otro lugar. En este caso, el fabricante es el responsable de proporcionar los datos de la calidad analítica de los reactivos. Una valoración de la calidad funcional relativa a los lotes previos puede ser adecuada. La contaminación es un problema considerable para los laboratorios que utilizan PCR diagnósticas. Los estudios entre laboratorios han mostrado que las muestras negativas pueden dar resultados positivos en algunos laboratorios, y la explicación más probable es el sobrediagnóstico de resultado. Claramente, las consecuencias sobre el cuidado de un paciente con un resultado falso positivo para VHC. VIH o MTBC son importantes. El fundamento de la prevención de este sobrediagnóstico en la mayoría de los laboratorios en este punto es la separación física de la reacción PCR establecida y las zonas de análisis del producto PCR con un flujo de trabajo estrictamente unidireccional. La automatización de PCR puede también ayudar en la prevención de este fenómeno (Wilke, 1995), y la mayoría de los fabricantes de equipos comerciales de diagnóstico molecular han desarrollado, o están en proceso de desarrollo, sistemas automatizados o semiautomatizados para minimizar la posibilidad de un error humano. Los resultados falsos positivos parecen ser poco frecuentes con el uso de sistemas de test comerciales automatizados (Víncelette, 1999). Además de la prevención del sobrediagnóstico, los métodos para prevenir la amplificación de productos que contaminan la PCR están disponibles. Los dos métodos principales son aquellos que utilizan isopsoralen para modificar los resultados a un estado no amplificable, y la ADN uracilo-glucosilasa, para degradar lo generado antes de la amplificación (Rys, 1993). En cualquiera de los sistemas que se utilicen, debería determinarse el impacto de la técnica en el límite de la detección de PCR. También es importante para demostrar la electividad de la medida dar el coste añadido al procedimiento. La comprobación funcional en cada uno de los lotes nuevos de enzimas es una comprobación adecuada en la producción y el procedimiento de reparto. Para la ADN pohmerasa, puede ser adecuada la comparación con un lote previo de enzimas utilizando pruebas en el límite de detección. Para la endonucleasa de restricción se recomienda la digestión de ADN lambda. La reproducibilidad en muchas técnicas moleculares es muy dependiente de un control preciso de la temperatura y del uso de un reactivo exacto. Lo primero y esencial para asegurar la calidad es la adquisición de un instrumento de alta calidad. Dos veces al año, o con más frecuencia, se recomienda la monitorización de la temperatura y su correcta realización (Kopp, 1994). Las pipetas deben calibrarse dos veces al año.
CAPÍTULO 56
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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
El servicio de calidad del laboratorio no termina con la generación del resultado. El tiempo que tarda en darlo es un elemento esencial. Las guías para la interpretación del resultado son particularmente importantes en relación a los métodos nuevos, ya que los médicos pueden no estar familiarizados con las limitaciones de estos métodos. Las guias para la limitación apropiada del empleo de los test son importantes por razones financieras, estando implicados los asuntos de reembolso. Sólo recientemente la Health Care Financing Administration (HCFA) ha asignado códigos de pago para la detección e identificación de un número limitado de patógenos específicos [Health Care Financing Administration. 1999) Además, no se sabe con certeza los test que serán reembolsados. Dada una realización previa, es improbable que el nivel de reembolso cubra completamente los costes de los test en todas las circunstancias. La participación en programas de test de competencia es. obviamente, un aspecto importante y necesario para mantener la calidad de los servicios de diagnóstico en el laboratorio de microbiología. Los test de competencia para los métodos moleculares utilizados en la detección e identificación de agentes infecciosos están solamente disponibles para unos pocos organismos. El College of American Pathologists (CAP) proporciona modelos de test para la prueba basada en ácidos nucleicos para la detección e identificación de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (CAP Inspección HC5): identificación de cultivos de micobacterias; y amplificación basada en la detección de una variedad de organismos, incluidos VIH, VHC, CMV. MTBC y Borrelia burgdorferi (CAP Inspección ID). La seguridad de la calidad en el diagnóstico molecular no es esencialmente diferente de los principios aplicados en otras áreas de patología clínica. La atención a los detalles, los controles adecuados y un conocimiento de los problemas potenciales, junto con una cuidadosa conservación, son esenciales.
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CAPÍTULO 56
•
PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
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C A P Í T U L O
57
Manejo y recogida de muestras para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas • Goil L. Woods, M.D.
SANGRE
1255
TRACTO URINARIO
1262
FLUIDOS CORPORALES
1257
TRACTO GENITAL
1264
TEJIDOS
1260
HECES
1266
OJO
1260
PIEL Y LESIONES SUBCUTÁNEAS
1268
TRACTO RESPIRATORIO
1260
BIBLIOGRAFÍA
1269
Las claves para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas son una adecuada recogida y un adecuado manejo de las muestras. Las guias para la recogida y transporte de muestras y el procedimiento se explican en este capítulo. Los principios generales se revisarán primero, seguidos de la explicación de los tipos más comunes de ejemplares encontrados en el laboratorio de microbiología. Para una detección óptima de los patógenos responsables de la enfermedad infecciosa, las muestras deberían tomarse cuando la probabilidad de recoger el agente sospechoso sea mayor. Por ejemplo, la probabilidad de recoger la mayoría de los virus es en la fase aguda de la enfermedad. Las muestras para bacterias se deberían recoger antes de la toma de antibióticos. El volumen de muestras recogido debe ser adecuado para el estudio microbíológico solicitado. Si el volumen recibido es insuficiente, el médico o enfermera de la sala deben informar, y se deberá sacar una muestra adicional o el médico debe priorizar las peticiones solicitadas. Si la muestra se recoge con una torunda, la punta de poliéster vale para todos los microorganismos. El alginato calcico debería evitarse para recoger muestras para el cultivo de virus, porque podria inactivar el herpes simple, el algodón podría ser tóxico para Neisseria gonorrhoeae y los depresores de madera deberían evitarse porque la madera podría ser tóxica para Chlamydia trachomatis. Las torundas no son adecuadas para la detección de anaerobios, micobacterias u hongos, y su uso no debería permitirse cuando se sospechan estos microorganismos. Las muestras deberían obtenerse del sitio de la infección sin que se contaminaran con otros tejidos adyacentes ni secreciones. Todas las muestras, excepto las heces, deberían recogerse en un recipiente estéril y ser etiquetadas con el nombre y el número de identificación de la persona a la que pertenece la muestra, la fuente de la muestra y la hora a la que fue recogida. Después de recogidas, las muestras deben ponerse en una bolsa de residuos biológicos y ser transportadas al laboratorio tan pronto como sea posible. Si el retraso es inevitable, la orina, el esputo y otras muestras respiratorias, heces y muestras para la detección de Chlamydia trachomatis o virus deben ser puestas en el frigorífico para prevenir un crecimiento de la flora normal. El líquido cefalorraquídeo (LCR) y otros fluidos corporales, la sangre y muestras recogidas para determinar Neisseria gonorrohoeae deben dejarse a temperatura ambiente, porque el frío afecta adversamente a la determinación de patógenos potenciales en estas fuentes.
Cada director de laboratorio debe establecer unos criterios para rechazar muestras Inadecuadas para cultivo. La mayoría de los microbiólogos coinciden en que las siguientes muestras deberían ser rechazadas. • • • •
Cualquier muestra recibida en formol. Esputos recogidos hace 24 horas. Muestras de contenedores en los que se ha derramado la muestra. Muestras que han sido inyectadas en placas de agar que se han secado o están caducadas. • Muestras contaminadas con bario, tintes químicos o agentes grasos. • Muestras de sondas Foley. • Muestras duplicadas (excepto hemocultivos) recibidas en un período de 24 horas. Las siguientes muestras deberían ser rechazadas para el cultivo de anaerobios: lavados gástricos, la orina de la mitad de la micción, heces (excepto para determinar Clostridium difficile) para estudios epidemiológicos o para el diagnóstico de la bacteria asociada a la intoxicación alimentaria (se explicará posteriormente), muestras orofaríngeas. excepto las muestras obtenidas de tejidos profundos durante un procedimiento quirúrgico, esputos, muestras de colostomía o ileostomía obtenidas con torunda y muestras superficiales de piel. Además, deberían establecerse unas normas para el manejo de muestras que no están etiquetadas o mal etiquetadas; dichas muestras no deberían ser analizadas hasta que se hubieran resuelto las diferencias. Con el manejo de todas las mueslras deben seguirse unas precauciones universales. Esto significa que hay que usar barreras adecuadas para prevenir la exposición de piel y mucosas a las muestras. En todo momento deben llevarse guantes, mascarillas y gafas (o trabajar detrás de una protección de plástico), y deben llevarse trajes o delantales impermeables en situaciones que haya riesgo de que se derrame el contenido. Lo deseable sería que todos los recipientes para muestras, como minimo esos que contienen secreciones respiratorias y los que se someten especialmente para la detección de una micobacteria u hongo, se abrieran en una cabina de seguridad. Las muestras recogidas para aislar un virus deberían ser manejadas en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación de los cultivos celulares. Cuando las muestras o cultivos tienen que ser transportados a través del servicio postal de EE.UU. a un laboratorio de referencia, deben ser empaquetados de acuerdo al código interestatal de transporte de agentes biológicos.
CAPÍTULO 57
•
MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Las muestras deben estar limitadas a no más de 40 mi. Los cultivos de bacterias y hongos deberían crecer en unos tubos en un medio sólido. El cierre del recipiente primario (tubo o vial) debería ser sellado con una cinta resistente al agua e introducido en un segundo contenedor (preferiblemente metal) rodeado por una cantidad de material suficiente para absorber el volumen total de la muestra por si el primer contenedor se rompiera o saliera. El segundo contenedor debe ser cerrado y puesto en un recipiente para transportar (hecho de cartón, fibra mecanizada o poliestireno), y etiquetado con una etiqueta oficial de agentes etiológicos (disponible en los centros para la prevención y control de enfermedades). Si una muestra debe ser transportada en hielo seco (que está considerado como material de riesgo), debe decir "Hielo seco, muestra clínica congelada". El hielo seco debería ponerse luera del segundo recipiente con el material empaquetado, de manera que el material no se pierda dentro del recipiente extemo si el hielo seco se evapora.
SANGRE La detección de patógenos en la sangre es una de las (unciones más importantes del laboratorio de microbiología. El hemocultivo es imprescindible para identificar la bacteria responsable de la bacteriemia, la sepsis, las infecciones de válvulas nativas y protésicas, la tromboflebitis infecciosa, los aneurismas fúngicos y las infecciones de injertos vasculares. Los hemocultivos también son útiles en el diagnóstico de algunas infecciones víricas e infecciones invasivas o diseminadas causadas por ciertos hongos, especialmente especies de Candida. Cryptococcus neolormans. especies de Fusarium e Histoplasma capsutalum. Los parásitos son detectados en la sangre por un examen microscópico de frotis de sangre periférica. En general, la sangre deberia ser recogida para cultivo antes de empezar el tratamiento con antibióticos o cuando esté presente uno o una combinación de los siguientes síntomas: fiebre (38"C o más), hipotermia (36"C o menos), leucocitosis (especialmente con desviación a la izquierda), granulocitopenia o hipotensión. El tiempo de detección y la identificación exacta de los organismos en la sangre depende de una adecuada recogida, del transporte y del proceso de la muestra. La técnica para detectar todos los microorganismos en la sangre es la flebotomía. Para minimizar la contaminación de la muestra sanguínea con la flora de la piel, el lugar de la venopunción deberia prepararse con un agente bactericida (el 70% de isopropanol o alcohol etílico) y después con 1%-2% de solución yodada o clorhexidina. Para una asepsia mayor, el lugar debería estar seco 1 ó 2 minutos antes de la venopunción Otros aspectos de la recogida de muestras varían para bacterias, virus y parásitos. Detección de bacterias y hongos. El momento óptimo para sacar los hemocultivos cuando se sospecha una bacteriemia o funguemia es antes del resfriado, pero como eso no se puede predecir, la mayoría de los hemocultivos se recogen después de comenzar con fiebre o catarro. La sangre se extrae con una aguja y una jeringa y, sin cambiar la aguja, se inyecta directamente en los frascos de hemocultivo o en otro sistema de hemocultivo (Krumholz. 1990). Los frascos o tubos inyectados deben invertirse inmediatamente varias veces para asegurar la mezcla, y ésta deberá transportarse al laboratorio a temperatura ambiente lo antes posible después de haber sido recogida. Los hemocultivos nunca deben ponerse en el frigorífico. En adultos con bacteriemia, el número de unidades formadoras de colonias (CFU) por mi de sangre generalmente es bajo. En un estudio, por ejemplo, el 25% de los pacientes con Staphilococcus aureus y más del 50% con Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa tienen menos de una colonia por mililitro de sangre (Henry. 1986). Dado este bajo nivel de bacteriemias en adultos, es recomendable recoger de 20 mi a 30 mi de sangre para el hemocultivo (Washington, 1986; llstrup, 1983). En recién nacidos y niños, la concentración de microorganismos en la sangre es mayor, por lo que con recoger de 1 mi a 5 mi es suficiente (Dietzman, 1974). Las recomendaciones relacionadas con el número de muestras que hay que tomar están basadas en la naturaleza de la bacteriemia. dependiendo de si es transitona, intermitente o continua. La bacteriemia transitoria sigue a un proceso de manipulación de un foco de infección (un absceso, un forúnculo o
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celulitis), instrumentación de una superficie mucosa infectada (como ocurre en procesos dentales, cistoscopías, sondaje vesical, aborto provocado o sigmoidoscopia) o un procedimiento quirúrgico de una zona contaminada (como resección transuretral de la próstata (RTU), histerectomía, resección de colon y desbridamiento de quemaduras infectadas). La bacteriemia transitoria también aparece al principio de muchas infecciones sistémicas y locales, como meningitis, neumonía, artritis piógena y osteomielitis. La mayor parte de las bacteriemías intermitentes se asocian con abscesos que no se han drenado, mientras que una bactenemia continua es evidencia de una infección intravascular, como endocarditis bacteriana, aneurisma fúngico. o un catéter intravascular infectado. Una bacteriemia continua también se produce durante las primeras semanas de una fiebre tifoidea y brucelosis. Dos hemocultivos separados son casi siempre los adecuados para descubrir los patógenos responsables de las infecciones intravasculares (Werner, 1967). En un estudio de personas con infección intravascular, los porcentajes de positividad del primero, de los dos primeros y tres primeros hemocultivos por episodio séptico eran del 80%. 90%. 99%. respectivamente (Washington, 1975). Los datos de otro estudio mostraron que el 91% de los episodios sépticos eran detectados en el primero hemocullivo, porcentaje que aumentaba hasta el 99% con el segundo hemocultivo (Weinstein. 1983). Por tanto, tres hemocultivos en un período de 24 horas deberían ser suficientes para detectar casi todas las bacterias potencialmente patógenas. El intervalo adecuado entre hemocultivos es desconocido, pero se ha sugerido que es de 30 a 60 minutos. Sin embargo, si es urgente el comienzo del tratamiento con antibiótico, los hemocultivos deberían recogerse de sitios diferentes con un intervalo de pocos minutos antes de empezar el tratamiento. Los organismos como el estafilococo coagulasa negativo. Streptococcus viridans. Corinebactenum. Bacillus spp. y Propiontbacterium son contaminantes frecuentes de los hemocultivos, pero también podrían ser verdaderos patógenos. Recoger dos grupos de hemocultivos por episodio febril ayuda a distinguir probables patógenos de contaminantes. Los últimos, generalmente, están presentes en un solo frasco del cultivo, mientras que los patógenos se recogen en más de un frasco. Como puede haber más de un episodio febril en un período de 24 horas y deben sacarse dos muestras de hemocultivo por episodio, debería estar permitido un máximo de 4 muestras. La mayoría de las muestras sanguíneas son extraídas por venopunción periférica. La recogida de muestra arterial no parece que muestre mejor los microorganismos, y el hemocultivo recogido a través de un catéter intravascular se asocia con un aumento de supuestos contaminantes. Como con este último método con frecuencia se necesitan más cultivos y tratamiento antibiótico innecesario, no se recomienda hacer la recogida de sangre para cultivos de un catéter intravascular, excepto para catéteres umbilicales arteriales en niños (Reller. 1982: Cowett. 1976). Sin embargo, varios cultivos recogidos de un catéter intravascular podrían ser útiles para determinar si el catéter es el foco de infección (Wmg. 1979). Los factores del huésped tales como anticuerpos, complemento, células blancas fagocíticas y agentes antimicrobianos podrían impedir el crecimiento de los microorganismos en la sangre; por tanto, se han usado varios modos de contrarrestar estos factores. Diluir la sangre en un medio en una proporción 1:10 produce una adecuada neutralización de la actividad bactericida en el suero (Washington, 1986). Incorpora de 0,025% a 0,05% de sodio pohanetolsulfonato en el medio del cultivo inhibe la coagulación, la fagocitosis y la activación del complemento e inactiva los aminoglucósidos. Entre los métodos que contrarrestan la presencia de agentes antimicrobianos se incluye añadir penicilinasas al caldo para inactivar las penicilinas: usar resinas que se adsorban a los antibióticos o usar el sistema de centrifugación para la lisis, por el cual se produce la Nsis de las células blancas y rojas, los microorganismos se concentran por medio de la centrifugación y la concentración se cultiva en un medio libre de antibióticos. Existen varios sistemas para analizar la sangre, cada uno con sus ventajas y desventajas (Wilson, 1996; Reimer, 1997). En los sistemas convencionales para analizar los cultivos, que usan un medio liquido enriquecido con nutrientes, se pueden cultivar la mayoría de las bacterias. Para recuperar aerobios y anaerobios facultativos se utiliza soja triplica, peptona suplementada. infusión de cerebro-corazón. Columbia o caldo de brúcela y lioglucato (THIOl o caldo de infusión de corazón anaerobio se usa para aislar anaero-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
bios. Por lo general se inoculan dos frascos, y uno de ellos se abre para asegurar el crecimiento de los aerobios. Dada la disminución de las bacteriemias producidas por anaerobios, se está cuestionando la técnica de usar un Irasco para aerobios y otro para anaerobios (Murray, 1992: Sharp, 1991), La inoculación sistemática en dos frascos para aerobios y hacer cultivos selectivos de anaerobios podría permitir la detección de más bacteriemias y funguemias. Los frascos de cultivo se revisan diariamente durante 7 días para ver si hay crecimiento, indicado bien por turbidez, hemolisis, producción de gas, un número discreto de colonias o por la combinación de éstos. Cuando el crecimiento es aparente, una extensión del cultivo se tiñe con una tinción de Gram y se examina al microscopio, y el caldo es subcultivado en un medio agar apropiado. Un subcultivo habitual de las muestras macroscópicamente negativas debería ser realizado del frasco abierto, y de 6 a 18 horas después de haber inyectado. Hacer un subcultivo del Irasco de anaerobios es innecesario. Las ventajas de los cultivos convencionales son un coste más bajo de material y un porcentaje menor de contaminación. El principal inconveniente es el tiempo que se utiliza en los subcultivos periódicos. Un método menos laborioso consiste en una botella con medio de cultivo al que se le añade una cámara que contiene un medio agar. Para subcultivar este sistema bilásico hay que dar la vuelta al frasco varias veces, permitiendo que la sangre y el medio agar se mezclen. Las colonias en el medio agar se usan para identificar y hacer test de sensibilidad. Para cultivar aerobios, bacterias resistentes y levaduras, este sistema es comparable a otros sistemas, siendo igual o mejor que ellos (Murray, 1991). Sin embargo, la rentabilidad para anaerobios podría ser mayor que en los medios de cultivo convencionales. El sistema de lisis por centrilugación consiste en un tubo que contiene reactantes que inhiben la coagulación y la cascada del complemento, produce la lisis de las células sanguíneas y tampona los microorganismos durante la centrifugación. Se añade la sangre al tubo, que se invierte varias veces para evitar la coagulación, y se transporta al laboratorio lo antes posible. Lo ideal es que la muestra se procese inmediatamente, pero puede ser retrasada 8 horas sin efectos adversos para la recuperación de los microorganismos. Para realizar el cultivo, el tubo es centrifugado durante 30 minutos a 3.000 x g, el sobrenadante se desecha y el sedimento se mezcla en una mezcladora colocándose en medio agar. También se puede hacer lo mismo con los tubos más pequeños de menor volumen de muestras de recién nacidos y niños. Las ventajas de la lisis por centrifugación incluyen una recuperación mayor de Staphylococcus aureus, algunas enterobactenas y hongos (es el mejor sistema para recolectar mohos, como el Histoplasma capsulatum), la disponibilidad directa de colonias para la identificación y el test de sensibilidad y la capacidad de llevar a cabo varios cultivos. Además, este sistema es flexible porque se pueden inyectar medios de cultivo especiales para recuperar organismos con unos requerimientos específicos de crecimiento, tales como especies para Legionelta y micobacterias. Sin embargo, el sistema es muy laborioso y es menos probable encontrar Streptococcus pneumonieae. Haemophilus influenzae o anaerobios y el riesgo de contaminación aumenta. Están disponibles en el mercado varios sistemas automáticos para tener la sangre continuamente monitorizada (Wilson, 1996). La ventaja de estos sistemas es que eliminan la necesidad de hacer un subcultivo y acortan el período de incubación habitual de 7 a 5 días (Woods. 1994; Reisner, 1999). Uno de estos sistemas está basado en el cambio de color ante la detección de CO, (Thorpe, 1990), gracias a una membrana que es impermeable para la mayoría de los iones y componentes del medio y de la sangre, pero permeable al CO . Los frascos de aerobios y anaerobios con el inoculo se colocan en celdas en el aparato, proporcionándoles un movimiento continuo. Si hay bacterias, éstas generan C0 que se libera en el medio; el pH entonces disminuye haciendo que el sensor cambie de verde a amarillo. Los cambios de color se monitorizan una vez cada 10 minutos por un detector del cambio de color. Los medios disponibles para utilizar con este sistema incluyen los medios habituales de aerobios y anaerobios que necesitan de 5 mi a 10 mi de sangre, el Pedi-BacT, que necesita 4 mi de sangre o menos, y FAN (neutralización cuidadosa de antibióticos), que intensifica el crecimiento de hongos y bacterias en pacientes con tratamiento antibiótico. ?
2
Un segundo sistema de monitorízación continua se basa en una tecnología de lluorescencia (Nolte, 1993). Hay un sensor de CO en la base de ?
cada vial que es impermeable para los iones, los componentes del medio y la sangre, pero permeable para el C0 . Si hay organismos presentes, liberan CO, en el medio, se difunde por la matriz del sensor y genera iones hidrógeno. El consiguiente descenso del pH aumenta la fluorescencia del sensor cambiando la señal transmitida a los componentes ópticos y electrónicos del aparato. El ordenador genera curvas de crecimiento y los datos se analizan de acuerdo con unos algoritmos crecientes. Las botellas que han sido inoculadas se ponen en celdas individuales del aparato, donde los frascos de aerobios y anaerobios están continuamente en movimiento. Los medios aerobios y anaerobios de poco volumen (de 5 mi a 7 mi de sangre) y de gran volumen (8 mi o 10 mi de sangre), el medio Peds-Plus (de 0,5 mi a 5 mi de sangre) y el medio Myco F Lytic son válidos para hallar hongos y micobacterias (Waite. 1998). 2
:
Un tercer sistema detecta el crecimiento de los organismos en el caldo midiendo el consumo y/o producción de gas (Zwadyx. 1994). Cada vial inoculado se ajusta con un conector desechable que contiene una aguja hueca. La aguja penetra en el tapón de la botella y conecta el cuello de la botella con el sensor. Los monitores del sensor cambian dentro del cuello de la botella por el consumo y/o producción de gases (CO „ H y H,) producidos por el crecimiento de organismos y crea unos datos dentro del ordenador. Hay dos medios básicos disponibles (medio aeróbico y anaeróbico) que contienen 80 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 10 mi de sangre, y frascos aeróbicos y anaeróbicos EZ Draw que contienen 40 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 5 mi de sangre. r
}
El hallazgo de algunas bacterias requiere un medio especial o una incubación larga. Por ejemplo, cuando se sospecha brucelosis, la sangre debería sacarse al principio de la enfermedad y los hemocultivos deberían incubarse durante 3 ó 4 semanas, aunque con los sistemas automáticos la Brucella con frecuencia crece en menos de una semana (Bannatyne. 1997). Las infecciones producidas por Borrelia, excepto Borrelia burgdorferi (causante de la enfermedad de Lyme, más frecuentemente diagnosticada serológicamente), se diagnostican por la detección de espiroquetas en sangre periférica durante un periodo febril. Los organismos se visualizan al microscopio de campo claro u oscuro en preparaciones en fresco mezclando una gota de sangre con una gota de citrato sódico, o bien en frotis grueso o fino teñidos con Giemsa o tinte de Wright examinados por un microscopio de luz. Para aislar la Leptospira mterrogans en sangre, se debe añadir unas gotas de sangre fresca o anticoagulada, recogida durante la primera semana de la enfermedad, a cada uno de los 3 ó 4 tubos de medio de cultivo semisólido de leptospiras (el medio de Fletcher o el de Ellinghausen-McColloughJohnson-Harris). Podemos utilizar diferentes métodos para aislar las micobacterias en las muestras de sangre. Un modo es mediante la lisis por centrifugación, colocando el sedimento en un medio sólido y/o líquido y, posteriormente, los cultivos se incuban durante ocho o más semanas. Otra posibilidad, y quizás un método más rápido, es la inoculación directa del medio Myco-F Lytic (momtorizado para el crecimiento por el apáralo BACTEC 9000) o el medio 13 A (monitorizado por el BACTEC 460TB). Detección de virus. Las muestras de sangre son útiles en el diagnóstico tan sólo en un número limitado de infecciones por virus (Tabla 57-1). La viremia generalmente se produce durante el periodo de incubación o los dos primeros días después de que los síntomas comiencen, por lo que la muestra de sangre debe tomarse al comienzo de la enfermedad. Una excepción es la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que se detecta con facilidad en sangre periférica, células mononucleares y plasma de la mayoría de las personas seropositivas y, además, en casi cualquier fase de la enfermedad. Una muestra de sangre recogida de una vena periférica o de un catéter intravascular es adecuada para detectar el virus. Los requisitos de la muestra dependen de cada virus (Tabla 57-1). Todas las muestras de sangre deberían ser llevadas al laboratorio lo antes posible. Si es inevitable un retraso en el análisis, las muestras deberían estar toda la noche a 4°C, excepto las muestras de plasma para la detección del ARN del VIH, que debe ser analizado dentro de las 6 primeras horas de la recogida de la muestra. Aquí vamos a hacer hincapié en la técnica de detección del CMV y de los enterovirus empleados en la mayoría de los laboratorios. Para la detección de otros virus, los de la Tabla 57-1, por lo general las muestras se mandan a un laboratorio de referencia.
CAPÍTULO 57
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
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Tabla 57-1 R e q u e r i m i e n t o s d e las m u e s t r a s para u n a óptima detección d e los virus hallados e n sangre Requerimientos de las muestras de sangre Virus Citomeqalovirus Enlorovirus Virus de la inmunodehciencia humana' Virus del herpes humano-6 Parvovirus B 1 9 Virus transmitidos por artrópodos'
Modo de recolección Con anticoagulante' Con o sin anticoagulante' EDTA Heparinizado Sin anticoagulante Con o sin anlicoagulante
Parte empleada para la detección Leucocitos Suero o leucocitos Células mononuclearcs o plasma Células mononucleadas Suero Leucocitos o coágulo homogeneizado
Vo lumen (mi) 5 - 1 0 5 - 1 0 2 - 5 5 - 1 0 5 - 1 0 5 - 1 0
"Se puede utilizar hepanna o EDTA para ciloinegalovirus: para los enterovirus se puede usar heparina. citrato o EDTA 'Para monilorizar la carga viral de VIH en pacientes en tratamiento con terapia anlirretroviral •Incluye a los v i r u s del este, oesle y la encefalitis equina venezolana, encefalitis de San Luis y California, fiebre amarilla, dengue y liebre de la garrapa la de Colorado EDTA: acido etileriediarninoletraacético, VIH: virus de la mmunodeficiencia humana.
Para la detección de CMV y enterovirus en sangre, se debe separar el componente sanguíneo que tenga más probabilidad de contener el virus y su inoculación en un cultivo de células en monocapa que aguanten la replicación viral o preparar una extensión para teñir con anticuerpos monoclonales. El CMV se detecta con más frecuencia en los neutrófilos, pero podría estar presente en las células mononucleares de la sangre periférica; de este modo, para una detección adecuada, los neutrófilos y células mononucleares debehan ser cultivados o teñidos (Howell, 1979). Los enterovirus se pueden obtener con igual probabilidad tanto de los leucocitos o células mononucleares como a partir del suero (Prather, 1984). Para separar los leucocitos hay que recoger sangre con anticoagulante, siendo el citrato o la hepanna sódica los anticoagulantes permitidos (Woods. 1987; Storch, 1994). Para separar el suero, la sangre se recoge en un tubo sin anticoagulante y se coagula a 4 C. Cuando se forma un coágulo, la sangre se centrifuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 C y el suero se separa de un modo aséptico. El tipo de cultivo celular para aislar el virus se debe seleccionar en función del virus que esperemos encontrar. Para aislar el CMV se recomienda emplear dos tubos de MRC-5 u otras células fibroblásticas humanas para cultivo. La incubación celular en un medio que contenga 10 M dexametasona. durante un mínimo de 24 horas antes de la inoculación, aumenta el porcentaje de detección de CMV y disminuye el tiempo para la aparición del efecto citopático (Thiele. 1988). Para aislar enterovirus. debería inyectarse MRC-5 y células primarias de riñon de mono, y el porcentaje de aislamiento podria aumentar también mediante el empleo de células de riñon de búfalo y células humanas de rabdomiosarcoma (Dagan. 1986). Las muestras de suero incubadas deben ser posteriormente examinadas para el efecto citopático especifico del virus. Para las muestras de leucocitos, la capa celular de cultivo debe ser inoculada con 0,5 mi de muestra, añadiendo 1 mi de medio de mantenimiento y dejando en incubación toda la noche. Posteriormente, la suspensión celular se coge y se lava con salmo estéril amortiguado con fosfato, añadiéndose 1,5 mi de medio de mantenimiento, y se vuelve a colocar a cultivar. 5
Además de un cultivo convencional de las células debería realizarse un cultivo del centrifugado cuando se solicite CMV (Woods. 1987). Un método más sensible para detectar CMV en sangre es el test de la antigenemia, que se realiza tiñendo la preparación del citocenlrifugado de leucocitos con anticuerpos monoclonales contra proteínas virales (pp 65) (Van Der Bij, 1988; Brumback, 1997), Detección de parásitos. Las muestras de sangre son útiles para el diagnóstico de malaria, babesiosis. tripanosomiasis y algunas diarias. Las muestras deberían ser recogidas en tubos con anticoagulante y transportadas rápidamente al laboratorio. Si las extensiones deben ser enviadas a un laboratorio de referencia, deben fijarse con alcohol inmediatamente tras su preparación. Las técnicas utilizadas en el laboratorio para detectar esos
parásitos son las mismas y se van a exponer aquí, desde la más simple a la más compleja. La técnica más sencilla para detectar parásitos en la sangre es el examen directo. Para prepararlo se coloca una gota de sangre en un porta de cristal, se tapa con un cubre portas y se analiza inmediatamente. La observación directa es excelente para el diagnóstico de tripanosomiasis, ya que los tripomasligotes y las microfilarias pueden, con frecuencia, verse en movimiento con un bajo o mediano aumento. El diagnóstico definitivo se hace por la tinción de las muestras. La extensión usada en hematología, teñida de un modo similar, es una preparación habitual para determinar las especies de Plasmodium. Babesia. Trypanosoma y microfilarias. Las extensiones para la búsqueda de parásitos se deben fijar y después teñirse manualmente con Giemsa. aunque la tinción hematológica automática es también válida. Las muestras se deben observar inicialmente a bajo aumento para detectar microfilarias, que son objetos grandes (entre 100 pm y 200 pm) y que por lo general se ven con facilidad en los bordes de la extensión. Después de localizadas, las microfilarias deberían estudiarse bajo una lente de aceite de inmersión para su correcta identificación (véase Cap. 55). Después de observarla con bajo aumento, la extensión se examina con un objetivo de gran aumento para buscar tripanosomas, y finalmente con el uso de aceite de inmersión para buscar e identificar Plasmodium, Babesia y Trypanosoma. Las extensiones más grandes son útiles para detectar todos los parásitos antes mencionados y son parte de los requisitos minimos para su diagnóstico. Se coloca una gota de sangre en un porta y con la esquina de otro porta se separa cuidadosamente para que ocupe 1 cm-. La preparación se deja secar y sin fijarla se tiñe con Giemsa, permitiendo su deshemoglobinización.
FLUIDOS CORPORALES Líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR se recoge para el diagnóstico de meningitis y. menos frecuentemente, de encefalitis víricas. Una meningitis infecciosa es una emergencia médica que requiere tratamiento urgente para evitar la muerte o secuelas neurológicas serias; se divide en aguda, subaguda y crónica en función de la duración de los síntomas (Tabla 57-2). Una presentación aguda se produce en el 10% de los casos y la causa más frecuente es infección bacteriana. Casi todas las personas con meningitis viral y el 75% de los que tienen meningitis bacteriana tienen un cuadro subagudo. mientras que el resto presentan meningitis crónica (los patógenos responsables están recogidos en la Tabla 57-2). Los enterovirus son los causantes más comunes de la meningitis y deberían ser los primeros en ser considerados en el diagnóstico diferencial de meningitis en un niño o adolescente al linal de
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
Tabla 57-2 Pruebas c o m e r c i a l e s de A D N para la identificación de cultivos* Duración
Síndrome Agudo ; Subagudo Crónico
Probables patógenos
<24 horas
Bacterias piógenas
t a 7 dias Al menos 4 semanas
Enterovirus, bacterias piógenas Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Brucella sp Leptospira interrogans Borrelia burgdorferi Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Candida spp.
verano y principio de otoño. La bacteria productora de pus responsable de la meningitis varía según la edad del paciente (Tabla 57-3). El LCR por lo general se obtiene mediante punción lumbar, pero algunas veces se aspira de ventrículos directamente o se recoge de un cortocircuito. Al igual que para cultivo de sangre, también la asepsia de la piel es fundamental para extracción y recogida del LCR, que se envía normalmente al laboratorio en tres tubos. Las sugerencias para realizar los test en cada tubo son: tubo 1. recuento celular; tubo 2, preparación de extensiones para teñir con la tinción Gram u otros tintes para cultivo; tubo 3. proteínas y glucosa y. si está indicado, test especiales, como el del antigeno criptocócico, test serológico para la sífilis, otros estudios serológicos y citología. Los parámetros normales de LCR y los cambios que se producen durante la meningitis en función del organismo causal se recogen en la Tabla 57-4, El LCR debe llevarse rápidamente al laboratorio y tiene que analizarse lo antes posible. Si el retraso es pequeño, la muestra debe dejarse a temperatura ambiente, salvo que se pida un cultivo viral, en cuyo caso habría que meter en el frigorífico una muestra (preferiblemente 1 mi, pero nunca menos de 0,5 mi) durante un breve espacio de tiempo. El proceso de analizar la muestra es diferente para bacterias, hongos, virus y parásitos y se expone de modo separado para cada grupo de microorganismos. Procesar LCR para un cultivo habitual bacteriológico incluye su concentración (si se recibe 1 mi o más de muestra), preparación de una extensión pequeña para teñir con tinción Gram y cultivo. La concentración se consigue mediante la centrifugación del líquido durante 15 minutos al menos a 1.500 x g. El sobrenadante se deja en un tubo estéril, dejando como 0,5 mi de sedimento y liquido, que son completamente mezclados en una mezcladora o con la ayuda de una pipeta estéril. Como alternativa, si se reciben 2 o más mililitros, el fluido podría ser concentrado filtrándolo a través
Tabla 57-3 C a u s a s bacterianas m á s habituales de meningitis aguda s e g ú n la e d a d Edad Neonalos-3 meses
4 meses-6 años' Seis años-45 años >45 años
Organismos Streptococcus del grupo B Escherichia coli Listeria monocytogenes' Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Streptococcus del grupo B
"Puede producir meningitis en inmunosuprimidos en rodos los grupos de edad. 'La incidencia en EE.UU. de meningitis debida al Haemophilus inlluenzae tipo 0 ha disminuido drásticamente gracias a la vai unación
Tabla 57-4 Parámetros d e l liquido cefalorraquídeo normal y c a m b i o s en la meningitis infecciosa — — - ~ ~ — ^ ~ ~
cwwu Normal Meningitis Aguda/subaguda bacteriana Crónica bacteriana tuberculosas, hongos Enterovirus
GB (célsAil)-
Proteínas (mg/dl)
Glucosa (mg/dl)
5 (linlocitos)
14-45
45-100 (2/3 serum)
500-200 000 (PMN)
elevado
baio
200-2 000 (linfocitos)
elevado
ba|o
200-2 000 elevado (al principio PMN; después linfocilos) GB células blancas; PMN: leucocitos polimorfo nucleares. "Se citan las células habitualmente predominantes
normal
de un filtro estéril desechable de 0,45 pm y usar el filtro para su cultivo (se explica más adelante). Sin embargo, antes de filtrar la muestra, se ponen 0.5 mi en un tubo estéril y se centrifuga para preparar las extensiones para teñir con la tinción Gram (como ya se ha descrito) o. preferiblemente, se hace una preparación citocentrifugada (Shanholtzer, 1982), Después de preparar la extensión, el medio se inyecta como se explica en el Capitulo 50. Las muestras filtradas se colocan hacia abajo en la superficie de agar chocolate, y tras 24 y 48 horas de incubación, se desplaza con una pinza estéril a otro lugar para detectar las colonias formadas debajo de él. Además de la tinción de Gram para las muestras y cultivo, los test de aglutinación de látex para la detección de antigenos de Streptococcus del grupo B. Streptococcus pneumoniae, algún serotipo de Neisseria meningitidis. E. coli (el antigeno capsular K1 hace una reacción cruzada con el tipo B de Neisseria meningitidis) y Hemophilus inlluenzae tipo B. se debería realizar la técnica del sobrenadante de una muestra centrifugada, la filtración de una muestra previamente filtrada o de un muestra original. Estos test de látex son más útiles para diagnosticar las meningitis tratadas incompletamente (Maxson, 1994; Bhisitkul. 1994) y para confirmar una extensión positiva para la tinción con Gram. La realización sistemática de los test de látex debería descartarse porque, en comparación con las muestras teñidas con Gram, su sensibilidad no es significativamente mayor y son mucho más caros (Perkins, 1995; Kiska, 1995). El diagnóstico de la meningitis bacteriana crónica requiere una petición especial, ya que el LCR se maneja de modo diferente para cada entidad. Para diagnosticar la brucelosis. el LCR se procesa como se ha descrito anteriormente para un cultivo bacteriano ordinario, pero los medios se incuban dos o tres semanas. Para leptospirosis. Leptospira interrogans, debería cultivarse el LCR de las primeras semanas de la enfermedad. Los medios especiales (mencionados antes) se inyectan con unas pocas gotas de LCR y se incuban como se ha explicado en el Capítulo 50 El diagnóstico de neurosífilis se basa en encontrar en el LCR los siguientes hallazgos: pleocitosis. concentración de proteínas aumentada, un test de laboratorio de investigación de enfermedad venérea positivo (VRDL, LCR VRDL), que de momento es el único método útil para la detección de anticuerpos para Treponema pallidum en el LCR (véase Cap. 52). El test de enfermedades venéreas en el LCR se indica sólo si la persona tiene el suero positivo para la sífilis (Albright, 1991). La muestra debería conservarse en el frigorífico hasta que se haya examinado. La afectación del SNC por Borrelia burgdoferi (enfermedad de Lyme) también se diagnostica serológicamente mediante la detección de IgM e IgG especificas en el suero y LCR. El análisis del LCR para la detección de micobacterias sólo está indicado en muestras con pleocitosis, elevación de glucosa o proteínas (Albright, 1991). Para una adecuada recuperación del germen se recomienda el cultivo de al
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
menos 5 mi. El fluido se cenlrifuga a 3.000-3.600 x g durante 30 minutos, se saca el sobrenadante, el sedimento se mezcla completamente en una mezcladora y se usa para preparar muestras para teñir e inocular en medio apropiado (véase Cap. 53). El análisis del LCR para la detección de hongos es el mismo que el descrito para la detección de bacterias en un cultivo habitual. Los organismos se concentran por centrifugación o filtración. Una preparación obtenida por citocentrifugación o una extensión del sedimento teñido con Gram se examina, y se coloca en el medio adecuado para cultivo (infusión de cerebrocorazón o el agar de Shabi sin antibióticos). Para muestras filtradas, el filtro se corta con unas tijeras estériles en dos partes, cultivando una para bacterias y la otra para hongos. El cultivo de las muestras centrifugadas se hace colocando una parte del sedimento en diferentes lugares de la superficie del agar. Además de los cultivos de LCR y las tinciones con Gram, hay disponibles unos test rápidos para el diagnóstico de meningitis causada por Chptococcus neoformans: preparación de tinta china, aglutinación con látex y ensayo mediante unión enzimática inmunoadsorbente (ELISA), Los dos últimos son específicos para el antigeno capsular. Las células encapsuladas del C. neoformans son visibles en el LCR mezclado con tinta china (una gota de sedimento de LCR con una gota de tinta china, disponible en tiendas de arte) en un cristal y examinadas bajo un gran aumento (Fig. 57-1). La sensibilidad de la tinta china es baja excepto en personas infectadas por VIH, por lo que el test de aglutinación con látex para el criptococo o la ELISA (que son altamente específicos y que tienen más del 90% de sensibilidad) son los recomendados para el diagnóstico. Estos dos últimos test pueden ser hechos en un filtro de LCR (si la muestra fue concentrada por filtración), en el sobrenadante de una muestra centrifugada o en LCR sin centrifugar. Un falso positivo en los resultados de la aglutinación con látex se debe a la presencia de Trichosporon beigelii en el fluido del test o a la aparición de condensación del agar en dicho fluido. Para evitar este último problema, el test de látex debería hacerse antes del cultivo o mejor en una muestra separada (Heelan, 1991). El análisis del LCR para el diagnóstico de infecciones virales consta de un cultivo convencional celular (principalmente para la detección de enterovirus), cultivo para virus causantes de encefalitis (equina occidental, equina oriental, equina venezolana, San Luis, japonés y La Crosse) y test serológicos. Además, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) está siendo investigada como una herramienta para la detección de enterovirus, virus del herpes simple y para el análisis del ácido nucleico del CMV en LCR, pero en la actualidad no hay equipos disponibles en el comercio. Las líneas celulares para aislar enterovirus son las ya expuestas previamente para las muestras hemáticas.
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El LCR es en ocasiones enviado al laboratorio para el diagnóstico de tripanosomiasis africana (Trypanosoma gambiense o Trypanosoma rhodesiense) o infección con amebas libres (Naegleria fowlery y especies de Acanthamoeba). Una vez que se recibe la muestra en el laboratorio, debería analizarse inmediatamente. Las preparaciones frescas se preparan directamente de la muestra y del sedimento, agitando primero suavemente el tubo para prepararlo (paso necesario, porque los parásitos con frecuencia se quedan en la pared del tubo) y después centrifugando la muestra a 250 x g durante 10 minutos. Las preparaciones se examinan en el microscopio con el condensador a baja potencia para permitir la visualización de trofozoitos o, preferiblemente, en un microscopio de contraste. Los cultivos de amebas de vida libre del LCR se hacen en unas placas de agar no nutriente cubiertas con una suspensión de E. coli o Enferobacler aerogenes. El fluido se centrifuga a 250 x g durante 10 minutos, el sobrenadante se mueve con una pipeta estéril y el sedimento se mezcla con 0,5 mi de solución salina y se coloca en el centro de la placa. El cultivo se incuba a 37°C y se examina diariamente durante 10 días bajo el microscopio con un objetivo 10x (Martínez, 1991). Otros fluidos corporales. Se recogen del pericardio, de la cavidad torácica o de la peritoneal aspirando con una aguja y jeringa. El volumen adecuado para aislar la mayoría de las bacterias es de 1 mi a 5 mi, pero lo ideal para recoger bacterias y hongos es de 10 mi a 15 mi, que por lo general están presentes en pequeñas cantidades. Por otra parte, para diagnosticar una peritonitis asociada a diálisis peritoneal ambulatoria crónica, la recogida de hasta 50 mi podria mejorar el aislamiento del patógeno causal (Dawson, 1985). Para transportar el fluido, se debe aspirar en un contenedor estéril y debe ser llevado al laboratorio sin demora. Alternativamente, la muestra puede ser inyectada en ese momento directamente a los botes de cultivo; parece ser especialmente útil una aproximación para detectar bacterias en el liquido peritoneal (Luce, 1988). Los enterovirus, principalmente los Coxsackievirus A y B, están entre las causas más comunes de pericarditis infecciosa. Estos virus podrían detectarse en el fluido pericárdico por un cultivo celular convencional, pero como no se detectan en todos los casos, la recogida de un exudado faríngeo y de heces (que es donde más probablemente se produzca el virus), además del fluido pericárdico, es altamente recomendada para aislar el virus en personas en las que se sospecha una pericarditis enteroviral. Otros virus (herpes simple, varicela zóster, CMV, Epstein-Barr, hepatitis B. virus parotiditis, virus influenza) son agentes infrecuentes de la pericarditis y. por general, no se detectan en el líquido pericárdico. El análisis del líquido de las cavidades corporales para la detección de bacterias incluye la preparación de una extensión para la tinción con Gram e inyectar el medio adecuado para cultivo. Como se ha mencionado antes, las muestras pueden inyectarse en ese momento o en el laboratorio. En el laboratorio, el fluido se centrifuga a 1.500-2.500 x g durante 20-30 minutos y el sobrenadante se separa dejando 0,5 mi donde se mezcla el sedimento y después se usa para preparar las extensiones e inyectar el medio. Alternativamente se puede separar un volumen pequeño (0,5 mi) de fluido antes de la centrifugación, y se usa para preparar una extensión para citocentrifugar. El líquido sin centrifugar también podría ser inyectado directamente para un sistema de hemocultivo en el laboratorio, dejando de 0,5 mi a 1 mi para preparar una extensión para hacer una tinción de Gram. Las muestras de fluido usadas para la detección de micobacterias se analizan como se ha descrito antes para el LCR. Los fluidos para el cultivo de hongos deberían estar concentrados mediante centrifugación, como se ha descrito antes para las bacterias. El sobrenadante se separa dejando de 1,5 mi a 2,0 mi. donde el sedimento entero es mezclado. Una muestra de sedimento se aparta para la tinción con Gram, calcoflúor blanco, rojo congo o tinción de plata. Lo ideal es que se inyecten de 0.5 mi a 1 mi de sedimento en un medio de cultivo de hongos (como para LCR), pero también es posible con menos volumen.
Figura 57-1. Preparación de tinta india de líquido cefalorraquídeo que nos muestra las formas de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans. (x 400.)
Los fluidos corporales raramente se recogen para la detección de parásitos; sin embargo Enlamoeba histolylica podría encontrarse en el pericardio, cavidad pleural o peritoneal, debido a la rotura de un absceso en el hígado (en las cavidades peritoneal, pleural o pericárdica) o en los pulmones (cavidad pleural o pericárdica) o a la perforación de úlceras amebianas (en cavidad peritoneal). Los quistes hidatídicos no son frecuentemente diag-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
nosticados por el análisis de los líquidos de las cavidades corporales, también debido a que el quiste se rompe en un lugar contiguo a la cavidad El Huido recogido es generalmente claro y contiene "arena" hidatídica (véase Cap. 55]. pero alguna vez puede ser turbio debido a sobreintección bacteriana. En individuos con infección por filarías es raro que el análisis de una preparación en fresco de un fluido de una cavidad corporal pueda demostrar las microfilias, y en pacientes con hiperinfección por Strongyloides. las larvas podrian detectarse en los fluidos de las cavidades corporales.
TEJIDOS La toma de muestras de tejidos mediante cirugía posee un riesgo considerable para el paciente y supone un gran gasto; por tanto, le corresponde al cirujano tomar una muestra suficiente para el estudio histopatológico y microbiologico. Las torundas por lo general son poco adecuadas para este propósito. La histopatologia de la lesión sirve no sólo para diferenciar entre infección y malignidad, sino también para distinguir entre un proceso supurativo y granulomatoso. En algunos casos los tintes especiales son útiles para establecer la etiología del proceso. En lesiones crónicas el diagnóstico diferencial incluye enfermedad debida a Aclinomyces. Brucella. micobacterias y hongos, y cualquiera de éstos debería estar presente sólo en un número pequeño; de nuevo queremos recalcar la necesidad de obtener muestras adecuadas para cultivo y análisis. Las muestras obtenidas quirúrgicamente para cultivo deben colocarse en un recipiente estéril de boca ancha y. como regla general, el cirujano debería separar asépticamente el tejido en el quirófano y remitirlo a análisis histopatológico y microbiológico. Es importante que exista una buena relación entre histopatólogo y microbiólogo, especialmente en casos de fiebre de origen desconocido, para lo que se realiza una laparotomía exploratoria y se toman varias biopsías. Los tejidos recibidos en el laboratorio deberían ser examinados, describiendo sus características antes de analizarlos. Debe ser entonces cuando se corta muy fino con las tijeras estériles y se deja en un mortero, donde se mezcla con un abrasivo estéril en el caldo para hacer una suspensión al 20%. Esta suspensión se usa para inyectar todo el medio de cultivo necesario y después se deja refrigerar durante por lo menos dos semanas antes de tirarlo.
OJO Muestras conjuntivales. Los raspados conjunlivales o las muestras recogidas con torunda se recogen para determinar el agente etiológico de la conjuntivitis. Las bacterias son los agentes etiológicos más comunes de las conjuntivitis inlecciosas, y los que con mayor frecuencia encontramos son: Streptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis en adultos, y Haemophilus influenza. Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus en niños. El tracoma, que es causada por Chlamydia trachomatis, es la principal causa de ceguera en el mundo. C. trachomatis puede causar conjuntivitis de inclusión en recién nacidos y menos comúnmente en adultos. Los virus son responsables del 15%-20% de los casos de conjuntivitis inlecciosas agudas y, en EE.UU., la mayoría de las epidemias de conjuntivitis víricas las causan los adenovirus. Raramente los parásitos son los causantes de la conjuntivitis. Las células conjuntivas se obtienen de la parte superior e inferior de la conjuntiva tarsal usando una torunda humedecida en caldo de cultivo o una espátula estéril de platino. Lo ideal es que las muestras se preparen y, si se sospecha una infección bacteriana o fúngica, el que recoge la muestra debe inocularla directamente en el medio de cultivo. Si la preparación directa de la muestra o la inyección del medio no fuese posible, se deberían recoger muestras con torunda. Las muestras deberían secarse al aire y rápidamente transportarse al laboratorio junto con el medio inyectado. Si se pide un cultivo viral, hay que recoger una segunda muestra (un raspado o con torunda), colocarla en un medio de transporte viral y llevarla pronto al laboratorio, o bien dejarla en el frigorífico durante un rato y después transportarla en
hielo húmedo. Se podría obtener un diagnóstico rápido por una inmunofluorescencia directa o indirecta de las extensiones de células conjuntivas con anticuerpos específicos para virus, pero el cultivo celular es el método más sensible para detectar patógenos virales potenciales, por lo que siempre debería hacerse. Para detectar Chlamydia trachomatis, se debería teñir con Giemsa una extensión preparada directamente de raspados conjuntivales y debe examinarse para células epiteliales con inclusiones intracitoplasmáticas basofilicas diagnósticas de C trachomatis o. preferiblemente, con anticuerpos monoclonales. que son más sensibles y específicos que la Giemsa. Para obtener buenos resultados con el test de fluorescencia directa de anticuerpos debería usarse el equipo que haya sido proporcionado por el fabricante (véase Cap. 49). Pasamos la torunda directamenle por la superficie del cristal, fijamos el material y el porta se lleva directamente al laboratorio y se deja a temperatura ambiente, o se mete un rato en el frigorífico. Los portas se tiñen de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se ven al microscopio fluorescente para cuerpos elementales (véase Cap. 49). Se considerarán inadecuadas las muestras que tengan menos de 10 células columnares o escamosas metaplásicas. y los resultados deberían ser remitidos sin conclusión, dando una explicación, y debería pedirse otra muestra. El cultivo es el método de referencia para la detección de C. trachomatis y debería hacerse cuando hay una alta sospecha de diagnóstico de conjuntivitis por Chlamydia y el test de fluorescencia directa de anticuerpos es negativo. Muestras corneales. Los raspados corneales y las biopsías son útiles para determinar el agente etiológico de la queratitis, una infección que puede potencialmente producir pérdida de visión y que requiere atención inmediata. Se encuentran bacterias del 65% al 90% de los casos de queratitis, y Sfreptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y especies de Moraxella son los que encontramos con mayor frecuencia en EE.UU. Las muestras corneales se recogen con una espátula de platino estéril y se usa para preparar las extensiones poniéndolas directamente en los portas para teñirlas e inocularlas en el medio de cultivo adecuado. Si solicitan un cultivo viral, los raspados deben colocarse directamenle en un medio de transporte viral y se llevan rápidamente al laboratorio o se dejan en el frigorífico un rato y luego se llevan con hielo húmedo. Por lo general, la conjuntiva y los párpados del ojo infectado y del no infectado se cultivan concomitanlemente para determinar la flora normal, que es útil para valorar los resultados del cultivo de cornea. Cuando el cultivo de una Ulcera corneal se sospecha que va a ser negativo, el oftalmólogo debería hacer una queratectomía superficial o una biopsia corneal, que es muy útil para la detección de hongos y Acanthamoeba.
TRACTO RESPIRATORIO Muestras nasofaríngeas. Las muestras de aspirados nasofaríngeos, lavados y frotis se recogen sobre todo para el diagnóstico de infecciones respiratorias virales, pero también para sarampión. Chlamydia trachomatis, neumonía en niños, difteria y pertussis. Los frotis nasales también se usan para identificar los portadores del Staphylococcus aureus. Las aspirados nasofaríngeos y los lavados son mejores que los Irotís para determinación viral, pero por lo general el frotis es más conveniente. Los lavados o frotis se recogen para la detección de Bordetella pertussis: el frotis es la muestra preferida para detectar Chlamydia trachomatis y Corynebacterium difteriae. El aspirado se recoge con un tubo de plástico (como el que se utiliza para alimentar a los niños) junto con una jeringa de 10 mi o un catéter para succionar. El lavado se obtiene con una pera de goma, metiendo y sacando de 3 ml a 7 mi de salino tamponado con fosfato. Para recoger muestras nasofaríngeas con una torunda se tienen que sacar los mocos de la cavidad nasal, entonces se inserta una torunda pequeña y flexible nasofaríngea a través del septo nasal a la faringe posterior y se mueve varias veces por la mucosa. Para detectar virus, las muestras nasofaríngeas se colocan en un medio de transporte adecuado, con o sin antibiótico (tales como infusión de ternera con 0,5% de gelatina, solución salina de Hank o caldo sucrosa-fosfato), y se lie-
CAPÍTULO 57
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
van rápidamente al laboratorio o se dejan un rato en el frigorífico y se ponen con hielo lo antes posible. Los métodos de detección de virus se explican con más detalle en el Capítulo 48. Para detectar Chlamydia trachomatis se recoge una muestra nasofaríngea con una torunda con la punta de poliéster. que puede utilizarse para cultivo, para preparar una extensión para tinción directa con anticuerpos fluorescentes o posiblemente para ELISA (si el sistema es adecuado para muestras nasofaríngeas). Los métodos de detección se explican en el Capítulo 49. Para cultivo de Chlamydia trachomatis, la torunda deberia colocarse en un medio 2-sucrosa fosfato que contenga agentes antimicrobianos y ser transportada al laboratorio lo antes posible, o bien ponerla en el frigorífico un poco tiempo. Para detectar Bordetella pertussis nos basta con inyectar el lavado o el frotis en el mismo lugar. Si esto no es posible, colocamos la muestra en un cultivo de casamino estéril, llevamos la muestra rápido al laboratorio y se analiza dentro de la primera hora o segunda después de recoger el cultivo, que es el método más sensible para detectar B. pertussis: se realiza la tinción directa de anticuerpos fluorescentes, que da unos resultados diagnósticos rápidos pero se asocian con muchos resultados falsos positivos y falsos negativos (Friedman. 1988). En la actualidad el medio recomendado para el cultivo es el agar Regan-Lowe (compuesto de agar carbón oxidado. 10% de sangre de caballo y que contiene cefalexina), mejor que el tradicional agar Bordet-Gengou (infusión de agar patata con el 20% de sangre de oveja). Las muestras que deben transportarse a un laboratorio de referencia para cultivarse deberían de inyectarse en un medio de transporte para Regan-Lowe. Para detectar a los portadores de Staphylococcus aureus, las secreciones nasales se recogen de la nariz con una torunda de poliéster que se coloca en un tubo para transportarla rápidamente al laboratorio. La muestra se coloca en un agar con el 5% de sangre de oveja, un medio selectivo para organismos grampositivos (agar colistina-ácido nalidíxico o agar alcohol fenil-etílico), o agar sal de manitol, un medio selectivo para Staphylococcus aureus y que ayuda a diferenciar las especies coagulasa positivo de las coagulasa negativo. Muestras de garganta. Los frotis faríngeos que se hacen por lo general se recogen para diagnosticar las faringitis por Streptococcus del grupo A, y las muestras que se reciben en el laboratorio para cultivo ordinario sólo deberían buscar este agente. Los lavados de garganta o frotis son útiles para detectar virus que se encuentran en la cavidad oral sin causar faringitis (virus del herpes simple, CMV o enterovirus), y los frotis deberían ser útiles para determinar el agente causante de la epiglotitis, una celulitis que progresa con el riesgo potencial de causar obstrucción de la vía aérea (casi siempre debido a Haemophilus influenzae tipo B, aunque en ocasiones a Staphylococcus aureus o Streptococcus pneumoniae) y en el diagnóstico de gonorrea, neumonía por Mycoplasma pneumoniae, difteria y angina de Vincent. Los frotis de garganta se recogen sujetando la lengua con un depresor, introduciendo la torunda entre las amígdalas y detrás de la úvula sin tocar las paredes laterales de la cavidad bucal y moviendo en todas las direcciones por la faringe posterior. Los frotis recogidos para detectar virus deberían colocarse en un medio de transporte para virus y, los que sean para detectar bacterias, en un tubo para transportar que contenga medio Stuart modificado. Los lavados de garganta para el diagnóstico de infecciones virales se obtienen haciendo gárgaras con 5 mi de medio de transporte viral que contenga antibióticos. Los lavados y frotis deberían llevarse pronto al laboratorio o dejarlos un rato en el frigorífico, si es inevitable un retraso. Para el diagnóstico de faringitis por Streptococcus del grupo A, el cultivo es el más sensible. Utilizar un medio selectivo aumenta la recuperación de Streptococcus pyogenes, y si inhibimos la flora normal, disminuye el tiempo requerido para leer las placas y la interpretación de colonias |i-hemolíticas (Bellon. 1991). Cuando se solicita urgente un test directo para Streptococcus grupo A (hay varios disponibles comercialmente) se deben recoger dos muestras. Si el test directo es positivo, la segunda muestra debe desecharse; pero si el test directo es negativo, hay que cultivar la segunda muestra, porque la sensibilidad del test es sólo del 70% (Bisno, 1991). Para determinar el agente causante de la epiglotitis, el médico debería recoger un frotis en un lugar donde se pudiera intubar al paciente en caso de
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ser necesario. Para detectar la Neisseria gonorrhoeae en la garganta, la muestra debería inocularse en ese mismo lugar, o tendría que ser transportada al laboratorio lo antes posible y ser inoculada tan pronto como sea posible en un medio selectivo, como el agar Thayer-Martin modificado. Si el retraso es inevitable, la muestra tiene que estar a temperatura ambiente. El frotis de faringe es la muestra para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae, aunque para el diagnóstico de la neumonía por M. pneumoniae por lo general es suficiente con la clínica o un test serológico. La muestra debe dejarse en el frigorífico hasta que se inyecte en un medio de cultivo adecuado (véase Cap. 49). Para el diagnóstico de difteria se recoge una muestra nasofaríngea y una (o mejor dos) de garganta y se llevan al laboratorio inmediatamente. Si el personal del laboratorio no tiene experiencia en la identificación y recuperación de Corynebacterium diphteriae, tienen que remitir las muestras secas en paquetes o tubos que contengan gel de silica u otro secante a un laboratorio de referencia. Para analizar las muestras de los individuos de los que se sospecha difteria, se preparan dos extensiones de una de las muestras de garganta; una se tiñe con Giemsa, para diferenciar la difteria de la angina de Vicent, y la otra con azul de metileno Loftier, para visualizar los granulos metacromáticos profundos teñidos de azul de las especies de Corynebacterium. diphteriae no puede identificarse por la morfología de las células, por lo que deben realizarse cultivos. Las muestras nasofaríngeas y de garganta deberían colocarse en un medio de suero de Lóffler y en un medio que contenga telurito potásico. Además tiene que inyectarse y analizarse una placa de agar de sangre de oveja para Streptococcus del grupo A. La angina de Vincent es una amigdalitis aguda, ulcerativa y necrotizante que puede ser causada por Fusobacterium necrophorum y otros anaerobios. Una enfermedad con esta clínica debería llamarse angina de Vincent si en las extensiones preparadas de una muestra faríngea o la muestra de la lesión ulcerada encontramos gramnegativos, bacilos fusiformes y espiroquetas al teñirlas con Gram. El cultivo del área de alrededor no suele ser útil porque existen muchas especies de anaerobios que están presentes en la cavidad oral; sin embargo, deben realizarse cultivos de sangre porque la enfermedad suele acompañarse de sepsis. Esputo y aspirado traqueal. Los estudios microbiológicos de los esputos (expectorado e inducido) y de las muestras de aspiración traqueal son lo primero que se hace para determinar los agentes etiológicos de la neumonía. Lo mejor es que el esputo se recoja a primera hora de la mañana antes de comer. El individuo deberia enjuagarse la boca con agua y después recoger la muestra, preferiblemente de 5 ml a 10 ml, que resultará de una tos profunda. Para las personas que no tienen tos productiva se debería inducir, poniendo al individuo aerosoles de una solución de cloruro sódico al 15% y glicerina al 10% durante aproximadamente 10 minutos o hasta que se inicie el reflejo de la tos. La aspiración traqueal obtiene secreciones respiratorias bajas de pacientes con traqueostomía recogidas en un recipiente de Lukens. Los pacientes con traqueostomía enseguida se colonizan con gramnegativos y otros patógenos nosocomiales, y como la bacteria que coloniza el aparato respiratorio no puede ser diferenciada de la bacteria que causa la enfermedad invasiva por el cultivo de aspiración traqueal, la interpretación de los cultivos es muy difícil. Las muestras de esputo y de aspiración traqueal deben llevarse al laboratorio o, si el retraso es inevitable, se dejan un rato en el frigorífico. Ambos tipos de muestras se deben someter a screening antes de colocarlas en las placas para hacer el cultivo, para determinar si lo que tienen son pocas secreciones o saliva (Morris, 1993). Una extensión obtenida de una parte de la muestra que consiste en material purulento se tiñe con Gram. Por lo general, las muestras que encontramos con más de 10 células epiteliales por campo de bajo aumento están significativamente contaminadas con saliva, por lo que deberían rechazarse. Las muestras con menos de 25 células epiteliales y más de 25 neutrófilos por campo de bajo aumento probablemente se acepten (Murray, 1975). El número de neutrófilos no se suele tener en cuenta cuando se determina la calidad de la muestra, porque el individuo del que la hemos recogido puede estar neutropénico. Por lo general no se pide un screening en las muestras de esputo inducido y esputos no inducidos para la detección de Mycoplasma neumoniae, especies de Legionella y mícobacteria para valorar la calidad (Ingram, 1994; Havlik. 1995). Sin em-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
bargo. los dalos de un estudio sugieren que la presencia de neutrófílos en un screening de las muestras de esputo es un método efectivo para evaluar la aceptación del esputo para el cultivo y muestra micobacteriana. (McCarler, 1996). Las extensiones teñidas con Gram que se han preparado de una muestra adecuada para cultivo se examinan con inmersión en aceite para determinar los diferentes organismos. La cantidad de organismos (raros, pocos, moderados o muchos) se estima para cada tipo de bacterias (p. ej.. cocos grampositivos en parejas, cadenas o racimos; bacilos grampositivos. diplococos gramnegativos y gramnegativos en varillas), diferenciando si son o no intracelulares. Las muestras de secreciones traqueales teñidas con Gram en las que no se observan organismos deberían rechazarse (Gilligan, 1999). Los trozos de muestras aceptadas que contengan material purulento se inyectan como se describe en el Capítulo 50: para muestras de individuos con fibrosis quística. también se recomienda inyectar en un medio selectivo para Burkholderia (Pseudomonas) cepacia. Hay algunos organismos que no encontramos en un cultivo ordinario, y para aseguramos de que se detectan hay que pedir unos test específicos. Por ejemplo, cuando se sospecha enfermedad por Legionella, se recomienda un cultivo de Legionella y un test directo rápido (anticuerpos fluorescentes). El cultivo es el método más sensible y debería realizarse siempre. Las muestras de esputo y aspiraciones traqueales que vayan a ser sometidas a un cultivo para Legionella deberían diluirse 1:10 en un tubo con caldo tnpticasa que contenga pedas de cristal estériles, y se agita en una mezcladora o se trata lavándolo con una solución acida para evitar el crecimiento de la llora bacteriana normal. Habría que inocular algunas gotas de la muestra de cada una de las dos placas de agar extracto de levaduras carbón tamponado con u-cetoglutarato, una con agentes microbianos y otra sin ellos. La tinción con fluorescencia directa de los anticuerpos, que puede darnos resultados en unas horas frente a los 57 días que tardan los cultivos, debería usarse para suplementar. pero no para sustituir el cultivo. Para una detección adecuada de micobacterias en los esputos, se recomienda recoger las muestras en tres días diferentes. El esputo y otras secreciones respiratorias deben descontaminarse para evitar el sobrecrecimiento bacteriano rápido de la flora respiratoria saprofita sobre las micobacterias de crecimiento. Este proceso y los métodos para detectarlo se comentan en el Capítulo 53. Todas las muestras destinadas para el cultivo de hongos se deben manejar en una cabina de seguridad biológica. La calidad de las muestras debería determinarse con un screening de las extensiones teñidas con Gram (como se ha descrito para las bacterias). Para el cultivo de hongos se deberían inyectar en el medio de cultivo muestras adecuadas de esputo no inducido, esputo inducido y aspiraciones traqueales. Por lo general, para el cultivo de hongos se recomiendan los siguientes principios generales: debería usarse un medio con y sin enriquecimiento de sangre con y sin cicloheximina; todos los medios deberían contener agentes antimicrobianos. Sin embargo, cuando se haga la selección, el director del laboratorio también debería considerar el coste y los tipos de hongos que se suelen encontrar en la población. Las muestras de esputo inducido son útiles para el diagnóstico de neumonía por Pneumocystis carínii en personas con el síndrome de inmunodeficíencia adquirida (sida) (Wolfson, 1990). Primero se analiza una extensión teñida con Gram para ver si es representativa de secreciones del tracto respiratorio bajo. Las muestras aceptadas se tratan son un agente mucolítico (como W-acetil-L-cisteína), y las extensiones se preparan y se tiñen para detectar P. carínii (véase Cap. 54). Muestras por cepillo telescopado. El cepillado es útil para el diagnóstico de neumonía bacteriana en pacientes ventilados que no han recibido tratamiento antibiótico, y probablemente es útil para el cultivo de aerobios y anaerobios (Baselski. 1994). La muestra se recoge con un cepillo pequeño que obtiene de 0.01 ml a 0,001 mi de secreciones, colocado en un catéter, dentro de una cánula doble. La cánula de luera tiene en la punta un tapón desplazable de polielileno glicol. Para obtener la muestra, se inserta la cánula, mediante broncoscopia, en el sitio deseado, la cánula de dentro se saca quitando el tapón (hidrosoluble) y se extiende el cepillado más allá de la cánula interna. Una vez que se ha tomado la muestra, el cepillo se mete en la cánula interna y ambos, el cepillo y la cánula interna,
se meten en la cánula externa para evitar la contaminación del cepillo cuando se retira el catéter. Después se coloca el cepillo en una solución estéril con 1 mi de suero salino. La muestra debe llevarse inmediatamente al laboratorio y analizarse lo antes posible. Si el retraso es inevitable, tiene que guardarse en el frigorífico. Para analizar la muestra, hay que agitarlo en la mezcladora donde se deja el cepillo. Las preparaciones del centrifugado se tiñen con una tinción Gram y con el asa de inoculación calibrado de 0,01 mi, y se deja el cultivo en un medio apropiado Las colonias de más de 1.000 organismos/ml en el cultivo (que corresponde a 10' organismos/ml de la muestra original) parece que corresponden con una infección (Baselski, 1994). Lavado broncoalveolar. Las muestras de lavado broncoalveolar son útiles para el diagnóstico de neumonía en pacientes ventilados que no han recibido tratamiento antibiótico, y para detectar patógenos oportunistas en pacientes con neumonía e inmunocomprometidos (Baselski. 1994). Sin embargo, para el cultivo de las especies de Legionella son preferibles las muestras de esputo, porque las muestras broncoalveolares se diluyen en salino y podrían contener pequeñas cantidades de anestésico local, que inhibe los organismos. Para recoger el fluido, la punta del broncoscopio se introduce cuidadosamente en la luz de la vía aérea. A través de la luz, se inyecta un volumen de salino (por lo general > 140 mi) en 3 ó 4 alícuotas lavando 1 millón de alvéolos. El volumen total que se saca varia en función del volumen metido, pero por lo general es de 10 ml a 100 mi. El tiempo que tarde en llevarse al laboratorio tiene que ser mínimo (<30 minutos), y una vez que esté en el laboratorio debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse un retraso, el liquido debería conservarse en el frigorífico. El análisis de las muestras de lavado broncoalveolar para detectar virus incluye un examen microscópico directo y un cultivo celular. El análisis de las preparaciones centrifugadas teñidas con la tinción de Papanicolau permite detectar los cambios citopáticos, útiles en especial para el diagnóstico de neumonía por CMV (Fig. 57-2) (Woods. 1990). Se recomienda teñir las preparaciones centrifugadas del fluido con Gram: visualizar una o más bacterias sin células escamosas epiteliales por campo de aceite de inmersión es altamente sugerente de una neumonía bacteriana aguda (Baselski. 1994; Kahn, 1987). Las preparaciones centrifugadas también pueden teñirse con tinción acido-resistenle. con anticuerpos específicos, como aquellos para delectar las especies de Legionella o Pneumocystis carínii. o con tintes no específicos para detectar Pneumocystis carinii u otros hongos (como tinte de plata, calcoflúor blanco o Giemsa). Los datos indican que un cultivo cuantitativo de muestras de lavado alveolar es útil para el diagnóstico de neumonía bacteriana aguda (Baselski. 1994). La muestra se inyecta en un medio agar usando un asa de inoculación calibrado de 0,001 mi (como se vera después para los cultivos de orina) La presencia de más de 10.000 colonias/ml corresponde con la enfermedad. Para detectar micobacterias, las muestras deben ser descontaminadas y manejadas como se describe en el Capítulo 53. Para detectar virus, debe hacerse un cultivo convencional y un cultivo centrifugado para CMV. Para recuperar los hongos, se debe inyectar el sedimento de una muestra centrifugada en un medio de cultivo primario.
TRACTO URINARIO Los métodos aceptados para recoger la orina incluyen recogida de la mitad de la micción (preferiblemente la primera de la mañana), sondaje y aspiración suprapúbica. Por lo general, las muestras de orina de 24 horas deberían desecharse, excepto cuando se pida específicamente detectar Schistosoma haematobium. Lo más común es que se recoja la micción de la mitad de un modo limpio. Para mujeres, primero se limpia la zona periuretral y penneanal con unas gasas estériles, con jabón de delante hacia atrás, y se enjuaga con una gasa estéril mojada y se seca con una gasa estéril. Para hombres, limpiar el área genital no va a mejorar la detección de bactenuria de modo significativo, por lo que no es necesario (Lipsky, 1984). Durante la micción, las mujeres deben separar los labios, los hombres no circundados deben retirarse el prepucio. Los primeros mililitros de orina se desechan para limpiar las bacterias que normalmente colonizan la uretra, y la micción central se recoge en un contenedor estéril de boca ancha y se cierra fuertemente la tapa.
CAPÍTULO 57
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
aureus) (Pezzlo. 1988; Barón. 1990). Por consiguiente, para una correcta interpretación del cultivo, se necesita comunicación entre el médico y el personal del laboratorio. Los cultivos de orina para bacterias se hacen inyectando el medio adecuado (véase Cap. 50) en una determinada cantidad de orina con un asa calibrado de plástico o alambre, diseñado para repartir un volumen conocido. Un asa de 0,001 mi se utiliza para inyectar todas las muestras de orina, excepto las que se recogen en mujeres con sospecha de síndrome uretral agudo y aspiraciones suprapúbicas. Las dos últimas se inyectan con un asa de 0,01 mi. El asa adecuado se mete verticalmente en la muestra de orina bien mezclada, y el asa repleto de orina se saca y se extiende sobre una superficie de placa agar como se indica en la Figura 57-3. Sin remover el asa, se mete verticalmente otra vez en la muestra de orina y la muestra que sacamos se inyecta en una segunda placa.
Figura 57-2. Preparación cite-lógica de fluido del lavado broncoalveolar que nos muestra una célula alargada con inclusiones intranucleares e intracitoplasmáticas. que se corresponden con el citomegalovirus. (Tinción de Papanicolau, 250x.) (Cortesía de Vicki J. Schnadig, M.D., Departamento de Patología, Universidad de Texas, Rama Médica, Galveston, TX.)
Para determinar el número de microrganismos por mililitro de la muestra original, se cuenta el número de colonias en la placa agar y se multiplica por 1.000 (sí se ha usado un asa de 0,001) o por 100 (si se ha usado un asa de 0.01 mi). El crecimiento de 3 o más especies en una recogida limpia de la mitad de la micción por lo general indica contaminación. En ese caso, los organismos se enumeran y se caracterizan mínimamente (p. ej.. Staphylococcus coagulasa negativa o bacilo gramnegativos lactosa positiva) y no se hace el test de sensibilidad. Uno o dos aislados presentes en un número mayor de 10.000 en una mitad de micción limpia deberían identificarse y deberia hacerse un test de sensibilidad antibiótica. Los organismos en un número menor de 10.000 se dejan, con las siguientes excepciones: un cultivo puro de Staphylococcus aureus es considerado significativo independientemente del número y debería hacerse un test de sensibilidad. Un crecimiento de 10 a 10 CFU/ml podría ser significativo en infecciones que tienen que ver con la sonda. En hombres con sintomatología, un crecimiento de 10 CFU/ml o más se considera infección, y se debería identificar el organismo, pero el test de sensibilidad se hará sólo si lo piden específicamente. Para todos los organismos aislados de una punción suprapúbica. se identifican y se hace el test de sensibilidad. Un crecimiento único en un número de 100 o mayor de una mujer con sospecha de síndrome uretral agudo debería identificarse si hay piuria, y el test de sensibilidad debe hacerse sólo si se pide específicamente. J
El sondaje se asocia con el riesgo de inducir una infección nosocomial y, por tanto, deberia estar restringido a personas que no pueden recoger la mitad de la micción; por ejemplo, personas con una alteración sensitiva o aquellos que no pueden miccionar por razones urológicas o neurológicas. Utilizando una técnica estrictamente aséptica, se introduce la sonda en la uretra, se desechan los primeros mililitros para limpiar los organismos que pueden haberse introducido por la punta de la sonda mientras se colocaba y la mitad de la micción se recoge para cultivo. La orina puede recogerse de una sonda aspirando con una jeringa y una aguja del 28 a través del conector de goma, teniendo cuidado de limpiar el punto de punción. La orina no debe recogerse de la bolsa de orina, y las puntas de la sonda Foley no deberían ser aceptadas para cultivo, porque casi siempre están contaminadas con organismos de la uretra. La aspiración suprapúbica se usa principalmente en neonatos. El procedimiento requiere que la vejiga esté llena; la piel se desinfecta, se pincha la vejiga por encima de la sínfisis del pubis, y con una aguja del 22 y una jeringa aspiramos aproximadamente 10 mi de orina. Todas las muestras deberían llevarse al laboratorio nada más recogerse, y se deberían analizar dentro de las dos primeras horas después de haber sido recogidas. Si el retraso es inevitable, deben meterse en el frigorífico un mínimo de 24 horas. Hay equipos que se comercializan que contienen conservantes para mantener las bacterias durante 24 horas a temperatura ambiente, pero no ofrecen ninguna ventaja con respecto a meterla en el frigorífico. El tracto urinario por encima de la uretra en personas sanas es estéril, pero la uretra está normalmente colonizada con muchas bacterias, por lo que las muestras recogidas por métodos no invasivos (media micción, recogida limpia) son contaminadas durante su tránsito. Las bacterias comensales se diferencian de los patógenos por varios cultivos de orina, proceso ¡nicialmente promovido por Kass (Kass, 1956). Al principio, un crecimiento de 10 o más CFU de bacterias por mililitro de orina era altamente indicativo de infección, pero este criterio se ha modificado para las diferentes situaciones. Por ejemplo, en mujeres jóvenes sexualmente activas con sintomatología uretral aguda (disuria, frecuencia y urgencia), 10 CFU/ml se considera significativo en presencia de piuria concomitante (Stamm, 1982). Infecciones de orina reales asociadas con menos de 10 CFU/ml pueden producirse en bebés y niños, en hombres y en personas que están sondadas, que se han tratado recientemente con antibióticos, con ingesta hídrica abundante (para diluir la orina), tienen síntomas y piuria concomitante. Obstrucción urinaria o pielonelritis adquirida por una diseminación hematógena (especialmente infecciones debidas a levaduras y Stalilococcus 5
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Más de la mitad de las muestras de orina que se llevan al laboratorio para cultivo no tienen crecimiento, o tienen niveles bacterianos por debajo de lo que se considera clínicamente significativo; por tanto, los test de screening que identifican de un modo rápido las muestras como "negativas" para el cultivo se han desarrollado en un intento de proporcionar resultados rápidos, eliminar las muestras negativas y permitir tener más tiempo para las muestras positivas, mejorando la eficiencia y el coste. La comprobación de la orina y los cultivos se corresponden cuando la referencia es 10 CFU/ml o más, pero son menos adecuadas para un número menor de colonias (Pezzlo, 1988). Otras razones para considerar adecuado el screening de la bactenuria son la capacidad de detectar piuria y el coste. Este último es especialmente importante cuando consideramos la automatización. s
Comprobar las muestras de orina con una tinción Gram es rápido y económico. Encontrar uno o más organismos por campo con aceite de inmersión en una extensión preparada de una muestra centrifugada se corresponde con bacteriuria con 10' o más CFU/ml. La sensibilidad del tinte Gram. sin embargo, disminuye cuando se trata de un número menor de colonias, y continuar con el análisis es una pérdida de tiempo. Comercialmente hay disponibles tiras de reactivos que combinan la nitrato reductasa (una enzima presente en la mayoría de los bacilos gramnegativos que causa infecciones del tracto urinario) y la esterasa leucocitaria (una enzima producida por neutrófilos), son métodos baratos y fáciles de manejar, pero su sensibilidad es demasiado baja para comprobar las infecciones del tracto urinario (Pezzlo. 1988). r
Hay sistemas de screening para la orina disponibles comercialmente. Un sistema de filtración de colores proporciona resultados rápidos y detecta más del 90% de las muestras positivas (incluidas las que contienen neutrófilos г y sólo ^0 CFU/ml), pero pueden dar falsos negativos para enterococos y Pseudomonas aeruginosa (Pezzlo. 1988; Shaw, 1997). La orina se pasa a través de un filtro de papel que retiene las células y después se pasa el tin-
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
TRACTO GENITAL
Figura 57-3. Tècnica para inocular orina en placas agar. (De Woods GL Gutierrez Y: Diagnostic Pathology of Infectious Diseases. Filadelfia, Lea 8 Febiger, 1993, con permise.)
te a través del filtro. La intensidad del color del resultado, que se lee manualmente o con un fotómetro, se corresponde con el número de partículas adheridas al filtro. Un sistema bioluminiscente se basa en la reacción de ATP (presente en todas las células vivas) con lucíferina y luciferasa, que producen luz que se mide con un luminómetro. Se puede estimar el número de CFU en una muestra de orina por el ATP liberado selectivamente por las bacterias solas. Esta técnica se compara favorablemente con el cultivo a nivel de 10 CFU/ml o más. pero como necesita un tiempo de incubación, los resultados tardan unas pocas horas. Un sistema de fotometría automatizada detecta la bactenuria midiendo los cambios de transmisión de la luz a través de un medio de caldo inyectado con la muestra de orina. El crecimiento bacteriano hace que el medio se ponga turbio en 2 ó 3 horas generalmente, pero los resultados negativos no pueden darse hasta pasadas 5-13 horas. Este sistema se compara favorablemente con un cultivo a nivel de 10 CFU o más y tiene la capacidad de identificar el organismo y hacer el test de sensibilidad anlimicrobiana. 5
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Algunas bacterias no se detectan en un cultivo ordinario de orina, y cuando se sospecha de estos patógenos, se debe pedir un test específico. Por ejemplo, una muestra de orina es válida para detectar Neisseria gonorrboeae y Chlamydia trachomatis pata la amplificación de ácidos nucleicos. Las instrucciones del fabricante deben seguirse tanto para la recogida como para el análisis. Leplospira interrogans puede detectarse en la orina después de la primera semana de la enfermedad y hasta varios meses después. La orina debería ser analizada lo antes posible, porque la acidez podría dañar los organismos. Inyectamos una o dos gotas de orina sin diluir y de orina diluida 1:10 en 5 mi de medio Fletcher o de medio EllinghausenMcCullough-Johnson-Harris. que contienen 5-fluoracilo. El urocultivo para micobacterias se ve en el Capítulo 53. Las levaduras deberían recuperarse de la orina en el medio que utilizamos para un cultivo bacteriano habitual, pero si se pide específicamente un cultivo para hongos, debe colocarse el sedimento de una muestra de orina centrifugada en un medio que contenga agentes antimicrobíanos. como un inhibidor de mohos o el agar Shabi. Cuando las muestras de orina se cultivan para virus, deberían añadirse antibióticos (p. ej„ penicilina, gentamicina y anfotericina B) para minimizar la contaminación bacteriana de los cultivos celulares. Las lineas celulares se seleccionan para la inoculación basada en los virus que encontramos con más frecuencia aislados: CMV, adenovirus y virus del herpes simple.
Secreciones vaginales. Las secreciones vaginales son útiles para determinar el agente etiológico de la vulvovaginitis y la vaginosis bacteriana (así llamada porque no es invasiva). En mujeres pospuberales, los patógenos más comunes son Gardnerella vaginalis (asociada con anaerobios como especies de Mobiluncus), especies de Candida y Trichomonas vaginalis. Una preparación en fresco es el test más adecuado para el diagnóstico, y puede ser realizado por el médico allí presente: los cullivos no son necesarios para el diagnóstico, Para preparar la muestra fresca, se coloca la torunda de la muestra en un tubo que contiene cerca de 1 mi de salino y se agita con cuidado: una gota de esa suspensión se coloca en un porta de cristal. De modo alternativo, colocamos una gota de salino en el porta y la mezclamos con una muestra de material vaginal. Ponemos un cubreportas y calentamos la muestra pasándolo a través de una llama o manteniéndolo sobre una bombilla incandescente. Se examina el porta a bajo y gran aumento, buscando "células clave" (células epiteliales cubiertas con pequeñas bacterias cocobacilos) (Fig. 57-4) compatibles con el diagnóstico de vaginosis mespecífica, pseudohifas, sugestivo de candidiasis vaginal, y Trichomonas móviles. Además de la muestra en fresco, también son útiles para el diagnóstico determinar el pH vaginal y el test del olfato, que se realiza añadiendo KOH al 10% a una gota de muestra vaginal situada en el porta o en el espéculo. El pH vaginal es de cerca de 4,5 en mujeres con candidiasis vulvovaginal, pero está por encima de 4,5 en aquellas con vaginosis o tricomoniasis. Un lest del olfato positivo (es decir, hay un olor acre como a pescado) se asocia por lo general con vaginosis bacteriana, pero en ocasiones con tricomoniasis. Muestras endocervicales y uretrales. Las muestras endocervicales se recogen para determinar el agente etiológico de las cervicitis y para identificar las personas asintomáticas con un organismo que causa enfermedad de transmisión sexual. Las muestras endocervicales se obtienen con la ayuda de un espéculo humedecido sólo en agua caliente, porque los lubricantes pueden contener agentes antibacterianos. Si se indica una muestra Papanicolau, esa muestra debería recogerse primero. Las muestras para estudios microbiológicos por lo general se recogen con una torunda, aunque en mujeres no embarazadas el uso de un cepillo endocervical podría aumentar la sensibilidad de los test de cultivo y no cultivo para Chlamydia trachomatis (Linder, 1987). Como se ha dicho anteriormente, en este capitulo se recomienda usar una torunda con la punta de poliéster y un recipiente de plástico. Si se utiliza un equipo para test que no sea para cultivo para detectar organismos, la muestra tiene que recogerse con la torunda que viene en el equipo o con lo que el fabricante diga. La muestra para detectar Neisseria gonorrhoeae hay que recogerla antes que la de Chlamydia trachomatis o la del virus del herpes simple (VHS). Antes de recoger las muestras para estos dos últimos organismos, hay que sacar todas las secreciones de la cavidad cervical. La torunda o el cepillo se insertan 1 cm o 2 cm en el canal cervical (pasada la unión escamocolumnar), se frota firmemente contra la pared durante 10-30 segundos, con cuidado de no tocar la pared de la vagina, y se coloca en un medio de transporte adecuado o un sistema de tubo, que se utiliza para preparar un porta de cristal para la tinción directa con anticuerpos fluorescentes (para Chlamydia trachomatis) o para inyectar inmediatamente un medio agar para recuperar Neisseria gonorrhoeae. El manejo de las muestras varía en función del organismo que busquemos. Para aislar N. gonorrhoeae, está indicada la inyección directa de un medio agar, como Thayer-Martin modificado, dentro de un recipiente al que se haya añadido una pastilla para generar CO. . De otro modo, la muestra de la torunda puede colocarse en un sistema de transporte de lubo y se lleva al laboratorio lo antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que dejar la muestra a temperatura ambiente, nunca en el frigorífico. Si utilizamos una muestra de ADN o amplificación de ácidos nucleicos para detectar Neisseria gonorrhoeae, tendremos que utilizar un equipo y seguir las instrucciones del fabricante para el almacenaje y transporte. ¿
Para detectar Chlamydia trachomatis podrían usarse métodos de cultivo u otros (véase Cap. 49). Para el cultivo de células de Chlamydia, utilizamos
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normalmente como medio de transporte 2-sucrosa fosfato o sucrosa-glutamato-fosfato, y añadimos antibióticos (como gentamicina, vancomicina y nistatina o anfotericina B) para impedir el sobrecrecimiento de hongos y bacterias Para mantener con vida las clamidias. la muestra debe transportarse inmediatamente al laboratorio, o se deja almacenada en el frigorífico si el transporte no puede ser inmediato. En el laboratorio la muestra debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse el retraso, las muestras deben dejarse en el frigorífico si pueden ser analizadas dentro de las siguientes 48 horas. Si se sabe de antemano que el retraso va a ser mayor, las muestras deben dejarse a - 7 0 C o más frío, aunque el proceso de congelación puede disminuir el porcentaje de aislamiento de C. Irachomatis en un 2 0 % (Mahoney, 1985). Para detectar los cuerpos elementales de Chtamydia por una tinción de fluorescencia directa de anticuerpos, se debe utilizar el equipo de recogido y seguir las instrucciones del fabricante. La torunda se da una vuelta en el porta que se va a observar al microscopio, se deja secar y se aplica un producto para fijar. Para el inmunoensayo enzimático, las pruebas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y la amplificación de ácidos nucleicos, el equipo de recogida y transporte que deja el fabricante es el que hay que usar, salvo que el fabricante diga que vale olro sistema de transporte especifico. También deben seguirse las instrucciones del fabricante para las condiciones de transporte, los requisitos de almacenamiento y el tiempo para analizarlo. Para detectar adecuadamente el VHS es necesario hacer un cultivo celular. El exudado se coloca en un medio de transporte viral y se lleva lo antes posible al laboratorio. Si el transporte inmediato no es posible, la muestra debe almacenarse en el frigorífico. Para pacientes que tengan una lesión visible en el cérvix, los cambios virales citopáticos pueden verse en las extensiones preparadas de raspados de la lesión base Las extensiones se lijan inmediatamente y se liñen con el tinte Wright o Giemsa (preparación Tzanck) o con anticuerpos monoclonales. Para diagnosticar las mismas enfermedades de transmisión sexual en varones, se deberia coger un exudado uretral o una muestra de la primera micción, dependiendo del método que se use para detectarlo. Lo ideal es que los exudados uretrales se recojan por lo menos dos horas después de que el paciente haya miccionado. Las muestras para Neisseria gonorrhoeae son las primeras que se obtienen. Las condiciones en función del tipo de torunda y transporte son las mismas que las descritas para muestras endocervicales, aunque se usan torundas genitales que son más pequeñas. La torunda se inserta en la uretra 2 cm-4 cm, se rota en un sentido durante 5 segundos, se retira y se coloca en un medio de transporte adecuado, o se usa
Figura 57-4. Células clave" en una extensión de una muestra vaginal. (Tinción Papanicolau. 400x.) (Por cortesia de Vicki J. Schnadig. M.D., Departamento de Patología, Universidad de Texas. Rama Médica. Galveston. TX.)
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para preparar extensiones para una tinción fluorescente directa de anticuerpos para detectar Chlamydia trachomatis o con tinción Gram para diagnosticar gonorrea (la detección de diplococos gramnegativos mtracelulares en una extensión uretral de hombres sintomáticos nos proporciona un diagnóstico de presunción). Vesículas. Las muestras de lesiones vesiculares en los genitales se recogen para confirmar la infección por VHS. El líquido de la vesícula se aspira con una aguja de pequeño calibre en una jeringa de tuberculina. Si sólo hay presente una vesícula pequeña, se corta y la base se raspa con una torunda Dracon o un depresor para asegurarse de que recogemos las células. El liquido de la vesícula o el exudado debe llevarse en un medio de transporte adecuado y analizado para cultivo convencional El VHS también se puede detectar directamente en la muestra por tinción directa de las extensiones, pero es menos sensible que los cultivos, y si es negativo, deberia hacerse un cultivo. Para hacer una extensión, las células recogidas con el depresor o torunda Dracon se extienden en el porta de cristal y se fija el material con acetona. Hay que teñir la muestra con el tinte Papanicolau, Wright o Giemsa para detectar los cambios citopáticos típicos (Fig. 57-5). tintes que no distinguirán entre VHS o el virus varicela zóster. o con anticuerpos monoclonales. Úlceras. El material de las úlceras genitales se recoge para identilicar el patógeno responsable; VHS. Haemophilus ducreyí. Treponema pallidum. Chlamydia trachomatis (serogrupos L,, L,, L ) y Calymmatobacterium granulomalis deberían ser considerados en el diagnóstico diferencial. El protocolo de recogida, transporte y análisis de las lesiones ulcerativas para detectar el VHS es el mismo que para las vesículas. En general, la sensibilidad de los test directos descritos antes y la recuperación de virus son más bajas en lesiones ulcerativas. 3
Si hay sospecha de infección por Haemophilus ducreyí, el material de la base de la úlcera se recoge con dos torundas Dracon o algodón, se lleva en un medio de Stuart modificado al laboratorio y se deja en una habitación a temperatura ambiente hasta que se analice. Una muestra se utiliza para preparar una extensión para teñir con Gram. Si observamos muchos bacilos gramnegativos pleomórficos y cocobacilos organizados en grupos o cadenas, es sugerente de H. ducreyí. Sin embargo, el cultivo es más sensible y es necesario para confirmar. El segundo exudado se inyecta en un medio especial. Las espiroquetas de Treponema pallidum pueden detectarse en los genitales u otras lesiones, pero la sífilis por lo general se diagnostica serológicamente. Deberían llevarse guantes cuando se manejen muestras obtenidas de estas lesiones. Para recoger las muestras, se limpia la superficie de la lesión (si hay varias lesiones, se debe recoger la más reciente) con suero salino y se deja secar, y se quitan las costras si las hubiera. Raspamos la lesión superficialmente hasta que sangre un poco y aplicamos una presión pequeña en la base. El exudado se recoge de la superlicie tocando el liquido con un porta de cristal o usando una pipeta capilar y pasando el liquido a un porta de cristal. Se pone un cubreportas y la muestra se examina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Otro modo es aspirar el material con una aguja de un calibre de 26 de la base, y después se mete una gota de salino en la aguja. El material se extiende en un porta de cristal, se cubre con un cubreportas y se examina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Las espiroquetas de T pallidum tienen de 10 pm a 13 pm de longitud y 0,15 pm de ancho, tienen una cola ancha y regular y son puntiagudas al final. Los serogrupos L,, L^, L, de Chlamydia trachomatis pueden detectarse por cultivo de células en una biopsia de la lesión ulcerada o del material celular recogido de quitar primero cualquier exudado de la lesión y después girando la torunda (en un palo de plástico) contra la base. El transporte y análisis de las muestras son iguales que para los exudados endocervicales. Para una detección ideal de Calymmatobacterium granulomatis. se biopsia un tejido de una zona de granulación activa e inmediatamente se transporta al laboratorio en un recipiente estéril y seco, o en uno que contenga una pequeña cantidad de salino sin conservantes. Las extensiones se preparan de un trozo de tejido aplastado y se tiñen con Giemsa o tinte de Dieterle. El diagnóstico se basa en encontrar C. granulomatis característicos encapsulados dentro de los macrófagos.
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Figura 57-5. Célula giganle mullinucleada con inclusiones inlranucleares por virus herpes simple en una extensión de células endocervicales. (Tinción de Papanicolau, 400x.) (Cortesía de Vícki J. Schnadig, M.D. Departamento de Patología. Universidad de Texas, Rama Médica. Galveston. TX.)
HECES Las heces y, en algunos casos, los exudados rectales son útiles para determinar el agente etiológico de la diarrea infecciosa o intoxicación alimentaria, confirmando el diagnóstico de botulismo, diagnosticando infecciones causadas por adenovirus, enterovirus, algunos patógenos de transmisión sexual, protozoos intestinales y helmintos y, en algunos casos, helmintos de los tractos respiratorio y biliar. La recogida, el transporte y el análisis de estas muestras son diferentes para virus, bacterias y parásitos, y se explican más adelante para cada grupo. Se prefieren las heces para detectar adenovirus, enterovirus y los virus responsables de la gastroenteritis. Las muestras se recogen en un recipiente limpio de tapa ancha. Si no puede obtenerse una muestra de heces, se inserta una torunda a través del esfínter anal, se gira, se saca y se coloca en un medio de transporte viral que contenga agentes microbianos. Cualquiera de las muestras debe llevarse pronto al laboratorio, si no se pudiera, tiene que meterse un rato en el frigorífico y debe llevarse en hielo húmedo. Si hay que enviar la muestra a un laboratorio de referencia, debe almacenarse a -70°C y tiene que transportarse en hielo seco. Se recomienda el cultivo celular para detectar adenovirus y enterovirus, aunque el test de ELISA es válido para detectar adenovirus. Los rotavirus son los responsables de la mayoría de las gastroenteritis virales y los únicos virus que se asocian con gastroenteritis, y que se detectan en muchos laboratorios virales. Lo más corriente es que los rotavirus se detecten por ELISA; los equipos de aglutinación de látex también son válidos, pero parece que son menos sensibles (Christensen, 1989). Las muestras se analizan según las indicaciones del fabricante. El examen directo de las muestras de heces en el microscopio electrónico es el método de referencia para detectar los rotavirus y es el que más se usa para detectar calicivirus, astrovirus. el virus Norwalk y los virus similares al de Norwalk. Las heces también se prefieren para detectar las bacterias responsables de la diarrea infecciosa, aunque un exudado rectal es una alternativa válida. Las muestras de heces tienen que recogerse en un contenedor limpio y de tapa ancha, y la muestra no tiene que contaminarse con orina, bario o papel higiénico, Los exudados rectales, que se obtienen como se ha descrito antes para los virus, se colocan en un sistema de transporte de tubo que contenga medio Stuart modificado. Ambos tipos de muestras deben transportarse rápido al laboratorio y ser analizadas lo antes posible, porque la bajada del pH que se produce cuando las heces se enfrían puede inhibir el crecimiento de algunos patógenos, especialmente Shigella. Si el retraso es inevitable, o hay
que llevar la muestra a un laboratorio de referencia, se recomienda añadir un conservante, como fosfato tamponador 0.03M. mezclado con un volumen igual de glicerol. El análisis de las muestras de heces, o los exudados rectales para bacterias, se basa en el organismo o grupo de organismos que esperamos que estén presentes. Las muestras que se reciben para un cultivo bacteriano ordinario deben analizarse de modo que se pueda encontrar Shigella, Salmonella y Campylobacter jejuni/coli. En las instituciones pediátricas, también sería razonable de modo sistemático buscar Aeromonas. Las muestras se colocan directamente en un medio adecuado (véase Cap. 50); de manera alternativa, para detectar C. ¡ejuni/coli. la muestra se puede filtrar utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,65 pm. y dejar el filtro en un agar sangre de oveja brúcela o agar chocolate. Las especies de Aeromonas crecen en el medio utilizado habitualmente para el cultivo de bacterias de las heces, o de los exudados rectales, pero utilizar un medio selectivo (cefsulodina-irgasán-novobiocina [CIN] que contenga 4 mg/l de cefsulodina mejor que el típico agar sangre de oveja con 10 mg/l de ampicilina) incubado a 25 C-30"C puede aumentar la eficiencia del screening. C
La prevalencia de la gastroenteritis causada por la shiga productora de toxinas (enterohemorrágica) Escherichia Coli (STEC), Yersinia enterocolilica, Vibrium cholerae u otras especies de Vibrio o Plesiomonas shigelloides es baja en la mayor parte de EE.UU.; por tanto, las peticiones específicas para detectarlo son más eficientes. Como mínimo, las muestras de heces sanguinolentas deben analizarse para detectar la STEC, Para detectar la STEC, la muestra de heces podría inyectarse en agar sorbitol-MacConkey (que contiene un 1% o-sorbitol en lugar de lactosa), que es un medio que diferencia las STEC de manera aislada, las que no fermentan en sorbitol, de casi todas las £ coli. que son sorbitol-positivas. Un método más sensible que el cultivo para delectar STEC es la detección de toxina en las heces o en las heces filtradas (Kehl, 1997). Cuando se pide aislar Yersinia enterocolilica. el agar CIN se inyecta y se incuba a una temperatura ambiente. El organismo también puede recuperarse inyectando un medio típico para el cultivo bacteriano ordinario (véase Cap. 50). La placa MacConkey se incuba a 35'C las primeras 24 horas y después a temperatura ambiente durante otras 24 horas; las colonias de Y. enterocolilica son moradas y del tamaño de una cabeza de alfiler. Las especies de Vibrio con frecuencia crecen en el medio que se utiliza habitualmente. pero para recuperarlas mejor se inyecta agar citrato tiosulfato sales biliares sucrosa (TCBS) y agua alcalina (para enriquecer). Plesiomonas shigelloides también crecen en los medios usados para cultivos ordinarios, pero como más del 30% de P. shigelloides se aislan en lactosa fermentada, las colonias no se diferencian lo suficiente para reconocerlas en este medio, y hacer un screening de todas las colonias no es rentable. Por esta razón, el cultivo de heces o exudados rectales para P. shigelloides debe solicitarse de manera específica. El uso de un medio selectivo-diferencial agar inositol sales biliares verdes brillantes es recomendable, pero no es imprescindible. Los exudados rectales que vayan dirigidos a detectar Chlamydia trachomatis se colocan en un medio de transporte y se llevan rápido al laboratorio, o se dejan un rato en el frigorífico. Los exudados recogidos para diagnosticar gonorrea se tratan como se ha dicho antes para las muestras endocervicales. Las muestras de heces o el contenido gástrico recogido de personas con un período de incubación corto de una intoxicación alimentaria deberían analizarse para Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. El análisis incluye la preparación y examen de las extensiones teñidas con Gram y cultivadas. Como los dos organismos pueden estar presentes normalmente en la comida, hay que hacer varios cultivos. Se hacen una serie de diluciones de la muestra (10 , 10' , 10' , 10* y 10' ) y se preparan en diluyente de gelatina tamponada, y 0,1 mi de la muestra sin diluir y cada una de las muestras diluidas se colocan en colistina ácido nalídixico o agar sangre alcohol feniletilico (selectivo para organismos grampositivos). Además, para mostrar la producción de endoesporas de B. cereus, se mezcla 1 mi de la muestra original con 1 mi de etanol puro, y la mezcla se deja una hora a temperatura ambiente. Las diluciones de la muestra se preparan como se ha dicho antes, y 0,1 mi de cada una, de la muestra diluida y de la de sin 1
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
diluir, se colocan en agar sangre de oveja. Todas las placas se incuban a 35"C-37"C durante 18-24 horas y se cuentan las colonias. La presencia de 10'' CFU ó más de S. aureus o B. cereus por gramo de muestra es significativa, especialmente si se encuentra en la mayoria de los individuos afectados. El diagnóstico clínico de botulismo alimentario y botulismo infantil tiene que confirmarse detectando Closíridium botulinum. la toxina botulinica o ambos en las heces. Lo ideal sería recoger 25 ml-50 mi de heces. 15 ml-20 mi de suero y una muestra del alimento sospechoso. La mayoria de los laboratorios no están equipados para analizar las muestras de personas con sospecha de botulismo. En EE.UU., cuando se sospecha un caso de botulismo se debe notificar a los investigadores del CDC. asegurar el diagnóstico, el tratamiento e investigar una epidemia potencial. Las enfermedades asociadas con Closíridium dillicile. tales como colitis seudomembranosa y diarrea por antibióticos, están producidas por las toxinas que produce el organismo y se diagnostican detectando la toxina A y B o ambas en heces. Ei método de referencia para detectar la citotoxma es el ensayo de cultivo celular. Deben recogerse 25 g (25 ml-50 mi) de heces líquidas en un recipiente limpio de tapa ancha, y tiene que llevarse inmediatamente al laboratorio. La muestra debería analizarse dentro de las dos horas de la recogida o dejarla almacenada en el frigorífico. Para extraer la toxina, aclaramos la muestra de heces por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos o a 10.000 x g durante 10 minutos, y se filtra a través de una membrana de 0,45 pm. Se preparan varias diluciones y se inyectan a una monocapa de células, que se incuban durante 24-48 horas. Por otra parte, la toxina A o ambas toxinas, la A y la B, deben detectarse en las muestras de heces por ELISA. Esta técnica parece ser tan sensible como el cultivo celular y nos proporciona resultados en pocas horas (Merz, 1993; Whittier, 1993). La sensibilidad de los diferentes test de ELISA comercializados sin embargo varía (Lyerty, 1998; Fedorko, 1999). Un test de aglutinación de látex es válido, pero no da resultados fiables (Lyerly. 1988). Para estudios epidemiológicos, C. dillicile tiene que aislarse en las heces o exudados rectales poniéndolo en un sistema de transporte anaeróbico. Como hay muchas bacterias en las heces, hay que utilizar procedimientos selectivos para C. dillicile. La muestra de heces se diluye en gelatina tamponada (se recomienda 1:200). y ambas muestras, la diluida y la no diluida, se inyectan en un medio selectivo para C. dillicile. como el agar cicloserina cefoxitina fructosa yema de huevo (CCFA), y se incuban anaeróbicamente 48 horas. C. dillicile también puede aislarse de otras formas, por ejemplo, con el método de selección del alcohol, como se describe para Bacillus cereus. excepto que las muestras se ponen en un medio selectivo como el CCFA y se incuban anaeróbicamente. Closíridium pedringens es una de las causas de una intoxicación alimentaria de larga incubación (7-15 horas después de tomar la comida contaminada); también puede causar la diarrea asociada a antibióticos, que es típica en pacientes ancianos hospitalizados, y enteritis necrotizante. Para diagnosticar una intoxicación alimentaria causada por C. pedringens tienen que hacerse varios cultivos de heces y transportarse en un medio anaeróbico El material fecal, tanto el que está tratado con etanol como el que no está tratado, se diluye como se ha dicho antes para detectar las bacterias asociadas a una intoxicación alimentaria de periodo de incubación corto. Las placas de agar de alcohol leniletílico se inyectan y se incuban anaeróbicamente durante 48 horas. Un recuento de esporas de 10 o más por gramo de heces puede ser significativo, sobre todo si se encuentran en las muestras de la mayoria de los individuos. La toxina tiene que detectarse en la muestra de heces original, pero este test por lo general se realiza en los laboratorios de referencia. Un criterio similar se utiliza para diagnosticar la diarrea producida por C. pedringens durante el tratamiento antibiótico. 5
En relación con el cultivo bacteriano, las muestras de heces, por lo general, se destinan para aislar Mycobaclerium avium complex (principalmente de pacientes con sida), pero también se pueden aislar Mycobaclerium tuberculosis y otras especies de Mycobactehum. Analizar la muestra (de 1 g a 2 g de heces formadas o 5 mi de heces liquidas) incluye la descontaminación y concentración, preparación de extensiones y la inoculación de medio como se comentó en el Capítulo 53.
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Lo ideal para el diagnóstico de parásitos en el laboratorio es el examen de las muestras de heces para protozoos, parásitos y huevos de helmintos o larvas. Los laboratorios que realicen esos test deberían tener las condiciones adecuadas para manejar las muestras fecales y un buen microscopio con una escala para medir los organismos encontrados. Para identificar los protozoos intestinales, también se requiere teñir las extensiones fecales. La muestra (que por lo general la recoge el paciente) puede recogerse sin tenerla que fijar, y se llevará al laboratorio si se piden estudios bacterianos y de parásitos. La muestra de heces reciente debe colocarse en un contenedor limpio, seco y de tapa ancha. No debe recogerse de la taza del baño y no debe contaminarse con orina, aceites, componentes antídíarreicos o contraste radiológico. Una vez recogida, la muestra tiene que llevarse inmediatamente al laboratorio. Primero se hacen los estudios bacteriológicos, después la muestra se pasa al personal que hace los test parasitológicos, preferiblemente dentro de los 30-60 minutos después de recoger la muestra. Los retrasos en el análisis dan como resultado la degeneración de trotozoitos de Entamoeba histolytica, que es el único parásito por el que se requiere que la muestra sea reciente. Como es posible adquirir una infección en el laboratorio, se ha cuestionado el uso de muestras frescas para el examen parasitológico. Si la muestra fecal se ha recogido sólo para detectar parásitos, puede fijarse a la vez que se recoge. La muestra se lleva al laboratorio cuando la persona pueda, y el análisis se hace según la rutina del laboratorio. Hay varios equipos disponibles comercialmente para la recogida y transporte de las muestras fecales; la mayoría tienen dos viales, uno con fijador (formalina) para trofozoitos y quistes, y otro con un fijador (solución de Schaudinn) más alcohol pohvinilo (PVA) para preparar las extensiones para teñir. La pregunta de cuántas muestras son necesarias para identificar a todos los individuos con protozoos intestinales y helmintos aún no tiene respuesta. Para el diagnóstico de amebas, se recomienda que se recojan como mínimo tres muestras en tres días diferentes y que se analicen (Proctor, 1991). Para disminuir el coste, los médicos deben pedir el análisis de una muestra sólo, porque cerca del 90% de las infecciones se diagnostican en la primera muestra (Montessori. 1987). Si no se encuentra ningUn parásito en la primera muestra, se debe pedir una segunda o tercera. Si se reciben dos o más muestras al mismo tiempo recogidas en días diferentes, deben evaluarse como una sola (Peters, 1988). Los exámenes de heces de pacientes que han estado ingresados más de tres días no son útiles (Siegel, 1990). El análisis de las muestras lecales para parásitos incluye preparar una solución salina y de yodo (Lugol) y teñir las muestras frescas que se han recogido recientes (p. ej., aquellas que pueden analizarse dentro de las pocas horas de su recogida). A esto le sigue la concentración de quistes y huevos de helmintos y. al final, la preparación de extensiones para teñir con el tinte tncromo. Las preparaciones frescas, de realizarse, deberían analizarse y prepararse antes de hacer la concentración y el tinte tricromo. Si el diagnóstico está claro con el análisis de la muestra fresca (p. ej„ el diagnóstico de giardiasis cuando encontramos Giardia en la muestra fresca), no es necesario hacer las otras pruebas. Sin embargo, en muchos laboratorios no se analizan las muestras frescas, porque cuando las reciben ya no están frescas. La extensión fecal estándar, que tiene cerca de 2 mg de heces, se hace de una muestra fecal reciente del siguiente modo: se coloca una gota de salmo en un porta de cristal limpio: con un depresor se coge un poco de las heces y se mezcla con el suero salino con movimientos circulares (hasta que haya bastante muestra disuelta), y la mezcla se tapa con un cubreportas cuadrado de 22 mm. Una muestra está bien preparada si la dejamos encima de un pequeño papel escrito y podemos leer a través de la extensión lo que hay escrito. La extensión que teñimos con yodo la preparamos de la misma manera. Las dos preparaciones frescas, la de la solución salina y la de la solución yodada, pueden hacerse en el mismo porta de cristal, a la vez. mezclando las heces primero con suero salino y después con yodo. La extensión de solución salina nos mostrará protozoos y quistes de protozoos, además de los huevos de helmintos y larvas. En la extensión teñida con yodo no encontraremos Irofozoitos, porque el yodo los destruye, salvo que la muestra se haya fijado primero. La principal ventaja de la
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SECCIÓN VI
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MICROBIOLOGÍA MÉDICA
extensión teñida con yodo es que permite visualizar mejor algunas características de los quistes. La solución salina permite ver el movimiento de los trofozoitos. que es útil para identificarlos. Para preparar las muestras frescas del material fijado con formalina, los contenidos se mezclan bien y se coloca una gota directamente en el porta y en una gota de solución yodada. El examen de la extensión hecha con salmo se hace con un aumento medio (objetivo de 10x) al principio. Empezando por el vértice superior izquierdo, movemos el porta horizontalmente. de derecha a izquierda. Repetiremos esta operación hasta que terminemos de ver los 22 mm del porta. Debemos ver todos los huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoos. El examen con el objetivo de gran aumento se hará después para detectar e identificar los protozoos, mirando aleatoriamente durante unos 5-10 minutos para cada preparación. La técnica para la concentración, que puede hacerse tanto en muestras frescas como fijadas, es muy útil porque permite el enriquecimiento de muestras con un número bajo de organismos. El método ideal para un examen ordinario es la concentración con éter-formaiina, que se ha hecho más segura por el uso de etil-acético que con el éter-dietil. El tinte permanente de la extensión fecal para el diagnóstico de infección por protozoos intestinales se considera el patrón de buena práctica en los laboratorios de América del Norte. Los tintes se hacen en las extensiones preparadas con un pequeño cepillo mojado suavemente en solución salina y se fijan en solución Schaudinn antes de secarse. Las extensiones se hacen también de muestras recibidas fijadas en PVA: utilizando un depresor de madera, colocamos unas gotas de muestra en el porta, asegurándonos de que la película toca los bordes del porta, para evitar que se caiga mientras se tiñe. y ocupa la mitad del porta. Después de que la película se seca completamente a temperatura ambiente, se tiñe. Ciertos parásitos intestinales, como Cryptosporidium, Microsporidium y Cyctospora, requieren tintes especiales para detectarlos, como se ha visto en el Capitulo 55.
PIEL Y LESIONES SUBCUTÁNEAS Vejigas, bullas y pústulas. El liquido de una vejiga o una bulla puede extraerse con una aguja y una jeringa, y puede inyectarse este líquido a un tubo estéril. También se puede recoger una muestra de las vesículas y las bullas cortando la bulla y frotando la base con una torunda. Las muestras de las pústulas se recogen de modo similar, con una torunda quitando las costras que haya. Como mínimo hay que recoger dos exudados para preparar las extensiones para teñir. Sin embargo, si lo que piden es buscar más de un grupo de organismos (p. ej., virus y bacterias, o bacterias y hongos), lo ideal es recoger al menos tres exudados. Ante una sospecha de infección viral, la persona que recoge la muestra debe preparar una extensión en ese mismo lugar, pasando la torunda por todo el porta y dejándolo secar al aire. Todas las muestras tienen que colocarse en unos tubos para el transporte que contengan medio Stuart modificado. Sin embargo, si se pide una análisis para virus, se recomienda colocar una torunda en un medio de transporte viral; y si se pide un cultivo anaerobio, la torunda debe colocarse en un medio de transporte anaerobio. Los exudados y extensiones tienen que llevarse inmediatamente al laboratorio. El análisis de las muestras de vejigas o pústulas para detectar virus incluye un cultivo celular, y para el virus varicela zóster, y posible VHS. ayuda también el examen de las extensiones teñidas. Las muestras para cultivo se dejan en el frigorífico hasta que vayan a analizarse. El líquido que sacamos con la jeringa de una vejiga, que se recibe en medio de transporte viral, y los exudados, que se reciben en medio de transporte viral, se agitan en la mezcladora y se saca la torunda. El análisis de las muestras para detectar bacterias y/u hongos incluye preparar una extensión para teñir con Gram (para bacterias) o tinte de plata, calcoflúor blanco o rojo Congo (para hongos) e inyectar en un medio de cultivo adecuado, como se explica en los Capítulos 50 y 54. Úlceras cutáneas. Las muestras que se recogen de las úlceras cutáneas, exudado o aspirado, son para estudios microbiológicos. Las lesiones pueden
ser primarias (p. ej., las causadas por virus. Bacillus anthracis. Corynebacterium diphtheriae, Francisella lularensis, Pseudomonas aeruginosa, micobacterias u hongos) o úlceras por decúbito, que pueden ser colonizadas o infectadas con bacterias aeróbicas y anaeróbicas. La recogida, el análisis y el transporte de los exudados de úlceras cutáneas para detectar virus son idénticos a los descritos anteriormente para vejigas y pústulas. El manejo de las muestras de úlceras cutáneas es diferente para hongos y bacterias, y se explica de modo separado para cada uno de los organismos que causa lesiones primarias y para las bacterias asociadas con úlceras crónicas. Bacillus anthracis causa ántrax, una enfermedad rara en EE.UU.: se limita a personas que trabajan con lana importada bruta y otros productos animales contaminados con esporas de B. anthracis. El ántrax cutáneo comienza con una pápula y un dolor, que se convierte en vesicular, después hemorragia, necrótica, y se cubre con una escara. Para un diagnóstico adecuado, se recogen dos exudados: uno para cultivos y el otro para preparar extensiones para teñir con Gram y anticuerpos fluorescentes (esto último debe hacerse en un laboratorio de referencia). Debido a la naturaleza peligrosa de B. anthracis. debe considerarse si se mandan las muestras de una persona sospechosa al laboratorio. Si las muestras se analizan en el laboratorio, tienen que manejarse en una cabina de seguridad. El exudado que se va a cultivar se inyecta en un agar sangre de oveja y se deja incubándose a temperatura ambiente. Corynebacteríum diphtheriae es el causante de la difteria cutánea, que es una lesión ulcerativa que se cubre con una capa de tejido necrólico que semeja a una membrana. Para hacer un diagnóstico real, se prepara una extensión con material del borde de la membrana, se tiñe con azul de metileno y se recogen dos exudados de la membrana. Una muestra se utiliza para cultivo ordinario y la otra para inyectar en un medio de cultivo adecuado para C. diphtheriae (expuesto anteriormente en muestras de la garganta). El ectima gangrenoso es una lesión cutánea ulcerativa que casi siempre se produce cuando hay óacteriemia por Pseudomonas aeruginosa, pero rara vez se desarrolla cuando existe bacteriemia por otros bacilos gramnegativos. Lo ideal es recoger dos muestras de la base de la úlcera: una se utiliza para preparar una extensión con tinción Gram y la otra para inyectar en medio de cultivo. Para hacer el diagnóstico de la forma úlcero-glandular de tularemia es necesario recoger dos exudados de material de la base de la úlcera. Uno para cultivo ordinario y el otro para detectar Francisella lularensis, o para enviarlo a un laboratorio de referencia. Las micobacterias que podemos aislar son: Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium avium complex. Mycobacterium kansasii. Mycobacterium lortuitum-cheionae. Mycobacterium marinum, Mycobacterium haemophilum y Mycobacterium ulceraos. El exudado recogido con aguja y jeringa es válido para recuperar las micobacterias. Para transportar el material, se mete dentro de un tubo estéril, que se cierre bien, y se lleva pronto al laboratorio. No es recomendable recoger el exudado con una torunda de algodón, porque las micobacterias se quedan atrapadas en las fibras y es difícil sacarlas. Las muestras tienen que guardarse en el frigoríficopoco tiempo hasta que sean analizadas (véase Cap. 53). Muchas bacterias aeróbicas, facultativas, y anaeróbicas colonizan las úlceras cutáneas crónicas, Para identilicar el organismo responsable, el cultivo de los tejidos profundos o una aspiración profunda de material purulento recogido con aguja y jeringa nos proporciona la información bacteriológica más útil. Para transportar el pus aspirado, lo colocamos en un tubo estéril, lo tapamos bien y se lleva inmediatamente al laboratorio. El proceso de la muestra incluye preparar una extensión para teñir con Gram e inyectar en el medio adecuado para cultivo de aerobios y anaerobios. Para detectar hongos, basta con un exudado del margen activo de la úlcera (el transporte es como para las bacterias). El exudado con torunda de algodón es válido, aunque debería descartarse esta práctica. Analizar las muestras para detectar hongos incluye preparar una extensión para examen microscópico directo (preparación de hidróxido de potasio o los lintes señalados para las muestras de vesículas y pústulas) y la inyección en un medio de cultivo adecuado, tal como infusión cerebro-corazón, inhibidor de moho o agar Shabi, que contiene antibióticos y cicloheximína.
CAPÍTULO 57
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Heridas infectadas y abscesos. Lo ideal es aspirar el material purulento con aguja y jeringa y transportarlo como se ha dicho para las lesiones ulcerativas. Si no se puede aspirar de la herida, es válido un exudado recogido de la parte prolunda de la lesión. Para el cultivo ordinario, nos valen dos muestras; una para preparar una extensión y teñir con Gram y otra para cultivo. Para encontrar anaerobios, debe recogerse un exudado más y ser colocado en un sistema de transporte anaerobio. Todas las muestras tienen que llevarse pronto al laboratorio y ser analizadas lo antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que poner las muestras en el frigorífico- excepto las de anaerobios, que hay que dejarlas a temperatura ambiente.
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SECCIÓN VI
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S E C C I Ó N
V I
Patología molecular Chester J. Herman, M.D., Ph.D. John Bernard Henry, M.D.
CAPÍTULO
58
Introducción a la patología molecular • Chester J. Herman, M.D., Ph.D. • John Bernard Henry, M.D.
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD
1273
GARANTÍA DE CALIDAD
1274
FARMACOGENÓMICA Y TERAPIA GÉNICA
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BIBLIOGRAFÍA
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ANÁLISIS DE DATOS
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Hace algunos años, la revista Time publicó un reportaje con una ilustración en portada del viejo simboto de la profesión médica, el caduceo, transformándose en una doble hélice de ADN. y encima el titulo "El Futuro de la Medicina'. Articulos como este, en la prensa de información general, son un ejemplo de cómo el público no profesional reconoce lo que la profesión médica sabe desde hace algún tiempo que los avances de la biología molecular y de la genética están transformando todas la áreas de la medicina, y que estos avances aumentarán y se comedirán en el paradigma predominante de la ciencia médica en el siglo xxi. La patología se encuentra ahora a la vanguardia de esta transfonvación. Las técnicas moleculares ya han revolucionado, en muchas áreas, los diagnósticos de laboratorio y han ampliado enormemente los horizontes para ejercer la patología social y la académica. La revolución es tan global y tan profunda como lo es el último gran avance de la patología, la inmunobiologia. ya que las técnicas moleculares se aplican a todas las secciones del laboratorio. Y lo que es más impoñante. prometen liberar a la anatomía patológica de su dependencia de los análisis morfológicos. El advenimiento de esta nueva tecnología, aunque quizás intimide a algunos patólogos de formación clásica, debería ser bienvenida por su conmoción científica intrínseca, por su promesa de rejuvenecer la práctica de la patología tradicional y de lanzarla hacia nuevas direcciones, y por su auténtico potencial para hacer que la patología sea la especialidad médica preeminente en la nueva era de la medicina molecular, según avanzamos en el nuevo milenio. /Adaptado con el permiso de Wayne W. Grody. M.D.. Ph.D.) La patología molecular se aplica a los análisis de los ácidos nucleicos para diagnosticar enfermedades, para predecir el pronóstico de la enfermedad, conducir la terapia y para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad antes de que ésta se haga evidente. A pesar del poder de las técnicas patológicas moleculares y del hecho de que proporcionan nuevos puntos de vista, que antes eran imposibles, éstas son complementarias a los análisis tradicionales del laboratorio, no una sustitución en la mayoria de las aplicaciones. Las aplicaciones significativas y las interpretaciones seguras de la mayoría de las técnicas moleculares requieren que éstas se establezcan sobre una base firme de aplicación de las determinaciones bien establecidas del laboratorio. Quizá, el mejor ejemplo de que estas lécnicas son complementarias es el hecho de que se deben emplear las técnicas morfológicas, la histopatologia y la citopatologia para garantizar que los lejidos y las células apropiadas se analizan molecularmente. De otro modo, el análisis de lo que no sean tejidos o células diana puede conducir y conducirá a resultados erróneos y, a veces, a engaños peligrosos, a pesar de los métodos técnicos de alta calidad, que se interpretan con pericia y experiencia.
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD La disponibilidad de la secuencia del genoma humano y la identificación de todos los genes humanos han cambiado rápidamente nuestra forma de entender la salud, la susceptibilidad a la enfermedad y los precursores, y la enfermedad (Pandey, 2000) La capacidad para identificar el patrón de expresión génica que hace única la entidad de una enfermedad permite luego al patólogo definir especialmente enfermedades clínicamente diferentes, que pueden ser difíciles o imposibles de distinguir, basándose sólo en la morfología o en otros datos del laboratorio (Heller, 1997; Golub, 1999). También se delmen, más claramente, las relaciones entre las enfermedades, y a veces cambian radicalmente, comparando los perfiles de expresión génica de las enfermedades (Anbazhagan. 1999). En la dirección opuesta, la secuenciacion de los genes causantes de una enfermad y los análisis de las mutaciones demuestran que las enfermedades tienen formes ¡rustes no reconocidos previamente y que pueden incluir complejos de síntomas leves que no se han reconocido previamente de lorma aislada como síntomas de la enfermedad. Un ejemplo convincente de este aumento tan acusado de los síntomas de los que se compone la enfermedad es la fibrosis quistica (Friedman. 1999). Además de las disfunciones pulmonares y pancreáticas, leves y agudas, que están aceptadas desde hace mucho tiempo como fibrosis quistica, se han asociado ejemplos aislados de la ausencia congenita bilateral de los vasos deferentes, la pancreatitis crónica y las dolencias sinopulmonares a las mutaciones del gen de la fibrosis quistica (FCRT). Estas son mutaciones frecuentes no asociadas a la forma clásica y aguda de la enfermedad. Reconocer que los complejos de síntomas expanden la definición de las enfermedades sobre la base de las mutaciones de los genes, enfocará el tratamiento apropiado del paciente, en las formas más leves o alípicas de la enfermedad, y definirá la patobiologia, no sólo de los genes enteros sino también de los exones y de los intrones específicos afectados.
FARMACOGENÓMICA Y TERAPIA GÉNICA Los genes y las regiones no codificantes de los genomas tienen tales polimorfismos que en el genoma humano 1 de cada 1.000 pares de bases (pb) aproximadamente es distinto entre individuos diferentes. La secuenciación de partes del genoma demuestra que algunos de estos polimorfismos están en genes cuyas funciones son importantes en la respuesta a la terapia de algunos pacientes individuales (Evans, 1999). Los genes de las enzimas metabolizadoras de fármacos, activadores o mactivadores. y los genes de ligandos y receptores pueden mostrar poliformismos que disminuyen o aumentan los efectos terapéuticos o la toxicidad de los fármacos que ya son ampliamente
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
utilizados; esto explica algunas respuestas de hipersensibilidad que no se conocían o que no eran previsibles con anterioridad. Según se correlacionan e identifican más polimorfismos con la respuesta individual de los pacientes al tratamiento, el patólogo necesitará perfilar los polimorfismos corrientes en los pacientes que empiezan una terapia para enfermedades frecuentes, como la diabetes, la hipertensión, el cáncer y las infecciones. La definición del laboratorio de cada genotipo/fenotipo individual de los pacientes determinará los fármacos específicos y las dosis adecuadas para ese paciente. Esta evolución sitúa al patólogo en una posición más definitiva para determinar la terapia apropiada que el pronóstico tradicional de la evolución de la enfermedad, basado en la morfología de las lesiones o en las características del cultivo de los organismos infecciosos. Más allá de las alteraciones en genes individuales, los patrones de sobre e infraexpresión de muchos genes definen un perfil relacionado, en algunas enfermedades, para responder o resistirse a las terapias especificas. Además, los genes afectados pueden no estar directamente relacionados con las rutas metabólicas involucradas en la terapia afectada (Bubendorf, 1999). Del mismo modo, el laboratorio de patología verifica el éxito de la terapia génica. Después de que se introduce un gen, el tejido en el que el gen debe ser activo tiene que ser monitorizado para la expresión normal del gen introducido y para la (unción y estructura normales del producto génico. Es muy importante señalar que el laboratorio de patología debe monitorizar también la integración correcta de los genes transfectados, de modo que la integración permita la expresión normal del gen y no produzca una función y estructura anormales en los otros genes del paciente.
ANÁLISIS DE DATOS Para capitalizar al máximo el poder de la patología molecular, se están desarrollando propuestas, completamente nuevas, para el análisis de datos y para los datos relativos a los tratamientos de las enfermedades. La investigación patológica de la enfermedad y la biología básica han relacionado y analizado, tradicionalmente, sólo uno o unos pocos marcadores, como los antígenos, las enzimas, las proteínas estructurales y cosas por el estilo. Las técnicas moleculares producen datos de muchos miles de genes, tanto de sus expresiones como de sus secuencias. El procesamiento de todos estos datos, organizarlos en perfiles de enfermedades o de pacientes, y el relacionar los diferentes perfiles exige nuevas propuestas de la bioinformática. Estas propuestas requieren también que el patólogo trabaje más estrechamente con los matemáticos y que aprenda a utilizar herramientas analíticas más sofisticadas que las utilizadas tradicionalmente (Bitner, 1999).
GARANTÍA DE CALIDAD Como con todos los métodos del laboratorio, es necesario contar con programas de garantía de calidad para asegurar que los resultados de la patología molecular son exactos y útiles. Dos componentes esenciales de los programas
de garantía de calidad son la estandarización de los métodos y la comparación de los resultados de los análisis entre laboratorios. El National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha publicado los métodos estandarizados para realizar los análisis clínicos de patología molecular más comunes. La utilización de las directrices del NCCLS garantiza que los datos generados en los laboratorios de patología molecular son el estándar de una práctica excelente. La comparación entre laboratorios de la realización de los análisis la proporciona el College of American Pathologists (CAP) (www.cap.org). Los exámenes de las comparaciones entre laboratorios del CAP incluyen las aplicaciones de la microbiología molecular, de la genética, de la hematología, de paternidad e identidad y de las forenses en general. Si el patólogo aplica los estándares de garantía de calidad y utiliza las técnicas patológicas conociendo a fondo su fuerza y su debilidad, respectivamente, como se detalla en los siguientes capítulos, seguirá capitalizando las oportunidades que ofrecen estas técnicas para mejorar la atención al paciente y para comprender la patobiologia básica. En resumen, la patología molecular está penetrando e impregnando el laboratorio clínico en su conjunto, igual que lo hizo la inmunopatologia hace dos décadas. Se seguirán rompiendo y disolviendo las barreras y los límites sectoriales en esta transformación de la medicina de laboratorio a través del impacto de la nueva biología de la medicina, "la biología celular y molecular".
BIBLIOGRAFÍA Anbazhagan R, Tihan T, Bornman DM. et al: Classification of small cell lung cancer and pulmonary carcinoid by gene expression profiles. Cancer Res 1999: 59:5119-5122. Bitner M, Meltzer P. Trent J: Data analysis and integration: Of steps and arrows Natl Genet 1999: 22:213-214. Bubendorf L, Kolmer M, Kononen J, et al: Hormone therapy failure In human prostate cancer: Analysis by complementary DNA and tissue microarrays J Natl Cancer Insl 1999; 91:1758-1764. Evans WE, Rellmg MV: Pharmacogenomics: Translating lunctional genomics into rational therapeutics. Science 1999; 286:487-491, Friedman KJ, Silverman LM: Cystic fibrosis syndrome: A new paradigm for inherited disorders and implications for molecular diagnostics Clin Chem 1999; 45:929-931. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P. et al: Molecular classification of cancer: Class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999:286:531-537. Heller RA, Schena M, Chai A, et al: Discovery and analysis ol inflammatory diseaserelated genes using cDNA microarrays, Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94:21502155. NCCLS: Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases. Dale H. Altmiller (ed): Document MM-1. NCCLS. Wayne, PA, USA. NCCLS: Immunoglobulin and T-Cell Receptor Gene Rearrangement Assays. Timothy J. O'Leary (ed): Document MM-2. NCCLS. Wayne, PA, USA. NCCLS: Molecular Diagnostic Methods for Infectious Disease. Russel K Enns (ed): Document MM-3. NCCLS. Wayne. PA, USA, NCCLS: Quality Assurance for Immunocytochemislry Timothy J. O'Leary (ed): Document MM-4. NCCLS, Wayne. PA, USA. NCCLS: PCR-based Assays. Timothy J. O'Leary (ed): Document MM-5. NCCLS Wayne, PA, USA. NCCLS: Quantitative Molecular diagnostics lor Infectious Diseases, Roberta Madej (ed): Document MM-6. NCCLS, Wayne, PA, USA NCCLS: Fluorescence in situ Hybridization. Russel K. Enns (ed): Document MM-7. NCCLS. Wayne, PA, USA. NCCLS: Trinucleotide Repeats. Document MM-8. NCCLS. Wayne, PA, USA. Pandey A, Mann M: Proteomics to study genes and genomes Nature 2000; 405:837846.
CAPÍTULO
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Diagnósticos moleculares: técnicas y principios básicos • Elizabeth R. Unger Ph.D., M.D. • Margaret A. Piper, Ph.D., M.P.H.
BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Ensayos de hibridación: componentes básicos 1275
Estructura y composición molecular
Formatos de ensayos de hibridación Métodos de amplificación
Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos Ensayos basados en los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción
Replicación del ADN Transcripción del ADN a ARN Modificación postranscripcional
RELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LA
Traducción de ARN a proteínas
EVALUACIÓN DEL LABORATORIO
Control transcripcíonal
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Diagnóstico molecular
Mecanismos de reparación del ADN
Más allá del diagnóstico
Mutaciones del ADN ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
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BIBLIOGRAFÍA
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Separación electroforética Hibridación del ácido nucleico
Los ácidos nucleicos son las moléculas clave de la vida. El ácido desoxirribonucleico (ADN) reside en las células eucariotas y conserva toda la información necesaria para la conservación del organismo, y transfiere esa información a las generaciones sucesivas. El ácido ribonucleico (ARN) lleva la información del ADN al citoplasma de una célula y dirige la síntesis de las proteínas que se necesita para la función del organismo. De la estabilidad del ADN y de la duplicación exacta del ADN y su traducción a proteina depende el estado de salud normal. La biología celular moderna busca determinar los mecanismos básicos de la función y de la estructura de la célula, y los estudios se enfocan cada vez más a nivel del gen, las unidades del ADN que codifican proteínas. Como consecuencia de esto, los métodos de diagnóstico se dirigen también hacia la evaluación de los ácidos nucleicos. El objetivo de esle capitulo es el de proporcionar la estructura conceptual para las aplicaciones diagnósticas de los análisis de los ácidos nucleicos.
BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS La bioquímica de ácidos nucleicos es muy importante para la biología celular moderna y dicta muchos aspectos de las aplicaciones diagnósticas. Muchas de las enzimas asociadas con la reparación, la degradación y con la síntesis de ácidos nucleicos in vivo se han convertido en herramientas básicas del laboratorio para la manipulación y el análisis del ADN y del ARN. Los mecanismos celulares que actúan para dirigir y controlar la traducción, la transcripción y la replicación del ADN dirigen la biología básica de la célula en la salud y en la enfermedad. La investigación, el diagnóstico y la terapia se dirigen, cada vez más, al nivel molecular de la (unción de la célula. Para comprender las aplicaciones diagnósticas actuales de la biología molecular se necesita una visión general de los aspectos de la biología y la bioquímica del ácido nucleico, que se describen en esta primera sección. Hay más detalles disponibles en los libros de texto de biología celular (Alberts, 1994).
Estructura y composición molecular El ADN es una molécula polimérica de doble hebra (dsDNA). larga, que existe predominantemente en forma de doble hélice dextrógira. Cada molécula de ADN de una hebra (ssDNA) está compuesta de un número pequeño de monómeros. El esqueleto del polímero del ssDNA es el azúcar desoxirribosa. que está unida por grupos fosfato (Fig. 59-1A). Los enlaces fosfodiéster entre el carbono 3' de un residuo de azúcar y el carbono 5' del siguiente le dan al esqueleto su estructura invariable y su direccionalidad 5' a 3'. Unida al carbono 1' de cada azúcar está una de las cuatro bases posibles: la timina (T) y la citosina (C) (pirimidinas); la adenina (A) y la guanina (G) (purinas). Las bases pueden aparecer en cualquier orden secuencial y por eso forman la porción variable del ssDNA. Los monómeros del polímero de una hebra son los cuatro deoxirribonucleótidos trifosfato (dTTP. dCTP dATP, dGTP). cada uno se compone de una base, un trifosfato y una molécula de azúcar. Durante la síntesis del ADN los nucleólidos se desprenden primero de dos grupos fosfato y luego se unen enzimáticamente por dos enlaces fosfodiéster para formar una cadena. El ADN es una molécula extraordinariamente estable que sólo pierde su conformación normal por altas temperaturas, por el pH o en presencia de agentes desestabilizadores. La hélice de doble hebra es el estado más energéticamente favorable para el ADN. y el examen de los componentes del ADN explica este hecho. El azúcar y los grupos fosfato son hidrofílicos, en solución forman enlaces de hidrógeno estables con las moléculas de agua circundantes. Sin embargo, las bases son hidrofóbicas y no son solubles en agua a un pH normal. Una molécula estable de ADN debe asegurarse que las bases no entran en contacto con el agua. Esto es posible cuando dos polímeros ssDNA antiparalelos (uno va en dirección 3 a 5 y el otro en dirección 5' a 3) giran alrededor del mismo eje. Esta ordenación permite la formación de los enlaces de hidrógeno planares entre la adenina y la timina y entre la guanina y la citosina (Fig. 59-18). Mientras que las dos cadenas tienen secuencias de bases en orden complementario, las
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
l'IKIMIIMWs
Citosina
I'LKINAS
Guanina
Figura 59-1. Estructura repetida de ADN y pares de bases complementarios. A. Una cadena de ADN de una sola hebra. Las unidades de nucleótidos reoetidas son unidas por enlaces toslodiéster que unen al 5 -carbono de un azúcar al 3 -carbono de la siguiente. ('En el ARN el azúcar es nbosa. que tiene un 2 -hidroxilo añadido a la desoxirribosa). S. Bases de purina y de pirimidina y la lormación de pares de bases complementarios Las rayas sombreadas indican la formación de enlaces de hidrógeno. ("En el ARN la timina es reemplazada por uracilo. que se diferencia de la timina en que le falta el grupo metilo) (Adaptada y por cortesía de Piper MA, Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago, ASCP Press. 1989.)
hebras de la hélice tienen una estructura parecida a una escalera con peldaños (pares de bases [pb]) de tamaño consistente. La flexibilidad de los enlaces entre moléculas de oxigeno y carbono en el enlace fosfodiéster permite que la escalera se enrolle, formando una hélice regular, de modo que los pares de bases planares se quedan apilados uno encima de otro y no dejan sitio intermedio para las moléculas de agua. Las series poliméricas de enlaces de hidrógeno en los pares de bases mantienen las cadenas de ssDNA fuertemente unidas, y la conformación helicoidal protege a los pares de bases del agua, quedando expuestos sólo los esqueletos hidrofílicos.
matina) de forma altamente estructurada. La estructura del cromosoma incluye varios niveles jerárquicos de cromatina empaquetada, de un nucleosoma "como cuentas en un collar" (146 pares nucleótidos enrollados alrededor de un núcleo de histona) a asas altamente condensadas. cada una de las cuáles contiene alrededor de 100.000 pb de ADN. Cada núcleo de célula humana contiene 23 cromosomas de longitud característica y secuencia de pares de bases única. Estos cromosomas juntos constituyen el genoma humano.
El dsDNA es estable sobre un límite de pH de 4-9 aproximadamente. Las soluciones con pH fuera de estos limites son capaces de romper los enlaces entre pares de bases y pueden ser la causa de que la hélice de ADN se desnaturalice o se desenrolle en dos rizos separados al azar. También tienen el mismo efecto las altas temperaturas y los disruptores de los enlaces de hidrógeno, como la formamida. La transición de la forma hélice a la forma rizo puede ser seguida espectrofotométricamente a A (Fig. 59-2). A esa longitud de onda las bases absorben al máximo la luz ultravioleta, pero a una absorbancia molar menor en el dsDNA: cuando el dsDNA se convierte en ssDNA, la absorbancia aumenta de un 20% a un 30%. Debido a que a menudo se utiliza la temperatura para efectuar esta transición, a este proceso se le denomina fusión, y a la temperatura a la cual se convierte el 50% del dsDNA en ssDNA se le llama punto de fusión o T. del ADN. La T„ de las moléculas de ADN depende del contenido de pares de bases G-C frente a A-T relativo, ya que los tres enlaces de hidrógeno de los pares de bases G-C precisan más energía para romperse que los dos enlaces de hidrógeno de los pares de bases A-T. Se puede revertir el proceso de tusión bajando la temperatura, así las dos hebras complementarias pueden rehacer la hélice original si se reforman los pares de bases en la conformación lineal correcta. 26ü
La longitud de una molécula de ADN eucariótica es mucho más larga que la célula misma. El ADN purificado y no degradado forma una solución viscosa astringente que refleja la enorme longitud del ADN genómico (Fig. 59-3). Sin embargo, In vivo, el ADN se organiza en unidades regulares, altamente compactas, que se llaman cromosomas. Un cromosoma se compone de su hebra de ADN enrollada alrededor de proteínas asociadas al ADN (cro-
'Icmperaliira I (.')
Figura 59-2. Curva de anillamienlo y fusión del ácido nucleico helicoidal de doble hélice. (Adaptada de Pioer MA. Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago. ASCP Press, 1989, con autonzacion.)
CAPÍTULO 59
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DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
Tabla 59-2 E n z i m a s de ácido nucleico y funciones asociadas F u n c i ó n in vivo
Enzima
Las polimerasas mantienen unidos a los Polimerasas Polimerasas de ADN nucleótidos de ADN o ARN para formar Polimerasas de ARN una molécula hija de una sola hebra, utilizando como molde el estiramiento de una molécula padre de una sola hebra Estas enzimas ejecutan la síntesis de acuerdo a las reglas de los pares de bases y actúan en la dirección 5 a 3 La transcriptasa inversa, que se encuentra Transcnptasa inversa sólo en los virus, cataliza la síntesis del ADN. tanto de un molde de ARN como de uno de ADN Unen los fragmentos de ADN formados por ADN ligasas las síntesis discontinuas en la replicación del ADN o por las vías de reparación del ADN. Nucleasas Las nucleasas "digieren" las moléculas de DNasas, RNasas ácido nucleico por medio de la rolura de los enlaces foslodiéster Endonucleasas Las endonucleasas digieren los ácidos Exonucleasas nucleicos del centro de la molécula mientras que las exonucleasas empiezan en un extremo libre y pueden necesitar un extremo 3 o uno 5 Las nucleasas pueden tener la especificidad de una sola hebra, de doble hebra de ADN o de ARN Algunas polimerasas tienen actividad nuclear. Figura 59-3. Fologralia de ADN purificado que demuestra la naturaleza viscosa astringente del ADN genómico recortado mínimamente.
El ARN difiere del ADN en su función, en estructura y en composición química (Tabla 59-1). En el ARN. el azúcar es ribosa. que contiene un grupo hidroxilo en la posición 2' y se sustituye la timína por uracilo metilado (U). El ARN sólo existe como una molécula monohebra y de longitud mucho más corta que el ADN. La estructura del ARN es mucho más irregular, por la naturaleza monohebra de la molécula, pero puede contener algunas secciones helicoidales. Las moléculas de ARN con la misma secuencia de bases, sin embargo, formarán la misma estructura tridimensional como resultado de adoptar la conformación más favorable energéticamente. El ARN es mucho menos estable que el ADN. debido no sólo a la estructura monohebra, más azarosa, sino también a su susceptibilidad a la hidrólisis alcalina vía el grupo de hidroxilo 2 de la ribosa. El ARN también se degrada rápidamente por enzimas específicas de ARN que son ubicuas.
Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos El ADN se debe duplicar antes de la división celular para que las células hija retengan una copia exacta de la información genética contenida en los cromosomas paternos. El ARN debe ser sintetizado por todas las células en Tabla 59-1 C o m p a r a c i ó n de las características clave del ADN y del ARN Característica Azúcar Pares de bases Estructura Estabilidad
Función
ADN Desoxirribosa Timina-adenma Citosina-guanina Doble hebra Hélice-a Estable
Endonucleasas de restricción
Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias de pares de bases de ADN cortas específicas y rompen la molécula de ADN sólo en el sitio de reconocimiento.
funcionamiento para dirigir la síntesis de las proteínas necesarias. El ADN se debe degradar durante la reparación de los segmentos dañados y el ARN se está degradando y resmtetizándose continuamente. Estas y otras funciones se ven afectadas por las enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos. La Tabla 59-2 enumera las principales categorías de enzimas específicas de los ácidos nucleicos y sus funciones in vivo. Para el biólogo molecular, las enzimas purificadas in vitro se han convertido en herramientas de laboratorio, haciendo posible la ingeniería genética y muchos ensayos de ácidos nucleicos. Las enzimas especificas de ácido nucleico incluyen a las polimerasas. que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster durante la síntesis: y las nucleasas. que hidrolizan estos enlaces. Las nucleasas especificas de ARN (RNasas) están virtualmente presentes en todos los sitios, lo que hace mucho más difícil trabajar in vilro con ARN que con ADN. Las endonucleasas de restricción son una categoría especial de nucleasas y se encuentran sólo en bacterias, donde su función es destruir el ADN extraño. Las dianas de reconocimiento de las enzimas de restricción están situadas dentro de las moléculas del ADN. no en uno u otro extremo, son de secuencia especifica y su longitud puede variar, aproximadamente, de 4 pb a 12 pb. Las enzimas de restricción generan cortes específicos asimétricos o romos en la secuencia de reconocimiento (Fig. 59-4). En las siguientes secciones se verán las funciones ¡n vivo y la utilidad in vitro de muchas de estas enzimas.
ARN
Ribosa Uiacilo-adenma Citosina-guanina Una sola hebra Al azar (véase texto) Expuesto a hidrólisis de base Se degrada con DNasa Se degrada con RNasa Mantiene la información Lleva la información genética en el núcleo genética al citoplasma
Replicación del ADN El proceso de duplicación del ADN, conocido como replicación semiconservativa. utiliza cada hebra de la molécula progenitora para dirigir la síntesis de una hebra hija (Virshup. 1990). Ya que la secuencia base de la hebra progenitora ordena la secuencia de la hebra hija, la replicación es exacta y el producto de la replicación son dos moléculas de dsDNA. compuestas cada una de una hebra progenitora y una hebra hija con la misma y exacta secuencia de pares de bases. Aunque el concepto es simple, el proceso es complicado e involucra a un número de enzimas y proteínas accesorias.
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SECCIÓN VII
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PATOLOGIA MOLECULAR la secuencia de ssDNA ordenando la secuencia ARNm que utiliza las mismas reglas de complementariedad de pares de bases (pares de bases de uracilo con adenina). Cuando se alcanza el fin del gen, se termina la síntesis de ARNm.
Modificación postranscripcional
Figura 59-4. Ejemplos de enzimas de restricción de ADN y sus especificidades. A las enzimas se las denomina como a las bacterias de las que son aisladas (donde N es cualquier base y N' es su pareja).
Para que la síntesis comience, primero hay que producir una pequeña región de una hebra. Esto no es favorable energéticamente y se debe efectuar con proteínas que desenrollen y separen las hebras de la hélice. A continuación se sintetiza un oligonucleótido corto de ARN complementario a la secuencia de una hebra. La polimerasa III de ADN actúa con la síntesis del ADN y más tarde el oligonucleótido se corta y se sustituye con ADN por la polimerasa I de ADN. El ADN del cromosoma contiene muchos sitios de inicio para la replicación y este proceso se produce simultáneamente a través del cromosoma. La polimerasa III de ADN es una enzima direccional y sólo puede sintetizar ADN en dirección 5' a 3', ya que requiere una terminación ЗОН libre. Esto significa que puede ser sintetizada continuamente sólo una hebra hija, denominada hebra lider. La otra hebra, denominada hebra recesiva, es cebada por primasa de ARN, que no requiere una terminación ЗОН libre. Se sin tetiza discontinuamente en fragmentos cortos (fragmentos Okazaki) según se abre la burbuja de replicación. Entonces, estos fragmentos son unidos por la ligasa de ADN. La polimerasa III de ADN es también única, porque tiene actividad exonucleasa y es a prueba de fallos de lectura. Si se añade un nucleótido incorrecto a la cadena en crecimiento, es detectado y cortado por la porción nucleasa de la enzima y entonces se añade el nucleótido correcto. Esto ayuda a explicar la fidelidad extraordinaria del proceso de replicación del ADN. Los mecanismos de reparación postsíntesis también contribuyen a la exactitud de la replicación (véase más adelante en Mecanismos de reparación del ADN).
Transcripción del ADN a ARN A las secciones de ADN que especifican secuencias de aminoácidos de proteínas se las denomina genes; un gen contiene el código de la secuencia de aminoácidos para una proteína, así como las secuencias de ADN necesarias para regular la producción de esa proteína. Aunque las secuencias codificadoras de genes son de suma importancia para la célula y para la función del organismo, como un todo, la gran mayoría del genoma humano no está compuesto por genes. Sin embargo, no son bien conocidas las funciones de las regiones no codificadoras del ADN. A veces a estas secuencias se las denomina ADN basura, pero es más que probable que desempeñen funciones estructurales u otras, como permitir que se produzca la recombinación, que aún no han sido descubiertas. La síntesis de la proteina comienza con la activación del gen apropiado. Una copia del gen está hecha de ADN en forma de ARN. Debido a que la copia ARN lleva el código del ADN en el núcleo de la célula al citoplasma donde se produce la síntesis de los aminoácidos, este tipo de ARN recibe el nombre de ARN mensajero (ARNm). El ARN mensajero se sintetiza solamente de una hebra del gen del ADN; no se utiliza la hebra del ADN complementaria. Esto se realiza por medio de un proceso que se denomina transcripción. La síntesis de ARNm se hace de idéntica forma que la replicación de ADN, con
La molécula de ARNm se modifica de varías formas antes de enviarla al citoplasma (Rosenthal. 1994). El ARN mensajero contiene secuencias codificadoras de aminoácidos (exones) y secuencias no codificadoras (intrones); los intrones son cortados de la molécula de ARNm antes de la síntesis de proteínas. Un complejo molecular denominado maquinaria de procesamiento (Sharpe, 1988), que está compuesto de ARN de bajo peso molecular y de proteina. reconoce las secuencias del ARNm que identifican los límites de un intrón. une a los exones flanqueantes y libera al intrón. El procesamiento debe ser exacto, ya que la suma o la resta de un solo nucleótido en la unión de procesamiento podría cambiar el marco de lectura de 3 nucleótidos en las siguientes secuencias de nucleótidos. Otras modificaciones de la molécula de ARNm incluyen la suma de residuos de 7-melil-guanosina al extremo 5' en un único enlace 5-5' fosfodiéster. A esto se le llama un cap. que ayuda a unir el ribosoma a la molécula de ARNm para iniciar la síntesis de proteínas. Al extremo 3' se le añade una cola de poli-A, que puede ser necesaria para la estabilidad y el transporte al citoplasma. La señal de poliadenilación es especificada, en parte, por la secuencia AAUAAA, que está, por lo general, en la región 3' no traducida de la transcripción del ARN. En este punto, la molécula de ARNm está preparada para dirigir la síntesis de su proteína correspondiente.
Traducción de ARN a proteínas La síntesis de proteínas necesita traducir el lenguaje de los nucleótidos al de los aminoácidos. Se utilizan 21 aminoácidos diferentes en la síntesis de proteínas; cada aminoácido es especificado por uno o más tripletes de nucleótidos del ARNm. denominados codones. Debido a que un aminoácido puede ser codificado por más de un codón. al código se le conoce como código degenerado. Por ejemplo, AAG es el codón para lisina y UCG es el triplete para serina. Por tanto, la secuencia que codifica un aminoácido se lee en grupos de tres nucleótidos que van en dirección 5' a 3': este es el marco de lectura de una secuencia que codifica proteínas. Tres codones específicos no codifican para aminoácidos, sino que señalan el extremo de un gen (codones de parada). La traducción del código de nucleótidos de ARNm a proteínas es mediada por ribosomas en el citoplasma de la célula. Un ribosoma se une al extremo 5' del ARNm y proporciona un ambiente químico estable para todas las moléculas involucradas en la síntesis de proteínas. Los aminoácidos son unidos en la secuencia correcta por la acción de pequeñas moléculas de ARN adaptadoras. denominadas ARNs de transferencia (ARNt). Cada molécula ARNt contiene una región que es complementaria de un codón ARNm especial: el anticodón. El aminoácido que corresponde al codón ARNm complementario del ARNt está unido a un extremo del ARNt. Un ARNt con el anlicodón complementario correcto se une al primer codón en la secuencia de ARNm. que siempre es AUG. Cuando otro ARNt específico se une al codón siguiente, las enzimas ribosómicas catalizan la formación de un enlace peptidico entre los dos aminoácidos unidos al ARNt, eliminando la unión entre el primer aminoácido y su molécula ARNt. El primer ARNt se desprende del hbosoma y un ARNt nuevo se une al codón siguiente. Mientras este proceso continúa, el ribosoma se mueve a lo largo de la molécula de ARNm, completando la síntesis de la cadena de aminoácidos. Cuando se llega al codón de parada (UAG, UGA o UAA), el ribosoma se desprende del ARNm. En realidad, a lo largo de la misma molécula de ARNm se pueden mover varios ribosomas, cada uno de ellos traduce el código de ARNm dentro de una nueva molécula de proteínas.
Control transcripcional Son necesarios los mecanismos de control del repertorio de la transcripción génica y de la traducción de las proteínas para permitir la diferenciación
CAPÍTULO 59
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DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
celular y para la respuesta al estímulo ambiental. Algunos de estos mecanismos actúan a nivel del ADN y controlan la transcripción del ARNm (Rosenthal, 1994). Por ejemplo, los promotores son secuencias de ADN importantes para el inicio de la transcripción del ARNm. Los promotores se encuentran secuencia arriba, como aguas arriba de un río, (hacia el extremo 5) a una distancia relativamente invariable del inicio de la secuencia codificadora de proteínas. Hay varias clases diferentes de secuencias consenso de los promotores (secuencias de nucleótídos que están en muchos ejemplos). Los promotores más comentes son ricos en adenina y timina y son denominados cajas TATA. Al repetir las secuencias A-T, el ADN se desenrolla con más facilidad, debido a que los enlaces de pares de bases A-T son más débiles que los enlaces de pares de bases G-C. Hay otras secuencias de promotores reconocidas, las cajas GC y el motivo CAÁ. Después de la activación transcrípcional y por la unión de la polimerasa de ARN con sus cofactores. se produce y estabiliza una región de ssDNA local. El ARN mensajero es sintetizado desde la región local de ssDNA. y el ARNm es desprendido rápidamente a la vez que el ADN vuelve a su estado, más favorable energéticamente, de doble hebra helicoidal. Los amplificadores son secuencias de ADN que pueden aumentar la transcripción del ARNm y se pueden encontrar en localizaciones diferentes relativas al gen que afecten. Los factores de transcripción son proteínas que se unen a los amplificadores y a los promotores y estimulan o inhiben, selectivamente, la transcripción del ARNm (Papavassiliou. 1995). A su vez, los factores de transcripción son controlados por acontecimientos celulares, como la fosforilación, o por otras proteínas, como las hormonas y los factores del crecimiento. Una red de comunicaciones químicas intra y extracelulares puede asi seleccionar y controlar la síntesis de proteínas necesaria. Debido a que el ARNm es mucho menos estable que el ADN, la vida media del ARNm es muy corta. Nuevas moléculas del ARNm se están transcribiendo continuamente a partir del ADN. A la vez que la célula responde a los cambios en las señales de transcripción, los genes que están transcritos en ARNm pueden cambiar rápidamente y dar como resultado la síntesis inmediata de nuevas proteínas. Por tanto, la célula tiene la capacidad de ajustar su producción proteica en respuesta a su ambiente.
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sintetizada y cortan la región que incluye el fallo. La polimerasa III del ADN y la ligasa restablecen la secuencia correcta y la integridad de la hebra hija. La importancia de este mecanismo en la estabilización del genoma se ha evidenciado por estudios recientes que asocian el cáncer colorrectal no polipósico hereditario con defectos en las proteínas reparadoras de errores. La escisión de bases repara las dianas pequeñas, los aductores que no deforman la doble hélice, como los producidos por metilacíón. oxidación, reducción o fragmentación de bases por radiación ionizante. La escisión de bases deja huecos de 34 nucleótídos que luego se sellan con los nucleótídos reparados: los cortes se sellan con ligasa. Los aductores de bulto más grandes o los dimeros que distorsionan la hélice de ADN pueden ser causados, entre otros agentes, por la radiación UV, los carcinógenos y por los fármacos terapéuticos. Estas lesiones se eliminan por la vía de reparación de escisión nucleotidica (REN), que utiliza un sistema de enzimas, compuesto de muchas proteínas, para cortar un oligonucleotide de una hebra que contiene la lesión (Sanear, 1994). Luego el hueco se sella con la polimerasa ADN y se liga. Hay dos vías de reparación de escisión nucleotidica: una, en la que las lesiones que bloquean la transenpción son eliminadas rápidamente (reparación acoplada a la transcripción; Hanawalt. 1994), y dos, una vía global que repara el ADN basura, incluyendo la hebra no transcrita de los genes activos. Algunas de las consecuencias posibles originadas por la pérdida de actividad REN tienen como ejemplo la enfermedad xeroderma pigmentosa (XP). cuya causa son las mutaciones de REN. La XP acusa una extrema sensibilidad a los rayos solares y. como consecuencia, aparecen cánceres de piel a una edad muy temprana (Weeda, 1998). Los cortes no (recuentes de la doble hebra o los que se producen por la radiación ionizante o por el daño oxidativo presentan problemas importantes. Si no se resuelven, se bloquearán la transcripción y la replicación de las secuencias involucradas. Para mantener la integridad genómica, local y total, se reparan los cortes de la doble hebra por mecanismos de reparación de recombinación no homologa o alélica. Ahora queda claro que la reparación de ADN juega un papel importante en la vida de la célula. Hay evidencias recientes que indican que varias proteínas, que son proteínas de reparación primaria, también funcionan en la regulación y en la transcripción del ciclo de la célula. Por tanto, el proceso que concierne al ADN parece estar altamente integrado y se estudiará, cada vez más. como un todo y en relación a las enfermedades humanas.
Mecanismos de reparación del ADN Se deben minimizar los errores en la replicación del ADN y los daños al ADN durante la vida celular normal para preservar la salud de todo el organismo. Hay varios mecanismos que actúan para mantener normal la secuencia del ADN. Primero están los mecanismos para anular los errores, que actúan durante la replicación del ADN. La polimerasa del ADN, que sintetiza nuevos polímeros de ADN. selecciona cada monómero de nucleótídos sucesivo basándose en su complementariedad al nucleólido siguiente en la hebra molde. La fidelidad a este nivel es grande y en esta etapa se anulan la mayoría de los errores en la síntesis. Sin embargo, a la hebra en crecimiento se le puede añadir, ocasional e incorrectamente, una base. Para corregirlo, la actividad a prueba de errores de lectura de la polimerasa reconoce el error, elimina la base incorrecta y continúa de nuevo con la síntesis. Los mecanismos para anular errores reducen los fallos en los pares de bases en aproximadamente 1 entre 10 millones (Radman. 1988). Esto representa un aumento de 100.000 veces en eficacia, comparándolo con el índice de error de 1 en 100 bases para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida in vitro. A pesar de la extraordinaria anulación de errores en la replicación del ADN, se producen equivocaciones ocasionales. Aún más. el ADN puede ser dañado por reacciones bioquímicas normales y por agentes no fisiológicos, como la luz ultravioleta y los carcinógenos ambientales. Hay varios mecanismos de reparación que reparan el ADN dañado (Yu, 1999) (Tabla 59-3). Los mecanismos de reparación directos reparan los daños a través de una reacción en un solo paso. Por ejemplo, la O - metil-guanina ADN metiltransferasa repara los daños por alquilacíón, transfiriendo el grupo alquilo desde la lesión al sitio activo de la enzima. Otro mecanismo de reparación directo, caracterizado en Escherichia coli, puede existir, también, en las células humanas (Yu, 1999).
Mutaciones del ADN A pesar de los extensos mecanismos de reparación, se producen alteraciones de las secuencias de bases en el ADN (mutaciones), y en alguna medida deben producirse, para que continúe el proceso de evolución. Incluso para un organismo individual, algunas mutaciones son claramente dañinas y pueden estar asociadas al cáncer y a las enfermedades genéticas hereditarias. Los estudios de estas enfermedades han conducido a la caracterización de varios tipos de mutaciones que se producen el genoma humano (Weatherall, 1987). Éstas pueden ser agrupadas, conceptualmente, en varias categorías principales (Tabla 59-4). Una mutación puntual se encuentra en el gen de la (J-globina en
Tabla 59-3 Vías de reparación del ADN Reparación directa Reparación de errores
Reparación de la escisión de la base
e
La reparación de errores (RDE) funciona inmediatamente después de la replicación del ADN para reemplazar las bases erróneas por las correctas (Modrich, 1994). Algunas proteínas RDE reconocen el erraren la hebra hija recién
Reparación de la escisión del nucleótido
Repara ciertos tipos de lesiones del ADN en una reacción de un solo paso Comprueba los errores cometidos cuando el ADN se ha replicado Elimina a cualquiera de las bases mal emparejadas y las reemplaza por las correctas. Repara los pequeños aductores que no deforman la hélice, como los originados por la metilacíón. la oxidación, la reducción o la fragmentación de la base mediante radiación ionizante
Elimina los aductores de bulto del ADN. como los dimeros de timina y ciertos fotoproductos, asi como a los aductores químicos y a los enlaces cruzados. Reparación de la rotura Repara las roturas de la doble hebra de la doble hebra originadas por procesos fisiológicos o por la radiación ionizante y las agresiones oxidativas
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÌA MOLECULAR
Tabla 59-4 Tipos de m u t a c i o n e s de A D N y e j e m p l o s de las e n f e r m e d a d e s Mutación Punto Deleción o inserción Deleción o inserción con frameshilt
Amplilicación o repetición de los Irinucleótidos Translocación
Descripción
Enfermedad
Sustitución de un solo par de bases. Sustracción o adición de codones de aminoácido en múltiplos de tres Se conserva el marco de lectura Sustracción o adición de codones en no múltiplos de tres. El resultado es un desplazamiento del marco de lectura y una secuencia que codifica aminoácidos completamente diferente a partir de la mutación. Aumenta el número de secuencias en el ADN microsatélite. Origina la disrupción de la expresión del gen Cambio intercromosOmico de segmentos largos de cromosoma Origina una nueva proteina con una función diferente.
la anemia de células enfermas (Kan. 1992). Una base de timina reemplaza a una base de adenina y origina un cambio grave en la estructura de la hemoglobina. La deleción en el gen de la proteína muscular distrófica es la causa de la distrofia muscular. En la variedad Becker de la enfermedad, las deleciones no interrumpen el marco de lectura, pero en la mayoría de los casos de la variedad Duchenne, mucho más grave, las deleciones sí cambian el marco de lectura, eliminando eficientemente la función de las proteínas (LiechtiGallati. 1989). El ADN humano contiene muchas secuencias cortas de nucleótidos (ADN microsatélile) que algunas veces se agrupan en repeticiones en tándem y que se repiten muchas veces por todo el genoma humano. El número de repeticiones en tándem en lugares especiales es un carácter hereditario. Se ha observado que algunas repeticiones de trinucleólidos aumentan en número en asociación con la enfermedad (Sutherland, 1994). En el síndrome del cromosoma X frágil, la expresión de la enfermedad está asociada a la amplificación, más allá de un cierto limite, del número de una secuencia de repetición trinucleótida intragénica. La expansión de las repeticiones trinucleótidas, más allá de un número crítico, rompe la expresión del gen. No siempre se pueden detectar las translocaciones por el análisis del cariotipo cromosómico. A nivel del gen, una translocación puede crear un gen de fusión, la combinación de dos genes diferentes unidos de forma anormal en el sitio de la translocación. Esto no sólo puede crear una transcripción del gen alterada, sino que también puede producir un gen bajo el control transcripcional de otro. Por ejemplo, el cromosoma Filadelfia. que se encuentra en la mayoría de los casos de leucemia mielógena crónica, es el resultado de una translocación recíproca entre el gen c-abl. en el cromosoma 9, y una región denominada región de agolpamientos de puntos de sutura (raps), en el cromosoma 22. El gen de fusión producido por este reordenamiento cromosómico se compone de la mayor parte del gen c-abl y de una raps truncada, codilica una proteína c-abl, que es más grande que el producto normal, tiene una actividad enzimática incrementada y se cree que interfiere con las vias de transducción de señales que, normalmente, están involucradas en el control de proliferación y muerte de las células. Lo que determina el efecto último en el producto proteico es el tipo de mutación, asi como su localización en relación al gen. Las mutaciones pueden no tener efecto sobre la expresión de la proteina o su actividad funcional: existen muchas proteínas humanas, en variantes perceptibles, que no están asociadas con la enfermedad. Las mutaciones que se producen en las regiones intrónicas se supone que no tienen ningún efecto. Sin embargo, incluso las pequeñas mutaciones en regiones que codifican para dominios funcionales clave (exones) pueden alterar o eliminar funciones drásticamente. Las "mutaciones sin sentido" son mutaciones que transforman un codón de aminoácido en un codón de parada, o viceversa, y dan como resultado productos proteicos anormalmente cortos o largos, respectivamente. Las mutaciones de sentido erróneo son aquellas que cambian el código de un aminoácido a otro y que pueden alterar o no la función de la proteina dependiendo del cambio y de la función del aminoácido. De igual forma, las mutaciones dentro de las secuencias que señalan los sitios de unión pueden eliminar exones e introducir intrones en el ARNm transcrito. Las mutaciones pueden producirse también en las secuencias reguladoras, como las promotoras y las amplificadoras, que producen efectos drásticos en los niveles de transcripción,
Anemia drepanocitica Distrofia muscular de Becker Distrofia muscular de Duchenn<
Cromosoma X frágil Leucemia mielógena crónica
ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Las propiedades bioquímicas únicas de los ácidos nucleicos han sido el detonante para proporcionar información de la biología o bioquímica de un sistema. Mientras que algunos ensayos, como la electroforesis. se aplican a otras unidades básicas, como las proteínas y los lípidos, la gran mayoría son específicos para los ácidos nucleicos En las siguientes secciones se describen brevemente los principios de las categorías de análisis básicas utilizados para caracterizar el ADN y el ARN. las separaciones electroforéticas. los ensayos de hibridación, las técnicas de amplificación y los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción. En la práctica, las categorías, a menudo, se combinan para producir nuevas variaciones del mismo tema. Por ejemplo, un ensayo completo puede involucrar a la amplificación, la electroforesis y la hibridación.
Separación electroforética El esqueleto de azúcar-fosfato repetitivo de los ácidos nucleicos da como resultado una carga neta negativa distribuida ligeramente sobre estas moléculas lineales. Por tanto, el movimiento del ADN o del ARN en respuesta a un campo eléctrico será proporcional al peso molecular o a la longitud de la molécula. Esta propiedad se utiliza para caracterizar el tamaño de los fragmentos de ácido nucleico por separación electroforética. El formato es similar al que se utiliza para la separación de proteínas según su tamaño. Se ponen múltiples muestras en pocilios separados, en un extremo de un medio de separación sólido pero poroso. Cuando se aplica el voltaje, la muestra se mueve hacia el electrodo positivo de manera lineal, formando cada muestra una linea de migración. Se conoce como ge/al medio electroforético sólido y a la repetición de pocilios de muestra. Los tamaños estándar, a los que nos referimos como escaleras de ADN o ARN, son mezclas de ácidos nucleicos de longitud de fragmento conocida que son analizados en una o más líneas del gel. La determinación del tamaño se hace comparando la distancia de migración de una muestra desconocida con la escalera, bien ~a ojo" o por mediciones asistidas por ordenador. La composición y la concentración del medio de separación determina el tamaño de los fragmentos, los cuales se pueden separar en bandas diferentes. Otras variables que contribuyen a la resolución son el grosor del gel, la longitud de la vía de electroforesis, la duración de la electroforesis y el voltaje aplicado. En la práctica, estos factores se gustan empiricamenle y se controlan tan cuidadosamente como es posible para asegurar la capacidad de reproducción de día en día. La agarosa es el medio de separación que se utiliza con más frecuencia y. por lo general, conjuntamente con una cubeta de electroforesis horizontal, en la que se sumerge el gel en tampón. el gel sumergido. Las muestras se espesan con sacarosa o Ficoll y son cargadas en los pocilios del gel por medio del tampón (Fig. 59-5). Se obtiene un poder mayor de resolución con acrilamida, utilizada normalmente en un lormato vertical, que permite la diferenciación en longitud de un solo par de bases. El método más simple para visualizar las bandas separadas por electroforesis es la tinción con colorantes intercalados (p. ej.. el bromuro de etidio), que se insertan
CAPÍTULO 59
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DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
entre las bases emparejadas, y visualizando con transiluminadores de luz UV. La visualizacíón directa requiere que la banda consiga un concentración significativa. En algunas aplicaciones se pueden delectar los fragmentos de ácido nucleico por fluorescencia o por radiactividad, marca que puede aumentar la sensibilidad. Las moléculas en el ADN genómico son reducidas a fragmentos que se pueden resolver por electroforesis por medio de la digestión con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción con una secuencia de reconocimiento relativamente simple producen fragmentos de menos de 50 kilopares de bases (kpb) de longitud. Los fragmentos de ADN extremadamente largos, medidos en megapares de bases (Mpb). se producen por la digestión con enzimas con una secuencia de reconocimiento compleja, y deben ser separados en sistemas electroforéticos especiales utilizando un campo eléctrico pulsado. La mayoría de las aplicaciones de la electroforesís de ADN utilizan condiciones no desnaturalizantes (es decir, los fragmentos que se resuelven en bandas son de doble hebra). Por el contrario, la mayoría de las separaciones del ARN utilizan condiciones desnaturalizantes (bien fornamida o glioxal) para eliminar la estructura secundaria de las moléculas monohebra. Las moléculas de ARN, que son transcritas de ADN. son "premedidas" y relativamente pequeñas, por lo que no se requiere digestión antes de la electroforesís.
Hibridación del ácido nucleico La hibridación es un concepto fundamental en la bioquímica del ácido nucleico: se le define como la interacción entre dos moléculas monohebra de ácido nucleico para formar una molécula dúplex (de doble hebra), basada en el emparejamiento de bases complementarias de sus respectivas secuencias. La hibridación es consecuencia directa de la estructura estable de doble hebra del ADN bajo condiciones fisiológicas. Como se ha visto antes, la hélice está formada por dos hebras antiparalelas de ADN sujetas por la fuerza combinada de muchos enlaces específicos de hidrógeno entre pares de bases complementarios, asi como por una carcasa hidrofóbica de bases de un ambiente acuoso. Lo importante de la reacción de hibridación es el hecho de que las uniones entre moléculas complementarías separadas (hebras) sea reversible y especifica de secuencia de bases. Al proceso de reforma de la estructura de la doble hebra estable, cuando ninguna de las hebras está marcada, se le denomina amllamiento. Si una hebra está marcada (es decir, si tiene un marcador que puede ser detectado de alguna manera), a esa hebra marcada se la denomina sonda, y al proceso se le conoce como hibridación, debido a que se forma una molécula híbrida entre una hebra marcada y otra sin marcar. Las moléculas de ARN también pueden participar en el proceso de hibridación. El emparejamiento de bases puede producirse entre hebras de ADN complementarias, entre el ADN y el ARN y entre hebras de ARN complementarias, dando como resultado estructuras dúplex de ADN-ADN. ADN-ARN y ARN-ARN. Las estructuras más
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Figura 59-6. Ilustración de la astringencia. Según aumenta la astringencia de la hibridación se toleran menos errores en un hibndo dúplex Con la astringencia muy alta, incluso un error en un solo par de bases interrumpirá el dúplex.
estables las forman las moléculas dúplex, con complementariedad exacta en la secuencia de bases, pero pueden formarse estructuras con diversos grados de error de ios pares de bases dependiendo de las condiciones. La inestabilidad relativa de estos dúplex erróneos se reflejará en la baja temperatura de su disociación (por debajo de la T,,). Se pueden manipular las condiciones ambientales para controlar el grado de errores de los pares de bases que se tolerarán en una estructura dúplex (es decir, la astringencia de la coincidencia de la secuencia) (Fig. 59-6). Una baja astringencia tiene que ver con las condiciones, como sal elevada, baja temperatura, ausencia de fornamida. que favorecen a la carcasa de bases hidrofóbicas de un ambiente acuoso, incluso sin un alineamiento perfecto; la coincidencia no necesita ser perfecta. Las condiciones de alta astringencia -alta temperatura (cerca de T,„). baja sal y fornamida alta- sólo permitirán estructuras dúplex perfectamente alineadas para permanecer en una conformación helicoidal estable.
Ensayo de hibridación: componentes básicos El proceso conocido como ensayo de hibridación es el que utiliza la reacción de hibridación para analizar el contenido del ácido nucleico de una muestra no conocida. La propiedad del emparejamiento de bases complementarias permite a los fragmentos de una composición conocida (la sonda) interrogar a una desconocida por la presencia de secuencias (complementanas) de comparación. Por tanto, todos los ensayos de hibridación requieren varios elementos básicos: una sonda, una muestra, condiciones controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementarias y un método para el descubrimiento de híbridos específicos de sonda-muestra. A continuación se verán brevemente cada uno de estos elementos, así como las variaciones en los formatos que se han desarrollado para permitir la ejecución y la interpretación de los ensayos de hibridación
Sonda La sonda determina la especificidad de la reacción de hibridación. Por eso la sonda es capital para un ensayo de hibridación, de la misma manera que el anticuerpo primario es capital para un inmunoensayo. Una sonda es un fragmento bien caracterizado de ácido nucleico, bien de ADN o bien de ARN. En la mayoría de los ensayos, y aunque se producen variaciones, la sonda es la que porta al grupo reportero para delectar moléculas hibridadas dentro de la reacción. Los grupos reporteros pueden ser radiactivos o no radiactivos (es decir, mareaje por afinidad). Figura 59-5. Fotografía de la carga de una muestra y su tinción mediante lampón en un pocilio de gel de agarosa en un apáralo de electroforesis de gel sumergido.
La mayoría de las sondas son producidas por la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes, como se ilustra en la Figura 59-7. Los plásmidos, segmentos de doble hebra cortos y circulares de ADN, son utilizados para pro-
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 59-7. Producción de sondas clonadas. La inserción de un segmento extraño conocido de ADN en un vector de plásmido produce un plásmido recombinante Los piásmidos de este tipo son pequeños trozos circulares de ADN que se propagan mediante su cultivo en un huésped bacteriano. El ADN plásmido se separa fácilmente del cromosoma bacteriano en base al tamaño. El plásmido recombinante purificado puede ser utilizado como sonda. Esto produce una sonda de ADN de hebra doble con secuencias del inserto y del vector De forma alternativa, se pueden purificar las secuencias del inserto del vector del plásmido y utilizarlas solas como la sonda. Si el plásmido contiene una región de ARN promotor, se pueden producir sondas de ARN utilizando una polimerasa de ARN para transcribir las secuencias del inserto. Como solamente se transcribe una hebra, las sondas de ARN que se producen son de una sola hebra. (Por cortesía y adaptada de Unger ER: In situ hybndization. Principies and praclice Clin Immunol Newslett 1990:10:120-126, copyright © 1990 Elsevier Science.)
pagar las secuencias deseadas en las bacterias. El segmento que interesa se introduce en el plásmido, utilizando la digestión de enzimas de restricción y ligación, lo que da como resultado una nueva molécula "recombinada" que mantiene la capacidad de propagarse en la bacteria y que incluye a la secuencia de ADN que interesa. Las bacterias que contienen el plásmido recombinante pueden ser crecidas en cultivo y los piásmidos pequeños y circulares pueden ser fácilmente separados del genoma bacteriano en base al tamaño. Así se obtienen muchas copias idénticas y por eso nos referimos al ADN como clonado. El plásmido purificado puede ser utilizado en ensayos donde las secuencias de vectores no interfieren con la especificidad de la reacción. En muchas aplicaciones, la secuencia de ADN insertada es separada de la secuencia de vectores por medio de la digestión del plásmido aislado con la misma enzima de restricción, utilizada originalmente en la construcción de la molécula recombinante. La sonda resultanle, por cualquiera de esos métodos, es una molécula de ADN de doble hebra. Antes de utilizarlas, las sondas de doble hebra deben ser desnaturalizadas, y el reanillamiento de la sonda limita la extensión de la hibridación de la sonda con una diana. El vector del plásmido que no contiene ADN clonado es un control negativo utilizado corrientemente para este tipo de sonda. Los vectores de los piásmidos han sido construidos para incluir a las regiones promotoras de ARN adyacentes a la secuencia de ADN insertada. Estos piásmidos recombinantes se usan para producir transcritos de ARN a partir del ADN insertado. El resultado es una sonda de ARN monohebra que no experimentará autohibndación. El control de la orientación del ADN insertado con respecto al promotor de ARN permite la producción de transcritos en la dirección sentido (igual que el ARNm) o antisentido (complementaria al ARNm). En muchas aplicaciones, los transcritos de sentido forman sondas de control negativas, ideales para las reacciones de hibridación con sondas antisentido. Una sonda de ARN enlazada no especiticamenle (es decir, el ARN no es una estructura dúplex estable) puede ser eliminada utilizando RNasa específica de ARN monohebra. Como el ARN es muy delicado, es necesario que las sondas sean manejadas con un cuidado extremo para prevenir su degradación (técnicas estériles, agua tratada y material de cristal). Las sondas recombinantes. sean de ADN o de ARN. son genéticamente complejas, lo que significa que pueden incluir muchas kilobases de información genética, al contrario que las sondas producidas por métodos sintéticos, que son segmentos de ADN relativamente cortos. Las sondas de oligonucleó-
tidos producidas por reacciones químicas automatizadas son, normalmente, de 15 a 45 bases de longitud, sintetizadas para producir una secuencia de bases específica. Se pueden diseñar sondas con una especificidad de hibridación muy alta, en base a la información de secuencias disponible en los bancos de datos. Se pueden generar en dirección sentido o antisentido, con costes relativamente baios. Estas sondas cortas son monohebra. esparcidas en la diana y de hibridación rápida, debido a su pequeño tamaño, y extremadamente sensibles incluso a un solo error en los pares de bases. Debido a su limitada complejidad genética, la susceptibilidad última que se consigue con las sondas de oligonucleótidos es más baja que la que consigue con las sondas recombinantes. Las múltiples sondas de oligonucleótidos dirigidas a diferentes áreas de la misma diana han sido utilizadas, en algunos casos, para aumentar la susceptibilidad, incrementando la representación de la secuencia diana en la mezcla de la sonda. Este método es análogo a la ulilización de una mezcla de anticuerpos monoclonales que reaccionan frente a epitopos diferentes del mismo antigeno complejo. Se pueden generar sondas más largas que las obtenidas por la síntesis química directa con la reacción en cadena de la polimerasa o con otra tecnología de amplificación. Estas sondas pueden ser monohebra o de doble hebra, dependiendo de las condiciones empleadas, y pueden ser tan largas como el producto de la reacción de amplificación; en la mayoría de los casos de 100 pb a 1 kben longitud.
Muestra Mientras que la selección y la preparación de las sondas es esencial para determinar la susceptibilidad y la especificidad del ensayo de hibridación, no se debe olvidar que la preparación de la muestra contribuye al éxilo del ensayo. Para aplicaciones clínicas, las muestras de interés deben ser bastante diversas. Por ejemplo, un laboratorio de microbiología podría contar con muestras de análisis de sangre, de orina, de heces y de esputos. Puede ser difícil mantener la integridad de las dianas de ARN bajo en tales condiciones, e incluso el ADN puede ser degradado si no se maneja adecuadamente. El objetivo de la preparación de la muestra es mantener la integridad del ácido nucleico y hacer asequible la información genética de la diana para la interacción con la sonda. Para algunas aplicaciones, la necesidad de integridad de la diana aconsejará una congelación inmediata o añadir lampones de lisina que contengan inhibidores de RNasa o de DNasa potentes. En otras aplica-
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ciones, la utilización de métodos de recogida de muestras más habituales permitirá una preservación adecuada de la diana. Las similitudes fisicas y químicas de los ácidos nucleicos, sea cual sea la fuente, permiten métodos uniformes de purificación y extracción. En muchos ensayos, para eliminar inhibidores de enzimas que son añadidos al ensayo (como una enzima de restricción o una polimerasa) y para maximizar la accesibilidad de la diana a la sonda, es preferible purificar extensivamente el ADN o el ARN. Sin embargo, los sistemas de purificación completos consumen mucho tiempo y requieren una cantidad relativamente grande de muestras de partida. En muchas aplicaciones se pueden utilizar purificaciones de muestras relativamente abreviadas. Normalmente para las purificaciones se utiliza la lisis de la célula (mecánica, quimica o ambas), tratamiento de proteasa y extracciones orgánicas o inorgánicas.
recta de los anticuerpos. El primer mareaje por afinidad introducido en los ácidos nucleicos fue la biotina, un mareaje por afinidad utilizado corrientemente en los inmunoensayos (Langer, 1981). La biotina por sí misma no genera señales, pero es delectada por la interacción de alta afinidad con una molécula de avídina o estreptavidina. que a su vez se combina o conjuga con una enzima generadora de señales o fluorocromo. Muchos otros grupos funcionales se han desarrollado como marcas monoisolónicas. como la bromodesoxiundina. la digoxigenina y la sullona. En estos casos, la detección se consigue con anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra el grupo funcional. Estos anticuerpos están, por lo general, directamente enlazados a una enzima generadora de señales o fluorocromo que actúa como un anticuerpo secundario marcado en una reacción inmunoquimica. La biotina también puede ser detectada con un anticuerpo antibiotina más que con una molécula de avídina o estreptavidina.
Condiciones controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementarias
Debido a que las marcas de afinidad son detectadas con proteínas grandes, como la avidma o los anticuerpos, la disponibilidad de la marca al reactivo de detección es un factor crucial en la determinación de la sensibilidad. El aumentar el número de marcas de afinidad no incrementará necesariamente el número de moléculas detectaras que serán unidas al ácido nucleico. Además, y debido a que las marcas de afinidad son grandes, su sobremeorporación en la molécula de ácido nucleico puede conducir a un bloqueo espacial de la reacción de hibridación. Por estas razones, la actividad especifica de la marca de afinidad no controla directamente la sensibilidad de la detección.
La susceptibilidad y la especificidad de las reacciones de hibridación son influenciadas, en gran medida, por el ambiente lisico-quimico durante la reacción y la consecutiva detección/recogida de las moléculas híbridas. En la práctica, el medio utilizado para controlar el ambiente de la reacción de hibridación es el cóctel de hibridación. Diseñado empíricamente, el cóctel de hibridación es una mezcla de reactivos seleccionados para favorecer la interacción de los ácidos nucleicos a través de enlaces de hidrógeno específicos de secuencia, más que en base a la carga. Sus componentes varían mucho, pero incluyen tampones, sales, desnaturalizantes como la formamida. polímeros de alto peso molecular, ADN o ARN portador y varios componentes más que se le añaden para reducir el fondo (como detergentes, suero de bovino, albúmina y Ficoll). A esta mezcla tan compleja se la denomina, con toda propiedad, un cócfeí La luerza iónica del cóctel de hibridación, y los lavados subsiguientes, es modulada, muy frecuentemente, por la concentración de un tampón citrato sódico salmo (SSC). compuesto de 0.15 mol/I de cloruro de sodio. 0.015 mol/l de citrato de trisodio y un pH 7.0. La abreviatura de estas condiciones hace referencia a la fuerza del SSC. esto es. 2 x SSC. 0,1 x SSC. La astringencia final de la reacción de hibridación está controlada por la formamida y por la concentración salina del cóctel de hibridación, por la temperatura de la reacción de hibridación y por la temperatura y la concentración salina de los pasos de lavado.
Detección de híbridos Se ha aplicado una amplia variedad de técnicas para la recogida y el análisis de híbridos específicos, que se verán brevemente más adelante bajo el titulo de Formatos de ensayos de hibridación. Una vez que se han recogido los híbridos específicos, los métodos de detección van unidos, obviamente, a los métodos de mareaje. Se han utilizado marcas radiactivas, como el lósloro-32 (*P), el yodo 125 ("'-I), el azufre-35 ( S), el carbono-14 ( C) y el tritio ( H). que se detectan por medio de la autorradiografía o por el contador de centelleo en muchas aplicaciones de investigación y en las primeras aplicaciones clínicas. La actividad especifica de la marca influye directamente en la sensibilidad de la detección. Se han buscado, para las aplicaciones clínicas, alternativas al mareaje radioisotópico. Las sondas radiactivas tienen una vida media, relativamente corta, haciendo que uno de los reactivos claves en el ensayo de hibridación sea inestable. También han contribuido a la necesidad de encontrar métodos no radiactivos el peligro que corre el personal del laboratorio y los costes de la eliminación de los desechos radiactivos. Las sondas marcadas no isotópicamente son reactivos estables, facilitan enormemente la producción industrial y la estandarización, lo que es crucial para la capacidad de reproducción de los ensayos. iS
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Una ventaja de la detección indirecta de las marcas de afinidad es que para la misma marca se pueden utilizar varios métodos de detección (Fig. 59-8). Por ejemplo, la biotina puede ser detectada con avidina unida a una enzima con color subsiguiente o con una detección quimioluminiscente o con avidina con marca fluorescente. Para todos los métodos no radiactivos, la parte de detección del ensayo es crucial para obtener una sensibilidad óptima. Una reacción de hibridación eficaz se puede frustrar por reactivos de detección con poco fondo y una generación de señal subóptima Para conseguir resultados óptimos, lo más importante es elegir los marcadores de enzimas (peroxidasa frente a fosfatasa alcalina), el sustrato de la enzima (colorimétnco trente a quimioluminiscente) e incluso la procedencia de los reactivos.
Formatos de ensayos de hibridación Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de ensayos de hibridación, cada uno de ellos diseñado para resolver los problemas metodológicos del ensayo de hibridación: las condiciones que permiten el emparejamiento de las bases complementarias específicas, un método para detectar híbridos y una interpretación del resultado. Cada método tiene su punto débil y su punto fuerte, y la selección del formato la dicta el marco clínico y la pre-
]
El mareaje no isotópico y los métodos de detección de los ácidos nucleicos tienen muchas similitudes con los ensayos mmunoquimicos desarrollados por la detección de proteínas no isotópicas. En algunas aplicaciones, los ácidos nucleicos son enlazados directamente a un compuesto emisor de señal, normalmente a un fluorocromo. aunque ocasionalmente a una enzima. Esta situación es igual para los inmunoensayos, en los cuales es marcado el anticuerpo primario. Los ácidos nucleicos son detectados, más cornentemente, en un ensayo de múltiples pasos, cuyo concepto es similar a la reacción indi-
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Suslralo (colorìmclrico o quimioluminisccntc)
Figura 59-8. Sistemas de delección de sondas de marcaje por afimdad. (Por cortesia de Unger ER. Piper MA: Nucleic acid biochemistry and diagnostic applications En Burlis CA. Ashwood ER led.]: Tietz Textbook ol Clinical Chemistry. 2" ed. Filadelfia. WB Saunders Company, 1994 )
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
gunla diagnóstica específica. No hay un ensayo perfecto, y a continuación se describen, brevemente, varios de los formatos básicos, con sus puntos fuertes y sus puntos débiles especiales. Cada ensayo de hibridación requiere controles positivos y negativos para su verificación. Un control de muestras positivo es aquel que se sabe que contiene secuencias complementarias de la sonda. Se utiliza para establecer que la preparación de la muestra es la adecuada para liberar la diana para el ensayo de hibridación, y para garantizar que la sonda se hibridará con la diana especifica bajo las condiciones del ensayo. El control de muestras también se puede utilizar para monítorizar la susceptibilidad del ensayo, si el control positivo se elige cerca de los límites de detección más bajos. Un control de muestras negativo (es decir, del que se sabe que no contiene secuencias complementarias de la sonda) se utiliza para monítorizar la especificidad de las interacciones de la sonda diana. Los controles de la sonda incluyen secuencias de vectores o sondas marcadas no relacionadas, hibridadas y detectadas bajo las mismas condiciones del ensayo. Estos últimos controles permiten la monitorización del fondo de la señal generada por la localización de la sonda a través de interacciones no hibridadas, como carga o atrapamiento. En la práctica clínica se pueden emplear controles adicionales para monítorizar cada paso del ensayo de hibridación.
Hibridación de fase líquida o solución En los ensayos de hibridación líquida tanto la muestra como la sonda actúan reciprocamente en solución, lo que maximiza la cinética de la reacción. Los ácidos nucleicos de la muestra se purifican, generalmente, de proteínas contaminadoras y de lípidos, que podrían interferir en la obtención de híbridos al final del ensayo, aunque el ensayo tolera alguna degradación de la muestra. La muestra se desnaturaliza y se trocea al azar antes de añadirte la sonda de una hebra que no tiene capacidad de autohibridación. Se puede detectar la hibridación por la unión específica de los híbridos a una matriz como la hidroxiapatita. que sólo une estructuras dúplex. Una vez que los híbridos están unidos, la sonda no hibridada se puede eliminar eficientemente lavándola. La detección de la marca en la sonda ya unida permite la cuantificación de la reacción de hibridación. En una variante de esta propuesta, un ensayo comercial (captura de híbridos) utiliza un anticuerpo específico de ADN y ARN híbridos para unir específicamente estructuras dúplex formadas de la diana de ADN y la sonda de ARN, Un análisis alternativo incluye la digestión de la mezcla de reacción de hibridación con la nucleasa S1, que es una enzima que sólo actúa en el ácido nucleico monohebra. Las estructuras dúplex que son resistentes a la digestión pueden ser precipitadas por un tratamiento de ácido tricloroacético. En el ensayo de prolección por la hibridación, la marca de la sonda está protegida de la degradación química solamente cuando la sonda está insertada en una estructura dúplex. En la actualidad se utilizan muchas otras variaciones del ensayo de hibridación de fase de solución. Lo que hace que este ensayo se adapte a las aplicaciones clínicas es la óptima cinética, la tolerancia a los pasos de purificación abreviados y alguna degradación de la muestra. Se puede conseguir la cuantificación del producto de la reacción, dependiendo del sistema de detección. El lormato de lase de solución no permite la identificación del tamaño del producto hibridado. Las reacciones positivas bajas son difíciles de interpretar, ya que los bajos niveles de las dianas específicas y los altos niveles de las dianas de reacción cruzada débiles darán resultados similares. La hibndación en lase de solución se puede adaptar al formato de 96 pocilios con un lector tipo del empleado en un ensayo mmunosorbente unido a enzima (ELISA), lo que permite anticipar un aumento de la automatización del ensayo.
Hibridación de soporte sólido Las variaciones de los ensayos de hibridación de soporte sólido incluyen la hibridación en puntos o por transferencia, la hibridación Southern y Northern y la hibridación m situ. En estos ensayos la hibridación se produce en un ambiente bifásico, una fase sólida (generalmente la muestra) y una fase líquida (generalmente la sonda). La cinética de la hibridación de un ácido nucleico unido a un soporte sólido se retrasa enormemente y limita la extensión de la
reacción de hibridación. Estas desventajas se compensan, frecuentemente, por la conveniencia de disponer de un medio sólido que nos lleve a través de los múltiples pasos del ensayo. Hibridación de punto o transferencia. En este formato de ensayo, múltiples muestras están inmovilizadas en una repetición geométrica sobre una membrana de nailon o de nitrocelulosa. El nombre del ensayo deriva de la forma de cada muestra sobre la membrana. Cuando se aplican las muestras a mano, la forma es más fortuita (mancha). Con la utilización de instrumentos de vacío, disponibles comercialmente. las muestras se aplican utilizando la succión, la forma de la muestra es más regular, redonda (punto) o alargada (muesca). La matriz sólida permite que múltiples muestras sean procesadas simultáneamente a través de todos los pasos del ensayo. El hecho de que estén expuestos todos los controles y muestras a exactamente los mismos reactivos y condiciones aumenta la estandarización del ensayo. La prolongación de la preparación de la muestra varia desde la purificación completa de los ácidos nucleicos, antes de su aplicación al filtro, a la aplicación directa de una muestra no purificada. El ensayo tolera algún grado de degradación de la muestra. Los ácidos nucleicos purificados tienen la ventala de que están muy dispuestos a la interacción con la sonda y no tienen apenas problemas con el fondo. Sin embargo, la purificación individual de la prueba consume mucho tiempo y el trabajo es intensivo. Los métodos que utilizan la aplicación directa de la muestra no purificada llevan el experimento a través de un procedimiento abreviado de purificación que incluye, normalmente, la lisis y la desnaturalización, la digestión de la proteina y el lavado con detergente. Las ventajas de este método son que se aplica a pequeñas cantidades de material de partida y reduce el tiempo de preparación de muestras. Sin embargo, la susceptibilidad final de la reacción es más baja y el fondo de las interacciones no especificas de las sondas puede hacer que el ensayo no sea fiable. La interpretación de los resultados de un ensayo de hibridación mancha/punto es relativamente directa. Si ha tenido lugar la hibridación se genera una señal en el punto especifico. Los resultados se pueden cuantificar. dependiendo de la marca utilizada para generar las señales, aunque normalmente se da una interpretación simple de si o no (es decir, la muestra tiene más o menos señal que las muestras contiguas y reconocen controles positivos y negativos). Suelen provocar errores de interpretación las señales débiles, que pueden ser el resultado de una cantidad muy pequeña de dianas específicas o de una gran cantidad de dianas de reacción cruzada débiles. No hay información disponible sobre el tamaño de los fragmentos que se hibridan. Se conoce como ensayo inverso de mancha/lineas de puntos a una variación interesante del ensayo de mancha/punto. En este formato, que se aplica en situaciones en las que una muestra tiene que ser analizada con muchas sondas diferentes y donde la muestra puede estar limitada, es la muestra la que porta la marca. Las sondas no marcadas o las dianas son fijadas a un soporte sólido en repeticiones lineales o de matriz. Se identifican e interpretan las áreas de formación de híbridos específicos igual que en el ensayo estándar de mancha punto. Este lormato de ensayo es una forma útil para identificar el producto de un ensayo de amplificación (vide intra y Cap. 60), como en HLA (Bugawan, 1994) o para tipificar el papilomavitus humano (Gravitt, 1998), Hibridaciones Southern y Northern. Ambas hibridizaciones. Southern y Northern, combinan la separación por electroforesis del ácido nucleico a analizar, con su transferencia a un soporte sólido y la hibridación subsiguiente. Por tanto, este ensayo no sólo da información sobre la presencia de hibridación, sino que permite determinar el peso molecular de las especies hibridadas. Se dio el nombre de hibridación de mancha Southern o manchas de Southern al procedimiento original en honor a su inventor, E M. Southern (Southern. 1975). En este ensayo, el ácido nucleico a analizar es ADN, A la técnica que utiliza ARN como ácido nucleico a analizar se le dio, por analogía, el nombre de manchas Northern. (Y yendo aún más lejos con la analogía, las manchas western son un proceso similar en el que las proteínas están expuestas a la electroforesis y a la transferencia: a una mancha south-western se la ha descrito como una técnica que mancha y separa al
CAPÍTULO 59
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DIAGNÓSTICOS MOLECULARES: TÉCNICAS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
ADN seguida por la incubación con soluciones de proteínas, lo que permite la evaluación de las proteínas específicas de unión a ADN.) En estas dos últimas técnicas, la preparación de muestras lleva mucho tiempo y el trabajo es intensivo. El ensayo no tolera la degradación del ácido nucleico de la muestra y requiere una cantidad relativamente grande de material de partida. En la hibridación Southern, el ADN debe ser purificado con cortes mínimos. Esto se debe a que el tamaño de los fragmentos se consigue a través de la digestión con una o más enzimas de restricción. La degradación y los cortes presentan roturas aleatorias en la muestra, lo que reduce la cantidad disponible para ser cortada específicamente en las secuencias de reconocimiento adecuadas. Las impurezas de la muestra pueden interferir con la actividad y la susceptibilidad de la secuencia de la enzima de restricción. Las muestras digeridas parcial o inadecuadamente pueden producir tamaños de bandas espúreos o dar como resultado una concentración reducida de la banda especifica que ya no será detectada durante la hibridación. El material de partida para las hibndizaciones Northern es el ARN. y hay que tener un cuidado excesivo para evitar la degradación durante la recogida y preparación de las muestras, debido a la naturaleza ubicua de las RNasas. El ARN esta compuesto de fragmentos de tamaños determinados por la transcripción y el procesamiento del ARN mensajero y ribosómico. No se digiere antes de la electroforesis, pero se separa bajo condiciones desnaturalizantes para eliminar la estructura secundaria. Los fragmentos separados por tamaño en el gel de agarosa son luego transferidos a un filtro de nailon o de nitrocelulosa. La transferencia se produce de forma pasiva por la acción capilar, como se diseñó originalmente. En la mayoría de las aplicaciones actuales se utiliza el vacio o la presión para acelerar la transferencia. Después de ser transferidos, los ácidos nucleicos están inmovilizados por horneado o por uniones cruzadas generadas por luz UV y toda la membrana hibridada con sondas marcadas. A la hibridación le sigue la detección por autorradiografia, colorimetria o quimioluminiscencia de bandas que contienen secuencias complementarias de la sonda. La interpretación incluye la detección de las especies hibndadas y la determinación del peso molecular de la molécula. Estos ensayos, técnicamente muy exigentes, necesitan varios días para ser ejecutados, aunque pueden ser necesarios para aplicaciones clínicas en las que no se pueda obtener la información por medio de ningún otro formato. La presencia de bandas de pesos moleculares diferentes de muestras normales o de linea germinal (no alteradas por el desarrollo experimental) puede indicar un cambio en el material genético. Hibridación in sito. La hibridación in situ es, simplemente, la detección de información genética en un contexto morfológico. Este tipo especializado de ensayo de soporte sólido incluye el tomar tejidos morfológicamente intactos, células o cromosomas adheridos a un portaobjetos de cristal de microscopio a través del proceso de hibridación. Se han aplicado métodos de detección autorradiográficos, colonmétricos y lluorescentes. La evaluación del producto final es muy similar a la evaluación de inmunoquímica, y es necesario tener experiencia en histopalología. La fuerza de este método recae en la unión de la evaluación morfológica microscópica con la detección de la hibridación. Este método tiene también aplicaciones en los análisis citogenéticos de cromosomas metalásicos esparcidos o de núcleos en mterfaz. La detección, en este contexto, se hace normalmente por fluorescencia, y a la técnica se la denomina hibridación in situ fluorescente (HISF). Se puede conseguir, rápidamente, la detección de aberraciones numéricas o la translocación de cromosomas utilizando sondas para dianas especificas. La HISF evita algunas de las dificultades de la citogenética convencional y puede tener una mayor susceptibilidad hacia algunas dianas. Aunque la HISF no puede reemplazar completamente a los canotipos, puede complementar y reducir la necesidad de la frecuencia de los análisis citogenéticos. Las nuevas variaciones de la HISF (Luke. 1998) explotan las posibilidades de automatización (HISF-rápida). y difusión de la información que se puede obtener de un solo ensayo. La FICTION (inmunofenotipado fluorescente y la citogenética de interfaz como una herramienta para la investigación de neoplasmas) combina el inmunofenotipado con la HISF; la HISF de fibra hace posible el detectar y hacer un mapa de los puntos de rotura cromosómicos simultáneamente. La HISF se explica con más detalle en el Capitulo 62. La hibridación in situ puede ser tediosa y de trabajo intensivo. Las recientes mejoras han dado como
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resultado el procesamiento automatizado de portaobjetos durante el ensayo y son muy prometedoras en cuanto a que esta técnica se adopte más ampliamente. Tecnología de los chips de ADN. Se ha desarrollado una nueva variación de hibridación de soporte sólido (Pease. 1994) Utilizando chips de alcona miniaturizados y síntesis de fase sólida generada por luz. se han construido repeticiones densamente empaquetadas de oligonucleólidos unidos. Los chips, que contienen todas las combinaciones de oligonucleótidos relativamente cortos (p. ej.. 65.536 combinaciones para un octámero). se pueden hibridizar a una muestra marcada por fluorescencia (un formato de ensayo inverso de hibridación de puntos). La fluorescencia localizada índica la presencia de una secuencia complementaria, y por el alineamiento de secuencias superpuestas se puede ejecutar un análisis rápido de secuencias. Hay muchas variaciones sobre este tema, incluidos los portaobjetos de cristal (microrrepeticiones) o los filtros (repeticiones de filtros de alta densidad) con las dianas de ADNc inmovilizadas. Este tema se expone con más detalle en el Capitulo 61.
Métodos de amplificación Es prácticamente imposible leer cualquier revista médica sin encontrarse con. al menos, una aplicación de la tecnología de la reacción en cadena de la pohmerasa (PCR). La PCR ha cambiado para siempre el ámbito de los problemas de investigación, que pueden ser solucionados eliminando prácticamente el problema del tamaño limitado de las muestras. Se ha reconocido la importancia y elegancia de este concepto concediéndole el Premio Nobel de Quimica a su inventor. Kary Mullís, menos de 10 años después de la publicación de la primera aplicación práctica de la PCR (Saiki. 1985). Ahora hay otras metodologías que han dado como resultado la multiplicación de las dianas, las sondas y las señales. Todas ellas se pueden agrupar bajo el epígrafe de tecnologías de amplificación y se exponen en el Capitulo 60
Ensayos basados en los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Los ensayos de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (PLFR) son conocidos como los ensayos que utilizan la propiedad de las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción para demostrar las variaciones de los polimorfismos en la secuencia de ADN de dos muestras. El ADN genómico o el ADN producido por la PCR. es digerido por una enzima de restricción y los fragmentos son analizados por la electroforesis en gel. seguido de la visualizaron de la banda o del análisis de manchas Southern con una sonda específica de sitio. Los cambios en la secuencia del ADN pueden dar como resultado la alteración de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Esta alteración puede introducir sitios de enzimas de restricción adicionales, eliminar sitios de restricción o insertar o eliminar secuencias entre los sitios de restricción. Estos cambios se verán reflejados en el cambio del tamaño de la banda visualizada en un gel o hibndizando a la sonda específica de sitio. No todos los cambios, por supuesto, se verán reflejados en una secuencia de reconocimiento alterada, por eso el tamaño de la banda inalterado tiene que ser interpretado en el contexto de los marcadores y de las frecuencias conocidas de los polimorfismos en la región En algunos ensayos, en cada muestra se produce la digestión de una o varias enzimas de restricción antes del análisis de manchas Southern. Esta propuesta es muy útil para los estudios de familia, como se ve en la Figura 59-9. Se pueden utilizar los polimorfismos en el ADN estrechamente enlazados a un gen de la enfermedad para predecir la herencia del alelo alterado. Muchos marcadores son específicos de locus y existen mapas cromosómicos de estos marcadores. Para establecer marcadores alélicos. estas regiones que tienen el máximo de vanaciones y el máximo de polimorfismos son las de más fácil utilización. Las áreas de secuencias repetitivas dentro del cromosoma, conocidas como números variables de repeticiones en tándem, son algunos de los marcadores más polimórficos, y pueden dar lugar a un patrón complejo de bandas o 'huella genética". En los estudios de familias con enfermedades hereditanas (genética clásica) y para identificar regiones del genoma
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÌA MOLECULAR genética molecular. Se denomina clonación posicional y es un proceso que utiliza el análisis de enlaces PLFR de familias que portan y expresan la enfermedad, para localizar marcadores polimórficos que se acercan cada vez más y más al gen de la enfermedad, hasta que éste es localizado al fin. Los marcadores polimórficos, fuertemente unidos, que tienden a segregarse con la enfermedad, se pueden utilizar en los análisis diagnósticos, clínicamente útiles, antes incluso de que el gen esté completamente caracterizado y de que la proteína producto esté finalmente idenlificada. En esta línea, primero se desarrollan y utilizan los análisis moleculares de diagnóstico, que luego se sustituyen por métodos más simples y económicamente más efectivos, dirigidos al nivel del producto génico, cuando se ha entendido por completo el resultado de la mutación.
Más allá del diagnóstico
Figura 59-9. Ejemplo del análisis de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (PLFR). (M = madre; P = padre; H = hijo.) (Por cortesía y adaptada de Piper MA, Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer for Pathologists. Chicago, ASCP Press, 1989.)
Los análisis moleculares tienen el potencial para desarrollar al máximo el papel del laboratorio en áreas que van más allá del diagnóstico de la enfermedad. El análisis molecular de las mutaciones somáticas del cáncer tiene la posibilidad de proporcionar información sobre el pronóstico, de aconsejar la elección de una terapia óptima y de monítorizar la respuesta a la terapia. Ahora se están examinando en varios tipos de malignidades las implicaciones del uso de marcadores moleculares para detectar células neoplásicas, en ausencia de evidencia clínica o morfológica de la enfermedad, conocida como enfermedad mínima residual (véase Cap. 65). Esta propuesta de utilizar marcadores moleculares para detectar la enfermedad puede anticipar las consecuencias de los métodos secundarios de la prevención del cáncer (selección) y la valoración de suficiencia de la resección quirúrgica (evaluación de márgenes). La terapia génica para las enfermedades genéticas hereditarias, así como para el cáncer, se está llevando a la práctica y está basada en el conocimiento detallado de la enfermedad subyacente. La monitorización de estos pacientes para conocer la presencia y la actividad del gen terapéutico introducido añadirá otro aspecto a la evaluación de la enfermedad del laboratorio.
BIBLIOGRAFIA alteradas durante la neoplasia (mutaciones somáticas), el PLFR es muy útil para establecer el vínculo de una región del genoma con la enfermedad.
RELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LA EVALUACIÓN EN LABORATORIO Los capítulos siguientes describen las aplicaciones actuales de los diagnósticos moleculares. Está claro que esta nueva tecnología ha ¡mpactado en todas la áreas de diagnósticos del laboratorio. Los métodos moleculares tienen también el potencial de redefinir la evaluación de la enfermedad por el laboratorio, para incluir resultados más allá del diagnóstico de la enfermedad.
Diagnóstico molecular Las ventajas del enfoque molecular para los diagnósticos se expondrán detallando cada aspecto de las aplicaciones actuales. Sin embargo, es muy importante recordar que estos nuevos análisis moleculares probablemente no sustituirán a los análisis tradicionales en un futuro inmediato. El coste y la complejidad de esta tecnología tienden a restringir sus primeras aplicaciones para situaciones diagnósticas especiales, donde la información obtenida no se podía proporcionar por ningún otro método. El aumento de la automatización y los métodos diseñados comercialmente rebajarán los costes, reducirán el nivel de los técnicos especializados que se precisan para realizar los análisis y el resultado será la integración de la tecnología molecular en la línea central de los análisis del laboratorio. En el centro de la explosión de información actual de la ciencia médica está la detección de las mutaciones y su asociación con la enfermedad y en muchas de las aplicaciones de los diagnósticos moleculares. La capacidad de localizar un gen responsable de una enfermedad sin conocer la proteína producto es una de las consecuencias más importantes de la revolución de la
Alberts B, Bray D, Lewis J. et al: Molecular Biology ol the Cell, 3rd ed New York Garland Publishing. 1994. Bugawan TL. Apple R. Eriich H: A method lor typing polymorphism as the HLA-A locus using PCR amplification and immobilized oligonucleotide probes. Tissue Antigens 1994:44:137-147. Gravitt PE, Peyton CL. Apple RJ. Wheeler CM: Genotyping ol 27 human papilomavirus types by using LI consensus PCR products by a single-hybridization, reverse line blot detection method. J Clin Microbiol 1998; 36:3020-3027. Hanawalt PC: Transcriplion-coupled repair and human disease Science 1994; 266:1957-1958. Kan YW: Development ol DNA analyses for human diseases: Sickle cell anemia and thalassemia as paradigm. JAMA 1992; 267:1532-1536. Langer PR. Waldrop AA. Ward DC: Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A1981; 78:6633-6637. Liechtl-Gallati S. Koenig M. Kunkel LM. et al: Molecular deletion patterns in Duchenne and Becker type muscular dystrophy Hum Genel 1989: 81:343-348. Luke S, Shepelsky M: FISH: Recent advances and diagnostic aspects Cell Vis 1998; 5:49-53. Modrich P: Mismatch repair, genetic stability, and cancer. Science 1994; 266:1959-1960. Papavassiliou AG: Transcription laclors. N Engl J Med 1995: 332:45-47. Pease AC. Solas D, Sullivan EJ, et al: Light-generated oligonucleotide arrays lor rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci U S A1994; 91:5022-5026. Radman M, Wagner R: The high fidelity of DNA duplication. Sci Am 1988; 259:40-46. Rosenthal N: Regulation ol gene expression. N Engl J Med 1994; 331:931-933. Saiki RK. Scharf S, Faloona F, et al: Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for the diagnosis of sickle-cell anemia. Science 1985:230:1350-1354. Sancar A: Mechanisms of DNA excision repair. Science 1994; 266:1954-1956. Sharp PA: RNA splicing and genes. JAMA 1988; 260:3035-3041. Southern EM: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975; 98:503-517. Sutherland GR, Richards Rl: Dynamic mutations. Sci Am 1994; 82:157-163. Virshup DM: DNA replication. Curr Opm Cell Biol 1990; 2:453-460. Weatherall DJ: Molecular pathology ol single gene disorders. J Clin Pathol 1987; 40:959-970. Weeda G. de Boer J, Donker I, el al: Molecular basis of DNA repair mechanisms and syndromes. Rec Results Cancer Res 1998:154:147-155. Yu Z, Chen J, Ford BN. et al: Human DNA repair systems: An overview. Environ Mol Mutagen 1999; 33:3-20.
C A P Í T U L O
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Reacción en cadena de la polimerasa y otras tecnologías de amp ificación • James C. Zimring, M.D., Ph.D. • Frederick S. Nolte, Ph.D. MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE LAS DIANAS
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Reacción en cadena de la polimerasa Amplificación mediada por transcripción/amplificación del ácido nucleico basada en secuencias Amplificación del desplazamiento de la hebra MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SONDA
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES
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ADN ramificado Ensayo de captura de híbridos
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CONCLUSIONES
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BIBLIOGRAFÍA
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Reacción en cadena de la ligasa Tecnología invasora/enzima de rotura
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por Mullís y otros colaboradores (Saiki. 1988) tue un hito en la biotecnología y anunció el comienzo de los diagnósticos moleculares. Aunque la PCR es la estrategia de amplificación del ácido nucleico más ampliamente utilizada, se han desarrollado otras estrategias, y algunas de ellas tienen propiedades y ventajas únicas en su género. Estas estrategias están basadas en la amplificación de las dianas, de las sondas y de las señales. En las secciones siguientes se exponen los ejemplos de cada una de ellas. Estas técnicas tienen una sensibilidad sin igual en la medicina de laboratorio y han originado nuevas oportunidades para que el laboratorio clínico sea efectivo en el tratamiento de los pacientes, en las áreas de las enfermedades infecciosas, en el cáncer y en los desórdenes genéticos.
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE LAS DIANAS Todos los sistemas de amplificación de las dianas comparten ciertas características fundamentales. Son procesos mediados por enzimas en los que una sola enzima o múltiples enzimas sintetizan copias de un ácido nucleico diana. En todas las técnicas, los productos de la amplificación están especificados por 2 oligonucleótidos cebadores que se unen a las secuencias complementarias en las hebras opuestas de las dianas de doble hebra. Todo el resultado de la producción de millones a billones de copias de la secuencia a amplificar es cuestión de horas y, en cada caso, los productos de la amplificación pueden servir como moldes para las rondas de amplificación subsiguientes Debido a esto, todas estas técnicas son sensibles a la contaminación con productos moleculares de anteriores amplificaciones y pueden originar reacciones de falsos positivos. Sin embargo, se han desarrollado diseños de laboratorio especiales, prácticas y flujos de trabajo para reducir, a niveles aceptables, la posibilidad de reacciones de falsos positivos.
Reacción en cadena de la polimerasa La PCR es una sencilla reacción química, in vitro. que permite la síntesis de cantidades esencialmente ilimitadas de una secuencia de un ácido nucleico diana. Esto se hace a través de la acción de una polimerasa de ADN que, bajo las condiciones adecuadas, puede copiar una hebra de ADN. En su forma más simple, la PCR consiste en ADN diana, un exceso molar de 2 oligonucleótidos cebadores, una polimerasa de ADN termoestable, una mezcla
equimolar de desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP. dCTP. dGTP y dTTP). de MgCI , KCI y un tampón de Tns-HCI. Los dos cebadores flanquean a la secuencia que va a ser amplificada, suelen ser de menos de 100 bases y son complementarios a las hebras opuestas de la diana. Para iniciar una PCR se calienta la mezcla de la reacción, para separar las dos hebras del ADN diana, luego se enfría para permitir a los cebadores que se anillen al ADN diana de forma secuencia-especifica. Después, la ADN polimerasa inicia la extensión de cada cebador desde sus extremos 3 en direcciones opuestas. Los productos de la extensión de los cebadores se disocian de la diana de ADN mediante calor. Cada producto de la extensión, lo mismo que la diana original, puede servir como un molde para las rondas subsiguientes de anillamienlo y extensión del cebador. Un ciclo de PCR consta de tres etapas: desnaturalización, anillamiento y extensión. Los productos de la PCR se duplican, teóricamente, después de cada ciclo. Por eso, después de n ciclos de PCR la secuencia de la diana se puede amplificar 2" veces. Todo el procedimiento se lleva a cabo en un termociclador programable que controla con exactitud la temperatura a la que se producen las etapas, la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reacción a las diferentes temperaturas y el número de ciclos. Lo ideal es que después de 20 ciclos de PCR. se consiga una amplificación del orden de millones de veces y después de 30 ciclos, una del orden de billones de veces. En la práctica, la amplificación puede que no sea completamente eficiente, debido a errores en la optimización de las condiciones de la reacción o a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa. En estos casos, la amplificación total está mejor descrita por la expresión (1 + e)", donde e equivale a la eficiencia de la amplificación (0
PCR transcriptasa inversa La PCR, como se la describió originalmente, tue una técnica para la amplificación del ADN. La PCR transcriptasa inversa (PCR-TI) se desarrolló para amplificar las dianas de ARN. En este proceso, primero se produce el ADN complementario (ADNc). a partir de dianas de ARN. por transcripción inversa, y más tarde se amplifica el ADNc por PCR. De acuerdo a la descripción original, la PCR-TI emplea dos enzimas: una TI termolábil, como la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviario (VMA-TI). y una ADN polimerasa termoestable. La síntesis del ADNc debe producirse a temperaturas más bajas, debido a los requisitos de temperatura de la enzima termolábil. Esto presentaba problemas en cuanto al anillamiento de cebadores no específicos
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
y a la extensión ineficaz del cebador a causa de la formación de estructuras secundarias de ARN. Estos problemas se han superado con creces por el desarrollo de una ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus thermophilus. que bajo las condiciones adecuadas puede funcionar eficientemente como una TI y como una ADN polimerasa (Myers. 1991). Las PCR-TI que utilizan esta enzima son más eficientes y específicas que los protocolos anteriores que utilizan enzimas de TI termolábil convencionales. Se pueden obtener equipos comerciales (Roche) que emplean PCR-TI de una sola enzima para la detección del ARN del virus de la hepatitis C (VHC) y para determinar la cantidad del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-11 y de ARN-VHC en muestras clínicas.
PCR anidada La PCR anidada se desarrolló para aumentar tanto la sensibilidad como la especificidad de la PCR (Haqqi, 1988). Emplea dos pares de cebadores de amplificación y dos rondas de PCR. Por lo general se utiliza un par de cebadores en la primera ronda de PCR de 15 a 30 ciclos. Los productos de la primera ronda de amplificación están sujetos, después, a una segunda ronda de amplificación utilizando la segunda serie de cebadores, que anillan en una secuencia interna a la secuencia amplilicada por la primera serie de cebadores. El aumento de la sensibilidad proviene del alto número total de ciclos y el aumento de la especificidad proviene del anillamiento de la segunda serie de cebadores a las secuencias que sólo se hallan en los productos de la primera ronda. El alto índice de contaminación, que puede darse durante la transferencia de los productos de la primera ronda al segundo tubo para la segunda ronda de amplificación, es la mayor desventaja de la PCR anidada. Esto se puede evitar bien por la separación física de las muestras de la primera y de la segunda ronda, con una lámina de cera o de aceite, o bien diseñando protocolos de amplificación de un solo tubo. En la práctica, raramente se requiere para las aplicaciones clínicas el aumento de la sensibilidad que proporcionan los protocolos de la PCR anidada, y generalmente se confirma la identidad de un producto de amplificación, hibridándolo con una sonda de ácido nucleico.
El concepto básico detrás de la PCRc es la coamplifícación en el mismo tubo de reacción de dos moldes diferentes de longitud igual o similar y con las mismas secuencias de unión de cebadores. La garantía de la eficiencia de la ampliación y la idéntica termodinámica se debe a que ambos moldes se amplifican con el mismo par de cebadores. Se debe conocer la cantidad de uno de los moldes y. después de la amplificación, se tienen que poder distinguir los productos de ambos. En la PCRc se han utilizado diferentes tipos de competidores, pero, en general, aquellos que actúan de una manera más eficiente son los que tienen un tamaño similar y una composición de bases igual a la diana. Para acometer el problema de la eficiencia variable de la TI, en las PCR-TI cuantitativas se deberían utilizar competidores de ARN. El rendimiento del producto de la PCR está descrito por la ecuación Y = /(1+e)\ donde Y es la cantidad de producto PCR, / es la cantidad de molde al principio de la reacción, e es la eficiencia de la reacción y n es el número de ciclos. Esta ecuación, para la PCRc, está escrita para ambas muestras y es como sigue: competidor. Y = 4(1 + e) ; y diana, V, = f,(1 + e) . Dado que e y n son iguales para el competidor y la diana, el índice relativo del producto Y,IY, depende directamente de su índice de concentración inicial l ll. y la función. V /y, = l U es lineal. n
n
c
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c
c
r
En teoría, para cuantificar una cantidad desconocida de dianas sin tener que utilizar una curva patrón es suficiente una sola concentración de competidor. Sin embargo, generalmente se ejecuta la PCRc que utiliza vanas concentraciones de competidores dentro de la esperada y amplia concentración de la diana, ya que el análisis de dos especies de moldes presentes en una muestra, en cantidades enormemente diferentes, puede ser difícil e impreciso en la práctica. Por otro lado, este método no proporciona resultados más exactos que la utilización de una sola concentración de competidores, según recientes estudios de diferentes métodos para la estandarización de la PCRc (Haberhausen, 1998). Los ensayos de la PCR cuantitativa para el citomegalovirus (CMV), el VIH-1 y el VHC (Sistemas Moleculares Roche), comercialmente disponibles, utilizan todos ellos una sola concentración de un competidor para determinar la concentración inicial de la diana.
PCR en tiempo real PCR múltiple En la PCR múltiple están incluidas en la misma mezcla de reacción dos series, o más, de cebadores, diseñados para la amplificación de diferentes dianas (Chamberiain, 1988). Con esta técnica se puede co-amplificar en un solo tubo más de una secuencia diana en una muestra clínica. Los cebadores que se utilizan en las reacciones múltiples deben ser cuidadosamente seleccionados para que tengan temperaturas de anillamiento similares y carezcan de complementariedad. Las PCR múltiples son más complicadas de desarrollar y tienen menos sensibilidad que las reacciones de la PCR donde se usa una sola pareja de cebadores, pero permiten detectar múltiples dianas en una sola muestra en una reacción.
PCR y PCR-TI cuantitativas Puede existir una relación lineal entre la cantidad de molde inicial y la cantidad de producto de la amplificación. Sin embargo, ya que la cantidad final de producto de la PCR depende de la amplificación exponencial de la cantidad inicial de molde, pequeñas diferencias en la eficiencia de la ampliación pueden conducir a enormes diferencias imposibles de predecir en el rendimiento del producto final (Clementi, 1993). Las diferencias tubo-a-tubo pueden depender de la preparación de la muestra y de los procedimientos de purificación del ácido nucleico, de la presencia de inhibidores y de la actuación del termociclador. Por estas razones, la simple cuantificación del producto amplificado y la utilización de curvas de referencia de patrones externos no proporcionan una cuantificación exacta del molde que estaba inicialmente presente en la muestra. Se han desarrollado varias estrategias basadas en la PCR para cuantificar exactamente las dianas de ADN y de ARN en muestras clínicas. Está generalmente aceptado que un método de PCR competitivo (PCRc) es el más fiable y robusto.
La PCR en tiempo real describe los métodos por los que la detección y la amplificación de la diana se producen simultáneamente en el mismo tubo. Estos métodos precisan de termocicladores especiales de precisión óptica, que son capaces de monítorizar la emisión de fluorescencia de los pocilios de muestras. El software del ordenador que da soporte a los termocicladores monitoriza los datos, durante toda la PCR, de cada ciclo y genera un campo de amplificación en cada reacción. En su formato más simple, el producto de la PCR es detectado al mismo tiempo que se produce, utilizando colorantes fluorescentes que se unen, preferentemente, al ADN de doble hebra. Uno de los colorantes que se utilizan en esta aplicación es el SYBR Green I (Morrison, 1998). La fluorescencia es relativamente baja en el estado de no ligado, pero cuando se une al ADN de doble hebra, la fluorescencia se amplifica enormemente. El colorante unirá a los productos específicos y no específicos de la PCR. Se puede incrementar la especificidad de la detección mediante un análisis de la curva de separación. El producto específico amplificado tendrá un pico de separación característico en su temperatura de separación prevista (TJ, mientras que los dímeros cebadores y otros productos no específicos tendrán una T,„ diferente o darán unos picos más amplios (Ririe, 1997). También se puede incrementar la especificidad de la PCR en tiempo real incluyendo sondas de hibridación en las mezclas de las reacciones. Estas sondas están marcadas con colorantes fluorescentes o con combinaciones de fluorescencia y un colorante aplacador. En el ensayo de la PCR de nucleasa 5' (Taqman). la actividad 5' a 3' exonucleasa de la ADN polimerasa Taq se utiliza para cortar una sonda de hibridación que es incapaz de alargarse durante la primera fase de alargamiento de la PCR (Holland, 1991). Este método utiliza sondas de hibridación fluorogénicas de mareaje dual. Un colorante fluorescente sirve como reportero y su espectro de emisión es aplacado por el segundo colorante fluorescente. La degradación de la sonda de hibridación por la nucleasa libera al colorante reportero, y el resultado es un aumento del pico de emisión de fluorescencia. El aumento de la
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
emisión fluorescente indica que se ha obtenido el producto de la PCR especifico y que la intensidad de la fluorescencia es relativa a la magnitud del producto (Heid, 1996) La base de otro método de PCR en tiempo real es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (TERF) (Lay, 1997). Este método necesita dos sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia especialmente diseñadas. Estas sondas de hibridación están diseñadas para hibridarse. una al lado de la otra, en la molécula del producto. El extremo 3' de una sonda está marcado con un colorante donador y el extremo 5' de la otra sonda está marcado con un colorante aceptador mediante un proceso denominado TERF. El colorante aceptar excitado emite luz en una longitud de onda más larga que el colorante donador no unido, y la intensidad de emisión de luz del colorante aceptador es proporcional a la magnitud del producto de la PCR. También se puede realizar la detección y la cuantificación en tiempo real del producto de la PCR, utilizando guías moleculares (Tyagi, 1998). Las guías moleculares son sondas de oligonucleótidos en forma de horquilla con un fluoróforo aplacado internamente cuya fluorescencia se restablece cuando se unen a un ácido nucleico diana. Están diseñadas de tal manera que la porción del asa de la molécula de la sonda es complementaria a la secuencia de la diana. El tallo se forma por el anillamiento de secuencias de brazos complementarias en los extremos de la sonda. Un colorante fluorescente está insertado en un extremo de un brazo y una molécula aplacadora está insertada en el extremo del otro brazo. El tallo mantiene en contacto al fluoróforo y al aplacador, de modo que no se produce ninguna emisión de luz. Cuando la sonda encuentra una molécula diana, forma un híbrido más largo y más estable que el tallo y sufre un cambio de conformación que obliga al tallo a abrirse, lo que hace que el fluoróforo y el aplacador se alejen el uno del otro, restableciéndose la fluorescencia. Los métodos de la PCR en tiempo real disminuyen el tiempo que se requiere para los ensayos de ácido nucleico, debido a que no existen etapas de procesamiento post-PCR. Además, y dado que la detección y la amplificación tienen lugar en el mismo tubo cerrado, estos métodos eliminan las manipulaciones postamplificación, que pueden dar lugar a la contaminación del laboratorio con el producto de amplificación. Más aún, los métodos de la PCR en tiempo real se prestan a las aplicaciones cuantitati-
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vas, porque el análisis se ejecuta en la fase temprana del registro de acumulación del producto.
Amplificación mediada por transcripción/ amplificación del ácido nucleico basada en secuencias La amplificación mediada por transcripción (AMT) y la amplificación del ácido nucleico basada en secuencias (AANBS) son dos técnicas isotérmicas de amplificación del ácido nucleico, aunque en la práctica son ligeramente distintas, cuyo concepto es exactamente igual, por lo que se describen juntas (Kwoh, 1989; Compton. 1991). Esencialmente, estas técnicas resumen el ciclo de vida del retrovirus ¡n vilro convirtiendo el ARN en ADN y utilizando luego el ADN como molde para la transcripción de copias múltiples de ARN. El proceso comienza cuando una diana de ARN. que en la mayoría de los casos existirá como una entidad de una sola hebra (Fig. 60-1, etapa 1), elimina la necesidad de desnaturalización termal del molde antes de la amplificación. Un cebador de ADN específico de secuencia se une a la diana de ARN (Fig. 60-1. etapa 2). Luego la transcriptasa inversa prolonga el cebador, creando un heterodúplex de ADN-ARN (Fig. 60-1. etapa 3). El extremo 5' del cebador especifico de secuencia no es complementario a la diana; más bien contiene al promotor de una T7 polimerasa bacteriólaga. La presencia de este promotor T7 en el extremo 5' del cebador da como resultado la síntesis de una hebra de ADN complementaria a la diana inicial de ARN que contiene al promotor T7 en su extremo 5'. En el caso de la AMT, la enzima transcriptasa inversa degrada el molde inicial de ARN al mismo tiempo que sintetiza su ADN complementario. En la AANBS. una enzima separada. ARNsa H. degrada al molde inicial de ARN. La ARNsa H rompe selectivamente el ARN, que forma estructuras heterodúplex con el ADN. pero no al ARN solo (Fig. 60-1, etapa 4). En ambos casos, el T7 que contiene ADN complementario es liberado de su ARN asociado, liberándolo para unirse a un segundo molde, que se une al extremo 3' de la molécula de ADN (Fig. 60-1, etapa 5). La ADN polimerasa se prolonga desde este segundo molde, dando como resultado la síntesis de una molécula de ADN de doble hebra que contiene un promotor T7 intacto. (Fig. 60-1, etapa 6).
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SECCIÓN Vil
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Esta molécula de ADN puede servir ahora como sustrato para la polimerasa T7. una enzima bacteriófaga que reconoce específicamente al promotor 17 y que sintetiza copias múltiples de ARN (Fig. 60-1, etapa 7). Cada una de estas moléculas de ARN, recientemente sintetizadas, es antisentido a la diana inicial, lo que les permite hibridar al segundo molde. Luego, la transcriptasa inversa, el segundo cebador, la ARNsa H y la ADN polimerasa utilizan esta molécula de ARN antisentido como un molde para sintetizar nuevos cebadores de ADN de doble hebra, quienes a su vez expresan más molde de ARN. Asi, de esta lorma se produce una amplificación exponencial. La AMT y la AANBS tienen algunas ventajas que las diferencian de otras técnicas de amplificación del ARN. Quizá la más significativa de estas ventajas es que no se necesita la desnaturalización inicial para que se produzca la amplificación. Por tanto, las secuencias de ADN de doble hebra no se separan nunca y por eso no son capaces de unirse a los cebadores en la reacción. La contaminación del ADN puede ser esencialmente problemática cuando se utilizan técnicas, como la PCR, para los ensayos de los transcritos del ARN de los genes retrovirales o de los genes eucariotas sin intrones. La AMT y la AANBS eliminan el problema de la contaminación del ADN dando una determinación falsamente elevada de ARN. Una segunda ventaja es que esta tecnología utiliza procesos isotérmicos, lo que hace innecesario el uso de termocicladores muy sofisticados. Combinando esta tecnología con guias moleculares o con otras sondas especificas de secuencia, que se pueden añadir directamente a la mezcla de la amplificación, se crea un sistema de tubo cerrado que ayuda a prevenir la contaminación cruzada con productos de amplificación en el laboratorio. La AMT y la AANBS se han aplicado con éxito en una amplia gama de sistemas de ensayo. Se han utilizado para detectar varios patógenos, incluyendo a virus, como el VIH, el VHC, el de la varicela, el virus zóster, los citomegalovirus (CMV), el rinovirus, el del sarampión y el papilomavirus. y a bacterias, como Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae y Campylobacter ¡ejuni. Además, esta tecnología ha cuantificado la carga viral del VIH y del VHC. También se han realizado análisis de genes, como la tipificación del HLA y la mutación del factor V de Leiden. En resumen, la AMT y la AANBS son técnicas de amplificación de ARN isotérmicas, con amplias aplicaciones y ventajas únicas sobre otros métodos de amplificación, en especial para la eliminación de los problemas de contaminación y, en particular, para aquellos relacionados con los genes sin intrones y los retrovirales. La combinación de estas técnicas con sondas fluorescentes permite la amplificación en tiempo real, en tubo cerrado y en una etapa, sin necesidad de termocicladores.
Amplificación del desplazamiento de la hebra La amplificación del desplazamiento de la hebra (ADH) es una técnica isotérmica de amplificación del molde que puede ser utilizada para detectar los rastros de ADN o de ARN en una secuencia específica. La ADH, según se la describió al principio, era un proceso de amplificación conceptualmente directo y con algunas limitaciones técnicas (Walker, 1992a. 1992b). Sin embargo, desde entonces ha evolucionado, y se ha convertido en una herramienta muy versátil que es técnicamente simple, aunque conceptualmente compleja. Para explicar la ADH. primero hay que hablar de las metodologías iniciales y después rastrear el desarrollo de la tecnología ADH actual. El proceso de la ADH. según se describió al principio, empieza con una digestión de restricción de la muestra de ADN para generar un fragmento de ADN que ha reconocido los extremos 3' y 5' (Fig. 60-2. paso 1). Este ADN digerido es separado luego (Fig. 60-2, paso 2) por la presencia de un cebador cuyo extremo 3' híbrida al extremo 5' del ADN diana (Fig. 60-2. paso 3). El resultado es un fragmento de ADN con un extremo saliente 5' a ambos extremos. Luego, la ADN polimerasa se alarga desde el cebador, para sellar el fragmento de una sola hebra de la diana, y se alarga desde el molde, para sellar el Iragmento de una sola hebra del cebador (Fig. 60-2, paso 4). Esta síntesis del ADN se produce en presencia de dCTP. dGTP, dTTP y de desoxiadenosina 5-[t/.-thio) trifosfato (dATP[u-S]). La incorporación de dATP (a-S) da como resultado una nueva hebra de ADN sintetizada (representada por lineas pespunteadas) que no puede servir como sustrato para cier-
tas endonucleasas de restricción, que precisan, en su sitio de reconocimiento, de un dATP auténtico. El cebador está diseñado para contener, justamente, este sitio de reconocimiento, en este caso un sitio de Hinc II. La digestión del sitio de restricción da como resultado una muesca en el cebador, pero deja al dATP[a-S] que contiene la hebra intacto (Fig. 60-2, paso 5). La muesca en el extremo 5' del cebador que contiene la hebra permite que la ADN polimerasa se alargue desde el sitio de la muesca en dirección 3 . desplazando al ADN, previamente sintetizado, según se va alargando (Fig. 60-2, paso 6) En esta etapa, se utiliza el fragmento Klenow mutado de la ADN polimerasa I, que está perdiendo su actividad 5' a 3' exonucleasa. para que la hebra desplazada continúe intacta. A la vez que el alargamiento desde el sitio de la muesca desplaza a la hebra existente, regenera un sitio de restricción intacto. La presencia de dATP[i/.-S] en posición 5 del sitio de restricción restablecido no inhibe las digestiones subsiguientes por Hinc II. Por tanto, se puede producir una segunda digestión que regenere una muesca, y de esta manera se produce un sustrato para un segundo desplazamiento de la ADN polimerasa. Este proceso continúa de forma cíclica y da como resultado la amplificación de la ADN diana. Para obtener una amplificación exponencial, se utilizan dos cebadores, uno para cada hebra. En este caso, el producto del desplazamiento del cebador 1 híbrida al cebador 2 y genera un nuevo ADN de doble hebra con hemifosforotioato, que puede generar sus propios productos de desplazamiento, los cuales a su vez rehibridan al cebador 1, dando lugar a una amplificación exponencial (Fig. 60-3). La metodología inicial de la ADH tiene bastantes limitaciones, incluyendo la necesidad de la digestión de restricción de la muestra, antes de la amplificación de la diana, y que el producto de la amplificación no contenga el mismo sitio de restricción que el se ha utilizado para la digestión del cebador. Para superar la primera de estas limitaciones, se desarrolló un sistema inteligente que utiliza cuatro cebadores para definir una región diana. Para hacer más fácil la explicación, se expondrá por etapas amplias, enfocándolo primero hacia una sola hebra. Claro que. en realidad, el resultado de este sistema es un proceso dinámico, con muchos procesos que suceden simultáneamente. En este procedimiento, el ADN no digerido es separado (Fig. 60-4, paso 1), y un cebador igual al que se describe en la Figura 60-2 híbrida a su región diana en el ADN (Fig. 60-4, paso 2). El extremo 3 del cebador que hibnda al molde es alargado, luego, a lo largo del molde por la ADN polimerasa, como se ha descrito previamente (Figura 60-4, paso 3). En este caso, y dado que el ADN no ha sido digerido el extremo 5' del cebador no es un extremo saliente, sino que está simplemente no hibndado. Por esta causa, el extremo 5 del cebador no está sellado por la ADN polimerasa. En este punto, el segundo cebador híbrida hacia arriba (como las aguas de un río) al primer cebador, lo que permite a la ADN polimerasa alargarse desde él en dirección 3 y desplazar a la hebra que contiene al primer cebador (Fig. 60-4, pasos 4 y 5). También están presentes otro par de cebadores, diseñados para ejecutar la misma tarea en la hebra opuesta. La amplificación exponencial se produce a lo largo de las líneas, como se muestra en la Figura 60-3. debido a que los productos de un par de cebadores sirven como molde para el segundo par de cebadores. En realidad, lo que ocurre en el tubo de ensayo es más complicado que todo esto, en él se forman vanos subproductos teóricos a lo largo del proceso; sin embargo, aquí se describen los productos mas importantes del sistema. Las aplicaciones clínicas de la ADS incluyen la detección directa en muestras clínicas de M. tuberculosis, C. trachomatis y N. gonorrhoeae. La ADH ha demostrado tener una susceptibilidad lo suficientemente alta como para delectar sólo de 10 a 50 copias de una molécula diana (Walker, 1992a). Utilizando una serie de cebadores diseñados para amplificar una secuencia repetitiva, con 10 copias en el genoma de M. tuberculosis, el ensayo es tan susceptible que es capaz de detectar de una a cinco copias del genoma de la bacteria. La ADH ha sido adaptada, recientemente, para cuantificar ARN, añadiéndole una etapa de transcriptasa inversa (TI-ADH). En este caso, un cebador híbrida a la ARN diana y una transcriptasa inversa sintetiza a un ADNc. Este ADNc sirve luego como molde para la incorporación del cebador y el desplazamiento de la hebra. Los productos del desplazamiento de esta hebra se alimentan después en el lugar de la amplificación descrito anteriormente. Se ha utilizado la TI-ADH para la determinación de la carga viral del VIH (Nycz. 1998).
CAPÍTULO 60
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
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Digestion de restricción Paso I
;• ^ Molde desnaturalizado 5-
Paso 2 p 3 S G-T-T-G-A-C '' La mayor ventaja de la ADH es que es un proceso isotérmico que, a dife3' rencia de la PCR. se puede ejecutar5a' una mise; ma|temperatura [ , \ (- después de la desnaturalización inicial de la sonda. aso4 r Este _ _ (proceso \ \
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5' Reacción en cadena de la ligasa Ì'
En una reacción en cadena 5' de la ligasa estándar (RCL), las sondas de 2oligonucleótido se hibridan una junto a la otra en cada una de las hebras de ADN desnaturalizadas de dianas, de forma que se produce una "muesca". Una ADN ligasa termoestable sella la "muesca" uniendo el extremo 3' de una ^ sonda al extremo 5' de la otra. Cada producto ligado, así como la diana origi^' nal, sin/en de molde enyrondas subsiguientes de desnaturalización, anillamiento y el ligado, y el resultado es una acumulación de productos exponencial +(Wu. 1989; Barany. 1991).
Una modificación de esta técnica, denominada espaciada RCL (G-RCL), y en que después del anillamiento de las sondas al difiere de la RCL estándar molde se forma un pequeño hueco. Este hueco es rellenado por una ADN polimerasa termoestable y la muesca que se produce es ligada por una ADN ligasa + (Birkenmeyer. 1991). Aunque la RCL es útil y se automatiza con facilidad, puede resultar difícil controlar la contaminación por los productos del 5' G-T-T-G-A -C ligado. Hay en el mercado un equipo de combinación G-RCL (Abbol) para Paso 7 r - - C-A-A-C-T-G 5' detectar en las muestras clínicas C. Irachomalis y N. gonorrhoeae. Figura 60-2. Representación por medio de un di agrama de la ADH de una hebra. (Por cortesía y adaptada de Walker GT, Little MC. Nadeau JG: Isothermal m vitro ampliMÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SONDA fication ol DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA. 1992b: 89:392-396.) (Véase texto para más detalles.) s
y
Tecnología invasora/enzima de rotura Los métodos de amplificación de sonda difieren de los métodos de amplificación de diana en que los productos de la amplificación contienen sólo una secuencia presente en las sondas iniciales Los ejemplos de métodos de amplificación de sonda, con potencial comercial, son la reacción en cadena de la ligasa (Wu, 1989), replicasa Qbeta (Kramer, 1989) y la tecnología de enzima de rotura/invasora (Lyamichev, 1999). Sin embargo, sólo se desarrolla comercialmente la tecnología enzima de rotura/invasora y la reacción en cadena de la ligasa.
Los ensayos invasores son un método de amplificación de la sonda que se basan en el reconocimiento específico y en la ruptura de estructuras de ADN particulares por miembros de la familia FEN-1 de las ADN polimerasas. Estas polimerasas romperán el extremo 5' saliente de una sola hebra de un dúplex de pares de bases en forma de racimo (Fig. 60-5). Esta actividad enzimática juega, probablemente, un papel esencial en la eliminación de estructuras de ácido nucleico complejas que afloran durante la replicación y la reparación del
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
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Figura 60-3. Representación por medio de un diagrama de la amplilicación exponencial de la ADH de las dos hebras. (Véase texto para más detal les.)
ADN. Dado que estas estructuras pueden darse en cualquier sitio del genoma replicante, la enzima reconoce la estructura molecular del sustrato sin tener en cuenta a la secuencia de los ácidos nucleicos que construyen el complejo de ADN (Lieber, 1996). Esta actividad enzimàtica ha demostrado ser una
herramienta muy útil en los análisis de ADN y es la base de los ensayos invasores. El ensayo invasor se basa en el hecho de que sintetizando sondas de ADN de una sola hebra superpuestas que pueden hibridar a una diana específica,
Figura 60-4. Representación mediante un diagrama de la reacción de la ADH de un cebador dual. (Véase texto para más detalles.)
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
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ductos de ruptura de una sola molécula diana. Por esle motivo, se puede efectuar el ensayo invasor bajo condiciones isotérmicas, eliminando la necesidad de utilizar cualquier termociclador. La lectura del ensayo de ruptura depende de la capacidad para cuantificar y detectar específicamente al producto de la ruptura. Se pueden utilizar varios métodos de detección. Third Wave Technologies ha desarrollado esta tecnología, que comercializa un sistema para generar una lectura lluorescente de productos de ruptura específicos. Se han desarrollado varios ensayos invasores, incluyendo la mutación del factor V Leiden, la cuantificación del ARNm de citocmas y la detección del Slaphylococcus aureus resistente a meticilina. de la hepatitis B, del CMV y de puntos de mutaciones en genes humanos, como el ApoE (Rossetti, 1997: Ryan. 1999).
Figura 60-5. Representación gráfica del complejo ternario reconocido mediante segmenlación y los productos de la digestión producidos por la actividad de segmentación.
creando la estructura reconocida por la ruptura, un miembro de la familia FEN-1 puede generar un producto de ruptura en respuesta a una diana especifica. Se diseñan dos cebadores que hibndan a la secuencia de la diana de manera superpuesta (Fig. 60-6). Bajo las condiciones adecuadas de anillamiento, el cebador 1 se puede fijar en la secuencia de la diana (Fig. 60-6. paso 1). El cebador 2 está diseñado de tal forma que híbrida 3' al cebador 1 con una región solapante entre el extremo 3 del cebador 2 y el extremo 5' del cebador 1. Bajo las condiciones adecuadas, el cebador 2 "invade" el sitio de unión del cebador 1, dando como resultado el desplazamiento equilibrado entre los cebadores (Fig. 60-6. paso 2). La ruptura sólo romperá los extremos salientes 5', por eso el extremo 5' del cebador 1 se rompe y se elimina (Fig. 60-6, paso 3). De esta manera, la secuencia de la diana actúa como un andamio sobre el que se puede formar la estructura de ADN apropiada. La generación de productos de ruptura indica la presencia de la diana, debido a que la estructura de ADN que se necesita para servir como sustrato de ruptura sólo tendrá lugar en presencia de la secuencia de la diana. La utilización de una enzima de ruptura termoestable permite que las reacciones transcurran a temperaturas suficientemente altas, de modo que, para poder existir, el cebador intercambie el equilibrio. Esto hace posible que se lormen múltiples pro-
El ensayo invasor tiene varias ventajas añadidas. Esta tecnología se puede adaptar fácilmente para detectar puntos de mutación de interés, diseñando una región solapante que rodee a la mutación que ha de ser detectada, debido a que el solapamiento de la sonda mvasora sólo necesita ser de un par de bases. La detección de estos puntos de mutación no requieren de digestión de restricción postreacción, dado que los cebadores se romperán de forma diferencial en base a la presencia o ausencia de la mutación en cuestión. Esto hace posible la localización de alelos mutantes asociados a las enfermedades hereditarias y mutaciones en patógenos asociadas a la resistencia, o la virulencia de los fármacos. Además, y al contrario que las técnicas de amplificación, como la PCR. la ADH y la AMT. en las que la secuencia diana se amplifica por ella misma, el ensayo invasor no aumenta el nivel de la secuencia de la diana. Por esta causa, el ensayo invasor es menos propenso a los problemas de falsos positivos ocasionados por la contaminación cruzada del producto de amplificación. Además del ensayo invasor, también se puede utilizar el método de ruptura para fabricar polimorfismos de la longitud de los fragmentos (de manera similar al polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción). Desnaturalizando el ADN genómico y enfriándolo rápidamente, se producen en el ADN estructuras secundarias de asas en lorma de horquilla que se reproducen velozmente y que pueden servir como sustrato para la ruptura. La digestión del ADN da como resultado un patrón preciso, que se ha utilizado con éxito para el análisis de la hepatitis C resistente al interferón-o. (Sreevatsan, 1998) y para detectar mutaciones específicas en los genes humanos (Rossetti, 1997). Esto ofrece un análisis versátil del patrón de fragmentación, debido al hecho de que las asas en forma de horquilla se producen con mucha mayor diversidad que la mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.
Figura 60-6. Representación mediante un diagrama del ensayo invasor. (Véase lexto para más detalles.)
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Por eso se pueden utilizar nucleasas especificas de estructura para detectar dianas de ácido nucleico en una secuencia especifica, que se emplean en los ensayos de puntos mulantes y que se aplican para generar diversos patrones de fragmentación, que son capaces de distinguir genotipos complejos. Todas juntas, estas tecnologías añaden herramientas muy poderosas a los análisis de ácidos nucleicos.
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES En los métodos de amplificación de señales no se aumenta la concenlración de sondas o de dianas. El aumento de la susceptibilidad analítica procede del aumento de la concentración de moléculas marcadas adheridas al ácido nucleico de la sonda. Para amplificar la detección de la sonda, se han utilizado múltiples enzimas, múltiples sondas, múltiples capas de sondas y se han reducido los ruidos del entorno (Kricka, 1999). Los sistemas de amplificación de las dianas tienen, generalmente, una mayor susceptibilidad analítica que los métodos de amplificación de señales, pero el desarrollo tecnológico, especialmente en los ensayos de ADN ramificado, ha rebajado los limites de detección, en algunas aplicaciones, a niveles que pueden rivalizar con los ensayos de amplificación de las dianas (Kern, 1996). Los ensayos de amplificación de la señal tienen diversas ventajas sobre los ensayos de amplificación de la diana. En los sistemas de amplificación de la señal no se altera el número de las moléculas diana, y el resultado es que la señal es directamente proporcional a la magnitud de secuencias de la diana, presentes en la muestra clínica. Esto reduce la preocupación por los falsos positivos, debidos a la contaminación cruzada, y simplifica el desarrollo de los ensayos cuantitativos. Puesto que los sistemas de amplificación de la señal no dependen de procesos enzimáticos para amplificar las secuencias de la diana, no se ven afectados por la presencia de inhibidores de enzimas en las muestras clínicas. Por consiguiente, se pueden utilizar menos métodos difíciles de extracción del ácido nucleico. Clásicamente, los sistemas de amplificación de la señal utilizan sondas más grandes o mayor cantidad de sondas que los sistemas de amplificación de la diana y. en consecuencia, son menos susceptibles a los errores producidos por la heterogeneidad de la secuencia de la diana. Finalmente, el ARN puede ser medido directamente sin la síntesis de un ADNc intermediario.
ADN ramificado El sistema de la amplificación de la señal del ADN ramificado (ADNb) es un ensayo de hibridación en sandwich de fase sólida que incorpora series múltiples de sondas de oligonucleótidos sintéticos (Nolte, 1998). La molécula amplificadora es la base de esta tecnología; es una molécula de ADNb con quince ramas idénticas, cada una de las cuales puede unir tres sondas marcadas. Se utilizan varias sondas especificas de secuencia para capturar al ácido nucleico diana sobre la superficie de un pocilio de microlítulo. Una segunda serie de sondas específicas de diana también se une a la diana. Las moléculas pre-amplificadoras se unen a la segunda serie de sondas dianas y hasta a ocho amplificadoras de ADNb. Tres sondas marcadas de fosfatasa alcalina hibridan a cada una de las ramas de la amplificadora. Se consigue la detección de las sondas marcadas unidas incubando el conjunto con un sustrato activable por una enzima, dioxetano, y midiendo la emisión de luz con un luminómetro. La señal que se produce es directamente proporcional a la cantidad de sondas en la muestra. La cantidad de sondas en la muestra está determinada en una curva estándar externa. La hibridación no específica de cualquiera de las sondas de amplificación y los ácidos nucleicos no dianas conduce a la amplificación de la señal del entorno. En los ensayos de ADNb de tercera generación se introdujeron isocitidina (isoC) e isoguanosina (isoG) en las sondas de amplificación para reducir la hibridación potencial de todas las bases no diana y no naturales (Collins, 1995). Los pares de bases isoC e isoG mutuamente, pero no con cualquiera de las cuatro bases, se producen naturalmente (Piccirilli, 1990). En los ensayos de ADNb, la utilización de sondas de isoC y de isoG aumenta la amplificación especifica de la sonda sin un aumento concomitante en el entorno, con lo cual se amplifican enormemente los limites de la detección. El límite de detección del ensayo de ADNb de tercera generación de' ARN VIH-1 es
de 50 copias/ml. Hay, comercialmente disponibles, ensayos de ADNb para la cuantificación del ADN del VHB, del ARN del VHC y del ARN del VIH-1 (Bayer). El Sistema 340, plataforma para el ensayo de ADNb. automatiza la incubación, el lavado, la lectura y el procesamiento de datos.
Ensayo de captura de híbridos El sistema de captura de híbridos es un ensayo de captura de anticuerpos de hibridación en solución que utiliza la detección quimioluminiscente. El ADN diana en la muestra se desnaturaliza y se híbrida con una sonda de ARN específica. Los híbridos de ADN-ARN son capturados por anticuerpos específicos de híbridos de ADN-ARN. con los que se recubre la superficie de un tubo. Los anticuerpos antihíbridos acoplados a la fosfatasa alcalina unen a los híbridos inmovilizados. El anticuerpo de unión acoplado es detectado con un sustrato quimioluminiscente, y la luz que emite se mide en un luminómetro. La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN diana en la muestra. El ensayo de captura de híbridos para la detección de VPH (Cope, 1997) y del CMV (Mazzulli, 1999), en muestras clínicas, está disponible comercialmente (Digene).
CONCLUSIONES En este capítulo hemos proporcionado las bases para comprender los principios que subyacen en los métodos de amplificación de los varios ácidos nucleicos y su fuerza y sus limitaciones relativas. La tecnología ya ha tenido un tremendo impacto en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y en los desórdenes genéticos, y promete revolucionar la atención y los diagnósticos de los pacientes con cáncer. El poder real de la tecnología se basa en su capacidad para derribar las disciplinas tradicionales de la medicina de laboratorio. La compresión, por medio de los principios básicos de la tecnología de amplificación del ácido nucleico, es importante para todos los que están involucrados en el ejercicio de la medicina de laboratorio, dado que es la tecnología que representa el futuro de los laboratorios clínicos.
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CAPÍTULO 60
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN
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C A P Í T U L O
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Tecnologías de la hibridación en serie • Jacques Schrenzel, M.D. • Jonathan R. Hibbs, M.D. • David H. Persing, M.D., Ph.D. TECNOLOGÍAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIÓN
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EN SERIE
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA TECNOLOGÍA
Macroseries
Secuenciación de las series
Microseries
Series de expresión
Sustratos de microseries
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DE LAS MICROSERIES
BIBLIOGRAFÍA
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Fabricación de microseries Microseries de oligonucleótidos Microseries de ADNc Bioinformática
TECNOLOGÍAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIÓN EN SERIE Desde hace muy pocos años, la tecnología de la hibridación en serie, que hace posible la ejecución de miles de reacciones de hibridación simultáneas en un sustrato sólido sin un solo proceso analítico, ha pasado de ser una teoría a ser una realidad práctica. Estas determinaciones, masivamente paralelas, ofrecen oportunidades, antes inimaginables, de aplicaciones diagnósticas, que van de la secuenciación del gen y la detección de polimorfismos genéticos a la medición de los perfiles de expresión del gen en las células cancerígenas. Las sondas moleculares están unidas a una superficie sólida, en las series definidas, para permitir la discriminación espacial de las numerosas reacciones que se producen simultáneamente. La hibridación en serie es el equivalente molecular de una hoja de extensión, donde cada célula o dirección revela un dato específico, que normalmente se deducen del enlace de un ligando a su diana específica. Los primeros métodos basados en las series fueron aprovechados en los ensayos de inmunidad (Ekins, 1987, 1999). Las series también han sido propuestas para estudios paralelos sobre diferentes moléculas, como las proteínas, los lípidos, los carbohidratos y las moléculas pequeñas (Fodor, 1991; Guschin, 1997: Pirrung. 1992: Schena. 1998; Southern, 1996a). Al igual que las interacciones antígeno-anticuerpo en las inmunoseries, el principio fundamental de las series de ácidos nucleicos se basa en la delección de interacciones intermoleculares específicas. En las series de ácidos nucleicos, esta complementariedad se deriva del apareamiento de bases de nucleótidos de las dos hebras (hibridación). Los estudios anteriores sobre la desnaturalización y reformación del dúplex, realizados en soluciones de ácido desoxirribonucleico (ADN), han hecho posible vaticinar la cinética de la hibridación y el punto de fusión de los productos, como una función de la composición del ácido nucleico y de la concentración de sal, Muchos de los primeros trabajos en este campo están ligados al uso de membranas de nilrocelulosa (Gíllepsie, 1965) en puntos/manchas (Kafatos. 1979). en sondas de linea y en manchas de Southern (Southern, 1975). Los rápidos cambios experimentados en este campo en los últimos años han sido liderados, en parte, por una convergencia tecnológica sin igual de microfabricación, robótica y bioinformática, fomentados por las demandas de altas cantidades de análisis genéticos asociados al proyecto del genoma humano.
Muchos investigadores especulan ahora con que esta tecnología puede sustituir, finalmente, a la microscopía de luz para la clasificación de lipos de tumores, para la determinación de la sensibilidad cromoterapéutica, para la caracterización de respuestas inflamatorias y para determinar la identidad de un patógeno infeccioso, debido a la capacidad que tiene la tecnología de hibridación de la matriz para impactar en los procedimientos diagnósticos de muchos tipos. En la actualidad, muchos fabricantes de EE.UU. y del extranjero afirman que están desarrollando matrices para la hibridación. El propósito de este capítulo es revisar las bases teóricas de varios programas de hibridación de la matriz y proporcionar una perspectiva sobre su utilización en el laboratorio clínico, tanto ahora como en el futuro.
Macroseries El término macroseries se aplica a la fabricación de series de hibridación genéticas en matrices macroscópicas, como las membranas de nailon o nitrocelulosa. La densidad de las macroseries va desde unas pocas docenas de sondas (también llamadas rasgos, en inglés features) hasta cientos e incluso miles de sondas depositadas sobre la membrana por impresión o por manchas de puntos, que luego se secan y se almacenan para su uso futuro. La membrana de nitrocelulosa es de interés histórico, ya que fue la primera matriz sólida que se utilizó ampliamente en la hibridación de ácidos nucleicos. Este material ha dejado de ser popular debido a su fragilidad y a que es muy inflamable. El nailon y el cristal (sello de silicio) son los soportes estándar para hacer microseries. El nailon tiene varias desventajas si se le compara con el silicio, que ahora se ha convertido en la matriz preferida para las series de la hibridación fvide infra). Además de su naturaleza porosa, el nailon muestra una autofluorescencia alta, limitando la sensibilidad de la detección basada en la fluorescencia, debido a los altos valores de fondo. Esto último evita, también, la posibilidad de desarrollar ensayos para medir relaciones. Esta propuesta utiliza dos dianas distintas, cada una marcada con un flúor diferente (p. ej., las muestras que se toman antes y después de la administración de un fármaco recetado). Utilizando un control constante, como una de las sondas, y expresando una relación de las dos señales fluorescentes emitidas, uno puede minimizar las variaciones sonda a sonda al igual que las diferencias interexperimentales (Brown. 1999; Duggan, 1999). Actualmente, el uso de las macroseries de nailon está limitado a aplicaciones específicas, por las cuales las sondas de interés parecen existir en los ensayos prefabricados. Por ejemplo, existen algunas series comerciales que con-
CAPITULO 61
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TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
tienen todos los genes de citosma conocidos y genes identificados dentro de las vías de transducción de la señal que se activan durante los procesos infecciosos e inflamatorios. Estas series han sido útiles para el estudio de las respuestas del huésped a los procesos infecciosos. Otras series, que incluyen todo sobre los oncogenes conocidos, han sido utilizadas en la investigación del cáncer (p. ej., Series del Atlas Humano Clontech, Palo Alto. Ca; o Genefilters Research Genetics, Huntsville, AL). El uso de las macroseries prefabricadas está limitado a los genes conocidos, y la capacidad limitada de las series de membranas limita su utilización como objetivo para descubrir genes. Algunos grupos han tenido éxito produciendo series de nailon de alta densidad, a petición de clientes, con el propósito de descubrir genes (Clark. 1999; Granjeaud. 1996: Gress, 1992; Pietu, 1996; Takahashi. 1995) La mayor desventaja de las series de nailon, por lo que a esto se retiere, ha sido el tamaño de la membrana, que representa, prácticamente, una limitación con respecto al volumen de la sonda que se debe utilizar, en especial cuando sólo se dispone de pequeñas cantidades de tejido. Debido a que se espera que las microseries. en vez de las macroseries, representen la plataforma elegida, el grueso de este capítulo se centra en las microseries.
superficies (Beattie, 1 9 9 5 : Beier. 1999; Maskos, 1992; Matson, 1995). Hay una alternativa interesante que consiste en la declaración de parches pequeños de poliacrilamina a los que los oligonucleótidos presintetizados son unidos por microinyección (Guschin. 1997; Khrapko. 1991: Yershov. 1996). La densidad de empaquetamiento de las sondas unidas a las superficies sólidas influirá enormemente en el rendimiento de las matrices de hibridación. La poca eficiencia del emparejamiento, que se encuentra, a menudo, en las matrices de cristal, puede dar como resultado una baja densidad de la sonda y bajos índices de señal/ruido. Por otra parte, el empaquetamiento demasiado denso de los oligonucleótidos sobre una superficie sólida ongma un impedimento espacial. Este obstáculo puede ser incluso más impresionante con bio moléculas más largas, como los ADNc. Se puede aumentar el rendimiento de la hibridación por hasta dos órdenes de magnitud introduciendo espaciadores entre la superficie y los oligonucleótidos (Southern. 1999). Cuanto más largo sea el espaciador, mejor será la hibridación, pero es interesante saber que hay una longitud del espaciador óptima, más allá de la cual desciende el rendimiento de la hibridación (Duggan, 1999: Shchepinov, 1997). Por ejemplo, un espaciador de 40 átomos de carbono proporciona un aumento de la hibridación de 150 veces, ya descrito (Shchepinov. 1997). Aproximadamente, la densidad de los oligonucleótidos es de 0.1 pmol'mm en superficie de cristal, dos órdenes de magnitud menos que en el polipropileno aminado. Por eso, en la actualidad, la ventaja potencial de las matrices de cristal sobre las de plástico es una densidad ohgonucleótida óptima asociada a un impedimento espacial más bajo (Southern, 1999). Si se mejora la calidad de las superficies químicas, algún día se podrán fabricar series sobre película o sobre hojas de plástico, lo que reducirá enormemente los costes de producción, 7
Microseries Los ensayos de miniaturización ahorran tiempo, a la vez que reducen los costes en las aplicaciones de diagnósticos biomédicos y en la investigación. El trabajo con volúmenes más pequeños reduce el consumo de reactivos y aumenta la concentración de la muestra, por lo que mejora la reacción cinética. Estas mejoras le permiten al investigador determinar cientos o miles de resultados en el tiempo que antes se necesitaba para un solo experimento. Ahora se pueden conseguir microseries de varios distribuidores comerciales, junto con la lectura y la fabricación de equipos, a gusto del cliente, de series dedicadas a la investigación específica o a las aplicaciones diagnósticas (vide intra).
Sustratos de microseries
La composición terminal (extremo-5) de los oligonucleótidos influencia su rendimiento. Como se esperaba, los extremos 5' ricos en G:C llevan a un rendimiento mejor que sus homólogos (la misma composición pero secuencias diferentes) (Maskos, 1993b). Por tanto, para minimizar esta contribución, se pueden considerar las propuestas para modificar el extremo 5' de los oligonucleótidos (p. ej.. la adición covalente de un nexo degenerado). Por otra parte, el saber que los errores en los extremos son menos desestabilizadores y. por tanto, más difíciles de discriminar por la hibridación (Southern, 1999) ha llevado a introducir mejoras inteligentes para la detección de los acontecimientos de la hibridación. Se han desarrollado métodos enzimáticos con una detección de astringencia mejorada (minisecuenciación de fase sólida [Pastinen. 1997. 1998; Syvanen. 1999]. análisis de unidades de información genética [Nikilorov, 1994] o ensayos de ligación [Landgren, 1988: Nickerson. 1990], ya que las polimerasas y las ligasas son más sensibles a los errores terminales (como oposición a los internos).
La distinción principal entre las microseries y las macroseries consiste en la elección de un soporte sólido y no poroso. Impidiendo la difusión de los ácidos nucleicos diana, las superficies no porosas (sustratos de plástico, de cristal o de silicio) permiten una hibridación cinética más rápida y unos pasos de lavado más fáciles. La declaración de las sondas sobre un sustrato sólido es también más receptiva para la automatización y posibilita densidades de serie más altas con una definición de la imagen óptima. Estos rasgos se aplican a cualquier tipo de microseries, desde los productos de oligonucleótidos sintéticos a los de los ADNc clonados o los de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Southern. 1999). Actualmente, la mayoría de las microseries se desarrollan sobre cristal. Al contrario que en los derivados del plástico, la transparencia del cristal y la falta de autolluorescencia permiten la detección basada en la fluorescencia de bajo fondo. Sin embargo, ya que la ciencia de los materiales empieza a estar más comprometida con las tecnologías de sene, puede que en el futuro inmediato, estén disponibles sustratos alternativos, incluidos el cristal bañado y los sustratos de plástico.
Marshall (1998) ha analizado las series que hay en el mercado. La fabricación de microseries comprenden dos amplias categorías: las que se hacen depositando la sonda directamente sobre la superficie sólida y las que se hacen por síntesis in situ. Hay un tercer método, desarrollado por Nanogen (San Diego. CA), que se compone de oligonucleótidos prefabricados caplurados sobre manchas electroactivas en chips de silicio (Cheng. 1998: Edman, 1997; Heller, 1998; Sosnowski. 1997). La modificación del campo eléctnco por electrodos independientes dirigibles espacialmente puede acelerar la hibridación, y cuando la polaridad es invertida, proporciona un lavado astringente (Edman, 1997).
Fabricación de microseries
Tecnologías de liberación
Para obtener la inmovilización covalente sobre cualquiera de estas dos superficies, de cristal o de polipropileno, se requiere la funcionalización del extremo 3 (esto es, la modificación química) de los oligonucleótidos de ácido nucleico, de los productos de la PCR, de los ADNc o de los oligómeros de péptidos y ácidos nucleicos (Beier, 1999: Matson, 1995), Por ejemplo, el tratamiento de láminas de cristal con silano permite al cristal amino tratado unir sondas ligadas a grupos amino utilizando moléculas bifuncionales, como una dialdehído o una disotiacina (Case-Green, 1994; Guo, 1994). De forma alternativa, el cristal bañado con un policatión (p. ej.. polilisina) permite la unión acoplada a la carga directa de las sondas de ADN polianiónico (Maskos. 1993a), un paso de entrecruzamiento por ultravioleta añade enlaces covalentes a la interacción iónica. El enlace covalente es esencial para permitir los lavados astringentes y, por tanto, la discriminación exacta de las especies hibridadas. Se han publicado varios protocolos para dirigir la activación de las
Pat Brown y otros colaboradores fueron los que iniciaron la declaración de moléculas presintetizadas (Schena. 1995; Shalon. 1996). Se preparan las sustancias bioquímicas (p. ej.. las proteínas, los péptidos. los oligonucleótidos, los ADNc), se purifican y se almacenan en placas de microtitulos. Mecánicamente se depositan pequeñas cantidades de moléculas en las localizaciones exactamente definidas sobre una superficie sólida, utilizando diversos sistemas robóticos de precisión. Este método es muy flexible en cuanto a la composición bioquímica, a la topología de la microserie (p. ej.. el tamaño y la densidad de las manchas, las manchas de réplica para cada molécula) y a su facilidad para hacer prototipos. Los métodos mecánicos permiten la síntesis de microseries de elevada a moderada densidad (hasta cerca de 16.000 sondas por cm- [Graves. 1999]). Es el método elegido cuando se necesita gran número de microseries con la misma composición, así como para secuencias largas que utilizan productos de la PCR. En la actualidad, varias compañías
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
están fabricando y vendiendo senes prefabricadas (p. ej„ Micromax. NEN Life Science, Boston, MA) o repetidores basados en la deposición (Cheung, 1999) como alternativa a la construcción de un repetidor (Brown, 2000). Los procedimientos de liberación se componen de diferentes sistemas de microimpresión y han sido recientemente revisados (Bowtell. 1999). La mayoría de los repetidores utilizan puntas microdispensadoras parecidas a una pluma estilográfica (p. ej.. Cartesian Tecnologies. Irvine, CA), aunque se han desarrollado algunos sistemas originales, como la técnica de pincho y anillo (Genetic MicroSystems. Woburn, MA). En general, y debido a la tensión superficial, a la electricidad estática y a otros electos, la reproducción de las senes impresas es más baja que la síntesis in situ. y debe ser corregida por medio de experimentos separados (repetidos), por las réplicas de las manchas (en la misma plancha), por la detección de la lluorescencia multicolor y por otros algoritmos de detección específicos o por ambos (Chen. 1997). Debido a su flexibilidad y a su disponibilidad, la tecnología de las senes impresas tendrá, probablemente, el mayor impacto en los laboratorios clínicos y de investigación en el curso de los próximos años.
Síntesis in situ La síntesis in situ permite producciones más altas, variaciones de chip a chip más bajas, asi como densidades de sondas más altas. Estos métodos también permiten la fabricación de series de "acceso al azar" genuinas. esto quiere decir que cada oligonucleótido. en cualquier posición, puede tener cualquier secuencia elegida (Southern, 1999). Las estrategias de combinación se refieren a métodos que han sido desarrollados para hacer microseries que contienen todas las secuencias de una longitud dada (también se las conoce como "senes genéricas"). Las series de combinación se han fomentado, principalmente, para estudiar el comportamiento de las hibndaciones a gran escala (Southern. 1994), o para la secuenciación de los ácidos nucleicos en estado sólido (Drmanac, 1993a, 1993b, 1999. 1998: Lipshutz, 1993: Macevicz. 1991; Strezoska. 1991), Las técnicas de fabricación incluyen a las máscaras fotolitográficas para controlar la activación química por medio de pasos de fotodesprotección (Fodor, 1991). de declaraciones por inyección de tinta (Stimpson, 1998), así como de barreras físicas para la inundación secuencial de los precursores (Maskos. 1993c). Affymetrix ha emparejado la desprotección fotoquímica con la síntesis del ADN en fase sólida adaptando las técnicas de la industria de los semiconductores (Lipshutz, 1999; Lockhart. 1996: Pease, 1994). Los nexos sintéticos modificados con grupos protectores transportables por medio de la fotoquímica son unidos a los chips de silicio. La fotodesprotección localizada se produce por medio de rayos UV brillantes a través de una máscara fotolitográfica y deja que las unidades básicas (desoxinucleósidos protegidos de hidroxilos) reaccionen con los grupos desprotegidos (Fodor. 1991). Los ciclos alternos de fotodesprotección e incubación con distintas unidades básicas químicas permiten la síntesis dirigida por rayos de los polidesoxinucleótidos. Los ohgonucleótidos sintetizados tienen una longitud práctica máxima debido a la eficiencia limitada de la fotodesprotección (del 80% al 95% en cada ciclo) (Forman, 1999). Por tanto, la proporción de 20-mers que muestra la secuencia predefinida está entre el 1% y el 36% (0.8E20 a 0.95E20) (Fodor. 1991). Las máscaras o barreras mecánicas permiten la limitación de las áreas de la superficie antes de ser inundadas por los precursores definidos. Las máscaras físicas de formas diferentes (en forma de rombo, de circulo) permiten la síntesis in situ de un precursor dado en localizaciones conocidas. El desplazamiento secuencial de las máscaras, seguido por la inundación de otro precursor, permite la síntesis de las series de combinación extensas de desoxinucleótidos (Maskos, 1993c; Southern 1992,1996b). A fecha de hoy, Affymetrix es capaz de sintetizar hasta 400.000 polidesoxinucleótidos diferentes en un área de 1,6 cm(Fodor, 1991). A pesar de su alto coste, este es el método elegido para los estudios de la expresión génica diferencial a gran escala, debido a su susceptibilidad, su capacidad de reproducción y a la redundancia de información. Las tecnologías de inyección de tinta deben su desarrollo a la industria impresora y actualmente están siendo desarrolladas por varias compañías Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA), Protogene (Palo Alto, CA) y Rosetta Inpharmatics (Kirkland, WA) (Blanchard, 1996). Esta tecnología también está disponible en el mercado (Ink-Jet. Packard Instruments. Meriden, CT: Piezoelectric pump. GeSiM. Grosserkmannsdorf, Alemania). Esta propuesta ofrece versatilidad en las biomoléculas que están siendo liberadas y elimina la necesidad del
contacto físico con las superficies de las series; esta última propiedad puede ser relevante para el desarrollo de las series bañadas con finas láminas de metales y que utilizan diferentes métodos de detección (Heyse, 1998; Schmid, 1998). Se puede detectar una leve dispersión de las micropartículas que eslán marcando a las secuencias dianas cuando, de inmediato, aflora en la superficie del cristal una ola evanescente. Este método permite la medición de afinidad en tiempo real con un poso muy bajo (Stimpson. 1996).
Microseries de oligonucleótidos Se ha estudiado ampliamente la termodinámica, la cinética de la hibridación y los aspectos cuantitativos de la hibndación de los oligonucleótidos (revisado por Hoheisel, 1996; Wetmur. 1991). La utilización de los oligonucleótidos en las series tiene ventajas y desventajas potenciales. Las desventajas potenciales son: una susceptibilidad más baja que las series de ADNc, para la detección de mensajeros poco comunes o para la de dianas de hibndación, y su poca capacidad, desde el potencial de la hibridación, para predecir las características de la hibridación y, por tanto, la intensidad esperada de la señal no parece correlacionarse bien con el contenido de G:C o con la temperatura de fusión (Graves, 1999; Lockhart, 1996), Basándose en estos conocimientos, las series de oligonucleótidos se pueden hacer por la deposición de oligonucleótidos sintéticos o por la síntesis in situ. Esle método ofrece numerosas ventajas sobre la liberación de los productos de ADNc o de la PCR. Las condiciones de la hibridación pueden ser más homogéneas que en la serie del ADNc, con tal de que ésta esté diseñada con oligonucleótidos de tamaños equivalentes. Las series de oligonucleótidos no requieren, necesariamente, del conocimiento anterior de las secuencias dianas. Se pueden dividir en dos campos: las series genéncas (que representan a una matnz de oligonucleótidos azarosa) o las series especializadas (por vanaciones moleculares de una diana prederminada). Las series genéricas han sido propuestas como una alternativa barata a la secuenciación. Es posible "pasearse" por todas las posiciones a lo largo de una secuencia de nucleólidos si se utilizan todas las combinaciones posibles de un n-mer. Hyseq (Sunnyvale, CA) reclama una posición de liderazgo en el campo de la secuenciación por hibridación. Esta propuesta inteligente está, actualmente, limitada por la complejidad del algontmo que se necesita para generar grupos (la conversión de una lista de n-mers hibridados en una secuencia significativa). Además, si la secuencia que se está analizando contiene una región repetida (la misma secuencia aparece más de una vez sin la molécula diana), el diagrama de reconstrucción tendrá que desplegar un número correspondiente de puntos de ramificación que derivarán a una secuencia ambigua. Una propuesta de este tipo depende del acceso azaroso de la síntesis. Este tipo de serie es el único capaz de detectar las secuencias que faltan en las grandes bibliotecas electrónicas. Como contraste, las senes especializadas se utilizan para las secuenciaciones repetitivas (resecuenciación) de la misma diana para la detección de polimorfismos de nucleótidos o de mutaciones funcionales. Esto implica el conocimiento de las dianas y sus variantes más frecuentes, para incorporar grupos predeterminados de nucleótidos en las series diagnósticas. Este método se ha utilizado para la detección de polimorfismos genéticos asociados a la resistencia a los fármacos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), así como para otros polimorfismos (vide iníra). Las series de oligonucleótidos también se pueden utilizar para definir los polimorfismos de un solo nucleótido (Guo, 1994). incluso comparando dos muestras con fluorescencia multicolor (Chee, 1996). Más adelante se describen otros ejemplos de este método. La búsqueda de oligómeros de afinidad más elevada ha abierto el camino para las modificaciones químicas de las sondas y de los moldes de oligonucleótidos para mejorar la cinética y la termodinámica de los enlaces. Las sondas de péptidos de ácido nucleico (PAN) hacen que la hibridación se efectúe en una astringencia más elevada, debido a la alta estabilidad de las PAN-ADN dúplex (Corey. 1997). Las sondas mediadas de ARN (Corey, 1998) muestran afinidades similares relativas. Sin embargo, las PAN muestran condiciones de hibridación más rápidas que sus ácidos nucleicos equivalentes, debido, fundamentalmente, a su estructura neutral de columna vertebral (Freeman, 1999). Por regla general, se puede decir que, a pesar de que sería una clara ventaja la reducción de los tiempos de hibridación de horas a minutos, se debe superar el problema que hay de no poder predecir los puntos de fusión de estos oligómeros de alta afinidad antes de su aplicación en las microseries (Weiler.
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TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
1997). Además de las sondas, también las dianas pueden ser modificadas químicamente para localizar las señales amplificadas. Las regiones dianas ricas en pirimidina pueden generar señales más altas de hibridación añadiendo 5-metiluridina durante la transcripción in vilro (Hacia. 1998).
Microseries de ADNc Las microseries de las secuencias de ADNc permiten la monitorización basada en la hibridación de genes similares. Por tanto, esta estrategia implica el acceso a los clones o la posibilidad de generar productos de la PCR. Hasta la fecha, las mejores estrategias utilizan la detección fluorescente de dos colores para discriminar entre una muestra y su control y para comprobar el nivel diferencial de la expresión. Pat Brown y sus colaboradores en la Universidad de Stanford fueron los pioneros y verificaron este método (Schena. 1995,1996; Shalon. 1996). Las ventajas de este método se basan en calcular una relación en cada sonda, en controlar la calidad de la sonda, en las propiedades específicas de hibridación de cada par de dianas o sondas y en la eficacia en el mareaje. Synteni (una compañía subsidiaria de Incyte. Palo Alto. CA) ha desarrollado para este propósito su microserie de expresión génica (Schena. 1998). La compañía NEN Life Science vende ahora portas de cristal con 2.400 genes humanos conocidos (MicroMax). A pesar de que parecen intrínsecamente menos reproducibles, en la actualidad las microseries de ADNc ofrecen la mayor versatilidad en cuanto a la deposición de las sondas se refiere, y a la accesibilidad de la tecnología. Varias compañías están ahora ofertando equipos para la fabricación de senes y para la lectura de las matnces hibridadas. Las series de ADNc y las series de oligonucleótidos de densidad elevada probablemente tendrán papeles complementarios relevantes, en los próximos años, en los laboratorios de investigación: las senes de densidad elevada se usarán, primordialmente, para el descubrimiento de locus de relevancia diagnóstica, y las series dedicadas se utilizarán, cada vez más. para los análisis de densidad media a baja de los locus de relevancia diagnostica descubiertos por los análisis de sene de densidad elevada.
Problemas de la propiedad industrial La tecnología de las microseries es un campo que avanza rápidamente y en el que existe una competencia feroz. Por eso es importante enfatJzar el hecho de que se han registrado muchas patentes y de que algunas de ellas son directamente relevantes en los diagnósticos clínicos. Por ejemplo, Affymetrix (Santa Clara, CA) posee derechos sobre las patentes que son esenciales para las series de oligonucleótidos de densidad elevada (Chee. 1998; Holmes. 1998), sin tener en cuenta los propósitos para los que fueron hechas. Si un laboratorio, presuntamente, decide desarrollar series de densidad moderada para análisis de tumores y cobra por este servicio, este ensayo puede infringir los derechos de las patentes de Affymetrix si exceden las 400 unidades/cm. sin tener en cuenta de qué tipo es el método de la síntesis (Fodor, 1998). Las tecnologías de las series que utilizan micromatnces de tampones de gel de poliacrilamida (elementos de gel tndimensionales), representan un método nuevo que puede que no infrinja los derechos de Affymetrix (Guschin, 1997; Khrapko. 1991 Yershov, 1996). Esperemos que. como ocurrió con las tecnologías de amplificación de los ácidos nucleicos, la competencia entre fabricantes rebaje los costes y permita la democratización de esta tecnología tan poderosa. 2
Bioinformática La bioinformática es un componente esencial en las microsenes, desde que se empieza a diseñar la serie hasta los sofisticados análisis de datos. Utilizando robots controlados por ordenador, las biomoléculas pueden ser distribuidas, exacta y precisamente, en cualquier configuración de gradilla deseada. Este paso es relativamente trivial y parece que se adapta bien a la capacidad de los instrumentos que hay en el mercado (Bowtell. 1999). Sin embargo, se debe seguir con atención el vinculo secuencia arriba entre cada punto y el pocilio (y la placa) de donde procede la biomolécula. El nuevo software (p. ej„ CloneTracker, BioDiscovery, Inc. Los Angeles, CA) garantiza la identificación correcta de cada sonda durante la fabricación de las microseries y el tratamiento de los datos para correlacionar rápidamente una señal con una sonda específica. En los lugares donde se llevan a cabo las senes de tamaño medio a grande, lo más sensato es la utilización de un sistema de código de barras. La obtención de datos genera gran
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cantidad de grupos de datos (generalmente una imagen utiliza de 10 a 50 megabites) que se tienen que almacenar en formatos estándar (BMP, GIF. JPG). El software procesador de imágenes mostrará una creciente automatización. Este software debe garantizar el ajuste apropiado de la gradilla y la detección de restos, así como identificar las características para obtener información significativa. El aspecto de las microseries que más desafios encara empieza aquí, cuando las grandes cantidades de grupos de datos se han reunido y purgado de restos y esperan para el análisis (Vingron, 1999). Se pueden utilizar dos estrategias. La hipótesis clásica del análisis consiste en la agrupación (utilizando vanas herramientas estadísticas) de genes que se comportan de forma similar. Entonces, se pueden deducir los genes potencialmente co-regulados o detectar la expresión diferencial. Sin embargo, estos datos son. sólo, fortuitos. La otra estrategia asume que. después de ejecutar un proceso estadístico o de visualización, los datos "hablan por si mismos" (Bassett, 1999; Brown. 1999). El software que está disponible comercialmente permite hacer estos análisis, pero con frecuencia los investigadores tendrán que personalizar estos programas, e incluso puede que tengan que escribir sus propios algoritmos. Uno de los problemas logísticos que han surgido y que entrañan más desafios para las tecnologías de las microseries son las extensas bases de datos capaces de ser tratadas por la red. Ya está muy claro que probablemente la información significativa provenga de la comparación entre experimentos múltiples, más que de las deducciones de un experimento basado en un solo fragmento, siendo esto tan complejo. Por eso, debido a la imperiosa necesidad del reconocimiento del patrón, de la interpretación multidimensional de los datos y de la comparación cruzada del programa, las tecnologías de las microseries van a tener una íntima relación con la bioinformática, y la evolución conjunta del hardware y del software parece ser inevitable (véase Cap. 6).
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA TECNOLOGÍA DE LAS MICROSERIES En los últimos años se han propuesto numerosas aplicaciones de la tecnología de las microseries, que van de la clasificación molecular de tumores a la identificación y caracterización de agentes microbianos. Esto ha llevado a muchos a especular con que la tecnología de las senes representa la "nueva ola" de los avances tecnológicos, que va a tener un impacto práctico en los diagnósticos de las enfermedades humanas, precedida sólo por la PCR, como tecnología central en los laboratorios clínicos de diagnósticos moleculares. Esta sección se centra en las aplicaciones, actuales y futuras, de la tecnología de las series.
Secuenciación de las series Los datos de las secuencias de los ácidos nucleicos son fundamentales para la biología molecular moderna. Los métodos convencionales (Maxam, 1977: Sanger, 1977) llevan tiempo, el trabajo es intensivo y son caros. Los métodos de secuenciación alternativos que utilizan la hibridación en fase sólida se propusieron en base a una teoría (Bains. 1988; Khrapko, 1989) a menos de 15 años del descubrimiento de estos métodos (Southern. 1975). A los artículos teóricos les siguieron después los datos, que confirmaban los principios de la secuenciación basada en la serie, de moldes cortos artificiales (Pannov, 1996: Pease, 1994; Southern, 1992). En 1999 se publico un artículo, muy bien escrito, sobre los métodos de secuenciación de las microseries (Hacia. 1999). Sin embargo, el lector puede advertir que muchos de los trabajos publicados y citados en esta área provienen de investigadores con intereses financieros en uno o varios dispositivos patentados, y que estas publicaciones evalúan, Más que respaldar a un método o dispositivo especial, este capítulo trata de familiarizar al lector con los principios básicos de las senes, En teoría, cualquier secuencia de ácido nucleico se puede romper en subgrupos de longitud n. Después, todos esos oligonucleótidos posibles, de longitud n (n-mers) se pueden situar en localizaciones estables sobre una superficie sólida. El ácido nucleico que va a ser secuenciado (el molde) se amplifica, si es necesario, se marca con una molécula fluorescente, luminiscente o radiactiva y se le permite que hibride a las series de unión de n-mers. La detección de la marca permite, al que está haciendo la secuencia, verificar un resultado con un n-mer en un locus particular en la superficie sólida. La
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PATOLOGÍA MOLECULAR
intensidad de la señal en ese locus debería ser directamente proporcional al número de dominios en el molde correspondiente al n-mer en ese locus. De los métodos para todos estos pasos, se ha dado una idea general en las secciones precedentes de este capítulo. Para las aplicaciones de la secuenciación, los n-mers que se ajustan al molde se agrupan, luego, en un orden definido por el análisis de los n-mers con la secuencia solapante, que en principio es igual al ordenamiento de grupos por los programas de secuenciación a gran escala. Piensen en un molde nonanucleólido que bajo condiciones astringentes es unido solamente a los locus que contienen cuatro tetrámeros en una serie con todos los 256 tetrámeros posibles: Tetrámero
Intensidad
5ACTG 5'CTGA 5'TGAC 5'GACT
2 2 1 1
Desde las áreas replegadas, no es muy útil razonar que el molde nonanucleótido fuera 5'ACTGACTGA. Este tipo de análisis se hace directamente por ordenador. Desde el ordenador se puede automatizar el escáner de la serie para detectar la marca, el mareaje mismo y, en alguna medida, incluso la extracción y la amplificación del ADN: es estupendo imaginar que una "caja negra" puede realizar todo esto en una tarde. Sin embargo, pensemos en un nonanucleótido que une a los locus que contienen los siguientes tetrámeros: Tetrámero 5'TCTA 5'CTAC 5 TACT 5'ACTT 5'CTTC 5TTCT
Intensidad 1 1 i 1
1 1
Esto podría representar 5' TCTACTTCT o 5' TTCTACTTC, y no hay manera de resolverlo por ordenador. Donde n es menos que la mitad de la longitud del molde, repetir la misma longitud como n/2 puede dar resultados ambiguos. El ordenador empieza a tener cada vez más dificultades, ya que la longitud del molde llega a ser un múltiplo de n cada vez más alto; en consecuencia, es deseable tener un n tan largo como sea posible para la secuenciación de los dominios no conocidos. En la práctica, la longitud de n sigue limitada por la tecnología, sin embargo, desde entonces 4" (el número de locus que se precisan para la representación universal) excede a 1 millón por n = 10. Esto limita los métodos actuales del número de oligonucleótidos diferentes que pueden ser diferenciados sobre un chip fotolitográfico (Lipshutz, 1999). Y una vez descritas estas limitaciones intrínsecas, en la actualidad es mejor reservar la secuenciación basada en las microseries para los sitios ampliamente conservados, donde el conocimiento de la secuencia esperada es mucho mayor. Aquí, el número de locus que se precisan no necesita aproximarse a 4". ya que hay un número limitado de secuencias posibles para ser identificadas. La detección de polimorfismos de un solo nucleótido de un gen fenotípicamente definido (Cronin. 1996; Hacia, 1996) es una estrategia arquetipica apropiada para la secuenciación basada en las microseries. Sus aplicaciones especificas incluyen la detección de alelos de resistencia antimícrobianos (Kozal. 1996; Troesch, 1999), las mutaciones de puntos asociados con el cáncer (Ahrendt, 1999), las secuencias específicas de especies en un sitio ampliamente conservado (Gingeras, 1998) y la identificación de mutaciones en genes conocidos para determinar su papel en una enfermedad de origen desconocido (Halushka, 1999). A pesar de que los costes de esta tecnología siguen siendo altos, es posible que bajen según vaya aumentando la producción. Suponiendo que los costes bajen, los métodos de secuenciación a través de microseries serán, probablemente, los preferidos en las aplicaciones clínicas donde se requiera la secuenciación repetitiva de la misma diana. Además de los costes, la secuenciación de microseries tiene algunas limitaciones técnicas, incluso para sitios ampliamente conservados. En la mayoría de los casos, mientras que al investigador se le proporciona la secuencia
interpretada, el instrumento de recogida de datos sigue siendo una "caja negra", sin las señales visuales que relacionan directamente a un nucleótido específico de la secuencia mencionada. Algunas veces, una imagen del cromatograma (de un secuenciador capilar) o del gel (de una secuenciación de gel) puede resolver las ambigüedades o las inconsistencias de los datos de la secuenciación. Sin embargo, los usuarios de los secuenciadores actuales de microseries quizá tengan que aceptar que los datos primarios de los cuales se deduce su secuencia no pueden ser interpretados directamente, bien porque es demasiado complejo o bien porque la composición y la localización en el chip de los oligonucleótidos específicos sigue siendo un secreto industrial de los fabricantes, o por ambas cosas. Esto no tiene que ser, necesariamente, una desventaja para los laboratorios clínicos, aunque sea frustrante para los investigadores, ya que, en ellos, es cada vez más corriente el uso de sistemas automatizados y de la interpretación guiada por el ordenador. Para las aplicaciones clínicas, en general, una limitación más seria es intrínseca a la secuenciación como una estrategia diagnóstica. Debido al potencial de velocidad y de automatización, la secuenciación de microseries resulta atrayenle como alternativa a los métodos fenotipícos clásicos y. muy notablemente, a la selección de resistencias a los fármacos. Como todas las estrategias de secuenciación, las microseries tienen una sensibilidad limitada para los alelos minoritarios. Particularmente instructivo es el ejemplo de la identificación de la resistencia a los fármacos en el VIH basada en la secuencia. La secuenciación de microseries de aislados clínicos puede pronosticar correctamente algunos casos de resistencia a los fármacos basándose en mutaciones específicas (Race, 1998), y ya se está convirtiendo en una práctica estándar (Perez-Olmeda, 1999). Incluso suponiendo que la secuenciación pueda detectar un alelo resistente cuando está representado en más de o igual a un 1% de la población vírica, hay razones, sin embargo, para dudar del valor profético de una prueba negativa de resistencia. Pocos virólogos argumentarían que el 0,5% de prevalencia de la resistencia a los fármacos no sea importante en un virus que genera más de un billón de copias al día.
Series de expresión La expresión diferencial del gen es el problema fundamental de la biología molecular. Generalmente, la pregunta que nos hacemos es" ¿La expresión de qué gen está asociada con este resultado en particular?". Desde los viejos malos tiempos de sustracción de bibliotecas y de manchas de Northern a los métodos más modernos de selección, como la demostración de la diferencia (Liang, 1992) o la amplificación de la diferencia (Lisitsyn, 1993), los métodos siguen siendo caros, el trabajo intensivo y se emplea mucho tiempo. Las microseries son prometedoras en cuanto a afrontar este problema de una manera no solamente menos cara, con menos trabajo y más rápida que con los métodos antiguos, sino que permitirán los análisis mucho más complejos del problema en cuestión. Los métodos más antiguos se basan en la identificación de uno o, a lo sumo, de un puñado de secuencias para comparar entre muestras de control y experimentales. Los sistemas basados en las microseries ofrecen un programa para cuantificar la expresión de miles de genes al mismo liempo (Brown, 1999). Esto permite el análisis de cassettes enteras de genes, o patrones de expresión del gen. nada menos que de uno, dos o tres genes al mismo tiempo. El método que permite el estudio de los acontecimientos de la transcripción puede estar anticuado, debido a que en la ciencia biomédica la mayoría de los problemas de interés general involucran a varios genes que actúan todos de acuerdo. Por lo general existen dos tipos de series para hacer los análisis de expresión. En uno se pueden utilizar series de porciones enteras o sustanciales de ADNc o de exones. utilizando en la microserie secuencias largas de cientos de bases en locus individuales. Aunque la síntesis comercial se encuentra en el mercado, estas series se pueden preparar en cualquier laboratorio utilizando mecanismos hechos con componentes caseros (Brown, 2000: Schena. 1995). Esto permite hacer análisis de la expresión personalizados a un precio razonablemente bajo y dando un rodeo a las patentes de fotolitografía. Por otra parte, estas series representan una pequeña o ninguna variedad de alelos para cada gen, con poca distinción en la representación entre las regiones variables y constantes del gen expresado. Alternativamente, se pueden utilizar series hechas de oligonucleótidos solapantes, que incluyen las regiones de diferenciación de varios genes. Estas series se preparan por medio de la foto-
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TECNOLOGÍAS DE LA HIBRIDACIÓN EN SERIE
litografía, utilizando métodos propios y máscaras complejas. Debido a esto son caros, y para los pequeños laboratorios su disponibilidad es limitada (Fox, 1999). No obstante, permiten que miles de genes a la vez detecten a todos los alelos conocidos y proporcionen información cuantitativa y detallada de cualquiera de las secuencias (incluidos los alelos patógenos) que están representadas en la transcripción. Incluso se puede detectar, rápidamente, la expresión de bajo nivel del gen con un alcance de más de 1.000 (Lockhart. 1996). Las series de ADNc y las de oligonucleótidos se han utilizado con éxito para afrontar los eternos problemas de la biología de la expresión. En 1999 se publicaron los aspectos prácticos y los méritos relativos de varios sistemas (Bowtell, 1999). La investigación publicada en 1995. por Schena y cois, del laboratorio de Pat Brown, fue la de un resultado seminal en la utilización de senes de ADNc de alta densidad sobre cristal para el análisis de la expresión (Schena, 1995). Los autores marcaron el ADNc de la Arabidopsis. cuyo genoma está entre los más pequeños de cualquier eucariota. En un prototipo de los experimentos subsiguientes se marcó a los ADNc de la hoja y de la raíz de la planta con diferentes fluorocromos. Utilizando series de productos amplificados por PCR de clones seleccionados al azar de una biblioteca del ADNc de la Arabidopsis, los autores identificaron 26 genes, cuyo índice de transcripción era diferente en cinco veces o más entre la hoja y la raíz. Esta diferencia ambiental no era especialmente sutil, pero esta investigación representó una desviación notable de las publicaciones anteriores de la expresión diferencial, en las que el descubrimiento de cinco o menos genes expresados diferencialmente podría haber sido considerado un triunfo colosal. Las acciones subsiguientes efectuadas por el mismo laboratorio encontraron en las células humanas once genes regulados hacia arriba y seis regulados hacia abajo dos veces o más por medio de un choque de calor de 43" C, así como también seis genes regulados hacia arriba dos veces o más por exposición a esteres de lorbol (Schena. 1996). En estos experimentos hibndaron el material del molde sobre, aproximadamente. 1.000 secuencias de genes a la vez. aumentando por dos órdenes de magnitud el número de acontecimientos de la transcripción que podrían ser asociados con un estímulo delinido en un bloque de experimentos. Desde estas primeras publicaciones, otros laboratorios han utilizado métodos similares para descubrir 30 genes regulados hacia arriba por radiación ionizante (Amundson. 1999), 62 genes expresados diferencialmente en neuronas afectadas de esclerosis múltiple (Whitney. 1999) y 89 genes expresados diferencialmente entre las células del carcinoma de las células renales y las células derivadas de un riñon humano normal (Moch, 1999). Se han hecho progresos similares con programas de oligonucleótidos fotolitografiados. Éstos se han utilizado para identificar 23 transcritos que median la respuesta a un gen asociado al cáncer de mama (Harkmg, 1999). 94. 268 y 129 genes cuyos niveles de transcripción cambiaron dos veces o más después de la exposición a interferón (IFN) -a, y -y, respectivamente, de células derivadas de un librosarcoma (Der, 1998); y 258 transcritos cuyo nivel cambió cuatro veces o más después de la exposición a otomegalovirus de fibroblastos humanos (Zhu, 1998). Las últimas publicaciones citadas, que sólo son unos pocos ejemplos de toda una gran y creciente documentación, analizan aproximadamente 5.000 ADNc al mismo tiempo, en comparación con los aproximadamente 1.000 de las primeras investigaciones de las microseries de ADNc. El número más amplio se aproxima al número de secuencias codificantes de proteínas en los genomas procarióticos. La proporción en aumento de estos análisis de expresión de las microseries hace que estos métodos sean especialmente atractivos para los estudios in vilro de las procariotas (de Saizieu. 1998). de las cuales más de 20 se han secuenciado en su totalidad. Si bien la extracción de ARN de las procariotas es menos precisa, desde que se debe utilizar ARN entero, en vez de ARN poliadenilado, como molde para la transcripción inversa, la globalidad de este análisis es una gran ventaja. Se puede capturar una imagen completa de genes de procariotas codificantes de proteínas en una sola membrana de nailon (Tao. 1999). También es posible una propuesta similar del genoma completo con eucariotas simples. El bloque Ye6100 de cuatro chips de oligonucleótidos fotolitograliados contiene información secuencial acerca de más de 6.000 marcos de lectura abiertos, lo que posibilita una evaluación detallada de la respuesta Iranscripcional a través del genoma completo de la levadura Saccaharomyces cerevisiae (Holslege. 1998: Jelinsky, 1999; Wodicka, 1997).
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Además de incrementar el numero total de las secuencias analizadas, las nuevas estrategias analíticas de los datos de las microseries también están mejorando los análisis de la expresión de los genes. Estos métodos hacen evidentes los límites para analizar uno o varios genes a la vez, los cuales demuestran amplios grupos de genes que responden a estímulos individuales. Y lo que es peor, los genes cuyos niveles de transcripción responden a un estímulo a menudo también responden a otros estímulos (Fambrough. 1999). En vez de analizar cada transcnptor como un pronosticador de resultados, los datos paralelos masivos que proporcionan las microseries permiten identificar familias enteras de genes implicados en acontecimientos biológicos complejos (Eisen. 1998). El año pasado se publicó un éxito paradigmático de esta propuesta, que fue la clasilicación de las leucemias mediante el perfil de la expresión génica (Golub. 1999). En este artículo los autores explican que empezaron por extraer ácido ribonucleico (ARN) de las muestras de médula ósea de 38 pacientes con leucemias linfoblásticas y mielógenas. Los transcritos biotinílados del ADN derivados de esas muestras fueron hibridados por series de Affymetrix HU6800 con oligonucleótidos representantes de más de 6.800 genes humanos, luego marcaron los chips con ficoeritrina-estreptavidina para su cuantificación en un escáner confocal. Los autores identificaron 50 genes cuya expresión estaba asociada con una de las dos clases de leucemia por medio de la utilización de métodos matemáticos, desarrollados por este proyecto (Lander, 2000), y de procedimientos de verilicación repetitiva. Después probaron el modelo diagnóstico verificado en células derivadas de la sangre y de la médula ósea de 34 pacientes adicionales con leucemia. El funcionamiento del modelo no fue perfecto en esta segunda verificación, ya que no se pudieron hacer predicciones precisas sobre cinco pacientes. Por otra parte, el modelo sí hizo predicciones diagnósticas seguras de 29 (85%) de estas muestras, todas las cuales eran correctas. Yendo aún más lejos con la ampliación de estas técnicas, los autores utilizaron su software GENECLUSTER para configurar un mapa de auto-organización (Tamayo, 1999) de los datos de la expresión de los 38 pacientes iniciales. Estos mapas identifican grupos de genes cuyos patrones de expresión están asociados unos con otros. Los patrones de expresión que surgieron del mapa no sólo identificaron a las leucemias linfoblásticas y mielógenas, sino que incluso pudieron distinguir entre la leucemia linfoide derivada de células T y la derivada de células B. Y lo más importante es que, al contrario que en los análisis iniciales, estos grupos de patrones de la expresión no estaban basados en el conocimiento previo de las bases para hacer diagnósticos. Lo que esto sugiere es que estos métodos podrían conformar una nueva y amplia base para la clasificación de enfermedades poco clasificadas hasta ahora y para otros procesos biomédicos. Una de las aplicaciones clínicas obvias de esta estrategia es la identificación del pronóstico de las enfermedades con resultados variables. Esto ilustra la reciente identificación de los perfiles de la expresión génica asociados con la supervivencia, corta y larga, en el linfoma (Alizadeh, 2000). En este artículo los autores explican que extrajeron ARN poliadenilado de lineas de células de leucemia y de linfoma, así como tejido linfoide humano normal Los ADNc marcados con fluorescencia de esos extractos fueron unidos a las series que contenían secuencias de 17.856 clones moleculares representantes de células B del medio germinal, de células de leucemia y de linfoma y de una colección de genes de respuesta a mitógenos o citocinas. Cada ADNc experimental fue hibridado a la serie en la presencia del ADNc de control marcado con un fluorocromo de contraste. Este ADNc control se hizo con una gran cantidad de ARN linfoide, cuyas alícuotas fueron utilizadas en cada experimento. Esto hizo posible la comparación de los niveles relativos de la expresión entre todas las muestras experimentales. Los resultados se representaron y se analizaron con software disponible libremente (Eisen, 2000). Como ya se ha anticipado, los análisis revelaron perfiles de la expresión característicos de la proliferación y del estado de los restantes, así como perfiles asociados a localizaciones anatómicas específicas, como el medio germinal, y perfiles asociados a los tipos de malignidad establecidos. No obstante, se hizo un avance significativo al identificar un nuevo perfil de la expresión génica que podría pronosticar la supervivencia tan bien o mejor que los criterios clínicos existentes. En particular, el nuevo perfil identificó correctamente a un subgrupo de pacientes con alto nesgo de mortandad prematura, incluso entre pacientes clasificados previamente por criterios clínicos de ser de bajo riesgo. Futuros avances en el diagnostico, la clasificación y el pronostico
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
esperan a que los métodos basados en las microseries los descubran en un futuro cercano. Como se ha enfatizado antes, el lector debería tomar buena nota de que lo que hace que esto sea posible no es el mero perfeccionamiento de los equipos, sino el desarrollo de más estrategias analíticas sofisticadas, para estar al día con los datos más complejos generados por esos equipos (Bassett. 1999).
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CAPiTUlO 6 1
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T E C N O L O G I A S D E LA H I B R I D A C I Ö N E N SERIE
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C A P Í T U L O
62
Aplicaciones de la citogenètica en la patología moderna Constance K. Stein, Ph.D.
DEFINICIONES
1304
RESUMEN
1331
CITOGENÈTICA
1305
BIBLIOGRAFÍA
1331
Cromosomas Anomalías cromosómicas CLÍNICA
1321
Aplicaciones clínicas Desórdenes citogenéticos Otros fenómenos citogenéticos
La genética, en la medicina actual, es uno de los campos que progresa más rápidamente. La investigación está identificando continuamente nuevos genes y mutaciones asociados con las enfermedades. Las nuevas técnicas de laboratorio en genética molecular y citogenètica proporcionan métodos mejores para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Las perspectivas de la terapia gènica y las posibilidades de curar algunas enfermedades genéticas son prometedoras. A la genética se la define, en general, como el estudio científico de la herencia, pero en la medicina de los laboratorios clínicos el interés se centra en dos subespecialídades en este campo: 1 ) la genética humana, el estudio de la herencia en el hombre, y 2) la genética médica, el estudio de las variaciones genéticas humanas significativas para la medicina. La genética médica se puede subdividír en cinco grupos, dos campos especialmente clínicos (genética clínica y genética consultiva) y tres ciencias de laboratorio (citogenètica, genética molecular y genética bioquímica). Este capítulo desarrolla con mayor intensidad la citogenètica, y en el Capitulo 66 se exponen los diagnósticos moleculares.
Mutación: Es un cambio hereditario permanente en la secuencia del ADN genómico. Éste se puede manifestar tanto en los niveles citogénicos como en los moleculares. No todas las mutaciones son sucesos negativos, Muchas de ellas son benignas (p. ej.. el color de ojos azul) y algunas tienen efectos positivos (p. ej., el carácter de célula falciforme en países con un riesgo significativo de malaria). Un individuo que tenga una mutación constitucional (es decir, una mutación presente en cada célula del cuerpo) puede transmitir la mutación a toda su progenie por la transmisión de línea germinal. En algunos casos, de manera notable en el cáncer, puede surgir una mutación adquirida en una sola célula somática. Esta mutación estará limitada al clon compuesto de productos mitóticos de la célula original mulante y no será trasmitida a la progenie del individuo. En casos raros de mosaicismo gonadal puede aparecer en las gónadas una mutación adquirida de novo, dando como resultado una población mixta de gametos normales y mutantes. La progenie que recibe la nueva mutación puede presentar un fenotipo que no está presente en ninguno de los progenitores.
Cariotipo: Es la constitución del cromosoma de un individuo. También es una figura que muestra la disposición de los cromosomas emparejados de una célula en una secuencia estándar. DEFINICIONES Diploide: Es la presencia de dos copias de cada cromosoma único por cada célula. En el hombre los cromosomas están dispuestos en pares y el númeComo en todas las áreas de la medicina, la genética, para su comunicaro diploide (2N) es 46. ción, depende del uso apropiado de los términos específicos. Las siguientes Haploide: Es una copia de cada cromosoma único. En el hombre los gamedefiniciones proporcionan el vocabulario básico para este campo. tos son haploides (N = 23). Gen: Es una secuencia de nucleótidos que representan una unidad funcional Homocigoto: Ambos alelos están en un locus al mismo tiempo. (En el sistema ABO, un complemento AA representa la homocigosidad). de la herencia; una región de ADN que codifica para un producto, bien un Heterocigoto: Los dos alelos en un locus son diferentes. (En el sistema ARN o bien una proteína. ABO, un complemento AO representa la heterocigosidad.) Cromosoma: Es una estructura altamente ordenada compuesta de ADN y Hemicigoto: La presencia de un cromosoma solamente o de un segmento proteínas que porta la información genética. En el hombre hay 46 cromodel cromosoma en vez de los dos normales; se aplica a los varones y somas ordenados en pares. machos con un cromosoma X solo. Autosoma: Son todos los cromosomas excepto los cromosomas X e Y, a los Genotipo: Es la constitución genética de un individuo o de un organismo (es que se les denomina cromosomas sexuales. decir, qué alelos están presentes). (En el sistema ABO, AA, AO. BB. BO, Cromosomas homólogos: Son los cromosomas hermanos, miembros de AB y 00 son genotipos.) un par de cromosomas en el que uno es heredado de la madre y el otro del Fenotipo: Es la apariencia de un individuo como resultado de la interacción padre. del genotipo y del medio ambiente. (En el sistema ABO. los tipos de sanLocus: Es la posición de un gen en un cromosoma. gre A, B y 0 representan la expresión genotípica de los alelos de un indiviAlelo: Es una forma alternativa de un gen que ocupa el mismo locus. Un alelo duo determinado.) puede ser el resultado de una mutación. Hay un máximo de dos alelos por Alelo dominante: Es un alelo que es expresado cuando está presente en una cada complemento del cromosoma diploide (un alelo por cromosoma), pero sola dosis (esto es, que "domina" a los otros alelos presentes). (En el sistedentro de una población pueden existir múltiples alelos.
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ma ABO, A es domíname sobre 0, igual que un genotipo AO tiene como resultado a un fenotipo con el tipo de sangre A. De forma similar, la presencia de pigmento [T] es dominante de la ausencia de pigmento [t] [esto es. el albinismo], de manera que Tt tiene como resultado la pigmentación.) Alelo recesivo: Es un alelo que está expresado solamente cuando es homocigoto en un organismo diploíde. (En el sistema ABO, el grupo de sangre O sólo se ve con un genotipo 00: O es recesivo de A y de B. Igualmente, el albinismo [t] es recesivo de la pigmentación [T], y un fenotipo albino sólo aparece con un genotipo tt.) Alelos codominantes: Son los alelos que muestran no dominación o que no son recesivos el uno al otro en un organismo diploide, pero que cuando están presentes juntos, ambos están expresados completamente. (En el sistema ABO. A y B son codominantes, igual que un genotipo AB expresa antígenos A y B.) Clasificación independiente: Es la clasificación azarosa de los cromosomas (paternos y matemos) en los gametos: la oportunidad de heredar un cromosoma determinado de uno de los progenitores es del 50%. Enlace: Es la presencia de dos o más genes en el mismo cromosoma que tienden a ser heredados juntos. Sobrecruzamiento: Es el intercambio físico de material genético entre los cromosomas homólogos. Recombinación: Es la generación de combinaciones alélicas nuevas en los cromosomas, normalmente por entrecruzamiento. Mitosís: Es la división somática de la célula en la que se replica el ADN y se distribuye, uniformemente, a dos células hijas iguales. Meiosis: Es la división celular en las gónadas que produce los gametos. Una sola replicación del ADN es seguida de dos divisiones celulares, lo que reduce el contenido total de ADN de una célula de 2N a N. La recombinación se produce para incrementar la diversidad genética dentro de una población. No disyunción: Es el error de los cromosomas o de las cromátidas para separarse hacia los polos opuestos en la división celular. Normalmente da como resultado un cromosoma de más o uno de menos en una célula.
CITOGENÈTICA A la citogenética se la define como la ciencia que combina los métodos y los hallazgos de la citología y de la genética para investigar la herencia a nivel celular. Esto incluye la evaluación cuidadosa de los cromosomas, estructuras compuestas de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble hélice que están unidas con proteínas histonas y no histonas. Sólo 16 años después de que Mendel estableciera que la genética era un nuevo campo de la ciencia, Walther Fleming, en 1882. lúe el primero en observar cromosomas en células tumorales, haciendo de la citogenética uno de los campos más antiguos de la genética. Poco después de comenzar el siglo xx se estableció la importancia de los cromosomas sexuales, y en 1959 se utilizaron por primera vez los estudios citogenéticos en las investigaciones de los laboratorios clínicos. La capacidad para detectar cambios en la estructura de los cromosomas, y de correlacionarlos directamente con la enfermedad, y las anomalías fenotipicas en los individuos demostró que era un gran avance para los diagnósticos clínicos. Pasado el tiempo, se han acrecentado el número y los tipos de los estudios, y muchos de los análisis que se han hecho se han convertido en el "estándar oro" para los diagnósticos. En la actualidad, cuando cada vez se clonan mayor número de genes de enfermedades, el énfasis en el desarrollo de análisis moleculares de mutación directa es cada vez mayor (véase Cap. 66). Todos estos estudios funcionan bien cuando el diagnóstico se sabe o se sospecha, pero en ausencia de un desorden conocido, la citogenética aún conserva su posición como el único análisis de laboratorio clínico que es capaz, con un solo análisis, de examinar la constitución celular genética de un individuo. En consecuencia, las aplicaciones clínicas de los análisis citogénicos se pueden encontrar en todos los campos y en todas las edades, desde el diagnóstico prenatal a la evaluación del cáncer.
Cromosomas Para comprender las anomalías lo primero es comprender en qué consiste una serie de cromosomas "normales". El complemento del cromosoma huma-
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no incluye 46 cromosomas ordenados en 23 pares (Fig. 62-1). Uno de los miembros de cada par se hereda de la madre y el otro del padre. Se sabe que 22 pares son autosomas y se presentan como homólogos los unos de los otros (es decir, que no se pueden distinguir unos de otros). El par 23. incluye a los cromosomas sexuales, que son homólogos en las mujeres o hembras que tienen dos cromosomas X y no homólogos (estructuralmente diferentes) en los hombres o machos que tienen un cromosoma X y uno Y (Fig. 62-1). Los genes son codificados en el ADN y están ordenados a lo largo de la longitud de los cromosomas. La longitud absoluta de los cromosomas variará durante el ciclo celular, pero su mayor condensación se alcanza en la metafase, que es cuando se puede observar a los cromosomas con más facilidad. Debido a esto, los cromosomas de la metafase son la base de la mayoria de los estudios citogenéticos. e
Estructura
del cromosoma
Un solo cromosoma en metafase está compuesto de dos dobles hélices de ADN. A cada doble hélice se la denomina cromátida: las dos cromátidas se mantienen unidas por una región hasta ahora no replicada de ADN que se conoce como centrómero o constricción primaria. El centrómero actúa como una señal y divide al cromosoma en dos regiones diferentes conocidas como brazos (Fig. 62-2A). Al brazo más corto se le designa brazo p y al más largo brazo q. Cuando el centrómero está casi equidistante de ambos extremos, se dice que el cromosoma es metacéntrico, pero si está más cerca de un extremo que del otro, el cromosoma es submetacéntrico (Fig. 62-26). Cmco pares de cromosomas acrocéntricos modifican los brazos cortos con tallos que sólo contienen copias múltiples de genes de ARNr cubiertos por una caperuza producida por un telómero modificado, denominado satélite (Fig. 62-2A). El extremo de un cromosoma es el telómero. Se sabe que estas regiones están compuestas de ADN repetido en tándem con la secuencia (TTAGGG)„ que funciona para estabilizar a los cromosomas. Los mecanismos de la replicación del ADN son de tal forma que no todo el ADN telómero se puede replicar en cada división, por lo que con el paso del tiempo se produce un acortamiento de los telómeros. Se da por sentado que la pérdida total de los telómeros lleva a un aumento de las aberraciones cromosómicas, que, en parte, pueden ser las responsables del proceso de enveiecimiento humano (Harley. 1990; Wright, 1992: de Lange. 1998).
Cultivo
celular
Para hacer un análisis cromosómico, las células de un paciente se deben cultivar in vitroa fin de obtener células en metafase. Como promedio, las células humanas se dividen una vez cada 24 horas, de forma que sólo un 1% de la población celular se divide en un tiempo determinado. Sin embargo, algunas células, como los linfocitos en un individuo sano y normal, no se dividen en absoluto, por lo que se han desarrollado técnicas especiales de cultivo para estimular la división de las células y así aumentar la producción de células en metafase. Especímenes. Se puede utilizar, prácticamente, cualquier muestra de células, siempre que contenga células viables y nucleadas. Sin embargo, se puede favorecer a ciertos tipos de células, que son fáciles de obtener y de cultivar, por medio de preparaciones cromosómicas. La muestra preferida para hacer estudios citogénicos sistemáticos de niños y de adultos es la sangre periférica heparinizada. Dado que muchos otros análisis de laboratorio dependen de estas muestras, el obtener una alícuota para los estudios citogénicos en general es fácil de organizar y no resulta doloroso para el paciente. En los desórdenes hematológicos, las muestras de médula ósea son las que proporcionan mejores resultados, ya que son el foco del proceso de la enfermedad. Una fuente adecuada de células en metafase la proporcionan los cultivos de fibroblastos obtenidos de una biopsia de piel o de piel extraída con un sacabocados. No se utilizan, habitualmente. los tejidos del hígado, del riñon, de los pulmones y de los músculos, debido a la naturaleza invasora de los métodos utilizados para la extracción de estas muestras; sin embargo, estos tejidos proporcionan, con frecuencia, una fuente excelente de material si se obtienen como resultado de una pérdida fetal o poco después de la muerte, durante la autopsia. Las muestras de productos de la concepción pueden con-
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Figura 62-1. Cariotipo del complemento de cromosoma humano de un hombre: los 46 cromosomas están ordenados en pares. Obsérvese el par no homólogo de los cromosomas sexuales con un cromosoma X y un cromosoma Y.
Figura 62-2. A, Esquema de la anatomía del cromosoma de metalase que muestra marcas importantes. Se contrasta la forma del metacéntrico con la del acrocéntrico, que tiene la estructura del brazo corto modificada y está integrada por tallos y satélites. En todos los casos, el brazo corto, o brazo p, está orientado hacia arriba y el brazo largo, o brazo q, está orientado hacia abajo. 8, La posición relativa del centrómero puede variar, originando cromosomas metacéntricos. submetacéntricos y acrocéntricos.
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tener una mezcla de tejidos fetales y maternales, y por esta causa se requiere un cuidado extra al establecer el cultivo (De Martinville. 1984). Para los análisis prenatales, la muestra más corriente es el líquido amniótico. que se consigue por medio de una amniocentesis. Este procedimiento se ejecuta con una guía ecográfica para evitar al feto cuando el médico introduce una aguja, a través del abdomen y del útero de la madre, en la bolsa amniótica. Esto se hace, generalmente, a las 16 ó 18 semanas de gestación, en ese momento se pueden extraer entre 20 mi y 30 mi de fluido amniótico (orina fetal) sin riesgo para el feto. Las células presentes en la muestra son derivadas del feto y proporcionan material tanto para el análisis citogenético como para el análisis genético molecular. El liquido contiene o-letoproteina (AFP), así como otras proteínas y enzimas que forman el sustrato para otros análisis prenatales (véase Cap. 22). El riesgo de pérdida fetal debido a la ammocentesis es de aproximadamente un 0,5%. Otro procedimiento prenatal es utilizar una muestra de vellosidad conónica (CVS), que proporciona el tejido de la placenta en desanollo (vellosidades cortónicas) (Blakemore, 1988; Rhoads. 1989) El procedimiento transabdominal ó transvagmal se efectúa a las 10 ó 14 semanas de gestación y tiene un riesgo de pérdida fetal de, aproximadamente, 1 entre 100. Si no se extrae líquido amniótico. no se pueden hacer análisis relacionados o de AFP, aunque es posible hacer análisis estándar citogénicos. bioquímicos y moleculares. El resultado de una muestra de sangre umbilical percutánea (MSUP) o cordocentesis se convierte en un espécimen de sangre fetal que puede ser utilizado para hacer un rápido cariotipo o para estudios moleculares. Este procedimiento se efectúa en fases de gestación más tardías (>20 semanas) y conlleva un riesgo mayor de pérdida fetal (del 2% al 5%). Todas las muestras clínicas para los análisis citogénicos se deben recoger de la forma más estéril posible. La presencia de hongos o bacterias harán peligrar, muy gravemente, el estudio, debido a que las células procariólicas crecerán demasiado y dejarán fuera de combate a cualquier célula humana presente. Para maximizar el número de células viables, las muestras deben ser llevadas al laboratorio tan pronto como sea posible después de ser recogidas. La sangre, la médula ósea, el liquido amniótico y la vellosidad coriónica se deben mantener a la temperatura del lugar donde se vayan a analizar, mientras que el tejido sólido se transporta sobre hielo húmedo. Esta diferencia de temperatura en el transporte se debe a las condiciones innatas de la muestra. Las células de la sangre, de la médula ósea y del líquido amniótico se comportan como células individuales en un sustrato liquido, y la integridad de la muestra no se pone en peligro siempre que se mantenga esta relación a una temperatura cercana a la corporal. Sin embargo, la obtención de tejidos necesita células para ser extraídas del cuerpo, dejando a las células rotas o agonizantes en la periferia de la muestra. La liberación de enzimas lisosómicas facilita la degradación de las células muertas y bajo condiciones adecuadas atacarán a las células vivas contiguas. Si la temperatura se baja a unos 4"C, se inhibirá la actividad de las enzimas y así se mantiene la viabilidad de la muestra. Técnicas de cultivo celular. Dependiendo del tipo de célula, se pueden utilizar técnicas de cultivo, bien de suspensión (dotando) o bien de monocapa (fijadas a una superficie). Las células sanguíneas y las de médula ósea se cultivan en suspensión y se alicuotan directamente dentro de un medio de cultivo apropiado. Las de médula ósea se cultivan, normalmente, durante 24 a 48 horas, mientras que los linfocitos. para obtener un resultado máximo, necesitan estar en cultivo tres o cuatro días. Además, dado que normalmente los linfocitos no se dividen en cultivo, tienen que ser inducidos mediante la utilización de un mitógeno. normalmente la fitohemaglutinina (PHA). de esta manera se pueden recoger después las células de la metafase resultantes por medio de un inhibidor mitótico, como colcemida. Las células del líquido amniótico y el tejido sólido se cultivan in silu como una monocapa. Primero se disgregan los tejidos y VC utilizando un tratamiento de colagenasa suave y a continuación se esparcen las células individuales sobre cubres de cristal y se cubren con medios de cultivo. En las muestras de líquido amniótico, las células, antes de ser colocadas en placas, deben ser disociadas del líquido por medio de la centrifugación, y se las deja para que formen colonias in silu. Los tiempos normales de cultivo son de 5 a 10 días para el VC y los amniocitos y hasta de dos semanas para los cultivos de tejidos sólidos. Una vez que se ha conseguido el máximo crecimiento, se recolectan todos los tipos de células utilizando técnicas similares. Las células son agrandadas
Figura 62-3. Diseminación cromosómica de melafase. Los cromosomas de una sola célula según se ven en un portaobjelos de microscopio.
hípotónicamente (hasta el punto de que la membrana de la célula se eslire, pero no se rompe) y luego son fijadas. Al soplar suavemente el cubre que contiene células lijadas de los cultivos in silu. se rompe la membrana de la célula y los cromosomas de la melafase se dispersan. Aunque en la mayoría de los laboratorios todavía se efectúan estos pasos manualmente, se ha desarrollado un recolector robótico automatizado que puede procesar gran cantidad de cultivos con bastante eficiencia. En los cultivos de suspensión, las células fijadas se deben colocar, mediante un goteo, sobre una placa de microscopio limpia, la cual, mecánicamente, rompe las membranas y deja a los cromosomas ligeramente separados los unos de los otros, pero en una región diferente ocupada por una sola célula (Fig. 62-3). Las placas, después de secarlas con un secador, están listas para la coloración. En algunos casos se mejora la calidad de la coloración envejeciendo las células a 65 C durante 30 a 60 minutos.
Coloración Los cromosomas se tiñen habitualmente utilizando Giemsa, un tinte de carga positiva que se une a una molécula de ADN de carga negativa. La tripsinización suave de los cromosomas antes de la tinción aparentemente debilita las interacciones de la proteina con el ADN, lo que da como resultado un patrón definido de regiones alternativamente claras y oscuras, al que se le denomina patrón de bandas (bandeo G para bandeo Giemsa) (Yunis. 1973: Burkholder. 1977; Holmquíst. 1982). Cada par de cromosomas tiene un patrón de bandas único que está representado esquemáticamente como un ideograma (ISCN. 1995) (Fig. 62-4), y que se utiliza para identificar a cada cromosoma y a las sub-regiones cromosómicas. Si bien el bandeo G es el adecuado en la mayoría de las situaciones, se puede obtener información adicional de la estructura del cromosoma utilizando otras tecnologías especiales de tinción. Las coloraciones especiales más corrientes son el bandeo Q. el bandeo C y el bandeo R. En un principio se utilizó el bandeo Q. o tinción de fluorescencia de guinacrina, para hacer cariotipos ordinarios (Comings. 1975). Sin embargo, y debido a que la fluorescencia es transitoria, ahora ha sido reemplazado por el bandeo G, que admite una preparación de coloración permanente. En la actualidad el bandeo O se aplica principalmente para lograr una identificación rápida del cromosoma Y. El extremo distal del brazo largo del cromosoma Y esta compuesto de heterocromatina y es la región fluorescente más brillante en una metalase humana (Fig. 62-5A). En los casos de genitales ambiguos, una preparación rápida de bandeo Q puede, normalmente, contestar a la pregunta de si hay presencia o ausencia
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Figura 62-4. Ejemplos de ideogramas de los cromosomas 1.7,14 e Y que muestran el patrón estándar de las bandas claras y de las bandas oscuras.
del cromosoma Y en el paciente. El bandeo C, constitutivo o bandeo de centrómero. se utiliza para evaluar la heterocromatina constitutiva o para determinar si un cromosoma tiene dos centrómeros (dicéntrico). Normalmente el centrómero aparece como un solo punto oscuro en un cromosoma teñido en su totalidad con una coloración clara (Holmquist, 1979) En el caso de un cromosoma dicéntrico, la presencia de dos regiones oscuras permitirá identificar con claridad a los dos centrómeros (Fig. 62-5S). El bandeo R, o bandeo inverso, presenta a los cromosomas con el mismo patrón de bandeo que el que hemos visto en el bandeo G, pero las bandas claras y las oscuras están invertidas, de ahí su nombre. Debido a que los telómeros de los cromosomas tienen tendencia a ser pequeños, bandas de tinción claras, si se utiliza un bandeo G estándar puede que no sea fácil detectar una deleción. Sin embargo, en el bandeo R los telómeros se colorearían como bandas oscuras y su ausencia, como resultado de una deleción, es más obvia.
Análisis del carie-tipo Para efectuar un análisis citogenético es esencial poder identilicar cada cromosoma, rápida y exactamente, y determinar cuándo se presentan anomalías cromosómicas. El primer paso que hay que dar es contar el número de cromosomas presentes en la célula que se está evaluando. El número de centrómeros activos define el número total de cromosomas, que serán 46 en una célula diploide humana normal. El que haya cromosomas de más o de menos indica una anomalía numérica potencial. El cultivo in vitro puede dar como resultado artefactos de cultivo, por eso no se utiliza una sola célula para definir el complemento de cromosomas de un paciente, asi que para un estudio clinico típico se necesitan analizar de 15 a 20 células: en los casos de mosaicismo o para otras situaciones especiales tal vez haya que evaluar de 10 a 30 células adicionales. Los cromosomas individuales se identifican basándose en el tamaño total de cada cromosoma, en la posición de su centrómero y en el patrón de bandeo. En este momento se debería detectar cualquier variación en la estructu-
ra del cromosoma. Para cumplir con los objetivos diagnósticos clínicos, en casi todas las circunstancias es suficiente el bandeo G de los cromosomas metafásicos. Sin embargo, quizá no se puedan resolver algunos desórdenes que están asociados con deleciones muy pequeñas del material cromosómico a este nivel. En estas situaciones se utilizan análisis de alta resolución. Las células se cultivan de manera que se puedan recolectar en una etapa ligeramente más temprana de la división celular, la prometafase. En este momento de la división celular, los cromosomas están menos condensados. haciendo que sea más fácil detectar la presencia de pequeñas anomalías. El análisis lo ejecuta un leenólogo examinando las células a través del microscopio, y una vez que se ha completado el estudio se hace una determinación de si el complemento de cromosomas es "normal" o "anormal". Para la documentación se fotografían las células de la metafase utilizando una cámara de 35 mm montada en un microscopio. Luego se revela la película, se hacen las copias, se recortan los cromosomas y se pegan en una hoja de papel con cinta adhesiva o con pegamento. Los pares homólogos están organizados, de mayor a menor, en siete grupos a los que se les designan letras de la A la G. más el par de cromosomas sexuales. Siguiendo la costumbre, el brazo más corto, denominado brazo p, está orientado hacia arriba y el brazo más largo, o brazo q, está orientado hacia abajo. El producto final es una ilustración de los cromosomas de una célula especifica y se la conoce como cariotipo (Fig. 62-1).
Imagen asistida por ordenador Los cariotipos que proceden de fotografías dan una imagen de alta resolución, pero requieren tiempo y esfuerzos significativos. En los últimos años los ordenadores han tenido un gran impacto en los laboratorios clínicos, ya que permiten la automatización de muchas tareas tediosas y se han hecho un hueco en los laboratorios de citogenética bajo el formato de sistemas para hacer cariotipos asistidos por ordenador. En lugar de una cámara de 35 mm, se monta en el microscopio una videocámara DCA (dispositivo de carga acó-
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piada). Utilizando un software especialmente diseñado, se capta la imagen de una célula en metafase usando un captador de imágenes estándar, se dígitaliza y aparece en el monitor del ordenador. Llegados a este punto, el software permite modificar la imagen, aclarándola, oscureciéndola o cambiando el contraste, de modo que se pueden hacer múltiples modificaciones de los cromosomas, incluso enderezarlos e importar cromosomas de otros campos. Después se puede hacer un cariotipo, utilizando una sub-rutina de reconocimiento del patrón que reconocerá los cromosomas, automáticamente, y los emplazará en sus lugares adecuados, en forma de cariotipo. La precisión de este procedimiento puede variar entre un 10% y un 85%, dependiendo del software y de la calidad de la imagen. Después de que el ordenador haya capturado a su "mejor huésped", las correcciones adecuadas las debe hacer un tecnólogo citogenético especializado. Una vez que los cromosomas están correctamente posicionados se pueden hacer las amplificaciones cosméticas adicionales para eliminar los bordes rasgados o residuos de posos. Luego se imprime la versión final del cariotipo en una impresora de alta resolución. Aunque la calidad total no es tan alta como la de una presentación fotográfica, la utilización del sistema por ordenador conlleva un enorme ahorro de tiempo. Un tecnólogo especializado puede tardar en hacer un cariotipo ordinario, desde la captura hasta la impresión, de 15 a 20 minutos por término medio. Otra gran ventaja de los sistemas asistidos por ordenador se encuentra en la microscopía de fluorescencia.
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Hibridación in situ fluorescente Los tipos clásicos de coloración citogenética que se han descrito son el resultado de los tintes que se unen al ADN o a las proteínas de un cromosoma y que permiten su visualización por medio de la microscopía óptica. La hibridación in situ. que es la combinación de la biología molecular y de la citogenética, abrió otra puerta que hizo posible las investigaciones de las anomalías cromosómicas posteriores. En éstas, en lugar de un tinte, es una sonda molecular (esto es, un fragmento de ADN) la que se une al cromosoma. En los primeros estudios se marcó a la sonda con una mezcla radiactiva (normalmente tritio), de manera que, después de su exposición a un película de rayos X durante un tiempo de 5 a 10 días, se pudo detectar un patrón de granos de plata que identificaban la localización cromosómica de la sonda. Esta técnica facilitó el poder hacer el mapa génico por medio de la identificación de los locus del gen (Trask. 1991). La autorradiografía tuvo su utilidad, pero sólo se podía utilizar una sonda cada vez. necesitaba una cantidad de tiempo significativa y había un grado de dispersión de los granos de plata que requería un análisis estadístico de los datos obtenidos. A mediados de los años 80 (del siglo xx), se desarrolló una variante de esta técnica que ha demostrado ser extremadamente útil en las aplicaciones clínicas. Esta nueva tecnología, la hibridación in situ fluorescente (HISF), es más rápida, más específica y permite la utilización de múltiples sondas en un solo procedimiento de hibridación. Además, en vez de sondas marcadas con radiactividad, se utiliza una tinción fluorescente que se visualiza a través de la microscopía de fluorescencia (Ledbetter, 1989). A pesar de que la HISF se puede utilizar para hacer mapas de genes, la meta, en las aplicaciones clínicas, es determinar si hay un gen o una mutación específica, por eso la sonda molecular tiene que estar bien caracterizada y tiene que ser específica para el locus en cuestión. Hay tres tipos básicos de sondas. La sonda de secuencia única aislada de un gen causante de la enfermedad clonado y que se utiliza para identificar la presencia o ausencia de ese gen (Cheríf, 1989; Lindsay, 1993). Las sondas de coloración del cromosoma son, en realidad, un cóctel de muchos fragmentos de ADN únicos recogidos a lo largo de toda la longitud de un cromosoma, de modo que en la hibridación siguiente todo el cromosoma emite luz fluorescente (Fig. 62-6A). Las sondas de secuencias repetitivas son aisladas de las regiones de telómeros o de centrómeros. Las sondas de centrómeros se utilizan, generalmente, para la enumeración de los cromosomas (es decir, para detectar el aumento o la pérdida de cromosomas específicos) (Figs. 62-66 y C) (Lichter, 1990). Las sondas de telómeros se utilizan, a menudo, para caracterizar los reordenamientos crípticos (esto es, para determinar si ambos telómeros de un cromosoma están presentes y localizados en el cromosoma correcto o si se ha producido una deleción o reordenamiento). Técnica HISF. La HISF combina los métodos de la biología molecular y de la citogenética, como en la hibridación in situ original. Las células se cultivan y se recolectan, y se preparan las placas exactamente igual que para un estudio citogenético clásico. Luego se desnaturaliza el ADN de las placas y se deja que una sonda molecular de una sola hebra marcada con fluorescencia hibride al ADN cromosómico. utilizando una temperatura de anillamiento que favorece la hibridación de las regiones homologas del ADN (Fig. 62-7A). Después de un periodo de hibridación adecuado, se eliminan los restos de la sonda por medio del lavado y al ADN no hibridado se le aplica una contracoloración con otro fluorocromo para poder visualizar el complemento de cromosoma en su totalidad. La evaluación de la célula se hace utilizando un microscopio fluorescente con la luz de una bombilla de mercurio de 100 W combinado con juegos de filtros excitadores apropiados. En un microscopio fluorescente típico sólo se pueden visualizar tres colores como máximo, debido a las limitaciones ópticas de los filtros de cristal. Se puede utilizar una cámara de 35 mm unida al microscopio para la documentación del estudio. Sin embargo, si se utiliza un sistema asistido por ordenador para obtener las imágenes fluorescentes, se obtienen resultados muy superiores. Además, los paquetes de software adecuados permiten la amplificación de las señales débiles y la nitidez de la imagen.
Figura 62-5. A. Metalase de bandeo-0 que muestra la fluorescencia brillante del cromosoma Y (flecha). 6, Cromosomas de bandeo-C que muestran a los centrómeros teñidos de oscuro. Se detectó un cromosoma dicéntrico con dos bandas oscuras (dos flechas).
Uno de los elementos de la HISF más críticos es la elección de una sonda o sondas específicas, ya que ayudarán a dar respuesta a las preguntas clínicas. Por ejemplo, una de las aplicaciones clínicas de la HISF más útiles es la detección de microdeleciones que son demasiado pequeñas para poder ser vistas utilizando la citogenética clásica (Figs. 62-76 a D). El gen debe ser conocido y la sonda utilizada debe ser homologa a la región del gen que es eli-
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minado, la región critica. La hibridación con la sonda deberia aparecer como una señal fluorescente sólo en el locus diana. Si aparece una señal, es que está presente el ADN complementario a la sonda, por tanto no hay deleción. Sin embargo, la ausencia de la señal indica que existe la deleción (esto es, no hay secuencia de ADN presente en el cromosoma que es complementario a la sonda, por tanto la hibridación no puede producirse). Un individuo no afectado deberia tener dos señales por célula en cada gen autosómico, una señal en cada cromosoma del par (Fig. 62-8A). Un individuo afectado por una deleción deberia tener una sola señal por célula, mostrando un cromosoma normal y otro delecionado (Fig. 62-86).
dor para los cromosomas de interés (Fig. 62-70). Se puede hacer el estudio en células en metalase, asi como en las de mterfaz. si se utiliza un sistema de color dual. Las sondas de coloración de cromosomas son muy útiles para identificar reordenamientos complejos o cromosomas marcadores. Si un paciente tiene un cromosoma anormal con material extra de origen desconocido, se podría utilizar la tinción del cromosoma para identificar la fuente del ADN extra. Esto puede ayudar en el diagnóstico o en el pronóstico del individuo. En el caso de un paciente con 46 cromosomas, incluyendo un cromosoma X y un cromosoma marcador no identificado pequeño, será importante determinar si el origen del marcador es un cromosoma X o uno Y. Esto se puede hacer utilizando tintes de cromosomas en los cromosomas X y en los Y marcados con lluorocromos diferentes.
Uno de los problemas de los análisis de deleción es que lee la ausencia de señal como una indicación positiva de la deleción. El fracaso de la hibridación también puede tener como resultado la ausencia de la señal. Para eliminar esto como fuente de errores, se deben evaluar 20 células como minimo y todas las células deben concordar en el cómputo de la señal. Si se sospecha de que existe mosaicismo, se deben examinar células adicionales. Además, las sondas de secuencia única se utilizan actualmente en combinación con una sonda control (Fig. 62-7C). La segunda sonda se localiza en el mismo brazo del cromosoma que el locus de deleción. Se puede marcar con el mismo lluorocromo que a la sonda de locus de deleción, pero se ha visto que resulta más fácil interpretar los resultados de la hibridación si se marca a la sonda de control del sitio con un íluorocromo de color diferente.
Las sondas HISF proporcionan mucha información cuando se evalúan en las células en metalase, donde es posible identificar al cromosoma especifico al que híbrida la sonda. Sin embargo, en algunas preparaciones celulares quizás estén presentes muy pocas células en metalase, y en estos casos se puede obtener información con sondas de secuencia única o de secuencia repetida en los núcleos de inlerfaz. Pero aquí aumentan los problemas técnicos, debidos a la pérdida azarosa de la señal, a las señales extra y a las señales solapadas en las células, asi que se deben contar células adicionales (un total de 50 a 200) para obtener un resultado estadístico significativo.
Se deben ver dos señales de control claras en todas las células evaluadas y luego se pueden registrar las señales que se corresponden con el locus de enfermedad. Esto proporciona un control de hibridación, asi como un marca-
HISF multicolor. Una de las ventajas que tiene la HISF sobre la vieja hibridación in silu es su capacidad de hibridar múltiples sondas a una sola
Figura 62-6. A. Sonda de tinción del cromosoma completo que hace resaltar a los dos cromosomas X en una célula de mujer B y C. Sonda de centrómero de secuencia repetida para el cromosoma 21. B. A la izquierda se ve la tnsomía 21 en un núcleo de mterfaz y a la derecha en una metalase. C, Complemento normal de dos copas del cromosoma 21 visto en mterfaz (derecha e izquierda) y en una melafase (centro).
CAPÍTUIO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
Figura 62-7. A. Esquema de la tecnología HISF. El ADN derivado de un gen conocido se separa quedando una sola hebra, se marca con una señal fluorescente y luego se le híbrida de vuelta a los cromosomas de una célula en metafase. B.CyD. Dibujos de cromosomas metalásicos fluorescentes con sondas marcadas que hibridan a las dianas (flechas) 6. Señales duales que indican la hibndación de ambos alelos del gen diana. C. El gen diana está señalado en rojo y la sonda de control en verde. Hibridación completa de todos los alelos. D, Hibridación de ambos controles (verde), pero la presencia de un único gen diana solamente indica la deleción de un alelo.
Figura 62-8. Detección medíame HISF de una microdeleción del cromosoma 22 asociada al síndrome DiGeorge y al síndrome velocardiotacial. A. Un individuo "normal" con no deleción muestra la presencia de una señal roja (locus de gen) y de una señal verde (locus de control) en cada cromosoma 22 B. Paciente con una deleción que se visualiza en un cromosoma con una única señal verde solamente. El cromosoma 22 homólogo es "normal", con una señal roía y una señal verde.
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
rojo:amanllo 13
100:0
13
rojo
21
75:25
21
verde
IX
25:75
IX
rosa
Y
5(1:50
Y
blanco
\
(l:l(K)
X
amando
Figura 62-9. HISF multicolor A. Diagrama de tinción real de cinco sondas de combinación. La tabla de la derecha muestra las proporciones de colores relativas para cada sonda utilizada. 8, Diagrama de la imagen obtenida de un ordenador de la misma célula que muestra el color artificial que se le ha asignado (la clave se nuestra en el recuadro a la izquierda de la imagen).
placa y obtener un conocimiento mejor de los reordenamientos de cromosomas (Schrock. 1996; Speicher. 1996). Sin embargo, incluso aqui existen límites. Una imagen fluorescente se produce por la luz de una bombilla de mercurio que pasa a través del filtro estimulador, da en el fluorocromo de la placa y transmite la imagen del color adecuado a la lente del microscopio para su visionado. Cada fluorocromo requiere su propio filtro, por eso. para cada color adicional que se desee conseguir, la luz debe pasar a través de diferentes grosores del cristal. Por tanto, las propiedades ópticas de la luz y del cristal limitan a tres el número de colores que pueden verse. Sin embargo, con el advenimiento de los sistemas asistidos por ordenador, ya es posible distinguir múltiples colores en una sola hibridación El ordenador no "ve" realmente más colores, pero puede detectar, meior que el OJO humano, diferencias sutiles en las tonalidades. Para hacer un examen relativamente sencillo, se utilizan dos fluorocromos, que, mezclados en proporciones variables, dan una gama de colores (Fig. 62-9A). El ordenador registra cada color como una tonalidad diferente de gris y luego asigna un color único a esa tonalidad para su presentación en el monitor (Fig. 62-98). Esa imagen multicolor se puede imprimir después, aunque los colores de la impresión son completamente diferentes a los que en realidad había visto el sistema. A partir de la asignación de un color único por ordenador, se han desarrollado combinaciones de fluorocromos que permiten la detección de cada uno de los 24 cromosomas diferentes (Reíd. 1992a. 1992b; Divane. 1994).
Anomalías cromosómicas Los análisis citogenéticos clínicos se han convertido en una parte importante de la medicina clínica, ya que el descubrimiento de una anomalía cromosómica específica puede explicar un problema físico o una anomalía fenotípica en el paciente y se la puede asociar directamente con el diagnóstico de la enfermedad. El propósito del ensayo clínico es determinar si un individuo tiene un complemento de cromosoma diferente del patrón estándar de 23 pares de cromosomas de morfología conocida. Hay dos categorías básicas de vanaciones detectables a través de la citogenética; 1) numérica y 2) de cambio estructural.
Anomalías
numéricas
En el hombre y en otros mamíferos los cromosomas se producen en pares, por lo que de los 46 cromosomas sólo hay 23 especialmente diferentes. Un conjunto de 23 incluye el número haploide (N) de cromosomas, que es el número de cromosomas en un gameto. En el momento de la fertilización, se unen dos complementos haploides para formar un zigoto con 46 cromosomas, que es el complemento diploide (2N). Los errores en la división pueden dar lugar a complementos de cromosoma que tengan más de 46 cromosomas o menos de esta cantidad. A los múltiplos exactos del conjunto haploide del cromosoma se le denomina euploidia. Y aneuploidia al aumento o a la pérdida de uno o unos cuantos cromosomas Euploidia. La diploidía, que es el estado normal de las células humanas, es una lorma de euploidia. Las euploidías anormales incluyen la triploidía (3N = 69 cromosomas) y a la tetraploidía (4N = 92 cromosomas), que no son com-
patibles con la vida y que se detectan, principalmente, en tejidos procedentes de abortos espontáneos. La triploidía (Fig 62-1OA) puede estar causada por un error en la gametogénesis de una de las divisiones meióticas que da origen a un gameto 2N. el cual, al ser fertilizado por un gameto haploide del otro progenitor, produce un zigoto triploide. Por otro lado, un complemento 3N puede estar derivado de la dispermia (fertilización de un huevo haploide por dos espermatozoides), y esto, generalmente, da como resultado una masa parcial hidatidiforme (véase Cap. 20) La tetraploidía es un acontecimiento posmeiótico y se presenta como una duplicación de un complemento diploide (XXXX o XXYY). que seguramente se debe al error de una escisión de la división mitótica temprana en el zigoto. Aneuploidia. Los errores de no separación que dan como resultado la aneuploidia son más corrientes. En estos casos un solo par de cromosomas no logra separarse correctamente en la división, originando un cromosoma extra o perdiendo un cromosoma por célula. Algunas veces pueden verse involucrados más de un par de cromosomas, pero estos casos son extremadamente raros. Los errores de la no disociación pueden producirse tanto en la meiosís como en la mitosis. La no disociación mitótica temprana en el zigoto puede dar lugar a un individuo con el complemento de cromosoma aberrante en todas las células del cuerpo, pero un error en la división más tardío produce un mosaico (un individuo con dos lineas de células que únicamente se diferencian en un solo cromosoma). Los errores meiósicos producen gametos, bien con un cromosoma extra o bien con uno de menos (Fig. 62-11) (Angelí. 1994). Una vez fertilizados, el primero dará una concepción trisómica al cromosoma no disociado (Fig. 62-1 Ofi) y el ultimo dará una monosomía. Tanto la trisomia como la monosomía pueden producirse en cualquier cromosoma, pero la mayoría de éslas son incompatibles con la vida y se eliminarán de forma espontánea. Por ejemplo, la trisomia 16 es la trisomia que se detecta, más frecuentemente, en los tejidos procedentes de abortos espontáneos, pero no se ha informado de ningún caso en seres nacidos vivos. Las trisomias autosómicas de seres nacidos vivos incluyen los cromosomas 13.18 y 21. Muy raramente se identifican pacientes con un complemento de cromosoma mosaico de trisomías 8. 9 ó 22. Las tnsomías de los cromosomas sexuales son viables y están bien documentadas (vide mira). La única monosomia viable es la del cromosoma X (45,X). Más adelante, en este capitulo se describirán las aneuploidías clínicamente significativas. En los últimos años se ha detectado un efecto secundario de las concepciones aneuploides. Dado que las trisomias y las monosomias son, en gran parte, incompatibles con la vida, se asumió que podrían dar lugar a la pérdida del feto. Pero ahora se sabe que un pequeño fragmento de estas concepciones aneuploides es "rescatado" y sigue adelante para originar niños nacidos vivos. En caso de una monosomía. el rescate se produce por la duplicación del único cromosoma existente, que da como resultado un complemento de cromosoma con isodisomia uniparental para ese cromosoma (dos copias del mismo cromosoma heredado de un progenitor) (Fig. 62-12) (Ledbetter. 1995). Esto está desento en vanos casos publicados, en los que se demuestra que un niño afectado de fibrosis cistica (FC) es homocigoto a la mutación AF508, aunque los análisis moleculares de ambos progenitores revelaron que sólo uno de ellos era el portador de AF508 (Spence, 1988; Voss, 1989). Esto se interpreta como que la
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
concepción fue una monosomia 7 no viable rescatada por la duplicación del cromosoma 7 existente, que por casualidad era el portador de la FC. En el caso de una trisomía también es posible una situación similar. Volvemos a repetir que la mayoría de las tnsomías no son viables, pero si se pierde uno de los tres cromosomas, se restablece una disomía para ese par de cromosomas. En un conjunto de tres cromosomas la pérdida de un solo cromosoma originará, dos de cada tres veces, un complemento con un cromosoma paterno y uno materno Iheterodisomia biparental). La tercera vez. los dos cromosomas restantes son de un solo progenitor (esto es, disomía uniparental). En esta situación, la diferencia está en cuál de las divisiones meióticas se produjo el error. Una disociación en la primera división tendrá como consecuencia una heterodisomía, es decir, dos cromosomas homólogos pero heterocigotos (uno de la abuela y otro del abuelo): sin embargo, un error en la segunda división originará copias duplicadas de un solo cromosoma, esto es, la isodisomia (Figs. 62-11 y 62-13). Podria pensarse que mientras que estén presentes un par de cromosomas no debería importar su origen específico, pero los datos indican, firmemente, que la evidencia es otra. Los problemas de disomía uniparental frente a biparental y de isodisomía frente a heterodisomía tienen una enorme importancia para comprender los fenómenos de impronta, un tema descrito con detalle en el Capitulo 66 (Nichols. 1998; Hall. 1990; Cassidy. 1992: Petersen, 1992).
Anomalías estructurales del cromosoma Los cromosomas no son estructuras estáticas, sino que experimentan recombinaciones tanto en la meiosis como en la mitosis. Este es un proceso natural que es vital para generar variaciones en las especies, por eso está altamente regulado y rara vez se producen errores. Sin embargo, es posible que se produzcan reordenamientos cromosómicos que cambien la estructura de uno o de varios cromosomas. Estas anomalías son bastante variadas y con frecuencia son especificas del paciente. Las reordenaciones pueden ser
A
19
20
21
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1) equilibradas, si todo el material cromosómico está presente y es funcional, pero está ordenado en una conformación diferente, o 2) desequilibradas, si hay pérdida y/o adición de material cromosómico. Las reordenaciones equilibradas son, en general, clínicamente benignas y tienen tendencia a ser trasmitidas de forma estable, aunque pueden aumentar el riego de errores en la meiosis. que originarán desequilibrios cromosómicos en los letos o en los niños nacidos vivos. Los complementos de cromosoma desequilibrados están, generalmente, asociados a un fenotipo clínico anormal que a menudo incluye el retraso en el desarrollo y el retraso mental. La deleción es la pérdida de una parte de un cromosoma y produce la monosomia parcial del cromosoma involucrado (Fig. 62-14). Las deleciones varían en tamaño, desde bastante grandes a muy pequeñas, y pueden ser terminales (Fig. 62-15A). la pérdida de un fragmento del cromosoma que contiene al telómero, o intersticiales (Fig. 62-156), la pérdida de un trozo interno del cromosoma. Las roturas de los cromosomas, sobrecruzamientos desiguales, o los errores de no separación comprendidos en las reordenaciones cromosómicas pueden dar como resultado una deleción. En general, las deleciones mayores originarán anomalías clínicas más graves, debido a que faltan un mayor número de locus genéticos. La duplicación es la presencia de una copia adicional de un segmento del cromosoma, que origina una trisomía parcial en ese cromosoma (Fig. 62-14). Esta anomalía puede ser también terminal o intersticial. Las duplicaciones auténticas parecen ser bastante raras y son, normalmente, esporádicas. Las duplicaciones están generadas por los mismos mecanismos que las deleciones y quizá sean la consecuencia recíproca de estos procesos. Al igual que en las deleciones. cuanto mayor sea el fragmento duplicado del cromosoma, las anomalías clínicas tenderán a ser más graves. La inversión es el cambio de un segmento cromosómico respecto al ordenamiento génico normal y necesita un mínimo de dos roturas en un cromosoma (Fig. 62-14). Las inversiones están clasificadas como 1) paracéntricas,
22
X
T
Figura 62-10. Anomalías cromosómicas numéricas. A. Complemento de cromosoma triploide (3N) con tres copias de cada cromosoma |69,XXY). Esta ilustración continúa en la página siguiente.
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SECCIÓN VII
PATOLOGÍA MOLECULAR
dos roturas que tienen lugar en el mismo lado del cenlrómero (esto es, en el mismo brazo), o 2) pericéntricas, las roturas se producen en lados opuestos del centrómero y la inversión involucra a ambos brazos (Fig. 62-16/4). La mayoría de las inversiones son equilibradas, pero se pueden detectar anomalías clínicas si el cromosoma se rompe dentro de un gen e interrumpe la producción normal de un producto génico necesario. Existe un aumento del riesgo de error meiótico y los portadores de la inversión muestran, frecuentemente, infertilidad o pérdida fetal espontánea temprana debido a los productos cromosómicos desequilibrados. En la meiosis I, los cromosomas homólogos se emparejan y se origina la recombinación. Para que un cromosoma invertido se empareje con su homólogo, se debe formar una estructura conocida como asa de inversión (Fig. 62166). Los gametos no serán impactados negativamente si no se produce la recombinación y los cromosomas se separan normalmente. Sin embargo, el sobrecruzamiento dentro del asa de inversión puede originar producios meióticos desequilibrados. En la inversión paracéntrica, los resultados de la recombinación son, normalmente, no viables, por lo que hay una supresión de la recombinación aparente (es decir, los únicos gametos viables producidos
proceden de cromosomas no recombmados) (Fig, 62-168). En las inversiones pericéntricas es posible que los gametos con duplicación cromosómica y deleción, o ambas, puedan ser derivados. En general, las inversiones pericéntricas mayores pueden originar deficiencias en las duplicaciones más pequeñas y aumentan las probabilidades de que un niño nazca vivo, a pesar de que el desequilibrio cromosómico puede generar anomalías en ese niño. Una vez que se ha identificado al portador de la inversión, se puede utilizar el diagnóstico prenatal para valorar los cromosomas del feto. Las translocaciones son las reordenaciones de dos o más cromosomas no homólogos. Cada cromosoma se rompe una vez y los fragmentos se intercambian de lugar, originando dos (o más) cromosomas derivados (Fig. 6214). Al igual que en las inversiones, la mayoría de las translocaciones son equilibradas, y sólo tienen ramificaciones clínicas cuando se elimina un gen estructural importante. Por otra parte, el peligro principal de una translocación equilibrada es el de que el portador tiene un mayor riesgo de tener hijos vivos con anomalías cromosómicas. En la primera división meiótica los cromosomas translocados adoptan una estructura en forma de cruz para que todos los alelos se empa-
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
No s e p a r a c i ó n - M e i o s i s I
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No separación - Meiosis
II
A Figura 62-11. Los errores de la no separación en la meiosis generan gamelos aneuploides. A, La no separación en la meiosis I produce una copia extra del cromosoma A (heterodisomía) en dos gametos, pero también la falta de cualquier cromosoma A en los dos gametos restantes S. La no separación en la meiosis II origina dos gametos con un complemento de cromosoma normal (abajo a a derecha), la falla de un gameto en el cromosoma A y un gameto con un cromosoma extra duplicado (dos copias del cromosoma A1 producen isodisomia en el cromosoma Al)
No separación
Figura 62-12. Generación de disomía uniparental por los errores de la no separación. A la izquierda del diagrama se puede ver la heterodisomia originada por la reducción de una trisomia a una disomía A la derecha se observa la isodisomia producida por el rescate de la monosomía (la duplicación del único cromosoma que existe).
Heteródísomfa uniparental
Heteródísomfa hiparcntal
Isodisomia uniparental
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Isodisomia uniparental
SECCIÓN V I I
Heterodisomia uniparental
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Heterodisomia biparental
Figura 62-13. Isodisomía Irente a heterodisomia. La conformación nalural de una célula es la heterodisomia biparental: un cromosoma de cada padre. Los errores en la división pueden originar una distribución aberrante de los cromosomas de ambos padres, de forma que se pueden producir dos copias de un cromosoma de uno de los padres (isodisomía uniparental) o dos cromosomas diferentes del mismo padre (heterodisomia uniparental).
rejen adecuadamente (Fig. 62-17). En la anafase los cromosomas altemos se deben segregar juntos para generar gametos equilibrados. Una de cada tres veces los cromosomas no se segregarán de esta manera y producirán gametos desequilibrados. A los errores más corrientes se les denomina segregación adyacente 1 y segregación adyacente 2. A pesar de que ambos patrones producen deficiencias en la duplicación del material cromosómico, la segregación adyacente 2 es más deletérea, ya que está caracterizada por la presencia de centrómeros homólogos en una sola célula. La viabilidad de un feto que recibe un gameto desequilibrado depende de los cromosomas y de los genes involucrados en la translocación y del tamaño de la duplicación o de la deleción. Los cromosomas también pueden seguir un patrón de segregación 3:1, en el cual tres cromosomas se separan en una célula y el resto de los cromosomas en una segunda célula. Esto produce desequilibrios totales del material cromosómico y por lo general es letal in útero. El diagnóstico prenatal es posible una vez que se ha identificado al portador de la translocación. Las translocaciones Robertsonian son una variación de la translocación clásica. Se producen, solamente, entre dos cromosomas acrocéntricos y se presentan como una fusión de los brazos largos al centrómero, cuyo resultado es la pérdida de los dos brazos cortos (Fig. 62-14). La pérdida de los brazos cortos no es deletérea, dado que se localizan múltiples copias de los genes de ARNr en todos los cromosomas acrocéntricos. Una persona portadora de la translocación Robertsonian tiene 45 cromosomas, ya que dos cromosomas se han convertido en uno que es funcional. Estas personas están más expuestas a los errores de la no separación meiótica, cuyo resultado son hijos con una trisomia en uno de los cromosomas reordenados. El ejemplo más corriente de esto es el de una persona con una translocación Robertsonian en los cromosomas 13 y 14 que tiene hijos vivos con trisomia 13 (Fig. 6218). El hijo afectado tendrá 46 cromosomas con dos copias libres de cromosomas 13 y la translocación Robertsonian. Otra reordenación corriente es la translocación Robertsonian 14;21. que podria dar lugar a que su progenie tuviera una trisomia 21. Aunque las translocaciones robertsonianas más corrientes se producen entre cromosomas acrocéntricos no homólogos, es posible que se produzcan estas reordenaciones entre cromosomas homólogos. Por ejemplo, un individuo con una translocación robertsoniana 21;21 tendrá un total de 45 cromosomas, incluida la translocación en la que los dos 21 están unidos al centrómero. Este tipo de reordenación es siempre virtualmente de novo, ya que los portadores de esta anomalía, no es probable que tengan una progenie normal. Los gametos viables incluyen 1) una célula con la translocación Robertsonian (dos copias del cromosoma 21), que si es fertilizada dará lugar a un niño con síndrome de Down, o 2) una célula sin copias del cromosoma 21, que si es fertilizada dará como resultado una monosomía 21, que es incompatible con la vida.
El cromosoma que es el resultado de la división errónea del centrómero durante la división celular que produce dos copias de uno de los brazos del cromosoma pero al que le falta el otro brazo es un isocromosoma (Fig. 6214). Por tanto, el portador de esta reordenación tiene una trisomia en el brazo duplicado y una monosomia en el otro brazo. El ejemplo mejor conocido es el isocromosoma del brazo largo del X. Esta configuración produce una trisomia en el brazo largo y una monosomía en el brazo corto del X, y dado que se necesitan dos copias funcionales del brazo corto del X para que se desarrolle un ser del sexo femenino, esta anomalía cromosómica es coherente con el síndrome de Turner (véase más adelante en Aneuploidias cromosómicas sexuales). Los cromosomas acrocéntricos también pueden formar isocromosomas (duplicación inversa del brazo largo), pero esto produce la homocigosidad de todos los locus presentes, lo que puede llevar a expresar desórdenes recesivos que de otra manera no habrían sido evidentes. Un cromosoma de anillo se produce cuando se pierden los dos telómeros de un cromosoma y el fragmento del cromosoma que queda se hace un circulo para restablecer la estabilidad cromosómica (Figs. 62-14 y 62-19). Desafortunadamente, estas construcciones son, por lo general, inestables, ya que la replicación puede producir círculos entrelazados que llevan a la rotura del cromosoma y a su pérdida cuando los homólogos intentan separarse en la anafase. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, los anillos pueden ser transmitidos de forma estable en lineas celulares. Esto se produce cuando el anillo contiene material genético, que es esencial para la función celular normal. El cromosoma marcador es un cromosoma con un centrómero que se transmite de forma estable a las células hijas, pero no puede ser claramente identificado debido a que es demasiado pequeño o a que el patrón de bandeo es demasiado ambiguo. La HISF ha sido de gran ayuda para determinar el origen de los marcadores. Conclusiones. Las anomalías cromosómicas, tanto las numéricas como las estructurales, que producen un complemento de cromosoma desequilibrado están asociadas a algún tipo de descubrimiento clínico anormal, y el tamaño del desequilibrio es proporcional a la gravedad del problema. La mayoría de los individuos a los que les han diagnosticado una anomalía cromosómica constitucional sólo tienen un único defecto cromosómico. Sin embargo, hay casos raros de personas que tienen dos o más errores cromosómicos. Las anomalías cromosómicas adquiridas (vistas en células cancerígenas) pueden ser más complejas y pueden tener múltiples cambios, numéricos y estructurales, en una sola linea celular.
Nomenclatura Con un campo tan amplio de variaciones cromosómicas. se hizo necesario desarrollar un sistema de clasificación que hiciera posible que el complemento de cromosoma de cada individuo fuera descrito sucintamente y comprendido por todo el mundo. La primera nomenclatura citogenética proporcionó una línea de trabajo y desde entonces se ha ido desarrollando el "idioma". Actualmente, el estándar reconocido es el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética (SINC). y la última revisión ha sido en 1995. La nomenclatura que describe a un complemento de cromosoma se divide en tres partes básicas: 1) el número total de cromosomas, 2) el complemento de cromosoma sexual y 3) cualquier anomalía cromosómica. Estas unidades están enumeradas por orden y separadas por comas. Así, una mujer o hembra aparentemente normal se debe codificar como 46.XX y un hombre o macho será 46.XY. Si hay dos o más líneas presentes, se enumeran secuencialmente separadas por una barra inclinada, y si está presente un clon diploide normal, siempre se le enumera al final (45,X/46,XX). A otros clones se les ordena por tamaño, poniendo primero al clon más grande. El número de células en cada clon se indica por un número encerrado en un paréntesis angular (45,X[15]/47.XXX[3J/46,XX[12]. Para las anomalías numéricas, el número de cromosomas se aumenta o se disminuye para indicar el cambio total, y el cromosoma especifico adquirido o perdido se anota al final. Por ejemplo, la trisomia 13 en una mujer o en una hembra se debe escribir 47,XX,+13 y la monosomía 8 en un hombre o en un macho se debe escribir 45.XY.-8. Sin embargo, para una variación cromosómica sexual que se sabe que es constitucional, no es necesario utilizar el símbolo + o el -, ya que se puede notar directamente el cambio en el complemento de cromosoma. La monosomía X
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
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Figura 62-14. Represeniación esquemálica de las diferentes anomalías cromosómicas estructurales, descritas en el texto, asociadas con ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la conliguración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B. C. D y E indican a los diferentes locus de genes y el centrómero está indicado por un punto entre los locus B y C Deleaon La delación cromosbmica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo codo del cromosoma 4. Duplicación: La duplicación cromosómica muestra las conliguraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X Inversión: La inversión cromosómica muestra las formas paracéntnca y pencéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las flechas indican los centrómeros) Translocación: Translocación reciproca frente a Iranslocación Robertsonian. Ejemplo: la transiocactón Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: el anillo 18.
La ilustración continua en el pagina siguiente.
8
SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
18
a(18)
Figura 62-14. Continuación. Representación esquemática de las diferentes anomalías cromosómicas, descritas en el texto, asociadas con ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la configuración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B, C, D y E indican a los diferentes locus de genes y donde el cenlrómero está indicado por un punto entre los locus B y C. Delación: La deleción cromosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo corto del cromosoma 4. Duplicación: La duplicación cromosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X. Inversión: La inversión cromosómica muestra las formas paracénlrica y pericéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las flechas indican los centrómeros). Translocación: translocación recíproca frente a translocación Robertsonian. Ejemplo: la Iranslocación Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: anillo 18.
CAPÍTULO 6 2
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APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
Figura 62-15. Ejemplos de deleciones cromosómicas A. Deleción del brazo largo disial del cromosoma 4 El cromosoma de la derecha es significativamente más cono (Hecha) que el cromosoma normal de la izquierda, fl. Deleción intersticial del brazo largo del cromosoma 11. El ideograma de la izquierda muestra la región de ADN que falta en el cromosoma que ha sufrido la deleción. A la derecha están los cromosomas bandeados reales con el cromosoma 11 que ha sufrido la deleción a su derecha (las Hechas indican la deleción).
Figura 62-16. Inversión cromosómica. A. Diagrama de la inversión pericéntrica del cromosoma 9 que utiliza los ideogramas para indicar los mecanismos de inversión. A la derecha se ven los cromosomas bandeados que demuestran esta inversión. 8 . Asa de inversión que indica el emparejamiento de homólogos en la meiosis de un cromosoma normal y uno con una inversión paracéntrica. Si la recombinación se produce en el punto indicado por el cromosoma X en el asa, se generarán cromosomas recombinantes como se muestra abajo. En el caso de una recombinación paracéntrica. los cromosomas que se producen son dicénlncos o acéntncos.
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 62-17. Translocación cromosómica. En el diagrama se muestra la generación de gametos procedentes de una translocación hipotética durante la meiosis. Los cromosomas se emparejan, en la meiosis 1. con una configuración en lorma de cruz. La segregación alterna generará gametos equilibrados. La segregación adyacente 1. la adyacente 2 o la adyacente 3:1 producirán gametos desequilibrados, los cuales pueden originar un niño nacido con vida anormal. (Sólo se muestra una de las distintas segregaciones 3:1 posibles.)
se pone 45.X y la adquisición de un cromosoma sexual será 47.XXY.47.XXX o 47.XYY. Por otro lado, si el cambio cromosómico sexual es adquirido, como en algunas líneas celulares cancerígenas, se necesita un + o un - para indicarlo (es decir, 45.X-Y para un hombre o macho que haya perdido su cromosoma Y como resultado de su enfermedad). Los cambios estructurales en los cromosomas no afectan a los cromosomas presentes, pero se deben anotar al final para clarificar el estatus del o de
los cromosomas reordenados. Para no alargar la nomenclatura, se han generado una serie de abreviaciones para las anomalías estructurales corrientes que acortan el total de la misma (Tabla 62-1). Una anomalía estructural se indica con la abreviatura de la anomalía seguida del cromosoma implicado y el punto de ruptura en el mismo. Para las reordenaciones en las que hay dos cromosomas implicados, los cromosomas se dan en un primer conjunto de paréntesis (primero el número más bajo o el cromosema sexual), seguido de
Figura 62-18. Los cromosomas bandeados y los de ascendencia muestran la herencia de una translocación Robertsonian de los cromosomas 13 y 14. La madre es la portadora de la translocación (tlecha larga) en una lorma equilibrada, pero un error mekótico origina la transmisión, de la madre al hijo, de un cromosoma con la translocación Robertsonian y de otro cromosoma 13. El niño tiene trisomia 13 (las flechas cortas indican el 13S normal, la Hecha larga indica la translocación Robertsonian). Nota: la segunda copia del cromosoma 14 no falta, sino que está unida al centrómero del tercer cromosoma 13.
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENETICA EN LA PATOLOGÌA MODERNA Tabla 62-2
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A n o m a l í a s c r o m o s ó m i c a s en las pérdidas fetales e s p o n t á n e a s y en niños nacidos con vida
Anomalías 45.X Triploidia Tetraploidía Tnsomias 16 22 21 15 14 18 13 Translocación desequilibrada Reordenamiento equilibrado
Pérdidas fetales espontáneas %
Incidencia en los nacidos vivos
18 17 6,0
1/10.000 1/60 000 0
16 5.7 4,7 4,2 3.7 3.0 2.0 3.0 4,0
0 0 1/700 0 0 1/8.000 1/10.000 1/2.100 2/1.000
Figura 62-19. Cromosoma anillo. El cromosoma 18 normal está a la izquierda. A la derecha se indica el cromosoma de un solo anillo y el cromosoma de doble anillo. Los dalos proceden de Hook (1977). Jacobs ( 1992) y Mueller ( 1998) El cromosoma anillo de la parte superior es de un solo anillo, como confirma la imagen de banda-C de la derecha (un solo centrómero oscuro). El cromosoma anillo de la parte inferior es mucho más grande y la tinción de banda-C indica dos cenCitogenètica prenatal trómeros oscuros, lo que lo confirma como un cromosoma de doble anillo.
los puntos de ruptura de la reordenación en el mismo orden relativo; esto es, t(4;9)(q21,2;p22) es una translocación entre los cromosomas 4 y 9 con los puntos de ruptura 4q21,2 y 9p22. Los siguientes ejemplos incluyen a: Deleción: 46,XX.del(4)(p15) Duplicación:
46,XX,dup(11)(q23)
Translocación: Inversión:
46.XY,t(4:9)(q21,2;p22) 46.XY,mv(9)(p11q21.1)
Deleción terminal del brazo corto del 4 en la banda 15 Duplicación terminal del brazo largo del 11 en la banda 23 Translocación entre el 4 y el 9 Inversión pericéntrica entre las bandas p11 yq21.1
CLINICA Aplicaciones clínicas Las anomalías citogenéticas se pueden encontrar en individuos aparentemente normales, asi como en pacientes con anomalías fenotipicas o con desórdenes genéticos diagnosticados. El diagnóstico se puede producir en cualquier etapa de la vida. Se puede establecer la existencia de un síndrome cuando se observa que varios individuos, no emparentados, tienen un conjunto de rasgos iguales. Ya se sabe que las características asociadas a un síndrome tienen una base común, las cuales son, con frecuencia, una anomalía cromosómica especifica. Sin embargo, aunque un síndrome está definido por un conjunto de caracteres, los individuos afectados pueden ser viables y no todos mostrarán un fenotipo idéntico.
Tabla 62-1
Abreviaturas c o m u n e s de a n o m a l í a s cromosómicas
Abreviatura cen del dup
Signiticado Centrómero Deleción Duplicación
ins mv
Inserción Inversión
i marcador a
Isocromosoma Mar Anillo
rob l
TranslocacíOn Robertsonian TranslocaciOn
Los estudios han demostrado que 1 de cada 13 productos de la concepción tiene una anomalía cromosómica, pero de éstos, sólo 6 de cada 1.000 nacen vivos, lo cual indica que son reconocidos y eliminados la mayoría de los errores. Por ejemplo, de todas las concepciones 45.X, el 95% acabará espontáneamente. La misma frecuencia en el fin del embarazo se registra en las trisomías de los nacidos vivos (no llegarán a término el 90% de las concepciones con trisomía 13. el 80% de las concepciones con trisomía 18 y el 65% de las concepciones con trisomía 21). Por término medio, el 15% de todos los embarazos reconocidos termina con la pérdida fetal de manera espontánea, y el 80% de éstos se producen durante los tres primeros meses. De todos los abortos espontáneos, el 60% se deben a anomalías cromosómicas (Tabla 62-2), y de éstos el 52% se deben a trisomías autosómícas. La tnsomia más comente que se ve en material procedente de un aborto, es la tnsomia 16. pero el tipo más frecuente de error cromosomico en las pérdidas espontáneas es el 45,X. El diagnóstico prenatal se ha convertido en el área más importante de los esludios citogenéticos clínicos, debido a esta clase de información y a los conocimientos, cada vez más amplios, de la genética. Los datos de referencia más corrientes deben contar con una historia familiar del o de los hijos anteriores con una anomalía cromosómica. de niveles anormales de AFP en un análisis (véase Cap. 22), de una anomalía detectada por ecografia y de la edad de la madre. La razón exacta de este fenómeno no está clara, aunque los estudios sobre la población han demostrado que en las mujeres de más de 35 años está aumentando la frecuencia de hijos nacidos con anomalías cromosómicas, especialmente trisomías (Hassold. 1985) El análisis estadístico se ha realizado, debido a la frecuencia relativamente alta de nacimientos con síndrome de Down, y muestra, claramente, la correlación entre los niños afectados y la mayor edad de la madre (Fig, 62-20). Esto se está convirtiendo en un problema para una sociedad en la que las mujeres están dejando los embarazos para edades más tardías. Las anomalías cromosómicas más comentes detectadas en los análisis prenatales son las trisomías en los nacidos vivos y las aneuploidías de los cromosomas sexuales. Pero debido a que éstas son, normalmente, el resultado de un error de la no separación meiótica, el nesgo de reincidencia es muy bajo. Ocasionalmente se identifica a un niño con una anomalía cromosómica estructural equilibrada o desequilibrada. En estas circunstancias, se hace un análisis del cariotipo de los dos progenitores biológicos para diferenciar si el niño tiene una reordenación heredada o una anomalía de novo. Por ejemplo, en un niño con una translocación equilibrada heredada, el nesgo de que la reordenación cromosómica plantee cualquier problema es menor de un 1%. Sm embargo, si la translocación aparentemente equilibrada que se ha visto en el feto no es detectada en ninguno de los padres biológicos, se ha tenido que originar de novo en el niño y hay de un 5% a un 10% de nesgo de perjuicio para el niño. Desafortunadamente, encontrar una translocación no equilibrada en un feto, a pesar del estatus portador de los padres, es una situación grave y casi siempre origina algún tipo de defecto genético en el
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 62-20. Aumento del riesgo de una concepción con sindrome de Down relacionado con el aumento de la edad materna. El número de niños nacidos con vida de madres con más edad es menor, debido a la intervención de los diagnósticos prenatales, seguido de la interrupción de embarazos anormales.
niño. Sin embargo, en esta situación, el determinar si uno de los padres es el portador de la translocación equilibrada proporcionará información sobre el riesgo de reincidencia en embarazos futuros.
Posnatal Aproximadamente el 0,6% de los recién nacidos tienen una anomalía cromosómica. Estos niños pueden presentar señales o síntomas de un síndrome definido o pueden tener anomalías clínicas no relacionadas con un desorden específico, pero de las que, sin embargo, se puede sospechar que se deben a una anomalía cromosómica. Los genitales ambiguos son un síntoma para examinar el complemento de cromosoma sexual de un recién nacido. Si un niño muere poco después de su nacimiento, el análisis citogenético puede proporcionar la información necesaria para comprender el porqué de esa muerte. Los hallazgos cítogénicos para establecer el diagnóstico deberán estar correlacionados, siempre que sea posible, con los resultados de la autopsia.
Infancia y edad adulta Un malentendido corriente sobre los desórdenes genéticos es que porque son heredados el diagnóstico será obvio al nacer. De hecho, la presencia clínica de muchos desórdenes tarda en manifestarse y puede no ser expresada completamente hasta más tarde en la vida. En consecuencia, algunos de los problemas diagnósticos más difíciles se dan en niños y adultos. Además, para considerar el amplio alcance de las posibilidades citogenéticas, también se deben tomar en consideración las opciones bioquímicas y moleculares.
Genética del cáncer Otra área de la medicina en la que la citogenética está siendo cada vez más importante es la oncología. A pesar de que la amplitud de variabilidad en los hallazgos cariotípicos de la mayoría de los tumores sólidos hace que las decisiones sobre los tratamientos sean difíciles, existen datos clínicos excelentes, de las leucemias y de los linfomas, que incluyen a reordenaciones cromosómicas específicas que están directamente asociadas a la tumorigénesis (Tabla 62-3; véase Cap. 65; Block, 1998). Al identificar estas anomalías se podrá hacer un diagnóstico a nivel citogenético, aunque en la práctica la citogenética es, generalmente, sólo una parte de los datos que se utilizan para hacer un diagnóstico. Una vez que se ha detectado una anomalía cromosómica, se puede monitorizar el progreso de la enfermedad del paciente. Si el tratamiento tiene éxito, la mayoría de las anomalías cromosómicas ya no serán evidentes en la médula ósea y se dirá que el paciente está en remisión, mientras el cariotipo sea aparentemente "normal". Sin embargo, si el tratamiento no elimina completamente la línea celular aberrante, la remisión puede ser sólo un intervalo, en el cual las células causantes de la enfermedad pueden estar detenidas a unos niveles tan bajos que no son detectables a través de los análisis de cariotipo rutinarios. Después, en la recaída, reaparecerán las mismas anomalías cromosómicas, que pueden ir acompañadas de ano-
malías adicionales y/o de líneas celulares más complejas, resultados acordes con progresión de la enfermedad. Un aumento en la complejidad de la recuperación es lo que se conoce como la evolución del cariotipo y. por lo general, el número y el tipo de las anomalías cromosómicas vistas están correlacionados con un mal pronóstico y con la gravedad de la enfermedad. La HISF de interfaz ha sido un elemento valioso para los estudios oncológicos clínicos (Cremer, 1988: Anastasi, 1991). Muchas de las anomalías citogenéticas importantes que se han visto en las leucemias son translocaciones, y se han desarrollado sondas HISF de combinación que hibridan a los lados opuestos de los puntos de ruptura de la translocación. Por ejemplo, la leucemia mielógena crónica (LMC) está caracterizada por una translocación entre el proto-oncogen ABL en el cromosoma 9 (9q22.3) y el gen BCR en el cromosoma 22 (22q11.2). La reordenación origina un gen quimérico en el cromosoma 22 derivativo. Para detectar la translocación se utilizan un par de sondas: 1) se localiza al lado distal del locus ABL en el cromosoma 9 (rojo) y 2) situada en el lado proximal del locus BCR en el cromosoma 22 (verde). Cuando hay no translocación presente, deberían estar presentes en cada célula dos señales verdes (que detectan cada alelo ASÍ.) y dos señales rojas (que detectan cada alelo BCR) (Fig. 62-21 A). La presencia de una translocación da una señal verde y una señal roja contiguas la una a la otra, y con la resolución del microscopio de luz, las dos señales se unen, dando una sola señal amarilla. Por tanto, una célula con una translocación tendrá sólo tres señales, una verde, una roja y una amarilla (Fig. 62-216). Aunque se puede hacer este estudio en células en metafase, la utilización de células de interfaz proporciona una muestra mucho más grande con la que se puede hacer el ensayo más rápidamente (Werner, 1997). De la misma manera se pueden comprobar otras translocaciones leucémicas. Otras aplicaciones de la HISF en oncología incluyen 1) la utilización de una sonda de centrómero específica del cromosoma 12 para análisis de una población de células de interfaz para las células de trisomia 12 indicativas de LLC. 2) la utilización de una sonda de cromosoma 7 para detectar la monosomía 7 en el síndrome mielodisplásico (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA) y 3) la utilización de una sonda de cromosoma 8 para identificar la trisomia 8 en los desórdenes agudos y en los crónicos. También ha tenido mucho éxito la utilización de sondas de X e Y de diferentes colores, para evaluar el éxito de un trasplante de médula ósea en el que el donante y el receptor eran de sexos diferenles. Después del trasplante, el hombre que ha recibido células de un donante femenino debería tener un complemento XX, pero si se encuentra un número significativo de células XY, indicaría un problema potencial o posiblemente el fallo del injerto, La HISF se puede repetir, a intervalos regulares, para monitorizar el progreso y para advertir de que empieza a proliferar la población de células leucémicas del paciente. La HISF multicolor también se ha utilizado para evaluar las líneas celulares leucémicas. Es interesante hacer notar la discrepancia que hay, a menudo, entre lo que se detecta a través de la citogenética habitual y lo que se ve utilizando la HISF (Veldman, 1997). Se ha sugerido que las células cancerige-
CAPÍTUIO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
Tabla 62-3 R e o r d e n a m i e n t o s cltogenéticos c o m u n e s e n la leucemia y en el linfoma Desorden LMC (leucemia mielógena crónica)
LMA (leucemia mieloide aguda) MI M2
M3 (APL) M4 (AMMoL)
Reordenamiento cromosomico t(9;22)(q34 1q11 2) +8 'd 7q) segundo Ph' + 19 t(9;22)(q34 1;q11 2) + 11 t(8:21)(q22:q22) t(9.22)(q34.1;q11.2) I(6.9)(p23q34) t(7.11)(p15;p15) +8 t(15;17Kq22;q11-22) t(11;17Kq23:q21) mv(16)(p12q22) t(16:16)(p13:q22) del(16)(q22) mv(3)(q21q26).
I(3;3)(q21;q26)
M5 (AMoL)
M6 t(3;3)(q2l;q26) M7 Cualquier subtipo
I(11;19)(q23:p13) +8 +22 I(8;16)(p11;p13) I(9;11)(p21-22:q23) t(11;19)(q23;p13) t/del(11q23) t(3.5)(q21-25:q31-35) inv(3)(q21q26). t(1.22)(p13;q13) +8 -7
Y
20q9q K17q) LLA (leucemia linfoblástica aguda) hiperdiploidía L1 L I , L2
L3
LLC (desórdenes imloproliferativos crónicos) Célula B Célula T Síndromes mielodisplásicos
I(1;19)(q23;p13) del/t(12p) 1(4:11)(q21;q23) del(6q) I(9:22)(q34.1;q11.2) I(11:19)(q23:p13) +21 hiperdiploide, mn 50-56 I(8;14)(q24;q32) 1(8;22)(q24;q11) I(2:8)(p12:q23)
+ 12 14q+ 14q+ 14q 11 reordenamientos 5q del(5)(q13q33) -7, del(7q) +8 + 19 dcl(20q)
ñas experimentan, realmente, un grado significativamente mayor de reordenaciones cromosómicas de las que se habían apreciado previamente y que algunas de las nuevas reordenaciones que se han detectado pueden evidenciar nuevos genes relacionados con el cáncer. Sin embargo, llevará algún tiempo antes de que se pueda recoger un conjunto de datos significativos que proporcionen las correlaciones clínicas de estas nuevas reordenaciones.
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Desórdenes citogenéticos Síndromes de aneuploidías cromosómicas Aneuploidías autosómicas. La causa más común del retraso mental es la trisomía 21 o síndrome de Down. La incidencia de este desorden es de 1 de cada 700 nacimientos y está caracterizado por hipotonia. caras aplanadas, cisuras palpebrales oblicuas, orejas pequeñas, lengua protuberante, pliegue palmar transversal, defectos del corazón e hipogonadismo. Aproximadamente el 92.5% de todos los individuos con síndrome de Down tienen 47 cromosomas, incluidas tres copias del cromosoma 21 originadas por un error de no separación en la meiosis (Tabla 62-4). Sin embargo, sólo menos del 3% de los pacientes tienden a expresar un fenotipo menos severo y se manifiestan como mosaicos con dos líneas celulares que pueden incluir una línea 46.XX o una 46.XY. Además, alrededor de un 5% de los pacientes con síndrome de Down sólo tienen 46 cromosomas, dado que el 21 extra es parte de una translocación Robertsonian o de otras translocaciones. Con frecuencia, un niño con una translocación indica la presencia de un padre portador de una translocación, por lo que en estos casos es recomendable hacer un análisis de cariotipo a ambos padres, para determinar si la pareja tiene un riesgo mayor de tener más hijos con síndrome de Down en futuros embarazos. Los estudios citogenéticos de los individuos con reordenaciones del cromosoma 21 han revelado que no es necesario que se triplique el cromosoma 21 en su totalidad para que esté presente el fenotipo del síndrome de Down. A menudo, tres copias del brazo largo proximal producen presentaciones clínicas distintas de las del síndrome de Down. A la inversa, la triplicación del brazo largo distal está directamente correlacionada con un claro fenotipo del síndrome de Down. Los análisis de pacientes con reordenaciones citogenéticas diferentes han identificado una región conocida como la región crítica del síndrome de Down. la cual incluye bandas de la 21q22.12 a la 21q22.3 (Fig. 62-22). La presencia de tres copias de este fragmento del 21 es suficiente para establecer un diagnóstico claro del síndrome de Down (Korenberg. 1990; Delabar, 1993). A pesar de que al hacer el mapa cromosómico se ha estrechado la región crítica del síndrome de Down, los esludios comparativos entre pacientes con síndrome de Down e individuos con otros desórdenes asociados a genes localizados en el cromosoma 21 (Fig. 62-22) han dado correlaciones interesantes. Los análisis de la estructura cerebral de pacientes con síndrome de Down o con Alzheimer, en particular, han revelado una anomalía arquitectónica similar, lo que sugiere que la triplicación y la mutación del locus del gen de la proteina |3-precursora amiloide (PPA) pueden producir resultados negativos similares. Las otras dos trisomías de los nacidos vivos son la trisomía 13 y la tnsomia 18. La trisomía 13, el síndrome de Patau, con una frecuencia de 1 de cada 4.000 a 1 de cada 10.000 nacimientos, está caracterizado por cabeza pequeña, labio leporino o paladar hendido, o ambos, ciclopía. pliegue palmar transversal, polidactilia de las manos, de los pies, o ambas, talón prominente, defecto septal ventricular y cuero cabelludo puntiagudo. Aproximadamente se diagnostica de trisomía 18 o síndrome de Edwards (Fig. 62-23A) a uno de cada 8.000 recién nacidos, que tienen poco peso al nacer, boca y mandíbulas pequeñas, delecto septal ventricular, hipoplasia de los músculos, un occipucio prominente, orejas malformadas y bajas, pies de base basculante y dedos cruzados. Por lo general, el síndrome de Down es bastante manejable, a pesar de que tiene, frecuentemente, consecuencias clínicas graves y los pacientes llegan a vivir veinte o treinta años. La trisomía 13 y la trisomía 18 son mucho menos compatibles con la vida y los pacientes suelen morir durante el primer mes de vida. Si un individuo sobrevive al primer año, el porvenir es sombrío, ya que esos pacientes no aprenden a hablar, a caminar o a cuidar de sí mismos. Por este motivo, la opción de la interrupción del embarazo, está entre los consejos para los casos con diagnóstico prenatal de trisomía 13 y trisomía 18. Aneuploidías cromosómicas sexuales. Las aneuploidías cromosómicas sexuales son relativamente comentes (su Irecuencia, por lo general, es de 1 de cada 500 nacimientos) y son fenotipicamente más leves que las aneuploidías autosómicas, debido al efecto de la inactivación del cromosoma X y al número limitado de genes presentes en el cromosoma Y. La
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 62-21. Detección mediante la HISF de la translocación 9:22 en la LMC. A. No hay translocación presente, como se ve por dos copias de cada sonda del cromosoma 9 (en rojo) y del cromosoma 22 (en verde) en la célula en metalase (a la derecha) y en la de interfaz (a la izquierda). 8. Translocación en un paciente que ha sido detectada mediante la señal amarilla (Hecha) más una señal verde y una roja (en células de interfaz).
causa, en la mayoria de los casos, es debida a cuatro desórdenes, tres trisomías y una monosomía. Todos son originados por errores de no separación durante la meiosis y excepto el XYY. que es exclusivamente paterno, los otros desórdenes pueden ser originados tanto por el error materno como por el paterno. Los cariotipos aberrantes de los individuos con tres cromosomas X [47,XXX mujeres] o con un cromosoma X y dos cromosomas Y [47.XYY homTabla 62-4 Errores d e n o s e p a r a c i ó n q u e p r o d u c e n trisomia 21 detectados mediante tecnología citogenética y molecular Citogenéticos Meiosis materna I Meiosis materna II Meiosis paterna I Meiosis paterna II
70% 10% 10% 10%
Dalos de Sherman (1991. 1994) Anlonarakls 11992)
Moleculares 75% 20,6% 1,2% 3,2%
bres] a menudo no son detectados en toda la vida. La incidencia de los nacimientos es relativamente alta. 1 de cada 1.000, pero salvo que son algo más altos que la mayoría, no tienen rasgos chocantes que pudieran indicar una anomalía cromosómica. Algunas de estas personas tienen dificultades de aprendizaje generalizadas, por lo que pueden ser identificadas mediante los programas de rendimiento escolar. También se puede detectar a las mujeres XXX y a los hombres XYY en las clínicas de infertilidad, aunque la anomalía citogenética no está, generalmente, relacionada con el motivo de referencia, ya que las evaluaciones globales muestran que estas personas son completamente fértiles y que, por lo general, tienen hijos cromosómicamente normales. Los hombres XYY tienen más riesgo de padecer problemas de conducta, y los primeros estudios sugirieron que también tienen tendencias criminales debido a la incidencia, más alta de lo que se esperaba, de XYY en presos de instituciones penales (Jacobs, 1968; Price, 1970). Sin embargo, los trabajos posteriores muestran que la criminalidad, más probablemente, se deba a la combinación de múltiples causas y que los hombres XYY no son más propensos a tener una conducta criminal que cualquier otro hombre (Witkm, 1976; Pitcher, 1982; Theilgaard, 1984).
Figura 62-22. A la derecha se ve el mapa del cromosoma 21. que muestra la región critica del síndrome de Down y las posiciones relativas de los locus asociados a vanos rasgos clínicos. A la izquierda se muestra otro mapa de los locus (SUH1E = sindrome de Usher PPA = proteína |5-precursora amiloidea [asociada a la enfermeoad de Alzheimer; DS01 = dismutasa superóxida-1; ELA1 = esclerosis lateral amilrópica; DFNB8 = sordera 8: ETS2 = oncogén ETS-2; HPE1 = holoprosencefalia alobar-1 : COL6A1'COL6A2
19
20
21
22
X
T
Figura 62-23. Cariolipos de los síndromes cromosómicos numéricos A, Síndrome de Edwards (trisomía 18): 47.XX.+18. La ilustración continua en la página siguiente.
Los hombres con síndrome de Klinefelter (47.XXY) tienen tendencia a ser altos y delgados, de piernas relativamente largas, aunque en los primeros años estos hallazgos rara vez los apartan de los demás niños. A algunos individuos se les identifica en el colegio por sus dificultades en el aprendizaje, pero las causas de referencia más corrientes son hipogonadismo pospuberal. desarrollo del pecho como en una mujer, infertilidad debida a la pequenez testicular, tubos testiculares híalinizados y azoospermia. En individuos con un complemento de cromosoma mosaico, incluida una línea celular 46.XY [47.XXY/46.XY], se ve una forma más leve del síndrome de Klinefelter con fertilidad potencial a causa de un desarrollo testicular normal. La llave de la fertilidad es la proporción relativa de células XXY y XY durante la determinación sexual en el primer zigoto y en los testículos. Un exceso de células XXY llevará al individuo a ser un verdadero Klinefelter, mientras aue un mayor número de células XY moderarán el fenotipo y aumentarán las probabilidades de que sea fértil. El sindrome de Turner: 45,X(Fig. 62-348) es la aneuploidia cromosómica sexual más comúnmente reconocida, presente en un fenotipo femenino. En la determinación sexual, el desarrollo femenino normal depende de la presencia de dos cromosomas X aclivos. La región critica de la diferenciación femenina se ha estrechado a una región del brazo corto del cromosoma X, justamente proximal al centrómero. Si esa región no existe o está inactiva, se originará un individuo con el síndrome de Turner. Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con sindrome de Turner tienen el complemento de cromosoma
45.X clasico, que representa la única monosomia de los que nacen vivos viable. Normalmente, el único cromosoma X es de origen materno e indica que una no separación meíótica paterna es el origen del error más corriente. También puede haber cariotipos más complejos además del 45.X (Tabla 625) (Palmer, 1976). A los que más les atañe es a los individuos que tienen un cromosoma Y, completo o parcial, en al menos una línea celular: éstos tienen un nesgo mayor de gonadoblastoma. El fenotipo del sindrome de Turner es altamente variable. Los individuos afectados son típicamente bajos (<1,50 m) con disgenia gonadal y dificultades de aprendizaje. Otros rasgos comunes son membrana cervical originada por higroma quístico in útero, nacimiento del pelo posterior bajo, anomalías renales y del corazón, cubitus valgus (aumento del ángulo de porte en el codo) y tórax de caparazón. Los pacientes al nacer pueden presentar edemas en las manos y en los pies. Los pacientes con síndrome de Turner tienen una capacidad amplia para las habilidades mentales, y muchos tienen una inteligencia normal, pero algunos tienen detectos mentales significativos. Más aún, aunque en el síndrome de Turner la infertilidad se solía aceptar como el estándar, ahora se sabe que algunos pacientes se pueden reproducir con éxito, normalmente los que tienen cariotipos mosaicos. Por tanto, y debido a la gran diversidad de las presentaciones, el asesoramiento prenatal a una pareja con un feto con un síndrome de Turner no identificado es extremadamente difícil. Sin embargo, la mayoría de los pacientes nacidos vivos con síndrome de Turner, por lo general, pueden tener vidas productivas, y los individuos afee-
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PATOLOGÍA MOLECULAR
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
Tabla 62-5 Distribución d e los c o m p l e m e n t o s d e c r o m o s o m a diferente q u e origina el s í n d r o m e de Turner Porcentaje de casos % bü 20 15 10
Anomalía cromosómica 45.X 45.X,i(Xq) Deleciones del cromosoma X o anillos. o la presencia de un cromosoma Y Mosaicos 45.X/46.XX 41>.X/46. XY
lados levemente quizá no sepan que están afectados por el desorden hasta que lleguen a la pubertad.
Otras anomalías cromosómicas sexuales En los humanos, la determinación sexual es el resultado de una vía bioquímica compleja, que conlleva la interacción de proteínas producidas por genes presentes en los cromosomas X e Y, así como por los genes en los autosomas. El sexo natural, en los humanos, es el femenino, por eso se desarrolla un individuo femenino en ausencia de cualquier estímulo que defina a un varón. El primer desencadenante para el desarrollo de un varón es un gen localizado en el brazo corto del cromosoma Y. denominado FDT. factor que determina los testículos, que está localizado en la región determinante del sexo del cromosoma Y (RSY) (Fig. 62-24). La proteína producida por el FDT inicia la vía para el desarrollo de un varón. Se han identificado vanos desórdenes asociados a mutaciones en distintos genes dentro de esa vía que pueden originar genitales ambiguos o errores del genotipo o del fenotipo (un hombre fenotípico con un complemento de cromosoma sexual XX o una mujer tenolípica con un complemento XY). El origen de un hombre XX se puede atribuir, generalmente, a una o dos causas. La más corriente de las dos es la virilización de un leto femenino, que con frecuencia es el resultado del desorden recesivo autosómico hiperplasia adrenal congénita (HAC). Este desorden lo produce la carencia de la
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enzima 21 -hidroxilasa. que origina un bloqueo en la via de biosintesis normal y produce una acumulación de andrógenos. Los niveles excesivos de hormonas masculinas en la circulación femenina pueden dar origen a una persona de apariencia masculina, a pesar del complemento de cromosoma femenino. Además, un feto femenino normal puede desarrollar genitales ambiguos, debido a la exposición a un exceso de hormonas de la madre afectada de HAC, dado que los andrógenos son capaces de atravesar la placenta. También se puede originar un hombre fenotípico con un complemento de cromosoma sexual XX a causa de una translocación críptica entre el cromosoma X y el cromosoma Y. Los extremos distales de los brazos cortos de los cromosomas X e Y son homólogos, e incluyen a las que se denominan regiones seudoautosómicas (Fig. 62-24). Este es el primer lugar de apareamiento del cromosoma X y del Y durante la meiosis y se puede producir la recombinación entre el alelo X y el Y. De forma ocasional se puede producir un acontecimiento de recombinación fuera de las fronteras de la región seudoautosómica, originando la transferencia de los únicos locus Y, incluyendo a la RSY. en la punta del cromosoma X. La cantidad de material cromosómico presente en este intercambio es extremadamente pequeña y no puede ser detectada por medio de la citogenética. Un hombre con una translocación tan equilibrada no tendrá anomalías clínicas debido a que todos los genes están presentes, aunque en localizaciones alternas. Sin embargo, si este hombre transmite su cromosoma X reordenado a un hijo que haya recibido un cromosoma X de la madre, el niño tendrá un complemento de cromosoma XX aparente, pero tendrá un fenotipo masculino o un fenotipo masculino Klinefelter debido a la presencia del gen FDT, que desencadena la via de desarrollo de un hombre. De forma recíproca, la translocación descrita antes puede originar una mujer Turner con un complemento XY aparente. La vía para desarrollar a un hombre no se iniciará en un individuo con un cromosoma Y que no tenga el FDT y la RSY. y la determinación sexual se decantará hacia una mujer. Sin embargo, la ausencia de dos copias intactas del brazo corto del X proximal impedirá el desarrollo de una mujer "normal" y dará origen a un individuo con síndrome de Turner. Esta situación es bastante infrecuente. En una mujer XY el resultado más común es la insensibilidad andrógena, que también es conocida como "feminización testicular". En estos individuos el cromosoma Y está intacto y el FDT está presente y es funcional. El problema surge en otra parte de la via bioquímica por un defecto del gen receptor de andrógeno que está localizado en el brazo largo del cromosoma X (Xq21.3). El FDT inicia el desarrollo de un hombre, pero la vía estará bloqueada en el punto donde se necesita el producto del gen receptor de andrógeno para hacer un compuesto de testosterona con dihidrotestosterona. No se puede ir más lejos en la diferenciación de un hombre y por eso el fenotipo se revelará en una mujer. Sin embargo, estos individuos no son fértiles por la falta de algunos genitales internos funcionales y presentan, comúnmente, una vagina ciega y testículos en el abdomen o conducto inguinal.
Anomalías
cromosómicas
estructurales
Se ha descrito un número razonable de síndromes directamente relacionados con una anomalía cromosómica estructural. La mayoría de ellos son bastante raros. A continuación se explican algunos de los más comunes (véase también Jones. 1997). El síndrome de Wolf-Hirschhorn. también conocido como 4p-sindrome. se debe a una aparente deleción terminal del brazo corto del cromosoma 4 [del(4)(p16|] (Fig. 62-14). Los resultados clínicos incluyen microcefalia. micrognalia, hipotonia, pliegues epicánticos y retraso en el desarrollo. Se asocia la apariencia facial característica de estos individuos con el casco de un guerrero griego, debido a la nariz larga y a las cejas arqueadas. Las personas que tienen este desorden necesitan educación especial y tienen un gran riesgo de padecer convulsiones.
Figura 62-24. Diagrama de las localizaciones relativas del FDT, del RSY y de las regiones seudoautosómicas del cromosoma X y del cromosoma t
El Cri du chat o síndrome 5p- [del(5)(p15)j está caracterizado por un llanto como de gato, agudo y distintivo, en la infancia. Otros rasgos son poco peso al nacer y el crecimiento lento subsiguiente, hipotonia. microcefalia. hipertelorismo. pliegues epicántico. anomalías cardiacas y retraso mental. Los niños afectados tienen un desarrollo retrasado y pueden alcanzar los niveles sociales y cognitivos a los cinco o seis años.
SECCIÓN V I I
1328
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PATOLOGÍA MOLECULAR involucrados en el síndrome de Miiler-Dieker. así que es un auténtico síndrome de genes contiguos originado por una microdeleción. Una deleción más pequeña del gen LIS1 origina una lisencefalia aislada (Ledbetler, 1992). Los síndromes de microdeleción mejor conocidos son el síndrome de Prader-Willi (SPW) y el síndrome de Angelman (SA). Ambos comparten la misma deleción intersticial del brazo largo proximal del cromosoma 15 [del(15)(q11.2q11.2)], pero la presentación clínica es significativamente diferente. Los pacientes con el síndrome de Prader-Willi cuando nacen son pequeños e hipotónicos, pero cambian durante el primer año de vida y empiezan a ganar peso con rapidez. Si no se les pone una dieta controlada, pueden ser bastante obesos debido la sobrealimentación. Tienen otras características, como manos y pies grandes, hipogonadísmo y mal genio. Aunque son retrasados en su desarrollo, la mayoría se desenvuelve bien en las clases de educación especial. A los pacientes con el síndrome de Prader-Willi se les puede internar en casas para grupos especiales, que les proporcionan un ambiente adecuado, debido a su temperamento y a la dificultad para controlar su dieta. Por otro lado, los pacientes con el síndrome SA tienen un retraso mental agudo. Aunque son muy amistosos, por lo general no pueden mantener una conversación normal y la interrumpen, con frecuencia, con estallidos de risa inapropiados. Este desorden está también caracterizado por hiperactividad, estatura baja, microcefalia, convulsiones y ataxia.
Síndromes de microdeleción y síndromes de genes contiguos Por definición una microdeleción es una deleción muy pequeña, normalmente sólo una fracción de la banda de un solo cromosoma. Las microdeledones pueden ser confundidas con deleciones moleculares, asi que es importante reconocer que, aunque las microdeleciones son pequeñas, son significativamente más grandes (>500 kb) que la deleción molecular típica (1 par de bases [pb] a varios cientos pb), que sólo se pueden resolver por medio de la tecnología molecular (véase Cap. 66). El tamaño real de una micro-deleción puede variar de un paciente a otro, y algunas pueden ser lo suficientemente grandes para identificarlas mediante un análisis citogenético, aunque la mayoría para ser detectadas necesitarán la utilización de la HISF. Aunque al principio se creía que las deleciones estaban dentro de los genes solos, ahora se ha demostrado que ciertos síndromes se deben, en realidad, a deleciones que abarcan porciones de varios genes no relacionados adyacentes. La presentación clínica, por tanto, puede ser una combinación de características, debido a la ausencia de varios productos génicos diferentes. El tamaño de la deleción y el número de genes afectados puede variar tanto que el fenotipo expresado puede ser significativamente diferente entre los individuos. A estos síndromes se les denomina colectivamente síndromes de genes contiguos y representan una serie dentro de la categoría más amplia de los síndromes de microdeleción (Tabla 62-6).
La deleción 15q se puede detectar en casi un 60% de los individuos con el SPW. y en los pacientes con SA sólo entre un 10% y un 20%, por medio de un análisis ordinario o criogénico de alta resolución. La utilización de la HISF ha proporcionado una herramienta para el diagnóstico mucho mejor, y ahora se pueden establecer las deleciones en el 80% a 85% de los casos. Aunque se aceptaba que no todas las deleciones fueran visibles a nivel citogenético, parecía extraño que la HISF no fuera capaz de detectar una delación en el 100% de los casos. Esto, unido al hecho de que el SPW y el SA parecen compartir la misma deleción aunque tienen fenotipos completamente diferentes,
El síndrome de Miiler-Dieker ilustra con claridad el solapamiento entre la microdeleción y los síndromes de genes contiguos. Este desorden se ha asociado con una microdeleción del brazo corto distal del cromosoma 17 (17p13.3), y los rasgos clínicos esenciales son lisencefalia (cerebro liso) y anomalías craneofaciales. La lisencefalia aislada (LSA) ha sido reconocida como una entidad independiente, así que el síndrome de Miiler-Dieker es una presenlación más compleja que une el defecto cerebral con los rasgos faciales característicos. El análisis molecular muestra que hay al menos dos genes
Tabla 62-6 Microdeleción y síndromes de genes contiguos Localización
Trastorno Angelman (SA)
15q11.2
DiGeorge (SDG)
22q1l.2. 10p, 4q, 6q
Rasgos clínicos
Genes UBE3A
RM agudo, retraso en el desarrollo, boca grande, progriatia, ataxia, convulsiones
¿
?GCSL y otros
Cara caracteristica. paladar hendido, hipoplasia del limo y paratiroides, corazón delectuoso e hipocalcemia
7
Icliosis
Xp22.32
STS
Piel escamosa, estatura baja, hipogonadismo, RM
Kallmann
Xp22.3
KAL1
Hipogonadismo, incapacidad para oler
Larger-Giedion (SLG)
8q24 11-q24.13
TRPSI TRPSII EXT
Dismorfismo craneofacial. anomalías esqueléticas, deficiencia mental de moderada a aguda
Lisencefalia (SIL)
17p13,3
LISI
Cerebro liso, retraso mental profundo, convulsiones
Miiler-Dieker (SMD)
17p13.3
Lisencefalia. microcefalia, trente alta, nariz pequeña, micrognatia, orejas bajas
Prader-Willi (SPW)
15q11.2
LIS1 ¿y otros? SNRPN
Retinoblastoma
13q14.1-q14.2
Rb1
Tumores del relinoblasto del ojo
Rubinstein-Taybi (SRT)
16p13.3
CBP
Nariz rota, columela prominente, maxilar superior hipoplásico, fisuras palpebrales inclinadas hacia abajo, dedos pulgar y primero del pie anchos, RM y lenhtud al hablar
Smith-Magenis (SSM)
17p11.2
Hipotonia al nacer, ojos almendrados, RM de moderado a agudo, ausencia de saciedad, lo que lleva a comer de más. manos y pies pequeños, hipogonadismo
Braquicefalia, hipoplasia en media cara, puente nasal ancho. mandíbula prominente, manos pequeñas y anchas, hiperactividad. lentitud al hablar, conducta autodestructiva, RM
Síndrome velocardiofacial (SVCF)
22q11.2
?GCSL
Defectos en el paladar, alae nasi hipoplásica con nariz larga, incapacidad para el aprendizaje, enfermedad cardiaca congénita
WAGR
11p13.3
WT1 AN2 ¿y otros?
Tumor de Wilms, aniridia, defectos genitourinarios y retraso mental
Síndrome de Williams (SEW)
7q11?
ELN
Cl bajo, hipersensibilidad auditiva, oíos azules con un patrón en forma de estrella en iris, labios prominentes, voz ronca, estenosis aórtica supravalvular u otro defecto cardíaco, hipercalcemia y envejecimiento prematuro de la piel
RM = retraso mental. v
...
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
WAGR
1329
entre repeticiones directas que están contiguas a la región de deleción común. Esta recombinación intercromosómica generará una estructura de asa que, si se escinde, producirá la deleción del segmento intermedio. También se han detectado recombinaciones intercromosómicas entre repeticiones directas (Edelman, 1998).
Otros fenómenos citogenéticos Síndrome del cromosoma X frágil
11
Figura 62-25. Diagrama del síndrome de genes contiguos WAGR que muestra la posición relativa de los diferentes genes en el brazo corto del cromosoma 11.
sugería que pudiera haber otra causa que originara estos desórdenes. Ahora se sabe que el SPW y el SA son ejemplos de impresión genética y que el proceso de la mutación que origina las enfermedades es mucho más complejo que una simple deleción del ADN (Nicholls, 1989; Robinson, 1991) (véase el Cap. 66 donde se explica la detección molecular y de impresión de los genes impresos). El síndrome de Williams ha sido asociado a una deleción del gen de elaslina (ELN) del brazo largo proximal del cromosoma 7 (7q11.23). Este desorden se caracteriza por anomalías cardíacas, hipertensión, voz ronca, envejecimiento prematuro de la piel y anomalías en el comportamiento. La ausencia de elastina explica muchas de las anomalías físicas asociadas a este síndrome, ya que se sabe que es una proteína importante que da elasticidad a tejidos, como los del corazón, vasos sanguíneos, piel y cuerdas vocales. Sin embargo, los problemas de conducta no se pueden atribuir a la falta de elastina, por eso actualmente se cree que el síndrome de Williams es, en realidad, un síndrome de genes contiguos y que la variabilidad del fenotipo está relacionada con el número de genes adyacentes que se delecionan en combinación con el gen ELN. El síndrome de WAGR (tumor de Wlms, aniridia. defectos genitourinarios, y retraso mental) es un síndrome de genes contiguos muy bien caracterizado y está localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (11 p13). Excepto por los defectos genitourinarios, que parecen ser debidos a una mutación variante en el locus del tumor de Wilms. cada una de las otras tres anomalías han sido asociadas a un gen específico, y éstos están ordenados en tándem en el brazo corto del cromosoma 11 (Fig. 62-25). El fenotipo de un individuo afectado variará dependiendo del tamaño de la deleción. Estadísticamente, alrededor de uno de cada tres niños diagnosticados de aniridia desarrollarán también el tumor de Wilms. Por el contrarío, sólo 1 de cada 50 pacientes con tumor de Wilms tiene aniridia. Con deleciones más grandes, también se pueden ver defectos genitourinarios y retraso mental. El síndrome velocardioíacial es. posiblemente, el síndrome de microdeleción más común en los humanos, pero, muy a menudo, pasa desapercibido, debido al amplio espectro de los rasgos clínicos y a que puede presentarse de forma bastante leve. Este desorden se diagnostica, normalmente, en niños lactantes, debido a las dificultades que tienen para alimentarse, a los detectas cardiacos y a las dismorfologías faciales características. Cuando el individuo crece, se advierten discapacidades en el aprendizaje, poca estatura y pérdida de audición conductiva. Es interesante hacer notar que entre un 10% y un 15% de estos pacientes tienen un progenitor afectado, pero mucho más levemente, por la misma deleción. Se cree que la deleción 3 Mb del brazo largo proximal del cromosoma 22 (22q11.2q11.2) se debe a la recombinación
El síndrome del cromosoma X frágil es la segunda causa más importante de retraso mental y la primera de retraso mental heredado. Herbert Lubs describió por primera vez este desorden en 1969, cuando se dio cuenta de que en los miembros de la familia afectados había una correlación entre el retraso mental y un cromosoma X "marcador" (Lubs, 1969). Posteriormente se conoce al cromosoma X marcador como el cromosoma X frágil, que es una rotura o abertura en la estructura del cromosoma X que se puede delectar por medio de la citogenética cultivando células en el medio de inducción adecuado (Fig. 62-26). Desgraciadamente no todos los individuos afectados expresan el cromosoma X frágil por medio de la citogenética, por lo que el análisis clínico es imperfecto. Sin embargo, durante muchos años fue el único ensayo disponible y proporcionó una muy necesaria confirmación de los diagnósticos de muchos pacientes. En 1991 se clonó el gen asociado al síndrome del cromosoma X frágil y se identificó a la mutación como la amplificación de una secuencia repetida de tnnucleótidos, algo que nunca antes se había visto o asociado como un mecanismo causante de la enfermedad. Afortunadamente, esta mutación se puede detectar a nivel molecular, y se ha desarrollado un análisis clínico, altamente competente, que permite la detección directa de la mutación del síndrome del cromosoma X frágil (Rousseau. 1991; Verkerk. 1991).
Síndromes de rotura Los síndromes de rotura cromosómicos (Tabla 62-7) son un conjunto de desórdenes recesivos autosómicos que se agruparon juntos al principio a causa de que los resultados tenían en común la fragilidad o inestabilidad cromosómica (Ariett. 1978). Por esta razón, los análisis citogenéticos fueron de gran ayuda para los diagnósticos. Los estudios moleculares han demostrado una causa común adicional entre estos desórdenes, y es que la mutación en cada uno de ellos origina un defecto en los mecanismos de reparación del ADN de las células. Esto ayudó a explicar otras características de los síndromes, ya que la incapacidad para reparar el ADN puede llevar a 1) la rotura o al aumento de la recombinación, que se puede caracterizar por medio de la inestabilidad cromosómica, y 2) a mutaciones adicionales y defectos en la secuencia del ADN, que pueden originar el cáncer. Con un mejor conocimiento de la mutación específica, la terapia génica para el tratamiento se convierte en una posibilidad.
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Figura 62-26. Cromosoma X frágil. Ideograma del cromosoma X frágil (izquierda) y un par de cromosomas con bandeo-G representativos que muestran, a la derecha, al cromosoma X frágil.
Tabla 62-7 Síndromes de rotura cromosomica Trastorno
Características clínicas
Locus gènico
Manifestaciones citogenétícas
Tipo de cáncer
Defecto de reparación del ADN
Miscelánea
Pancitopenia, retraso en el crecimiento pre o posnatal, hipopiasia o falta de dedos pulgares, posibilidad de deformación en ios brazos, pigmentación oscura de la piel Retraso en el crecimienio. erupción en la piel en forma de mariposa, posiblemente maligna
1. Grupo A— I6q24.3 2. Grupo C—9q22.3 3. Grupo D—3p22-p26 4. Grupo E—6p21-p22 5. Grupos B E H sin mapa I5q26 1
Aumento de roturas cromosómicas detectadas mediante tratamiento con MMC y DEB
Ataxia telangiectasia (AT)
Ataxia con degeneración del SNC, telangiectasia en la cara, deficiencia de inmunidad celular, degenerativo, retraso en el crecimiento
11q22.3
Vanas leucemias y tumores sólidos
Xeroderma pigmentos (XP)
Sensibilidad a los rayos solares, anomalías neurologicas. ataxia y espasticidad
Aumento en la incidencia de cancer de piel
i Falta de escisión de los los dímeros de timina 2. Defecto en la reparación posreplicación
Síndrome de Cockayne
Enanismo, envejecimiento prematuro, microcefalia, déficit neurològico, degeneración de la pigmentación, sordera, sensibilidad a la luz del sol. RM
incidencia: 1 en 250 000 1. A-9q22.3 2. C-653p25 3. D—19q13.2-ql3.3 4. E—11p11.1-p12 5. F-16p13.1-13.2, 16p13.13-p13.3 5. G—13q33 Cromosoma 5
Aumento de las roturas espontáneas, aumento de anillos tnrradiaies y translocaciones, especialmente en el cromosoma 7 y en el 14 inducidas con bleomicma o con radiaciones ionizantes Aumento del CCH y reordenamiento cromosomico en respuesta a los rayos ultravioletas
Sensibilidad a los rayos ultravioletas
Aumento en la incidencia de cáncer de piel
Posible deficiencia de ADN ligasa o defecto de la reparación de la transcripción asociada emparejada
Anemia de Fanconi (AF)
Sindrome de Bloom (BLM)
Aumento del riesgo de LMA y fallo progresivo de la médula ósea
Aumento de CCH en respuesta a los rayos ultravioleta o incorporación de BrdU
Terapia actual trasplante de medula ósea
Actividad anormal de la ADN ligasa I
MMC • mitomicma C: DEB = diepoxybutano: CCH = camOio de la cromdtida hermana: SNC = sistema nervioso central. RM • retraso mental: BrdU = bromodesoxiuridma: LMA = leucemia mieloide aguda
Alta frecuencia en la población ludía ashkenazi: 1/110 es portadora de esa frecuencia
CAPÍTULO 62
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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA
RESUMEN La citogenética es una ciencia de laboratorio de trabajo intensivo, relativamente antigua, que todavía se ejecuta de la misma manera en la que siempre se ha hecho, a pesar de que la llegada de los sistemas asistidos por ordenador para hacer cariotipos y el recolector robótico han añadido un elemento de tecnología avanzada al laboratorio. Aunque una vez se vaticinó que los diagnósticos moleculares eliminarían a la citogenética. eso no ha ocurrido, ya que la citogenética es aún el único ensayo clínico que puede proporcionar una visión general rápida de todo el genoma humano. En lugar de ser reemplazada, la citogenética ha cambiado con los tiempos para hacer (rente a los retos de las enfermedades que se han identificado recientemente y de las nuevas tecnologías. La utilización de la HISF ha rellenado el hueco entre la citogenética y los diagnósticos moleculares de tal manera que los dos campos proporcionan información complementaria para muchos casos. La citogenética continúa siendo importante en la valoración de las anomalías cromosómicas estructurales y numéricas, y es el estándar oro para diagnosticar muchos desórdenes. Su lugar en la medicina de laboratorio clínica está asegurado (por lo menos hasta el momento en el que el escáner tipo "Star Trek" está disponible).
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
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C A P Í T U L O
63
Organizando un laboratorio de diagnóstico molecular Andrea Ferreira-Gonzalez, Ph.D. David S. Wilkinson, M.D., Ph.D. Carleton T. Garrett, M.D., Ph.D.
INSTALACIONES DEL LABORATORIO
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LAS PRUEBAS MOLECULARES
Diseño del laboratorio
EQUIPAMIENTO
1335
PERSONAL DE LABORATORIO
1335
Limitaciones especiales en relación con las pruebas genéticas CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD
Director del laboratorio
DE LA CALIDAD
Supervisor técnico
1341
Control de calidad en el proceso de las pruebas
Técnicos médicos y técnicos en biología molecular
Control de calidad del equipo de laboratorio
Residentes, becanos y estudiantes graduados
Elementos del programa de seguridad de la calidad
Adiestramiento y acreditación 1337
ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO
Pruebas de desarrollo propio
Pruebas de los laboratorios clínicos
Métodos manuales basados en equipos
Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad
Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares SELECCIÓN DE PRUEBAS
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Reactivos específicos del sustrato
Métodos de ayuda en el control de contaminación
FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS
VALIDACIÓN ANALÍTICA Y CLÍNICA DE
1342
CONCLUSIÓN
1343
BIBLIOGRAFÍA
1343
1337
Codificación CPT e ICD-9 Patentes
Durante la última década se ha adquirido una enorme cantidad de conocimientos con respecto a los genes y a sus funciones en las enfermedades humanas. Esle conocimiento nos ha permitido una mejor comprensión del proceso de muchas enfermedades. Como consecuencia, las enfermedades se definen cada vez más en términos de su patogenia molecular. Esto ha conducido al desarrollo de nuevos métodos clínicos moleculares para su utilización en el diagnóstico, pronóstico, selección de modalidades terapéuticas y vigilancia de las enfermedades (Ferreira-González, 1996; Fredericks. 1999; Hodinka, 1998; Hruban. 1998; Sawyers, 1999; Tsongalis. 1999). Los métodos clínicos moleculares representan una serie de técnicas y reactivos en los que el principal analizado es el ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido deoximbonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Existen múltiples aplicaciones de esta tecnología a diferentes áreas del laboratorio clínico. Una de las principales ventajas de utilizar ácidos nucleicos como sustrato analizado es que representa el marcador natural más especifico de todos los organismos vivientes, esto es. el orden de los nucleótidos que comprenden el genoma de un organismo. El número de disposiciones diferentes de los cuatro diferentes nucleótidos, que puede estar presente en una molécula de ADN que sólo es tan grande como el virus de menor tamaño, es muchas veces superior al número total de los diferentes tipos de organismos vivos de esle planeta. Así. la secuencia del ADN de cada organismo vivo contiene una información peculiar que se puede utilizar para su identificación. Además, los cambios en las secuencias del ADN son la causa de enfermedades genéticas y malignas; por tanto, proporcionan una infor-
mación diagnóstica y pronostica muy importante Hasta hace poco, los principales métodos de laboratorio para detectar diferencias en la secuencia de los ácidos nucleicos no habían sido lo suficientemente sencillos o fiables como para utilizarlos en el laboratorio clínico. Los avances recientes en la tecnología y en la instrumentación, asi como los esfuerzos para su normalización, han podido vencer muchas de estas limitaciones.
INSTALACIONES DEL LABORATORIO La potencia del diagnóstico molecular se deriva de la exquisita sensibilidad y especificidad proporcionada por el uso de ácidos nucleicos como sustrato analizado. La alta sensibilidad se deriva de la amplificación m vitro de secuencias especificas diana de ácidos nucleicos presentes en la muestra procedente del paciente. La amplificación in vitro crea millones o billones de copias de la secuencia blanco y permite asi detectar hasta una única molécula diana en el espécimen del paciente. Al mismo liempo, sin embargo, esta alta sensibilidad presenta importantes desafios para el uso de esta tecnología. Asi, una de las principales ventajas de esta tecnología es también una de sus principales limitaciones. El cierre y apertura de los tubos de la microcenlrilugadora que contienen productos amplificados pueden producir microgotas en forma de aerosol que pueden transportar entre 10 y 100 copias de la secuencia diana amplificada. Estas microgotas pueden posteriormente depositarse en
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PATOLOGÍA MOLECULAR
los puntos de trabajo, instrumentos, mobiliario, suelo, polvo, pelos, piel expuesta: virtualmente cualquier superficie. Otra importante fuente de contaminación puede ser el propio ácido nucleico diana. Los métodos de manejo de las muestras siempre deben estar protegidos contra la contaminación cruzada de las muestras de los pacientes. La contaminación por el propio ácido nucleico diana nativo puede ser también el resultado del procesado de muestras de pacientes en un ambiente en el que el ácido nucleico diana sea amplificado biológicamente bien por clonación o cultivando la célula o los microorganismos que lo contienen. Así, es necesario diseñar cuidadosamente las instalaciones del laboratorio de diagnóstico molecular para asegurar que hay un espacio suficiente y adecuado para el personal y el equipo, y también para minimizar el potencial problema de la contaminación de especímenes con ácido nucleico diana natural y/o ácido nucleico procedente de una amplificación m v//ra(Porter-Jordan. 1990).
Diseño del laboratorio El espacio de laboratorio debe diseñarse para minimizar el riesgo de contaminación y maximizar el flujo de trabajo. El uso de barreras de contención mediante la utilización de áreas de trabajo separadas físicamente para el preparado de reactivos, acceso de muestras, extracción de ácidos nucleicos y análisis del material amplificado es altamente deseable. Un laboratorio ideal está compuesto de tres habitaciones completamente independientes. Dos de estas habitaciones se consideran habitaciones limpias, dado que todas las tareas y ocupaciones antes de la amplificación in vitro se realizan en estos cuartos. Estos cuartos se llaman habitaciones de preampliíicación. El tercer cuarto se considera un cuarto sucio, dado que se dedica a la amplificación in vitro y al análisis del material amplificado. Esta habitación se llama la habitación postamplificación. Los sistemas de tratamiento del aire de cada uno de estos cuartos deben ser completamente independientes uno de otro. Si ello no es posible, el laboratorio de preampliíicación debe localizarse lo más próximo posible a la fuente del aire. Si ello es posible, los laboratorios de preampliíicación deben estar dotados de filtros electrostáticos de aire instalados en la entrada de aire a cada laboratorio. Estos filtros deben vigilarse de forma periódica, incorporando el cambio y limpieza de los filtros de aire en el programa de control de calidad del laboratorio. Ademas de los filtros de aire, los laboratorios de preamplificación deben estar a presión positiva de aire. Esto impedirá la entrada de cualquier contaminante aéreo en el laboratorio de preamplificación cuando se abra la puerta. El laboratorio de postamplificación debe estar a presión de aire negativa para impedir la salida de cualquier partícula de este laboratorio, con la consiguiente contaminación del ambiente circundante. La construcción de una antesala en cada laboratorio es una forma barata de crear una presión diferencial en el laboratorio. Una antesala a presión positiva para el laboratorio de preamplificación se puede crear utilizando un ventilador en el techo de la antesala que extraiga el área de dentro del laboratorio y lo empuje hacia la antesala. Esta antesala a presión positiva tiene a grandes rasgos la misma función que tener todo el laboratorio bajo presión positiva. De lorma parecida, se puede construir fácilmente una antesala a presión negativa para la habitación de postamplificación haciendo que la turbina extraiga el aire de la antesala y lo sople hacia dentro del laboratorio. Esta antesala debe disponer de un método de sellado alrededor de la puerta que separe la antesala del laboratorio para evitar que el aire que está dentro del laboratorio vuelva a salir hacia la antesala. Un punto importante es que la puerta que conduce hacia la antesala desde fuera y la puerta que comunica con el interior del laboratorio nunca deben abrirse a la vez. Un método de seguridad adicional es añadir un suelo adherente en la entrada de cada antesala o laboratorio. El tamaño de la antesala lo determina las actividades que se llevarán a cabo en la misma. Las antesalas deben tener suficiente espacio como para permitir que por lo menos dos individuos entren o salgan del laboratorio y se cambien las ropas de laboratorio a la vez. Además, si se utilizan batas, gorros y cubrezapatos desechables especiales para el laboratorio, se necesitará espacio para su almacenamiento. En cada uno de los tres laboratorios se llevan a cabo diferentes actividades. La amplificación m vitro nunca se lleva a cabo en los dos laboratorios de preamplificación. Uno de estos últimos se dedica a la preparación de reactivos, y el otro al acceso y procesado de especímenes y al preparado de la reacción. En caso de que el espacio sea limitado, las dos habitaciones de preamplificación se pueden combinar en un solo laboratorio. Se recomienda alta-
mente el uso de campanas de "aire muerto" para el preparado de reactivos y organización de las reacciones, lo cual es aún más crítico en el caso de que ambos laboratorios deban estar combinados. Las campanas de aire muerto proporcionan un medio altamente controlado donde se pueden llevar a cabo el preparado de reactivos y reacciones. Es importante intentar localizar esta zona en una sección de laboratorio que tenga poco tráfico. No se deben introducir ARN, ADN o especímenes de pacientes tanto genómicos como plásmidos dentro de la caja de aire muerto donde se realiza la preparación de los reactivos. Esta caja de aire muerto debe estar provisla de una luz ultravioleta para colaborar a esterilizar las superficies interiores. Las superficies de las cajas de aire muerto también se deben tratar con una solución recién preparada de hipoclorilo sódico al 10% (lejía) y posteriormente con una solución de etanol al 75% después de trabajar en la zona. Estas áreas deberían contener un equipo e instrumentación específicos que no se deben compartir con ninguna otra área Esto debería comprender las pipetas, el agitador, las puntas, los tubos y otro instrumental similar. Se debe utilizar un traje y guantes específicos de laboratorio antes de trabajar en esta zona. La segunda área o habitación limpia dentro del laboratorio de preamplificación es donde se lleva a cabo el acceso de los especímenes, su procesado y la adición de ácido nucleico a los tubos de reacción adecuados. Esta área debe estar provista con por lo menos un gabinete de bioseguridad ambiental para procesado de muestras y extracción de ácidos nucleicos además del equipo de laboratorio especifico, que sólo se debe utilizar para estos fines. Debería disponerse de otra cabina de bioseguridad medioambiental completamente separada si en este laboratorio se lleva a cabo cualquier tipo de cultivo tisular, y debería existir equipo de laboratorio separado dedicado a esta labor. Si en el laboratorio se utilizan extracciones de ácidos orgánicos nucleicos, se debería disponer de una cabina de seguridad química para manejar los pasos que comprenden lenol y cloroformo durante el proceso de extracción. Si se llevan a cabo extracciones tanto de ARN como de ADN en el mismo laboratorio de preampliíicación. se deberían realizar estos procedimientos en áreas separadas del laboratorio y tener instrumentos específicos para cada uno. así como pipetas y puntas para cada método. En circunstancias donde hay problemas de espacio y no es posible dedicar dos áreas completamente separadas, la extracción del ADN y del ARN debe llevarse a cabo en momentos diferentes o en días diferentes después de limpiar a fondo las áreas antes de trabajar. Como ya se ha descrito, todas las áreas deberian limpiarse con una solución al 10% de hipoclorito sódico preparado en el día y con una solución de etanol al 75%. El laboratorio de postamplificación es donde se realiza la amplilicación in vitro y el análisis de ácido nucleico. Los instrumentos que se utilizan en este laboratorio no se deben compartir con las áreas de preamplificación Si se utilizan termocicladores para la amplificación in vitro de los ácidos nucleicos, se recomienda que se coloquen en este laboratorio. Si los termocicladores se colocan en el laboratorio de preamplificación. bajo ninguna circunstancia se deben abrir los tubos de reacción después de la amplificación en este cuarto. Además, los termocicladores deben enchufarse en líneas específicas con su propio disyuntor de circuito para evitar cualquier fluctuación en la electricidad que pudiera afectar a su funcionamiento. Normalmente, este laboratorio necesitará de más espacio que los laboratorios de preamplificación debido a los requerimientos de espacio de la instrumentación y de los métodos de análisis del producto amplificado. La electroforesis en gel. por ejemplo, utiliza con frecuencia una cantidad significativa de espacio. Se recomienda disponer de una cabina de seguridad biológica y de una incubadora por agitación si se van a llevar a cabo métodos de clonación. También es altamente deseable disponer de un cuarto oscuro con una procesadora automática de radiografías y un congelador. Sin embargo, es preferible colocar el cuarto oscuro fuera del laboratorio de postamplificación, de manera que se pueda tener acceso al mismo sin tener que entrar en el laboratorio de postamplilicación.
Métodos de ayuda en el control de contaminación La introducción de prácticas sencillas en las actividades ordinarias puede ser útil en el control de la contaminación, tanto de las muestras como de la amplificación. Se debe seguir estrictamente un flujo de trabajo unidireccional en el que el personal lleve a cabo sus tareas primero en los cuartos limpios, y sólo después de completar su trabajo se muevan a la habitación de postamplificación. Ningún personal que haya trabajado en el laboratorio de postamplifi-
CAPÍTULO 63
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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
cación debe volver al área de preamplificación antes de ducharse y cambiarse de ropa. Se recomienda el uso de batas de laboratorio, gorros y cubrezapatos de un solo uso. Si se utilizan batas de laboratorio de tela, es necesario tener batas de laboratorio especiales para cada laboratorio, que deben mantenerse dentro de cada laboratorio y no se debe utilizar en las áreas externas. El uso de batas con diterentes colores para cada zona es una forma de recordar al personal el estricto flujo de trabajo. Otro factor importante en el flujo de trabajo del laboratorio es la limpieza. El método más seguro es hacer que el personal del laboratorio guarde en bolsas la ropa sucia de cada laboratorio y lo coloque fuera del mismo para ser llevado a la lavandería. Si el personal de lavandería entra en los laboratorios, debe recibir las instrucciones de quitar primero la ropa sucia del cuarto de preamplificación, después del espacio de oficinas y después de la sala de postamplificación. No se recomienda proteger los mostradores de trabajo con papel absorbente que lleve plástico detrás, dado que el papel puede recoger polvo y, con él, material amplificado si no se cambia a menudo. Si se utiliza, este tipo de papel debe descartarse de forma inmediata después de cada uso. El uso de lejía parece ser el método más aceptado de descontaminar superficies. La descontaminación de los mostradores, equipos de laboratorio y muebles debe llevarse a cabo enjuagándolos con una solución fresca de lejía al 10% y después con una solución de etanol al 75%, o incluso con agua para diluir la lejía que podría corroer las superficies. Todas las puntas de pipeta deben contener un filtro hidrófobo para evitar cualquier contaminación de la punta de la pipeta con las plantillas o con el material amplificado. La evaluación de la hidrofobicidad puede conseguirse haciendo que la pipeta aspire por encima de su límite superior una solución coloreada, para determinar entonces si la punta de la pipeta se ha teñido. Las puntas de pipeta deben desecharse en bolsas de plástico sellables, asegurándose de que las bolsas están completamente selladas antes de desecharlas. Los guantes se deben cambiar de forma periódica o tan pronto como se sospeche cualquier contaminación. Otro método de prevenir la contaminación por amplicones es tratarlos químicamente de manera que no sean capaces de soportar amplificación incluso si se transfieren de forma accidental a otra muestra. La contaminación por amplicones se identifica por la presencia de señal positiva en un control negativo. El amplicón se puede destruir por vanos métodos. El método más utilizado es por el uso de irradiación UV. El tratamiento con UV del ADN induce el entrecruzamiento de las dos cadenas por formación de dimeros de timidina. Este ADN entrecruzado ya no sirve como una plantilla eficaz. Una desventaja del tratamiento con UV es que es más eficaz cuando el amplicón es de más de 700 nucleótidos de largo, y muchas pruebas comerciales utilizan amplicones de tamaño más pequeño. Otro método para inaclivar o esterilizar amplicones es por medio de la incorporación de trifosfato de desoxiuridina en vez de trifosfato de desoxitimidina en el amplicón durante la amplificación (Udaykumar, 1993). En este método se incorpora al amplicón trifosfato de desoxiuridina en vez de timidina. Después de la amplificación, si este amplicón que contiene uracilo se transfiere accidentalmente a otra muestra, el tratamiento de la muestra antes de la amplificación con uracil-rV-glucosilasa (UNG) dará lugar a la destrucción del amplicón que contiene uracilo. El amplicón que contiene uracilo es un sustrato para el UNG, mientras que el ADN nativo que contiene timidina no lo es. El UNG elimina los residuos de uracilo del amplicón mientras que inicialmente deja intacta la estructura de fosfodiésler del amplicón. Sin embargo, durante el primer paso de desnaturalización del método de amplificación, las uniones foslodiésler se rompen en los puntos donde se localizaron los residuos de uracilo. El amplicón fragmentado ya no es por tanto capaz de actual como plantilla. El uso de UTP y de UNG ha demostrado ser eficaz si el amplicón que contiene uracilo no supera las 10M0 copias por reacción (Espy. 1993). También se han utilizado los isopsoralenos con cierto éxito. Después de la amplificación, la exposición a la luz UV de onda larga produce uniones entre los isopsoralenos y la citosina que existe en el material amplificado, haciendo ineficaz al amplicón como plantilla para la amplificación (Jinno, 1990). 7
La transferencia de papel entre los laboratorios y la parte administrativa constituye una preocupación. Esto debe reducirse tanto como sea posible, en especial para el papel de trabajo utilizado en el laboratorio de postamplificación. Es muy recomendable la instalación de una red de ordenadores en el laboratorio con un cierto número de terminales en los diterentes laboratorios y en las áreas administrativas para reducir o eliminar el movimiento de pape-
1335
les a través de laboratorio y de vuelta hacia el área administraliva. Es importante que el servidor de la red se someta diariamente a copias de seguridad.
EQUIPAMIENTO El equipamiento de laboratorio necesario para llevar a cabo con éxito las actuales pruebas diagnósticas moleculares puede incluir instrumentación que no se suele encontrar en el típico laboratorio clínico. Incluso donde hay una superposición, es importante que el laboratorio de diagnostico molecular contenga su propio equipo a fines de control de la contaminación. En la Tabla 63-1 se proporciona una extensa lista de equipo de laboratorio junto con sus precios aproximados. Algún equipo adicional especializado no incluido en esta lista, que pudiera ser útil dependiendo de la perspectiva del menú de pruebas, comprende un secuenciador automático de ADN (45.000-125.000 dólares), un termociclador en tiempo real de la reacción de polimerasa en cadena (PCR) (45.000-95.000 dólares), instrumentos de electroforesis capilar (50.000 dólares) e instrumentación para la cromatografía líquida de alta resolución (20.000-40.000 dólares).
PERSONAL DE LABORATORIO Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnostico molecular se clasifican como laboratorios de pruebas de alta complejidad según la enmienda de
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Tabla 63-1 Necesidades y c o s t e s a p r o x i m a d o s de equipamiento Descripción Cantidad Coste' Termociclador de ADN Campanas de flujo laminar Refrigerador/congelador Congelador sin escarcha manual de 20"C Congelador a 70"C Microcentrifuga de cabeza angular. 14 OOO rpm Microcentrifuga horizontal. 14.000 rpm j Placa lavadora de micropocillos Lector de placa de micropocillos Balanzas electrónicas Medidor de pH Agitador/calentador de placas ! Baño de agua Alimentador de electioloresis j Apáralos de electroforesis mmi-PAGE Torres de moldeado de geles mini-PAGE Sistema de fotodocumentación Aparatos de electroforesis en gel de agarosa Procesador automático de placas radiográficas l Placas para aulorradiogratia (17 x 14 pulgadas) | Placas de autorradiografia (8x10 pulgadas) | Micropipetas normalizadas (tres tamaños) Sistema do verificación de temperatura para el termociclador Estación de trabajo de PCR Mezcladores por agitación Sistema de pipetas neumáticas Contador radiactivo Espectrofotómetro UV Contador Geiger Aparato secuenciador de ADN Alimentador para el secuenciador de ADN Hornos de hibridación Computadoras y programas Centrifuga refrigerada de sobremesa Incubadora Baño de agua en seco Microcentrifuga refrigerada TOTAL |^ "Los precios son sólo aproximados
2 2 2 2 '
2 1 •
1 :> :>
2 I 3 8 2 i 4 i 4 4 18 1 1 3 4
1 i
1 2 1 2 • IA 1 i 4 1
17 000$ 8 000$ 1.600$ 900$ 7000$ 3.200$ 2.500$ 6.500$ 7.500$ 2.000$ 1.000$ 500$ 2.000$ 2.000$ 3.200$ 990$ 9 000$ 1.600$ 3.800$ 1.600$ 800$ 3.780$ 1.400$ 1.500$ 750$ 800$ 2.500$ 8.000$ 485$ 1 600$ 2 000$ 4 000$ 10000$ 6 000$ 1 000$ 800$ 2800$ 128.105S
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÌA MOLECULAR
mejora de laboratorios clínicos de 1998 (CLIA'88) (Bachner. 1988: CLIA'88.1992). Esta ley impone unos requerimientos específicos de educación y entrenamiento para el personal que trabaja en estos laboratorios. Además, es importante tener en mente que estas pruebas no sólo son más complejas que las pruebas habituales de laboratorio, sino que también algunas de ellas se han desarrollado dentro de los mismos. Es más. eslas pruebas se modifican constantemente para mejorar factores como la especificidad, la sensibilidad, el tiempo de realización y el flujo de trabajo como resultado de la introducción de nuevas tecnologías.
Director del laboratorio Según CLIA'88. los directores de laboratorio de laboratorios de pruebas de alta complejidad deben ser bien un MD o un DO con experiencia en patología clínica o anatómica, un MD o DO con dos años de experiencia en dirección o supervisión de un laboratorio de pruebas de alta complejidad, o bien disponer de un grado doctoral en alguna de las ciencias biológicas y tener dos años de experiencia supervisando un laboratorio de alta complejidad. Las responsabilidades del director de laboratorio son la selección de pruebas, su implementación y la resolución de dificultades técnicas. El director de laboratorio es también el responsable del desarrollo de programas de laboratorio para la validación clínica y analítica de las nuevas pruebas moleculares y el desarrollo de guías y métodos de acción que aseguren la realización fiable de las pruebas clínicas. Además, el director de laboratorio debe ser responsable del desarrollo, implementación y revisión del control de calidad y de los programas de calidad del laboratorio.
Supervisor técnico Según CLIA'88. un supervisor técnico debe cumplir uno de los siguientes criterios para calificarse para este puesto. El individuo debe poseer bien un MD o DO con un año de experiencia en un laboratorio de pruebas de alta complejidad, un grado de maestro con dos años de experiencia o un grado intermedio con cuatro años de experiencia.
Técnicos médicos y técnicos en biología molecular Los técnicos médicos y técnicos en biología molecular son los responsables de las tareas necesarias para las operaciones diarias de la agenda de pruebas de laboratorio. Son los individuos responsables del acceso y procesado de los especímenes, de llevar a cabo diariamente las pruebas, mantener los registros adecuados de pruebas y control de calidad, adherirse a los procedimientos escritos y a las políticas de control de calidad, identificar problemas y documentar el mantenimiento de los equipos. El mantenimiento de registros de los métodos de laboratorio está complicado por el hecho de que los métodos desarrollados en el propio laboratorio se modifican constantemente para mejorar el proceso de las pruebas. Además, algunos instrumentos de laboratorio se usan solamente para las pruebas de diagnóstico molecular y existe poca experiencia del laboratorio clínico con ellas. Debido a estos factores, es importante que el personal técnico, y en particular el personal técnico superior, tenga un alto sentido de entrega profesional y que muestre un constante interés y esfuerzo en mejorar su educación y adiestramiento Es también importante que adquieran todas las habilidades avanzadas de laboratorio que sea posible y que reciban un adiestramiento cruzado en la mayoría o todas las diferentes pruebas que se usen en el laboratorio. Es crucial para el personal técnico comprender plenamente las bases científicas de la metodología y las aplicaciones e implicaciones clínicas de las diferentes pruebas moleculares.
Residentes, becarios y estudiantes graduados La captación de residentes, becarios y estudiantes de últimos años puede contribuir de forma significativa al éxito de un laboratorio de diagnóstico molecular. El valor de estos individuos proviene de su alto nivel de entrega profesional y de su visión acerca de la utilidad clínica de las pruebas individuales. Si tales individuos disponen de tiempo para trabajar en el laboratorio de diagnóstico molecular, con frecuencia son capaces de desarrollar y validar rápidamente un nuevo método de diagnóstico molecular. A cambio, estos
individuos ganan experiencia en un área de la medicina de laboratorio de rápido crecimiento, y esto les puede proporcionar una ventaja cuando busquen empleo en el futuro. Como parte de su adiestramiento en diagnóstico molecular, es importante para los residentes, becarios y estudiantes ganar experiencia en cada una de las diferentes áreas de pruebas, incluyendo las enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y cáncer. El adiestramiento debe incluir los principios básicos de biología molecular: experiencia manual en optimizar, validar y llevar a cabo pruebas de diagnóstico molecular, en interpretación de resultados de las pruebas y en preparación de informes para su revisión. Los directores de laboratorio deben familiarizar a aquellos que se están adiestrando con los diferentes temas de tratamientos del laboratorio.
Adiestramiento y acreditación La certificación del nivel doctoral del personal que trabaja en los laboratorios de diagnóstico molecular puede seguir varias rutas diferentes dependiendo del tipo de grado doctoral, así como de otra experiencia en el adiestramiento. Una vía abierta a los individuos que tienen bien un grado de licenciatura o que ya son doctores lo proporciona el Consejo Americano de Genética Médica (ABMG), que está destinado a individuos que proporcionan servicios en genética médica. El Consejo Americano de Genética Médica es un miembro del consejo americano de especialidades médicas, que es la organización "madre" de estas sociedades y que proporciona certificados en patologia, pediatría, medicina interna, cirugía y aproximadamente otras 20 especialidades médicas. La certificación en genética consiste en un examen general seguido de un examen de subespecialidad en genética clínica, genética médica, citogenética clínica, genética clínica bioquímica o genética clínica molecular. Para ser candidato a un certificado por el ABMG. un individuo debe cumplir los criterios en el área de la certificación deseada. Para la certificación en genética clínica molecular, el candidato debe poseer un grado doctoral adecuado y haber completado dos años de adiestramiento en un programa acreditado. El candidato debe presentar un libro de trabajo de 150 casos clínicos moleculares, haber completado una prueba en genética clínica molecular y tener una lisia de competencia en varios métodos firmada por el director del laboratorio en donde se ha invertido la milad del tiempo del adiestramiento. El examen se ofrece cada tres años Recientemente, el Consejo Americano de Especialidades Médicas aprobó la solicitud de la Sociedad Americana de Patología y de la Sociedad Amencana de Genética Médica con respecto a crear un certificado conjunto de su especialidad en patología genética molecular. Los candidatos para este certificado deben tener un grado de MD o de DO, haber sido certificados por sus respectivos consejos, tener una licencia en vigor sin restricciones para practicar la medicina o la osteopatia en EE.UU. y haber completado un año de adiestramiento en un programa acreditado. Al día de hoy todavía no hay programas acreditados, pero se ha anticipado que la primera aprobación de un programa de adiestramiento tendrá lugar aproximadamente en junio de 2000, con la aceptación de los primeros candidatos tan pronto como en julio de 2001. Se espera que el examen de candidatos para el certificado de la subespecialidad en patología genética molecular tenga lugar en el año 2002. Las normas de adiestramiento en patología genética molecular están siendo todavía definidas por las diferentes organizaciones que participan en el certificado. Además del programa de certificación anterior, el Consejo Americano de Bioquímica Clínica (ABCC) ha aprobado un programa de certificación en diagnóstico molecular que será ofrecido por primera vez en junio de 2000. La ABCC es una corporación independiente, sin ánimo de lucro, que certifica a profesionales con nivel de doctor en bioquímica clínica y bioquímica toxicológica. Las normas y regulaciones de la ABCC para certificar en diagnóstico molecular se han establecido recientemente. Antes de la admisión al examen, el solicitante debe tener algún certificado en cualquiera de los siguientes consejos: ABCC. Sociedad Americana de Microbiología Médica, Sociedad Americana de Patología, Sociedad Americana de Inmunología de Laboratorio Médico. Sociedad Americana de Bioanálisis o Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética. Los solicitantes deben cumplir unos requisitos de experiencia y de formación además de proporcionar tres cartas de recomendación que certifiquen la experiencia profesional del solicitante, su duración de experiencia en ese campo, y asi sucesivamente. El examen se realizará dos veces al año.
CAPÍTULO 63
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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
El certificado de subespecialidad en diagnóstico molecular está siendo ofrecido a individuos con nivel no doctoral, incluyendo técnicos médicos y técnicos de biología molecular a través de la Agencia Nacional de Credenciales para el Personal de Laboratorio (NCA). La NCA es una organización no lucrativa y no gubernamental que lleva a cabo el certificado del personal de laboratorio. Los técnicos médicos y los técnicos en biología molecular quedan certificados como especialistas de laboratorio en biología molecular [LSp (MB)]. Existen tres vías para llegar al examen de la NCA. En una, los candidatos deben haber completado un mínimo de experiencia de trabajo de doce meses en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios. Otra vía es haber completado un programa de licenciatura o poslicenciatura en biología molecular patrocinado por una institución o universidad acreditadas, que incluya seis meses de experiencia de trabajo en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios. La última vía es ser un científico de laboratorio clínico certificado o equivalente y completar un programa de certificación poslicenciatura en biología molecular patrocinado por una facultad o universidad acreditadas y completar un equivalente de seis meses de experiencia a tiempo completo en un laboratorio de biología molecular con todos los servicios. Este examen se ofrece dos veces al año en más de 80 centros a través del país e incluso en centros extranjeros seleccionados. Es probablemente deseable que todos los técnicos que trabajen en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios, en particular el personal técnico superior, dispongan de acreditación en diagnóstico molecular.
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paso de la totalidad del método es la responsabilidad del laboratorio que ofrece el test y se comenta más adelante en otra sección
Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares La disponibilidad de sistemas automatizados para desempeñar pruebas moleculares va en aumento. Estos instrumentos pueden desempeñar funciones únicas o múltiples en relación con las pruebas moleculares. El ejemplo típico de un instrumento automatizado de función única es un termociclador, que lleva a cabo todos los pasos necesarios para la amplificación de los ácidos nucleicos. Otros instrumentos automatizados de función única comprenden los extractores de ácidos nucleicos, los sistemas automáticos para la preparación y dosificación de reactivos y los secuenciadores automáticos de ADN. Más recientemente se han desarrollado también instrumentos automáticos que realizan más de una función. Un sistema automático introducido por sistemas moleculares Roche es el analizador COBAS Amplicor. Este instrumento contiene un termociclador, un brazo robótico cartesiano en tres dimensiones, bloques de calentamiento, estaciones de lavado e incluso un lector de colorimetría. Se ha previsto que en un futuro próximo estén disponibles instrumentos completamente automatizados que incluyan estas tres funciones, así como la extracción automática de ácidos nucleicos.
SELECCIÓN DE PRUEBAS FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS Existen dos principales formatos de pruebas utilizados en la mayoría de los laboratorios que realizan pruebas de diagnóstico molecular. Los dos formatos son las pruebas propias desarrolladas por cada laboratorio, conocidas también como ensayos de recela propia, y los basados en reactivos proporcionados en forma de equipo por los fabricantes de sistemas médicos.
Pruebas de desarrollo propio Las pruebas de desarrollo propio son aquellos análisis que se han desarrollado y validado por completo en el laboratorio que las lleva a cabo. Por lo general, estos análisis utilizan una combinación de reactivos que se compran por separado de diferentes fabricantes. Cada laboratorio determina las características de realización del análisis para un estudio clínico y para una población en particular de pacientes. La validación analítica y clínica de la totalidad del proceso es responsabilidad de cada laboratorio.
Métodos manuales basados en equipos Con respecto a los métodos manuales basados en equipos, el fabricante del sistema médico puede proporcionar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la prueba, o simplemente proporcionar reactivos de calidad controlada para llevar a cabo cualquier paso particular de la prueba. Un ejemplo del primer grupo es el equipo para controlar la carga viral en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos equipos proporcionan reactivos necesarios para todos los pasos del proceso de la prueba, incluyendo el aislamiento de los ácidos nucleicos, la amplificación y la detección. Incluyen también información con respecto a la sensibilidad, especificidad y limites de tolerancia para cada proceso clínico en particular. Estos equipos pueden estar etiquetados por el fabricante como aprobados por la Food and Drug Administralion (FDA), como despachados por la FDA, solamente para uso de investigación o para fines científicos. La validación analítica y clínica de estos equipos por los diferentes laboratorios es diferente dependiendo del etiquetado. Los métodos de validación serán analizados en una sección posterior. Un ejemplo de la segunda categoría de métodos basados en equipos son aquellos disponibles comercialmente para la extracción de ácidos nucleicos, reactivos de amplificación que comprenden controles y sistemas de detección para ácidos nucleicos amplificados m vilro. En algunos casos un laboratorio desarrollará una prueba molecular combinando dos o más equipos de fabricantes iguales o incluso diferentes. La validación analítica y clínica de cada
El objetivo principal del laboratorio de diagnóstico molecular es proporcionar de forma fiable y en tiempo adecuado resultados de pruebas referentes a muestras que parecen ser importantes para la atención de los pacientes. Cuando se considera qué pruebas se deben ofrecer, se deben tener en mente algunas consideraciones clave. Es importante que cualquier nueva prueba mejore de alguna forma el tratamiento de los pacientes, y que esto sea además eficaz con respecto al coste. Una nueva prueba puede proporcionar un método más barato o más eficaz para diagnosticar o controlar una enfermedad. Es importante que las decisiones referentes a elegir pruebas se basen no solamente en el coste de realizar la prueba sino también en cómo la nueva prueba pueda afectar de forma global a los cuidados y atenciones del paciente. Hay algunas circunstancias donde las pruebas moleculares puede que parezcan aumentar el coste del tratamiento de los pacientes añadiendo una prueba nueva a la batería ya existente de análisis para un proceso clínico particular. Sin embargo, al introducir la nueva prueba, el tratamiento de los pacientes podría ser más eficaz. Por ejemplo, la introducción de las pruebas de carga viral para el VIH-1 para controlar la progresión de la enfermedad y la eficacia del tratamiento farmacológico en individuos infectados por VIH-1 han colaborado de forma significativa al tratamiento de estos pacientes. Un gran número de pacientes inleclados por el VIH-1 están siendo tratados actualmente con una combinación de entre dos y cinco fármacos diferentes, que incluyen inhibidores de las proteasas y fármacos no-nucleosidicos. que han resultado ser muy eficaces en reducir la morbilidad y la mortalidad en un gran número de pacientes infectados por VIH-1. Sin embargo, estos fármacos son muy caros, por lo que es importante tener medios eficaces de controlar su efectividad si deben proporcionar el máximo beneficio al paciente. Sin pruebas de carga viral los clínicos deberían basarse en recuentos de CD4 y en los síntomas clínicos, que pueden ser en ambos casos marcadores poco sensibles de efectividad farmacológica hasta que uno se encuentra en las últimas fases de la enfermedad por VIH (Ferreira-González, 1995). El ejemplo anterior muestra el impacto sobre el tratamiento de los pacientes y la introducción de una nueva prueba, pero hay otros ejemplos en los que la rentabilidad se ve favorecida sustituyendo pruebas ya existentes de laboratorio. Esto puede producirse si la prueba molecular proporciona una mejor sensibilidad o especificidad, o un tiempo de realización reducido que impacte directamente sobre el tratamiento del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes con una posible infección por Mycobacterium tuberculosis necesita que sean tratados con fármacos que tengan una potencial toxicidad hepática y que sean aislados hasta que se confirme en el laboratorio el diagnostico de presunción. La prueba habitual de laboratorio de examinar directamente un espécimen del paciente buscando la presencia de Mycobacterium tubérculo-
SECCIÓN V I I
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PAIOIOGÍA MOLECULAR
sis carece de sensibilidad pero es extremadamente rápida Por otro lado, el cultivo es exquisitamente sensible, pero puede tardar hasta seis semanas en proporcionar resultados. A la vista de este dilema, una prueba molecular que permita un diagnóstico más rápido con un mayor grado de sensibilidad y especificidad permitiría interrumpir un tratamiento farmacológico y un aislamiento en aquellos pacientes que no tienen la enfermedad, reduciendo así los costes para el paciente y mejorando la atención médica. La identificación de las pruebas que se deben ofrecer en un centro médico es sobre todo la responsabilidad de los directores médico y técnico del laboratorio de diagnóstico molecular. A veces se puede ayudar en este aspecto revisando la lista de pruebas que el cenlro médico realiza fuera del mismo. En otros casos, individuos clave como clínicos y patólogos pueden ser una fuente valiosa para identificar las necesidades de un centro médico en particular. Es importante para los directores de laboratorio identificar claramente un área donde exista una necesidad percibida de mejorar las herramientas disponibles para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Durante el proceso de selección de pruebas, se debe llevar a cabo un ajuste real de las capacidades técnicas dentro del laboratorio con las necesidades del mundo clínico real en cuanto a volumen de las pruebas, tiempo de realización necesario y costes asociados para llevar a cabo el análisis. Una vez que se ha identificado un análisis en particular, se deben abordar los diferentes sistemas para llevar a cabo el análisis. Por ejemplo, se puede utilizar la hibridización de tipo Southern blot, métodos de amplificación in vitro de ácidos nucleicos o incluso análisis citogenético o de fluorescencia de hibridación in situ (HISF) para realizar algunos análisis. Asi. es importante tener en cuenta la condición clínica y las ventajas e inconvenientes de cada uno de los diferentes sistemas para diagnosticar un proceso clínico en particular cuando se hace la elección final. El establecimiento de un periodo de pruebas para evaluar la utilidad clínica de una prueba en particular es una importante herramienta. Sí se diseña con cuidado, este período permitirá al laboratorio trabajar directamente con el usuario final de la prueba y proporcionar una vía para que estos individuos comprendan la utilidad clínica de la prueba y sus limitaciones. Es importante definir con claridad las medidas que se puedan evaluar al final del periodo del estudio clínico y que dará lugar en última instancia a la realización o exclusión de la prueba.
nerar una factura. Hasta hace poco sólo existía un nUmero limitado de códigos CPT para las pruebas de diagnóstico molecular. Los códigos originales identificaban métodos generales que comprendían partes de un estudio molecular, como la extracción de ácidos nucleicos, la digestión enzimática, la amplificación in vitro, y así sucesivamente. Más recientemente, se ha añadido un número de nuevos códigos CPT especilicos de prueba". Sesenta de estos nuevos códigos son códigos específicos de reactivos utilizados para las pruebas moleculares microbiólogos. Los códigos específicos de análisis, como el que se utiliza para la detección del VIH mediante PCR, están diseñados para incorporar todos los pasos, procedimientos y reactivos utilizados en el análisis. También hay diferentes códigos CPT para la detección del mismo microorganismo utilizando diferentes métodos. Por ejemplo, la delección mediante una técnica de sonda directa frente a la detección mediante amplificación in vitro o la cuantificación del organismo necesitan cada uno un código CPT dilerente. Para las pruebas moleculares sin un código CPT específico del análisis sigue siendo necesario utilizar una combinación de códigos generales CPT de procedimiento. En la Tabla 63-2 se listan ejemplos de cómo se pueden facturar pruebas con códigos CPT especilicos del análisis y pruebas que todavía necesitan una combinación de códigos generales CPT de procedimiento. Los niveles de reembolso para cualquier prueba individual están establecidos por los terceros pagadores y pueden tener poca relación con el coste real de llevar a cabo la prueba. En general, los terceros pagadores tienden a establecer niveles de reembolso de acuerdo con las tarifas establecidas por Medicare y por Medicaid. Para la facturación de estas pruebas no se necesita la aprobación de la FDA Recientemente, la FDA ha ordenado que para las pruebas no aprobadas por la FDA, donde se utilizan reactivos específicos del análisis, y que incluyen esencialmente todas las pruebas moleculares, se debe añadir al informe una nota que indique que la prueba se desarrolló, que sus características de capacidad se han determinado en el laboratorio y que esta prueba no ha sido ni prohibida ni aprobada por la FDA. Algunos terceros pagadores pueden negarse al reembolso de las pruebas que llevan una nota de este estilo, dado que creen que el coste de llevar a cabo tales pruebas debe ser soportado mediante ayudas de investigación, incluso aunque las características y la utilidad clínica de la prueba hayan sido validadas por el laboratorio.
Codificación CPT e ICD-9 Patentes
La facturación de las pruebas de diagnóstico molecular siguen el mismo procedimiento que cualquier otra prueba de laboratorio. Por lo general, se necesitan un código de terminología de procedimiento de facturación (CPT) y un código diagnóstico de la clasificación internacional de enfermedades (ICD9). Más allá de esto, el procedimiento es por lo general específico de cada centro, basándose en los métodos de facturación manual e informatizada que tengan lugar en la institución. Es importante determinar por anticipado la documentación necesaria y los accesos informáticos imprescindibles para ge-
Tabla 63-2
La inmensa mayoría de los sistemas de amplilicación in vitro son procesos patentados, y se debe obtener una licencia formal para el uso de estos procedimientos, o el laboratorio que los use será susceptible de ser perseguido por inlracción de patente. De forma tradicional, la licencia se obtiene para un procedimiento en particular adquiriendo un conjunto de reactivos, aprobado por la FDA y vendido por un fabricante que tiene la patente del proceso de amplificación. Este abordaje es muy limitado para las pruebas de diagnóstico
Facturación de diagnóstico molecular
Nombre de la prueba Factor V Leiden por PCR-RFLP
Código CPT
Número de veces que se factura el código CPT
Nombre o procedimiento de la prueba
83890
1
Aislamiento de ácidos nucleicos
83898 83892 83894 83912 t(9:22) por RT-PCR
VIH-1 carga viral CMV carga viral VHC carga viral
83890 83902 83898 83894 83912 87536 87497 87522
Amplilicación con sonda Digestión enzimática Electroloresis en gel Interpretación e informe
I •
1 2 2 1 1
1 1 •
t
Aislamiento de ácidos nucleicos Transcripción inversa Amplificación con sonda Electroforesis en gel Interpretación e informe VIH cuantitativo CMV cuantitativo VHC cuantitativo
CAPÍTULO 63
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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
molecular, dado que existe un número muy limitado de pruebas que hayan sido aprobadas por la FDA. Asi. un laboratorio que utilice un proceso particular patentado para pruebas clínicas debe primero negociar una licencia con el propietario de la patente. Es muy importante darse cuenta de que. dependiendo de la complepdad de la institución que busca el acuerdo y de la complejidad del propio acuerdo, este proceso puede tardar entre tres meses y un año para obtener una licencia que permita llevar a cabo y facturar el procedimiento con fines clínicos. Se deben tener unas consideraciones prácticamente idénticas con respecto al uso de información de secuencias necesarias para diseñar un estudio molecular. El uso para fines clínicos de información de secuencias para muchos genes de nuevo descubrimiento está frecuentemente patentado por los descubridores del gen, y el uso de la información de la secuencia sin una licencia incurre en las mismas responsabilidades de infracción de patentes. Por desgracia, dado el actual medio y la diversidad de las fuentes de información de secuencias, no está siempre claro si la secuencia se ha patentado o quién es el propietario de la patente. Es recomendable, antes de llevar a cabo desarrollos de cualquier prueba basada en secuencias publicadas y donde se está pensando destinar una gran cantidad de recursos, verificar con los investigadores que primero descubrieron la secuencia el estado real de las patentes.
VALIDACIÓN ANALÍTICA Y CLÍNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES La implementación de una nueva prueba clínica necesita que sea validada tanto analítica como clínicamente. Durante la validación analítica se determinan la sensibilidad analítica, la especificidad, la precisión y. para los estudios cuantitativos, la linealidad del método. La sensibilidad analítica de la prueba es una medida del limite inferior de detección del método en el sustrato diana. La especificidad analítica mide el grado en el que la prueba reacciona de forma cruzada con ácidos nucleicos que no son la secuencia diana pretendida. La validación clínica se centra en determinar la utilidad clínica de una prueba positiva o negativa en una enfermedad especifica. Es importante cuando se lleva a cabo la validación clínica examinar una muestra transversal completa de los individuos que serán parte de la población en la que se va a utilizar la prueba. La CLIA'88 define importantes diferencias entre la implementación de una prueba aprobada por la FDA y una que no lo esté. Los laboratorios que implementan una prueba aprobada por la FDA sólo necesitan verificar las características de capacidad de la prueba para las indicaciones en poblaciones parecidas a aquellas para las que ha establecido el fabricante. Por otro lado, la implementación de pruebas desarrolladas en el laboratorio necesitan una extensa documentación de la capacidad de la prueba, además de los pertinentes programas de control de calidad, para asegurar la capacidad diaria de la prueba (Ferreira-González, 1997). El primer paso para introducir un análisis molecular propio es optimizar cada paso del proceso analítico, lo cual incluye la extracción de ácidos nucleicos, amplificación, detección, cálculos e interpretación de resultados. Cuando se optimizan por separado cada una de las fases, es importante darse cuenta de que en la mayoría de los casos será necesario volver a optimizar cuando todas las lases se realizan de forma conjunta. Después de optimizar el análisis, es importante valorar el impacto sobre las características de los resultados del método de las diferentes variables preanalíticas. como la clase de espécimen, el transporte, el manejo y la conservación de la muestra y las sustancias que interfieren, como lipidos, hemoglobina, bilirrubina y así sucesivamente. Después de la optimización, los laboratorios deben llevar a cabo una validación analítica del método. Esto puede ser difícil debido a la falta de normalización, paulas y materiales normalizados de referencia para un gran número de ácidos nucleicos diana. Esto impacta de lorma negativa sobre la capacidad de un laboratorio para determinar la sensibilidad y precisión del método. Diferentes organizaciones nacionales e internacionales están dando pasos para desarrollar estándares, pautas y materiales normalizados de referencia. Diferentes sociedades profesionales, agencias federales y organizaciones sin ánimo de lucro han desarrollado pautas y normativas para los diagnósticos moleculares (Tabla 63-3). Con respecto a los materiales norma-
133?
lizados de referencia, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) ha desarrollado uno de los primeros materiales normalizados de referencia de ácidos nucleicos para las pruebas de identidad humana Más recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) introdujo un material normalizado de referencia para la hepatitis C para la validación de pruebas de ácidos nucleicos (NAT) para el estudio de sangre y productos sanguíneos. Están disponibles en el comercio paneles de referencia calibrados con respecto al material de referencia normalizado de la OMS (Boston Biomedica Inc, Boston, MA). Además, se ha hecho un esfuerzo para desarrollar reactivos de referencia para el VIH-1 tanto por la FDA como por otras diferentes compañías. En ausencia de materiales normalizados de referencia, los laboratorios deben desarrollar su propio material de referencia para sus estudios de valoración analítica y para la posterior vigilancia de los resultados de la prueba. La creación de un material de referencia propio comprende el uso de métodos establecidos de forma independiente para determinar la concentración de ácidos nucleicos diana. De forma alternativa, los laboratorios pueden llevar a cabo estudios que comparen sus resultados con otros métodos ya establecidos. Por ejemplo, las muestras se pueden dividir para un estudio de comparación con otro laboratorio que lleve a cabo una prueba molecular parecida. Las muestras utilizadas para la validación analítica pueden ser de disposición propia o puede ser necesario obtenerlas de una fuente externa, como de un laboratorio colaborador, una agencia gubernamental (centros para el control y prevención de enfermedades [CDC], FDA o el Instituto Nacional de la Salud [NIH]) o incluso de un suministrador comercial. Una vez que se ha organizado un grupo adecuado de muestras, la validación analítica sigue las normas habituales utilizadas en otra clase de pruebas. La determinación de la sensibilidad y linealidad analítica se puede abordar llevando a cabo diluciones seriadas de muestras positivas para la diana que han sido estudiadas ya mediante otro método, o analizando especímenes diananegativos a los que se han añadido ácidos nucleicos diana purificados, microorganismos u otras células. La precisión de la prueba se valora haciendo determinaciones en un número de muestras de pacientes muchas veces en el mismo lote o en diferentes lotes a lo largo de varios días. Las muestras utilizadas para los estudios de precisión deberían abarcar el rango lineal dinámico de la prueba. Al igual que la precisión, la validación de la linealidad puede llevarse a cabo utilizando diluciones seriadas de un espécimen positivo en un espécimen negativo. La valoración de variables preanalíticas. como lipidos. hemoglobina, bilirrubina. fármacos terapéuticos y anticoagulantes presentes en el espécimen, puede realizarse añadiendo estas sustancias a especímenes negativos a los que se ha añadido una cantidad conocida de microorganismos, células o "diana" purificada (Lion. 1996). La validación clínica requiere la determinación de dos probabilidades: la primera, la probabilidad de que si la muestra procede de un paciente con la enfermedad la prueba sea positiva (sensibilidad clínica); y segundo, la probabilidad de que si la muestra proviene de un paciente que no tiene la enfermedad la prueba sea negativa (especificidad clínica). La evaluación de la sensibilidad clínica necesita pruebas de una cantidad adecuada de muestras de pacientes que hayan sido diagnosticados de la enlermedad La especificidad clínica se determina analizando muestras de pacientes diagnosticados con una enfermedad diferente que pudiera confundirse con la enlermedad indicada y que aparezca en el diagnóstico diferencial. Basándose de forma conjunta en la especificidad y sensibilidad clínica de la prueba, junto con el conocimiento de la prevalencia de la enfermedad, se pueden calcular los valores predictivos positivos y negativos de la prueba y evaluar la probable utilidad clínica del análisis. Desde el punto de vista práctico, la mayoría de los estudios de validación clínica son llevados a cabo comparando la sensibilidad y especificidad clínica del nuevo método frente a un grupo de muestras procedentes de la población objetivo que han sido estudiados mediante un "estándar oro" con respecto al sustrato analítico en cuestión. En algunos casos, las pruebas moleculares han parecido ser más sensibles y/o específicas que las actuales pruebas "estándar oro". La resolución de discrepancias entre la nueva prueba y la que se usa actualmente como método "estándar oro" puede en un cierto número de casos dar lugar a dilemas que necesitan la utilización de un método molecular diferente para resolver las discrepancias. Recientemente, la Association lor Molecular Pathology publicó un programa detallado de implementación
SECCIÓN VII
1340 Tabla 63-3
PATOLOGÍA MOLECULAR
Guías y estándares de las pruebas de diagnóstico molecular N o r m a s o estándares
Organización
Dirección
NCCLS
MM1-P Meiodos de diagnóstico molecular para enfermedades genéticas NCCLS 940 West Valley Rd. M M 2 - A Análisis de redisposiciún de genes de mmunoglobulinas y Suile 1400 receptores de células T Wayne. PA M M 3 - A Métodos de diagnóstico molecular para enfermedades infecciosas 19087-1898 M M - 5 Análisis de amplificación de ácidos nucleicos para hematología Wayne. PA molecular www nccls.org M M - 6 Diagnóstico molecular cuantitativo para enfermedades infecciosas M M - 7 Hibrídización in situ fluorescente para genética médica M M - 8 Medida e interpretación de repeticiones de trinucleOtidos
ACMG
Política de normas de estándares y pautas para los laboratorios de genética clínica ABMG/ABGC/ACMG. Hibridización in situ fluorescente de mterfaz prenatal Administrative office. Declaración de la ACMG sobre detección de marcadores múltiples en 9650 Rockville Pike. Bethesda. MD mujeres de 35 años y mayores 20814-3998 Síndrome de X frágil: pruebas de diagnóstico y portadores Normas de almacenamiento y uso de materiales genéticos Normas sobre detección de marcadores múltiples en mujeres gestantes Normas sobre el uso de pruebas de apolipoproteína E para la enfermedad de Alzheimer Puntos a considerar: éticos, legales e implicaciones psicosociales de las pruebas genéticas en niños y adolescentes Pruebas diagnósticas para los síndromes de Angelman y de Prader-Willi Declaración sobre detección poblacional para la mutación BRCA-1 en muieres judias ashkenazi Principios de detección: comunicado del subcomité sobre la detección del comilé de practica clínica de la Sociedad Americana de Genética Médica Comunicado sobre pruebas en portadores de la enfermedad de Canavan Declaración sobre pruebas genéticas para la fibrosis quistica
ASHI
Normas para la histocompatibilidad molecular y pruebas ¡nmunogenéticas
ASHI PO Box 15804 Lenexa. KS 66285-5804
NIII-DOI
Grupo de trabajo de pruebas genéticas que promueve unas pruebas genéticas seguras y efectivas en Estados Unidos: comunicado final del grupo de trabajo sobre pruebas genéticas
www nhgri.nih.gov/ELSI/TFGT-linal
FDA
Días para la industria sobre la manufactura y valoración clinica de pruebas m vitro para detectar in vitro secuencias de acido nucleico del VIH-1 www.fda.gov/cber/gdlns/nashivpdf Borrador de la gula para la industria y/o personal inspector de la FDA. normas previas a la comercialización para análisis en relación con www.fda.gov/cdrh/ode/1353pdl el virus de la hepatitis C (VHC) que están indicadas para el diagnóstico o monitorización de la infección por VHC o enfermedades asociadas: borrador de guias
AMP
Recomendaciones para desarrollo y operatividad doméstica de pruebas de diagnóstico molecular
Technical Working Group on DNA Analysis Methods
Guías para un control de mantenimiento de calidad para el análisis de ADN
para la introducción de la nueva prueba molecular (recomendaciones de 1999 de la AMP). La Tabla 63-4 proporciona una lista de tareas para llevar a cabo el proceso de pruebas clínicas.
Reactivos específicos del sustrato El término reactivo analítico del sustrato (ASR) fue desarrollado por la FDA para referirse a los reactivos utilizados en las pruebas clínicas que confieren especificidad para detectar el sustrato objetivo. La FDA define los ASR como "anticuerpos, monoclonales y policlonales. receptores especilicos. proteínas, lígandos. secuencias de ácidos nucleicos y reactivos similares que por medio de unión especifica o reacción química con sustancias de un espécimen están diseñados para su uso en una aplicación diagnóstica para la identificación y cuantificación de una sustancia química individual o ligando en especímenes biológicos". Las sondas y cebadores utilizados para detectar ADN o ARN objetivos se consideran ASR. A fecha de
Am J Clin Pathol 1999. 111 449 Crime laboratory Digest 1991; 18 44
noviembre de 1998, los laboratorios clínicos que utilizan métodos de tecnología propia que contienen ASR deben cumplir la normativa final de la FDA acerca de ASR publicados en el Registro Federal. Como parte de esta norma final, los laboratorios son requeridos para incluir una advertencia específica en sus informes afirmando que "Esta prueba ha sido desarrollada y sus características de capacidad determinadas por (nombre del laboratorio). No ha sido aprobada por la administración de fármacos y alimentos de Estados Unidos". Pero, al mismo tiempo, la FDA ha permitido a los laboratorios que añadan a esta coletilla que la prueba que utiliza ASR no precisa la aprobación de la FDA, que la prueba se utiliza con fines clínicos y que el laboratorio ha sido certificado por la CLIA'88 para llevar a cabo pruebas de alta complejidad. Además de la definición de los ASR, la FDA ha propuesto un coniunto de controles y restricciones que deben aplicarse a su uso para asegurar su calidad y uniformidad, y para aclarar que los laboratorios que desarrollan ensayos propios son los responsables de vigilar las capacidades de la prue-
CAPITULO 63
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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
ba. De forma interesante, estos controles se aplican tanto a los laboratorios que desarrollan ensayos propios que utilizan ASR como a los fabricantes de los reactivos para estos ensayos. Se solicita a los laboratorios que cumplan
Tabla 63-4
Llevando a c a b o el proceso d e p r u e b a s clínicas Consideraciones
Actividad Preparación de los reactivos
4. Recogida de especímenes
I
2.
3.
Procesado de los especímenes
1.
2.
Análisis del espécimen a Método de extracción
1.
b Organización del mCtodo, amplificación y detección 2.
Interpretación e informe
1 2.
Trabajar en el ambiente más limpio Almacenar las soluciones de trabajo en alícuotas de un solo uso. Realizar control de calidad en cada nuevo grupo de reactivos antes de su uso en pruebas clínicas Utilizar una muestra con un bajo número de copias para valorar la sensibilidad Preparación de las mezclas patrón para reducir errores y variabilidad. Establecer unos limites de tolerancia aceptables para cada tipo de espécimen que se deba analizar (temperatura de almacenamiento, tiempo de transporte, anticoagulanles, etc.) Distribuir protocolos para un adecuado manejo de las muestras a todos los usuarios potenciales. Recoger información clínica y analítica en formularios Los especímenes deben ser recibidos y almacenados en el laboratorio de preamplificación (limpio). Desarrollar pautas para asegurarse contra la mezcla de muestras y para mantener la integridad de la secuencia objetivo Valorar los métodos de extracción buscando la presencia de inhibidores y tactores que disminuyen el rendimiento del objetivo Control interno añadido a la muestra en el momento de la extracción para buscar falsos negativos debidos a inhibidores o determinar esta tasa por algún otro método Si no se va a evaluar un control interno con cada muestra de un paciente, entonces la tasa de falsos negativos deberia figurar en el informe en una nota, en caso de que el resultado sea negativo. Optimizar las concentraciones de cebadores MgCl.., dNTP; volumen; condiciones del ciclado y del sistema de detección. Desarrollar pautas para reducir al minimo la posibilidad de contaminación por el ácido nucleico plantilla o el amplicón (véanse secciones del control de calidad) Los controles deben procesarse de la misma forma que las muestras de los pacientes Desarrollar pautas para organizar el análisis y evitar la contaminación cruzada de la muestra y los controles. Desarrollar guias para la interpretación y los informes La interpretación debo ser realizada por lo menos por dos individuos y de forma independiente. Desarrollar pautas para la distribución de los informes.
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los requisitos de certificación de alta complejidad de la CLIA'88 y que determinen las características de los métodos propios siguiendo las regulaciones de CLIA'88 Los fabricantes de ASR son requeridos para registrarse ante la FDA, para seguir las normas de buena manufactura y para que restrinjan la venta de esta clase de reactivo a los laboratorios certificados bajo la CLIA'88 para pruebas de alta complejidad. Además, los fabricantes son responsables de comunicar a la FDA cualquier efecto adverso debido a fallos en el proceso de manufactura.
Limitaciones especiales en relación con las pruebas genéticas Las pruebas genéticas se llevan a cabo para el diagnóstico y/o valorar el pronóstico de trastornos de expresión fenotípica. para el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, determinación del estado de portador, y para realizar pruebas predictivas que valoren la probabilidad del futuro desarrollo del trastorno genético. Cuando se ofrecen pruebas genéticas se debe considerar un cierto número de limitaciones. La primera es que una prueba pudiera no detectar todas las posibles mutaciones que puedan estar presentes en un gen en particular que produce una enfermedad. Entre ejemplos de esto figuran el vasto número de mutaciones que se han identificado en el gen de la fibrosis quística y los dos genes principales para el cáncer de mama. Así. una prueba negativa pudiera no asegurar completamente que la persona examinada no transporta una mutación en un gen en particular. Al mismo tiempo, una prueba positiva puede comportar diferentes riesgos para el paciente en relación con diferentes frecuencias de penetración del trastorno en los distintos pacientes. Debido a la potencial complejidad con respecto a la interpretación de resultados de pruebas genéticas, es recomendable que un laboratorio que considere ofertar pruebas genéticas coordine estrechamente el desarrollo y la oferta de la prueba con el personal profesional clínico que utilizará los resultados de las pruebas para el cuidado de los pacientes. Una consideración añadida en relación con las pruebas genéticas son los esfuerzos a niveles tanto estatal como federal para imponer restricciones especiales en la realización de las pruebas genéticas. Esto ha sido expresado de la manera más frecuente con la proposición de normas que necesiten un especial consentimiento informado de los pacientes antes de que su muestra pueda utilizarse en cualquier prueba que estudie directamente el ADN del paciente en busca de mutaciones o polimorfismos genéticos. Es mas. estas normas propuestas podrían restringir el uso de todas las muestras de cualquier tipo para la investigación o para controles de pruebas clínicas a menos que se haya obtenido un consentimiento informado especifico para tal uso de lo que quede de las muestras de los pacientes. Esto hace preciso que los laboratorios que se propongan ofrecer pruebas de consejo genético estudien los requerimientos reguladores actuales de las autoridades tanto federales como estatales y de las sociedades profesionales pertinentes.
CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD
Control de calidad en el proceso de las pruebas El establecimiento de pruebas de diagnóstico molecular, en particular de los métodos de amplificación, necesita una especial consideración de cada fase del proceso, incluyendo la preparación de reactivos, la recogida de muestras, la separación de las mismas, la realización real del método y la comunicación de los resultados. Un método de laboratorio bien elaborado y correctamente escrito es un factor clave para asegurar que el método es reproducible. Es una de las ayudas más importantes durante el adiestramiento práctico del nuevo personal o cuando el método no se lleva a cabo con mucha frecuencia. El protocolo del método debe escribirse siguiendo guias especificas del Comité Nacional de Normalización de Laboratorios Clinicos (NCCLS). como figura en sus guías GP-A2 para escribir un manual de procedimiento técnico de laboratorio clínico. Para la interpretación de los resultados es vital una cuidadosa selección de controles. Se utilizan varios tipos de controles durante la ejecución de un
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
método para asegurar que un método específico funciona de manera adediferir en más de un par de minutos. Las fluctuaciones en los tiempos de ciclacuada. La CLIA'88 precisa controles positivos y negativos que deben llevarse do son un aviso de que el termociclador necesita ser ajustado y restaurado a a cabo en cada prueba clínica. El no ser capaz de obtener el resultado correcsu situación original. Además, el funcionamiento de las neveras y calentadoto para cualquiera de los controles invalida la prueba y necesita que se vuelres junto con la uniformidad del bloque de temperatura también se deben verivan a estudiar todas las muestras. Siempre que ello sea posible, los controficar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La verificación de la les positivos y negativos deberían parecerse al espécimen del paciente. Es uniformidad del bloque de temperatura se debe llevar a cabo utilizando un más. un control positivo debería contener la secuencia diana de ácidos nucleitermopar con una sonda térmica. cos a una concentración clínicamente relevante en un trasfondo de secuenOtros elementos importantes del equipo que se utiliza en práclicamenle cias negativas de ácidos nucleicos diana. El control negativo debe contener cualquier fase del análisis son las pipetas. Se debe poner un énfasis especial secuencias de ácidos nucleicos que se espere estén presentes en una muesen su control de calidad y en su mantenimiento, dado que pueden ser una tra negativa. Además de los controles positivos y negativos, en cada análisis importante fuente de error. Todo el resto de equipo debe ser igualmente condebería incluirse un control "blanco" que contenga todos los componentes de trolado y mantenido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. la mezcla de reacción a excepción de ácidos nucleicos. En circunstancias Siempre que ello sea posible, el calibrado del equipo se debe llevar a cabo donde un resultado negativo influya de forma significativa sobre el diagnóstiutilizando normas certificadas o materiales de referencia certificados. co, se debe incluir un control positivo interno. De otra forma, cuando se obtenga un resultado negativo, no estará claro si la ausencia de un amplicón se deElementos del programa de seguridad de la calidad be a la ausencia de la secuencia diana en la muestra del paciente o si se debe Todos los laboratorios de diagnóstico molecular deben desarrollar un proa la presencia de inhibidores que supriman la reacción de amplificación. Este grama de seguridad de la calidad exlenso y por escrito. El objetivo del progracontrol positivo interno puede ser otro gen que siempre esté presente en cada ma de seguridad de la calidad es vigilar y valorar, de lorma objetiva y sisteespécimen de ADN o ARN purificado del huésped. De forma alternativa, pomática, la calidad y adecuación de los resultados de las pruebas. El programa dría ser una secuencia incluida dentro de la muestra de lorma específica para de seguridad de calidad (QA) debe tratar cada una de las lacetas del proceevaluar la inhibición del método. Estos controles positivos internos son muy so de la prueba, desde la fase preanalitica hasta la fase analítica y postanaútiles para valorar la presencia de ácido nucleico amplíficable. la ausencia de lítica del proceso. El programa debe incluir unas políticas y documentación inhibidores y si las reacciones de detección y amplificación se llevan a cabo escritas de la educación y el adiestramiento del personal, educación médica de acuerdo con las normas. continuada, pruebas de eficiencia, inspecciones internas y externas, incluEl añadir controles para juzgar la sensibilidad de la reacción también es yendo la documentación o acciones correctoras de las deficiencias ciladas. importante. Se construyen tres o más diluciones en las que no se pueda programas de control de calidad para las pruebas clínicas, luncionamiento del detectar la dilución más baja. Esle control es muy útil para vigilar no sólo la equipo y seguridad. realización de la prueba a lo largo del tiempo sino también la presencia de El programa QA vigila los aspectos de pruebas clínicas que no inciden niveles bajos de contaminación del amplicón. directamente en la validación analítica de los resultados de las pruebas y que Es importante que los métodos de desarrollo propio implementen un prono son asi por lo general parte del programa del control de calidad. Algunos grama de control de calidad para valorar la potencia, la pureza y la capacide estos parámetros son el tiempo mensual de rotación, las revisiones mendad de cada reactivo crítico utilizado en el proceso del análisis. Cada reacsuales de los resultados anormales y normales, el desarrollo de criterios de tivo critico debe estudiarse antes de ser utilizado para pruebas clínicas. Se exclusión de muestras, la revisión del registro de especímenes rechazados y deben establecer límites de tolerancia para cada reaclivo crítico, Siempre los indicadores de calidad de las pruebas. Además, y como ya se ha mencioque ello sea posible, se deben establecer los niveles de tolerancia utilizannado, el laboratorio debe participar en programas de estudio de eficiencia. do una medida cuantitativa para evitar una valoración sujetiva de la caliHay un cierto nUmero de pruebas para las que las diferentes asociaciones dad del reactivo critico. profesionales han desarrollado programas de eficiencia. La Coitege ot Amencan Pathologists ofrece diferentes programas independientes y combinados Control de calidad del equipo de laboratorio para el diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas, oncología y Todo el equipo utilizado en los laboratorios de diagnóstico molecular debe genética. El programa de eficiencia en genética se ofrece en colaboración con tener un método escrito de control de calidad que describa para cada parte la American Cotlege of Medical Genetics. Recientemente, el CDC ha hecho del equipo los métodos de mantenimiento con sus registros asi como sus disponible un programa de evaluación de resultados para Mycobacterium calibraciones. El método de control de calidad debe estar escrito de acuertuberculosis y para el VIH-1. Para aquellas pruebas en donde no se ofrece un do con las normas publicadas por la NCCLS. Al igual que con otro equipo programa oficial de eficiencia, se recomienda altamente que se establezcan de laboratorio clínico, los límites de tolerancia para juzgar la adecuación de programas informales de eficiencia por medio del intercambio de muestras su funcionamiento y calibración clínica, que se debe utilizar durante las entre los laboratorios que ofrecen los mismos sen/icios. pruebas clínicas, también deben estar claramente definidos y vigilados de manera periódica. Cuando las verificaciones de capacidad o calibración caen fuera de los limites de tolerancia definidos para cualquier equipo en ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO particular, el instrumento debe quedar inmediatamente fuera de servicio para reparación. Después de la reparación, el equipo debe ser calibrado antes de volverlo a utilizar. Como parte del programa del control de calidad Pruebas de laboratorios clínicos desarrollado en cada laboratorio, todo el equipamiento, revisiones, calibraLos laboratorios que realizan pruebas en especímenes humanos con fines ciones y reparación de cada parte del equipo deben estar documentados y de diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad están sujetos a guardados de acuerdo con la política del laboratorio de retención de doculas regulaciones federales impuestas por CLIA'88. CLIA'88 establece normamentos. tivas diseñadas para mejorar la calidad en los laboratorios y expande la Los termocicladores son un elemento crucial en cualquier laboratorio de supervisión federal a prácticamente cualquier laboratorio clínico en EE.UU. Es diagnóstico molecular que realiza amplificación in vitro. Cualquier cambio en importante señalar que los laboratorios que llevan a cabo investigaciones no la capacidad de los termocicladores tiene un impacto directo en la precisión y están sujetos a la CLIA'88 a menos que el laboratorio de investigación expida sensibilidad del método que se lleva a cabo con ese aparato. Al igual que con resultados específicos a los individuos analizados, a sus familiares y a los cualquier otro instrumento, el mantenimiento, el control de calidad y el calimédicos que los tratan. Esto se aplica incluso si en el informe final hay colebrado de los termocicladores deben seguir las recomendaciones del fabritillas que establezcan que los resultados de las pruebas deben utilizarse con cante. De forma breve, y como parte de la vigilancia del funcionamiento de los fines de investigación solamente, o que la prueba sea gratuita CLIA'88 protermocicladores, la determinación y documentación del tiempo de ciclado, la porciona normativas específicas que se aplican a lodas las áreas del proceso verificación del punto de error y cualquier mensaje de error deberían también de la prueba, adiestramiento del personal, pruebas de eficiencia, control de quedar registrados. Los tiempos de ciclado entre diferentes lotes no deberían calidad y aseguramiento de la calidad. La legislación y sus regulaciones aso-
CAPÍTULO 63
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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
ciadas establecen un sistema de registro, así como sanciones y métodos disuasorios para asegurarse de que se mantienen las normativas establecidas
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CONCLUSIÓN
por las normas federales. Las regulaciones para implementar CLIA'88 fueron desarrolladas por el departamento de salud y servicios humanos (HHS) a tra-
Los mayores conocimientos y las mejoras en la tecnología han facilitado
vés del servicio de salud pública. Se ha asignado al CDC la tarea de clasifi-
el rápido desarrollo de nuevas pruebas moleculares que ya se han hecho
car la complejidad de varias pruebas para sustratos analíticos y para supervi-
habituales en la práctica médica (p. ej.. carga viral del VIH-1. pruebas de
sar la implementación de normativas. Recientemente, esta responsabilidad se
ADN para enfermedades genéticas). La secuenciación del genoma huma-
ha transiendo a la FDA. La FDA estaba encargada de revisar y garantizar la
no, que llegó a ser una prioridad nacional con la creación del Proyecto
seguridad y eficacia de las pruebas, y la administración de finanzas sanitarias
Genoma Humano de fundación general, se anticipa que estará completa
se destinaba a recoger tasas, expedir permisos, investigar a los laboratorios
para el año 2002 ó 2003. Más recientemente, diferentes compañías priva-
e iniciar acciones punitivas cuando era necesario. Bajo CLIA'88. las pruebas
das (Ciencias del Genoma Humano, Millenium Pharmaceuticals, Incyte
se han dividido como obsoletas, de microscopia, de moderada complejidad y
Pharmaceuticals y Celera Genomics) se han unido a los esfuerzos de se-
de alta complejidad. La clasificación de las pruebas en pruebas de compleji-
cuenciar el genoma humano. Además, la creciente disponibilidad de tecno-
dad moderada y elevada se desarrolló asignando una puntuación numérica a
logía fiable de alto nivel, como los secuenciadores automáticos de ADN, la
cada prueba Una prueba se considera como de complejidad moderada
PCR en tiempo real y los chips de ADN (Kunan. 1999). y asi sucesivamen-
cuando recibe una puntuación de 13 o menos. Cualquier puntuación superior
te, debería afectar de forma drástica a las pruebas de diagnóstico molecu-
se considera como altamente compleja. El sistema de puntuación tiene en
lar, proporcionando una tecnología más sólida, un menor tiempo de ciclado
cuenta algunos de los siguientes criterios: conocimientos necesarios para lle-
y una reducción de los costes. Las ciencias clínicas y básicas se combinan
var a cabo la prueba, adiestramiento y experiencia, disponibilidad de calibra-
para identificar nuevos marcadores moleculares que se puedan utilizar para
ciones, control de calidad, pruebas de eficiencia, características operativas,
el diagnóstico de enfermedades infecciosas, genéticas y neoplasias, asi
grado de interpretación y JUICIO, y asi sucesivamente.
como para la ciencia forense y la tipificación de tejidos. Analizando cambios
Las pruebas de diagnóstico molecular se consideran pruebas de alta complejidad y. como tales, los laboratorios que llevan a cabo estas pruebas deben buscar la acreditación del HHS. El HHS ha otorgado a la College ol American Pathologisls un nivel adecuado como agencia de refuerzo con respecto a estas normas aceptando el programa de acreditación de la sociedad como equivalente o más estricto en áreas de control y aseguramiento de calidad que las normativas descritas en CLIA'88. Otras organizaciones, que también han recibido un nivel similar, incluyen la comisión sobre acreditación de laboratorios, la comisión conjunta de acreditación de organizaciones sanitarias, la Asociación Americana de Osteopatía, la Asociación Americana de Bancos de Sangre (AABB) y la Sociedad Americana de Inmunogenética e Histocompatibilidad. Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnós-
sutiles en los genes y/o la expresión de los mismos cuando una célula se infecta por un virus o se transforma, es posible ganar una información importante no solamente para ayudar al diagnóstico sino también para el pronóstico o incluso vigilar la progresión de la enfermedad. Los actuales esfuerzos en la estadificación molecular de las neoplasias tanto sólidas como hematopoyéticas apuntan en esta dirección. Además, el nuevo campo de la farmacogenómica. que busca interpretar la influencia del polimorfismo genético sobre la eficacia y/o efectos secundarios de los agentes terapéuticos, tendrá un tremendo impacto en la futura atención sanitaria. El diagnóstico molecular esta todavía en su infancia. El crecimiento y los cambios en este campo serán una característica habitual en las pruebas clínicas y en un futuro previsible.
tico molecular buscan en general la acreditación a través del programa de acreditación CAP o de alguna de las demás organizaciones como un medio para cumplir las normativas reguladoras ya descritas. El CAP introdujo en 1993 una lista de patología molecular que ha sido puesta anualmente al día desde entonces. Además, la lista de revisión de patología molecular constituye un buen recurso cuando se está desarrollando un laboratorio de diagnóstico molecular con respecto al desarrollo de control de calidad, programas de aseguramiento de calidad, requisitos de los especímenes, misión de informes y temas similares.
Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de identidad con ADN o estudios forenses con ADN también deben estar acreditados para estos fines. Un medio de obtener la acreditación es a través de un programa ofrecido por la Sociedad Americana de Directores de Laboratorios Forenses (ASCLD) ASCLD ofrece un programa de acreditación de laboratorios criminales. Esta acreditación es un programa voluntario en el que puede participar cualquier laboratorio forense que realice análisis con ADN para demostrar que sus procedimientos, operaciones, personal, métodos, equipo, plan de seguridad física y métodos de seguridad cumplen con las normas propuestas por el grupo técnico de trabajo sobre métodos de análisis de ADN (TWGDAM). El Centro Nacional de Tecnología en Ciencia Forense (NFSTC) ofrece ayuda a los laboratorios forenses que se están preparando para la acreditación ASCLD/Lab .además de proporcionar certificados a los laboratorios de ADN que cumplen con las guias de la TWGDAM. Además, la Asociación Americana de Bancos de Sangre ha desarrollado pautas para las pruebas de paternidad que utilizan ADN y ofrece a través de su organización acreditaciones adecuadas. El programa de acreditación en pruebas de paternidad se basa en normas para realizar las pruebas de paternidad y cuida de la acreditación y valoración de los laboratorios que realizan estas pruebas. Hay más de 40 laboratorios acreditados por la AABB para pruebas de paternidad. Esta acreditación ayuda a los laboratorios a conseguir un control de calidad.
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C A P Í T U L O
64
Oncoproteins y detección tumoral precoz • Matthew R. Pincus, M.D., Ph.D. • Paul W. Brandt-Rauf, M.D., Ph.D., D.P.H. • William Koslosky, M.D. • William Appruzzse, Ph.D.
BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS
1344
1351
Eficacia diagnóstica de las oncoproteínas del suero
Marcadores tumorales ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL
EVALUACIÓN Y CONCLUSIONES
1345
Factores de crecimiento
Orígenes de los tumores malignos Tamaño tumoral y niveles de oncoproteína
Receptores de factores de crecimiento Proteínas G
BIBLIOGRAFÍA
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Oncoproteínas nucleares Detección de tumores mediante la medición de la proteína p53 Anticuerpos anti-p53 circulantes en la detección tumoral
un proceso de pasos múltiples que comienza en la membrana celular como resultado de la activación de un receptor de factor de crecimiento, que activa entonces a otras proteínas citosólicas y de membrana y a moléculas segundas mensajeras que transducen la "señal" mitogénica hacia el núcleo. Vías de transducción de señales. Se han podido aclarar algunos Marcadores tumorales pasos en la "via de transducción de señales" implicados en la transducción de la señal iniciada por el factor de crecimiento y que va hasta el núcleo, pero El control del proceso de la división celular en las células eucarióticas. en especial en las formas superiores de vida, es vital para los procesos de proli- muchos otros pasos no están completamente aclarados. Una vía bien establecida se resume en la Figura 64-1 para la vía señalizadora mitogénica induferación y diferenciación celulares. El delicado equilibrio entre estos dos procida por el oncogén ras. Esta figura muestra que cuando un receptor de faccesos está regulado por numerosas proteínas que interactúan en la célula tor de crecimiento se activa por su factor de crecimiento, activa a su vez para asegurarse de que éste se mantiene. Casi todas estas proteínas, muvarías proteínas intermediarias (grb-2 y SOS) que activan la importante prochas de las cuales son críticas en la regulación del ciclo celular, están codificadas por oncogenes. Las mutaciones en los oncogenes pueden resultar en teína G (esto es, la proteína ligadora de GTP) lamada ras-p21. Esta proteina de 21 kDa unida a la membrana, que contiene 189 aminoácidos, se activa la producción de proteínas que, o bien se activan de forma permanente para cuando la proteína SOS la induce para ligar GTP en lugar de GDP. En su estaestimular el crecimiento celular y su proliferación (como la proteína p21 codido activado (unida a GTP) ras-p21 activa directamente a ras (Moodie. 1993: ficada por el gen ras), o quedan inactivas para inhibir la proliferación celular Slokoe, 1994), que a su vez inducen una cascada secuencial de proleincina(como la proteína p53). Ambos sucesos dan lugar a células tumorales maligsas: esto es, MAP cinasa (MEQ) y la cínasa activada por mitógenos (MAP) nas. El conocimiento no sólo de la existencia de estos oncogenes y de las codificada por el gen ERK, como se muestra en la Figura 64-1. La MAP cinaoncoproteínas codificadas por ellos, sino también de los mecanismos mediansa activa directamente los factores de transcripción nuclear, siendo ios uno de te los cuales ejercen sus efectos, ha dado lugar a unas nuevas series de análisis altamente sensitivos, tanto de los oncogenes mutados como de sus pro- ellos. Esta importante proteína forma un complejo heterodimérico con otro factor de transcripción nuclear, jun. que se activa directamente por la cinasa, teínas mutantes codificadas. Los métodos que utilizan la amplificación, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para los oncogenes mutados, se ¡un cinasa (jnk). El complejo los-jun. lamado también AP1, se une a las regiones específicas del ADN genómico, induciendo la transcripción de proteínas exponen en otro punto de este texto. En este capítulo veremos cómo la detecmitogénicas tales como las ciclinas. De forma interesante, la transcripción de ción de estas proteínas oncogénicas, u oncoproteínas. que se encuentran en estas proteínas se bloquea por la proteína antioncogén p53 (Fig. 64-1), que a el suero de los pacientes con tumores malignos, permite diagnosticar un tumor maligno, a menudo en una fase precoz del desarrollo tumoral. Debido su vez induce la transcripción de proteínas antimitóticas tales como baxy waf. que inducen la apoptosis. a que el hallazgo de niveles elevados de cualquiera de estas oncoproteínas o formas mutadas de estas proteínas en el suero de un ser humano indica la En la Figura 64-1 se presentan también otras diferentes proteínas nucleapresencia probable de un tumor maligno, nos referiremos en esta capítulo a res importantes codificadas por oncogenes tales como myc. una proteína de estas proteínas como marcadores tumorales. 64 kDa que se sobreexpresa en el linfoma de Burkitt. Este oncogén proteínico no está directamente en la vía ras de transducción de señal. De forma inteLa oncogenesis, el proceso por el que las células normales se convierten resante, hay líneas celulares que. cuando se transfectan bien con el oncogén en malignas, comprende múltiples pasos, que se pueden clasificar grosso ras o con el oncogén myc. no sufren transformación celular, pero cuando se modo como iniciación tumoral y promoción tumoral. La propia mitogénesis es BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS
CAPÍTULO 64
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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
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Figura 64-1. Esquema de algunos de los componentes conocidos de la vía de transducción de señales ras empezando (arriba, a la izquierda) cuando un faclot de crecimiento se une a su receptor celular. El resto de los acontecimientos se explican en el texto. Abreviaturas: grb-2 = proteína adaptadora que une a la vez p2l y la proteina o tactor de intercambio de nucleótidos de guanina. SOS: proteína ras-p2i. definida en el texto: PLC = fosfolipasa C; DAG = diacil glicerol: PKC = proteina cinasa C; IP3 = mositol trifosfato: rat-\ = proteína codificada por el oncogén p74. que funciona como cinasa que fosforila otra cinasa de peso molecular 43 kDa. lamada MAP-2 cinasa cinasa. MEK. o MAP-KK en la ligura: MAP-2 kinasa = proteina cinasa activada por mitógenos o proteína cinasa-2 asociada a los microtúbulos (MAP-2K en la figura); GAP = proteína activadora de GTPasa [GAP], que promueve la hidrólisis del GTP a GDP unido a p2l : myc. tos y ¡un = oncogenes nucleares que codifican proteínas nucleares; NMP = proteínas de la matriz nuclear
transfectan a la vez con ambos oncogenes. experimentan transformación celular. Estos resultados indican que ras y myp pueden ser interdependientes, y son un excelente ejemplo prototipico de la naturaleza multifásica de la oncogenesis. Una característica central de los fenómenos de transducción de señal que se resumen en la Figura 64-1 es que las cascadas de activación están ordenadas y se encuentran bajo un estricto control regulador. Asi. por ejemplo, mientras SOS activa a ras-p21. la proteína activadora de GTPasa (GAP) induce la hidrólisis del GTP unido a ras-p21, dando lugar a su inactivación (Fig. 64-1). El MEK activado regula a la baja a SOS, disminuyendo el intercambio GDP; GTP por ras-p21 (Holt. 1996). Si una o más proteínas de vías como la que se muestra en la Figura 64-1 mutan de manera que no se puedan regular a la baja, es posible que se produzca una señal mitogénica continua que en última instancia de lugar a neoplasia. Cuantas más mutaciones de este tipo se produzcan, mas probable es que la célula sufra una transformación maligna. Así, lesiones progresivas en la via mitogénica pueden corresponder con las múltiples fases de la carcinogenesis. La Tabla 64-1 resume los mecanismos por los que cada tipo de elemento de transducción de señal ha resultado inducir la transformación celular, empezando por los factores de crecimiento, progresando a los receptores de factor de crecimiento, después a las proteínas G y a las cascadas de cinasas. y finalmente a las proteínas nucleares. Estos mecanismos se explican con más detalle en cada sección de este capitulo destinada a estas diferentes proteínas de transducción de señal.
ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL La detección de proteínas muladas de Iransducción de señal o de niveles elevados de proteínas de tipo "salvaie' en el suero o en los líquidos corporales es altamente sugerente de neoplasia: por tanto, se dispone ahora de muchos análisis para diferentes oncoproteínas en forma de kit. incluyendo determinaciones de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) para los factores de crecimiento como el factor-» transformador de crecimiento (TGF-a) y factor de crecimiento fibrobláslico (FGF). las proteínas EGFr y neu/HER-2. ras-p-21 del receptor de factor de crecimiento y las proteínas nucleares p53. myc y NMP22 de compañías tales como Oncogene Science (Uniondale. NY). Tritón
Bioscience (Houston. TX) y Matritech (Newton. MA) Diferentes estudios utilizan también la técnica de Western Blot o de Inmunoblot. como se ha descrito en otro capítulo de este libro. Numerosos estudios han documentado alteraciones en los oncogenes, oncoproteínas o expresión de factores de crecimiento en lo que se refiere tanto a ácido ribonucleico mensajero (ARNm) o proteínas, en tejido tumoral en com-
Tabla 64-1
M e c a n i s m o s para la inducción de la carcinogenesis por e l e m e n t o s de la vía mitogénica
Elemento de la via
Mecanismo de acción
1 Factores de crecimiento
a) Sobreproducción desde la célula y hacia sus proximidades b) Interacción con factores de crecimiento con receptores de elevada afinidad
2. Receptores de factores de crecimiento
a) Sobreexpresión que conduce a elevadas concentraciones de dimeros b) Pérdida del dominio extracelular que da lugar a una dimerizacíón permanente del receptor del factor de crecimiento y a una producción continua de señales c) Sustituciones de aminoácidos en el dominio transmembranoso que dan lugar a una dimerización permanente
3
a) Sobreexpresión de proteina normal b) Sustituciones de aminoácidos que cambian de forma permanente su conformación a una lorma activada c) Mutaciones que eliminan dominios reguladores de las cinasas
Proteínas cilosólicas proteínas G y cinasas
I 4 Oncoproteínas nucleares
a) Sobreexpresión de las proteínas de transcripción y replicación b) Mutaciones de proteínas antioncogénicas que las mactivan c) Mutaciones que eliminan dominios requladores
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÌA MOLECULAR
paración con el tejido normal (Pimentel. 1989: Brandt-Rauf. 1998). Diferentes estudios han estudiado las oncoproteinas o la expresión de factor de crecimiento en líquidos biológicos tales como orina o derrames, y han demostrado la posibilidad de utilizar estos péptidos y proteínas como marcadores para la presencia de neoplasia (Niman. 1985; Yeh. 1989). Los siguientes estudios han confirmado estos hallazgos iniciales, dando lugar al uso clínico de estos marcadores para detectar la presencia de tumores malignos. El enfoque de este capítulo se centrará por tanto en la identificación de diferentes oncoproteinas y factores de crecimiento en el suero, plasma u orina de pacientes con cáncer o con riesgo de desarrollar un cáncer. En la Tabla 64-2 se presenta un resumen de algunos de los muchos (más de 50) oncogenes conocidos y sus funciones en la célula. Aquellos de la Tabla 64-2 para los que se dispone de algún método comercial se marcan con un asterisco.
Factores de crecimiento Dado que varios factores de crecimiento parecen tener una función en la proliferación celular durante la tumorogénesis. y dado que los factores de crecimiento son segregados de forma activa al medio extracelular. son potencialmente objetivos atractivos para su detección en la sangre durante el desarrollo del cáncer. Hasta la fecha, son vanos los esludios que han sido capaces de demostrar diferencias en los niveles sanguíneos de factores de crecimiento entre los pacientes con cáncer y los pacientes control que no lo tienen. Factor transformador de crecimiento (TGF) a y 13. TGF-u es un polipéptido con 50 aminoácidos que se une al receptor EGF. que se dimeriza tras unirse con EGF. TFG-|i es una familia de proteínas etiquetadas desde |S. hasta |i . TGF-|Í, es un homodimero de dos subunidades de 12 kDa unidas por puentes disulfuro. Mientras que TGF-p" ha resultado ser elaborado por muchos tipos diferentes de tumores humanos malignos, se han encontrado niveles séricos elevados de este factor de crecimiento de forma predominante en tumores hepáticos y de vejiga. Curiosamente, se ha encontrado que TGF-|) inhibe la mitosis de ciertas lineas celulares especificas en cultivo, tales como las células epiteliales bronquiales del visón. Asi. el suero de los pacientes que tienen tumores que elaboran este factor de crecimiento se puede analizar en su busca midiendo el grado de inhibición de crecimiento celular. s
La actividad TGF-ji. determinada por medio de esta técnica, ha resultado estar notablemente elevada en pacientes con carcinoma hepatocelular pero no en pacientes control de la misma edad (Shirai, 1992). En el suero de los pacientes que se han sometido a una resección quirúrgica de estos tumores,
la actividad de TGF-ji es escasamente detectable, sugiriendo que el tumor era la fuente de los niveles elevados del factor de crecimiento del suero. De forma interesante, en muchos pacientes con carcinoma hepatocelular se ha observado que TGF-|i está elevado en orina (Tsai. 1997). El uso de un ELISA con un anticuerpo monoclonal dirigido contra TGF-|j. ha revelado que TGF-p\ está elevado en una gran proporción de pacientes con un cáncer de vejiga invasivo pero no en pacientes con tumores de vejiga no invasivos ni en pacientes sin cáncer (Klocker, 1994). Recientemente, se ha descrito un nuevo marcador tumoral para el cáncer de vejiga que parece ser más exacto para detectar los cánceres de vejiga tanto invasivos como no invasivos, y que es la proteína de matriz nuclear NMP22. detectada en orina y de la que se habla más adelante. Asi, los estudios séricos en busca de TGF-|i son muy utiles para diagnosticar y hacer seguimiento de carcinomas hepatocelulares. Son menos útiles para el diagnóstico de carcinoma de vejiga aunque, para el cáncer de vejiga invasivo, este factor de crecimiento tiene una elevada sensibilidad y especificidad. TGF-u ha resultado estar elevado en un gran número de pacientes con tumores de células epiteliales (Chakrabarty, 1994: Katoh, 1990), de forma predominante en mama (casi el 100%), pulmón, estómago, colon e higado. A diferencia de ellos, los individuos normales tienen unos niveles séricos muy baios. En lo que se refiere al higado. TGF-u ha resultado estar elevado en el suero de pacientes con carcinoma hepatocelular. pero no en pacientes con cirrosis. Los niveles elevados se redujeron en los pacientes que se habian tratado por un carcinoma hepatocelular (Tomiya. 1996). Estudios recientes confirman que TGF-u es un predictor eficaz de la producción de tumores malignos en una fase precoz. Por ejemplo, de 36 pacientes que tenían una historia de asbestosis y que posteriormente desarrollaron un cáncer, sobre todo un adenocarcinoma o un carcinoma pulmonar de células escamosas, más de un tercio resultaron ser seropositives para TGF-u. Las muestras sanguíneas de todos estos pacientes se recogieron y después se guardaron en el momento del diagnóstico de la asbestosis y antes del diagnóstico de un tumor maligno. De forma significativa, todos salvo uno de estos pacientes seropositives resultaron tener niveles elevados de TGF-u en la sangre almacenada (Brandt-Rauf. 1998). TGF-u parece ser así un excelente marcador para la presencia de tumores malignos. A diferencia del caso de TGF-p. estas elevaciones no son tumor-específicas. Aun así. parece claro que TGF-u es extremadamente útil como herramienta de detección en pacientes en los que se busca un lumor maligno.
CAPÍTULO 64
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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
Factores de crecimiento derivados de las plaquetas. El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, una proteína de un peso molecular de 28 kDa, exisle como un dímero de cadenas A y B. en forma de dímeros A-A. A-B o B-B. Cada cadena se puede glucosilar aumentando su masa molecular hasta 30 kDa. Este factor de crecimiento, que se aisló originalmente de plaquetas, se une a un receptor de factor de crecimiento transmembranoso. La cadena B se codifica por el oncogén sis. Se ha encontrado que es un potente mitógeno en lineas celulares linfoides. mieloides y de fibroblastos. También se ha estudiado en la sangre de pacientes con cáncer. De forma global, este factor de crecimiento ha resultado estar elevado de forma significativa en más de un 15% de pacientes con carcinomas, sarcomas y linfomas. pero en ninguno de los individuos normales. En pacientes con cáncer de mama exisle una excelente correlación entre la fase del tumor y el nivel sérico del factor de crecimiento (Ariad. 1991). Los niveles más elevados predijeron supervivencias más cortas. Factor de crecimiento fibroblástico básico. El factor básico de crecimiento fibroblástico (bFGF) es una proteína que contiene 155 aminoácidos. Es un factor de crecimiento para las células mesenquimales, pero también tiene concentraciones relativamente elevadas en el sistema nervioso central (SNC). De forma notable, se ha encontrado que bFGF está presente en altas concentraciones en el suero de pacientes con tumores de células epiteliales. De entre estos tumores, llama la atención el carcinoma de células renales. Más de un 50% de pacientes con esta enfermedad tienen niveles séricos muy elevados de bFGF (Fujimoto. 1991; li. 1993), bien se mida mediante ELISA o mediante métodos potenciados de quimioluminíscencia. Este factor de crecimiento está también elevado en el suero de más del 50% de pacientes con tumores del SNC. en el 90% de pacientes con cánceres de pulmón (li. 1993) y en alrededor del 60% de pacientes con linfomas (Kurobe, 1993). No está elevado, sin embargo, en el suero de grandes poblaciones de individuos normales (control). Recientemente, los niveles séricos elevados de bFGF han resultado ser un buen factor pro nóstico en pacientes con carcinomas de pulmón de células no pequeñas (Brattstrom, 1998). As. TGF-u y TGF-|i. PDGF y bFGF parecen todos ellos estar elevados en el suero de un número significativo de pacientes con tumores de células epiteliales, aunque no son completamente tumor-específicos. TGF-« tiene una cierta especificidad para el cáncer de mama y TGF-|5 para el carcinoma hepatocelular. bFGF se eleva en diferentes tumores malignos, incluyendo tumores de células no epiteliales, como los tumores del SNC y los linfomas. PDGF muestra poca especificidad en cuanto al tipo del tumor, pero sus niveles elevados en el suero indican la presencia de tumor maligno. Factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento hepatocitario. Se ha observado que el factor de crecimiento epidérmico está elevado en el suero de algunos pacientes con cáncer de estómago (Pawlikowski. 1989) y cáncer de lengua (Bhatavdekar. 1993), pero ha resultado estar normal o disminuido en otros tumores (Nedvidkova, 1992). Se han descrito niveles séricos elevados de tactor de crecimiento hepatocitano en pacientes con carcinoma hepatocelular. Sin embargo, este factor de crecimiento parece ser único en cuanto a que se encuentran también niveles elevados en enfermedades hepáticas no malignas (Hioki. 1993), disminuyendo su utilidad como marcador tumoral.
Receptores de factores de crecimiento En cuanto a los receptores de factores de crecimiento, existen varios mecanismos por los que puede iniciarse una mitogénesis incontrolada. Estos mecanismos se resumen en la Figura 64-2. Tanto para el receptor EGF como para la proleina del receptor del factor de crecimiento pl85. codificada por el oncogén neu (HER-2), y que se asocia intensamente con el cáncer de mama (Slamon. 1989), el receptor dimeriza y activa las tirosmas cinasas que están involucradas en la fosforilación de proteínas que transducen la señal mitogénica hasta el núcleo. Existen tres mecanismos patológicos conocidos que pueden dar lugar a una dimerización del receptor anormalmente prolongada y que produce una señal continua mitogénica. Estos mecanismos son la pérdida del dominio de unión extracelular (ECD); las mutaciones en el dominio transmembranoso que promueve la dimerización (Brandt-Rauf, 1990) y la sobreexpresión del receptor.
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Los receptores transmembranosos del factor de crecimiento codificados por la familia erbB de oncogenes (por ejemplo, erbS. que codifica el receptor EGF, también llamado EGFr. y neuvHER-2 [erbB-2]), son objetivos particularmente atractivos para la detección en sangre durante el desarrollo del cáncer, ya que se ha observado que. en los tumores humanos inducidos por estos receptores, el mecanismo parece ser la proteólisis del dominio extracelular de unión con el receptor (Figura 64-2, tercera ilustración). Los dominios extracelulares liberados, llamados ECD, entran entonces en la circulación y se pueden detectar lácilmente en el suero utilizando técnicas convencionales de inmunoanálisis (Brandt-Rauf, 1994a. 1994b. 1998) Receptor EGF (EGFr). En pacientes con asbestosis se han estudiado las elevaciones de los niveles circulantes del ECD de este receptor de factor de crecimiento (Brandt-Rauf, 1992). que se sabe predispone a tumores malignos. Se ha encontrado que en estos pacientes, aquellos con niveles séricos de ECD de 636 fmol'ml o más altos, o bien tienen un tumor maligno asociado al asbesto (carcinoma de pulmón o mesíotelioma). o bien posteriormente desarrollan un tumor de esta clase. Se ha observado que muchos individuos normales tienen unos niveles séricos de ECD mucho más bajos. Así. EGFr parece ser un excelente marcador para los tumores inducidos por el asbesto, Estos resultados tienen también interés porque sugieren que el electo principal del asbesto como carcinógeno es producir mutaciones en el gen EGFr. Receptor neu HER-2. Debido a la asociación firmemente documentada entre el cáncer de mama y las mutaciones en el gen neu'HER-2. muchos estudios han examinado el p185 erbB-2 ECD en la sangre de pacientes con cáncer, en particular cáncer de mama. En estudios previos sobre la sobreexpresión inducida por el oncogén neu de la proteina pl85 (Slamon. 1989). se encontró que el nivel de expresión del oncogén neu en el tejido de biopsias de cáncer de mama se correlacionaba con la extensión del tumor, siendo el mejor indicador pronóstico de tasas de supervivencia, excediendo la extensión de la afectación de ganglios linfáticos como indicador pronóstico. Los resultados de la cuantificación del p185 ECD en el suero de pacientes con cáncer de mama corren paralelos con los resultados genéticos previos Entre un 25% y un 50% de los pacientes con un cáncer de mama en estadios III o IV tienen niveles elevados de p185 ECD en su suero (entre 40 y 190 veces más altos que en el suero de los individuos control normales (Morí, 1990: Carney, 1991: Kath, 1993). En los pacientes de los que se dispone de un material de biopsia tumoral. hay una excelente correlación entre los niveles séricos de ECD y la expresión a nivel lisular (Breuer. 1993.1994). Exisle también una excelente correlación entre los niveles séricos de ECD y la recurrencia de la enfermedad (Brandt-Rauf, 1998), Los niveles de ECD en el suero también han resultado ser un excelente indicador pronóstico para el cáncer de mama (Molina, 1996). Dado que los niveles séricos de p185 ECD se correlacionan con la carga y con la fase del tumor, la detección del cáncer de mama incipiente, utilizando los niveles séricos de p185 ECD. es menos eficaz para estos pacientes. De forma global, la tasa de delección de los tumores mamarios en estadios I y II utilizando los niveles séricos de ECD, basados en técnicas ELISA convencionales, oscila entre un 10% y un 15%. Sin embargo, el uso de un método ELISA sensible para el p185 ECD en pacientes con cáncer de mama dio lugar al descubrimiento de un carcinoma in situ en un 43% de los pacientes con esta enfermedad (Breuer, 1993). Este último resultado indica que el uso de análisis más sensibles para p185 ECD identifica un aumento significativo en el número de pacientes con carcinoma in situ (esto es, en una fase precoz de su desarrollo). Neoplasias pulmonares, pl 85 ECD está también elevado en un alto porcentaje de pacientes con cáncer de pulmón. Las elevaciones de los niveles séricos de EGFr para la detección tumoral precoz se han empleado para estudiar a pacientes con una predisposición conocida, como los que tienen neumoconiosis, a desarrollar estos tumores. En el 70% de los pacientes con neumoconiosis, se han encontrado niveles séricos elevados de p185 ECD antes del desarrollo manifiesto del tumor maligno. En casi el 100% de los pacientes con este factor predisponente que tienen cáncer de pulmón, el p 185 ECD del suero está bastante elevado (Brandt-Rauf, 1994a). Claramente, esta proteina es un indicador muy sensible de cáncer de pulmón. Por el contrario, no se han encontrado elevaciones de pl 85 ECD en el suero de muchos individuos normales.
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 64-2. Mecanismos de la producción continua de señales mitogémeas por parte de los receptores de factores de crecimiento. El esquema 1 muestra que estos receptores tienen tres dominios: un dominio extracelular, donde se une el factor de crecimiento (ECD): un dominio transmembranoso (TMD| y un dominio intracitoplásmico (ICD). Un lactor de crecimiento. GF. se une al receptor haciendo que se dimerice. poniendo en marcha una cascada de fenómenos mtracelulares que se transducen hasta el núcleo (N). descrito en la Figura 64-1. Hay tres formas conocidas por las que se puede producir una señal celular continua a partir del receptor de factor de crecimiento, dando lugar a una transformación maligna de las células. El esquema 2 muestra el primero de ellos: sobreexpresión del receptor que da lugar a muchos procesos de activación y a señales continuas hacia el núcleo. El esquema 3 muestra el segundo mecanismo, donde ECD o bien está ausente o bien es eliminado por proleasas intracelulares, dando lugar a una dimerización espontánea. El esquema 4 muestra el tercer mecanismo, en el que una mutación del gen del receptor del lactor de crecimiento da lugar a una sustitución de aminoácidos (X en la Figura) en el dominio transmembranoso. dando lugar a la formación de hélices-ix que se asocian (Brandt-Rauf, 1990) y dando lugar a una dimerización espontánea que puede lener lugar en ausencia o presencia del ligando.
Carcinomas hepatocelulares. Se ha observado previamente que el factor de crecimiento TGF-p' puede ser un buen marcador del carcinoma hepatocelular. Hay ahora fuertes indicios de que p185 ECD es también un marcador sensible para esta enfermedad. Se ha encontrado que el p185 ECD del suero está elevado en casi un 100% en los individuos de raza oriental que tienen factores de riesgo conocidos de desarrollar esta enfermedad (Luo, 1 9 9 3 : Yu, 1994). Sin embargo, no se han observado elevaciones en individuos normales de edad y raza similares o en aquellos con factores de riesgo de tipo
exposición para esta enfermedad pero que no desarrollaron posteriormente cáncer. erbB-2 (p185) ECD en otros tumores. Se han encontrado también elevaciones en los niveles séricos de erbB-2 ECD en pacientes con cánceres colorrectales. pancreáticos, prostéticos, hepáticos y ováricos (Wu, 1993) con frecuencias de detección más bajas (del 15% al 20%). En estos casos se ha encontrado una excelente correlación entre los niveles séricos y los niveles tisulares. Hay una correlación directa entre los niveles séricos del p185 ECD y
CAPÍTULO 64
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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
el tamaño del tumor para los adenomas premaligos de colon (Brandt-Rauf. 1994b). Dado que las neoplasias de colon progresan por lo general a través de fases bien definidas desde adenoma a carcinoma, aumentando el potencial maligno de los adenomas con el tamaño, los niveles séricos de erbB-2 ECD pueden ser útiles para el seguimiento de esta progresión.
Proteínas G Como ocurre con los receptores de tactor de crecimiento, las proteínas señalizadoras que se producen aguas abajo de los receptores de crecimiento se hacen oncogénicas sobre todo por la sobreexpresión y sustituciones de aminoácidos en posiciones críticas en sus cadenas polipeptídicas. Con menos frecuencia, y para algunas proteínas, como raí (Figura 64-1; Tabla 64-2), la pérdida de los dominios de regulación también puede conducir a la oncogenesis. Las sustituciones de aminoácidos en las proteínas transductoras de señal hacen que estas proteínas sufran cambios de conformación que pueden dar lugar a que queden activadas de forma permanente para estimular la división celular (Pincus, 1992,1999). Este mecanismo se ha documentado bien para la proleína p21 codificada por el oncogén ras. en el que las sustituciones de la mayoría de los aminoácidos por glicina 12 o glutamina 61 dan lugar a una proteína oncogénica. Muchas proteínas p21 con tal sustitución han sido clonadas y microinyectadas directamente en células normales de cultivo tales como las células NIH 3T3 (Barbacid. 1987). Las células sufren una transformación maligna que dura hasta que se melaboliza la proteína mulante añadida y se elimina de las células. Las tormas mulantes oncogénicas del gen ras y de su proteína p2i codificada se han encontrado en aproximadamente uno de cada tres tumores de células epiteliales humanos habituales, en más de un 90% de los tumores pancreáticos humanos y en un 75% de los cánceres de colon humanos (Almoguerra, 1988; Forester. 1987). Una de las consecuencias de las sustituciones de aminoácidos en p21 y presumiblemente en otras proteínas transductoras de señal es la activación anómala de vías alternativas y no reguladas de transducción de señal. La proteina oncogénica ras-p21 (p21 * en la Figura 64-1) ha resultado unirse directamente a ¡un, el tactor de transcripción nuclear y su cinasa activadora. ¡un cinasa (JNK). Este proceso de unión da lugar a la activación directa de estas proteínas nucleares inductoras de transcripción, cortocircuitanto así los controles celulares normales. Esta derivación o via en cortocircuito se muestra en la parte derecha de la Figura 64-1 para p21' (Adler. 1995: Amar. 1997). Además, la proteína oncogénica ras-p21 activa la proteína cinasa C (Pincus. 1992), como se ilustra en la Figura 64-1. Como se mencionó previamente, las proteínas p21 codilicadas por el oncogén ras son proteínas G asociadas a las membranas de 21 kDa que se han implicado en el proceso de transducción de señales de crecimiento desde la membrana celular a las cinasas del citoplasma. Los cambios cualitativos (por ejemplo, mutaciones puntuales) y cuantitativas (por ejemplo, sobreexpresión i en p21 han sido identificadas como contribuidoras a la carcinogenesis humana (Barbacid. 1987). Gracias a mecanismos aún sin definir, las proteínas p21 ganan acceso al ambiente extracelular. Así, las mayores cantidades de p2l o las formas muladas de lorma puntual de p21 pueden detectarse mediante inmunoblot con anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de células cultivadas que se sabe sobreexpresan p21 o que expresan p21 mulante, respectivamente (Brandt-Rauf, 1991). De forma análoga, realizando inmunoblot en ratones con tumores que sobreexpresan p21 o que expresan un p21 mutante se encuentran mayores cantidades de p2i o formas muíanles de p21 en su suero, respectivamente (Hamer. 1991). Estos resultados sugieren que es posible realizar la detección de un aumento en p2l o encontrar p21 mutante en sangre de seres humanos. Debido a su papel central en la transducción de señales mitogénicas. se podría esperar encontrar proteína p2l mulada y'o sobreexpresada en una amplia variedad de tumores humanos. De hecho, se ha identificado un p2l sérico elevado en el suero de hasta un 68% de los pacientes con muchos cánceres diferentes, incluyendo cánceres de mama, próstata, colon, pulmón e higado. Por otro lado, sólo un pequeño porcentaje de individuos normales han resultado tener niveles séricos detectables (Weissfeld, 1994). En cánceres humanos de páncreas y colon se ha encontrado una incidencia muy alta de ocurrencia de formas oncogénicas del gen K-ras. Nuevos aná-
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lisis basados en la PCR han detectado en oncogén ras en las heces de un alto porcentaje de pacientes con cáncer de colon. Se han encontrado resultados igualmente aleccionadores utilizando el esputo de pacientes con cáncer de pulmón. Se han obtenido ahora resultados paralelos utilizando ELISA para la proteina p21 utilizando el suero de pacientes con carcinomas de colon y de pulmón. Se han encontrado niveles elevados (cinco veces superiores al del control) de p21 sérico en hasta un 83% de pacientes con cancer de pulmón, mientras que en los sueros de individuos normales sólo se han encontrado niveles bajos (Brandt-Rauf. 1991. 1998) Además, se han realizado estudios en los que se ha llevado a cabo una PCR para genes mutantes k-ras con cambios de bases en los codones 12 y 13. de forma simultánea en el tejido tumoral y en el suero de pacientes con diferentes fases de cáncer colorrectal (De Kok. 1997). En más de un 90% de los pacientes con genes ras mulantes específicos encontrados en tejidos tumorales, se descubrió el mismo gen mulado ras en sus sueros, de forma indiferente de la fase del tumor Previamente, cuando se habló de la proteína p185 codificada por el oncogén neu, se hizo notar que se habían encontrado elevaciones en los n veles séricos de esta proteina en pacientes con neumoconiosis que progresaron después hasta desarrollar tumores malignos sintomáticos. Un estudio similar en los niveles séricos de p2l se ha llevado a cabo en pacientes con neumoconiosis. Para los pacientes con esla predisposición, en un 39% se ha encontrado mediante inmunoblot (Western blot) que tenían niveles séricos elevados de la proteina p21. Casi todos estos pacientes desarrollaron un tumor de pulmón maligno después de haberse observado elevaciones de la proteina p21. Así, y al igual que p185 ECD, el p21 sérico elevado es un marcador biológico precoz de enfermedad maligna en pacientes con una predisposición conocida. Los estudios precedentes están relacionados con la detección de niveles séricos elevados de p2l como indicadores de tumores malignos. Como se ha observado antes, un importante mecanismo de la oncogenesis inducida por la proteína ras-p2l son las sustituciones de aminoácidos en su secuencia que dan lugar a su activación permanente. La identificación de genes ras mutantes mediante PCR y secuenciación directa del ADN aislado del suero o plasma en tres pacientes con cáncer de páncreas ya se ha descrito (Sorenson. 1994). pero, hasta hace poco, no se habia comunicado la detección directa de proteínas p2l mutantes en sangre humana (De Kok. 1997). Actualmente, sin embargo, las sustituciones oncogénicas de aminoácidos en la proteína p21 se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales que reconocen sustituciones oncogénicas especificas. Se ha encontrado p21 mutado en el suero de pacientes con una historia conocida de exposición a cloruro de vinilo. un carcinógeno. Este produelo químico ha resultado predisponer a las personas a desarrollar angiosarcomas. Los estudios tisulares de estos angiosarcomas revelan que en las células tumorales un gen ras mutante coditica ácido aspártico en lugar de la glicina que está normalmente en la posición 13 en la cadena polipeplidica. Un anticuerpo monoclonal que reconoce la forma Aspl3 de la proteina p21 ha podido desarrollarse (Oncogene Science). Esta proteína p2l mutante ha sido identificada en el suero del 80% de pacientes con angiosarcomas hepáticos inducidos por cloruro de polivinilo. pero no en individuos normales (DeVivo, 1994). Es más. existe una correlación directa entre el grado de exposición de los pacientes al cloruro de vmilo y la probabilidad de descubrir en su suero la forma oncogénica de la proteína. Se han obtenido otros anticuerpos monoclonales anti-p21 mutantes altamente específicos que reconocen sustituciones especílicas de aminoácidos en las posiciones 12. 13, 59 y 61. El uso de estos anticuerpos en el suero de pacientes con factores de riesgo conocidos de desarrollar cáncer parece ser muy prometedor para la detección precoz de los tumores.
Oncoproteínas nucleares Como ya se ha mencionado, dos importantes proteínas nucleares que parecen tener funciones críticas en la regulación del crecimiento celular y la división celular son la proteina p53 que suprime el gen tumoral y la proteina p62'64 codificada por el oncogén c-m/epara la que se han desarrollado análisis en suero. Además, las proteínas de matriz o esqueleto nuclear son los objetivos de las cinasas transductoras de señal tales como la cinasa MAP, según se indica en la Figura 64-1.
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGIA MOLECULAR
Proteina p53. Se sabe que esta proteina funciona como un homotetrámero y, de esta forma, se une a secuencias especificas del ADN. El efecto es reprimir el proceso de la mitosis. Así. p53 es una proteína antíoncogén. Se pueden producir mutaciones en p53 que lo ¡nactiven. Esta inactivación puede por sí misma ser oncogénica debido a que se elimina el control vital que esta proteína ejerce sobre la mitogénesis. Entre las mutaciones inactivantes están las deleciones de todo el gen, como se ha encontrado en un número de cánceres de colon. Las mutaciones del gen p53 pueden producir sustituciones de aminoácidos en la proteína que, como en la proteína p21, dan lugar a cambios de conformación en la proteína que resultan en su incapacidad para llevar a cabo su función antioncogénica en la célula (BrandtRauf, 1996). Se han identificado muchas diferentes mutaciones puntuales en p53 en tumores humanos (Soussi, 1994). El efecto de estas mutaciones es la pérdida de la función inhibitoria del crecimiento normal de p53 y. al mismo tiempo, algunas de estas mutaciones dan lugar a proteínas p53 con unas vidas medias considerablemente aumentadas, de manera que las proteínas muladas se acumulan en las células transformadas (Soussi, 1994). La oncoproteína c-myc se activa para dar lugar a la transformación celular mediante sobreexpresión, de manera que, además, se acumula en las células transformadas (Field. 1990). Así, tanto para p53 como para myc p62<64. se pueden detectar aumentos en los niveles de estas proteínas en células transformadas y en tumores humanos (Soussi. 1994: Field, 1990). Esta sobreexpresión da lugar aparentemente a una salida de las proteínas hacia el ambiente extracelular. Estas proteínas pueden por tanto no solamente detectarse en el suero y otros líquidos corporales, sino que estas proteínas normalmente secuestradas se reconocen como extrañas, de manera que algunos pacientes con cáncer desarrollan anticuerpos frente a myc p53 o p62<64. Por tanto, las concentraciones elevadas de p53 o p62/64 o de anticuerpos frente a estas proteínas en sangre periférica son excelentes marcadores para el estudio de la carcinogénesis humana.
Detección de tumores malignos mediante análisis de la proteína p53 Carcinoma hepatocelular. Se han encontrado niveles aumentados de p53 mutante mediante ELISA (más de 0,3 ng/ml, en límite superior en 100 individuos normales) en los sueros de un 20% de pacientes con carcinoma hepatocelular y en el 30% de pacientes con cirrosis, un grupo que se sabe tiene un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular (Virji. 1992). Dado que los pacientes con cirrosis tienen niveles elevados de p53 en su suero y un factor de riesgo conocido para desarrollar carcinoma hepatocelular, los niveles elevados de p53 pueden ser un indicador precoz de tumorogénesis. Cáncer de mama y pulmón. Se han realizado pocos estudios de p53 como marcador tumoral en el suero de pacientes con cáncer de mama y de pulmón. Se han comunicado niveles séricos elevados de p53 mutante. determinados mediante ELISA en el 8% de pacientes con cáncer de mama, disminuyendo los niveles con la resección quirúrgica de los tumores (Rosanelli. 1993), indicando que los tumores eran la fuente del p53 elevado. No se han observado elevaciones de proteína p53 en el suero de un individuo normal. Para el cáncer de pulmón, se han observado elevaciones séricas de los niveles de p53 mutante, determinados mediante ELISA y mediante inmunoblot en hasta un 34% de pacientes con cáncer de pulmón, pero no en individuos normales (Fontanini, 1994). En estos pacientes, la tinción inmunohistoquímica de biopsias tisulares obtenidas posteriormente mostraron niveles elevados de p53, correlacionándose con los hallazgos séricos. Cáncer de colon. Un mecanismo que se cree es importante en el desarrollo de los carcinomas de colon es la deleción del gen p53 normal o las mutaciones de este gen que dan lugar a una proteína antioncogénica no funcionante. Se han encontrado elevaciones en los niveles séricos de p53. determinados mediante ELISA, en aproximadamente uno de cada cinco pacientes con carcinoma de colon y en aproximadamente uno de cada diez pacientes con adenomas de colon. Los individuos normales fueron negativos para la proteína sérica p53. Estos resultados tienen una sensibilidad relativamente baja de este marcador para el cáncer de colon, posiblemente debido a que la delección del gen p53 se produce en un elevado porcentaje de los tumores estudiados.
Anticuerpos circulantes anti-p53 en la detección tumoral Se han descrito anticuerpos séricos frente a p53 como un hecho frecuente en pacientes con varios tipos de cáncer. La producción de anticuerpos frente a p53 y otras oncoproteínas se ha atribuido a su acumulación en células necróticas y a su consiguiente liberación hacia la circulación, donde se reconocen como sustancias extrañas. Para p53. hay todavía otra causa para el desarrollo de anticuerpos frente a p53 oncogénico. Al igual que ras-p21 oncogénico. las proteínas p53 mutantes que contienen sustituciones de un único aminoácido en posiciones críticas de la cadena polipeptídica pueden volverlas oncogénicas. Estas sustituciones de aminoácidos inducen cambios importantes en la conformación de la proteína p53 (Adler. 1998; Brandt-Rauf, 1996). Entre estos cambios figura la exposición de determinantes antigénicos específicos que normalmente no quedan expuestos. Si la proteina difunde hacia la circulación, es frecuente que se desarrollen anticuerpos contra estos determinantes. En diferentes estudios importantes (incluyendo un gran estudio de 1.392 pacientes con cáncer), se encontraron elevaciones en los niveles séricos de anticuerpos anti-p53 en pacientes con cáncer de ovario y de colon (15%); cáncer de pulmón, incluyendo tumores de células pequeñas (hasta un 25%), y cáncer de mama, incluyendo carcinomas intraductales (hasta un 15%). Los individuos normales no tenían niveles séricos elevados de estos anticuerpos (Angelopolou, 1994). En un número significativo de pacientes en los que se ha seguido la presencia de anticuerpos anti-p53 en su suero, la aparición de estos anticuerpos ha resultado preceder al desarrollo de tumores malignos. Se encontraron también anticuerpos anti-p53 en más de un 20% de pacientes con cáncer de vejiga (la mayoría en lases más avanzadas), en una alta proporción de pacientes con carcinomas de páncreas y hepatocelulares, y en linfomas infantiles. Los estudios de seguimiento continuado de anticuerpos anti-p53 en pacientes con diferentes cánceres revelan que hasta la mitad de los pacientes con carcinoma hepatocelular. independientemente de su tamaño, tienen niveles séricos notablemente elevados de antí-p53 (Ryder. 1996). Estos niveles elevados se correlacionan con la elevación conocida de p53 en el suero de pacientes con esta clase de cáncer, según se comentó antes. Es más. los anticuerpos anti-p53 se han encontrado en el suero de pacientes con lesiones orales, y muchos de estos pacientes resultaron tener lesiones premalígnas (Kaur, 1997), indicando que los anticuerpos anti-p53 son marcadores para la detección precoz del cáncer oral. Se ha encontrado también anti-p53 elevado en más de un 50% de los pacientes con carcinoma de células escamosas del esófago (Shimada. 1998). En un reciente estudio prospectivo muy extenso de pacientes con cáncer de pulmón, se encontraron niveles séricos de anti-p53 en el 100% de los pacientes con carcinomas de células grandes, en un 28% de los adenocarcinomas, en un 55% de carcinomas de células escamosas y en un 71% de carcinomas de células pequeñas (Segawa. 1998). Estos resultados demuestran que los niveles séricos elevados de anti-p53 tienen especificidad para tipo tumoral para el carcinoma del pulmón, mostrando tasas elevadas de positividad para los carcinomas pulmonares de células grandes y de células pequeñas. Proteínas codificadas por el oncogén myc en detección de tumores. El gen myc codifica una proteína con una masa molecular de 64 kDa cuya función es en gran medida desconocida. Existe una fuerte evidencia con respecto a que es un factor de transcripción que. cuando se activa, desreprime la expresión de otros genes que codifican proteínas que participan en la replicación. Este oncogén está sobreexpresado en un número de tumores, incluyendo el linfoma de Burkitt, donde el gen myc del cromosoma 8 se trastoca a una larga región terminal parecida a la de las repeticiones en una región codificadora de ¡nmunoglobulinas del cromosoma 14. Las regiones con repeticiones terminales largas permiten la expresión constitutiva de genes que son adyacentes a las mismas. Las proteínas en relación con c-myc y los anticuerpos trente a la proteína c-myc han sido identificadas, al igual que p53 y sus correspondientes anticuerpos, en el suero de pacientes con cáncer. La detección de esta proteína de 62.64 kDa está dificultada por su corta vida media en el suero. Sin embargo, es posible detectar una proteína específica p40 relacionada con c-myc en el suero de estos pacientes, utilizando inmunoblot. Las frecuencias más altas
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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
de encontrar proteina mycen el suero humano están en el cáncer de colon y de mama (aproximadamente el 20%). El tratamiento de estas dos clases de cáncer da lugar a una notable disminución en los niveles séricos de esta proteína. Las recurrencias originan niveles elevados: por tanto, la proteína c-myc es útil para el seguimiento del curso de los tumores malignos. No se ha detectado en el suero de individuos normales Anticuerpos séricos antiproteina c-myc en la detección de tumores. Se han encontrado niveles séricos elevados de anticuerpos anti-c-myc en el suero de pacientes con cáncer de colon y de recto (55% al 65%) y en el suero de pacientes tanto con leucemias mieloides como con linfoma de Burkitt. Se han descrito incidencias más bajas de anticuerpos elevados en pacientes con cáncer de mama (aproximadamente un 10%) y cáncer de ovario (10%). No se han encontrado anticuerpos anti-c-myc en el suero de individuos normales. Detección del cáncer de vejiga mediante las proteínas de matriz nuclear. Como se puede ver en la Figura 64-1, uno de los objetivos de las proteínas codificadas por oncogenes son las proteínas de la matriz nuclear (NMP). conocidas también como proteínas del esqueleto nuclear y proteínas del aparato mitótico nuclear. Estas proteínas de 236 kDa son vitales para la correcta formación del huso mitótico. Contienen una cabeza globular y una cola separada por un dominio central en forma de bastón de hélice-r/. consistente en repeticiones de secuencias de siete elementos. Estas proteínas varían según el tipo celular, la fase de diferenciación y el ciclo de la célula. De forma crucial, se ha identificado un número de NMP asociadas a tumores, específicas cada una de ellas para uno de cinco tipos tumorales (vejiga, próstata, mama, colon y hueso). El mejor estudiado es uno que está luertemente asociado con el carcinoma de células transicionales de la vejiga (TCC). NMP22. que funciona como una proteína del aparato mitótico nuclear, y que participa en la separación de los cromosomas durante la mitosis (Hughes. 1999). La cantidad de esta proteína en las células epiteliales transicionales malignas es entre 10 y 20 veces superior a la de las células normales. Se han desarrollado anticuerpos específicos para esta NMP. que se utilizan ahora en un ELISA comercial en la orina (Matritech. Newton. MA). La base del análisis es que. dado que las células uroteliales malignas se desprenden hacia la orina, y que este NMT es específico de las células cancerosas de vejiga, la elevación de esta proteína en orina puede detectarse en pacientes con cáncer de vejiga. Múltiples estudios de pacientes que tienen cáncer de vejiga en diferentes estadios revelan que la sensibilidad es próxima a un 90% en el cáncer maligno e invasivo y un 75% en el carcinoma in situ. Este último resultado es muy alentador, dado que esta lase es la fase más precoz detectable. Para los carcinomas no invasivos papilares y malignos, la sensibilidad es del 62%. La especificidad global para este marcador es superior a un 90%. La comparación de la sensibilidad del NMP22 ELISA con la citología muestra que los dos métodos tienen una sensibilidad de un 83% para el carcinoma invasivo, pero para el grado I TCC. NMP22 tiene una sensibilidad del 61%. mientras que para la citología aislada es de un 17% (Landman, 1998). Para los cánceres de grado II y III. el NMP22 ELISA es más sensible, con un 78% y un 93%, en comparación con la sensibilidad de las citologías de un 50% y 87%, respectivamente (Landman. 1998). Estos resultados sugieren que el NMP22 ELISA puede ser altamente eficaz como una herramienta de detección no invasiva para TCC. En la actualidad, este método ha sido aprobado por la FDA como prueba de seguimiento para TCC en pacientes que han sido tratados para esta enfermedad. Se han llevado a cabo estudios clínicos en los que se realizó un NMP22 ELISA en la orina de pacientes que han sido tratados para TCC. entre 20 y 60 días después del tratamiento, y que fueron después sometidos a una cistoscopia entre dos y seis meses después del tratamiento. Utilizando un punto de corte de 10 U/ml, un 86% de los pacientes con valores de NMP22 negativos (menos de 10 U/ml) resultaron tener cistoscopias negativas, y un 71% de los pacientes con valores superiores a 10 U'ml resultaron tener hallazgos positivos en la cistoscopia. A la vista del parecido de estas cifras con las obtenidas utilizando la citología para detectar nueva aparición de TCC. parece razonable concluir que el NMP22 ELISA podría constituir una prueba de detección eficaz para el TCC. Hace poco, de hecho, la prueba ha sido aprobada por la FDA para su uso como herramienta de detección. El uso de esta metodología puede obviar la necesidad de llevar a cabo cistoscopias en muchos pacientes que están seguidos por recidivas tumorales (Miyanaga. 1997).
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EVALUACIÓN Y CONCLUSIONES Existen unas vías bien delinidas para la transducción de señales mitogénicas entre la membrana y el núcleo de las células. Estas vias constan sobre todo de proteinas. cuyas mutaciones o sobreexpresiones pueden dar lugar a unas señales mitogénicas no controladas y a cáncer.
Eficacia diagnóstica de las oncoproteínas del suero Los resultados de los análisis para las diferentes oncoproteínas que se co mentaron antes en suero y en orina (NMP-22) se resumen en la Figura 64-3 en lo que se refiere a algunos de los tumores más (recuentes de células epi teliales. También se muestran, junto con el carcinoma hepatocelular. los resultados correspondientes a los angiosarcomas hepáticos. Los resultados de las determinaciones de las concentraciones de oncoproteínas en los líquidos corporales para grupos control de la misma edad y sexo se muestran como las áreas blancas en los gráficos de barras de esta figura. De la Figura 64-3 parece claro que. de las proteínas estudiadas hasta ahora, se producen altas tasas de positividad en ciertos cánceres, mientras que los grupos control muestran unas tasas de positividad muy bajas. De forma interesante, y dado que las oncoproteínas estudiadas provienen de vias de transducción de señal que participan en muchos tipos celulares diferentes, parece haber una cierta especificidad de oncoproteínas peculiares para ciertos tipos de cáncer. Por ejemplo, el factor de crecimiento TGF-a está elevado en un gran número de tumores de mama: FGF está elevado en una alta proporción de cánceres de pulmón: la proteína p185 ECD (neu) está elevada en el suero de muchos pacientes con carcinomas hepatocelulares y cánceres de pulmón y en las fases más avanzadas del cáncer de mama; la proteína C21 se eleva en carcinomas hepatocelulares, angiosarcomas hepáticos y tumores pulmonares; c53 está elevada en los cánceres de pulmón, y el anticuerpo anti-myc está elevado en los cánceres de colon. Para estas proteínas la sensibilidad en cuanto a detección de enfermedad es elevada y excede la de cualquiera de los antigenos oncofetales. Asimismo, la frecuencia con la que se producen estos factores de crecimiento u oncoproteínas es muy baja en el suero de los individuos que no tienen cáncer en cada uno de los estudios llevados a cabo hasta la fecha en varios miles de pacientes. Por tanto, la especificidad al utilizar factores de crecimiento y oncoproteínas como marcadores tumorales es también relativamente elevada. Esta conclusión no implica que la ausencia de una determinada oncoproteína en el suero de un paciente implique la ausencia de un tumor maligno. Debido a la naturaleza en casos múltiples de la carcinogenesis, puede haber muchas oncoproteínas potencialmente anómalas. Cualquier otro grupo de oirás oncoproteínas puede también estar presente en el suero del paciente. De hecho, la Figura 64-3 indica también que la Irecuencia de detección de ciertas oncoproteínas en el suero de pacientes que tienen un tipo determinado de tumor puede ser relativamente baja. Por ejemplo, como se ve en la Figura 64-3A se ha encontrado c-myc elevado en el suero de aproximadamente un 8% de pacientes con cáncer de mama: se ha encontrado la proteína p185 ECD (neu) en hasta un 25% de pacientes con cáncer de mama. Las bajas tasas de detección de estas oncoproteínas en estos tipos tumorales son el resultado del gran número de posibles pasos en la vía donde se producen proteinas aberrantes o factores de crecimiento. Así. los tumores que se producen en un tejido determinado pueden tener una multiplicidad de causas diferentes, dando lugar a la producción de diferentes proteinas aberrantes en la cadena. Por tanto, el siguiente paso al utilizar estos marcadores oncoproteínicos en el diagnóstico precoz del cáncer es buscar múltiples marcadores en el suero de un paciente determinado. El descubrimiento de por lo menos un componente aberrante de la via de transducción de señales se considera mucho más probable.
Orígenes de los tumores malignos La Figura 64-3 indica que el descubrimiento de un nivel elevado de una oncoproteína en el suero de un paciente no proporciona por lo general una información concluyeme con respecto al origen del tumor maligno. Por ejemplo, aunque se ha encontrado ras-p21 elevado, y con cierta especificidad, en angiosarcomas hepáticos, de colon y de pulmón: y neuHER-2 (c-ert>2) p185
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 64-3. Gráfico de barras con el resumen de resultados de los análisis del suero para diferentes componentes de oncoproteínas de las vías mitogenicas de señalización para seis tipos tumorales: pulmón, mama, colon, vejiga e hígado: carcinoma hepatocelular y angiosarcoma hepatocelular. Para cada tipo de tumor, se muestra la incidencia de detección en las ordenadas y en forma de porcentaje, y la oncoproteína se lista en la abscisa. En el tope de cada gráfico de barras se muestra la frecuencia de elevación de la oncoproteína en los grupos control como un área blanca dentro del grálico de barras. Para la mayoría de los gráficos de barras, esta frecuencia es cero, de manera que no aparece zona blanca. (TGF-ot. TGF-|i, FGF, PDGF y EGF = factor transformador de crecimiento u. factor transformador de crecimiento |3. (actor de crecimiento fibroblástico. factor de crecimiento derivado de las plaquetas y lactor de crecimiento epidérmico, respectivamente: erbB = receptor del factor de crecimiento epidérmico [EGF]; neu = proleina p185 que es parecida a la proteína erbfl y que también se llama erbB-2 y HER-2; ras = proteina p21; NMP22 = proteína de matriz nuclear que se eleva en el suero en los carcinomas de células transicionales del tracto urotelial; p53 = proteína anli-oncogén: anti-p53 = anticuerpo anti-p53; myc = oncogén nuclear que codifica la proteina myc. y anti-myc = anticuerpo frente a la proteína myc.)
ECD elevado en cánceres de colon, pulmón y mama, la elevación de una de estas oncoproteínas en el suero de un paciente no permite identificar con exactitud el tejido de origen del tumor maligno. Dado que la vía de transducción de señales en la mayoría de las células es muy parecida a la de otras, una elevación en cualquier oncoproteína puede significar que exisle un tumor maligno en uno de muchos lipos celulares diferentes. Además, quedan aún por realizar muchos estudios de las correlaciones que hay entre la presencia de tumores y los niveles séricos de oncoproteínas. Por ejemplo, no hay datos publicados acerca de la producción de formas detectables de proteína mutante p2l en el suero de pacientes con carcinoma pancreático con grupos control formados por individuos de edad y sexo similares y con grupos que contengan pacientes con pancreatitis pero sin tumo-
res. Este es un estudio necesario, dado que un 90% de los cánceres de páncreas expresan ras-p21 oncogénico (Almoguerra. 1988). Una forma de utilizar las oncoproteínas del suero para detectar tumores especilicos en una fase precoz de la progresión del tumor es en poblaciones que se sabe están en riesgo de desarrollar cánceres especilicos debido a una historia de exposición a carcinógenos o mulágenos. como se produce en la exposición ocupacional o por procesos médicos preexistentes, observado en la exposición al cloruro de vinilo que se asocia con el angiosarcoma hepático y en las neumoconiosis que se asocian con cáncer de pulmón. Ambos procesos se asocian con niveles séricos elevados de proteína rasp21: la última condición se asocia también con niveles séricos elevados de neup185.
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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ
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Barbaod M: Ras genes. Ann Rev Biochem 1987; 56:779 Bhatavdekar JM. Palel DD, Vora HH, et ai: Circulating markers and growth factors as prognosticators in men with advanced tongue cancer Tumour Biol 1993; 14: suero del paciente. Si por lo menos se encuentra un resultado positivo, el pacien55-58. te puede seguirse en busca de síntomas del desarrollo de un tumor. Brandt-Raul PW, Rachovsky S. Pincus MR: Correlation ol the transmembrane domain of the neu-oncogene-encoded pl85 protein with its lunclion. Proc Natl AcadSciUSA1990; 87:8660. Tamaño del tumor y niveles de oncoproteína Brandt-Rauf PW: Oncogene proteins as biomarkers m Ihe molecular epidemiology ol occupational carcinogenesis: The example of Ihe ras oncogene encoded p2l En la actualidad, hay poca información acerca del tamaño mínimo de un protein. Inl Arch Occup Environ Health 1991; 63:1. tumor que da lugar a elevaciones séricas de oncoproteínas. Sin embargo, Brandt-Raul PW. Smith S, Hemminki K, el al: Serum oncoproteins and growth lac hay indicadores de que pequeñas lesiones pueden dar lugar a niveles signitors in asbestosis and silicosis patients. Int J Cancer 1992; 50:881. Brandt-Rauf PW. Pincus MR, Carney WP: The c-erbB-2 protein in oncogenesis: ficativos de ciertas oncoproteinas. Primero, en un número significativo de paMolecular structure to molecular epidemiology Crit Rev Oncog 1994b: 5:313. cientes con factores de nesgo conocidos para el cáncer, las oncoproteínas Brandt-Raul PW, Luo JC, Carney WP, et al: The detection of increaseo amounts of se descubrieron en su suero antes del desarrollo de un cáncer detectable. the extracellular domain of Ihe c erbB 2 oncoprotein in serum during pulmonary Asi. en pacientes con asbestosis. el ECD de la proteína p185 erbB se elevó carcinogenesis in humans. Int J Cancer 1994a; 56:383 antes del diagnóstico de los tumores pulmonares. La sobreexpresión del ECD Brandt-Raul PW. Chen JM. Marion M-J. et al: Conformational effects in the p53 pro tem of mutations induced during chemical carcinogenesis: Molecular dynamic p185 se produjo en un número de pacientes antes del desarrollo de un cánand immunologic analyses. J Protein Chem 1996:15:367. cer de mama. Los pacientes orientales que tenian niveles séricos elevados de Brandt-Rauf PW. Pincus MR: Molecular markers of carcinogenesis. Pharmacol Ther pl 85 ECD desarrollaron después carcinomas hepalocelulares. Los pacientes 1998: 77:135. con neumoconiosis resultaron tener niveles elevados de pl 85 ECD yo proteBrartstrom D. Bergvist M. Larsson A, et al: Basic fibroblast growth factor in sera from non-small cell lung cancer patients. Anticancer Res 1998:18:1123 ina p121 y desarrollaron posteriormente carcinomas pulmonares. Se descuBreuer B, DeVivo I, Luo JC, et al: erbB-2 and myc oncoproteins in sera and tumors brieron proteínas mulantes (Asp13-) p21 en el suero de un porcentaje muy ol breast cancer patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994: 3:63. elevado de pacientes con exposición al cloruro de vinilo que. nuevamente, Breuer B. Luo JC. DeVivo I. et al: Detection ol elevated c-erftB-2 oncoprotein in Ihe desarrollaron después angiosarcomas. Los anticuerpos anti-p53 se encontraserum and tissue in breast cancer. Med Sci Res 1993; 21:383-384. Carney WP. Hamer PJ. Petit D. et al: Detection and quantitation of the human neu ron en el suero de individuos que posteriormente desarrollaron angiosarcooncoprotein. Tumor Marker Oncol 1991; 6:53. mas o cánceres de pulmón. Todos estos estudios sugieren que lesiones Chakrabarty S. Huang S. Moskal TL. et al: Elevated serum levels of transforming malignas que son indetectables por técnicas convencionales pueden detecgrowth factor u in breast cancer patients. Cancer Lett 1994: 79:157. tarse midiendo los niveles séricos de oncoproteinas. en especial en pacientes de Kok JB. van Solinge WW. Ruers TJ, el al: Detection ol tumor DNA in serum of colorectal cancer patients. Scand J Clin Lab Invest 1997; 57:601. con exposición conocida o (actores de riesgo de desarrollar un cáncer. DeVivo I. Marion MJ, Smith SJ, et al: Mutant c-Ki-ras p21 protein in chemical carciSegundo, parece existir una buena correlación en algunos pacientes entre nogenesis in humans exposed to vinyl chloride. Cancer Causes Control 1994; 5:273. los niveles séricos de marcadores oncoproteinicos y el tamaño del tumor y/o Field JK, Spandidos DA: The role ol ras and myc oncogenes m human solid luel nivel de expresión del marcador en el propio tejido tumoral. A este respec mours and their relevance in diagnosis Anticancer Res 1990; 10:1. to, algunos adenomas pequeños (menores de 1 cm) han resultado dar lugar Fontanini G. Fiore L. Bigmi D. et al: Levels of p53 anhgen m serum of non-small lung a niveles elevados de p185 ECD o ras-p21 en el suero de estos pacientes. cancer patients correlate with positive p53 immunohistochemistry on tumor sec lions, tumor necrosis and nodal involvement. Int J Oncol 1994; 5:553. Tanto para la proteina ras-p21 como para erb8-2-p185 ECD, existe una exceForester K. Almoguerra C. Han K, et al: Detection of high incidence of K-ras oncolente correlación entre los niveles séricos de estos marcadores y el estado clígenes durmg human colon tumorigenesis. Nature 1987: 327:298. nico pre y poslratamiento del paciente. Aun asi. quedan por realizar estudios Fujimoto K. Ichimori Y. Kakizoe T, et al: Increased serum levels of basic fibroblast de correlación entre el tamaño del tumor y los niveles séricos de oncoproteígrowth factor in patients with renal cell carcinoma. Biocnem Biophys Res Commun 1991; 180:386. nas. Un factor de confusión puede ser que un tumor pequeño puede produHamer PJ, LaVecchio J. Ng S. et al: Activated Val-12 ras p21 in cell culture fluids cir grandes cantidades del marcador, mientras que tumores de mayor tamaño and mouse plasma. Oncogene 1991; 6:1609 pueden producir cantidades más pequeñas. Hioki O. Watanabe A, Minemura M. et al: Clinical significance of serum hepatoc/te growth factor levels m liver diseases J Med 1993; 24:35. A este respecto, las oncoproteínas se elevan en una alta proporción de carHoll KH. Kasson BG. Pessin GE: Insulin stimulation ol MEK-dependent but ERK cinomas in situ. como lo manifiestan los niveles séricos elevados de proteina independent SOS protein kinase Mol Cell Biol 1996:16:577. neu p185 en el cáncer de mama incipiente y del NMP22 en el carcinoma in situ Hughes JH. Cohen MB: Nuclear matnx proteins and their potential applications to de la vejiga. De forma peculiar, los niveles séricos de la oncoproteína neu están diagnostic pathology Am J Clin Pathol 1999:111:267. li M, Yoshida H, Aramaki Y. et al: Improved enzyme immunoassay lor human basic elevados en números más pequeños de cánceres de mama en fases I y II. fibroblast growth lactor using a new enhanced chemiluminescence system A pesar de las advertencias anteriores sobre la interpretación de las elevaBiochem Biophys Res Commun 1993.193:540. ciones de los niveles séricos de oncoproteínas o de la detección de formas Kath R. Hoffken K. Olte C, et al: The neu-oncogene product In serum and tissue of anómalas de estas proteínas en el suero y de la necesidad de realizar más patients with breast carcinoma. Ann Oncol 1993:4:585 Kaloh M. Inagaki H. Kurosawa-Ohsawa K et al: Detection of transforming growth estudios de correlación, los análisis de la presencia de oncoproteinas en el factor alpha in human unne ano plasma Biochem Biophys Res Commun 1990; suero muestran unas excepcionales posibilidades para la detección de tumo167:1065. res malignos en una fase precoz y para el control de su progresión, respuesKaur J. Srivastava A. Ralhan R Serum p53 antibodies m palients with oral lesions; ta al tratamiento, remisión y recidiva. correlation with p53'HSP70 complexes. Int J Cancer 1997; 74:609. Klocker El. Slenzl A, Cronauer MV, el al: Quantitative determination ol transforming growth factor-|i in serum and urine in patients with bladder cancer and its expres BIBLIOGRAFÍA sion in malignant and nor-malignant primary epithelial cells. Proc Am Assoc Cancer Res 1994: 35:A261. Kurobe M. Takei Y. Ezawa H. et al: Increased level of basic fibroblast growth factor Adler V, Pmcus MR. 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coces es analizar la expresión de una amplia variedad de oncoproteínas en el
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
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CAPÍTULO
65
Técnicas moleculares en el diagnóstico de neoplasias hematopoyéiicas David S. Viswanatha, M.D. Richard S. Larson, M.D., Ph.D.
PERSPECTIVA HISTÓRICA TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA
1355
1356
Leucemia mieloide crónica Leucemia linfobláslica aguda Leucemia mieloide aguda TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LINFOMAS
USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL
1367
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN EL DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE LOS TUMORES MALIGNOS HEMATOLINFOIDES
1368
BIBLIOGRAFÍA
1368
1359
Bases para el análisis molecular genético en los trastornos linfoides Análisis de la reorganización genética de los receptores antigénicos para la determinación de la clonalidad Significado y detección molecular de traslocaciones comunes cromosómicas asociadas al linfoma
PERSPECTIVA HISTÓRICA Las técnicas utilizadas en el diagnóstico de neoplasias hematolinfoides comprenden la valoración morfológica, tinciones citoquimicas. análisis de citometria de flujo y análisis cariotipico. Aunque no todas estas técnicas son necesarias en cada uno de los casos, el uso adecuado de estas tecnologías ha dado lugar a una mejora en la precisión diagnóstica. Aún asi. recientemente se han desarrollado técnicas moleculares más sensibles que pueden detectar alteraciones genéticas en las células leucémicas y del linfoma, proporcionando una especificidad y sensibilidad aún mayores en el diagnóstico. Estas técnicas en continua mejoría han hecho que se comprenda la amplia heterogeneidad clínica y biológica de las neoplasias hematopoyéticas tales como leucemias y linlomas. Además, una gran selección de agentes quimioterapéuticos. así como el trasplante de médula ósea, están ahora disponibles para el tratamiento de las leucemias y los Imfomas A la vista de una mayor comprensión de la diversidad clínica y biológica de estas neoplasias junto con mayores opciones terapéuticas, la selección de la terapia óptima y el momento de administrarla pueden ser complicados. Sin embargo, estudios recientes que utilizan estas nuevas tecnologías moleculares han empezado a solucionar este dilema. El análisis de los tumores hematopoyéticos en busca de la presencia de traslocaciones de los cromosomas se ha limitado siempre a técnicas menos sensibles y que consumen más tiempo, como las técnicas citogenéticas y de Southern Blot. Los análisis basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ácido desoxiribonucleico (ADN) se desarrollaron originalmente como una alternativa, y han aumentado de forma drástica la sensibilidad de detección proporcionando una amplificación exponencial de fragmentos de ADN. Estas técnicas ADN-PCR se han adaptado a los tejidos tanto frescos
como fijados con parafina. De esta forma, se pueden detectar inmunoglobulinas y redisposiciones de genes de los receptores de células T y algunas traslocaciones cromosómicas en las células de linfoma. Sin embargo, la mayoría de las traslocaciones cromosómicas de las células leucémicas no se pudieron delectar inicialmente utilizando esta técnica debido a las grandes distancias genómicas a lo largo de las cuales se producen los puntos de rotura de los cromosomas. La llegada de la reacción de la transcnptasa inversa de polimerasa en cadena (RT-PCR) ha permitido la detección de fragmentos de ácido ribonucleico (ARN). Asi. los productos de fusión del ARNm transcribidos desde las traslocaciones cromosómicas pueden ahora detectarse en tejidos no fijados. Actualmente la RT-PCR se usa de forma sistemática para detectar un gran número de traslocaciones en la leucemia linfobláslica y mieloblástica aguda. Las técnicas moleculares tienen una importante función en la valoración diagnóstica de los pacientes con neoplasias hematopoyéticas. Estas tecnologías comprenden el análisis medíanle Southern Blot y métodos basados en PCR para detectar traslocaciones cromosómicas específicas. Estas técnicas proporcionan una mayor sensibilidad diagnóstica y tienen unas implicaciones pronosticas y terapéuticas esenciales. Este capitulo trata las técnicas moleculares diagnósticas que tienen utilidad clínica en el diagnóstico de Imloma y leucemia. Un punto importante que no se puede enfatizar en exceso en la interpretación de los estudios moleculares es que el análisis de las pruebas moleculares, en un grado muy elevado, es un arte de morfología. La interpretación exacta y completa de los resultados moleculares se hace mejor en el contexto de los hallazgos histológicos (esto es. cuanto más se sabe acerca de la morfología de las células, el contexto clínico y otros estudios complementarios, menos probable es que se cometa un error).
1356
SECCIÓN V I I
•
PATOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA Las leucemias agudas y crónicas representan expansiones clónales de precursores de células neoplásicas. Las leucemias agudas se dividen en dos grupos principales de acuerdo con una limitada diferenciación linfocitaria o mieloide de las células precursoras: leucemia aguda linfoblástica (LAL) y leucemia aguda mieloblástica (LAM). También existen la leucemia linfocítica crónica (LLC) y la leucemia mieloide crónica (LMC). Dado que las características biológicas, diagnósticas y clínicas de la LLC se superponen con los linfomas Imfocilicos de células pequeñas, la utilidad de las técnicas de diagnóstico molecular en casos de LLC se tratan en la sección de linfomas. La presencia de traslocaciones cromosómicas especificas y no aleatorias en la leucemia aguda y crónica es importante para el diagnóstico y el pronóstico (Rubnitz. 1999: Melnick. 1999: Morgan. 1998: Larson. 1996). Las técnicas de diagnóstico molecular se usan sobre lodo para detectar estas traslocaciones en muestras diagnósticas y para la detección de enfermedad residual mínima (Tablas 65-1 y 65-2). A diferencia de muchas de las traslocaciones cromosómicas de los linfomas. las regiones de rotura entre dos genes que se transponen son grandes. Esta diferencia impide el uso de técnicas de PCR basadas en el ADN para la detección de estas traslocaciones en la mayoría de los casos de leucemia. Una excepción notable a esta regla son las técnicas de ADN-PCR de larga distancia que ya se han descrito, pero que todavía no se usan de forma sistemática en los laboratorios diagnósticos. Aun asi, en la mayoría de los casos de leucemia con traslocaciones cromosómicas, se lorma un ARNm de transcripción quimérico que se puede detectar mediante RT-PCR. Como el ARN no es por lo general estable en tejidos lijados con paralina, la RT-PCR se lleva a cabo en tejido fresco y no fijado.
Leucemia mieloide crónica Diagnóstico La LMC es un trastorno clonal de las células madre que se caracteriza por una proliferación aumentada de elementos mieloides en todas las fases de diferenciación. El diagnóstico de LMC se basa en el examen microscópico de un frolis de sangre periférica y de la biopsia de médula. La documentación de una traslocación característica entre los cromosomas 9 y 22. t(9:22) (p34.l :q11.21) (cromosoma Filadelfia [Ph]) confirma el diagnóstico. La traslocación recíproca coloca el proto-oncogén ABL en el cromosoma 9 y próximo al gen BCR en el cromosoma 22 (Figura 65-1 A) (Kurzrock, 1988: First International Workshop. 1978; Heislerkamp, 1988:Tymmons. 1989; Chissoe. 1995: Papayannopoulou. 1977). Esta alteración genética da lugar a la formación de una proteina quimérica. BCR-ABL. El producto de la fusión se expresa por lo general como una proteina quimérica de un peso molecular de 210.000 Da (p210) (Wada, 1995: Guo, 1991: Gorska-Flipol. 1990). P210 actúa liberando los controles de la proliferación de células madre o bloqueando la muerte celular programada, de forma que conduce a la proliferación de este clon. Más recientemente se han descrito puntos de rotura adicionales BCR-ABL y nuevas proteínas de fusión (Wada. 1995). En una pequeña proporción de pacientes con LMC. también se ha visto que se producen traslocaciones complejas, en las que participan de forma universal el cromosoma 22 y. por lo general, el cromosoma 9 (Champlin. 1985; Bernstein, 1999: Kurzrock. 1988: First International Workshop. 1978). El conocimiento de estos últimos hallazgos es crítico para la interpretación de las pruebas moleculares para la presencia de t(9:22) (McCIure. 1994). Los pacientes con LMC y con un cromosoma Ph clásico demostrable mediante citogenética tienen una fusión molecular de los genes BCR-ABL. Esta traslocación cromosómica puede también ponerse de manifiesto mediante análisis Southern Blot (Kurzrock. 1988) o bien detectarse el producto de la transcripción del ARNm de fusión mediante RT-PCR (Milelman. 1993). Aunque el Soulhem Blot y RT-PCR pueden no detectar traslocaciones complejas, Southern Blot detecta una traslocación en una pequeña minoría de casos de LMC descritos como falsos negativos utilizando técnicas citogenéticas (Kantarjian. 1990: Martiat. 1991). Las características clínicas y hematológicas de esta pequeña cohorte de casos que son falsamente normales desde el punto de vista del cariolipo. pero que tienen redisposiciones BCR detecta-
das mediante Southern Blot. son comparables con los casos que tienen unos cromosomas Ph muy claros en el cariolipo. Utilizando tanto técnicas moleculares como cilogenéticas. se puede poner de manifiesto Ph en un 99% de los casos. El 1% restante ha sido llamado LMC Ph (-) o alípica por algunos autores. Sin embargo, es probable que represente otro tipo de trastorno mieloproliferativo crónico, de manera que no es sorprendente que tengan un comportamiento más agresivo que LMC. RT-PCR detecta productos de diferente longitud que responden a proteínas quiméricas BCR-ABL de 190 kDa. 210 kDa y 230 kDa (Figura 65-1/4) (Kurzrock, 1978: Wada. 1995: Guo. 1991) Gorska-Flipot, 1990). Los puntos de rotura detectados medíante RT-PCR pueden ser útiles para distinguir LAL. LMC. LAM y la leucemia neutrofílica crónica (véase más adelante en Leucemia linfoblástica aguda y Leucemia mieloide crónica). En la gran mayoría de LMC de adultos y prácticamente todos los casos de los niños, está presente un producto de fusión p210 (Figura 65-1A 6). Los casos de LAL Ph (+) se asocian con la proteína p190. aunque se han descrito casos raros de LMC y LAM con la proteína de fusión más pequeña. En casos de leucemia neutrófila crónica está presente una gran proteína de fusión p230. La p230 se ha comunicado también en casos de LMC, pero la revisión retrospectiva de estos casos sugiere que pueden en realidad ser CNL. Hay también dos tipos de transcripción p210. b2a2 y b3a2 (Shtalid. 1988: Kurzrock. 1990). Aunque las diferencias definitivas pronosticas entre estos grupos son controvertidas, los pacientes con transcripción b3a2 son más propensos a tener recuentos plaquetanos elevados. Además, la frecuencia relativa de b2a2 y b3a2 es diferente en la LMC de la niñez y de la vida adulta, teniendo b3a2 dos tercios de los adultos y teniendo transcripciones de b2a2 una abrumadora mayoría de niños con LMC.
Detección de la progresión de la enfermedad en la LMC La progresión de la LMC a la fase acelerada o blástica (esto es. lase terminal) se asocia con la adquisición de anomalías adicionales genéticas y cromosómicas (Mitelman, 1993: Morris. 1990: Serra. 1993). La inestabilidad cromosómica del clon maligno es una característica fundamental de la progresión de la enfermedad en la LMC. El t(9:22) sigue siendo la única anomalía de los cromosomas durante la fase crónica, y su expresión continúa durante la crisis blástica. Sin embargo, del 70% al 80% de los pacientes desarrollan anomalías cromosómicas adicionales. A veces, estas anomalías de los cromosomas se pueden detectar en el tejido extramedular antes de las manifestaciones clínicas y hematológicas de la crisis blástica. Los cambios cromosómicos secundarios se han comunicado en más de 1.500 pacientes con LMC. Aunque no existe una única vía a la progresión, la anomalía cromosómica adquirida más común es la adquisición de otro cromosoma Ph. Las anomalías que afectan a los cromosomas 8.17.19 y 22 son las siguientes más comunes afectadas en la progresión de la enfermedad Dos pruebas moleculares que delectan el tamaño o cantidad del producto de la transcripción del ARNm BCR-ABL pueden ser útiles para evaluar la transformación de LMC: la PCR cuantitativa y el tamaño del producto del gen BCRABL (Serra. 1993; Lion, 1994: Preudhomme. 1999). Se han detectado dos tamaños de proleina de lusión BCR-ABL que corresponden a proteínas con pesos moleculares de 190 kDa y 210 kDa. Por lo general, los casos de transformación blástica en la LMC expresan la forma de 210 kDa. mientras que los nuevos casos de LAL con un cromosoma Ph expresan la forma de 190 kDa. Debido a que algunos casos de transformación blástica de LMC se presentan sm una fase crónica previamente diagnosticada, la LMC subyacente se sugerirá por la presencia de un producto p210. Además, la presencia de una forma de 190 kDa en conjunción con un producto de 210 kDa sugieren la evolución a una fase terminal. Aunque éste puede ser el caso, se pueden también generar niveles bajos de productos p190 por medio de una rotura alternativa de la fusión de transcripción p210. y no indica de forma universal una transformación. En estos casos es crítica la correlación morfológica. La cantidad de mensaje BCR-ABL se puede determinar mediante PCR cuantitativa. Aunque no se utiliza mucho, esta prueba puede semi-cuantificar el nivel de transcripción de ARNm BCR-ABL en pacientes con LMC. Aunque el nivel absoluto no es predictivo de una transformación, un aumento desde unos niveles básales previamente documentados para ese paciente puede predecir una inminente transformación, por lo general en el plazo de seis meses.
CAPÍTUIO 65 • TÉCNICAS MOLECULARES EN El DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS Cromosoma 9
Cromosoma 22
1357
1(^:22) (q34;qll)
Q
i
Figura 65-1. A. Esquema de una fusión que afecta a los genes BCR y ABL. El panel superior muestra el fenómeno de traslocaoón de cromosomas t(9:22) (q34; ql 1). que dan lugar a la formación de un gen de fusión BCR-ABL en el cromosoma 22q. El panel inferior muestra la estructura molecular del oncogén BCR-ABL. la transcripción quimérica del ARNm y la proteina de fusión bcr-abl. El tipo de fusión-rotura que se muestra (una región principal de rotura de BCR) se encuentra en la leucemia mieloide crónica y en un subconjunto de leucemias linfoblásticas agudas con positividad para el cromosoma Filadeltia. Como resultado de la fusión genética, el híbrido de transcripción BCR-ABL contiene secuencias BCR 5 unidas a casi toda la región que codifica la tirosina cinasa ABL. En este caso, se forma una proteína BCR-ABL de 210 kDa con una sobreactividad constitutiva de tirosina cinasa. El comportamiento aberrante de esta proteína híbrida parece contribuir a la génesis de la leucemia induciendo una transducción de señal mitogénica no supervisada. 8. Análisis RT-PCR para detección de la fusión BCR-ABL Blot representativo de productos PCR Después del aislamiento del ARN. se realizó una RT-PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos que cubren la unión de fusión de la región principal de roturas (MBR). Los productos PCR se transfirieron a una membrana de nylon y se detectaron en esta situación con una oligosonda especifica de la unión b3-a2. En las calles A, C y D: muestras de pacientes positivas para la fusión BCRABL b3-a2: en las calles B y E: muestras de pacientes negativas para la fusión; calle "—" : células control negativas: calle V : células positivas control para la fusión b3-a2: calle Bl': control nulo (sin ARN).
Enfermedad residual y recidiva después de la terapia RT-PCR se ha aplicado también a la detección de enfermedad residual mínima (MRD) (Tabla 65-1) (Siever. 1995). RT-PCR amplifica el ARNm quimérico formado por la traslocación enlre el cromosoma 9 y 22 en la LMC. El producto amplificado da lugar a una banda específica en la electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa. La sensibilidad puede aumentarse aun más median
le análisis Southern Blot del gel utilizando una sonda de oligonucleótidos. RT-PCR se puede hacer como una técnica de fase única o de incubación, ofreciendo cada una ciertas ventajas frente al análisis cariotipico o el análisis Southern Blot. La PCR de fase única permite la detección de entre una de cada 10- a 10 células. La RT-PCR 'anidada' permite la detección de entre una de cada 10 a 10 células. Ambos tipos de RT-PCR son especilicas. relativamente baratas, útiles fuera del contexto de la investigación y rápidas, estando disponibles los geles entre 24 y 48 horas después de la obtención del espécimen. 5
r
SECCIÓN V I I
1358 Tabla 65-1
t(8:21) inv(16) Anomalías 11q23 t(9;22)
t(i;i9) I(12;21) TCR-/ igH
PATOLOGÍA MOLECULAR
seis meses que siguen a un trasplante son difíciles de interpretar por varias razones. Se pueden obtener falsos negativos debido a la escasez o "parcheado" del material celular, y algunos pacientes tienen resultados positivos que desaparecen después de seis meses.
C o m p a r a c i ó n de los m é t o d o s P C R para la identificación de leucemia residual 1
Anomalía cromosomica 1(15:17)
•
Ventajas
Desventajas
La detección se correlaciona con la recaída Supervivencia prolongada en pruebas negativas
Leucemia linfoblástica aguda RT-PCR para t(1;19) (q23;p13) Se ha observado que las traslocaciones cromosómicas no aleatorias adquiridas que se asocian con las leucemias humanas son marcadores fiables de células leucémicas. En la leucemia linfoblástica aguda, las más comunes son t(1:19) (q23:p13) y t(12;21) (Tabla 65-2) (Amylon, 1997; Rubmtz, 1997; Privitera. 1996; Hunger, 1998). El uso de la RT-PCR en casos de LAL con estas traslocaciones puede proporcionar una información pronostica critica, así como el descubrimiento de enfermedad residual mínima. La t(1:19) Iq23:p13) es una traslocación frecuente en la LAL infantil (Hunger, 1998: Privítera. 1996.1994). Esta traslocación se produce en el 5% al 6% de todas las LAL infantiles, pero también se produce en aproximadamente un 25% de casos pre-B (positiva para inmunoglobulinas citoplásmicas). En general, la 1(1:19) conduce a la fusión de E2A. y el gen que codifica la proteína hélice-asa-hélice (HLH) en el cromosoma 19. con PBX1. un "homeobox" que contiene el gen en el cromosoma uno. El híbrido E2A-PBX-lse expresa como un conjunto de proteínas quiméricas oncogénicas. En la mayoría de los casos, los puntos de rotura genómicos de t( 1:19) se producen en un intrón único de E2A y PBX1. dando lugar a ARNm quiméricos transcritos que muestran un punto de unión uniforme. La presencia de este punto de unión uniforme permite la detección de la mayoría de los casos de LAL con t(1:l9) mediante RT-PCR.
No es prediclora de recaída a menos que sea cuantitativa Se desconoce si predice la recaída Se desconoce si predice la recaída La detección tardía La detección precoz después de un cierto (<6 meses) no periodo de tiempo se se correlaciona con correlaciona con el la recaída de la LMC riesgo de recaída en la LMC No predice la recaída a menos que sea cuantitativa La detección se correlaciona con el nesgo de recaída Se desconoce si predice la recaída
RT-PCR tiene limitaciones en la LMC (Dhingra. 1992). La extrema sensibilidad del método crea una cierta tasa de falsos positivos, sobre todo debido al arrastre de productos de reacciones previas a las nuevas muestras. La tasa de falsos positivos es normalmente más alta con la RT-PCR "anidada" en relación con la de fase simple debido a la mayor sensibilidad de la RT-PCR anidada. Además, los controles negativos son críticos en ambos tipos de análisis RT-PCR. Los falsos negativos producidos por la degradación del ARN se pueden excluir utilizando una secuencia control de ARNm en paralelo. Además, una pequeña minoría de los casos tienen puntos de rotura complejos (<5%), dando lugar a falsos resultados negativos en la RT-PCR. Las técnicas de PCR y de Southern Blot parecen tener una sensibilidad similar frente a localizaciones atipicas de rotura: sin embargo, el análisis cariotípico probablemente detecte estas traslocaciones poco habituales. Un alto riesgo de recidiva se ve anunciado por un RT-PCR positivo durante más de seis meses después de un trasplante de médula ósea (Hughes, 1991; Van Rhee, 1994: Xu. 1994). Los resultados positivos o negativos en los
Tabla 65-2
La t(1:19) se ha asociado con un mal pronóstico clínico, aunque la quimioterapia intensificada parece ser eficaz para anular su impacto pronóstico adverso, Por tanto, la detección de t(1 ;19) en un caso de LAL de estirpe B tiene importancia pronostica y lerapéulica. A pesar de su importancia en los especímenes diagnósticos, el análisis medíante PCR no cuantitativa para enfermedad residual mínima al término del tratamiento de consolidación no parece ser de valor clínico o pronóstico, debido a que no hay diferencia en la supervivencia libre de incidencias de los casos positivos o negativos para PCR de las LAL en remisión (Tablas 65-1 y 65-2).
RT-PCR para t(12;21) Investigaciones recientes han demostrado que una t(12;21) es la traslocación cromosómica más frecuente en la LAL infantil, produciéndose en el 25% de todos los casos (Rubnitz. 1997; Amylon. 1997;Hoshino. 1997: Uphofl, 1997). Esta traslocación es "críptica", queriendo decir que por lo general no se detecta mediante técnicas citogenéticas. pero que se detecta con frecuencia me-
Traslocaciones recurrentes c o m u n e s y
Traslocación t(15;17)(q24;q22) I(8;21)(q22;q22) invl6(p13;q22)o t(16;16)(p13;q22) I(9;22)(q34.q11) t(1;19)(q23:p13.3) t(12;21)(p13;q22) I(4;11)(q21:q23) Otras traslocaciones 11(q23)
Gen de fusión
Mecanismo
Detección
LAM-M3 LAM-M2 LAM-M4EO
PML-RARct AML l-ETO CBFji-MYH 1!
Proteina quimérica Proteína quimérica Proteína quimérica
RT-PCR RT-PCR RT-PCR SBH
5 10-15 10
1/10M0 VIOMO 1/10 -10
LAL Ph' adulta y pediátrica LAL pre-B pediátrica LAL pre-B pediátrica LAL pre-B pediátrica ("estirpe mixta") LAL. LAM y LAM secundaria adultas y pediátricas
BCR-ABL
RT-PCR SBH RT-PCR. SBH RT-PCR RT-PCR. SBH
20 (adulto) 5 (pediátrico) 5 20-25 3-4'
1/W-10'
TEL-AML I MLL-AF4
Sobreexpresión de oncogén Proteina quimérica Proteína quimérica Proteína quimérica
MLUoliOS
Proteína quimérica
RT-PCR, SBH
Variable'
1/10'
Enfermedad
E2A-PBX1
" "Sensibilidad", tal como se menciona, refleja el método de detección más sensible (por ejemplo. PCR). ' Casi un 80% de las LAL inlantiles. Variable: el porcentaje depende del subtipo de leucemia !
.
!
Frecuencia (%)
Sensibilidad" 4
6
a
;
f
1/1OM0 1/10 1/10 4 4
C A P Í T U L O 65
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TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
diante RT-PCR. El 1(12:21) da lugar a una fusión en el dominio HLH del gen TEL a los dominios de Iransactivación y unión al ADN del gen AML /. El gen TEL es un miembro de la familia recientemente descrita ETS de factores de transcripción, y el gen AML1 codifica la subunidad de unión al ADN (CBFot) del complejo de transcripción del tactor de unión al "core". El gen TEL participa también en otras traslocaciones poco habituales, incluyendo t(5;12). t(9;l2), t(10;12) y t(12;22), que se encuentra sobre todo en trastornos mielodisplásicos y mieloprolilerativos. A diferencia de ello, el complejo del factor de unión al core AML1 'CDFji es el objetivo más frecuente de las traslocaciones cromosómicas en los casos nuevos de LAM. estando alterado en t(8:21) e inv(16) en hasta un 30% de los casos. La función de la oncoproteína TEUAML1 sigue siendo desconocida, pero datos recientes sugieren que altera directamente la actividad transcripcional de AML1. necesaria para una hematopoyesis normal. Los estudios iniciales han indicado que la presencia de esta traslocación identifica un subgrupo clínicamente diferente con un pronóstico favorable a pesar de la ausencia de hiperploidia en estos pacientes (Tablas 65-1 y 652) Cuando se estratifica de acuerdo con la edad, recuento leucocilario. clasificación de riesgo y régimen terapéutico, los pacientes con redisposiciones TEL tienen un pronóstico significativamente mejor que aquellos con una línea germinal TEL. De hecho, el poder predictivo de la redisposición TEL en la LAL pediátrica excede a todos los demás lactores de valoración de riesgo. Las bases biológicas o moleculares para el buen pronóstico son desconocidas.
Leucemia mieloide aguda Se ha utilizado RT-PCR en la LAM para la detección de anomalías 1(15:17), 1(8:21). inv(16). y Hq23 ¡Tablas 65-1 y 65-2). Los análisis basados en RT PCR en la LAM tienen las mismas ventajas y limitaciones técnicas que en el LMC: sin embargo, es importante evitar la tentación de aplicar los resultados de un análisis especifico al grupo heterogéneo de la LAM como todo. La importancia clínica de cada prueba debe determinarse individualmente como se explica más adelante. La característica traslocación tí 15:17) (q22:p21) está presente en casi todos los pacientes con leucemia promielocítica aguda (sistema de clasificación de leucemias franco-americano-británico [FAB] M3 LAM), constituyendo del 5% al 10% de todas las LAM (Miller. 1992). La traslocación entre un receptor de ácido retinoico (RAR-a) en el cromosoma 17 con el gen de la leucemia promielocítica (pml) en el cromosoma 15 da lugar en última instancia a una proteina de fusión PMLRAR-rx. La proteina quimérica contribuye de forma aparente a la génesis de la leucemia inhibiendo la diferenciación o promoviendo la supervivencia celular mediante la inhibición de la apoptosis. Los análisis RT-PCR persistentemente positivos tienen una relación directa con la recaída, distinguiendo a un pequeño grupo de pacientes en los que la recaída es casi segura (RT-PCR-posilivos) de un grupo más grande en los que la recidiva es poco probable (RT-PCR-negativos). Además, las pruebas a intervalos probablemente disminuyan los resultados clínicos ambiguos del grupo negativo al identificar pacientes propensos a recaer antes de la aparición de una enfermedad manifiesta. La t(8;21) (q22;q22) se observa en el 6% al 18% de las LAM, con mayor frecuencia en la LAM FAB-M2 (Nucifora, 1993a; Chang, 1993: Nucifora, 1993b) A diferencia de t(9;22) y t( 15:17). los investigadores han detectado de forma persistente y repetitiva esta traslocación en pacientes con remisión de larga duración. Así, a diferencia de p(15;17), en la LAM FAB-M2 la detección de t(8:21) no predice una recidiva inminente; sin embargo, dado que la detección de la traslocación implica un peor pronóstico y probablemente un abordaje terapéutico diferente, el uso de la RT-PCR en la LAM (FAB-M2) es una posible alternativa al análisis citogenético en el momento del diagnóstico y terapia inicial. La inv(16) (p13q22) está presente en el 2% al 8% de las AMP pediátricas, con mayor frecuencia en asociación con una leucemia clasificada morfológicamente como FAB-M4Eo (Liu. 1993: Claxton, 1994). Las anomalías 11q23. incluyendo t(4;11) son también comunes en LAM y en la LAL pediátricas (Yamamoto, 1994). Inv(16) es un hallazgo favorable en la LAM. 1lq23 tiene un mal pronóstico en la leucemia pediátrica y en la LAM secundaria del adulto. La utilidad de 1lq23 y de inv(16) en la MRD no está bien estudiada hasta la fecha.
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TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LINFOMAS Bases para el análisis genético molecular en los trastornos linfoides Los linfomas no-Hodgkin (LNH) y las leucemias linfáticas crónicas constituyen una enfermedad maligna relativamente común enlre los adultos, y la incidencia de estos trastornos va en aumento (Ries. 1994). El abordaje anatomopatólogo tradicional para el diagnóstico de LNH comprende el reconocimiento de las características células tumorales con microscopio óptico, por lo general suplementado mediante estudios con marcadores inmunofenotípicos. La aplicación de métodos de fenotipado cada vez más sofisticados, incluyendo la citometría de flujo y la inmunoperoxidasa. ha mejorado de lorma considerable nuestra precision diagnóstica y nuestra capacidad para subclasificar los tumores linfoides. Un paradigma central en el diagnostico del linfoma es la demostración de la clonalidad. que está relacionada con el estado maligno. De nuevo, en muchos casos, la clonalidad se puede sugerir o establecer con ayuda de estudios de inmunofenotipado. mediante la demostración de restricción de cadenas ligeras en el caso de las neoplasias de células B o mediante expresión de antígenos aberrantes en la proliferación de células T. Sin embargo, hay varios casos en los que los análisis previos pueden ser insuficientes y la determinación de la clonalidad linfoide sigue siendo un método diagnóstico clave. En este contexto, la valoración molecular de las redisposiciones genéticas de los receptores clónales de antigenos ha sido extremadamente valiosa en ciedas situaciones técnicas, como muestras con características fenotípicas poco definidas, biopsias tisulares pequeñas y tejidos impregnados con parafma. Los métodos habituales de detección de clonalidad se emplean también ocasionalmente para distinguir los linternas de células grandes de la enfermedad de Hodgkm. para asignar lineas celulares en tumores hematopoyéticos no diferenciados (esto es. de células B frente a células T) y para ayudar de forma general en el diagnóstico de los trastornos linfoproliferativos de células T. Además, la determinación molecular de la clonalidad es a menudo necesaria para resolver el diagnóstico definitivo de neoplasias linfoides con características que potencialmente se parecen a las hyperplasias benignas (por ejemplo, linternas centrofoliculares. linfomas de tipo "MALT" y leucemia linfática de células T granulares grandes) La identificación de anomalías recurrentes, genéticas y no aleatorias de los linfomas, producidas la mayoría de las veces por fenómenos de traslocación cromosómica. ha proporcionado otro conjunto adicional de herramientas diagnósticas y perspectivas biológicas nuevas Los datos citogenéticos y de genética molecular de esta clase forman ahora una parle integral de las clasificaciones actuales de los linternas (Hams. 1994). La correlación de redistribuciones genéticas específicas con subtipos particulares de linterna proporcionan no solamente unos marcadores moleculares alternativos para la determinación de la clonalidad, sino que, de forma más significativa, ayudan a clasificar de forma precisa la enfermedad. Según sigue aumentando nuestro conocimiento de la biología de los linternas, el reconocimiento de entidades específicas basadas en criterios genéticos moleculares probablemente lorme una faceta integral de los tralamientos "dirigidos al tumor". La sección que sigue delalla los abordajes moleculares a la determinación de la clonalidad de células B y T. la detección y significado de las traslocaciones comunes recurrentes en los linfomas y la aplicación de técnicas moleculares al seguimiento postratamiento de enfermedad mínima.
Análisis de las reorganizaciones de los genes receptores de antígenos para la determinación de la clonalidad Mecanismo de las reorganizaciones de los genes receptores de antigenos Los genes de receptores antigénicos se redistribuyen precozmente en el desarrollo de los linfocitos B y T en la médula ósea y en el timo, respectivamente. El proceso de redistribución, o recombinación genética, afecta especialmente a la división y fusión de uno de los numerosos segmentos variables (V) del gen con un exón de unión (J). En algunos puntos, y notablemente en
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SECCIÓN V I I
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PATOLOGÍA MOLECULAR
los receptores |5 de las inmunoglobulinas de cadenas pesadas y células T, se interpone un segmento de diversidad (D) suplementario de los segmentos Vy J-. El segmento ensamblado V-J o V-D-J se une después con la región constante (C) del gen receptor del antígeno para producir una secuencia codificadora intacta capaz de traducirse en una proteína funcional del receptor de antígenos (Sklar. 1992). Las células inmunes incapaces de producir proteínas de receptor funcionales se destruyen mediante apoptosis. Para las células B inmaduras, el gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas del cromosoma 14(q32) es el primero en someterse a una redistribución segmentaria, que se sigue a su vez por el gen K de cadenas ligeras en 2(p12). Si este último intento es no productivo en ambos alelos, se selecciona el locus X en 22(q11) (Sklar, 1992). Para las células T, el receptor de las células 8 (T6) (14(q11)] y y (Ty) [7(p15]) inician este proceso en el timo; sin embargo, muchas de estas redistribuciones de los genes 5 o y fracasan en la producción de receptores proteínicos funcionales. Así. la redistribución continúa en los locus TCR a y -p, localizados en los cromosomas 14(q11) y 7(q34). respectivamente, generando un receptor Tctp en una gran mayoría (85% al 90%) de las células T (Sklar, 1992). Como punto importante en relación con el análisis molecular (más adelante), prácticamente todas las células maduras Tup siguen portando una redistribución del locus genéticos Ty. Existe una enorme diversidad en los receptores de inmunoglobulinas y células T, que surgen del potencial de recombinación genética entre numerosos segmentos de genes V-, (D-) y J- en estos puntos. Además, la actividad de la enzima desoxmucleotidil-transferasa terminal (TdT) añade de forma aleatoria bases de ácidos nucleicos a las uniones de los segmentos reorganizados de los genes, aumentando aún más la diversidad de las secuencias. Como resultado de todo este proceso, los linfocitos individuales B y T transportan redistribuciones genéticas peculiares y expresan en su superficie celular moléculas inmunes de receptores de antígenos peculiares. En una expansión línfoide policlonal, existe por lo general una distribución altamente variable de redistribuciones genéticas de receptores antigénicos, mientras que en una población monoclonal es característica una redistribución única e idéntica en cada célula. Este concepto se explota tanto en la hibridación Southern Blot (SBH) como en los métodos de PCR. para distinguir las proliferaciones policlonales ("benignas") de las monoclonales ("tumorales").
nicas SBH para detectar clonalidad linfoide depende de varios factores. Primero, el locus que se está estudiando debe ser anatómicamente favorable para su estudio medíante digestión enzimática e hibridación con sondas. Ciertos locus, como el gen Ta, son muy grandes y difíciles de valorar de forma adecuada con una buena sensibilidad utilizando un número práctico de digestión enzimática restringida y sondas. Por el contrario, el locus Ty, y tal y como se explica más adelante, es relativamente pequeño y de diversidad limitada, dando lugar a una escasa especificidad e impidiendo su uso en la SBH. Segundo, las sondas deben estar disponibles con facilidad para su uso en el diagnóstico clínico. Las sondas pueden producirse a partir de un fragmento de ADNc (complementario) a la región que nos interesa o mediante clonación genómica. y en el comercio existen varias de ellas. Por último, el método SBH precisa del uso de un ADN no degradado, de alio peso molecular y procedente de fuentes (.Bulares frescas o congeladas. Dado que para la digestión enzimática se utiliza una cantidad uniforme de ADN (por ejemplo, 5 pg), se puede obtener una estimación de la proporción de células clónales o de linea germinal en una muestra dada. Para la determinación de la clonalidad de células B mediante SBH, se han utilizado tanto los genes de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas (IgH) como los de las cadenas ligeras (K, X). El gen IgH se valora frecuentemente mediante una sonda para la región J (Willman. 1990: Cossman. 1988). La región J de IgH es altamente informativa, dado que este locus es relativamente compacto, se define con facilidad mediante digestión enzimática restringida y siempre participa en los fenómenos de recombinación de las células B. El gen de las cadenas ligeras ic ha sido también estudiado mediante análisis SBH. con una sonda de la región J,, aunque una minoría de casos de linfoma (aquellos con una recolocación de las cadenas ligeras X) pueden ser pasados por alto debido a una delecíón específica del locus K (Medeiros. 1995). Las redisposiciones del gen de las cadenas ligeras X puede valorarse con una sonda de la región constante (C,); sin embargo, este locus es altamente polimórfico con los estudios habituales de restricción enzimálica y los resultados de las bandas son más difíciles de interpretar (Saueracker, 1992). El locus (3 de las células T (T,J ha resultado ser el más útil para la delección de la clonalidad de las células T mediante SBH, y esta región comparte características estructurales parecidas a las del gen IgH. La complejidad del locus T se ve aumentada por la presencia de dos regiones D-, J- y C- disponibles para la recombinación con el gran repertorio de segmentos de la región V . Sin embargo, dado que las dos regiones C,, son de una secuencia casi idéntica, las redistribuciones del gen T, se pueden identificar mediante SBH utilizando una sonda genómica C„ y digestión restrictiva adecuada del ADN objetivo (Figura 65-2/4) (Medeiros, 1995). Se ha descrito también el uso de sondas específicas de la región J para detectar clonalidad en el locus T, (Medeiros. 1995). El locus T-y (T.) es por lo general poco adecuado para el análisis SBH debido al número relativamente pequeño de segmentos redistribuidos de las regiones V y J. Esta capacidad limitada para la recombinación segmentaria crea un conjunto relativamente pequeño de redistribuciones funcionales del gen T Así, en una población policlonal de células T. el SBH con una sonda de región J, resuelve potencialmente varias bandas prominentes además de los fragmentos esperados de linea germinal, a diferencia del análisis SDH del locus T.„ donde los clones reactivos benignos individuales no pasan por encima del umbral de sensibilidad de detección (Cossman, 1988: Medeiros, 1995). Esta situación conduce a la posibilidad de lamar erróneamente "seudoclonales" a las bandas de los procesos reactivos de células T y, por el contrario, puede oscurecer la identificación de un auténtico gen monoclonal T.. en presencia de células benignas T coexistentes. |(
Técnicas para detectar reorganizaciones de los genes de receptores antigénicos Hibridación Southern Blot. Las técnicas SBH se pueden considerar un abordaje molecular a "gran escala", que comprende una digestión restringida mediante endonucleasas de una muestra de ADN de alto peso molecular, seguida de separación de fragmentos, inmovilización sobre una membrana y detección mediante una sonda radioisotópica específica de uno o más fragmentos objetivo de ADN (relativamente grandes) (Willman. 1990; Cossman. 1988). Esta técnica se describe con detalle en el Capítulo 59. De forma resumida, y para una región estructuralmente no alterada (no reorganizada) del ADN objetivo, el análisis por hibridación Southern mostrará un cierto patrón de tamaños de fragmentos o de bandas, una configuración de línea germinal, basada en la distribución de determinados puntos de restricción enzimática dentro del locus en cuestión. Si esta región del ADN se redistribuye, como en el caso de los locus de receptores antigénicos de las células B y T, se producirá un patrón de bandas diferente (como resultado de los cambios en las localizaciones en los puntos de restricción enzimática de linea germinal), y estos cambios se pueden reconocer con facilidad mediante hibridación con una sonda especifica. La sensibilidad de SBH es tal que por lo menos un 5% de una población de células deben contener la misma redistribución de linea no germinal para poder detectarse. En una población linlocitaria policlonal, las células individuales D o T son portadoras de redistribuciones peculiares de sus genes de receptores antigénicos, y teóricamente se debería esperar que generen una "escalera" o amplia distribución de las redistribuciones cuando se analiza mediante SBH y con sondas adecuadas. Sin embargo, y en la práctica, en las proliferaciones policlonales no se ve este patrón de redistribución, dado que incluso grupos expandidos y altamente seleccionados de células línfoides reactivas no constituyen un 5% de las células totales en estas situaciones. Por contra, cada célula de una población monoclonal contiene una redistribución de los genes receptores de antígenos idéntica, y la SBH identificará bandas reorganizadas y claras (lineas no germinales) (Figura 65-24). La aplicación con éxito de las téc-
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Reacción en cadena de polimerasa. Las recombmaciones de los genes de los receptores de inmunoglobulinas y células T pueden identificarse también por métodos PCR. A diferencia de SBH, que detecta alteraciones genómícas estructurales relativamente grandes basándose en cambios en los puntos de restricción enzimática, la PCR está diseñada para amplificar regiones cortas de ADN correspondientes al área de fusión de segmentos del gen en los genes recombmados del receptor de antigeno. Bajo condiciones estándar de PCR. la configuración del gen de receptor de antígenos de línea germinal se amplifica con una baja eficiencia, o no se amplifica en absoluto, debido a las áreas de tamaño muy grande intervínientes de ADN entre los puntos de cebado. Sin embargo, cuando los segmentos codificadores V-, (D-) y J se yuxtaponen en un gen recombinado, la amplificación de la región entre los ceba-
CAPÍTULO 65
TÉCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS
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FR3-JH
Figura 65-2. A. Hibridación Southern Blot en el locus T|i. Se muestra un ganglio linfático benigno (L) ADN de linea germinal piacentana (P) y un ganglio linfático afectado por un linloma de células T (A). Cada una de las muestras lúe digenda con los enzimas de restricción BamH1 (B), EcoR1 (E) y Hindlll (H) como se indica. Después de una electroforesis en gel y la transferencia a una membrana de nylon, los fragmentos del locus especifico T|i de cada digestión se detectan mediante hibridación con una sonda etiquetada de forma radioactiva y expuestos a una placa radiográfica. Los patrones de bandas de línea germinal (no reorganizados) se presentan para las muestras L y P, y estas bandas se ven también en la muestra del linfoma (A). Sin embargo, la muestra del linfoma (A) muestra además dos bandas concretas de línea no germinal, o reorganizadas, tanto en las digestiones Bamhl como Hindlll (flechas). Dado que se utiliza la misma cantidad de ADN en cada canal, se puede estimar la cantidad relativa de enlermedad clonal en la muestra del tumor Obsérvese la tenue banda de linea germinal en la muestra de nodulo linfático benigno (L) en la digestión BamH1. indicando que aqui se usó una cantidad insuficiente de ADN. B. Esquema de la estructura parcial del gen IgH y de la estrategia PCR para la detección de la reorganización del gen IgH Se indican las regiones determinantes complementarias (CDR) y las regiones marco (FR) de la cadena pesada variable Ig funcional. Superpuestas están las regiones V-, D- y J-. ilustrando la relación de los segmentos codificadores del gen con la estructura variable IgH de la cadena de anticuerpos. El segmento V_ codifica la mayoría de la región variable en la molécula IgH. incluyendo la tercera región marco (FR-lll). El "CDR III" está formado por la unión de los segmentos individuales V . D y J y es una región altamente peculiar en la secuencia de cada célula B. La letra "n" indica focos de inserciones nucleótidas no contempladas por la enzima TdT durante la recombmación VDJ. Para la detección mediante PCR de la clonalidad. el ob|etivo es CDR III. Con la mayor frecuencia, esto se consigue mediante el uso de un FR III de consenso y un conjunto de cebadores J„ (y D). Los métodos alternativos pueden incluir cebadores de consenso FR ll-JH (B y D) o una familia de cebadores FRI específicos de secuencia para la región V con un cebador de consenso JH (A y D). La PCR de amplificación a través de la región de unión peculiar IgH produce una mancha o distribución de producios en un proceso de células B policlonal. o un producto único de tamaño definido en una población monoclonal. C. Imagen representativa de la PCR FR lll-JH (CDR III) para la detección de las reorganizaciones del gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulmas (IgH). Después de la amplificación de IgH CDR III mediante la reacción de polimerasa en cadena, los productos PCR se analizan en un gel de poliacrilamida y se ven bajo luz UV tras su tinción con bromuro de etidio. Las calles etiquetadas A a C representan muestras de pacientes analizadas por duplicado La calle A del paciente muestra una banda claramente resuelta indicando una población monoclonal de células B A diferencia de ello, la calle del paciente C muestra una macha dilusa de productos PCR. acordes con un proceso policlonal de células B La calle del paciente B no muestra ningún producto de amplificación, indicando una ausencia de población significativa de células B en la muestra En la última situación, se necesita la amplilicación de un ADN objetivo control interno no relacionado para excluir una mala calidad del ADN. Otras calles: L. escalera de peso molecular (tamaño): calle *, control positivo de ADN: calle Bl. blanco (sin ADN). H
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S E C C I Ó N VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
dores ahora muy próximos se lleva a cabo muy fácilmente mediante PCR. Los locus de más amplio uso para la determinación mediante PCR de la clonalidad linloide son los genes IgH y T . En la Figura 65-2B se muestra un esquema de la IgH PCR. Se han descrito varios abordajes para la IgH PCR. La técnica que se aplica con más frecuencia comprende la amplificación a través de la tercera región determinante complementaria (CDR III) del gen reordenado IgH (Segal, 1994; Slack. 1993). El IgH CDR III está formado por la fusión de los exones V-, D-. y J-. La región del gen V„ comprende casi 200 segmentos diferentes que se pueden agrupar en seis familias basándose en similandades de secuencia Las regiones D - y J contienen aproximadamente 15 y 6 segmentos del gen, respectivamente. La recombmación aleatoria de estos segmentos crea asi una diversidad IgH significativa, aumentada aún más por la adición de nucleótidos funcionales sin plantilla por la enzima TdT. Como resultado, el CDR III es completamente único en cualquier célula B dada y puede utilizarse como un potente marcador de clonalidad en las neoplasias de células B. Aunque el CDR III es extremadamente variable entre los linlocilos B, los métodos de PCR de esta región están simplificados por el uso de cebadores consensuados. El extremo 3 de la región contigua V№ conocida como la región marco III (FR III). exhibe secuencias nucleotidicas que están muy conservadas en la mayoría de los segmentos del gen V . De lorma análoga, cada segmento J contiene regiones de secuencia idéntica de nucleótidos. Se pueden asi diseñar cebadores complementarios PCR para FR III y J„ que flanquean el CDR III. En una proliferación policlonal de células B. pueden esperarse muchos miles de redistribuciones individuales CDR III. Dado que ninguna de estas poblaciones reactivas están normalmente presentes por encima del umbral de sensibilidad del análisis PCR (aproximadamente un 1%). en la electroforesis con gel se observa un patrón muy débil de bandas múltiples (Figura 65-2C). En un proceso monoclonal de células B todas las células son portadoras de un CDR III idéntico que se amplifica de forma preferencial durante la PCR. dando lugar a una llamativa banda clonal durante el análisis con gel (Figura 65-2C). De forma ocasional, puede existir una segunda banda, indicativa de redísposiciones bialélicas de IgH. ;
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El locus T„ aunque no es muy adecuado para SBH. ha sido, sin embargo, utilizado con éxito para la determinación de clonalidad de células T mediante PCR (Slack. 1993: Wood. 1994). Las redistribuciones del gen Tyse producen precozmente en los linfocitos T tímicos en desarrollo, y este evento genético se retiene, aunque la inmensa mayoría de células T inmaduras continúan reorganizando los locus Ta y T|i, y en última instancia desarrollan un fenotipo Ta(l de receplor. El locus Ty proporciona así un marcador para valorar la clonalidad cuando se sospecha una neoplasia de células T. El locus Ty comprende once segmentos que codifican la región V, agrupados en cuatro lamilias basándose en similaridades de secuencia. Existen cuatro segmentos funcionales de la región J, incluyendo los exones conservados Jyl y Jy2. asi como los exones Jpl y Jp2 (McCarthy, 1992). La PCR de T. también se basa en la naturaleza peculiar de las redistribuciones luncionales en los linfocitos T individuales; la técnica es a menudo informativa a pesar de la diversidad segmentaria limitada de este locus, y teniendo en mente algunas limitaciones (analizadas en la próxima sección). Se pueden utilizar cebadores consensuados complementarios a las secuencias de homología compartida en los segmentos gamma V- y Jpara simplificar el procedimiento de la PCR. De forma similar al caso de la PCR de IgH, los productos de amplificación de las células T policlonales tienden a producir un patrón uniforme, mientras que la monoclonalidad se pone de manifiesto en forma de una o dos bandas discretas. Ventajas y limitaciones de SBH y PCR para la valoración de la clonalidad linfoide. La decisión de utilizar PCR trente a SBH conlleva conocer varios factores tales como la fuente tisular. el tipo de trastorno linfoproliferativo que se estudia, la sensibilidad de cada uno de los métodos y las frecuencias de falsos negativos y falsos positivos. En general, la técnica PCR ha ganado una amplia popularidad para la determinación de la clonalidad. principalmente debido a su relativa facilidad de llevarse a cabo y a su rapidez. El método SBH es. por contra, muy laborioso, más caro, y necesita de entre dos y tres semanas para completarse. Además, SBH se lleva a cabo por lo general con sondas etiquetadas con radiactividad. Otras desventajas de SBH son la necesidad de tejido fresco o congelado de buena calidad (para obtener un ADN de alto peso molecular) y una sensibilidad relativamente baja, en la proximidad del 5%. La PCR es ventajosa en cuanto a que su tiempo es en general de días, es más barata y necesita una cantidad inicial de ADN mucho más pequeña (por ejem-
plo. 0.5 pg a 1 pg) en comparación con SBH. PCR tiene una sensibilidad nominal de un 1%. y esto puede extenderse aun más entre un 0.1% y un 0,001%, mediante optimización en aplicaciones especiales tales como la detección de linfoma o leucemia residuales. Además. PCR se puede llevar a cabo a partir de fuentes tisulares parafinizadas, frescas o fijadas, aunque algunos fijadores (por ejemplo. B5) o sustancias utilizadas por lo común en el procesado de los ganglios linfáticos o de la médula ósea pueden inhibir la PCR. Aunque los métodos PCR son más "simplistas" en comparación, la técnica es muy lábil frente a alteraciones "micromoleculares de las regiones objetivo de los cebadores de oligonucleótidos. Así. el uso de cebadores de consenso no amplificará redistribuciones poco comunes IgH o Tg que comprendan segmentos del gen que carecen de las secuencias complementarias conservadas. Quizá de forma más significativa, las mutaciones de bases nucleotidicas o las delecciones en el ADN plantilla pueden impedir una unión eficaz de las secuencias de cebadores complementarias, dando lugar al fracaso de la PCR Tales situaciones se producen en algunos tumores linfoides B que han sufrido hipermutaciones somáticas de la región CDR III. Los ejemplos incluyen los linfomas de células centrofoliculares, algunos linfomas de células grandes y los linfomas con diferenciación plasmacitoide. en los que la determinación de clonalidad puede variar de un 35% a un 60% utilizando PCR IgH CDR III (Lombardo, 1996: Segal, 1995). La tasa de detección de clonalidad en tumores de linfocitos B pequeños de origen no folicular (por ejemplo, linfoma linfocítico pequeño, linfomas de células del manto) es. por contra, próxima al 100%. Las leucemias Imfoblásticas agudas de células B y los linfomas pueden portar de forma ocasional una redistribución clonal aislada D-J. o sufrir deleciones en la región V., del gen. impidiendo asi el éxito de los métodos habituales de PCR CDR III (Height. 1996). Para valorar la clonalidad Cg existe un problema más difícil. A pesar de la naturaleza funcional peculiar de cada reorganización de los segmentos V-J de Tg. la diversidad limitada de este locus puede dar lugar a amplicones PCR con un tamaño muy parecido e incluso características secuenciales muy similares. Esto puede crear dificultades para identificar una auténtica población clonal de células T cuando las células T policlonales coexistentes son numerosas, dado que las secuencias amplificadas similares pero no homologas pueden cear heterodúplex" con los amplicones objetivo durante la electroforesis en gel. disminuyendo de forma notable la capacidad para detectar una banda monoclonal. Dadas estas limitaciones de la técnica PCR, la SBH puede todavía ser necesaria para resolver un problema difícil de clonalidad en una proliferación linfoide. Dado que SBH valora la estructura de regiones genómicas de mayor tamaño, la técnica no es adecuada para aquellos temas mencionados antes para la PCR. SBH está considerada el método de referencia para la determinación de clonalidad en este contexto diagnóstico y. afortunadamente, dado que la PCR es un método muy rápido, uno puede posteriormente revertir al análisis SBH en caso de que los resultados de la PCR no sean determinantes. Sin embargo, la necesidad de cantidades adecuadas de ADN de tejido fresco o congelado en muchos casos no se pueden satisfacer, y esta limitación debida a la muestra ha estimulado las mejoras en los análisis y técnicas PCR. Por ejemplo, se han utilizado conjuntos alternativos de cebadores para soslayar el fracaso de la amplificación debido a alteraciones en las regiones CDR III o FR III que con una cierta frecuencia aparecen en la PCR del locus IgH. Se pueden combinar un cebador de la región II marco (FR II) situado aguas arriba de esta región de consenso o un número de cebadores VH "específicos de la familia" FR I con el cebador de consenso JH (Figura 65-20) (Ramasamy. 1992; Aubin. 1995: Deane, 1991). Estas maniobras sirven para aumentar el éxito global de la detección de clonalidad desde aproximadamente un 65% (sólo con la PCR estándar IgH CDR III PCR) hasta aproximadamente un 90% a expensas de un mayor trabajo y complejidad. También se han utilizado de forma efectiva cebadores de PCR específicos de familia" para aumentar la detección de clonalidad en el locus Tg (Greiner, 1999). Los cambios en el análisis de gel pueden también afectar de forma significativa la resolución y. por tanto, la detección, de productos clónales de PCR. El uso de geles de poliacrilamida es por lo general más informativo que los geles de agarosa, y las modificaciones en la composición del gel pueden mejorar esto todavía más. En el caso de la PCR Tg. la generación potencial de productos competidores pero mespecílicos de tipo heterodúplex puede reducirse de forma sustancial mediante vanos métodos preanalíticos y de electroforesis en gel. favoreciendo así la detección de una auténtica población clonal (Bottaro.
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T É C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
1994; Chhanabhai, 1997; Langerak. 1997). Por último, la demostración de traslocaciones cromosómicas recurrentes mediante técnicas de PCR. sobre todo en un subconjunto de tumores de células B. proporciona otro marcador adicional de clonalidad si la PCR inicial de redisposición de los receptores antigénicos no tiene éxito; esto se trata en la sección siguiente. Para resumir. PCR y SBH son técnicas clave y complementarias para la determinación de la clonalidad en los trastornos línfoides de células B y T. En general, los métodos PCR son a menudo considerados como "punteros", reservándose la SBH para aquellos casos con un material adecuado y en los que se considera que un resultado negativo de la PCR no está de acuerdo con otros hallazgos clínicos o patológicos. A este respecto, es importante tener en mente los conceptos de "tasa de detección" y "sensibilidad", en relación con la técnica PCR. La tasa de detección de la PCR IgH o Tg será dependiente de un número de factores previamente descritos, como el subtipo de trastorno linfoproliferativo. el método PCR (cebadores únicos frente a múltiples) y el tipo de análisis de gel empleado. La PCR no detectará las redistribuciones clónales en todos los casos de tumores línfoides malignos, y así el conocimiento de la tasa global de detección de un cierto método PCR, o las mejoras obtenidas mediante avances de esta técnica, es valioso para la interpretación de resultados. Un ejemplo es el del linfoma folicular, que se asocia normalmente con una tasa de detección clonal IgH de un 40% a un 60% utilizando el método PCR IgH CDR III (Segal, 1995). Combinando la PCR IgH con un análisis PCR para identificar las redistribuciones del gen BCL 2, se pueden detectar hasta un 80% a un 85% de los casos (Segal, 1995). Por otro lado, la capacidad de un método dado de PCR para resolver cantidades diminutas de un objetivo molecular, o su sensibilidad, se explota a menudo en circunstancias específicas tales como el seguimiento de la enfermedad residual mínima (por ejemplo, linfoma o leucemia) durante o después del tratamiento. La sensibilidad se mide por lo general de forma dilucional, y se optimiza a menudo mediante secuenciación de la región recombinada funcional peculiar del gen del receptor de antígenos clonal y diseñando cebadores "alelo"-específicos del tumor o sondas para utilizarse en la vigilancia de muestras posteriores de un paciente dado. Es esencial, dado que los estudios moleculares diagnósticos basados en PCR son capaces de conseguir elevados niveles de sensibilidad, tener gran cuidado para minimizar y eliminar la posibilidad de contaminación de muestras en el laboratorio; incluso una cantidad diminuta de una plantilla contaminante extraña puede convertir un resultado PCR policlonal auténtico en una interpretación falsamente positiva de monoclonalidad, con las correspondientes consecuencias clínicas graves.
Significado y detección molecular de traslocaciones cromosómicas comunes asociadas al linfoma La comprensión de la biología de los linfomas no-Hodgkín se ha agrandado de forma sustancial con la identificación de las traslocaciones cromosómicas recurrentes que se asocian con neoplasias en concreto (Tabla 65-3). La identificación de estas anomalías genéticas no solamente es muy útil para el diagnóstico (establecimiento de clonalidad, clasificación de los linfomas), sino que a
Tabla 65-3
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menudo proporciona información pronostica, o un marcador para la detección de enfermedad residual. En general, las traslocaciones cromosómicas en los linfomas resultan de la fusión de dos locus genéticos, que se producen con más frecuencia en el locus IgH del cromosoma 14(q32), En consecuencia, un protooncogén que normalmente está altamente regulado se activa de forma constitutiva, dando lugar a una marcada sobreexpresión de una proteína oncogénica. En otros casos, por ejemplo, el t(2;5) en un linfoma anaplásico de células grandes, se produce un gen de fusión quimérico y se expresa como un ARNm híbrido y proteína. En cada caso, se cree que la interferencia con el crecimiento normal de las células línfoides. su homeostasis o su muerte (apoptosis) parece tener un papel central en la génesis de los linfomas.
Anomalía t(14;18) (q32;q21) La anomalía 1{14:18) es la traslocación más común de los linfomas de estirpe celular B. A nivel molecular, esta traslocación da lugar a la yuxtaposición del gen BCL2 con la región J en el locus de las cadenas pesadas de inmunoblobulina (J„) (Weiss, 1987; Cleary, 1985: Bakshi, 1985; Tsujimoto, 1985). Como consecuencia, el gen BCL2 queda bajo el control del elemento potenciador de IgH altamente activo, dando lugar a la sobreexpresión de la proteina bcl2. El gen producto de BCL2 es una molécula antiapoptótica. capaz de abrogar el proceso normal de la muerte celular programada y proteger a las células de una variedad de eventos citotóxicos letales (Yang, 1996: Hockenberry. 1990). Las redisposiciones del gen BCL2 se encuentran en hasta un 85% de los linfomas de células foliculares centrales, aproximadamente en un 25% de los linfomas de células B grandes, y raramente en otros trastornos Imfoproliferativos B (Weiss, 1987: Horsman. 1995; Kouides. 1994). La estructura genómica parcial del locus del gen BCL2 se ilustra en la Figura 65-3A La mayor proporción (60%) de puntos de rotura-fusión en el gen BCL2 se produce en un área muy pequeña de aproximadamente 150 pares de bases (bp) en el segmento no codificador 3' del exón 3, conocido como región principal de rotura (MBfl) (Cleary, 1985). Se produce un menor número de roturas (15% al 20%) en una segunda región más telomérica que se conoce como la región menor de acumulo (mcr) (Ngan. 1989; Cleary. 1986). Raramente, una región 5' de BCL2 descrita como la "región acumulo variante" (VCR) se redispone en las leucemias linfocíticas crónicas de células B: normalmente, el locus VCR está afectado en traslocaciones con los genes de cadenas ligeras de las inmunoglobulinas (Dyer. 1994; Adachi, 1990). Las reorganizaciones del gen BCL2 pueden detectarse mediante técnicas SBH utilizando sondas clonadas de los locus MBR y mcr (mostrado de forma esquemática en la Figura 65-3A). aunque esto suele ser un método laborioso (Horsman, 1995). La hibridación fluorescente in situ (FISH) también ha resultado eficaz en la identificación molecular citogenética del t(14:18) (Poetsch, 1996; Taniwaki, 1995). Sin embargo, y como resultado del acumulo relativamente agrupado de los puntos de rotura genómico en los locus MBR y mcr. se pueden emplear métodos rápidos de PCR para detectar la mayoría de las fusiones BCL2;J (Horsman. 1995; Uu, 1993; Ladanyi. 1992; Shibata, 1990; Pezella, 1989: Crescenzi, 1988: Lee, 1987). En la mayoría de las situaciones, la región II
Traslocaciones c o m u n e s recurrentes en los linfomas n o - H o d g k i n
Traslocación
Enfermedad
Gen de fusión
I(14:18)(q32;q21)
FL
BLC-2/JH
I(11:14)(pl3;q32)
MCL
BLC-t/JH
t(2;5)(p23;q35)
ALCL-T o nulo
NPM-ALK
3(q27)locus
LCL, FL
BCL -6/otros
I(8;14)(q24.q32) t(9;14)(p13:q32)
Burkilt SLL-P(LPL)
c-MYC/lqH PAX5/JH
Mecanismo Sobreexpresión de proteína anii-apoplótica Sobreexpresión de proteína de ciclo celular (ciclma D1) Sobreexpresión de oncogén; proteina quimérica Eslado prolongado de centro germinal Sobreexpresión de oncogén Sobreexpresión del factor de transcripción de células B
Detección
Frecuencia*
PCR, SBH. LD-PCR PCR. SBH
85%-90% de FL 20%-30% LCL 70%-100% MCL
RT-PCR, SBH LD-PCR PCR, SBH LD-PCR SBH, LD-PCR SBH
30%-40% ALCL 30%-40% LCL 5%-10% FL 100% 70%
'La frecuencia indica los genes de lusión deteclados medíame métodos moleculares. PCR = reacción en cadena de polimerasa; SBH = hibridación Southern Blot; LD-PCR = PCR Oe larga distancia; FL = linloma lolicular; MCL = linloma de células del manto; ALCL = linfoma anaplásico de células grandes: LCL = linfoma de células grandes. SLL-P = linfoma Imlocitico pequeño-plasmaotoide (equivalente al linfoma linfoplasmocitoide |LPLJ).
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S E C C I Ó N VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 65-3. A. Esquema de la estrategia de detección para la reorganización del gen BCL2. La estructura genomica parcial del gen 8CL2y su vecindad se muestran en la tigura. La mayoría de los puntos de rotura se producen en la región pnncipal de roturas (MBR), localizada en el segmento 3' (no codificante) del exón III del BCL2(recuadro gris claro grande). Una minoría de las roturas BCL2se producen a más de 20 kb aguas abajo del gen en la región menor de acúmutos (mcr). Los recuadros sombreados cortos ilustran el uso de sondas genómicas para la hibridación Southern Blot Las flechas muestran los cebadores PCR BCL2 y muestran un método alternativo oe detectar fusiones del gen SCÍ.2-J., (que no se muestran a escala correcta) Como resultado del cúmulo de puntos de rotura en los puntos tanto BCL2 MBR como mcr, se pueden utilizar cebadores de consenso BCL2 para cada región, combinados con un cebador de secuencia de consenso J., para detectar la mayoría de las reorganizaciones BCL2 que se producen en ios linlomas (véase los detalles en el texto) B, Imagen representativa de una reorganización del gen BCL2 (lusón BCL2'V, delectada mediante PCR. Las calles A y D representan alícuotas del ADN de la misma muestra del paciente. Una alícuota (A) se ha analizado en busca de una reorganización del locus BCL2 MBR, mientras que la otra (D) se ha estudiado en busca de una roturafusión del locus SCL2 mcr. Las calles B y E muestran controles ADN-positivos para las fusiones MBR-J,, y mcr-J„, respectivamente, y las calles C y F representan muestras "en blanco" (sin ADN). Después de la amplificación PCR utilizando cebacores adecuados MBR y mcr con un cebador de consenso J„ los productos PCR se analizaron en un gel de agarosa. se transfirieron a membranas de nailon y se detectaron utilizando sondas de secuencia especificas de región MBR y BCR. El análisis muestra claramente un producto de fusión MBR-J., en la muestra del paciente (calle A), confirmando la presencia molecular de la anomalía t(14:18). El producto PCR de la muestra del paciente difiere en longitud en comparación con el control MBR-positivo (calle B). indicando que los puntos de rotura en la neoplasia individual son únicos al nivel ADN. (Tomado de vlswanatha DS Detection of trie 1(14:18) (q2l ;q32) associated BCL-2'JH gene lusion in non-Hodgkms lymphoma. En Kiieen A [ed]: Molecular Pathology Protocols Totowa, NJ. Humana Press [septiembre 2000]. con autorización.)
interviniente de ADN genómico entre los cebadores opuestos es lo suficientemente corta como para permitir una amplificación con éxito. Esta estrategia se suele lograr utilizando cebadores oligonucleóticos MBR y mcr colocados aguas arriba de las regiones de acúmulos. en combinación con un cebador J„ de consenso (Figura 65-3 A y B). De forma global, una técnica habitual PCR como ésta puede identificar aproximadamente los dos tercios de todas las fusiones del gen BCL2J., que surgen de t(l4:18) en los linfomas no-Hodgkin (Horsman, 1995). A diferencia de SDH, PCR se puede realizar a partir de material fijado y archivado, aunque el ADN extraído de fuentes embebidas en parafina puede estar comprometido debido a un entrecruzamiento y degradación de las cadenas de alto peso molecular. Como resultado, la tasa de detección BCL2J para las fusiones de los locus tanto MBR como MCR es por lo general más bajo en muestras de tejido incluidas en parafina en comparación con las muestras de tejidos frescos o congelados. La aplicación de la técnica de ADN PCR de larga distancia (LD-PCR) para identificar y caracterizar más la anatomía molecular de las fusiones BCL2/J,. ha sido descrita recientemente (Akasaka. 1998). Los análisis de los productos LD-PCR han revelado puntos de rotura extendidos que se producen en la región lejana 3 MBR y también 5' del locus mcr. correspondiendo en gran manera al resto de fusiones BCL2:Ó„ que no se identifican mediante las técnicas PCR normales.
(FCC). tal y como se indicó previamente (Segal. 1995). Sin embargo, la anomalía BCL2/J,, es por lo general detectable mediante PCR en estos casos, proporcionando un marcador alternativo clonal para distinguir el linfoma folicular de una hiperplasia folicular alípica o florida pero benigna. Como corolario, el análisis PCR para la fusión BCL2J,. se puede utilizar para diferenciar subtipos de linfoma no-Hodgkin de bajo grado de patrones morfológicos potencialmente similares, como el linfoma folicular frente a los lirfomas del manto o del tipo de zona marginal. Las redisposiciones de los genes BCL2 están muy pero no absolutamente correlacionadas con la sobreexpresión de la proteína bcl2. Por el contrario, es importante observar que muchos linlomas y leucemias de células B se asocian con una expresión desregulada BCL2 en ausencia de alteraciones genéticas estructurales, presumiblemente debido a mecanismos epigenéticos. La sobreexpresión de la proteina bcl2 parece en parte estar por debajo de la resistencia primaria del tumor a la quimioterapia (Gascoyne. 1997; Hill, 1996: Hermine. 1996). El uso de las lusiones BCLZX, como marcadores clónales específicos del paciente para la valoración cuantitativa de la enfermedad residual mínima ha sido descrito recientemente (Luthra, 1998a).
La identificación de las redisposiciones del gen BCL2 en las proliferaciones linfoides neoplásicas es muy útil en diferentes contextos clínicos, incluyendo el diagnóstico y la subclasificación de la enfermedad. Las redisposiciones clónales de los genes de las inmunogtobulinas con frecuencia no se detectan con las técnicas normales PCR IgH en los linfomas de células centrofoliculares
La t(11 ;14) está muy asociada con los linlomas de células del manto (MCL), aunque se ha encontrado raramente en casos de leucemia prolmfocítica, linfoma espléníco con "linfocitos vellosos (SLVL) y LLC. El 1(11 ;14) coloca al locus BCL1 adyacente al gen IgH, afectando casi siempre a la región J . El gen de la ciclina D1 está localizado a una gran distancia telomérica de la mayoría
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Anomalía t(11;14) (q13;q32)
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TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y E T I C A S
de puntos de rotura 11(q13)/flC¿. J. pero aun así es el blanco de desregulaciones transcripcionales o del gen IgH en las fusiones SCL J'J . La ciclina D1 es una proteína de la fase precoz del ciclo celular requerida normalmente para la actividad de las cinasas 4 y 6 ciclina-dependientes (cdk4. tdk6). y este complejo promueve la progresión a través de la transición G,/S del ciclo celular en las células que proliferan. La sobreexpresión oncogénica del tipo D1 de ciclinas parece asi tener una importante función en el desarrollo de MCL. Aunque los mecanismos moleculares de transformación mediante la ciclina D1 desregulada no han sido bien aclarados hasta la fecha, este concepto se ve apoyado por el aumento de actividad mitótica y el comportamiento clínico más agresivo de MCL. en comparación con otras neoplasias de Imfocitos pequeños B (Campo, 1999: Weisenburger, 1999; Argatoff, 1997: Samaha, 1998). La identificación de t(H;14) o las reorganizaciones del gen BCL1 en la MCL es variable dependiente de la metodología empleada y oscila entre menos de un 50% y un 100%. Independientemente, la expresión de la ciclina DI, bien mediante análisis de ARNm o análisis de proteínas, está presente en más de un 90% de los casos de MCL iRimokh. 1993: Oka. 1994; Bosch. 1994: De Boer. 1997; Yang. 1994; Zukerberg. 1995: De Boer. 1995: Alkan. 1995: Vasef. 1997: Soslow. 1997). La estrecha correlación entre las anomalías SCLJ'ciclina D1 y las formas de MCL forman una faceta clave en el diagnóstico de este linfoma. H
El locus genético BCL í comprende una gran región de la banda cromosómica 11(q13) (Fig. 65-4). Aproximadamente la mitad de las roturas BCL1 se producen en un área bien definida, conocida como la región del acumulo principal de traslocaciones {MTC) (Williams, 1993a: Williams. 1991) El MTC está localizado a casi 12C kilobases (kb) hacia el centrómero del gen de la ciclina DI. Se han definido otros puntos de rotura mediante análisis Southern Blot que son o bien más distales al MTC o localizadas en la región 5' inmediata del gen de la ciclina D1 (Williams, 1991.1993b). El método SBH, utilizando una única sonda de la región MTC, detectará casi todas las reorganizaciones de BCL1 del punto de rotura MTC, que suponen el 50% de todos los casos (Williams. 1993a). Con el uso de sondas genómicas múltiples, se puede también identificar el número más pequeño de roturas que no están en relación con MTC. aumentando la tasa de detección SBH hasta un 70% (Williams, 1991). Sin embargo, esta complejidad técnica, asi como la falta de disponibilidad habitual de sondas para múltiples regiones BCL 1. hace muy poco práctico SBH con fines diagnósticos sistemáticos. Se ha utilizado con éxito la técnica PCR para identificar el subconiunto de fusiones BCL f/J que se producen en la estrechamente agrupada región MTC. dando lugar a una detección mediante PCR de las reorganizaciones BCL1 de entre el 40% y el 50% (Pinyol. 1996). De forma notable, la gran región de rotura formada por el locus BCL 1 presenta asi sustancíales difi cultades para estos métodos de diagnóstico molecular. Los análisis basados en H
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FISH han emergido posteriormente como quizá la forma más completa de resolver las fusiones BCLhJ,. en MCL (Coignel. 19%: Vaandrager. 1996). Clínicamente, MCL es una enfermedad agresiva, a pesar de tener la modologia de un "indolente" linfoma de linfocitos B pequeños (Campo. 1999: Argatoff. 1997; Samaha. 1998). De acuerdo con ello, el establecimiento correcto de este diagnóstico es critico para el pronóstico y la planificación del tratamiento. Aunque la proteína ciclina D1 puede detectarse mediante técnicas inmunohistoquimicas (Yang, 1994; Zukerberg, 1995: De Boer, 1995: Alkan. 1995: Vasef. 1997; Soslow. 1997). los métodos genéticos moleculares para identificar las anomalías del locus BCL1 continúan aplicándose ampliamente en esta situación diagnóstica. Entre las leucemias crónicas de células B, hay cada vez más pruebas que indican que la expresión de la ciclina D1 en sí misma puede ser un determinante independíente de mal pronóstico (Levy, 1999), independientemente de sus clasificaciones morfológicas específicas.
Anomalías que afectan al locus del gen 3(q27) Recientemente se han identificado linfomas con aberraciones citogeneticas del cromosoma 3(q27) y del gen BCL6. A diferencia de otras traslocaciones asociadas a los linlomas. las fusiones del gen BCL6 pueden involucrar a un gran número de genes compañeros, muchos de los cuales no están en relación con los genes receptores de antigenos (Ohno, 1997: Chen. 1998; Ohshima. 1997). Un pequeño número de casos mostrará una clásica anomalía t(3;14) ¡q27;q32). que une al gen BCL6 con el locus IgH. mientras que otros pueden involucrar a los genes de las cadenas ligeras de inmunoglobulina. La aparente "promiscuidad' de las traslocaciones del gen BCL6 ha conducido al concepto de sustitución promotora heteróloga como mecanismo de la desregulacion de BCL6y la sobreproducción de la correspondiente proteina bcl6 (Chen. 1998). La expresión de la proteina bcl6 se detecta en las células normales de los centros germinales. Modelos en ratón de "atontamiento" del gen BCL6 han mostrado que este gen es vital para la formación del centro germinal normal y para las respuestas normales de anticuerpos dependientes de células T (Ye, 1997: Dent, 1997). Además. BCL6 parece necesario para el control de las respuestas inflamatorias de tipo Th2 inducidas por citocmas mediante una regulación normal a la baja de la expresión de una clase de moléculas transductoras de señal (las proteínas Stat) (Ye, 1997: Dent, 1997). De forma significativa, se han detectado reorganizaciones del gen BCL6en los linfomas asociados a los centros germinales, principalmente los tipos de células grandes (30% al 40%) o de células de los centros foliculares (10% al 15) (Ohno. 1997: Chen. 1998: Ohshima. 1997: Otsuki. 1995). Además, una gran proporción de estos linfomas muestran hipermutaciones somáticas de la re-
Figura 65-4. Esquema del locus BCL1 y de la estrategia para detección mediante PCR de las reorganizaciones SCLí-IgH. La organización del locus BCL1 se muestra en el panel superior, con su orientación centromérica Icen) y telomérica (tel) El gen de la ciclina D1 es el objetivo de la desregulación por las reorganizaciones de la región BCL 1 en el linloma de células del manto (MCL), aunque la mayoría de las roturas ocurren muy centroméncas en relación con el propio gen. Los recuadros cortos en color rojo claro muestran dos sondas habituales para la detección de las reorganizaciones de la región BCL1. La mayoría de las roturas BCL1 se producen en la región principal de acumulo de traslocaciones (MTC). suponiendo aproximadamente un 50% de los casos en el MCL. La organización genómica de la región MTC de la fusión BCL1-J., que surgen de t(H :14) se muestran en el panel interior. Las flechas verticales cortas moican el área de cúmulos de roturas MTC Debido al acumulo relativamente denso en este punto PCR puede detectar la mayoría de las fusiones BCL1-J en relación con MTC (véase el texto para detalles). Las localizaciones relativas de los cebadores para la PCR BC(.;-J„ están indicadas por flechas horizontales (las flechas de gran tamaño indican un único cebador de consenso para la secuencia JH). h
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PATOLOGÍA MOLECULAR
gión reguladora 5' de BCL6, de lorma independíenle de la presencia o ausencia de anomalías estructurales delectables del gen (Migliazza. 1995). El significado de la alteración mutacional sin reorganización genética está poco claro, dado que las células normales de memoria B (con linea germinal BCL6). muestran también este hallazgo, sugiriendo que las mutaciones somáticas BCL6 se producen durante el proceso de activación normal de los centros germinales (Shen. 1998). Aun así. la sobreexpresión de la proteína bcl6 parece estar integralmente en relación con la patogénesis de los linlomas del tipo centro germinal, y esta situación se puede inducir mediante la traslocación de BCL6. o mediante otros mecanismos sin una reorganización del propio gen BCL6 (Allman. 1996). De acuerdo con ello, la presencia de proteína bcl6 se observa en la gran mayoría de linfomas de células grandes, linfomas foliculares y linfomas de Burkitt (Onizuka. 1995: Carbone. 1997; Flenghi, 1996: Pittaluga. 1996: Falim. 1997; Cattoretti, 1995). La detección de las reorganizaciones del gen BCL6 que se producen en los casos traslocados se puede conseguir mediante varios métodos. Se ha utilizado ampliamente el análisis SBH. dado que la mayoría de estos casos muestran un cúmulo de puntos de rotura que cubren la región próxima 5'. el primer exón no codificante y el mtrón uno del gen BCL6 (Lo Coco. 1994; Oflit, 1994; Lee. 1987). Las aplicaciones más recientes comprenden PCR para ADN de larga distancia [específicamente para la anomalía t(3:14)] y técnicas FISH (Akasaka, 1996; Ueda, 1997). El significado clínico de las anomalías BCL6 en el linfoma sigue hasta la fecha sin entenderse del todo. La desregulación de BCL6 en el linloma indica un papel central en la patogénesis de la enfermedad, presumiblemente por el atrapamiento de células linfoides en un estado de centro germinal, creando así un ambiente para la producción de otros desarreglos genéticos. Aunque la proteína BCÍ.6" está ampliamente expresada en las neoplasias linfoides asociadas a los centros germinales, la relevancia clínica del estado del gen BCL6 sigue siendo controvertida. Se ha comunicado una mayor frecuencia de reorganizaciones del gen BCL6 en los linfomas extranodales de células grandes (Liang, 1997: Offit. 1994), y un estudio ha sugerido un mejor pronóstico para los linfomas de células grandes con reorganización del gen BCL6 (Offit, 1994). Sin embargo, la resolución definitiva del significado clínico de las anomalías del gen 8CL6en el linfoma sigue necesitando estudios adicionales a gran escala.
Anomalías que afectan al locus del gen 8(q24)
A diferencia de ello, el tipo esporádico de BL demuestra roturas C-MYC dentro de la región 5' del gen, y se asocian tipicamente con fusión con la región de cambio de inmunoglobulina. Estos datos indican que los fenómenos de traslocación que afectan a C-MYC en estas variantes BL se producen en fases ligeramente diferentes en una célula B inmadura. Clínicamente, sin embargo, estas diferencias parecen ser insignificantes. Las reorganizaciones del locus C-MYC o la presencia de 1(8:14) pueden detectarse mediante análisis SDH. FISH. o PCR de larga distancia (Falini. 1997; Cattoretti. 1995, Van Kneken. 1992: Siebert. 1998; Akasaka, 1998). Prácticamente, sin embargo, la presentación clínica característica y las características patológicas de BL son con mayor frecuencia suficientes para el diagnóstico, y la confirmación molecular o citogenética de la afectación C-MYC sólo es necesaria para aquellos casos con una enfermedad leucémica primaria (LAL-L3) o en casos con caracteristicas no habituales. La presencia de reorganización del gen C-MYC en oíros linlomas. como en el contexto de una transformación secundaria o inmunodeficiencia, es por lo general indicativa de un comportamiento biológico muy agresivo.
Anomalía t(2;5) (p23;q35) El linloma anaplásico de células grandes (ALCL) es un subtipo recientemente reconocido de linfoma no-Hodgkm que puede presentarse como una enfermedad cutánea primaria, o más comúnmente como una forma sistémica que afecta a ganglios linfáticos, visceras y piel. Este tumor se clasificó con frecuencia en el pasado como una enfermedad Hodgkin de deplecion linfocítica. como una histiocitosis maligna, o incluso como una enlermedad maligna metastásica. Una característica fenotipica en casi todos los casos de ALCL es la presencia del antígeno CD30 ("Ki-1"). un marcador de aclivación y miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (Smith. 1993). Normalmente. ALCL es de estirpe de células T. aunque algunos tumores no expresan marcadores de estirpe asociada a células B o T (células "nulas"). Una minoría de tumores son fenotipica o genéticamente de tipo celular B. Se ha generado un sustancial interés en ALCL con el hallazgo de una anomalía recurrente 1(2:5) en una proporción significativa de casos de enfermedad sistémica (Rimokh. 1989: Masón, 1990: Kaneko, 1989). A nivel molecular, esta traslocación yuxtapone el gen NPM con un nuevo gen lamado ALK (cinasa anaplásica de linfoma). El producto normal del gen NPM. llamado nucleofosmina. es una fosfoproteína nuclear de expresión ubicua que se cree es importante en el ensamblaje de los ribosomas. El gen ALK codifica una tirosina cinasa previamente desconocida que no se expresa normalmente en las células linfoides (Shiota, 1994a). Como resultado de la fusión del gen NPM-ALK. la actividad de tirosina cinasa de ALK queda sin regular, contribuyendo de lorma ostensible a la génesis de los linlomas. La fusión NPM-ALK difiere estructuralmenle de otras fusiones genéticas asociadas a los linlomas, en cuanto a que se produce una proteína y ARNm quiméricos. Aún asi, la sobreexpresión del gen ALK restringido normalmente parece ser el principal mecanismo involucrado en la transformación.
La alteración genética del locus C-MYC se ha asociado clásicamente con el linfoma de Burkitt (y con la leucemia Imfoblástica aguda, tipo LAL-L3): sin embargo, este gen también se ha implicado en la patogénesis de tres tumores, incluyendo las transformaciones de alto grado (secundarias) de linfomas indolentes, linfomas asociados al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y ocasionales trastornos linfoproliferativos agresivos postransplante. Con mayor frecuencia, el gen C-MYC se trasloca al locus IgH por la anomalía t(8;14). En otros casos. C-MYC se puede hacer adyacente a los genes de cadenas ligeras K- [2(pl2)J o X [22(q11)) (Croce, 1985). En cada uno de estos casos, C-MYC se coloca bajo la fuerte influencia transcripcional de potencíador de las inmunoglobulmas. El C-MYC es normalmente un gen altamente regulado que está involucrado en la respuesta nuclear "precoz" a las señales citoplasmicas mductoras de crecimiento. El producto del gen C-MYC lorma un complejo que se une al ADN con un compañero proteiníco. Max. para iniciar la transcripción de varios genes situados aguas abajo y que son necesarios para su entrada en el ciclo celular y en la proliferación celular (Blackwood, 1991). Max está a su vez regulado por dimerización con otras proteínas tales como Mad. y estos complejos alternados actúan para reprimir la actividad de transcripción (Ayer, 1993,1995; Zervos. 1993). Como resultado de la traslocación de C-MYCen el linfoma, el control normal de C-MYC se ve abrogado por el gen IgH. Esto a su vez da lugar a una sobreproducción no supervisada de c-Myc. dando lugar a un aumento de los dimeros c-Myc Max y a la transactivación de múltiples genes objetivo cognatos. resultando en última instancia en una proliferación celular no controlada (Amati. 1993). Los linfomas de Burkitt y LAL-L3 figuran entre las neoplasias humanas más agresivas y de división más rápida.
Los puntos de rotura genómicos en casos de ALCL afectan de forma uniforme a las mismas regiones de intrones de ambos genes, dando lugar a la generación de un ARNm de fusión constante NPM-ALK. Esta situación ha permitido el uso de RT-PCR para detectar la transcripción de fusión con una alta especificidad y sensibilidad (Elmberger, 1995: Wellmann. 1995: Ladanyi, 1994; Yee. 1996:Weiss. 1995; Downmg. 1995;Lamant. 1996). Además, y dado que los intrones afectados son relativamente cortos, también se ha empleado con éxito el LD-PCR genómico para identificar la anomalía NPM-ALK (Ladanyi, 1996: Sarris. 1996: Lulhra. 1988b). Este último método necesita un ADN de alto peso molecular, pero elimina la necesidad del aislamiento del ARN y de la transcripción inversa. Otras técnicas, incluyendo el análisis mediante sondas FISH y el SBH del locus NPM. también han sido descritas (Bullnch. 1994; MaIhew. 1997). Dado que la citogenética clásica es técnicamente exigente y que se lleva a cabo con poca frecuencia en casos de ALCL, estos métodos moleculares han servido para simplificar e incrementar la tasa de detección de esta lesión genética.
La anatomía molecular de los puntos de rotura de la región C-MYC ha sido bien estudiada en el linfoma de Burkitt (BL) con el t(8:14) (Neri. 1988; Yano, 1992). En el BL endémico, los punios de rotura C-MYC se producen bastante aguas arriba del gen y afectan principalmente al locus IgH JH en 14(q32).
Clínicamente, los primeros dalos con respecto a ALCL indicaron una relación entre la presencia de \{2:5)i NPM-ALK. la edad más joven, y un pronostico favorable (Kadin. 1986: Nakamura. 1991; Bitter, 1990). De enlre subconjuntos sólidamente definidos de ALCL (esto es, CD30+, estirpe T, morfología
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TÉCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
característica), la fusión NPM-ALK se detecta entre un 50% y un 60% de los casos (Chan. 1999: Wellmann, 1995; Elmberger, 1995; Downing, 1995: Lamant. 1996). Sin embargo, las estimaciones acerca de la frecuencia de tí2:5i NPM-ALK en la ALCL han variado de forma considerable, debido a diferencias en el método de detección y en la definición exacta de la enfermedad. Por ejemplo, aunque la gran mayoría de los casos de ALCL positivos para 1(2:5). NPM-ALK son de fenotipo celular T o nulo", también se pueden encontrar casos ocasionales de estirpe B (Downing. 1995; Weisenburger, 1996: Hutchinson. 1997). De forma análoga, el t(2;5) o la fusión NPM-ALK se ha identificado en casos raros de ALCL que carece de la expresión de CD30 (Hutchinson. 1997) y de forma infrecuente entre linfomas de células grandes de estirpe celular B o T sin características otológicas anaplásticas (Benharroch, 1998). Se han conseguido avances en los esfuerzos para definir mejor un grupo clínicamente relevante de ALCL con la aplicación de anticuerpos específicos que detectan el segmento ALK en la proteína de fusión (Benharroch, 1998: Pittaluga, 1997: Nakagawa. 1997: Shiota, 1994b; Pileri, 1997; Pulford. 1997). La presencia de proteina ALK en la ALCL se correlaciona estrechamente con la fusión NPM-ALK Es más, las neoplasias ALK-positivas parecen asociarse con un resultado clínico muy favorable, en comparación con aquellos tumores que carecen de esle marcador (Shiota. 1995: Falini. 1999; Gascoyne, 1999). Dado que la detección de la fracción ALK se puede conseguir por métodos inmunohisloquímicos, este método puede servir como una alternativa uniforme y fácil en la evaluación molecular, y es capaz de identificar casos raros de linfoma con sobreexpresión ALK debido a fenómenos genéticos alternativos [por ejemplo. t(1:2) (q25:p23), Ínv(2)(p23)(q35)] (Masón, 1998: Wlodarska. 1998). Por último, la identificación de la anomalía genética \{2.bv NPM-ALK. o la expresión de la proteina ALK, son útiles para distinguir casos de ALCL de la enfermedad de Hodgkin, o de los tumores epiteliales indiferenciados (Herbst, 1995; Elmberger, 1995; Wellmann. 1995: Ladanyi. 1994: Yee, 1996: Weiss. 1995: Sarris. 1996). Sigue siendo controvertida la aparición de \{2:5);NPM-ALK en la ALCL cutánea primaria (Wood. 1996; DeCoteau, 1996; Beylot-Barry. 1996).
USO DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL La aparición de técnicas de biología molecular para la detección de redisposiciones de los genes receptores de antigenos y de las traslocaciones cromosómicas ha proporcionado a su vez unas oportunidades específicas y sensibles para medir el riesgo de enfermedad tumoral después de las intervenciones terapéuticas de las leucemias y de los linfomas. La valoración tradicional en esta situación se ha limitado en gran manera al examen microscópico de puntos tisulares tales como la médula ósea. Sin embargo, las técnicas PCR se pueden optimizar para la resolución altamente sensible de cantidades submicroscópicas de enfermedad hemalopoyética, normalmente en las cifras de una célula anómala por cada 10-10 células benignas. La aplicación de tecnologías basadas en la PCR para la detección de enfermedad residual mínima (MRD) ha permitido un seguimiento muy preciso de la "emética" del tumor, además de presentar una pléyade de nuevas preguntas y precauciones. Los marcadores MRD comprenden los genes de fusión asociados a la leucemia o al linfoma, con las reorganizaciones clónales de los genes receptores de antigenos en los tumores línfoides. Para la detección de MRD se han utilizado tanto técnicas ARN (RT) PCR como ADN-PCR. Las técnicas pueden dar lugar a una medición cualitativa, estableciendo la presencia o ausencia de un marcador en particular a cierto nivel "umbral" de sensibilidad, o pueden elaborarse para conseguir varios grados de cuantificación de las moléculas diana. El significado clínico de MRD en las leucemias ha llegado a ser un lema importante y cada vez más estudiado. Entre las leucemias mieloides. muchos subtipos están caracterizados por genes de fusión con asociacíón-traslocación recurrente que sirven como marcadores peculiares moleculares de enfermedad. Los ejemplos más comunes comprenden la leucemia promielocítica aguda (LPA) con la anomalía 1(15; 17)'PML-flAflu, la leucemia mieloide aguda con la fusión t(8;21 )/AM. 1-ETO. y la LMC. asociada con la anomalía t(9;22);BCR-ABL. Los datos generados a partir de los estudios MRD en estas leucemias han resultado ser intrigantes. Para los pacientes LPA, la demos-
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tración de transcripción residual de una fusión EML-RARu después del tratamiento se ha asociado con un riesgo muy elevado de recidiva, normalmente en el plazo de meses (Diverio, 1994,1998). A diferencia de ello, los pacientes con una AML t(8;21 (-positiva pueden lograr remisiones clínicas muy duraderas, a pesar de la presencia de un ARNm de fusión АМ/Л-ErOdetectable a bajos niveles. Además, la anomalía AML1-ETO puede detectarse en individuos tratados con éxito de forma independiente del tipo de terapia empleado (quimioterapia o trasplante de médula ósea) (Kusec. 1994: Jurlander. 1996) Por último, en el caso de LMC, va emergiendo un cuadro más complejo, estando en relación la importancia pronostica del estado MRD con el intervalo después del tratamiento (por lo general un trasplante de médula ósea). Los pacientes LMC con una conversión "precoz" a un estado PCR positivo para BCR-ABL (esto es. entre 6 y 12 meses), o aquellos que manifiestan una positividad persistente de la PCR a lo largo del tiempo, parecen tener un mayor riesgo de recidiva en un estudio de gran tamaño: sin embargo, la previsión de los casos individuales es difícil y se puede modificar por factores adicionales en relación con el tratamiento (como el tipo de trasplante o la enfermedad de injerto contra huésped) (Radich. 1995). A pesar de la variabilidad en el valor prediclivo positivo para la recidiva de la enfermedad utilizando detección molecular de MRD en estas diferentes leucemias mieloides, como regla general, la positividad persistente de la PCR en mediciones seriadas se suele correlacionar con un mayor riesgo de recidiva. Es importante tener en cuenta que la ausencia de una enfermedad detectable mediante PCR se asocia fuertemente con un estado de remisión clínica. En la leucemia linfoblástica aguda pediátrica existen cada vez más pruebas que sugieren que la vigilancia de la MRD puede tener un papel clave en la identificación de pacientes con un elevado potencial de recaída. A diferencia de las leucemias mieloides. las reorganizaciones tumor-especificas de los genes de receptores de células T y de inmunoglobulinas (IgH) se han utilizado como marcadores clónales de leucemia linfoblástica residual. La enfermedad residual al final del tratamiento de inducción y a intervalos posteriores ha resultado correlacionarse con un peor resultado en la mayoría de los estudios (Evan, 1998; Gruhn, 1998; Wasserman, 1992: Nizet. 1991; Jacquy, 1997; Steenbergen, 1995: Goulden, 1998). Recientes esludios amplios sobre la LAL pediátrica son significativos en este aspecto, demostrando que los niveles de MRD leucémica equivalentes a aproximadamente una de cada 100 a 1.000 células son fuertemente predictivas de recidiva de la enfermedad a final del tratamiento de inducción y también a intervalos posteriores (Cave. 1998: Van Dongen. 1998). Además, los análisis senados de PCR a intervalos múltiples parecen añadir valor pronóstico, connotando la positividad persistente de un mayor riesgo de recidiva. De nuevo, aquellos pacientes con una PCR persistentemente negativa en todos los intervalos se asocian con un estado de remisión continuada y un bajo riesgo de fracaso terapéutico. Además de estos hallazgos, otros investigadores, utilizando técnicas PCR altamente sensibles, han sido capaces de demostrar niveles extremadamente bajos de MRD persistente en pacientes que mantienen una remisión clínica al final del tratamiento e incluso varios meses después (Roberts. 1997). Estos datos sugieren en conjunto que las cantidades diminutas pero cuantiticables de LAL residual en los pacientes pediátricos pueden ser una característica constante a pesar de un tratamiento satisfactorio, pero el nivel relativo de MRD y el comportamiento de las células leucémicas residuales están definitivamente en correlación con el riesgo de un fracaso terapéui со. La capacidad de resolver cantidades cada vez mas pequeñas de objetivos moleculares genéticos especilicos ha proporcionado nuevas perspectivas a la biología de la enfermedad, así como algunos potenciales fallos. La detección de las transcripciones de la fusión t(8;21).'AM/.f-ETO o las redisposiciones clónales de los genes receptores de antigenos en los supervivientes a largo plazo de LAM y LAL pediátricas, respectivamente, indica claramente que las células tumorales residuales pueden residir en un estado "durmiente' o no proliferativo. La distinción de estas células de las células tumorales con más agresividad biológica no es posible con estos análisis moleculares, y la información clínica relevante puede ser poco concluyeme o verse oscurecida. Por último, estudios recientes han demostrado la existencia en la sangre o en los tejidos de individuos sanos de genes de fusión asociados a la traslocación de leucemia o linfoma, sugiriendo que la recombinación genética aberrante de bajo nivel puede ser un fenómeno relativamente común, Los ejemplos comprenden la detección del t(9;22)/8Cfi-,48L y de t(14;18)/8CL?-/(jH(Biernaux,
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PATOLOGÍA MOLECULAR
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En cada uno de los casos, se han requerido análisis PCR altamente sensible para poner de manifiesto estas anomalías, y las implicaciones para el seguimiento MRD después de la terapia y en algunos pacientes son claramente aparentes. Un desalio clave para la valoración MRD es. por tanto, conseguir una sensibilidad técnica suficiente para conseguir datos pronósticos significativos, a la vez que se minimiza el riesgo de resultados falsamente positivos que surjan de contaminación de las muestras, o la potencial detección de eventos raros en células "durmientes'.
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T É C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N Ó S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y É T I C A S
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CAPÍTULO 65
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TÉCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYÉTICAS
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Diagnóstico molecular de las enfermedades genéticas Wayne W. Grody, M.D., Ph.D. Walter W. Noll, M.D.
ELECCIÓN DE TÉCNICAS ELECCIÓN DE APLICACIONES
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EJEMPLOS ESPECÍFICOS DE ENFERMEDAD
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Fibrosis quistica Distrofia muscular de Duchenne
CONCEPTOS ESPECIALES ÚNICOS DE LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENÉTICOS
Anemia de células falciformes y otras hemoglobinopatías 1376
Heterogeneidad molecular Penetrancia variable y expresividad Entrecruzamiento Disomia uniparental Impronta
Trombofilias hereditarias Trastornos por expansión de repetición de trinucleótido Síndromes de Prader-Willi y de Angelman Cánceres familiares Hemocromatosis Trastornos del ADN mitocondrial
Anticipación Influencias epigenéticas y herencia no mendeliana
FUTURO DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR
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Frecuencias alélicas y exploraciones masivas de la población
BIBLIOGRAFÍA
1388
La genética molecular diagnostica es una de las áreas más recientes y revolucionanas de la medicina de laboratorio y mantiene la esperanza de convertirse en la herramienta de diagnóstico y cribado más poderosa del siglo XXI. Con el ritmo trepidante del descubrimiento de nuevos genes patológicos bajo los auspicios del Proyecto Genoma Humano (Human Genome Project) y el reconocimiento de que todas las enfermedades, incluyendo neoplasias y enfermedades infecciosas, tienen algún componente genético, la utilidad de esta subespecialidad sólo puede continuar expandiéndose. Por otra parte, su capacidad única para diagnosticar enfermedad, tanto prenatal como presintomáticamente, le confiere un papel primario en la medicina preventiva, un foco de urgencia en la era actual de contención en el coste de los cuidados médicos. Además, la genética molecular diagnóstica conduce a la genética molecular terapéutica, ya que. esencialmente, las mismas secuencias génicas normales usadas para detectar defectos genéticos moleculares por hibridación con ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden ser usadas para corregir tales defectos mediante terapia de sustitución génica. Puesto que esta última actividad incrementa su ámbito y rango de utilidad, llegará a estar incluso más entrelazada con las actividades del laboratorio de diagnóstico molecular, sobre el que recaerá la responsabilidad de la monitorización adecuada de la inserción y expresión del gen sustituido. Con todo, dicho progreso no se encuentra frenado por obstáculos apreciables. Además de la considerable solisticación técnica y dificultad de estos procedimientos, estos avances se ven envueltos inextricablemente con ciertos dilemas éticos espinosos. La disección de la seña constitucional más fundamental de un paciente y los defectos innatos contenidos en ella, aumenta la problemática acerca de la discriminación genética, estigmatización, diferencias étnicas, privacidad, consentimiento informado y confidencialidad. Ya que a nivel genético molecular todo se convierte en una "condición preexistente", la misma definición de asegurabilidad puede necesitar ser revisada; ya existen sujetos sanos que han perdido la cobertura del seguro por haber encontrado ser portadores de una mutación, incluso una recesiva (Billings, 1992). El descubrimiento de cualquier muta-
ción hereditaria en un individuo tiene unas implicaciones más prolundas, que sobrepasan al paciente mismo que solicito la prueba de ADN (el probando"), extendiéndose al resto de miembros de la familia de esa persona, ninguno de tos cuales pudo haber consentido la exploración o revelación de este tipo de información. De hecho, con la nueva capacidad de las pruebas de ADN adquirida gracias a las técnicas de amplificación, como la reacción en cadena por la polimerasa (PCR). es muy fácil realizar análisis genéticos sin el consentimiento del paciente o incluso sin su conocimiento, ya que las pruebas se pueden hacer en diminutas porciones de tejido o muestras de líquidos obtenidas para otros propósitos no relacionados. El diagnóstico prenatal y. por extensión, la detección precoz preconcebida de portadores genéticos en las parejas, están al día en el apasionado debate ético y religioso sobre el aborto. La terapia génica. a pesar del consenso general de que debería dirigirse sólo a células diana somáticas, más que a la linea germinal (e incluso este concepto está comenzado a cambiar), aumenta el espectro de la eugenesia entre los que no recuerdan épocas pasadas en que tales conceptos no fueron sólo aceptados sino activamente defendidos. Gran parte de la genética molecular diagnóstica implica la evaluación del riesgo de frecuencia o recurrencia de un trastorno en un individuo o familia. Por razones que se describen más detalladamente en este capítulo, los resultados obtenidos en la prueba a menudo no se expresan en términos de una concentración numérica o una respuesta de si o no, sino como una probabilidad. El modo exacto y significativo de abordar estas complejas dudas en pacientes e incluso en los médicos solicitantes, puede ser muy difícil, si no imposible. Por esta razón, y debido a las serias implicaciones éticas de estas pruebas, como se describió antes, esta área de la medicina de laboratorio, quizá más que cualquier otra, requiere una estrecha comunicación entre el laboratorio y el clínico solicitante o el consejero genético. De hecho, muchas de estas pruebas deberían realizarse únicamente a petición de un médico genetista o un consejero genético, ya que son los especialistas mejor cualificados para evaluar la idoneidad de la prueba y explicar los resultados al paciente. Una estrecha y oportuna comunica-
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D I A G N Ò S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
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ción asegurará que los pacientes obtengan el mayor beneficio y el menor riesgo de desvéntalas de esta poderosa tecnología.
ELECCIÓN DE TÉCNICAS Con tantos genes, locus y mecanismos mutacionales conocidos de enfermedades genéticas, la genética molecular diagnóstica se beneficia de la amplia gama disponible de técnicas modernas de biología molecular. Éstas incluyen transferencia Southern (Southern blotting). transferencia en mancha (do/ blotting). PCR. hibndación m situ con fluorescencia (FISH). secuenciación de ADN, polimorfismo conformacional de ADN monocatenario y otras. La elección de la técnica a usar en un caso particular dependerá, en gran medida, del conocimiento actual del gen o genes asociados con la enfermedad en cuestión y su grado de heterogeneidad molecular. El primer criterio divide a casi todas las enfermedades genéticas en dos categorías: aquellas en las que se ha aislado el gen causante y aquellas en las que no. La primera categoría a menudo puede abordarse mediante análisis direclo del gen o la mutación: la segunda sólo pueden enfocarse mediante análisis de ligamiento, utilizando marcadores de ADN polimórfico cercanos en el mismo cromosoma, con tal de que se haya trazado el mapa aproximado de la enfermedad. El segundo concepto, la heterogeneidad, se refiere al número de genes diferentes o a la variedad de mutaciones dentro de un solo gen, que pueden causar la misma enfermedad. Cuanto mayor es la heterogeneidad, la prueba de ADN se convierte en más difícil, laboriosa y cara (y más compleja para informar los resultados). Las mutaciones responsables de algunos trastornos son tan numerosas y se extienden a través de genes tan grandes que la detección directa no es factible, y se debe recurrir al análisis de ligamiento aunque el gen causante haya sido identificado y clonado. En otros trastornos, una o más mutaciones pueden ser tan frecuentes en determinadas poblaciones étnicas que su detección precoz puede proporcionar una prueba de suficiente rendimiento que justifique su enfoque directo, aunque se ignoren bastantes mutaciones informadas menos frecuentes. Para hacer tales pruebas practicas y con un coste razonable, se han ideado ciertas estrategias de multiplexación para la detección simultánea de mutaciones, como se describe a continuación. Con todo, el lector debería tener en cuenta que todo esto implica cierto compromiso en cuanto a la sensibilidad total de la prueba. Efectivamente, el campo de la genética molecular diagnóstica tolera, por necesidad, ciertas pruebas de detección precoz con sensibilidades notablemente por debajo de las que se considerarían aceptables en otros campos del laboratorio clínico. La decisión de justo cuan bajo debería ser el valor discriminante aceptable de sensibilidad, se convierte en gran medida en una decisión ética. La mayoría de los genetistas han defendido que. al menos para las pruebas de detección precoz, los beneficios potenciales para la salud pública de ofrecer una prueba de sensibilidad subóptima superan los argumentos en contra de negarla, con tal de que se proporcionase una suficiente educación y consejo a los pacientes de modo que entiendan el riesgo residual inherente en un resultado negativo de la prueba. Los análisis directos de mutaciones se han simplificado de modo incalculable con la llegada de la PCR. Mediante la elección adecuada de cebadores [primers), esta técnica permite al laboratorio acercarse a la mutación precisa de interés o a un "punto caliente" (hot spot) dentro de un gen que contiene varias secuencias de mutación posibles, usando cantidades muy pequeñas de muestra. Es valiosa para la detección de mutaciones puntuales y microdeleciones que normalmente pasan inadvertidas en una técnica de transferencia Southern, a menos que se encuentren casualmente dentro de una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción que esté siendo utilizada. Una vez que se amplifica la región que contiene la mutación sospechada, se puede analizar mediante electroforesis en gel. secuenciación o hibridación con sondas de ADN. Ante una delecíón que se sospecha reduce la longitud del producto amplificado {amplicón), será suficiente la separación molecular exacta de los productos de la PCR mediante electroforesis y tinción con bromuro de etidio (Fig. 66-1), De un modo alternativo, si la delecíón o mutación puntual rompe (o crea) una secuencia de escisión de una endonucleasa. se puede detectar por análisis electroforético de los productos de la PCR digeridos con esa enzima (Fig. 66-2). Otra opción es hibridar los productos de la PCR con sondas oligonucleotídicas especificas de un alelo (ASO), fragmentos cortos de ADN que son complementarios a cualquiera de
Figura 66-1. Ejemplo de separación electrolorélica de productos de PCR para la detección de mutación. En este caso, las muestras de ADN del paciente se amplificaron usando cebadores que llanquean el codón 508 del gen de la librosis quistica íCFTR), produciendo un solo fragmento de 160 bp procedente de individuos normales (caniles 1. 2. 4. 5 y 6). un solo fragmento de 157 bp procedente de un paciente homocigoto para la delecíón trmucieolidica \F508 (carnl 7) y ambos fragmentos junto con una banda heterodúplex (H) procedentes de sujetos heteroagotos (carriles 3, 8 y 9).
las secuencias diana normales o mulantes. Si la hibridación, normalmente en forma de transferencia en mancha, se realiza ba|o condiciones suficientemente rigurosas, el ADN de la diana que contiene la mutación hibridará sólo con la sonda mutante y viceversa para el ADN de la diana normal. Para un cribado más eficiente pueden mezclarse juntas sondas para varias mutaciones poco frecuentes (Fig. 66-3); mediante la "PCR multiplex", se pueden amplificar juntos varios puntos calientes de la mutación. Como una variación de este enfoque, muchas sondas alélicas se pueden extender en un soporte sólido para su posterior hibridación con el ADN de la muestra (o los productos amplilicados). en forma de una "micromatriz" (microarray). Desde hace poco están disponibles ciertos equipos de reactivos comerciales e instrumentos que detectan mutaciones puntuales por hibridación diferencial con sondas/quencne/' o por electroforesis capilar y otras técnicas sofisticadas. Existen disponibles varias técnicas de cribado que exploran de un modo más amplio varias mutaciones desconocidas de un gen patológico. El polimorfismo conformacional de ADN monocatenario (SSCP) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) pueden detectar teóricamente mutaciones puntuales en cualquier secuencia dentro de un gen; los nucleótidos sustituidos debido a una alteración de la topología, dan lugar a ADN monocatenario y bicatenano incompatible. Estos métodos evitan la necesidad de sondas ASO separadas y especificas para cada posible mutación, aunque pueden realizarse sólo con limitaciones, ya que no son 100% sensibles, La prueba de proteínas truncadas detecta mutaciones que originan la terminación prematura del producto polipeptídico del gen; esto requiere un complicado método de transcripción/traducción in vitro y solo encontrará mutaciones linalizadoras" (y algunas variantes del marco de lectura [Irameshifts] y de la eliminación de intrones [splicing]). mientras pasa por alto sustituciones comunes de un solo nucleótido (mutaciones sustitutivas [missense]). La única técnica que presenta un 100% de sensibilidad en la detección de todas las mutaciones puntuales posibles, al menos en teoría, es la secuenciación completa del ADN del gen. Desafortunadamente, con la tecnología actual, este enfoque sigue siendo uno de los métodos más engorrosos y costosos para el uso clínico habitual; además, se perderían mutaciones situadas fuera del gen estructural (p. ej.. en intrones. promotores o regiones intensificadoras [enhancer]). Los trastornos debidos a una expansión génica por una mutación de repetición trinucleotidica pueden diagnosticarse mediante transferencia Southern o PCR y. en cualquier caso, por observación de un fragmento diana de ADN mayor de lo normal. Los trastornos debidos a grandes deleciones se diagnostican a menudo mediante transferencia Southern por observación de una pérdida o disminución en tamaño de un fragmento diana, aunque también puede usarse la pérdida de un producto de PCR amplificado normalmente desde esa zona o la aparición de un "fragmento de empalme" {"junction íragment). Los trastornos debidos a grandes deleciones o inserciones, asi como las traslocaciones, se pueden diagnosticar a nivel cromosómico mediante FISH.
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S E C C I Ó N VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 66-2. Ejemplo esquemático de detección de una mutación puntual mediante escisión diferencial con una enzima de restricción. En este caso, la mutación de la anemia falciforme, sustitución de T en lugar de A en el codón 6 del gen de la globina B, destruye una secuencia de escisión de la Msíll: por tanto, la digestión del producto de PCR de la región producirá dos fragmentos de ADN en individuos normales y sólo uno en homocigotos HbS. La mutación del primer nucleótido de este codón, encontrada en la enfermedad de la hemoglobina C, no elimina la secuencia de reconocimiento de Msíll (ya que la enzima puede reconocer cualquier nucleótido en esta posición), no pudiéndose detectar por este método.
Para esos trastornos con numerosas mutaciones desconocidas o en genes desconocidos, es posible un diagnóstico predictivo mediante análisis de ligamiento en ciertas familias. Debido a que los análisis requieren la realización A D N d e numerosos pacientes mezclado
Sonda ASO frente a una sola mutación rara
A D N de un solo paciente
Sondas ASO mezcladas frente a múltiples mutaciones raras
Figura 66-3. Estrategia para el cribado eficaz de múltiples mutaciones poco (recuentes mediante transferencia en mancha usando sondas oligonucleotidicas especificas de un alelo (ASO). Numerosas muestras de ADN de pacientes se pudieron mezclar en una sola mancha e hibridar con una sonda ASO: alternativamente, el ADN de un solo paciente se puede hibridar con una mezcla de múltiples sondas ASO poco frecuentes. En cualquier caso, la prueba será negativa la mayoría de las veces, ya que las mutaciones son muy raras. Si es positiva, se requieren pruebas adicionales para determinar qué paciente o sonda produjo la señal de hibridación.
de pruebas comparativas de otros afectados y de hermanos no afectados y padres, no todas las familias serán accesibles o buscarán información para esta evaluación. También se requiere el conocimiento de marcadores de ADN polimórfico estrechamente ligados, preferiblemente en los flancos o incluso intragénicos, que pueden ser observados al cosegregarse de forma constante con cualquier fenotipo, normal o patológico, dentro de la familia. Tradicionalmente. los marcadores usados han sido los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) detectados mediante transferencia Southern. Más recientemente, los polimorfismos microsatélite. secuencias de oligonucleotides en tándem de longitud repetida variable, detectables mediante una PCR y una simple electroforesis en gel, son preferidos debido a su abundancia a través del genoma, la naturaleza multialélica de sus polimorfismos y la relativa facilidad de la metodología de la prueba. Genes muy grandes, como los de la neurofibromatosis y la distrofia muscular de Duchenne (DMD). tendrán normalmente microsatélites intragénicos a los que se puede acceder, minimizando las posibilidades de recombínación entre la mutación y el marcador. Las técnicas de ligamiento son menos preferibles que los métodos de detección directa de mutación debido a la necesidad de analizar los múltiples miembros de la familia y porque la recombinación meiótica entre el gen y el marcador puede romper la fase aparente de ligamiento entre el padre y el descendiente, conduciendo a la interpretación de los resultados como falsos positivos o falsos negativos. Para cada centimorgan de distancia de mapa entre los dos locus, se puede esperar un 1% de recombinación (1 cM = 1 millón de pares de bases [bp]). Por ejemplo, en la Figura 66-4 se predijo que el feto estaría afectado, ya que había heredado el mismo fragmento RFLP superior que el hijo previamente afectado. Si la secuencia polimórfica de la endonucleasa de restricción que está siendo analizado está a 5 cM de distancia del gen patológico, se puede concluir que el feto tiene un 95% de riesgo de estar afectado.
ELECCIÓN DE APLICACIONES En cierto grado, la elección de la técnica dependerá también de la aplicación (es decir, la razón por la que se realiza la prueba). En genética médica,
CAPÍTULO 66
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS
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dos en edad temprana para poder iniciar el tratamiento (dietético o farmacéutico) antes de que aparezcan daños irreversibles. Actualmente, se están empleando métodos de genética molecular de este grupo, principalmente como apoyo para la confirmación de resultados positivos obtenidos por métodos bioquímicos o enzimáticos menos caros, aunque esta situación podría invertirse en el futuro con métodos moleculares que puedan automatizarse. Por definición, la prueba de diagnóstico genético se realiza en un suieto sintomático. Debido a que las pruebas de ADN para patologías genéticas son absolutamente específicas de la enfermedad y las mismas enfermedades muy poco frecuentes, estos procedimientos no abarcan lo suficiente como para usarse en un extensivo diagnóstico diferencial: los síntomas deben ser lo suficientemente sugerentes del trastorno en cuestión como para justificar la realización de la prueba. La prueba de ADN se debe sopesar frente a métodos más tradicionales con respecto al coste, conveniencia y utilidad. Por ejemplo, la electroforesis de hemoglobina puede ser mas conveniente y completa para clasificar una hemoglobinopatia sospechada que la prueba de ADN específica para la mutación de la anemia falciforme. Por otra parte, la prueba molecular puede ser más ventajosa para presentaciones clínicas precoces o atípicas. Por ejemplo, la prueba molecular para mutaciones de la fibrosis quística se puede realizar en recién nacidos cuando el análisis tradicional de cloruros en el sudor es impracticable o poco fiable. Las pruebas de ADN también tienen la ventaja de trabajar bien en la autopsia, cuando los analitos bioquímicos clásicos no se pueden valorar. Figura 66-4. Ejemplo de análisis de polimorfismos de la longitud de los Iragmentos de restricción para el diagnóstico prenatal de un trastorno autosómico dominante. En esta transferencia Southern, la banda superior procedente del padre es la única que se segrega conjuntamente con el fenotipo patológico, como se observa en el hijo afectado. Como también el feto (?) fia heredado esta banda, se predijo que estaría afectado. El riesgo preciso depende de la distancia de mapa entre el gen patológico y el marcador RFLP.
estas aplicaciones consisten en cinco áreas principales: cribado de portadores, detección precoz en recién nacidos, pruebas diagnósticas, análisis presintomáticos de ADN y diagnóstico prenatal. El cribado de portadores es el término aplicado a la detección de mutaciones recesivas en sujetos sanos con el propósito de consejo genético y planificación familiar. Esta aplicación se subdivide en el cribado de individuos con antecedentes familiares del trastorno y el cribado, basado en la población, de gran número de individuos sin antecedentes familiares pero que tienen nesgo de padecer el trastorno debido a la prevalencia dentro de su grupo étnico o en la población general. En cualquier caso, el propósito es identificar parejas de riesgo (es decir, tanto el hombre como la mujer son heterocigotos para mutaciones dentro del gen), las cuales tendrían entonces un 25% de posibilidad de tener un hijo afectado en cada embarazo, aunque diferirán las estrategias de análisis de los dos grupos. Obviamente, una persona cuyo hermano presenta el trastorno tiene mucho mayor riesgo de ser un portador que alguien de la población general. Esa persona puede, por lo tanto, autorizar más pruebas agresivas (p. ej., cribado para un número mayor de mutaciones o incluso análisis de ligamiento) más rentables que para un miembro de la población general. Por otra parte, el acceso al ADN de un hermano afectado puede permitir la identificación anterior de la mutación, la cual haría posteriormente mucho más fácil el análisis de otros miembros de la familia. Por el contrario, el cribado basado en la población se esfuerza, de modo característico, en mantener el procedimiento de la prueba tan rápido y barato como sea posible, centrándose quizá en algunas de las mutaciones más prevalentes y sacrificando la sensibilidad de la prueba por la rentabilidad y la conveniencia. Por supuesto, con antecedentes familiares negativos no hay miembros de la familia afectados para poder realizar una opción de análisis de ligamiento. Al igual que el cribado de portadores basado en la población, la detección precoz en recién nacidos intenta identificar defectos hereditarios relativamente prevalentes (como las enfermedades genéticas) en distintos individuos asintomáticos. De hecho, las dianas patológicas más importantes, como la fenilcetonuria, galactosemia, anemia falciforme y fibrosis quística, son trastornos autosómicos recesivos. En este caso, la meta es encontrar niños afecta-
Los análisis presintomáticos de ADN se aplican principalmente a trastornos dominantes de inicio tardío, en los cuales los descendientes de un padre afectado son conscientes de que tienen un 50% de riesgo de heredar la enfermedad y desean saber su estado antes del inicio clínico para informarse sobre decisiones reproductoras y de empleo o iniciar intervenciones de vigilancia y/o preventivas. Prototipos de trastornos de este grupo son la enfermedad de Huntington y los síndromes hereditarios del cáncer, aunque también son relevantes enfermedades como la neurofibromatosis, síndrome de Marfan, enfermedad del riñon poiiquístico en adultos y la esclerosis tuberosa. Este tipo de prueba ha sido la más problemática de la genética molecular diagnóstica desde el punto de vista psicosocial y ético, con un riesgo sustancial de graves consecuencias adversas del informe de los resultados, incluyendo el suicidio. Debido a esto, los protocolos de pruebas establecidos incluyen la condición del consentimiento mlormado, la evaluación clínica simultánea, el consejo genético amplio antes y después de la prueba y el apoyo psicosocial {Huntington's Disease Society ol America. 1989: American College ol Medical Genetics.
1999). Finalmente, está la aplicación clínica más característica de la genética médica: el diagnóstico prenatal o la detección de enfermedad en el feto. Salvo algunas excepciones (como la hidropesía fetal de la |t-talasemia homocigota, dwarfismo tanatofórico y la osteogenesis imperfecta de tipo I), la mayoría de los trastornos mendelianos. especialmente los errores innatos del metabolismo, no se expresan ni sintomática ni bioquímicamente en el feto; asi. el diagnóstico predictivo sólo puede realizarse a nivel del ADN. Incluso para los trastornos que podrían detectarse bioquímicamente, el ADN a menudo se muestra como un sustrato más accesible, desde el punto de vista obstétrico, que los productos proteinicos o sustratos metabólicos afectados. Mientras que los análisis moleculares pueden realizarse en cantidades muy pequeñas de líquido amniótico o muestras de vellosidad coriómca obtenidas por métodos habituales, incluso si se obtienen para otros propósitos, los análisis bioquímicos requerirán una biopsia invasiva de tejido fetal profundo, a menos que los productos proteinicos se expresen en fibroblastos (y asi, ammocitos). Por ejemplo, el análisis de actividad de la (enilalanina-hidroxilasa para diagnosticar la fenilcetonuria requeriría biopsia de hígado fetal, y la cuantificación de distrofina para el diagnóstico de la distrofia muscular de Duchenne requeriría biopsia de músculo fetal. Es evidente que el objetivo fundamental del diagnóstico prenatal es la identificación de un feto afectado de una manera oportuna para poder ofrecer una opción práctica de interrupción del embarazo a la pareja. Mientras que algunos pueden argumentar una ventaja de la obtención de diagnósticos prenatales para poder instaurar rápidamente una terapia en el nacimiento o para la tranquilidad psicológica de una pareja si se observa que el feto no está afectado, es difícil justificar el nesgo de aborto en la amniocentesis y la obtención de muestras de vellosidad coriómca (CVS) realizadas para estos
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PATOLOGÌA MOLECULAR
propósitos. Para un feto afectado, a menos que se tenga la intención de iniciar terapia en el útero, es perfectamente aceptable el tratamiento provisional en el nacimiento mientras se espera la prueba neonatal. Mientras que el consejo genético prenatal no es siempre una normativa, con objeciones morales y/o religiosas respecto al aborto, tanto el consejero clínico como la prueba de ADN del laboratorio tienen un derecho legítimo y la responsabilidad para cuestionar la conveniencia de la petición de una prueba prenatal, con su riesgo y coste acompañantes, en una pareja para quienes la interrupción no es una opción (igual se aplicaría a las peticiones tardías de interrupción del embarazo). Debido a estos problemas, esta prueba prenatal invasiva no se ofrece como una herramienta de cribado en la población general a las mujeres sin historia familiar del trastorno en cuestión. El poder de la PCR para permitir análisis genéticos de una sola célula ha abierto recientemente el camino para el diagnóstico preimplante, enfocado normalmente a la realización de fecundación in vitro y microdisección de un solo blastómero del embrión inicial (véase Cap. 21). Esta estrategia, ya aplicada a casos seleccionados con riesgo de fibrosis quística (Handyside. 1992) y otros trastornos, podría ofrecerse a algunas parejas de riesgo que no consideran el aborto como una opción, aunque tengan sus propias objeciones éticas (y económicas). A pesar de estos dilemas médicos y morales, la prueba de genética molecular prenatal, realizada en circunstancias apropiadas, se puede ofrecer a parejas de riesgo, muchas de las cuales han padecido ya el trauma de tener al menos un descendiente afectado, uno de los servicios más valiosos de toda la medicina clínica.
CONCEPTOS ESPECIALES ÚNICOS DE LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENÉTICOS Aunque las técnicas tratadas en este capítulo de análisis de ADN para el diagnóstico de enfermedades genéticas son generalmente las mismas que las usadas para el diagnóstico molecular del cáncer o enfermedades infecciosas, su aplicación en aquéllas ha revelado ciertos fenómenos inusuales que deben tenerse en cuenta cuando se está tratando con determinados trastornos hereditarios. Algunos de estos conceptos se conocen desde la época de Mendel, aunque ahora se comprenden a nivel de ADN; otros han surgido más recientemente como subproductos inesperados de la disección molecular de los genes específicos de enfermedad.
de mutaciones que sustituya al análisis de ligamiento o a técnicas de exploración de mutaciones. La expresividad variable se refiere a la aparición de diferentes signos y síntomas del trastorno en sujetos que heredan la misma mutación o mutaciones. Al igual que la penetrancia, la expresividad variable probablemente sea un reflejo de efectos génicos diferenciales dentro de orígenes genéticos distintos (en otras palabras, la modulación de la expresión fenotípica mediante otros genes no alélicos). Ésta también requiere averiguaciones y dificulta el consejo; además, plantea cuestiones éticas en la consideración del aborto en enfermedades de gravedad variable e impredecible (como la fibrosis quística).
Entrecruzamiento El fenómeno de recombinacíón meiótica entre cromosomas homólogos es, además de la mutación aleatoria, la principal fuerza conductora después de la diversidad genética y la evolución en los organismos de reproducción sexual. Su importancia en la genética molecular diagnóstica radica en la ruptura del ligamiento entre un gen patológico y un marcador polimórfico cercano, dando lugar al diagnóstico de falsos positivos o falsos negativos en los trastornos analizados mediante pruebas de ligamiento. Como se explicó con anterioridad, se puede minimizar el riesgo eligiendo marcadores más estrechamente ligados o en el flanco del gen patológico. Esto es más factible, porque el mapa del genoma humano presenta numerosos polimorfismos de repeticiones cortas en tándem, a los que puede accederse fácilmente con cebadores de PCR.
Disomía uniparental Causa poco usual de trastorno recesivo de un solo gen. descubierta por primera vez en un paciente con fibrosis quística (CF). de cuyos padres sólo uno era portador (Spence, 1988). Mediante haplotipado de ADN usando marcadores polimórficos, se demostró que el paciente había heredado dos copias del cromosoma 7 del padre portador que contenia el gen mutante de la CF y no el cromosoma 7 del otro padre. El fenómeno se ha observado en otros casos de CF y también en enfermedades que implican a otros cromosomas. Para algunas enfermedades, como los síndromes de Prader-Willi y de Angelman (véase más adelante), la incidencia de disomía uniparental (UPD) se aproxima a la de otros mecanismos clásicos de mutación de la patogénesis molecular, justificando una prueba sistemática para este fenómeno.
Heterogeneidad molecular
Impronta
Muy pocos trastornos genéticos se han asociado con una sola mutación identificada de forma constante en todos los casos afectados (p. ej„ la mutación sustilutiva en el codón 6 del gen de la (3-globina que causa la anemia falcíforme). La gran mayoría de los trastornos genéticos se originan por más de una, en ocasiones centenares de mutaciones diferentes dentro del gen patológico (ej., el gen CFTR de la librosis quística). incluso algunas veces por más de un gen (ej., los genes TSC1 y TSC2 de la esclerosis tuberosa o los BRCA1 y BRCA2 del cáncer familiar de mama y ovario). Obviamente, la identificación en tales trastornos de las mutaciones causantes es técnicamente mucho más difícil, si no imposible. Una consecuencia de esta heterogeneidad molecular es que no todas las mutaciones producirán enfermedades igual de graves; algunas pueden causar sólo formas leves, incluso síndromes relacionados con poco parecido con el fenotipo clásico. Toda esta variabilidad se añade a la gran complejidad del consejo genético y de los análisis genéticos.
La impronta se refiere a la expresión diferente de un gen en un descendiente, dependiendo de si lo ha heredado de la madre o del padre; a veces depende de otros factores epigenéticos (Hall, 1999). Algunos genes sólo se expresan o se desconectan cuando proceden del ovocito y otros sólo cuando proceden del espermatozoide. Si un individuo hereda el alelo normal a través de la línea parental donde no se expresa, no puede contrarrestar una mutación recesiva heredada del otro padre. El mecanismo molecular, al menos en algunos casos, parece ser la metilación diferencial de regiones del cromosoma y elementos reguladores. Ésta es la base tanto de los casos de delecíón como de UPD de los síndromes de Prader-Willi y de Angelman (véase más adelante).
Penetrancia variable y expresividad La penetrancia se refiere a la proporción de individuos que, habiendo heredado un gen patológico mutante, presentan el fenotipo patológico. Normalmente se aplica a trastornos dominantes, y puede producir en el árbol genealógico de la enfermedad el aspecto llamativo de "salto generacional". Esto puede complicar tanto el diagnóstico molecular como el consejo genético, ya que podría no estar claro si el probando heredó la enfermedad de un padre o en cambio, representa una nueva mutación en la familia. Ésta es una característica de trastornos genéticos relativamente comunes, como el síndrome de Marfan y la neurofibromatosis; ambos genes se han identificado, pero en la mayoría de los casos todavía no es tan fácil trabajar con la detección directa
Anticipación Este término se refiere al incremento progresivo en la gravedad y/o edad de inicio de un trastorno genético en generaciones posteriores de una familia. Se caracteriza por estar asociada con trastornos por repetición de trinucleotide como la distrofia miotónica y el síndrome X frágil, en los cuales el aumento de la gravedad puede correlacionarse con una mayor expansión de la región de repetición. En la enfermedad anterior, los hijos nacidos de madres afectadas son casos especialmente graves con inicio en la niñez o a edad infantil, dando a entender también una influencia mediante impronta (López, 1994). Lo contrario se observa en la enfermedad de Huntington, donde la expansión de repetición de un tríplete se produce con mayor probabilidad cuando se hereda del padre. Menos frecuentemente, se ha observado el fenómeno opuesto, la contracción. Por estas razones es tan importante para el diagnóstico y el consejo genético en estos trastornos la separación molecular exacta de los fragmentos de repetición de trinucleótido.
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D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
Influencias epigenéticas y herencia no mendeliana Los cambios epigenéticos son cambios hereditarios, pero potencialmente reversibles, en la expresión génica que no representan un cambio en la secuencia del ADN genómico de la célula. Los ejemplos más destacados de herencia epigenética son las improntas genómicas (tratadas anteriormente) y la inactivación del cromosoma X en mamíferos; ambas implican el silenciamiento transcripcional de genes por metilación de citosinas en dinucleótidos CpG. El estado de metilación del ADN se mantiene posteriormente a la replicación del ADN mediante metilasas. que también actúan sobre el ADN bcalenario hemimetilado para metilar la cadena de ADN recién sintetizada. El proceso se perpetúa indefinidamente en divisiones celulares sucesivas. Una evidencia reciente sugiere que la metilación de novo de los dobletes CpG puede tener lugar en los promotores de algunos genes supresores de tumores, silenciando estos genes y constituyendo esencialmente uno o ambos de los "impactos" en un gen supresor de tumor que conduce al desarrollo del tumor (Jones. 1999). Otra categoría de herencia epigenética menos aclarada implica la propiedad de algunas proteínas para regular la conformación de proteínas recien sintetizadas o ensambladas de forma autoperpetua. Los ejemplos más característicos en mamíferos son las enfermedades por priones, responsables de la encefalopatía espongiforme ovina y la enfermedad de las vacas locas en animales y del curu y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos. La enfermedad se produce por la proteina prión, que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una proteína normal pero está plegada con una conformación anómala, y sirve aparentemente como una plantilla para la proteina recién sintetizada de tal modo que perpetua la anomalía conformacional que origina la enfermedad.
Frecuencias alélicas y exploraciones masivas de la población Ya se ha hecho referencia a la aplicación de estudios de detección de portadores para mutaciones recesivas en grupos amplios de población. Para justificar el esfuerzo y el gasto requeridos al realizar una prueba de ADN en miles o millones de personas desde el punto de vista de la sanidad pública, la incidencia de esta enfermedad debe ser lo suficientemente alta en la población en general o en el grupo étnico o racial objeto del estudio. La ley del equilibrio de Hardy-Weinberg predice que la frecuencia del portador será mucho más alta para cualquier enfermedad aulosómica recesiva de incidencia apreciable. La enfermedad diana candidata debe ser lo suficientemente grave y/o favorable a alguna intervención médica en base a su identificación. Diversos trastornos no parecen corresponderse con estos criterios. Mutaciones asociadas con hemocromatosis hereditaria y resistencia a la proteina C activada (factor V Leiden) se encuentran en el 5% al 7% de la población caucásica, mientras que la frecuencia de portadores para la mutación de la anemia falciforme se aproxima al 19% en la población de afroamericanos. Las mutaciones de la fibrosis quistica. aunque de menor frecuencia, colocan a tal cantidad de parejas norteamericanas en riesgo que también se ha propuesto en niveles superiores como un objetivo válido de cribado en la población (véase más adelante). Este desplazamiento de la prueba de genética molecular fuera del campo de enfermedades raras y dentro del ámbito de estudios comunes tendrá un gran efecto en la medicina preventiva y la sanidad pública y conducirá a nuevos progresos en la automatización de las pruebas de ADN en años venideros.
EJEMPLOS ESPECÍFICOS DE ENFERMEDAD
Fibrosis quística Debido a la alta frecuencia de portadores en América del Norte y norte de Europa, la naturaleza clínica grave, el patrón directo de herencia mendeliana (aulosómica recesiva) y a su gen bien estudiado aunque bastante complejo, la CF ha surgido como un trastorno paradigmático para las pruebas de genética molecular a gran escala. Dentro de su ámbito se puede encontrar la gama completa de técnicas de genética molecular aplicables y un completo espectro de dilemas científicos y éticos que surgen de la variabilidad climca de la enfermedad, la heterogeneidad molecular extrema de las mutaciones causantes y la llegada de nuevos tratamientos que incluyen la terapia de sustitución génica. Con
una frecuencia de portadores tan elevada como de 1 de cada 30 en los ascendientes caucásicos del norte de Europa (y de forma decreciente en el sur de Europa, hispanos, afroamericanos y asiáticos), existían suficientes motivos para estudiar familiares de pacientes e incluso a la población general con el fin de identificar parejas con un riesgo de 1 de cada 4 de tener un hijo afectado en cada embarazo. Pero ya que estos portadores son asintomáticos y tienen niveles normales de cloruros en el sudor, se tuvo que esperar al aislamiento del gen en 1989 (Riordan, 1989: Kerem. 1989) Algunos años antes se había mapeado el cromosoma 7, permitiendo el diagnóstico prenatal mediante análisis de ligamiento en familias que buscaban información, realizando exploraciones masivas y analizando en otras familias, especialmente en las que no presentaban antedecentes familiares del trastorno; esto sólo pudo considerarse una vez que el gen se clonó y las mutaciones fueron identificadas. Sin embargo, el análisis del ADN para la CF ha estado lleno de problemas y controversias. El gen consta de alrededor de 250.000 bp y codifica una gran proteína de canal iónico denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) (Collins. 1992). Lo más notable es que el espectro de mutaciones observadas es notablemente heterogéneo. Mientras que una deleción de tres nucleótidos del codón "508 de la fenilalanina (designado como AF508) explica alrededor del 70% de las mutaciones en caucásicos (y significativamente menos en otros grupos étnicos), unas 800 mutaciones adicionales han sido informadas hasta ahora. La mayoría de ellas son tan poco frecuentes que no es factible ni rentable incluirlas en los paneles de pruebas: sólo alrededor de siete (además de la \F508) explican más del 1% de las mutaciones de CF en la mayoría de las poblaciones caucásicas (Tsui. 1992) (Tabla 66-1). La sensibilidad del cribado de portadores con paneles estándar de mutaciones de entre 6 y 25 alelos varía desde un 97% en judíos asquenazis (procedentes de Europa) (Abeliovich. 1992), un 75% a un 90% en caucásicos norteamericanos no asquenazis, alrededor del 60% en hispanoamericanos, el 50% en afroamericanos y menos del 10% en asiáticos (Ober, 1992; Orozco, 1993; Curtis, 1993; Grebe, 1994; Macek, 1997). Tal sensibilidad variable y subóptima en una población étnicamente heterogénea como la de
Tabla 66-1 Mutación AF508
Algunas mutaciones predominantes d e fibrosis quística Comentario
Deleción de 3 bp sm cambio del marco de lectura del codón phe, la principal mutación de la CF presente hasta en un 70% de portadores de algunas poblaciones caucásicas G542X Mutación sin sentido, alrededor del 3% de portadores c a u c á s i c o s W1282X Mutación sin sentido, presente en alrededor del 50% de portadores judíos asquenazis G551D Mutación sustituliva. alrededor del 3% de portadores c a u c á s i c o s N1303K Mutación sustituliva, 1-3% de portadores caucásicos y judíos asquenazis R553X Mutación sin sentido, alrededor del 1.5% de portadores c a u c á s i c o s 3849 + 10kbC -*T Mutación de una secuencia de unión exón-mtrón; 1.5 y 4%, respectivamente, de portadores caucásicos y ludios asquenazis; asociado con enfermedad pulmonar pero con niveles normales de cloruros en sudor 3905insT Mutación inserción/cambio del marco de lectura, alrededor del 1.5% de portadores caucásicos R117H Mutación sustituliva asociada con ausencia congénita de los conductos deferentes. frecuencia estimada del t%-5% 621 + IG -»T Mutación de una secuencia de unión exónintrón, alrededor del 1.5% de portadores caucásicos 1717 - IG -»A Mutación de una secuencia de unión exónintrón, alrededor del 1% de portadores caucásicos 3120 + IG ¿Ea Mutación de una secuencia de unión exónintrón encontrada en el 12% de pacientes afroamericanos
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Estados Unidos y las dificultades que supone el consejo a pacientes en cuanto al riesgo residual de un análisis negativo en un portador, ha hecho que la detección de portadores de mutaciones de la CF basada en la población sea un tema polémico (Wilfond, 1990; Williamson, 1993: Grody, 1999). a pesar de que una declaración consensuada recomienda que el estudio sea ofrecido a todas las parejas embarazadas y a aquellas que tienen planes de hacerlo (NIH, 1997). Aunque la mutación AF508 se puede detectar mediante migración diferencial en gel de poliacrilamida (Fig. 66-1) (Chong, 1990) y varias mutaciones producen patrones característicos de digestión por endonucleasas de restricción, el estudio de laboratorio para 30 o más mutaciones depende de estrategias con sondas ASO mezcladas (como la ¡lustrada en la Fig, 66-3) o transferencias en mancha inversas (en las cuales los productos de PCR marcados del paciente se hibridan con una serie de sondas de oligonucleótidos 'tipo salvaje" (wild-type) y mutantes inmovilizadas en un filtro (Chehab, 1992; Shuber, 1997). Hasta que existan avances tecnológicos en la secuenciación rápida y barata del ADN, la hibridación en "micromatriz" y los análisis de proteínas para la función del CFTR, la sensibilidad de la prueba anteriormente citada probablemente seguirá siendo la misma. Esto representa un problema especial para el consejo prenatal de parejas en las cuales la prueba de un cónyuge es positiva y la del otro negativa. No se puede ofrecer nada más en cuanto al diagnóstico prenatal, incluso si el cónyuge negativo es un portador, o si él o ella tienen una mutación que no puede analizarse en el feto, lo que aumenta la ansiedad con respecto al embarazo en curso. Se ha propuesto evitar la cuestión en su conjunto adhiriéndose a un modelo de detección precoz de la CF basado en la pareja, en el cual los resultados se informan como negativos incluso si se observa que un cónyuge es portador (Wald. 1991); sin embargo, este enfoque aumenta las cuestiones éticas acerca de la no revelación de información médica y otros asuntos (Miedzybrodzka, 1991). Otro problema con el consejo genético de la CF es el de la variable gravedad clínica del trastorno y la discrepancia de correlaciones entre genotipo y fenotipo. Más allá del hallazgo de que los homocigotos AF508 tienden a padecer insuficiencia pancreática, se sabe poco acerca de la gravedad de la enfermedad o complicaciones que puedan predecirse con fiabilidad a partir del conocimiento de un individuo afectado con dos mutaciones (Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype Consortium. 1993). Incluso los homocigotos para AF508, considerada la mutación "grave" prototípica, pueden mostrar un amplio rango en su grado de afectación pulmonar (Burke, 1992). Por el contrario, existen mutaciones que originan enfermedad pulmonar aun manteniendo niveles normales de cloruros en el sudor (Highsmíth, 1994); hay mutaciones y polimorfismos (como R117H y una extensión intrónica de politimidina) que no siempre producen CF sino algo de infertilidad masculina debido a la ausencia congenita de conductos deferentes (Gervais, 1993; Anguiano, 1992). Junto con la probable llegada de terapias efectivas de sustitución génica para la CF (Wilson, 1993), estos factores justifican el consejo genético debido a la dificultad de los padres para tomar una decisión sobre el trastorno. Dada la heterogeneidad molecular y clínica de la mayoría de trastornos genéticos, probablemente estos problemas son la regla más que la excepción en la genética molecular diagnóstica.
1988: Prior, 1991). Sólo con la llegada de la PCR multiplex se desarrolló un sistema para la identificación rápida y barata de más del 98% de deleciones del gen y su localización en los exones específicos de éste (Beggs. 1990; Multicenter Sludy Group, 1992). En este sistema se identifica una delecíón por la ausencia de uno o más de los múltiples amplicones esperados en geles de electroforesis teñidos con bromuro de etidio o en instrumentos de electroforesis capilar (ya que una delecíón en el gen diana suprimirá la secuencia o secuencias de hibridación de uno o más cebadores, causando un fallo en la PCR) (Fig. 66-5), El mapeado de su estructura fina junto con la secuenciación reveló importantes ideas sobre la patogénesis molecular de la DMD y la variante alélica más leve, la distrofia muscular de Becker (BMD). Mientras que ambas suelen estar causadas por grandes deleciones en el gen. en la BMD se conserva, de modo característico, el marco de lectura en el transcrito resultante, en tanto que las deleciones de la DMD producen más a menudo mutaciones del marco de lectura y un producto proteinico más truncado (Monaco. 1998). El tercio restante de pacientes en los que no se han detectado deleciones presenta normalmente mutaciones puntuales o microdeleciones/inserciones. Debido al tamaño del gen. no es factible identificar estas lesiones directamente, debiendo volver al análisis de ligamiento; también se ha estudiado el gen por análisis conformacional (SSCO, DGGE) (Prior. 1993), Como en cualquier estrategia de ligamiento, esta aproximación es posible sólo en familias que buscan información, en las cuales el ADN de un sujeto previamente afectado está disponible para su estudio. Los protocolos iniciales dependieron de marcadores RFLP que flanquean el gen de la distrofina (Williams, 1986); más recientemente, marcadores microsatélite intragénicos han permitido el haplotipado más rápido y exacto del cromosoma basado en la PCR (Beggs. 1990). Alternativamente, pueden realizarse estudios a nivel proteínico mediante la observación de una distrofina disminuida o ausente en la DMD y una distrofina de peso molecular anómala en la BMD, mediante transferencia Western (Western blot) o ¡nmunohistoquímica de biopsia de tejido muscular (Hoffman, 1988). Este procedimiento tiene limitaciones para el diagnóstico prenatal, para el cual se requeriría una biopsia de músculo fetal; sin embargo, el método ha sido recientemente adaptado para amniocitos y células de vellosidad coriónica, inducidas a diferenciarse hacia células musculares mediante técnicas de transferencia génica (Sancho, 1993). El diagnóstico molecular de la DMD ha vuelto al punto de partida: la identificación del gen sin conocer el producto proteinico ("genética inversa"), para la identificación y el uso diagnóstico del producto proteinico desde el conocimiento del gen. Esta clase de evolución se puede esperar en el diagnóstico de labo-
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Distrofia muscular de Duchenne Esta miopatía progresiva ligada al cromosoma X fue el primer trastorno cuyo gen causante fue aislado mediante el proceso de "genética inversa" (Rowland, 1988). Antes de su descubrimiento, las únicas pruebas que podían ofrecerse a familias de riesgo eran la detección de algunos portadores femeninos, aunque no todos, mediante el hallazgo de niveles séricos elevados de creatina cinasa, seguido de la determinación prenatal del sexo con la opción de interrumpir el embarazo en fetos masculinos (incluso aunque el 50% de estos embarazos fuesen normales). El consejo genético se presta incluso a mayor problemática porque alrededor de un tercio de los casos de DMD surgen a partir de nuevas mutaciones. Incluso después de su descubrimiento, su traslado a la aplicación clínica no fue fácil debido a que el gen, denominado "distrofina", demostró ser más grande aún que el descubierto, abarcando 2,5 millones de bp y compuesto de 79 exones (Ahn, 1993), El uso de sondas de ADNc de longitud completa o parcial para detectar la variedad de deleciones que se producen en dos tercios de los casos, fue un trabajo laborioso que llevó mucho tiempo (Darras,
Figura 66-5. Análisis mediante PCR multiplex para deleciones del gen de la distrofina en la dislrolia muscular de Duchenne. Las muestras de ADN de cinco pacientes se amplificaron simultáneamente con cinco pares de cebadores (mitad izquierda del gel) y nueve pares de cebadores (mitad derecha del gel) y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La ausencia de una banda esperada de un producto de PCR es indicativa de una delecíón. El paciente 2 carece de la banda superior en la plex-5 y de la segunda banda superior en la plex-9: éstas corresponden, respectivamente, a deleciones en los exones 50 y 48 del gen de la distrofina. (La banda 4 de la plex-9 es tenue, pero está presente en todas las muestras.) (Foto cortesía de Dra. Kathryn E. Kronquisl.)
CAPÍTUIO 66
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS
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ratono de muchas enfermedades genéticas, ya que los estudios funcionales del producto de un gen son, por definición, más completos que intentar localizar innumerables mutaciones individuales a nivel del ADN,
Anemia de células falciformes y otras hemoglobinopatías Debido a la larga historia de estudio de su producto proteinico, el diagnóstico de los defectos moleculares de los genes que codifican los polipéptidos de la globina no se hizo mediante técnicas de "genética inversa"; o mejor dicho, estos genes se clonaron por métodos clásicos, usando anticuerpos antiglobina en la precipitación polisómica para aislar los ácidos ribonucleicos mensaieros relevantes (ARNm). De esta manera, las mutaciones de la hemoglobina y en particular la que causa la anemia falciforme. fueron de las primeras en ser diagnosticadas a nivel de ADN. Una mutación puntual de la célula falciforme se encuentra dentro (por tanto, destruyéndola) de una secuencia de escisión para endonucleasas de restricción (Msfll o Ddel) en el codón 6 del gen de la globina [J. proporcionando un método rápido de detección usando transferencia Southern o digestión mediante enzimas de restricción de los productos de PCR del gen de la globina [i (Hatcher, 1992) (Fig. 66-2). De forma alternativa, las secuencias de hemoglobina S y hemoglobina A se pueden distinguir mediante transferencia en mancha usando sondas de oligonucleotides especificas de un alelo complementarias a la secuencia normal o mulante (Conner, 1983). Estas técnicas se pueden usar para el diagnóstico, cribado de portadores o diagnóstico prenatal; en este último caso es obvia la necesidad de una obtención invasiva de sangre letal y la electroforesis clásica de hemoglobinas. La prueba de ADN se vuelve importante para la confirmación de apoyo de los resultados positivos y ambiguos de los estudios, incluso si se hacen por métodos bioquímicos, puesto que más estados han iniciado los programas de detección precoz de las células falciformes en recién nacidos. Una mutación diferente en el codón 6, que origina la enfermedad de la hemoglobina C, no suprime la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (porque se da en una posición de nucleótido flexible para la enzima), por tanto puede distinguirse mediante sondas ASO (Maggio, 1993). Se debe tener en cuenta que ninguno de estos métodos identificará los heterocigotos compuestos célula falciforme/(i-talasemia o hemoglobina C/p-talasemia. Las talasemias engloban tanto alteraciones cualitativas como cuantitativas en una o más cadenas de globina; su diagnóstico a nivel molecular es más complejo que el de la anemia lalciforme. La u-talasemia es la más sencilla, ya que normalmente se origina por la deleción de uno o los dos genes a contiguos en uno o los dos cromosomas 16. Se puede detectar mediante transferencia Southern o PCR, permitiendo la diferenciación del portador imperceptible (pérdida de un gen a), de la hidropesía fetal muy grave (pérdida de los cuatro genes) y de los dos estados intermedios (Oron-Karni. 1998). El diagnostico molecular de la |i-talasemia es bastante más complicado debido a la gran variedad de secuencias promotoras, de terminación, de deleción, de unión exón-intrón y mutaciones del marco de lectura que se han documentado. Por esta razón, el análisis de ADN para este trastorno se ha limitado a algunos laboratorios especializados.
Trombofilias hereditarias La fibrosis quística no es el único trastorno con una frecuencia de mutación lo suficientemente alta como para justificar un cribado de la población usando métodos moleculares. Algunos genes, recientemente caracterizados, han revelado frecuencias de portadores de una magnitud superior a las de la CF. En este grupo se incluyen genes implicados en el sistema anticoagulante, que controlan la cascada de la coagulación. El más notable de tales alelos es la mutación del factor V de Leiden: se trata de un solo cambio nucleotídico que produce la sustitución de un aminoácido (R506Q) en la proteina del factor V de la coagulación, haciéndola resistente a la escisión por la proteína C activada (Bertina, 1994). El alelo es portado por el 5% al 7% de la población caucásica y es responsable de más del 90% de resistencia clínica a la APC, dando como resultado una tendencia al tromboembolismo venoso idiopático (Ridker, 1997a). Se ha informado que produce un nesgo relativo de trombosis siete veces superior al normal cuando se presenta en estado heterocigolo y alrededor de 80 veces en el estado homocigoto. El análisis de la muta-
Figura 66-6. Eiemplo de análisis electrolorético mediante PCR de la mutación del tactor V Leiden. Un fragmento amplificado por PCR del gen del factor V que aparca el codón 506 presentará dos secuencias de escisión para la enzima de restricción Mnñ en el ADN normal, pero sólo una si contiene la mutación R506Q, que destruye una de las secuencias. Los patrones resultantes de la digestión mediante enzimas de restricción mostrarán, respectivamente, dos. tres o cuatro bandas, dependiendo de si la mutación es homocigota (carril derecho), esta ausente (carril izquierdo) o heterocigota (carril central). El fragmento más corto migra cerca de la parte inferior de la foto del gel y suele ser difícil de ver.
ción es sencillo porque, al igual que la mutación de las células falciformes. ésta elimina una secuencia de escisión de una endonucleasa de restricción (Fig. 66-6); se han desarrollado métodos automáticos para mejorar el rendimiento de la prueba (Ryan, 1999). De igual modo que para la CF, existen controversias sobre a qué pacientes se debe proponer el estudio. A pesar del elevado nesgo relativo, el riesgo absoluto conferido por esta mutación es más bajo, con una penetrancia para los síntomas trombóticos de alrededor del 10% a lo largo de la vida. Por tanto, la mayoría de portadores no serian candidatos a terapia anticoagulanle a pesar del riesgo de hemorragia e idus; tampoco es seguro si tal estudio cambiaría el tratamiento del paciente de un modo significativo. Se ha propuesto realizar el estudio en sujetos con factores de riesgo ambientales conocidos que actúan de modo sinérgico con el riesgo del factor V de Leiden. como las mujeres que toman anticonceptivos orales. Aun aquí podría discutirse la obligación de dichas mujeres con una prueba positiva a volver a métodos menos eficaces de control del embarazo que podrian causar más perjuicios que beneficios, aumentando la tasa de embarazos con sus propias complicaciones de vigilancia, algunas de las cuales, de forma irónica, son de naturaleza trombótica (Kupferminc. 1999). Hoy en día, la mayoría de peticiones recibidas por los laboratorios de genética molecular para el análisis del factor V de Leiden son de pacientes que ya han padecido un episodio de tromboembolismo inexplicable. Junto con el factor V de Leiden. existen otras mutaciones hereditarias de elevada frecuencia alélica que confieren riesgo trombótico. La variante 20210A de la protrombina. un cambio de un solo nucleótido en la región 3' no traducida del gen de la protrombina. origina unos niveles altos de protrombina circulante y un fenotipo similar al del factor V de Leiden; se encuentra en el 1% al 2% de la población general (Poort. 1996). La variante 677C-*T de la metilenoletrahidrofolato-reductasa, una enzima implicada en el metabolismo de la homocisteina, la portan el 30% al 40% de la población general y se asocia con niveles plasmáticos elevados de homocisteina y riesgo de trombosis vascular (incluida la arteriopatia coronaria). Las mutaciones para cada uno de
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PATOLOGÍA MOLECULAR
estos factores pueden actuar de forma sinérgica con las otras, de modo que los pacientes que portan dos o incluso tres de estos defectos, incluyendo también las deficiencias menos frecuentes de proteínas S y C, tienen mayor riesgo (Halbmayer, 1999; Ridker, 1997b; Koeleman, 1994), Las pruebas de ADN para varias de eslas mutaciones trombofílicas se pueden multiplexar en un solo análisis (Hessner, 1999).
Trastornos por expansión de repetición de trinucleótido Un tipo importante de mutación patológica se reveló en 1991 con el descubrimiento de que la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X (enfermedad de Kennedy, SBMA) y el síndrome X frágil (FRAXA) estaban asociados, respectivamente, con la amplificación de secuencias inestables de repetición de trinucleótido en el gen del receptor de andrógenos (AR) y el gen FMR1 ("retraso mental del cromosoma X frágil"). Desde entonces, mutaciones patológicas similares se han asociado con varios trastornos neurológicos y musculares (resumidos en la Tabla 66-2), proporcionando una clasificación molecular de las ataxias espinocerebelares (La Spada, 1994; Bates, 1994; Reddy. 1997; Hardy, 1998; véase también Online Mendelian Inheritance in Man [OfvllM], http;//www3.nebí.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html). En cada uno de estos trastornos, el gen afectado contiene normalmente una secuencia repetida de 3 bp. por ejemplo (CGG)„ en el gen FMR1, donde n es variable pero está claramente limitado en su intervalo. En el estado patológico, el número de repeticiones del triplete se expande por encima del intervalo de normalidad, a veces de forma marcada. Son varios los mecanismos mediante los cuales estas secuencias de repetición expandidas originan enfermedad, incluyendo el silenciamiento génico y el aumento de la función tóxica de proteínas mulantes. Actualmente hay una sola excepción a la "regla del triplete" para las expansiones de repetición patológicas: una nueva expansión de repetición de 12 bp en dirección 5' de la secuencia de inicio de transcripción del gen de la cistatina B, asociada con una enfermedad autosómica recesiva poco frecuente, la epilepsia mioclónica progresiva de tipo 1 (Larson. 1999).
Síndromes XA frágil y XE frágil El FRAXA, la causa más común de retraso mental hereditario (1 de cada 1.250 hombres), es la segunda causa de retraso mental de moderado a grave en hombres, tras el síndrome de Down. Los hombres afectados con este trastorno ligado al cromosoma X tienen también orejas grandes, cara alargada y nariz prominente. Aproximadamente 1 de cada 2.500 mujeres son portadoras heterocígotas de mutación para el FRAXA, y una tercera parte de éstas puede presentar evidencias de una ligera disfunción mental. El sello citogenético del FRAXA es una "zona frágil" en la región Xq27.3 del cromosoma X, causada por un defecto en la condensación normal de la cromatina durante la mitosis. Aunque el patrón hereditario de la enfermedad está claramente ligado al cromosoma X. no se corresponde estrictamente con un patrón dominante o recesivo de expresión génica. La principal característica anómala ha sido la presencia de hombres fenofipicamente normales ("hombres normales transmisores") que son portadores obligados de la anomalía genética. Estos hombres son hijos de portadores demostrados del FRAXA: pasan el estado de portador a todas sus hijas y éstas a su vez transmiten la enfermedad completamente expresada a una alta proporción de sus hijos. El descubrimiento en 1991 de la anomalía genética que produce el FRAXA clarificó inmediatamente su patrón inusual de herencia (Fu, 1991). La región 5' no traducida del gen FMR1 situado en la posición Xq27.3 del cromosoma X porta un triplete (CGG). repetido un número de veces variable. En sujetos normales, n varía hasta 50, pero en individuos con FRAXA clínicamente aparente, n es superior a 200 (denominada "mutación completa"). Tanto los hombres como mujeres que portan un cromosoma X con n situado entre 50 y 200 (denominada "premutación") son fenotipicamente normales, pero tienen un riesgo elevado de transmitir a sus hijos un alelo incluso de un tamaño mayor. Esto se debe a la inestabilidad de los alelos con premutación y su tendencia a aumentar en tamaño durante las divisiones celulares meióticas que se producen en los gametos masculinos y femeninos. Los alelos de tamaño normal son estables y se transmiten sin alteraciones. Parece que existe una mezcla de alelos con pequeñas premutaciones en la población, posiblemente de ori-
gen ancestral, que tienen un riesgo elevado de sufrir expansiones adicionales cada vez que se transmiten a otra generación. Como el alelo con premutación aumenta en tamaño, se incrementa la probabilidad de que se expanda más en la próxima generación. Curiosamente, la expansión a una mutación completa sólo sucede en la meiosis femenina, nunca en la masculina, lo cual se corresponde con la observación de que las hijas de hombres normales transmisores son siempre fenotipicamente normales. La Figura 66-78 ilustra una familia con FRAXA: un alelo con premutación se transmite de la primera a la segunda generación, expandiéndose a una mutación completa en la tercera generación. Se está investigando el mecanismo por el cual la repetición expandida del triplete en la región 5' no codificante del gen FMR1 produce el fenotipo FRAXA. Debido al tamaño de las expansiones de repetición, existe una metílación progresiva de la región reguladora del gen FMR1 y una expresión disminuida de la proteina FMR-1. Esta proteina de unión al ARN se expresa ampliamente durante el desarrollo del cerebro y de otros tejidos. Su pérdida de expresión en el FRAXA puede alterar el desarrollo normal del cerebro y originar retraso mental (La Spada, 1994). Un escaso número de pacientes con síndrome X frágil típico no presentan expansión de repetición de tripletes o hipermetilación génica, pero presentan mutaciones de inactivación que dan lugar a la pérdida de expresión de la proteína FMR1. También se han descrito dos hermanos fenotipicamente normales con expansiones de repetición completas del gen FMR1 y zonas frágiles visibles citogenéticamente. pero sin hipermetilación génica y expresión normal de la proteína FMR1 (Smeets. 1995). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la responsable de este fenotipo patológico es la pérdida de expresión de la proteina FMR1. Familias poco comunes con retraso mental ligado al cromosoma X y una zona frágil demostrable citogenéticamente en la región cromosómica Xq2728, pero sin hipermetilación o expansión de repetición de (CGG)n en el gen FMR1. condujeron al descubrimiento de una segunda zona frágil más distal en la región Xq28 asociada con hipermetilación y expansión de repetición de (GCC)„. Individuos con expansión de la repetición superior a 200 copias padecen alteración mental leve. A diferencia del FRAXA. no existe una predisposición sexual aparente en la transmisión del FRAXE (Knight, 1994). Se ha descrito otra zona frágil, aún menos frecuente, con expansión de repetición de un trinucleótido en la región Xq28 distal al FRAXE, denominado FRAXF. No está claro si el FRAXF está asociado con disfunción mental (Ritchie, 1994).
Trastornos
neurodegenerativos:
enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X, ataxias espinocerebelares y
atrofia
dentatorubral-palidoluisana
La enfermedad de Huntington (HD), la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X (SBMA), las ataxias espinocerebelares (SCA) tipos 1,2,3,6, 7 y 12 y la atrofia dentatorubral-palidoluisana (DRPLA) son enfermedades autosómicas dominantes o ligadas al cromosoma X (SBMA), caracterizadas por una degeneración neuronal selectiva en el sistema nervioso central (SCN). En estos trastornos aparece una expansión de repetición del trinucleótido (CAG)„ en la región codificante de un nuevo gen. que produce una elongación anormal de una extensión de poliglutamina (La Spada, 1994). La proteína anómala resultante forma inclusiones intranucleares en las neuronas. Se postula que las secuencias expandidas de poliglutamina en estas proteínas conducen a alteraciones en sus propiedades de unión y a un aumento de su función que resulta tóxica para las neuronas de un modo selectivo. Se han observado inclusiones intranucleares. producidas por estas proteínas anómalas, en vanos de estos trastornos (Reddy, 1997; Rubinsztein, 1999). Las repeticiones expandidas de los trastornos neurodegenerativos, así como otros trastornos de repetición de tripletes, son inestables y tienden a incrementar su número en generaciones posteriores. Existe una correlación positiva, aunque no absoluta, entre el número incrementado de repeticiones, el inicio precoz de la enfermedad y la gravedad clínica. Al contrario que el síndrome X frágil y la distrofia miotónica, en los que los principales aumentos del número de repeticiones suceden en la meiosis materna, la transmisión paterna produce las mayores expansiones en los trastornos neurodegenerativos.
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PATOLOGIA MOLECULAR
-o
Figura 6 6 - 7 . Detección de la expansión de repetición de (CGG|„ en el síndrome X frágil. A, Diagrama de alelos normales, con premutación y con mutación completa en el locus del FRAXA. Cuando hay una expansión de la repetición a una mutación completa, la secuencia de la enzima de restricción Eag I se metila y no se corta con la enzima. 6 , La familia de un paciente (cuadrado oscuro) con síndrome X frágil. Una transferencia Southern de ADN digerido con EcoR \IEag I de cada individuo en el árbol genealógico se examinó con una sonda marcada de ADN que híbrida en 3' con la repetición. Los tres sujetos de la parte derecha de la figura son normales (cuadrados y círculos claros). Obsérvese que cada uno de los dos hombres presenta una sola banda de 2,8 kb, mientras que la mujer tiene ambas bandas, una de 2,8 y otra de 5.2 kb. Éste es el resultado esperado. La banda de 5,2 kb de la mujer es el cromosoma X inactivo normal (y, por tanto, metilado) de cada una de sus células. El ADN de este cromosoma está metilado y no se corta por Eag I. Sin embargo, la banda de 2,8 kb procede del cromosoma X activo no metilado (en este caso, Eag I cortará el ADN) de la mujer y de los hombres. El hombre afectado presenta una gran banda aumentada, como consecuencia de una marcada expansión de repetición de trinucleótido además de metilación en la secuencia de la enzima de restricción Eag I. Los tres individuos marcados por puntos negros son portadores de alelos con premutación. En las mujeres, la distinción entre alelos normales y expandidos se observa más claramente en el ADN procedente de sus cromosomas X activos (no metilados). Aquí, hay bandas distintas de 2,8 kb y 3,0 kb. La resolución no es tan buena en la parte superior del gel y los alelos de 5,2 y 5.4 kb apenas están separados. Obsérvese que en la muestra de sangre periférica procedente de la madre del paciente afectado, la inactivación del cromosoma X está sesgada con respecto a la expansión de repetición: una proporción mayor de cromosomas X normales de esta población celular se ha inactivado aleatoriamente comparado con los cromosomas X que portan el alelo con premutación. C, Separación de repeticiones de trinucleótido por electroforesis en gel posterior a la amplilicación del locus mediante PCR (Levinson, 1994). Los carriles del 1 al 6 representan seis individuos diferentes; el carril M contiene un marcador de tamaños. Los productos de PCR se marcaron mediante la incorporación de P-dCTP durante la reacción de amplificación y el gel seco se expuso sobre una película de radiografía. Las mujeres heterocigotas presentan dos alelos, los hombres y las mujeres homocigotas muestran sólo un alelo. Las bandas múltiples producidas con cada alelo se deben al fenómeno de "slippage" ("deslizamiento") de la ADN-polimerasa durante la reacción de la PCR: la banda más intensa se toma como representativa del tamaño real del alelo. (C, Cortesía de Dra. Anre Maddalena. Genetics & IVF Institute, Fairfax. VA.) 3?
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D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
En consecuencia, los casos de inicio juvenil de HD, DRPLA y las SCA se transmiten normalmente a través del padre (Reddy, 1997). A diferencia de las SCA anteriormente descritas, la SCA 8 autosómica dominante no se asocia con una expansión del fragmento de poliglutamina, aunque si con una expansión de CTG no codificante (Koob, 1999), Ésta también difiere de las otras SCA en su patrón de inestabilidad de repeticiones, con expansiones predominantemente maternas, algunas muy grandes. En este aspecto, la enfermedad se asemeja a la distrofia miotónica.
Distrofia
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rar alelos que difieran en tamaño por una sola unidad de repetición. Esto es de particular importancia cuando se necesita diferenciar entre alelos estables en el límite superior de tamaño y alelos con pequeñas premiaciones o patológicos. Sin embargo, cuando las expansiones de triplete son muy grandes, como las manifestaciones completas de FRAXA o DM, puede ser imposible amplificar mediante PCR el gran segmento expandido de ADN: en este caso, se prefiere utilizar la transferencia Southern. La figura 66-7 ilustra el uso de transferencia Southern y PCR para detectar mutaciones completas del FRAXA y alelos del FRAXA con premutaciones.
miotónica
La distrofia miotónica (DM) es un trastorno multisistémico autosómico dominante con un amplio rango de manifestaciones clínicas. En la infancia tardía o edad adulta temprana, los pacientes clínicamente más característicos desarrollan miotonía progresiva, debilidad y atrofia de los músculos distales de las extremidades y cara. También es frecuente la aparición de: cataratas, defectos en la conducción cardiaca y atrofia leslicular. La enfermedad puede ser leve y consistir únicamente en cataratas que se desarrollan durante la vejez, o ser tan grave que presenta al nacimiento una degeneración muscular marcada y retraso mental, seguido de muerte a edad temprana, A menudo se pueden observar todas las manifestaciones de la enfermedad en la misma familia, sucediendo en un patrón denominado por los genetistas como "anticipación": en generaciones posteriores, la enfermedad se hace más grave y con su inicio a edad más temprana. La anticipación está presente en todos los trastornos de repetición de trinucleótido, pero es más llamativa en la DM, donde el fenotipo clínico puede progresar en tres generaciones desde cataratas a enfermedad congénita grave. La DM está causada por una expansión de repetición de (CTG),, en la región 3' no traducida del gen de la proteina cinasa miotonina en la región cromosómica 19q13.3 (Mahadevan. 1992; Fu, 1992). En individuos normales, esta repetición varia entre 5 y 35. y es genéticamente estable. Las repeticiones CTG superiores a 50 son genéticamente inestables y propensas a la expansión cuando se transmiten a generaciones posteriores. En el intervalo de 50 a 100, estas repeticiones suelen ser asintomáticas o producir síntomas mínimos. Cuando están presentes repeticiones mayores de 100, el fenotipo típico de la DM es el más probable. Aunque existe una correlación entre la longitud de las repeticiones y la gravedad clínica, el número de repeticiones no es un indicador de pronóstico fiable en un caso individual. Las expansiones extremas de 1.000 a 2.000 repeticiones observadas en la DM congénita se dan sólo con la transmisión femenina de una repetición inestable; la DM congénita siempre se hereda de la madre. No se conoce el mecanismo por el cual las repeticiones expandidas de trinucleótido del gen de la proteina cinasa miotonina produce el fenotipo DM. Ya que la repetición no se localiza en la región codificante del gen. es posible que la expresión proteínica esté alterada o que estén perturbadas las interacciones reguladoras del ARNm.
Ataxia de Friedreich La ataxia de Friedreich (FRDA) es la más común de las ataxias hereditarias, con una incidencia de 2 por cada 100.000 habitantes. A diferencia de otros trastornos de repetición de trinucleótido. la FRDA se hereda como una enfermedad autosómica recesiva y no muestra evidencias de anticipación. La repetición (GAA)„ expandida se localiza en el primer intrón del gen FRDA, reduciendo la expresión de la frataxina, una proteína mitocondrial. Se desconoce la función de la Irataxina, aunque la disminución de su expresión en pacientes con FRDA se asocia con respiración mitocondrial defectuosa en el músculo esquelético. El 97% de los alelos FRDA se deben a expansiones de (GAA); el resto se debe a otras mutaciones inactivantes que incluyen mutaciones puntuales (Lodi, 1999).
Análisis de laboratorio de trastornos de repetición de trinucleótido Las expansiones de repeticiones de trinucleótido se demuestran rápidamente mediante transferencia Southern o PCR. Para la mayoría de estos trastornos se prefiere la PCR, seguida por la separación de los productos en un gel de electroforesis, debido a su rapidez, simplicidad y capacidad para sepa-
Síndromes de Prader-Willi y de Angelman Estos dos trastornos, cuyos genes están situados aproximadamente en el mismo locus del cromosoma 15, casi siempre se estudian juntos, incluso aunque sean causados por dos genes diferentes y no tengan fenotipicamente casi nada en común. El síndrome de Prader-Willi (PWS) se caracteriza por obesidad, retraso mental, hipoplasia genital y rasgos dísmórticos, mientras que el síndrome de Angelman (AS) presenta ataxia, rostro similar a una marioneta, retraso mental, sonrisa mantenida y crisis convulsivas. Pero comparten un potente mecanismo de impronta que determina la manifestación de la enfermedad. Los dos trastornos suelen ser esporádicos. El PWS. cuyo gen se desconoce, a menudo se origina por una delecíón en la región 15q11-13 del cromosoma paterno: sólo el gen PWS paterno se expresa, por lo que resulta patológico. Lo opuesto ocurre en el AS. causado por la delecíón de un gen conocido (UBE3A). exclusivamente en el cromosoma heredado de la madre, que es el único alelo que se expresa (Knoll, 1989; Matsuura. 1997). Por otra parte, el síndrome de Prader-Willi puede producirse por UPD en el cromosoma 15 materno, que porta sólo la copia que no se expresa del gen; asimismo el síndrome de Angelman se origina por UPD en el cromosoma 15 paterno. Estos tenómenos se pueden delectar mediante FISH, haplotipado cromosómico con marcadores microsatélite o transferencia Southern con enzimas de restricción sensibles a la mediación que pueden distinguir la región crítica materna metilada de la región critica paterna no metilada (Lerer, 1994). Más recientemente, se ha desarrollado un sistema de PCR diferencial que amplifica cualquier alelo metilado o no metilado cercano al gen SNRPN dentro de la región critica, basado en la resistencia de las citosinas metiladas a la modificación química por bisulfito sódico (Kosaki, 1997) (Fig. 66-8) Sin embargo, es importante tener en cuenta que ni la transferencia Southern ni los métodos de PCR distinguirán entre los mecanismos de delecíón o de UPD ni detectarán casos (más frecuente en AS) debidos a mutaciones puntuales dentro del gen causante. Estos métodos también distinguirán casos poco frecuentes de AS o PWS debidos a defectos primarios de impronta (Burger. 1997). los cuales tendrían mayor riesgo de recurrencia.
Cánceres familiares En cierto sentido, todos los cánceres son trastornos genéticos causados por mutaciones en genes que controlan la proliferación y diferenciación celular. De un modo simplificado pero útil, estos genes se pueden dividir en dos grupos: los que actúan predominantemente para promover la proliferación (profooncogenes) y los que actúan de modo que impiden el crecimiento celular (genes supresores de tumores). Frecuentemente, estos sucesos mutacionales tienen lugar en una célula somática, requiriendo alteraciones en varios protooncogenes o genes supresores de tumores antes de que se desarrolle un cáncer característico de esa célula particular (véase Cap. 64 para el estudio de oncogenes y genes supresores de tumores). En algunos individuos, la mutación inicial puede darse en la linea germinal, heredada de un padre y presente en todas las células del organismo. Hasta la fecha, las mutaciones hereditarias cancerígenas de la línea germinal normalmente se han encontrado en genes supresores de tumores, aunque también se han observado en algunos oncogenes y en ciertos grupos de genes reparadores de ADN (Tabla 66-3). La mutación hereditaria debería ser vista como un suceso inicial en el desarrollo del tumor y no como suficiente por si sola para producir cáncer: simplemente como el primer paso en una serie de mutaciones que finalmente conducen a un crecimiento celular incontrolado, análogo a la primera mutación somática que inicia el desarrollo del tumor en cánceres esporádicos.
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SECCIÓN V i l
Neg
PWS
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PATOLOGÍA MOLECULAR
AS
desarrolla un solo tumor esporádico. En un tercio de los casos, la primera mutación del gen RB1 está presente en la línea germinal del niño afectado, habiéndose heredado de un padre igualmente afectado o apareciendo como una nueva mutación en la gametogénesis. En este caso, la probabilidad de que el otro gen RB1 sufra una mutación en al menos una célula precursora de la relina es superior al 90%. Como observó Knudson. en la mayoría de pacientes con enlermedad familiar los tumores son bilaterales y multifocales (Knudson, 1971). dando a entender que varias células han sufrido mutaciones adicionales en RB1. No se sabe si las mutaciones RB1 por sí solas son suficientes para la tumorogénesis, aunque sí parecen ser el suceso que lo inicia. El retinoblastoma familiar ha servido como un modelo de guia en la investigación para la comprensión de muchos cánceres familiares. Esto ha conducido al descubrimiento de gran número de genes supresores de tumores importantes, no sólo en la patogénesis de algunos tumores familiares relativamente poco (recuentes, sino también en el desarrollo de tumores frecuentes como el carcinoma de mama de inicio precoz (Tabla 66-3) y el carcinoma de colon esporádico (Weinberg, 1991).
Oncogenes: neoplasia endocrina múltiple de tipo 2
Figura 66-8. Análisis electroforético mediante PCR de patrones de metilación de les síndromes de Prader-Willi y Angelman utilizando el método del bisulfito sódico de Kosaki (1997). En el síndrome de Prader-Willi, sólo está presente el alelo materno metilado (banda superior), debido a la deleción del alelo paterno o a disomia uniparental para el alelo materno. En el síndrome de Angelman, sólo está presente el alelo paterno no metilado (banda interior), debido a la deleción del alelo materno o a disomía uniparental para el alelo paterno. También pueden realizarse análisis similares mediante transferencia Soulhern usando enzimas de restricción sensibles a la metilación.
En comparación con sus homólogos esporádicos, los cánceres familiares suelen desarrollarse a una edad más temprana, son frecuentemente multifocales y aparecen bilateralmente en los órganos pares. Knudson postuló, observando estas características distintivas entre el retinoblastoma esporádico y el familiar, que eran necesarios al menos dos sucesos mutacionales para producir un tumor (Knudson, 1971). En el caso de un tumor esporádico, son necesarios dos sucesos mutacionales independientes en la misma célula para iniciar el desarrollo del tumor, mientras que en el caso del tumor familiar, la primera mutación está ya presente en el nacimiento en cada célula del organismo, haciendo más probable que un segundo suceso mutacional ocurra a una edad más temprana y a menudo en más de una célula. La hipótesis del "doble impacto" de Knudson es un concepto importante que ha guiado muchos estudios sobre la base genética del cáncer. La aclaración de las mutaciones hereditarias en los síndromes del cáncer familiar ha sido enormemente informativa, no sólo para comprender estos trastornos poco frecuentes, sino también para entender los cambios fundamentales responsables de los cánceres más comunes.
Genes supresores de tumores: retinoblastoma Aunque los síndromes de cáncer familiar debidos a mutaciones en genes supresores de tumores siguen un patrón dominante de herencia, los cambios a nivel celular a menudo parecen recesivos, ya que la tumorogénesis se inicia (en la mayoría de casos) sólo cuando ambas copias del gen supresor del tumor están inactivadas. La pérdida del gen normal heredado del padre no afectado puede ser el resultado de una segunda nueva mutación, pero más a menudo es el resultado de la sustitución por una copia duplicada del gen mutado heredado del padre afectado mediante mecanismos genéticos como la no disyunción cromosómica o la recombinación mitótica. Estos eventos tienen lugar en el retinoblastoma, un tumor de la retina originado por la pérdida funcional de las dos copias del gen RB1. que codifica una proteína, la RB, implicada en el ciclo celular y en la regulación de la transcripción. En la mayoría de los casos, estos dos eventos mutacionales tienen lugar a nivel somático y se
Hasta la fecha, sólo existen algunos síndromes de cáncer familiar, los cuales se sabe están originados por una mutación hereditaria de un oncogén. De ellos, los más conocidos son la neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN 2A) y sus variantes, el carcinoma medular de tiroides familiar (FMTC) y la neoplasia endocrina múltiple de tipo 2B (MEN 2B). Mutaciones de activación en sólo un alelo del protooncogén RET son suficientes para iniciar la lumorogénesis en esle trastorno (Noli. 1999). Estos tres síndromes se caracterizan por hiperplasia de las células C tiroideas y carcinoma de tiroides. Las familias que padecen MEN 2A también presentan feocromocitomas y/o adenomas paratiroideos o hiperplasia paratiroidea. MEN 2B se caracteriza por la presencia de múltiples neuromas de mucosas de labios, boca y tracto gastrointestinal, hábito marfanoide, un curso clínico particularmente agresivo y una elevada proporción de individuos afectados debido a nuevas mutaciones del gen RET. RET es una molécula de señalización con una zona receptora extracelular y una zona tirosina cinasa intracelular. Salvo algunas excepciones, las mutaciones conocidas de FMTC y MEN 2A son sustituciones de una sola base en uno de cinco codones en la zona extracelular: en cada caso se produce la sustitución de una cisteína por otro aminoácido. Se conoce sólo una mutación de MEN 2B, la sustitución de una sola base que produce una mutación sustituliva en la zona tirosina cinasa. No se ha encontrado mutación alguna en el 5% al 10% de familias afectadas con estos trastornos (Noli. 1999).
Genes reparadores de ADN: cáncer de colon hereditario sin poliposis Durante la búsqueda de posibles genes supresores de tumores como causa de cáncer de colon sin poliposis, se observó que secuencias polimórficas de repetición de dínucleótido (también conocidas como microsatélites), como (CA)„, eran inestables en los tumores de individuos afectados. Debido a la demostración de una inestabilidad similar en los microsatélites de bacterias con anomalías en los genes responsables de la reparación de una incompatibilidad del ADN, la atención se ha dirigido a la posibilidad de que genes humanos de reparación del ADN, homólogos a los genes bacterianos, fuesen los responsables de las anomalías hereditarias del cáncer de colon sin poliposis familiar (Fishel, 1993; Leach, 1993). De un modo análogo a la iniciación de la tumorogénesis mediante genes supresores de tumores, la herencia de una copia de gen defectuoso MSH2. MLH1. PMS1. PMS2 o MSH6. seguido por la mutación somática de una segunda copia, origina células deficientes en la reparación del ADN. Estas células acumulan con el tiempo mutaciones deletéreas y se producen transformaciones malignas. No se comprende la aparente especificidad de tejido.
Análisis de laboratorio de mutaciones del cáncer familiar La capacidad de analizar el ADN constitucional de un individuo para mutaciones hereditarias predisponentes al cáncer tiene un enorme poten-
C A P Í T U L O 66
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cial en la prevención de enfermedades y su Iralamiento precoz: ya se ha convertido en el estándar de cuidados de algunos trastornos. Si se conoce una proporción alta de mutaciones cancerígenas en un determinado gen y estas mutaciones son relativamente pocas, su análisis directo es sencillo y barato. De otro modo, si el gen es grande, si las mutaciones cancerígenas son numerosas y están ampliamente dispersadas o se producen en regiones del gen menos accesibles como intrones o secuencias reguladoras, los análisis de mutación deben estar menos dirigidos y ser capaces de explorar grandes extensiones de ADN en busca de anomalías. En estos casos, se pueden utilizar técnicas como el análisis SSCP. DGGE. el análisis de hete-
Tabla 66-3
1385
D I A G N Ó S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N É T I C A S
roduplex o la secuenciación directa de ADN. Los análisis de truncación de proteínas (Powell. 1993) pueden ser útiles si un alto porcentaje de las mutaciones producen un producto proteínico reducido. Estos métodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos. Sin embargo, una vez que se identifica la mutación en un sujeto afectado, el análisis posterior de otros miembros de la familia es relativamente sencillo, ya que puede dirigirse especificamente a esa anomalía. En la Figura 66-9 se ilustran varios métodos de análisis de mutaciones en el oncogén RETque origina la MEN 2A. Debido a que aproximadamente el 95% de familias con MEN 2A presentan una mutación en uno de los cinco codones de la zona extracelular de RET. el análisis de
Cánceres familiares* Tumores
Trastorno Genes supresores de tumores Poliposis adenomatosa familiar Sindrome basal-celular nevoide (de Gorlin) Càncer de marna familiar 1 Càncer de marna familiar 2 Sindrome de Cowden Sindrome de Li-Fraumeni
asociados
(aulosómicos dominantes) Carcinoma colorrectal. duodenal Carcinoma basal-celular, meduloblastoma Carcinoma de mama, ovárico Carcinoma de mama, de páncreas Carcinoma de mama, de tiroides Sarcomas, carcinoma de mama, leucemia, tumores cerebrales
Cáncer gástrico familiar Melanoma lamiliar Neoplasia endocrina múltiple tipo 1 ( M E N 1)
Carcinoma gástrico Melanoma Tumores de células de los islotes pancreáticos, hipotisarios, paraliroideos
Exostosis multiples
Osteocondromas/sarcomas
Neurofibromatosis tipo 1 Neurofibromatosis tipo 2 Síndrome do Peutz-Jeghers Retinoblastoma Enfermedad de Von Hippel-Lindau
Neurofibroma/sarcoma, feocromocitoma Neuroma acústico, meningioma Tumores gastrointestinales Retinoblastoma, osteosarcoma Hemangioblastoma, carcinoma renal, feocromocitoma Tumor de Wilms
Tumor de Wilms Oncogenes (autosomicos dominantes) Melanoma familiar Melanoma Neoplasia endocrina múltiple Carcinoma medular de tiroides, tipo 2 ( M E N 2) feocromocitoma. hiperplasia paratiroidea/adenoma Carcinoma renal papilar Carcinoma renal papilar hereditario de crecimiento Genes reparadores de ADN (aulosómicos Cáncer de colon hereditario sin poliposis ( H N P C C )
Genes reparadores de Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom Anemia de Fanconi
Xeroderma pigmentoso
ADN
(aulosómicos
dominantes) Carcinoma colorrectal. endometrial
recesivos) Linfomas otros Varios Leucemia mielógena aguda
Carcinomas de piel de célula basal y de célula escamosa
Gen
Localización
cromosomica
Tumor genico
APC PTCH
5q21 9q22
APC PTCH
BRCA1 BRCA2 PTEN p53
17q?1 13q12 10q23 17p13
BRCAt BRCA2 PTEN p53
CHK2 CDHI CDKN2 MEN1
22 I6q22 9p21 11q13
CHK2 Cadherina 1 p16 Mon na
EXT1 EXT2 NF1
8q24 11p12-p11 17q11
EXT1 EXT2 Neurofibromína
NF2 STK11 RB1 VHL
22q12 !9p13 13q14 3p25
Merlina STK11 pRB VHL
WT1
11p13
W11
CDK4 RET
I2q13 I0q12
CDK4 RET
MET
7q31
Receptor del factor del hepatocito
MSH2 MLH1 PMS1 PMS2 MSH6
2p16 3p21 2q32 7p22 2p16
MSH2 MLHI PMS1 PMS2 MSH6
ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF XPA-XPE
11q22 15p26 16q24 9q22 3p26-p22 6p22-p21 I1p15 Varios
ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF Varios
' Para una luente de información concisa, especialmente útil, acerca de los síndromes del cáncer lamillar, véase Lmdor. 1998 Esta disponible una información mas amplia en la pagina web Online Mendelian Innerilance m Man (OIM). http //www3 nebí nlm nih gov/Omim/searchomim.html
1386
S E C C I Ó N VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
mutación del ADN es muy eficaz en la identificación presintomática de portadores del gen de MEN 2A (Lips, 1994). La situación es más compleja con los genes supresores de tumores y de reparación del ADN. Las mutaciones patológicas en estos genes son numerosas y extendidas, a veces exclusivas de una determinada familia, y suelen necesitar una búsqueda costosa de múltiples secuencias de ADN hasta encontrar la mutación. Desafortunadamente, incluso después de una búsqueda exhaustiva de secuencias codificantes y también algunas regiones no codificantes, hasta la fecha sólo se consigue una tasa de detección de mutaciones del 90% en el retinoblastoma familiar, siendo bastante más baja en otros trastornos. Una complicación adicional del análisis de mutaciones de genes predisponentes al cáncer está relacionada con el significado funcional de algunas mutaciones. Mientras que las mutaciones de truncación de proteínas en genes supresores de tumores normalmente son significativas, las mutaciones sustitutivas. que producen la suslitución de un solo aminoácido, pueden
ser completamente benignas. En muchos casos, son imposibles o impracticables estudios funcionales de supuestas mutaciones cancerígenas, y el significado potencial de la mutación sólo puede evaluarse mediante grandes estudios clínicos de población realizados durante largos períodos de tiempo. Por último, el análisis del riesgo de cáncer sólo es útil si los resultados pueden afectar de forma positiva al Iratamiento clínico. En el caso de la MEN 2, el análisis de mutación en RET es bastante eficaz en la identificación de sujetos con riesgo y, si la prueba es positiva, el tratamiento recomendado (tiroidectomía profiláctica, seguimiento clínico durante toda la vida para el leocromocitoma y la hiperplasia/adenoma de paratíroides) puede salvar la vida y tener poco riesgo asociado o morbilidad. La colonoscopia periódica y la extirpación de pólipos son efectivas en la prevención del cáncer colorrectal en sujetos con mutaciones positivas para el cáncer de colon hereditario sin poliposis. Por el contrario, hasta la fecha existen pocas opciones atractivas, o ninguna, para prevenir el desarrollo de cáncer en otros síndromes predisponentes como el síndrome de Li-Fraumeni o el cáncer de mama familiar.
Figura 66-9. Análisis de mutación del protooncogén REÍ de la neoplasia endocrina múltiple tipo 2A (MEN 2A). A. Un sujeto control (WT/WT) e individuos afectados de tres familias diferentes se examinaron, mediante secuenciación directa, para mutaciones en el exón 11 del gen RET. En estos individuos se detectaron diferentes mutaciones sustitutivas heterocigotas en el codón 634, cambiando, respectivamente, la cisteína normal por tirosina (C634Y), glicina (C634G) y fenilalanina (C634F). S. Exploración de mutaciones del exón 11 mediante análisis de polimorfismo conformacional de ADN monocatenario (SSCP). La única banda observada en la muestra del paciente indica un alelo mutado. Posteriormente, se identificó por secuenciación directa como una mutación en el codón 634 (TGC->CGC). Está técnica suele ser una alternativa útil en la exploración mediante secuenciación directa. C. Análisis de mutación por PCR y digestión con enzimas de restricción en sujetos de riesgo (carriles 1 a 8) de una familia que porta la mutación C634Y. Esta mutación (TGC->TAC) crea una secuencia de reconocimiento para Rsa I en el exón 11. Se generó un producto de PCR de 279 bp del exón 11 que incluía el codón 634 y lúe digerido con Rsa I. Normalmente, está presente una sola secuencia para Rsa I en este producto de PCR, y la digestión produce fragmentos de 244 y 35 bp. Cuando está presente la mutación C634Y, se producen fragmentos de 169, 75 y 35 bp (carriles 4, 6, 7 y el control positivo). La presencia constante de la secuencia normal para Rsa I es una característica de control muy útil, ya que su digestión garantiza que el análisis está funcionando adecuadamente. Una vez que la mutación se ha identificado en una familia, se facilita su estudio en el resto de miembros familiares. (8, Cortesía de Dr. Brian Dawson, Universidad de Texas Southwesterm Medical Center, Dallas, TX.)
CAPÍTULO 66
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS
Hemocromatosis La hemocromatosis hereditaria (HH), reconocida desde el inicio por su manifestación clínica completa con la triada cirrosis, diabetes mellitus y piel bronceada, se pensó era un trastorno poco usual de sobrecarga de hierro que afectaba a 1 de cada 5.000 caucásicos. Sin embargo, cuando estudios genéticos ligaron el gen causante de la enfermedad al locus HLA del cromosoma 6 y se utilizaron pruebas bioquímicas de sobrecarga de hierro (fundamentalmente saturación de la transferrina), se reconoció que era bastante común la predisposición genética subyacente a la sobrecarga de hierro. En efecto, la HH actualmente se reconoce como un trastorno autosómico recesivo con una frecuencia de portadores elevada de uno de cada ocho en personas con ascendencia del norte de Europa, siendo el trastorno genético más frecuente en la población caucásica norteamericana. La incidencia de homocigotos con riesgo es de 1 de cada 250, aunque sólo una fracción de ellos acumula suficiente hierro en exceso para ocasionar el daño histico asociado con el trastorno clásico. El conocimiento de la hemocromatosis hereditaria entró en una nueva era con la identificación del gen HFE (denominado inicialmente HLA-H) dentro del locus del complejo mayor de histocompatibilidad en el cromosoma 6 (Feder. 1996). La proteína HFE. aunque es una molécula similar a la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. no se une ni presenta péptídos endógenos, y no parece tener ninguna función inmunológica. Es decir, se acumulan evidencias de que la proteína HFE mteractúa con el receptor de la transferrina y modula la absorción entérica del hierro de la dieta (Waheed. 1999). Mutaciones en el gen HFE afectan a esta función reguladora, originando una absorción aumentada de hierro y su almacenamiento en los tejidos. Una sola mutación sustitutiva en el gen HFE. la C282Y. que produce un cambio de lirosma en lugar de cisteina en el aminoácido 282 de la proteina HFE. está presenta en estado homocigoto en el 80% al 90% de caucásicos con hemocromatosis. Un pequeño porcentaje de pacientes con hemocromatosis son heterocigotos compuestos, portando un cromosoma con una mutación C282Y y otro con una mutación H63D. La mutación H63D es un polimorfismo común, con una frecuencia de portadores del 20%; el número de heterocigotos compuestos afectados con hemocromatosis todavía sugiere que el genotipo H63D contribuye a la sobrecarga de hierro. Aunque los homocigotos C282Y claramente presentan un riego elevado de desarrollar hemocromatosis. está menos claro el riesgo para personas con otros genotipos. Brandhagen combinó los resultados de vanos estudios para estimar las odds ratos (OR) ("razones de probabilidad") para el desarrollo de sobrecarga de hierro en los genotipos siguientes comparados con el homocigoto "tipo salvaje": homocigoto C282. OR = 2.300; heterocigoto compuesto C282/H63D, OR = 49,4; homocigoto H63D, OR = 6,3: heterocigoto C282Y, OR = 3,1; heterocigoto H63D, OR = 1.6 (Brandhagen, 1999), Las mutaciones C282Y y H63D son sustituciones de un solo nucleólido y pueden analizarse fácilmente mediante una variedad de técnicas, normalmente iniciándose con una amplificación por PCR. El análisis de mutación en el gen HFE es más útil para confirmar el diagnóstico ante una sospecha de hemocromatosis en un sujeto con sobrecarga de hierro, y puede eliminar la necesidad de realizar una biopsia hepática, que es la técnica de confirmación del diagnóstico. La flebotomía terapéutica es bastante eficaz, pues reduce los depósitos de hierro en individuos afectados, pudiendo prevenir el desarrollo de enfermedad clínica. El análisis de mutación también es útil en la evaluación del riesgo en familiares de pacientes positivos para la mutación. Sin embargo, es mucho menos efectivo como prueba de cribado, ya que se estima que del 10% al 15% de individuos que desarrollan hemocromatosis no portan una mutación conocida en el gen HFE. Hoy en día, son más útiles los estudios bioquímicos que calculan la sobrecarga de hierro, sobre todo el porcentaje de saturación de la transferrina (Bacon, 1999).
Trastornos del ADN mitocondrial Además de los 6 billones de bp del ADN que constituyen el genoma diploide nuclear en humanos, también se codifica inlormación genética vital en moléculas de ADN mitocondrial. Estas moléculas de ADN bicatenario circular de 16.500 bp están presentes en 2 a 10 copias en cada una de las centenares de mitocondrias celulares. El ADN mitocondrial codifica 13 proteínas de la cadena respiratoria y la adenosinatrilosfato-sintasa, 22 ARN de transferencia
1387
requeridos para su traducción y dos ARN ribosómicos (Hammans, 1994). El ADN mitocondrial se autorreplica y es transmitido únicamente por herencia materna, ya que la mitocondria de un espermatozoide no se incorpora al cigoto tras la fertilización del óvulo. Las anomalías patológicas del ADN mitocondrial pueden producirse por distintos mecanismos (Hammans. 1994: Jones. 1999). Grandes deleciones únicas (y menos frecuentemente duplicaciones) que aparentemente ocurren de forma esporádica durante la oogénesis son típicas del síndrome de Kearns-Sayre, una miopatía caracterizada por oftalmoplejia progresiva externa y retinopatía pigmentaria. Una gran variedad de trastornos se caracterizan por pequeñas deleciones múltiples y muestran patrones de herencia mendelíanos autosómicos dominantes o aulosómicos recesivos, ya que aparentemente se deben a defectos indeterminados en genes nucleares importantes para la replicación del ADN mitocondrial Los trastornos más característicos desde el punto de vista genético son los que siguen un patrón estricto de herencia materna, nunca presentan transmisión desde un hombre afectado y pasan de una mujer afectada tanto a sus hijos como a sus hijas. Estas enfermedades suelen deberse a mutaciones puntuales en uno de los genes que codifican un ARN de transferencia (p, ej., epilepsia mioclónica y fibras rojas rotas [MERRF] y miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y episodios similares a ictus [MELAS]) o una proteína mitocondrial (p. ej„ neuropatía óptica hereditaria de Leber). Además de las encefalomiopatías hereditarias, se cree que acumulaciones de mutaciones mitocondriales somáticas, específicas de tejido, pueden contribuir al desarrollo de muchos trastornos degenerativos comunes de inicio tardío y quizá al mismo envejecimiento (Jones. 1999). La confirmación de laboratorio de las grandes deleciones del ADN mitocondnal presentes en el síndrome de Keams-Sayre se consigue fácilmente mediante análisis de transferencia Southern de ADN mitocondrial del tejido afectado, usando ADN mitocondrial completo marcado como sonda. Las mutaciones puntuales de otros trastornos se pueden analizar mediante otras técnicas.
FUTURO DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR De los ejemplos citados en este capítulo, que representan algunos de los muchos trastornos hereditarios para los cuales se dispone de una prueba de ADN, es evidente que el diagnóstico molecular de la enfermedad genética es una de las aplicaciones más apasionantes de la patología molecular, repercutiendo en las demás debido el hecho de que casi todas las enfermedades presentan algún componente genético. Se puede anticipar que la genética molecular diagnóstica asumirá un papel más predominante en la sanidad pública y la medicina preventiva de lo que ha sido hasta el momento, debido a que el Proyecto Genoma Humano sigue descubriendo importantes genes patológicos (sobre todo los de trastornos más frecuentes) a una velocidad cada vez mayor, a la tecnología de secuenciación rápida del ADN y a que la delección multiplex de mutaciones continúa mejorando. La llegada de los "chips" de ADN que contienen miles de sondas algún dia podrán permitir el genotipado amplio y la predicción de enfermedades durante el transcurso de la vida para cientos de trastornos a partir de una sola gota de sangre (véase Cap. 61). Frente a estos prometedores avances, habrá que sopesar el impacto ético de tal "invasión" genética y el posible potencial curativo de la terapia de sustitución génica. De estas inquietudes, ha surgido la opinión generalizada de que los resultados de las pruebas de genética molecular son diferentes (principalmente debido a su poder predictivo) al resto de las informaciones médicas y deben someterse a políticas más rigurosas que protejan la privacidad, la confidencialidad, el consentimiento informado y la protección frente a la discriminación. Otros creen que los resultados de estas pruebas, aunque de gran alcance, no necesitan más carga emocional que otros estudios clínicos realizados en la medicina y patología del laboratorio Sin embargo, muchos estados y países están buscando soluciones reguladoras al darse cuenta de sus posibilidades de abuso; en Estados Unidos, están pendientes o ya aprobadas una variedad de iniciativas legislativas cuyo objetivo es salvaguardar la información genética y la privacidad. Cualquiera que sea el acuerdo final alcanzado, no hay duda de que la genética molecular será quien conduzca la práctica médica del siglo XXI, y prácticamente todo paciente, sano o enfermo, notará su impacto,
1388
SECCIÓN
VII
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P A I O I O G Í A MOLECULAR
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CAPÍTULO 66
•
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS
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C A P Í T U L O
67
Pruebas de paternidad: empleo del ADN, polimorfismo y otros marcadores genéticos Herbert F. Polesky, M.D.
EXCLUSIÓN DE LA PATERNIDAD
1390
Poder de exclusión Probabilidad de exclusión acumulativa
OTROS TIPOS DE PRUEBAS
1397
INCLUSIÓN DE LA PATERNIDAD
1397
Cálculo del índice de paternidad
ELECCIÓN DE UN SISTEMA GENÉTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD
1391
Probabilidad de paternidad
SISTEMAS CLÁSICOS
1392
Sistemas de antígenos eritrocitarios
Estimación de la paternidad con un padre ausente Reconstrucción de familias
Sistemas de proteínas séricas
DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS
1398
Enzimas eritrocitarias
CONCLUSIÓN
1398
BIBLIOGRAFÍA
1401
Antígeno leucocitario humano POLIMORFISMOS DEL ADN
1394
Pruebas de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Reacción en cadena de la polimerasa
En casos de paternidad dudosa "el laboratorio utilizará un grupo de pruebas... que incluye múltiples sistemas genéticos independientes. Este grupo de pruebas proporcionará, salvo raras excepciones, un supuesto padre no excluido con un índice de paternidad de al menos 99" (Standards lor Parentage Testing Laboratories, 1999). En el libro de Reyes (3:16-27), aparece una referenda de paternidad discutida citada con frecuencia, en la cual Salomón toma una decisión sobre la maternidad de un niño, amenazando con usar su espada para ofrecer un trozo del niño a cada demandante. Cuando la paternidad está en discusión, el arbitro de la verdad se suele encontrar ante un dilema similar al que se enfrentó Salomón: falta de testigos del suceso y la probabilidad de que los protagonistas puedan no saber o decir la verdad. El descubrimiento del grupo sanguíneo ABO por Landsteiner (1900) y el reconocimiento de que estas características medibles seguían las leyes genéticas descritas por Gregor Mendel proporcionaron una prueba objetiva de laboratorio que podía usarse para apoyar a los tribunales cuando deben decidir si una persona ha sido falsamente acusada de paternidad. En Estados Unidos, las leyes sobre el uso de marcadores genéticos para demostrar la no paternidad fueron promulgadas en 1935 (Schatkin. 1952). En años posteriores aumentaron bastante los conocimientos acerca de sistemas útiles de marcadores genéticos. En 1976. pautas conjuntas desarrolladas por una comisión de la American Medical Association-American Bar Association (AMA-ABA) recomendaron siete sistemas para las investigaciones de grupos sanguíneos en caso de paternidad discutida (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy, Kidd y HLA) (Míale, 1976). También se reconocieron como útiles otros sistemas genéticos tales como las proteínas polimórficas del suero y las enzimas de los glóbulos rojos. Se recomendó el uso de estimaciones matemáticas de la paternidad en los casos en los que no se observase exclusión. En 1983, como una continuación del informe de la AMA-ABA y de la conferencia internacional (Airlie, 1982) sobre Inclusion Probabilities in Parentage Testing, la comisión sobre pruebas de paternidad de la American Association
ol Blood Banks (AABB) publicó Guidelmes lor Reporting Estimates ot Probability ol Paternity (Walker, 1983). que aconsejaba sistemas múltiples de análisis (a elegir por el experto) para proporcionar pruebas de no paternidad con un 95% de probabilidad, cuando se analiza a un hombre al que se le ha acusado en falso, La Tabla 67-1 es un resumen de los sistemas usados en 1988. Cuando estas guías se desarrollaron, no se apreció la importancia en las pruebas sistemáticas de paternidad de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del acido desoxirribonucleico (ADN), descritos en 1980 (Botstem. 1980). Sin embargo, cuando se publicó en 1990 la primera edición de los Standards lor Parentage Testing Laboratories, se incluyeron las peticiones especificas de pruebas de RFLP junto con los que actualmente suelen denominarse sistemas clásicos (antígenos de superficie de glóbulos roios, antigenos leucocitarios humanos, enzimas eritrocitarias y marcadores genéticos de proteínas séricas). Este documento fue la base para la creación de un programa de inspección y acreditación que incluía datos concretos acerca de la identificación de los sujetos analizados, los métodos de análisis, los cálculos y el informe. En 1999 se publicó la cuarta edición de estas normas.
EXCLUSIÓN DE LA PATERNIDAD El objetivo lundamental de los análisis de marcadores genéticos en casos de paternidad discutida es identificar al padre biológico de un determinado niño. Aunque esto no puede realizarse con absoluta certeza, los análisis de marcadores genéticos pueden proporcionar pruebas objetivas de no paternidad. Mediante el uso de múltiples sistemas genéticos, es posible excluir a la mayoría (> 99%). pero no a todos los que no son padres. En sistemas que siguen las leyes de la genética mendeliana, las exclusiones se identifican mediante el hallazgo de excepciones al patrón hereditario esperado. Cuando se cuestiona la paternidad, la interpretación de los resul-
CAPÍTULO 67
Tabla 67-1
•
1391
PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.
Informe de los s i s t e m a s utilizados p o r los laboratorios d e p r u e b a s d e paternidad: 250.000 casos a p r o x i m a d a m e n t e *
en el padre en cuestión. El hallazgo de exclusión indirecta al menos en dos sistemas independientes suele ser una prueba suficiente para llegar a una conclusión de no paternidad.
Marcadores genéticos
„.,
Poder de exclusión
Anlígenos erilrocitarios H LA serológico Enzimas erilrocilarias Proteínas séricas ADN RFLP PCR
2-3 2-3 <1 <1 94 44 54
• Tasa de exclusión global. 28.3%. • Porcenlaie de casos analizados por el método Datos procedentes de American Association ol Blood Banks. Bethesda. MD. 1998.
Antes del análisis es posible proporcionar una estimación de la posibilidad media de que el análisis demuestre no paternidad si el acusado no es el padre. Para cada sistema genético se puede calcular un poder de exclusión medio (A) basado en las frecuencias génicas (p,g) de los alelos en el sistema. En 1930, Wiener informó de una ecuación general para un sistema de dos alelos: A - pq(j-pq). Se requieren fórmulas más compleías cuando el sistema presenta múltiples alelos (Walker, 1978). La ecuación general también se ha adaptado (Brenner, 1990) para determinar A en sistemas que no presentan alelos diferenciados, como los sistemas de RFLP de ADN, del siguiente modo: 2
A = h (1-rW) tados de la prueba depende normalmente de que se asuma que la muestra definida como materna procede de la madre biológica del niño. Deben compararse los fenotipos del niño y de la madre para determinar si los resultados son coherentes con los patrones hereditarios esperados. Un alelo presente en el niño pero no en la madre se denomina "gen obligatorio paterno" (OG). Si tanto el alelo del niño como el de la madre son idénticos, existen posibilidades alternas (dos) para el gen paterno. Si el hombre analizado no presenta la posibilidad de transmisión del OG y el marcador para el gen está ausente en la supuesta madre, la exclusión observada se denomina "directa" (Tabla 67-2). Este tipo de exclusión en uno de los sistemas clásicos, normalmente es suliciente para concluir que el hombre analizado no es el padre biológico del niño en cuestión. En los sistemas de ADN. debido a que la frecuencia de mutación es bastante superior a la observada en los sistemas clásicos, la exclusión de un solo locus no se considera prueba suficiente para establecer la no paternidad {Slandards. 1999). También hay una exclusión directa cuando el niño o el hombre analizados son heterocigotos y los dos marcadores identificados están ausentes en la otra persona. Este tipo de exclusión directa a veces se denomina "exclusión de dos haplotipos". En los casos en los que sólo están disponibles para el análisis el niño y un supuesto padre, es posible establecer la no paternidad si el individuo estudiado o el niño tienen dos haplotipos. ninguno de los cuales está en el otro. La ausencia de un marcador genético esperado en el niño cuando el padre en cuestión parece ser homocigoto para el gen se denomina "exclusión indirecta", también denominada a veces como homocigosidad inversa. Una exclusión indirecta no es prueba suficiente para concluir que el sujeto analizado no es el padre. La interpretación de la homocigosidad inversa como una exclusión indirecta supone que los sujetos analizados presentan los dos alelos del locus idénticos. Este resultado puede representar la presencia de una mutación en uno de los individuos analizados o es posible que esté presente un inusual alelo nulo (nuil) (u otro alelo no detectado) tanto en el niño como
Tabla 67-2
Directa
Dos haplotipos
Probable
donde H es el porcentaje de homocigosidad y h el porcentaje de helerocigosidad observados del locus. En la Tabla 67-3 se muestran valores de A para sistemas seleccionados Un sistema altamente polimórfico tiene un poder de exclusión mayor que un sistema con sólo algunos alelos o que presente uno o dos alelos frecuentes y numerosos alelos poco frecuentes.
Probabilidad de exclusión acumulativa Cuando el análisis incluye varios sistemas genéticos independientes, se puede calcular la probabilidad de exclusión acumulativa (CPE) usando la fórmula siguiente: CPE = 1-(1-P1) (1-P2) (1-P3)... (1-P/7)
(67-2)
donde P es el A para cada sistema usado. Tal como se muestra en la Figura 67-1. como cada vez se usan más sistemas, con cada prueba adicional se excluye a algún individuo más. Con una batería de sistemas de marcadores de ADN apropiadamente seleccionada, es posible conseguir fácilmente una CPE igual o superior a 0,995.
ELECCIÓN DE UN SISTEMA GENÉTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD El modelo de sistema genético para las pruebas de paternidad seria aquél en el que se puede encontrar un único marcador tanto en el niño como en el supuesto padre. Actualmente, salvo la secuenciación gémca, ninguno de los sistemas de marcadores proporciona hallazgos tan específicos. Por tanto, se usan múltiples sistemas genéticos que reúnen ciertos criterios para las prue-
Exclusión d e p a t e r n i d a d : fenotipo (genotipo)
Tipo de exclusión
Indirecta
(67-1)
Hijo AB(ab) 3.25:4.76 11.12 A(aa, a"x") 3,25:4,76 11 (11.11 u 11,"x") 7.8 Jk(a+b-)[aa o a"x") 3,25 (3.25:3,25 o 3.25:"x" 11 (11,11 u 11, "x") 11 (11.11 u 11, "x") R2r (cDE/ce)
'Supone que la secuencia de restricción es un alelo diterenciado •La Irecuencia de Rz (CDE) esta entre 0.02 y 0.004. OG • gen obligatorio paterno
Madre A(aa. ah) 3.25 5,31 8(8,8 o 8,"x") A(aa. a"x") 3,25.4,76 11.12 no disponible Jk(a+b+)(ab] 4.76 (4.76:4.76 0 4.76:"x") 11,12 no disponible R2 (cDE/cE)
Hombre analizado O(hh) 3,25:5.66 12,14 BR 4,95:5.66 8.9 11.12 Jk(a-b+)|bb o b"x") 3.25:5.66 12(12.12 0 12, V) 12(12,12 0 12,"x") R1R2(CDe/cDE) o Rzr (CDE/ce)-
OG b 4.76* 11 (materno) a o V 3,25 o 4.76 11 o "x" 7u8 a o "x" 3.25 o "x" (materno) t 1 0 "x" 11 0 " X " r(ce) o Ro (cDe)
1392
SECCIÓN V I I
•
PATOLOGÍA MOLECULAR
Tabla 67-3 Poder de exclusló (A): sistemas de p r u e b a s seleccionados* Sistema ABO RH ACP D2S44 D7S467 D10S28 HUMvWA D7S820 DI3S317
A 0.166 0.283 0.239 0,95 0.93 0,96 0.65 0,523 0,417
"Los valores varían en poblaciones diferentes.
bas de paternidad. Lo ideal es que el sistema presente múltiples alelos distribuidos en la población, de modo que tenga un elevado poder de exclusión y el fenotipo menos usual presente una frecuencia que puede determinarse con fiabilidad. Todos los marcadores del sistema deben expresarse como codominantes (sin alelos nulos), deben conocerse las frecuencias de mutación y éstas deben ser bajas; los fenotipos deben ser estables en condiciones habituales de almacenamiento. Los métodos para la detección de marcadores deben ser fiables, reproducibles y factibles para la gran mayoría de laboratorios. Debe conocerse la genética del sistema y a continuación establecerse los patrones hereditarios (leyes mendelianas). El sistema debe ser independiente de otros marcadores analizados habitualmente. Si el sistema se crea para calcular estimaciones de paternidad, deben establecerse las frecuencias génícas en varias poblaciones. La mayoría de los sistemas clásicos descritos anteriormente presentan uno o más problemas que deben considerarse antes de su inclusión en la batería de pruebas. Es común a estos sistemas el problema de los alelos nulos o variantes cuantitativas que dificultan la interpretación cuando existe homocigosidad inversa. En algunos sistemas, las variantes se detectan por un método o grupo de reactivos pero no por otro. Puede haber una variación biológica en la estabilidad de varios marcadores durante el transporte o almacenamiento. En algunos sistemas en los que se requiere el uso de anticuerpos, la variación en los reactivos puede crear problemas a menos que se utilicen procedimientos de control de calidad apropiados. Algunos marcadores no se expresan completamente hasta una cierta edad, poniendo limitaciones en el uso de los sistemas seleccionados. En los sistemas de ADN, la mutación o recombinación es más frecuente que en los sistemas clásicos, lo cual debe tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. La terapia médica, como la transfusión o el trasplante de células madre progenitoras (stem cell). puede dar como resultado la detección de características del donante en vez de marcadores hereditarios del sujeto analizado.
SISTEMAS CLÁSICOS Sistemas de antígenos eritrocitarios Los seis grupos sanguíneos (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy y Kidd) han sido utilizados en las pruebas de paternidad. Las técnicas de tipado utilizadas son las que se realizan de forma sistemática en los laboratorios de inmunohematologia que incluyen las pruebas en tubo y en placas microtiler. Las normas de la AABB requieren que estas pruebas se hagan por duplicado, de forma independiente y con distintos reactivos. Cuando se utilizan reactivos de antiglobulina, deben realizarse pruebas para demostrar que las células no son reactivas. Sólo es necesaria una prueba específica de antiglobulina directa cuando todas las pruebas que utilizan antiglobulina son reactivas. Siempre que sea posible, debe hacerse un control de calidad de los reactivos de tipado, usando células control heterocigóticas para demostrar la reactividad y especificidad del método utilizado. Tradicionalmente. el grupo sanguíneo ABO ha sido un estándar en los casos de paternidad discutida. Cuando se realiza el tipado de células y del suero, normalmente los resultados de las pruebas son inequívocos. Se debe tener cuidado cuando se utilizan reactivos monoclonales y los resultados no son los esperados (Stroup, 1990). Para la interpretación de la paternidad basada en pruebas serológicas, hay que tener en cuenta que sólo se puede deducir un probable genotipo a partir del fenotipo observado, a no ser que el hombre analizado sea O (OO.hh), AB o si la supuesta madre es A o B y el hijo es O. Cuando las células lipan como A o AB, el subtipado, si se realiza, debe interpretarse con precaución. En una variante poco frecuente, el fenotipo Bombay, existe un fallo en la expresión del antígeno esperado A o B: sin embargo, el suero de estos individuos contiene anti-H, lo cual sería detectado fácilmente utilizando células del grupo O para la determinación inversa de grupo. Otro raro fenotipo informado es el cis AB, en el que se heredan A y B como un solo alelo AB (Salmón, 1984). El sistema Rh es uno de los sistemas de antígenos eritrocitarios más informativos. Mediante las pruebas habituales con anti-D, -C, -E, -c, -e (en E-positivos) y -Cw (en C-positivos), es posible identificar 10 fenotipos comunes y numerosos genotipos probables. La secuenciación génica de la región RH del cromosoma 1 indica la presencia de dos genes, uno para D y otro para CcEe (Colin, 1991). Cada persona presenta dos haplotipos, cada uno de los cuales tiene múltiples marcadores reconocidos por los reactivos de tipado. Los resultados de la prueba sólo pueden sugerir el fenotipo más probable de una persona. También debe considerarse la raza de la persona que está siendo analizada, ya que las frecuencias de haplotipos difieren entre los grupos raciales. Aparte de los haplotipos más comunes, se han descrito varios haplotipos poco frecuentes con antígenos esperados que se han perdido o suprimido (Tippett, 1987). La aparición de uno de estos haplotipos en un trío puede originar una aparente exclusión materna o una exclusión indirecta del padre biológico. Algunos anticuerpos anti-Rh reconocen antigenos compuestos (p. ej.. los antiC suelen contener anti-Ce [rhi] y no reaccionan con células que contienen el haplotipo CDE [Rz]). Cuando se encuentran hallazgos inusuales en el tipado de Rh, es importante usar antisueros y métodos diferentes, junto con el estudio de otros miembros familiares. Con et sistema MNS es más probable la identificación de padres falsos que con cualquier otro sistema de antigenos eritrocitarios. Es importante ser cauto cuando se interpretan los resultados de la prueba, a la hora de asignar un genotipo a partir de un fenotipo observado. En sujetos de raza negra, un alelo observado frecuentemente, el S", puede ser mal interpretado como ausencia de un producto génico esperado. Las personas que parecen ser homocigóticas para Sos pueden ser realmente SS o sS". Este hallazgo puede producirse con M y N, pudiéndose lipar algunas personas como S negativo, s negativo. Normalmente, estas personas también son U negativo (Holliman, 1989). Otros alelos poco frecuentes, como M- y M', pueden dar resultados que parecen excluir la paternidad, cuando, de hecho, su existencia en un padre y un niño casi demuestran la paternidad. U
Figura 67-1. Poder de exclusión acumulativo. El porcentaje de la población excluido por cada prueba adicional se vuelve cada vez más pequeño. La probabilidad de exclusión global de las seis pruebas es del 95,3%. Si se realizase una séptima prueba con A = 0,5, sólo se excluiría un 2,4% adicional de la población ([1 - 0.953] x 0,5 = 0,0235).
Los reactivos para tipar los antigenos de los sistemas Kell, Duffy y Kidd suelen requerir antiglobulina para su detección. Cuando una muestra se analiza como heterocigótica para todos estos marcadores (Kk, Fy(a+b+) y JK(a+b+)j, es esencial determinar que la muestra es negativa en una prueba directa de antiglobulina. Todos estos sistemas presentan alelos nulos; son poco frecuentes en Kell y Kidd y muy frecuentes en Duffy. En sujetos de raza negra, el fenotipo más común es Fy(a-b-) (68%), y el gen FY tiene una fre-
CAPITUIO 67
•
PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL ADN, POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.
cuencia de 0,80. Es frecuente la homocigosidad inversa; también es común la aparente exclusión materna o una única exclusión indirecta de paternidad. En la mayoría de los estudios, raramente se encuentra el gen FY en sujetos blancos (Martin, 1983). También se han utilizado para la determinación de paternidad otros sistemas de grupos sanguíneos como P, Lutheran. Lewis. Xg y pruebas para algunos de los antígenos de grupos sanguíneos con alta y baja frecuencia. La posibilidad de obtener información útil a partir de estos marcadores es limitada.
Sistemas de proteínas séricas Se emplean numerosos sistemas de polimorfismo genético de las proteínas séricas en la determinación de la paternidad. En la mayoría de estos sistemas, el tipado de los productos alélicos se realiza mediante separación electroforética de las bandas proteinicas. que se detectan por tinción, inmunofijación o reaccionando con un sustrato específico. Cuando se encuentran variantes poco frecuentes, deben compararse con controles específicos o verificarse en un laboratorio independiente. En algunos sistemas se puede requerir la identificación de alotipos comunes mediante isoelectroenfoque (IEF) y técnicas convencionales. La haptoglobma (HP), una «,-globulina que lija hemoglobina libre, fue la primera proteina descrita como polimódica. basándose en su separación electroforética en gel de almidón (Smithies. 1955). El sistema del componente especifico de grupo (GC) es uno de los sistemas de marcadores proteínícos más informativos, excluyendo más del 30% de hombres acusados en falso. Se puede realizar la separación de los tres alotipos comunes 1s, 1f y 2. por isoelectroenfoque (Dykes. 1984) o usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Existen numerosas variantes muy raras que se han identificado como marcadores en poblaciones específicas. Estas variantes no se distinguen de los alelos comunes mediante el método de transferencia en mancha utilizado para detectar los productos de la PCR. El factor B properdina (BF), una proteína de la cascada del complemento, es fenotipado por electroforesis en gel de agarosa (Dykes. 1980). Los genes del BF y los marcadores del sistema C4 se localizan en el brazo corlo del cromosoma 6, dentro de la región que codifica el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Mauff, 1988). Debido a este ligamiento, las proporciones de probabilidad de los resultados de la prueba de estos sistemas y el HLA no son independientes y no deben multiplicarse para calcular el índice de paternidad (Pl). Las moléculas de mmunoglobulinas presentan varios polimorfismos detectados por inhibición de la hemaglutinación. Los polimorfismos de marcadores gamma (Gm) están asociados con secuencias especificas de aminoácidos de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina G (IgG). Cada una de las cuatro subclases de IgG presentan un grupo diferente de marcadores Gm (De Lange. 1988); por tanto, dependiendo del alcance del análisis, una persona puede presentar un fenotipo complejo de Gm. Se han encontrado haplotipos diferentes en varios grupos raciales, haciendo de ellos un sistema útil en los casos en que se sospecha un componente racial: estos marcadores están presentes en las cadenas pesadas de IgM e IgA. no son tan polimórficos como los marcadores Gm y no son muy útiles en las pruebas de paternidad. Los marcadores Km. anteriormente conocidos como Inv. son determinantes de las cadenas ligeras comunes a todas las clases de mmunoglobulínas. Otros sistemas de proteínas séricas que se han empleado en pruebas de paternidad son: la transferrina (TF): el plasminógeno (PLG): el factor de estabilización de la fibrina (FXIII). constituido por dos subunidades independientes de péptidos polimórficos (FXIIIA y FXIIIB): la a-1 -antitripsina (Pl); la amilasa; el C3, y el C4.
Enzimas eritrocitarias Los principios y los métodos generales usados en el fenotipado de proteínas séricas mediante electroforesis se aplican al polimorfismo de enzimas eritrocitarias. Los sistemas de detección dependen de la reacción de la enzima con un sustrato. Se produce una pérdida de actividad si las muestras no se
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obtienen y almacenan de un modo apropiado. Las células recogidas en tubos con floruro no son útiles para el fenotipado de enzimas. Antes de la prueba, se prepara un hemolizado lavando los glóbulos rojos con una solución salina isotónica y diluyendo la mueslra (1:1) con agua destilada. La fosfatasa acida de los glóbulos rojos (ACP1), también denominada EAP, presenta tres alelos comunes (A, B y C) y algunas variantes poco frecuentes (Miller. 1988). El tipado requiere la observación tanto de la posición de las bandas como de su intensidad de tinción. La fosfoglucomutasa (PGM1) es una enzima polimórfica de los eritrocitos que presenta más de 30 variantes (Dykes. 1984.1985). La prueba de IEF identifica cuatro alelos comunes (1Ao 1+ y 1B o 1-, 2Ao 2+ y 2B o 2-) y diez lenctipos. El fenotipado se determina haciendo reaccionar el gel con un sustrato que contiene glucosa-1-fosfato, glucosa-1 -6-dífosfato, mcotinamida-adenmadinucleótido-fosfato (NADP) aceptor de hidrógeno, un preparado aceptordonador de electrones (monotetrazolio [MTT]. glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) y un colorante (azul medola). Se ha informado de recombmación en el locus de la PGM1 (Wetterling, 1990), aunque es muy poco frecuente. El locus de la PGM1 se encuentra en el cromosoma 1; se han identificado otros dos subsistemas de PGM, el PGM2 y el PGM3. controlados respectivamente por genes situados en los cromosomas 4 y 6. Estos dos subsistemas son muy poco polimórficos. Otras enzimas eritrocitarias utilizadas en la prueba de paternidad son la esterasa D (ESD) que presenta dos alelos frecuentes [ESD't. ESD'2). codificados por genes situados en el cromosoma 13; la glioxalasa 1 (GL01) con dos alelos comunes {GLOfl GL0t'2) codificados por genes del cromosoma 6 cercanos al MHC, pero independientes; la glutamato-piruvato transaminasa (GPT), una enzima lábil que requiere el mantenimiento fresco de las muestras, y la glucosa-6-foslato deshidrogenasa (G6PD), de utilidad limitada por encontrarse ligada al sexo. La ademlato-cinasa (AK), la adenosma-desaminasa (ADA) y la 6-foslogluconato deshidrogenasa (6PGD) son sistemas de enzimas eritrocitarias que se utilizan en los laboratorios forenses. Existen métodos para la detección simultánea de estos marcadores independientes (Brinkmann. 1971). Estos sistemas no son demasiado útiles para la prueba de paternidad, ya que la mayoría de las poblaciones presentan un alelo de alta frecuencia {AK'1 = 0.96-0.99; ADA'1 = 0.96-0,98: 6PGD'A = 0,97).
Antígeno leucocitario humano (véase Cap. 40) El sistema HLA. localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano, contiene varios locus: HLA-A. -B, -C. -D. -DR, -DP y -DQ Se ha publicado la secuenciación completa del ADN de las regiones HLA-A y -B (Zemmour. 1992). Antes del uso extenso de las pruebas de ADN. la determinación de antígenos HLA-A. -B por métodos serológicos fue el segundo sistema, tras los antígenos eritrocitarios, más frecuentemente utilizados en las pruebas de paternidad en Estados Unidos (Polesky, 1999). Los marcadores DOA1 detectados por PCR también se utilizan en algunos laboratorios para pruebas forenses y de paternidad. El sistema HLA es muy potente para la prueba de paternidad, debido a la gran diversidad de estos antígenos en la población. Basándose en el estrecho ligamiento de las especificidades 40 A y 70 B, es posible identificar alrededor de 700 haplotipos y unos 180.000 fenotipos. Existe un desequilibrio de ligamiento entre HLA-A, -B (es decir, ciertas combinaciones de haplotipos, como HLA-A2, -B44 o -A1.-B8, suceden más de lo esperado según la frecuencia de los antígenos A1, A2, B8 y B44), Los AABB Standards requieren que el tipado serológico de HLA para la prueba de paternidad incluya todos los antigenos HLA-A y -B reconocidos oficialmente en 1980 por el Committee on Nomenctature de la Organización Mundial de la Salud (OMS). También recomendó que se realizase el tipado de otras especificidades conocidas de HLA si el laboratorio disponía de sueros apropiados de tipado. El tipado serológico de HLA-. -B se realiza mediante un método de hnlocitotoxicidad dependiente del complemento. Una suspensión de linfocitos, que contiene al menos un 80% de células viables, se incuba con múltiples antisueros. Si el anticuerpo es específico para un antígeno presente en las células estudiadas, éstas son destruidas en presencia de una cantidad adecuada de complemento reactivo. Se mide por la incapacidad de las células para excluir un colorante (Ray. 1982). Se recomienda el uso de muestras heparini-
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PATOLOGÍA MOLECULAR
zadas para el tipado de HLA. que no se deben refrigerar antes de la separación de los linfocitos. Lo ideal es que los Imfocitos se separen en una gradiente de densidad Hypaque-Ficoll en las 24 horas tras su obtención. Los linfocitos, una vez separados, pueden conservarse durante algunos días en un medio de cultivo. Algunos de los reactivos disponibles en la actualidad son monoespecíficos; los AABB Standards requieren que cada antígeno sea definido al menos por dos sueros monoespecíficos diferentes o por tres sueros multiespecíficos. En un caso de paternidad, todos los individuos deben tiparse en el mismo laboratorio, con el mismo método y los mismos reactivos, para minimizar la variabilidad que se da cuando las células son upadas con reactivos diferentes. La interpretación de los resultados de la prueba de HLA puede complicarse por un entrecruzamiento entre los locus A y B. Otro problema con el tipado de HLA es el fracaso para encontrar un 'MI house" (cuatro marcadores distintos). Pueden encontrarse blancos (alelos no definidos por los reactivos disponibles), dependiendo de la raza de la persona analizada. En la mayoría de los casos, se observan blancos apárenles cuando la persona analizada es homocigótica para el marcador A o B. En otros casos, los antisueros reaccionan de forma cruzada con el marcador indefinido o los antigenos esperados no se expresan completamente (Lamm, 1983).
POLIMORFISMOS DEL ADN La prueba de polimorfismos del ADN es el método utilizado con más frecuencia para la prueba de paternidad por los laboratorios (Polesky. 1999). Normalmente, los análisis de estos polimorfismos se basan en pruebas de RFLP y/o amplilicación por POR. Los AABB Standards han definido los criterios para que un sistema de marcadores de ADN sea aceptado para su utilización en las pruebas de paternidad. Mediante estudios familiares, debe comprobarse que cada locus presenta herencia mendeliana y una baja frecuencia de mutación y/o recombinación. Su localización cromosómica debe estar registrada por el International Human Gene Mapping Workshop. Lo ideal es que las características del locus (sonda, enzima de restricción, secuencia del cebador y tamaños de los fragmentos) estén documentadas en la bibliografía y exisla la posibilidad de pruebas confirmatorias en un laboratorio independiente.
thern. 1975). Los fragmentos que representan los locus de interés se detectan mediante sondas marcadas que se unirán a una secuencia de bases complementaria entre dos secuencias de restricción adyacentes. Antes de añadir la sonda, el ADN separado en el gel es despurinado y desnaturalizado. El ADN monocatenario resultante se transfiere desde el gel a una membrana (transferencia Southern) Una sonda marcada se híbrida con el ADN en la membrana. Usando determinadas temperaturas y otras condiciones definidas, la sonda de los locus se fijará a los fragmentos de ADN unidos a la membrana que comparten la misma secuencia (Maniatis, 1982). La localización de los fragmentos marcados en la membrana se consigue añadiendo un sustrato que reaccionará con una enzima fijada a la sonda o exponiéndola sobre una película fotográfica sensible (autorradiografia). si la marca es radiactiva (normalmente -^P) o quimioluminiscente. Es importante estandarizar los procedimientos e incluir controles adecuados cuando se realizan análisis de sistemas de RFLP. Debe controlarse la cantidad de ADN extraído y usado en el sistema de prueba, debe verificarse la reactividad de la enzima utilizada para asegurar la digestión completa del ADN y cada recorrido electroforético debe incluir un control de ADN humano de tamaños conocidos. Es importante emplear marcadores de tamaño con múltiples fragmentos distintos que abarquen el rango de alelos observados normalmente en el locus del ADN que está siendo analizado. Los AABB Standards requieren que se realice la electroforesis de una mezcla del ADN del supuesto padre y del niño en el mismo carril. Esto es útil para evaluar la presencia o ausencia de fragmentos de peso molecular parecido. La interpretación de los resultados de un sistema de RFLP depende de la coincidencia de las bandas observadas en el niño y en los supuestos padres (Figs. 67-2 y 67-3). El niño debe presentar fragmentos que coincidan con ca-
Caso I m M
C
AF nV
Caso 2 M
C
-
AF m —
Sonda
Las ventajas de los métodos de ADN consisten en la disponibilidad de numerosos sistemas altamente polimórficos y con una probabilidad de exclusión muy alta; la posibilidad de sistemas de pruebas múltiples en un recorrido electrolorético; la capacidad para usar muestras que contengan células nucleadas, incluyendo sangre periférica, frotis bucal y tejidos; el tamaño minimo de muestra requerido y la detectabilidad de los marcadores desde el momento de la concepción (Polesky, 1999).
Pruebas de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Se han descrito numerosos locus polimórficos de RFLP como parte de la investigación llevada a cabo en el mapeo del genoma humano (Walson, 1992). La identificación de un locus específico requiere una corta secuencia marcada de nucleótidos, complementaria a una única secuencia de la región del ADN que está siendo analizada. Las sondas útiles en la prueba de paternidad detectan fragmentos de restricción polimórficos en un solo locus (dialélico simple, inserción/deleción o repeticiones en tándem de número variable [VNTR]) (Baird, 1986). El ADN se extrae y purilica a partir de una muestra que contiene células nucleadas, como sangre periférica o un frotis bucal. En ocasiones, la única muestra disponible es tejido fijado. Deben utilizarse métodos especiales para la obtención y purificación del ADN de estas muestras (Forsthoefel, 1992). Se emplea una enzima bacteriana específica para escindir asimétricamente el ADN bicatenario aislado en las zonas donde está presente una secuencia definida de nucleótidos (p. ej.. Eco Rl. la nucleasa de Escherichla col! RY 13 escinde AG o GA). El proceso de restricción rompe el ADN en múltiples fragmentos de peso molecular variable. En numerosos locus. el tamaño de estos fragmentos está determinado genéticamente. La electroforesis en gel se emplea para separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño molecular (Sou-
Figura 67-2. Membrana hibndada con dos sondas marcadas que detectan los locus de RFLP D12S11 (A) y D17S79 (8). ADN procedente de dos tríos digeridos con Pst 1. Escalas de tamaño flanquean los dos tríos. Se muestran la madre (M), el hijo (C), el supuesto padre (AF) y una mezcla de supuesto padre/hijo (m'). En el caso 1, el AF se excluye mediante la sonda A. Mediante una cuidadosa observación, se demostró que el carril de la mezcla presentaba cuatro bandas. En el caso 2, existe coincidencia para ambos locus entre el hijo y el supuesto padre. Los alelos se designan por sus tamaño en kilobases: los tamaños mayores están situados en la parte superior de la membrana.
CAPÍTULO 67
M
Cl
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PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.
A P m* L C2 m
Figura 67-3. Membrana con una sonda multilocus (DNF24) ADN procedente de un caso con dos hijos analizados. Los carriles de izquierda a derecha muestran la madre, el hijo 1, el supuesto padre, una mezcla supuesto padre/hijo 1. la escala de tamaños, el hijo 2, una mezcla supuesto padre/hijo 2. El hijo 2 se excluyó debido a que no se encontró coincidencia con las bandas marcadas por el signo +.
da uno de sus padres biológicos. La presencia de un fragmento del niño ausente tanto en la madre como en el hombre analizado es una prueba de no paternidad. Del mismo modo, cuando el hombre analizado sólo tiene un único fragmento detectado, se espera que esté presente en su hijo. No debe excluirse la paternidad por los resultados de un solo sistema de ADN. Estos marcadores presentan una mayor frecuencia de mutación que los sistemas clásicos, y pueden existir alelos nulos o un segundo fragmento no identificado debido
a que esté fuera del rango de tamaños de detección utilizado (Chakraborty, 1994). El uso de pruebas de locus de RFLP junto con marcadores clásicos ha demostrado que los sistemas de RFLP presentan probabilidades de exclusión similares a los valores esperados (Endean, 1990b). Si se observa una coincidencia entre el hijo y el supuesto padre, se realizará el cálculo de un índice del sistema, similar a los presentados anteriormente en este capítulo. Para calcular los índices de paternidad utilizando los resultados de estas pruebas, se necesitan las frecuencias génicas determinadas en muestras de población adecuadas. Un problema frecuente con los sistemas de RFLP, no encontrado en los sistemas de marcadores clásicos, es que los fragmentos (alelos) presentan una continuidad de tamaños, en vez de ser marcadores diferenciados. Es muy difícil distinguir entre dos alelos de tamaño parecido que puedan diferir sólo en unos pocos pares de bases. Los errores de medición y otras variaciones técnicas menores del método pueden afectar al tamaño asignado a un alelo. Un laboratorio que realice pruebas de RFLP necesita determinar sigma (capacidad para reproducir resultados intra- e ínterrecorrido electroforético. usando las mismas muestras) y delta (diferencia de tamaño mínima entre dos bandas que puede detectarse de modo sistemático) para cada locu&sonda/combinación enzimática (Endean. 1990a) (Fig. 67-4). En la determinación de las frecuencias alélicas se emplean técnicas de compartimentación para compensar estas variaciones antes de asignar un valor a y (Alien, 1990). Uno de los métodos divide el rango de tamaños de los alelos esperados en una serie de intervalos fijados de igual tamaño. Para determinar la frecuencia alélica de un "hombre al azar" (y), se usa el valor de la frecuencia del intervalo en el cual se encuentra la banda. Con este método, la asignación de valores a bandas cercanas al extremo superior o inferior del intervalo puede requerir la combinación de datos procedentes de dos intervalos y dar como resultado valores bajos del índice. Un segundo método, preferido por el autor, utiliza un intervalo variable. La frecuencia de y se determina contando todas las bandas observadas en un intervalo determinado por el tamaño del fragmento ± delta (Tabla 67-4. Fig. 67-4). Usando este método, el tamaño del intervalo varía en relación al tamaño del alelo. Un tercer método, conocido como el principio del limite superior, fue propuesto por el National Research Councilen 1992 para garantizar que los datos forenses de identidad presentados a los tribunales fuesen prudentes. Consiste en fijar un límite superior para el valor de y. Asi. incluso si el alelo es muy poco frecuente, el valor del índice no excederá de un valor fijado (esto es, 20). Este método contrarresta los errores de mueslreo y las posibles subestructuras de una población. El Committee on DNA Forensic Science publicó en 1996 una actualización donde explica por qué este método es mapropiado. asi como otras consideraciones estadísticas y de población sobre las pruebas forenses y de paternidad.
Reacción en cadena de la polimerasa La reacción de la PCR, descrita inicialmente por Mullís y cois, en 1986, utiliza la termociclación para desnaturalizar el ADN óicatenario y promover la (íjación de cebadores específicos a secuencias diana que flanquean la región de interés. Esta técnica ha permitido definir un gran número de alelos dife-
Tamaflo de banda (kb) D I 2 S I 1 Pst 1
Figura 67-4. Determinación de sigma y delta. Representación gráfica de mediciones en cinco muestras recorridas 10 veces para determinar la reproducibilidad (sigma) y la capacidad para distinguir entre dos bandas (de'ía) que tienen un tamaño similar (AF-1, AF-2). Basándose en estas observaciones, sigma es 0,094 para la banda compartida por el hijo y la madre (C-M. M2). Delta es 11,7. Esta figura se utiliza para seleccionar el tamaño del intervalo que determina la frecuencia de y, utilizada para calcular el índice de paternidad.
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SECCIÓN V I I
1396 Tabla 67-4
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Frecuencia de g e n e s obligatorios en s i s t e m a s de R F L P : u s o de delta para determinar el t a m a ñ o del intervalo
Sistema
OG
Delta
Intervalo
D2S44 D2S44
3.54 1.85-3,54
2.0 2,0
D7S467
3,95
2,3
D10S28
1,96 6 68
2,5 1,8
±0,071 (3,47-3,61) ± 0 , 0 3 7 (1,81-1,89) ±0,071 (3.47-3,61) ±0,091 (3,86-4,04) ±0,049(1,91-2,01)
D12S11 D12S11
14.95
1.8
±0,120(6,56-6.80) ±0,269(14,68-15.22)
Frecuencia' 18/2.500 = 0,007 (250/2.500 + 18/2.500) = 0,107 375/1 800 = 0,208 65/1.200 = 0.054 28/900 = 0.031 4/900 = 0.004
'Número de bandas observadas en el intervalo/bandas loiales del sistema en la base de dalos
rendados únicamente por cambios mínimos en su secuencia. Las ventajas de la PCR para las pruebas forenses y de paternidad son: necesita muy poca cantidad de muestra de ADN genómico; no tiene que aislar previamente la secuencia para su amplificación y ofrece una disponibilidad rápida de los resultados de la prueba y condiciones de almacenamiento de la muestra no demasiado rigurosas. Cuando se utilizan sistemas de PCR, es necesario monitorizar y validar el funcionamiento del termociclador. Debido a que minimas cantidades de ADN en la etapa de postamplilicación pueden causar la contaminación de muestras en la (ase de preamplificación, es esencial ser cuidadoso en el diseño del laboratorio y del flujo de trabajo para separar los pasos de preamplilicación de las áreas en las que se realizan la amplificación y detección de resultados (Budowle, 1995: Dieffenbach, 1993) (véase Cap. 63). Debe procesarse y analizarse un control negativo con cada lote de muestras para verificar que no haya contaminación. Un problema asociado con la PCR es que si no se encuentra ningún producto, debemos asegurarnos de que la muestra no contiene ninguna sustancia que inhiba la amplificación.
DQA1. polimarcador La detección de los ocho alelos del locus HLA-DQA1 (Erlich. 1986) fue una de las primeras aplicaciones de la PCR en pruebas forenses y de paternidad. Los genes responsables de estos antigenos HLA de clase II fueron identificados mediante el uso de cebadores biotinilados específicos de secuencia (SSP) y de sondas oligonucleotídicas específicas de un alelo (ASO) en un sistema de transferencia en mancha inverso ("reverse dot blof). El ADN de la muestra se amplilica con los cebadores marcados. Posteriormente, la mezcla de reacción se transfiere sobre una membrana que contiene una sene de sondas ASO inmovilizadas. Si un alelo está presente en la muestra, la secuencia amplificada hibridará con la mancha que contiene el ADN complementario. Después de lavar para eliminar el ADN no fijado, las manchas que presentan ADN fijado se detectan por la reacción de la biotina de la secuencia amplificada con un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina. Se dispone de un equipo de reactivos (AmpliType PM) que utiliza el método de transferencia en mancha para detectar marcadores en los siguientes locus: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC. La mayoría de estos locus no son muy polimórficos (sólo presentan dos o tres alelos). Dos de estos sistemas de marcadores detectan alelos encontrados por los métodos clásicos (GYPA es igual que los antigenos eritrocitarios M. N; GC es igual que el sistema de proteínas séricas).
Repeticiones cortas en tándem (STR) y repeticiones largas en tándem (LTR) Los polimorfismos del ADN suceden en locus con variaciones de la longitud. Estos sistemas con marcadores que presentan VNTR se identifican por PCR. Los polimorfismos de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) se separan usando electroforesis en gel de alta resolución (Boerwmkle. 1989). Los fragmentos producidos por la reacción de la PCR se comparan con
escalas alélicas que contienen fragmentos de peso molecular conocido. Es posible el análisis simultáneo de varios sistemas si existen diferencias en el rango de tamaños de los alelos de cada locus Estos sistemas genéticos no son tan polimórticos como los sistemas de RFLP. El primer sistema de AFLP usado en casos forenses y de paternidad fue la región 3' hipervanable del locus de la apolipoproteína B (ApoB) formada por unidades de repetición de 15 pares de bases (bp) de adenina y timina. Este sistema de marcadores contiene 23 alelos que varían entre 611 y 931 bp y una heterocigosidad media de 0,8. D1S80, un locus del cromosoma 1 (26 alelos de 16 repeticiones con un rango de tamaños entre 430 y 782 bp). se utiliza con frecuencia en los laboratorios de pruebas de paternidad. Existen en el genoma otros locus formados por unidades de repetición de tres a siete nucleótidos (Weber. 1989). Los alelos de estos locus de STR se definen por el número de unidades de repetición del producto amplificado por PCR. Las muestras se mezclan con cebadores que se fijarán con el ADN del locus que presente la secuencia especifica. La mezcla se amplifica en un termociclador usando parámetros definidos cuidadosamente para maximizar la detección de los alelos. En una mezcla, pueden utilizarse varios cebadores con distintas marcas fluorescentes para detectar alelos de varios locus en una sola amplificación. Los productos de PCR que difieren en longitud se separan por electroforesis en poliacrilamida utilizando capilares o geles. La detección se realiza mediante un explorador láser que detecta la marca incorporada en el cebador o por tinción del gel con plata. La determinación de tamaños se basa en la comparación con una escala alélica y/o inclusión de un estándar de tamaños para cada locus que se marca de forma diferente a la muestra Los AABB Standards también requieren que se incluya una muestra mezclada del hijo y del padre en cuestión. Se ha estandarizado una combinación de 13 locus de STR para su uso en la obtención de perfiles genéticos de individuos condenados por varias causas criminales. Muchos de estos locus también se utilizan en pruebas de paternidad. Los sistemas de marcadores de STR presentan alelos diferenciados y. por tanto, no son tan polimórficos como los sistemas de marcadores de RFLP. En algunos casos, estos sistemas tienen tres o cuatro alelos comunes (frecuencias de 0.15 a 0,25) y varios alelos inusuales (frecuencias menores de 0.01). Asi, para obtener una CPE y un índice de paternidad altos, se requiere analizar seis o más locus de STR; Allord y cois, informaron en 1994 de que ambos métodos excluyeron a los mismos 13 supuestos padres (basados en dos o más locus). Según los sistemas de STR, la probabilidad de paternidad en 36 de los 37 hombres no excluidos estuvo por encima del 99%.
ADN
mitocondrial
La amplificación por PCR seguida de secuenciación puede utilizarse para identificar el polimorfismo de procedencia materna presente en la región hipervariable del bucle D del ADN mitocondrial. En situaciones complicadas, las secuencias de ADN amplificado extraídas de tejidos y huesos encontrados se comparan con las secuencias de ADN de descendientes maternos (Holland, 1994). Usando este método, se ha demostrado que los posibles huesos de la familia del zar Nicolás II (recuperados en Yekaterimburgo, Rusia) presentan un ADN materno similar a los descendientes vivos de la reina Victoria, la abuela materna de la zarina Alexandra (Ivanov. 1993).
CAPÍTULO 6 7
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PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.
OTROS TIPOS DE PRUEBAS El estudio de la longitud del cromosoma Y se utilizó para excluir la paternidad (De la Chapelle, 1967). También se ha usado la comparación de marcadores fluorescentes sobre varios cromosomas para excluir la paternidad o proporcionar estimaciones de inclusión (Gürtler, 1986). Se encontraron una serie de locus de STR en el cromosoma Y. Estos marcadores son útiles en la determinación de la linea paterna. Se han descrito sondas mutlilocus para la identificación de árboles genealógicos que detectan regiones hipervariables (Jeffreys. 1986). El método utilizado es similar a la técnica empleada para detectar marcadores de RFLP. Las relaciones entre los individuos se determinan comparando el número de bandas compartidas. Algunos investigadores han utilizado las repeticiones en minisatélites (MVR) (Jeffreys. 1991). Se han descrito sistemas de pruebas para el estudio de los genes del locus MHC. que emplean combinaciones de amplificación génica por PCR con cebadores específicos de secuencia, sondas oligonucleotidicas específicas de secuencia (SSOP) y secuenciación directa, aunque no se usan en pruebas forenses o de paternidad de modo sistemático (Alien. 1994: Bunce. 1995). Se han desarrollado métodos para detectar polimorfismos de un solo nudeótido (SNP). también denominados genetic bit analysis (GBA) (Nikiforov. 1994). Estos sistemas determinan el cambio de una sola base de una secuencia en una localización específica. Debido a la limitada variabilidad de estos locus. se precisa analizar unos 50 para conseguir el mismo nivel de información que el proporcionado por un muitipiexúe varios locus de STR.
INCLUSION DE LA PATERNIDAD Si después de múltiples sistemas independientes de pruebas el supuesto padre no es excluido, debe calcularse entonces una estimación sobre la posibilidad de que la persona analizada pueda ser el padre biológico. Se deben utilizar tablas adecuadas de frecuencias génicas que proporcionen estimaciones de inclusión de la paternidad. En general, esto significa que se ha fenotipado al azar una población de personas, que el tamaño de la muestra es lo suficientemente grande como para proporcionar con mínimos etrores una estimación de las frecuencias génicas de los alelos del sistema y que los hombres analizados y los padres biológicos proceden de la misma población. Cuando se analizan múltiples sistemas, las diferencias observadas en las frecuencias génicas de poblaciones procedentes de varias localizaciones geográficas no son relevantes en el cálculo de la probabilidad de paternidad (Hummel. 1981). En casos en los que el hombre estudiado tiene origen multirracial o procede de una población para la que no existen tablas de frecuencia apropiadas, puede ser imposible proporcionar una estimación precisa de la paternidad. Sin embargo, cuando se utilizan múltiples sistemas con un alto poder de exclusión y los valores del índice de paternidad son altos usando una población de referencia, existe un riesgo mínimo de que las frecuencias de una población más definida presenten un
1397
efecto significativo sobre la conclusión de paternidad. En estas situaciones, también pueden ser útiles las comparaciones con las frecuencias de determinados grupos raciales. Si el hombre analizado no es excluido, siempre se puede argumentar que el número de pruebas fue insuficiente, que la prueba de exclusión se encontrará mediante el análisis de otro sistema genético o que el verdadero padre es un familiar cercano del hombre analizado. Esta linea de razonamiento sólo sería correcta si el hombre analizado ha sido acusado en falso. Además del poder de exclusión medio descnto con anterioridad, también es posible calcular la frecuencia con la cual un hombre no será excluido al azar (RMNE), basándose en los fenotipos observados en la pareja madre-hijo (Salmón. 1983). Este valor está relacionado con el poder real de exclusión de las pruebas realizadas.
Cálculo del índice de paternidad En los casos en los que se analiza un trio, normalmente se utiliza un enfoque general denominado "comparación del método del esperma" (Walker, 1978). Este cálculo compara la probabilidad (x) de que un esperma procedente de un hombre con el fenotipo del hombre analizado pueda fertilizar el óvulo de la supuesta madre y la probabilidad (y) de que lo haga el esperma de un hombre de la población elegido al azar (Tabla 67-5). Las proporciones de probabilidad (x/'y) se calculan independientemente para cada sistema genético, comparando el hombre analizado mediante las frecuencias de los OG o mediante la contribución genética paterna a una población elegida al azar de la misma raza del hombre analizado. Posteriormente, estos valores se multiplican para calcular el Pl, que refleja las probabilidades genéticas a favor de la paternidad, teniendo en cuenta los fenotipos del trio. En la Tabla 67-5 se muestran fórmulas para el cálculo de los índices con vanas combinaciones de fenotipos. Los valores del índice de paternidad en casos en los que no se observa exclusión pueden tener un valor numérico desde mayor de cero hasta un número próximo a infinito. Los AABB Slandards actuales requieren para determinar la paternidad que la prueba tenga al menos un Pl de 99. Esto significa que la probabilidad de que el hombre analizado sea el padre es de 99 a 1.
Probabilidad de paternidad Otra estimación útil, la probabilidad de paternidad, combina las pruebas genéticas con suposiciones acerca de sucesos anteriores. Essen-Móller describió en 1938 este cálculo basado en el teorema de Bayes (Tabla 67-6). La estimación utiliza el Pl para resumir la información genética y P (un valor para la probabilidad previa) para explicar las suposiciones de que el hombre analizado: 1. 2. 3. 4.
No era estéril Tuvo acceso durante el periodo de concepción No es un familiar cercano del padre (primer grado) Otros posibles padres proceden de una población con frecuencias génicas similares
Si se utiliza una P de 0,5; ésta asigna igual posibilidad previa al hombre analizado y a cualquier hombre no analizado. Usando este valor, la probabilidad de paternidad (W) es igual a (PI/PI + 1)100. Se pueden utilizar en este cálcu-
Tabla 67-5 Cálculo d e la proporción del sistema* (índice d e paternidad) Madre A A A A AB AB AB AB BC AC
Hijo A A AB AB AB Al! AB AC BC AD
Genes obligatorios (OG) a i 0
b aob aob aob c boc ó
Hombre analizado
X
Y
A AB B AB A B AB AC BC BD
1 0.5 1 0,5 1 1 1 0,5 1 0.5
0,25 0.25 0,4 0,4 0,65 0,65 0.65 0,3 0.7 0,05
"Sistema hipotético con cuatro alelos codominantes p, q, ry s medidos por los marcadores A B, C y D
Fórmula para la frecuencia de Y P P g o p+q p+q p+q r
q+r s
X/Y 4 2 2,5 1.25 1,54 1.54 1.54 1.67 1.43 10
1398 s '
' "
SECCIÓN VII
•
PATOLOGÍA MOLECULAR
1
_
—
Tabla 67-6 F ó r m u l a de la probabilidad de paternidad (W) Se utiliza el teorema de Bayes para combinar p con Pl p = probabilidad previa de sucesos no genéticos Pl = resumen de los resultados de las pruebas genéticas
compartir el gen obligatorio paterno en todos los sistemas. Se puede calcular un Índice de paternidad utilizando una frecuencia para x que tiene en cuenta la posibilidad de que el difunto pudiera transmitir el marcador (Fig. 67-5). También se pueden realizar reconstrucciones utilizando datos procedentes de numerosos familiares supuestos, como se muestra en la Figura 67-6.
DOCUMENTACIÓN E INFORMACIÓN DE LOS RESULTADOS
lo otros valores de probabilidad previa, aunque introducen un sesgo contra el hombre analizado si son superiores a 0.5 y contra la madre si son menores de 0.5. Los valores matemáticos obtenidos a partir del cálculo del Pl o de la probabilidad tienen una significación especial debido a que en muchas jurisdicciones los valores informados pueden cambiar el estado legal de los interesados. Por ejemplo, la Minnesota Statute Section 257.55 transfiere el peso de la paternidad al hombre si la prueba indica que él es el padre con una probabilidad superior al 99%.
Estimación de la paternidad con un padre ausente
Los resultados de las pruebas de paternidad suelen utilizarse en los procedimientos jurídicos. Aunque la mayoría de las disputas de paternidad son acciones civiles, algunas jurisdicciones requieren documentos que muestren la cadena de custodia de las muestras de modo similar a los que se usan en asuntos cnmínales. Por tanto, deben documentarse todos los aspectos relacionados con los procedimientos utilizados, puesto que pueden estar expuestos a recusación por alguna de las partes. Es muy importante documentar la identificación de los individuos analizados, la obtención y etiquetado de las muestras, los procesos analíticos y la revisión de los resultados. Debe conseguirse la historia de transfusiones recientes (anteriores a tres meses) o de trasplante de células madre hematopoyéticas. También se debe acompañar cada muestra con una identificación fotográfica y el adecuado consentimiento informado. Para un menor, el consentimiento debe proceder del tutor legal de la custodia del niño.
Los AABB Standards requieren que el informe de los resultados de la prueSe puede proporcionar una estimación de la paternidad aunque uno de los ba incluyan lo siguiente: padres no esté disponible para el análisis. La situación más común es aquella en 1. El origen racial/étnico asignado a los supuestos padres la cual se dispone de muestras del hijo y del supuesto padre, pero no de la 2. Los fenotipos de cada persona analizada madre. En esta situación el hijo debe compartir al menos un gen de cada locus 3. Una opinión sobre si el supuesto padre puede ser excluido y la base con el hombre analizado. Las fórmulas (Tabla 67-7) para estimar el índice de para la exclusión, si la hubiera paternidad y su probabilidad son similares a las empleadas en el análisis de tríos, 4. El índice de paternidad del individuo para cada sistema informado con la excepción de que las estimaciones deben incluir un ajuste para la fre5. El Índice de paternidad combinado y la probabilidad de paternidad cuencia del alelo transmitido por la madre ausente (Brenner, 1993). El cálculo es expresada como un porcentaje, así como la probabilidad previa utilizamás complicado si la mujer ausente y el hombre no analizado son de razas difeda en el cálculo rentes (Traver, 1996). Sí el hombre analizado o el niño presentan dos marcado6. Una explicación de los resultados no concluyentes o inusuales (posible res en un locus, ninguno de los cuales está presente en el otro individuo analimutación observada) zado, el hombre analizado es excluido. También se sugiere la no paternidad si el La información acerca de los locus de RFLP de los individuos analizados niño y el hombre analizado presentan homocigosidad inversa. debe incluir la endonucleasa de restricción utilizada y la designación de la sonda usada. El fenotipo de los individuos debe informarse como el tamaño Reconstrucción de familias de los fragmentos de restricción en pares de bases o pares de kilobases o el Existen numerosas situaciones para las que es importante establecer una número de repeticiones en sistemas de STR'AFLP. Una opinión de no paterrelación entre los individuos. Esto ocurre cuando individuos, como los inminidad no es adecuada si existe una sola exclusión indirecta en un sistema clágrantes, intentan conseguir una condición, descubrir si tienen en común un sico o una exclusión aparente en un único locus de ADN. En algunos casos, padre o cuando existe una cuestión relacionada con la herencia. Los familiares cuando el Pl residual es alto (vale para todos los sistemas excepto los que pueden presentar sistemas en los cuales no se comparte ningún gen, ya que presentan exclusiones aparentes), puede ser necesario realizar pruebas en únicamente un padre y un hijo comparten al menos un marcador de cada locus. sistemas adicionales cuando sólo dos locus tienen resultados discrepantes. Se utilizan fórmulas que tienen en cuenta los marcadores que pueden ser compartidos por descendientes para estimar la cercanía de la relación entre dos individuos (Wenk, 1986). Los hermanos verdaderos presentan una posibilidad CONCLUSIÓN de 0,25 de no compartir un marcador en un sistema, mientras que los hermanastras, tías o tios presentan una posibilidad de 0.5. En casos en los que el Mediante análisis de múltiples sistemas genéticos, pueden obtenerse pruesupuesto padre ha fallecido, se puede reconstruir su probable fenotipo si se rea- bas científicas que ayuden a resolver los casos de paternidad discutida y liza la prueba en sus padres (Mayr. 1983). El hijo y los supuestos abuelos deben cuestiones sobre las relaciones de parentesco Aunque la tecnología actual Tabla
67-7 Cálculo de la p r o p o r c i ó n del sistema* (índice de paternidad) c u a n d o sólo se analiza un padre Hijo
Padre analizado
A A A AB AB AC BC AD
A AB BC B AB AB A BD
G e n e s paternos del hijo a a b ao b a d
G e n e s obligatorios de otro p a d r e a a a ao b ao b ao c boc aod
-Sistema hipaetico con cuatro marcactores A. B. C y D (frecuencias génicas a = p. b = q. c = r y d = s)
Fórmula para calcular la proporción del sistema 1/P 1/2p Exclusión M2q (p + q)IApq 1/4p Exclusión 1/4s
CAPÍTULO 67
•
Sistema
PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES. HIJO
Madre
(Hi
..Abuelo.'* /.Abuela.'*
¿Fenotipos
F ó r m u l a para
posibles del
calcular el
presunto
índice del
padre?
sistema
D12S11 (Pst1)
11.47; 12.85
12.85; 13,76
11,47
9,75; 11.47
11.47; 12,5
9.75; 12,5 11,47; 12,5 9.75; 11,47 11,47
D17S79 (Pst1)
3.31; 3.45
3,37; 3.45
3.31
3,45: 3,82
3,31; 3.52
3,31; 3.31; 3.45; 3.52:
vWA
16. 17
16. 17
16o 17
14. 15
16
3,45 3.82 3.52 3.82
14. 16
0.5/p
0,25/p
0,5/p • q
15. 16
TPOX
8, 11
10, 11
8
8. 10
8
8, 10 8(8.8)
0.75/p
D7S820
10
10. 13
10
10
10
10(10. 10)
1/p
"La interpretación asume que el supuesto padre fallecido es el rujo de las personas analizadas: p y g son las frecuencias de los genes obligatorios. En este caso se analizaron los supuestos padres del presunto padre fallecido para reconstruir su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obligatorio paterno (OG) está presente en uno de los supuestos abuelos del hijo. Nota: para vWA. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El índice de paternidad y la probabilidad de paternidad se obtienen multiplicando los valores de cada sistema.
Figura 67-5. Análisis de una familia para establecer la paternidad. En este caso, los supuestos padres del presunto padre fallecido fueron analizados para reconstruir su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obligatorio paterno (OG| está présenle en uno de los supuestos abuelos del hijo Nota: pata vWa. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El índice de paternidad y la probabilidad de paternidad se obtienen multiplicando lo valores de cada sistema.
1399
SECCIÓN VII
1400
Presunto padre 1
Presunto padre 2
D2S44
1,56. 3,24
2,12. 2,61
D7S467
3,71, 4.32
DI0S28
Sistema
•
PATOLOGÍA MOLECULAR
Hijo 1
Hijo 2
Hijo 3
Hijo 4
1,75. 3,24
1,75, 2,61
1,75. 2,12
1.75, 2,61
3,54
3.62. 3.71
3,54, 3,80
3,54, 3,62
3.54, 3,62
1,53, 1.92
1,75,2,42
1.53. L84
1.84, 2,42
1.75. 1.98
1.98, 2,34
vWA
14. 20
16. 17
15. 20
15. 17
16, 18
17, 18
IHOl
8, 9
6, 9
8, 9,3
6 9.3
6, 7
8, SL3
TPOX
8. 11
8, 10
8 (8,8)
8. 12
10, 12
8 (8.8)
CSF1PO
10, 11
11. 12
10, 14
12. 14
9. 12
11. 14
D5S818
13, 14
11, 12
10, 14
10. 12
12(12, 12)
12(12, 12)
D7S820
8, 9
8, 11
io. u
10, 14
13, 14
D13S317
11. 12
8. 10
12, 14
8, 10
10 14
10 (10, 10)
D16S539
12. 15
9, 11
8, 15
8. 11
11, 13
9, 13
IO.
13
Los cuatro hijos de este estudio familiar pudieron tener la misma madre. El probable marcador materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. El presunto padre 1 comparte un marcador con el hijo 1 en todos los sistemas analizados. Él fue excluido como el posible padre de los hijos 2, 3 y 4 (D2S44, D7S467. D10S28, vWa, D5S818, D7S820. D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se excluyó como el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28, vWa, TH01, CSF1P0, D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). También tue excluido el presunto padre 2 como el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analizado carece de 1,98 y de 2.34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 encontrados en el hombre analizado). Los hallazgos de una posible coincidencia entre el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el verdadero padre podría ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.
Figura 67-6. Estudio de una familia (la supuesta madre ha fallecido). Los cuatro hijos de este estudio familiar pudieron tener la misma madre. El probable marcador materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. El presunto padre 1 comparte un marcador con el hijo 1 en todos los sistemas analizados. Él fue excluido como el posible padre de los hijos 2.3 y 4 (D2S44, D7S467. D10S28. vWa. D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se excluyó como el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28. vWa. TH01, CSF1PO, D5S818, D7S820, D13S317 y D16S539). También fue excluido el presunto padre 2 como el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analizado carece de 1,98 y de 2,34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 encontrados en el hombre analizado). Los hallazgos de una posible coincidencia entre el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el verdadero padre podría ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.
C A P Í T U L O 67
•
PRUEBAS D E P A T E R N I D A D : E M P L E O DEL ADN, P O L I M O R F I S M O Y O T R O S M A R C A D O R E S .
proporciona exclusiones de más del 99% de hombres acusados en falso, no es posible excluir a todos los que no son padres, y tampoco es posible demostrar la paternidad mediante pruebas de laboratorio. Cuando no se encuentra exclusión, las estimaciones matemáticas derivadas de las pruebas de marcadores genéticos son una fuente significativa de datos que puede utilizarse para establecer la paternidad.
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1401
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C A P I T U L O
68
Pruebas forenses de identidad mediante análisis del ADN Victor W. Weedn, M.D., J.D. Rhonda K. Roby, M.P.H. USOS DEL ADN
1402
VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGÌA TRADICIONAL
1403
POLIMORFISMOS
1404
MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL ADN
1404
Análisis de RFLP Pruebas de PCR Transferencias en mancha basadas en la PCR AFLP y STR
DEGRADACIÓN DEL ADN Y DAÑO AMBIENTAL
1410
RECOGIDA DE MUESTRAS
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EXTRACCIÓN DEL ADN
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NORMAS DE GARANTÍA DE LA CALIDAD
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DESAFÍOS LEGALES
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BASES DE DATOS DE ADN
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BIBLIOGRAFÍA
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Marcadores de género y del cromosoma Y Secuenciación del ADN mitocondrial Instrumentación
El primer uso a gran escala de las pruebas de ácido desoxirribonucleico (ADNI no se realizó en los diagnósticos médicos, sino en los forenses (cnminalisticos y de análisis de la paternidad) (Weedn, 1993). Se atribuye a Sir Alee Jeffreys el primer informe aparecido en la bibliografía científica, en el cual propone que el tipado de ADN podría ser de utilidad en la identificación forense y acuñó el término "huella de ADN" en su articulo de Nalure (Jeffreys, 1985b, 1985c). Los laboratorios comerciales comenzaron el estudio de casos de paternidad y criminalisticos mediante el empleo de la prueba de ADN en 1986, (üfecoúes. 1986: Cellmark. 1987: Forensic Science Associates, 1986); a (males de 1988. los laboratorios criminalísticos gubernamentales incorporaron estas pruebas (FBI. diciembre de 1989, Virginia, marzo de 1989). Las pruebas forenses de ADN han reemplazado prácticamente por completo a la serología tradicional como medio de análisis de las muestras biológicas. El conjunto de las pruebas forenses de ADN ha estado sometido a numerosos cambios en cuanto a métodos y tecnologías, aunque parece haberse decidido actualmente por un grupo de 12 locus de STR, que serán los pilares de estas pruebas en un futuro próximo. Este grupo de locus se complementa con el análisis de género (amelogenína) y con la secuenciación del ADN mitocondrial. La principal plataforma instrumental es la electroloresis capilar, aunque también se están empleando otras plataformas.
USOS DEL ADN Salvo por la presencia de testigos o en caso de confesión, la capacidad para identificar a una persona en la escena del crimen sólo puede llevarse a cabo mediante la huella digital o una prueba de ADN (Peterson, 1991). Cualquier otra prueba sólo sugiere una conexión sospechosa. Por ejemplo, los "pequeños detalles" de las marcas que el cañón de la pistola deja en una bala, pueden vincular específicamente esa bala con una determinada pistola, aunque no implicarán al presunto sujeto que la disparó. Las huellas digitales y el ADN permiten la identificación directa del individuo, debido a que son personales y. como sucede normalmente en biología, presentan variación biológica. Concretamente, el ADN es útil como marcador de identidad
por diversas razones: 1) está presente en todas las células del organismo (excepto en los glóbulos rojos maduros). 2) es el mismo en todas las células del organismo (excepto en los gametos sexuales haploides). 3) no cambia durante el curso de la vida (excepto mutaciones) y 4) es diferente en todos los individuos (excepto en gemelos idénticos). Sólo recientemente, se ha considerado la prueba de ADN como una prueba de identificación positiva, más que únicamente una prueba estadística (aunque firme) de identificación. El FBI considera actualmente el resultado del perfil de ADN con un poder de discriminación de 10 veces la población de Estados Unidos, lo que permite asegurar que una determinada muestra de ADN procede de un determinado individuo. De acuerdo con el principio de transferencia de evidencias de Locard, normalmente se dejan restos biológicos en la escena del crimen que pueden vincularse con el autor. La prueba de ADN vincula al sospechoso con la escena, pero no es por si misma una prueba del delito. Por ejemplo, la evidencia de restos de semen no demuestra una violación (p. ej., el semen recuperado de una presunta víctima de violación puede haberse depositado a través de un contacto sexual consentido). Seguro que sería evidente un mayor impacto de la prueba del análisis de ADN. con la salvedad de que en numerosos delitos: 1) no se encuentran pruebas biológicas para analizar. 2) no existen muestras de ADN de referencia para su comparación o no hay sospechoso, y 3) el tipado del ADN no es trascendente para el caso, el ADN no demuestra culpabilidad o inocencia. No obstante, la prueba de ADN ha supuesto una revolución en los análisis criminalísticos. Actualmente la prueba de ADN se realiza de modo sistemático en el laboratorio criminalístico y es admitida en los tribunales. En Estados Unidos, se aplica aproximadamente a tres cuartas partes de los abusos sexuales y a una gran proporción de homicidios. Las pruebas de ADN exculpan al sospechoso acusado en un tercio de los casos, no son concluyentes en una cuarta parte y descubren al sospechoso del delito en algo menos de la mitad de los casos. Sólo son litigados una parte de los casos en los cuales se analizan restos de ADN. puesto que la mayoría son acordados entre las partes. La escena del crimen presenta una gran cantidad de pruebas físicas; sin embargo, muchas no se recuperan y otras no son remitidas a los laboratorios
CAPÍTULO 68
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PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANÁLISIS DEL A D N
de criminalística (Parker, 1970), En un estudio, Parker y Peterson descubrieron que se podían recuperar objetos físicos en el 95% de los casos de atracos residenciales, en el 85% de robos, en el 83% de lesiones y en el 100% de asesinatos. Durante el periodo que duró el estudio, sólo se revisaron en el laboratorio 489 de los 8.203 casos delictivos informados. En un estudio posterior, Peterson (1984) sólo encontró informes de laboratorio en una cuarta parte de los archivos liscales (la gran mayoría de los delitos nunca se convirtieron en archivos fiscales), aunque con diferencias según el tipo de delito (p. ej., cerca del 100% de asesinatos y menos del 20% de robos). Parker observó en su estudio que la mayoría de escenas del crimen presentaban numerosas clases de pruebas físicas, encontrándose de forma frecuente "sangre', "pelo" y "manchas de material orgánico, vegetal, animal y desconocidas" en prácticamente todas las categorías de delitos. Se registraron restos de sangre en el 2% de atracos residenciales, en el 14% de robos, en el 60% de lesiones y en el 60% de asesinatos. Se encontró material orgánico, vegetal y animal, junto a manchas desconocidas en el 35% de atracos residenciales. 15% de robos, 20% de lesiones y 40% de asesinatos. Se halló pelo en el 6% de atracos residenciales y en el 10% de robos. Se encuentra ADN tanto en semen y sangre como en saliva, pelo, células de la piel, orina, heces y otras muestras biológicas. La saliva puede recuperarse a partir de chicles, colillas de cigarros, cartas o un vaso. Las raspaduras de uñas y las uñas rotas son útiles por sí mismas como muestras con restos de ADN. La cinta del pelo y posiblemente otras ropas pueden presentar restos de ADN. Se han recogido muestras de referencia de ADN en cepillos de dientes, máquinas de afeitar, mechones de pelo de bebé, muestras de biopsia. sobres y sellos. En el contexto criminalístico, se puede utilizar ADN para vincular un sospechoso a un delito, para exculpar a sospechosos falsamente acusados, para reconocer crímenes en serie y distinguir crímenes inspirados en otro; también pueden emplearse en la reconstrucción de un accidente, por ejemplo, para determinar quién conducía el coche medíante la identificación de las gotas de sangre en el lado izquierdo del parabrisas. Además del uso del ADN como prueba en las escenas de los delitos, también se emplea en la identificación de restos, cuando no están disponibles las huellas digitales, dentales u otros medios tradicionales de identificación (Weedn, 1998a). Los métodos tradicionales de identificación son dificultosos porque están sujetos a la descomposición, fragmentación, incineración parcial o ausencia de datos premortem de comparación. Cualquier fragmento de tejido o hueso puede identificarse por análisis de ADN. La disponibilidad de las familias como fuente de material de referencia para propósitos de comparación supera los grandes obstáculos de la identificación mediante la huella digital y dental y la falta de datos premortem de comparación. En la actualidad, algunos institutos forenses conservan una muestra de ADN, en forma de un pequeño carné con una gota de sangre, en el archivo procedente de las autopsias, por si posteriormente se cuestiona la identificación o por si se necesita como material de referencia para investigaciones forenses. El ADN se utiliza en la determinación de la especie y del género, así como en la identificación del grupo y del individuo (Sensabaugh, 1999). Los análisis de ADN de plantas y animales han sido fundamentales en la resolución de algunos delitos. La identificación de especie es importante en los casos de caza furtiva. En algunas ocasiones, se han localizado ciertos lugares o personas a través de restos de animales y plantas dejados como prueba. El ADN se emplea para la prueba de paternidad (véase Cap. 67). Aunque normalmente se aplica en pruebas civiles de paternidad para apoyo económico del hijo, también se realiza con propósitos criminalísticos, como en el caso del embarazo provocado por una violación o en el caso de un bebé abandonado. Las pruebas de identidad de ADN pueden usarse en la separación de muestras muy mezcladas (Weedn, 1993b). Los laboratorios de patología encontrarán una aplicación de la prueba de identidad de ADN cuando las muestras son involuntariamente cambiadas o el material patológico varía en una preparación histológica o citológica. Las pruebas sanguíneas de análisis clínicos pueden ser variables. Las pruebas de estupefacientes en orina, cuya eficacia se ha puesto en duda debido a supuestos cambios de muestra, pueden resolverse mediante pruebas de ADN. El análisis puede
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emplearse para confirmar o refutar la identificación de muestras de biopsia. Se puede determinar que un pequeño fragmento de tejido cancerígeno ("variable") en una preparación microscópica procede de alguien distinto al paciente.
La reina contra Pitchfork La primera investigación criminal basada en el tipado de ADN lúe realizada por Alee Jeffreys utilizando una forma inicial de análisis de RFLP en un caso doble de violación y asesinato en Inglaterra. En 1983, Linda Mann, de 15 años de edad, fue violada y estrangulada en el tranquilo condado de Leieestersriire. No se encontró ningún sospechoso. En 1986. Dawn Ashworth. de 18 años de edad, lúe violada y estrangulada a una mila del primer asesinato. Richard Buckland, que se había comportado de forma sospechosa, fue acusado formalmente del segundo asesinato y declarado sospechoso del primero. Jeffreys demostró que las muestras de semen procedían del mismo hombre, aunque no de Buckland. De este modo, antes de que el ADN luese usado para condenar a alguien por un crimen, sirvió para demostrar que alguien era inocente. La policía no tenia pistas, a pesar de las miles de declaraciones, datos informatizados y las 20.000 libras de recompensa. Pensando que el responsable debía ser un hombre de la localidad, la policía pidió a todos los hombres de la zona de entre 13 y 30 años que presentaran de forma voluntaria una muestra de sangre para su análisis; prácticamente todos los hombres lo hicieron; de hecho, un total de 4.500 hombres ofrecieron la muestra requerida (un hombre se negó por motivos religiosos). Colin Pitchfork faltó dos veces a sus citas para dar sangre en enero de 1987. En la tercera cita, después de intentar pagar a varias personas para sustituirle, persuadió con éxito a su compañero de trabajo, lan Kelly, explicándole que le preocupaba que él pudiese ser "incriminado" debido a sus condenas anteriores por exhibicionismo. Pitchfork colocó la loto de Kely en su pasaporte, hizo que Kely practicase su firma y le instruyó en detalles de su familia. Pitchfork consiguió eludir a las autoridades. Sin embargo, meses más tarde, en septiembre de 1987, Kelly, mientras bebía en un bar, se jactó ante sus amigos de cómo él habia donado sangre en lugar de su amigo Pitchfork. La policía se enteró de la sustitución. Kelly fue condenado por conspiración para tergiversar el curso de la justicia. Posteriormente, Pilchfork fue analizado adecuadamente. En unas semanas, la huella de ADN identificó al señor Pitchfork como el violador. En la primavera de 1988, fue declarado culpable y sentenciado de por vida a prisión (Wambaugh, 1989).
VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGÌA TRADICIONAL
Los marcadores genéticos han sido muy utilizados en medicina forense. Los análisis criminalísticos de muestras biológicas comenzaron con la aplicación del grupo sanguíneo ABO en estudios forenses a finales del siglo XX. Las pruebas serológicas se ampliaron para incluir el tipado de antígenos y grupos sanguíneos, isoenzimas de proteínas séricas y análisis de HLA. Muchas de estas pruebas tradicionales emplean reacciones inmunológicas que presentan genes nulos y supresores, antigenicidad débil, reacciones cruzadas, desnaturalización, agentes bloqueantes y modificación microbiana. La prueba de ADN carece de estos impedimentos característicos de las reacciones inmunológicas (Weedn, 1993a). Además, el ADN es el determinante fundamental de todos los marcadores genéticos. Un gen nulo o supresor es sólo otra secuencia de ADN. Analizando el ADN. se estudia el código genético, más que una información secundaria. Asimismo, debido a la degeneración del código genético, existen más diferencias en el ADN que las reflejadas en las proteínas que éste codifica. La primera gran ventaja de la prueba de ADN frente al análisis serológico tradicional es que puede aplicarse a cualquier material de origen biológico. El análisis serológico completo (los laboratorios criminalísticos han empleado tradicionalmente 12 marcadores genéticos) sólo puede realizarse en sangre y no en otros tejidos o líquidos biológicos. Por ejemplo, los característicos métodos tradicionales de serología de un frotis vaginal en un caso de violación, sólo incluirían factor secretor. ABO si el factor secretor es positivo y fosfoglucomutasa (PGM). Prácticamente se puede utilizar cualquier vestigio de material biológico para el análisis de ADN, incluyendo sangre, pelo, saliva, semen e incluso orina. La segunda gran ventaja de la prueba de ADN, la más divulgada, es el gran potencial de discriminación de los perfiles de ADN, permitiendo una identificación positiva. El análisis del grupo sanguíneo ABO puede distinguir aproxi-
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SECCIÓN VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
madamente uno de cada tres individuos y otros marcadores serológicos pueden diferenciar uno entre miles, mientras que los perfiles de ADN actualmente presentan valores de discriminación de uno entre trillones. Una tercera ventaja de las pruebas de ADN está en su sensibilidad, que es bastante superior a la de los marcadores serológicos tradicionales. El análisis mediante PCR es muy sensible, por encima de las pruebas iniciales de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). La prueba se puede realizar con éxito a partir de muestras diminutas e incluso con restos imperceptibles de trazas de ADN. Una cuarta ventaja del ADN es su resistencia a los factores ambientales (Kobilínsky. 1992). Es una molécula bastante resistente a los ácidos fuertes, álcalis y detergentes, mientras que no lo son los determinantes de las proteínas, lípidos e hidratos de carbono. Las proteínas se desnaturalizan con relativa facilidad, siendo la conformación de su estructura terciana muy importante para el tipado. Sin embargo, la información que se tipa en el ADN se encuentra dentro de la secuencia de nucleólidos. que es independiente del estado conformacional de la molécula. Asi, las pruebas de ADN se pueden realizar satisfactoriamente en muestras que son más antiguas y que han estado expuestas a importantes agresiones ambientales, a diferencia de los marcadores tradicionales. Una quinta ventaja es la capacidad para distinguir entre el ADN de los espermatozoides, el procedente de otras células y el bacteriano La mayor parte de los estudios realizados por los laboratorios crimínalísticos en Estados Unidos son de abusos sexuales. Los frotis vaginales contendrán bacterias, células epiteliales de la mujer y esperma del hombre. Esto representa un problema para las técnicas de tipado serológico tradicionales; en dos terceras partes de los casos, el semen no puede identificarse debido a que la mezcla de líquidos origina una mezcla de tipos serológicos (Davies, 1982). Sin embargo, el ADN procedente del esperma se puede distinguir de otros ADN. mediante un procedimiento de lisis diferencial, debido a la cápsula de protección del espermatozoide (véase en el apartado "Extracción del ADN"). Esto permite la individualización de la procedencia del semen, sin la confusión de datos que originan los restos distintos al semen. Las sondas de ADN son especificas de humanos o primates, de tal modo que la presencia de ADN bacteriano no es trascendente.
Caso de inmigración ghanés La primera ocasión en la que se empleó la prueba de ADN fue en el estudio de un caso de inmigración en 1985 Un chico procedente de Ghana intentó emigrar a Gran Bretaña, afirmando que su madre ya era residente. Las autoridades sospecharon que el chico era un primo Los marcadores genéticos convencionales (16 sistemas que incluyen el HLA) indicaron que el chico y la madre estaban relacionados, pero no pudieron distinguir si la mujer era su tía o su madre. Para complicar la cuestión, la madre tuvo alguna duda en cuanto al padre biológico del chico y no existían muésIras del padre de Ghana ni de ninguna de sus hermanas. Jeffreys determinó que el chico y las tres hermanas tenian el mismo padre y la misma madre Todas las bandas de la huela de ADN del joven sospechoso no encontradas en la madre coincidían con las bancas determinadas como paternas, procedentes de las tres hijas. Las posibilidades de que una hermana de la madre produjese el mismo grupo de bandas malernas fueron insignificantes y. por consiguiente, se permitió al chico entrar en el país para unirse a su madre (Jeffreys. 1985a).
POLIMORFISMOS El ADN de cada persona es único (excepto para gemelos idénticos), debido a la presencia de "polimorfismos", diferencias en el ADN entre los individuos. Sin embargo, gran parte de la secuencia del ADN es idéntica entre los individuos; lo refleja el hecho de que tengamos dos brazos, dos piernas, una nariz, etc.. siendo más parecidos que diferentes. Sólo 1 de cada 1.000 pares de nucleótidos difiere de media entre los individuos. No obstante, esto equivale a una media de 3 millones de pares de bases que difieren entre dos individuos cualesquiera, lo cual explica la gran variación genética entre individuos en cuanto al tipado sanguíneo, color de ojos, color del pelo, temperamento y otras características. Aunque es grande la diversidad de las regiones codificantes del ADN (genes), también las regiones no codificantes del ADN dan lugar a una gran diversidad, soliendo utilizarse en las pruebas forenses de
ADN. Se emplean distintos métodos de análisis de ADN para detectar los dos tipos de polimorfismos. Se encuentran polimorfismos de la longitud en el ADN repetitivo. Más del 90% del genoma humano está compuesto de ADN no codificante o "junk", del cual, aproximadamente del 20% al 30% está compuesto de regiones repetitivas. Muchas de las regiones repetitivas varian en el número de repeticiones entre individuos diferentes, denominados locus de repeticiones en tándem de número variable (VNTR). Los fragmentos de ADN que contienen VNTR vanan en longitud y por tanto son útiles para el análisis. Las repeticiones de dinucleótido son las más comunes, aunque las repeticiones más grandes son de mayor utilidad para los propósitos forenses. Los RFLP. los polimorfismos de la longitud de los fragmentos amplificados de ADN (AFLP) y las repeticiones cortas en tándem (STR), son ejemplos de técnicas analíticas de la longitud de los fragmentos. Existen polimorfismos de secuencia en fragmentos de ADN con un tamaño similar. Los polimorfismos de secuencia consisten en diferencias de una o más bases en la secuencia de ADN de una región determinada del genoma. Las variaciones de secuencia pueden manifestarse como regiones de alelos alternativos o de delecciones. adiciones o susliluciones de bases. La mayoría de los polimorfismos de secuencia son simples mutaciones puntuales dentro de regiones repetitivas y no repetitivas, conocidos como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Los SNP. las transferencias en mancha y las pruebas de ADN mitocondrial son ejemplos de pruebas basadas en la secuencia.
MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL ADN Análisis de RFLP Durante la primera década de su aplicación en los esludios de casos de individuos, el análisis de RFLP ha sido el método más utilizado en los análisis forenses de ADN (Southern. 1975; Weedn. 1989). Esta técnica permite la separación y visualizacíón de los fragmentos de ADN por su tamaño. La diana de los análisis forenses de RFLP es el ADN repetitivo, los locus de VNTR. en los cuales el número de unidades de repetición difiere entre los individuos. Los fragmentos de ADN que contienen VNTR se obtienen a partir de enzimas de restricción que cortan el ADN cromosómico. La longitud de cada fragmento se denomina "alelo". Por tanlo. se analizan los fragmentos de ADN cortados ("restricción") que difieren (son polimórficos) en tamaño (longitud) entre los individuos (Fig. 68-1). Las primeras sondas empleadas por Jeffreys hibndaban de modo no específico con numerosos locus dentro del genoma y producían un patrón complejo parecido a un código de barras, específico de cada individuo (Jeffreys, 1985b, 1985c). La comunidad forense propuso cambiar estas sondas multilocus (MLP) por sondas de un solo locus (SLP), en las cuales sólo se originan un par de alelos, uno materno y otro paterno. Las SLP son más sensibles, más constantes y producen resultados que se manejan mejor mediante la estadística de poblaciones tradicional. Una SLP de RFLP característica puede tener aproximadamente una secuencia de repetición de VNTR de 70 bases. Los fragmentos de RFLP varían en tamaño entre 0.5 kb y 10 kb. Los seis pasos del análisis de RFLP, después de la extracción de ADN y la cuantificación, son: 1) digestión del ADN en fragmentos mediante enzimas de restricción; 2) separación de los fragmentos por tamaño, utilizando electroforesis en gel de agarosa: 3) desnaturalización de los fragmentos de ADN bicatenarío en formas monocatenarias, mediante soluciones con pH básico y transferencia e inmovilización de los fragmentos de ADN en una membrana de nailon, un proceso conocido como transferencia Southern; 4) permitir que sondas radiactivas hibriden con los fragmentos inmovilizados en la membrana; 5) exposición de la radiactividad procedente de las sondas sobre una película de rayos X en un proceso denominado autorradiografia y 6) determinación del tamaño de los fragmentos, mediante comparación de las bandas de la muestra con las bandas de fragmentos de un control en el autorradiograma resultante. El autorradiograma originado a partir de una sonda de un solo locus presenta dos bandas (alelos materno y paterno) en cada carril, en el caso de un sujeto heterocigoto, o una sola banda, en el caso de un individuo homocigoto. Aclualmente. la autorradiogralía ha sido reemplazada por técnicas de delección fluorescente o quimioluminiscenle. Se han desarrollado sistemas automáticos de proyección de imágenes analíticas (Fig 68-2).
CAPÍTULO 68
PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANÁLISIS DEL A D N
RFLP clásico
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RFLP de VNTR
Figura 68-1. Dos tipos de análisis de RFLP. El RFLP clásico está basado en el tamaño del fragmento cortado por una enzima de restricción en la secuencia de una mutación o un polimorfismo. El análisis de RFLP basado en locus hipervarlables varia en tamaño debido a las repeticiones en tándem de número variable (VNTR). (Modificado de National Research Council: ADN Technology in Forensic Science. Washington, DC. National Academy Press. 1992, con autorización.)
Los análisis de RFLP o transferencia Southern son muy potentes y representan la tecnología más poderosa de tipado del ADN, produciendo valores de discriminación de uno entre cientos de millones o incluso superiores. No obstante, es un proceso laborioso que lleva mucho tiempo (de seis a ocho semanas). Además, requiere una cantidad sustancial de ADN no degradado (alto peso molecular) para el análisis. La resolución y la imprecisión de la medición de los sistemas de RFLP no permiten determinaciones exactas diferenciadas por una sola repetición. Esta imprecisión de la medición origina una distribución continua de las determinaciones alélicas de tamaño, en lugar de bandas alélicas diferenciadas. Por tanto, empleando el análisis tradicional de RFLP. no puede decirse con certeza que un fragmento determinado con un tamaño de 4,32 kb sea el mismo u otro diferente que un fragmento determinado con un tamaño de 4,33 kb. Aunque el análisis de RFLP es una excelente técnica forense, ha sido desplazada por técnicas basadas en la PCR debido a su gran sensibilidad, aphcabilidad a muestras degradadas, producción de resultados alélicos diferen-
ciados, procesamiento más rápido, simplicidad y capacidad para ser automatizadas.
Florida contra Andrews Tommie Lee Andrews se convirtió en la primera persona en ser condenada por un crimen de violación, utilizando la prueba de tipado de ADN. Durante la primavera de 1986, se cometieron una sene de violaciones en la zona sur de Orlando, Florida. La primera victima fue Nancy Hodge. de 27 años de edad. Durante 1986, se pensó que el mismo hombre había sido el responsable de 23 incidentes, como acosar, forzar y entrar en hogares de mujeres y por tentativas de abusos sexuales o violaciones. El modus operan* era característico. Pasada la medianoche, el agresor, empuñando un cuchilo, se introducía en el hogar de la victima, sorprendía a ¡a muier en la oscuridad y cubría su cabeza con una sábana o una manta. Durante el abuso sexual, él encendía y apagaba la luz. Tras la agresión, solía levarse su permiso de conducir. En 1986. se registraron 23 incidentes. En lebrero de 1987, una mujer de 27 años de edad fue golpeada, acuchilada y repetidamente violada, mientras sus dos hijos pequeños dormían en la habitación de al lado. Su cabeza lúe envuelta por un saco de dormir. Agentes vestidos de
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PATOIOGÍA MOLECULAR
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Pruebas de PCR La prueba de la PCR no sólo ha revolucionado las ciencias biológicas, sino también los análisis forenses de ADN. Las pruebas de RFLP del ADN han sido reemplazadas por métodos basados en la PCR, que incluyen sistemas de transferencia en mancha, AFLP, STR y secuenciación directa del ADN mitocondnal. La PCR fue descrita por primera vez en 1985 (Saiki. 1985); su invención se atribuyó a Kary Mullís, que fue distinguido con el premio Nobel de química en 1993. El concepto inicial se demostró mediante el tipado de la cadena << de la hemoglobina, aunque su primera aplicación comercial fue el análisis de transferencia en mancha del sistema HLA DQA1. El primer caso en el que las pruebas de ADN se introdujeron en un juzgado de Estados Unidos fue el de Pennsylvanía contra Pestinikas en 1986. que consistió en el análisis del sistema HLA DQ-H (Commonwealth ol Pennsylvanía v Pestinikas. 19881 La PCR permite tipar el ADN de un modo rápido y sensible. La sensibilidad puede ser critica en temas lorenses. ya que ciertos tipos de pruebas no tienen el suliciente ADN como para poderse analizar mediante técnicas tradicionales de serología o análisis de RFLP. Además, el ADN diana, amplificado a partir del ADN original, puede detectarse incluso mediante tinciones no especificas de ADN, como la tinción con plata: asi, se evita la necesidad de emplear sondas marcadas frente a los fragmentos del ADN diana. Por consiguiente, los análisis de PCR no requieren ni hibridación ni transferencia Southern, permitiendo su automatización. Durante el proceso de amplificación, los amplicones de ADN también se pueden marcar específicamente o modificar mediante una molécula señal (p. ej„ un fluoróforo). Las pruebas basadas en la PCR. a diferencia de los RFLP. normalmente producen resultados tipables cuando la muestra de ADN está muy degradada, como en los tejidos de cadáveres, sangre expuesta al medio ambiente e incluso tejidos teñidos, fijados con formalina e incrustados con parafma en un portaobjetos de vidrio. Las tecnologías de PCR no son sensibles a la degradación porque, en primer lugar, los locus del ADN diana son pequeños, y porque sólo se necesita que algunas copias permanezcan intactas para producir cantidades detectables de producto amplificado. Por el contrario, los análisis de RFLP son muy sensibles a la degradación.
Figura 68-2. Autorradiografia de RFLP de un solo locus genético en un caso de violación. Los carriles de izquierda a derecha son: 1) escala de tamaños de fragmentos estándar de ADN: 2) K562, una linea celular estándar con dos bandas de peso molecular conocido; 3) muestra del control de calidad interno del laboralono: 4) muestra de referencia estándar del sospechoso: 5) muestra de referencia estándar de la victima; 6) escala de tamaños de fragmentos estándar; 7) fracción de células epiteliales procedentes del frotis vaginal; 8) fracción de espermatozoides procedentes del frotis vaginal; 9) escala de tamaños de fragmentos estándar de ADN. El perfil de ADN generado a partir de la fracción de células epiteliales (carril 7) coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estándar de la victima (carril 5). El perfil de ADN generado a partir de la fracción de espermatozoides (carril 8) coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estándar del sospechoso (carril 4). No se puede excluir al sospechoso como posible donante del ADN extraído de los espermatozoides del Irolis vaginal.
Los fragmentos más cortos, analizados mediante técnicas de tipado del ADN basadas en la PCR. requieren sistemas de detección de alta resolución. Estos sistemas de mayor resolución presentan la gran ventaja de producir resultados dilerenciados (o semidiferenciados), es decir, resultados alélicos, a diferencia de los análisis de RFLP, que originan una gama de tamaños repartidos en distintos intervalos de confianza, ya que la imprecisión real es menor que la del tamaño de los fragmentos alélicos.
Las pruebas basadas en la PCR son potentes, aunque presentan algunas desventajas. En general, los sistemas genéticos analizados mediante tecnologías basadas en la PCR tienen menor poder de discriminación (son menos informativos) que los sistemas genéticos de RFLP. No obstante, el poder de discriminación es aceptable, y se incrementa con sistemas adicionales. Otra desventaja es su susceptibilidad a la inhibición por medio de diversos factores, como el hemo de la sangre. También puede producirse una amplificación preferente de un alelo sobre otro, onginando una "marginación alélica". Igual que en las pruebas de RFLP. los alelos de mayor peso molecular pueden no detectarse si la muestra de ADN está muy degradada. Además, los cebadores específicos pueden ser más eficaces con un alelo que con otro, provocando un aumento en la producción del alelo favorecido. Por otra parte, la sensibilidad paisano vigilaron el vecindario El coche patrulla de reconocimiento descubrió un vehíextrema de los sistemas de PCR hace que sean susceptibles de contaminación culo que huia a toda velocidad procedente de la zona y lo siguió durante milas antes de que se estrelase contra un poste El conductor. Tommy Lee Andrews, fue detenido por ADN. De hecho, esta facilidad de contaminación cruzada es la única preocupación importante de las pruebas de PCR. por lo cual deben tomarse las precomo sospechoso de merodear, tras la persecución a elevada velocidad y el accidente. cauciones apropiadas. Aun asi. la PCR puede realizarse con fiabilidad, incluso Él vivía a tres milas de la primera víctima. Nancy Hodge. de 27 años de edad. A la mañana siguiente, Hodge le identificó de entre una sene de fotos. El tipado sanguíneo con pruebas no útiles en los análisis de RFLP, sólo demostró que él y el violador formaban parte del tercio de la población con el mismo tipo sanguíneo Ni su cara, ra su voz fueron reconocidas por la señorita Hodge. Pennsylvanía contra Pestinikas La habitación estaba oscura y el violador hablaba en voz baja El señor Andrew tenia una coartada y la policía sólo contaba con una par de huelas digitales en una pantala La primera vez que se introdujo la prueba de ADN en un ;uzgado de Estados Unxlos extenor de la casa de la victima. En octubre de 1987. Lifecodes determinó que el ADN fue en un caso de 1986, aunque la prueba no fue la base para la disposición del caso. de la sangre de Andrew coincidía con las muestras de semen obtenidas de las victimas. Los trabajadores de un asilo habian sido acusados del homicidio por negligencia de un Un mes más tarde, se perdió el juicio a pesar de que Hodge identilicó de forma positianciano que parecía haber muerto de hambre. Se cuestionaron los resultados de la va a Andrews. Sin embargo, el 6 de noviembre de 1987. Andrews fue condenado y sen- autopsia y se procedió a la exhumación. En respuesta, el médico de la autopsia inicial tenciado a 22 años de cárcel en un juicio de violación distinto. Durante 1988 en un alegó que los órganos internos habian sido cambiados por los de otro cuerpo. El cuernuevo juicio sobre su acusación inicial, se produjo un veredicto de culpabilidad y se le po había sido embalsamado y enterrado hacía un año La prueba de ADN del sistema condenó a 78 años adicionales de prisión [State v Andrews. 1987| HLA DQ-a fue realizada por Ed Blake de la Forensic Soence Associates. El ADN esta-
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PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANÁLISIS DEL A D N
ba muy degradado (el tamaño medio de los fragmentos fue de 100 bp). Los fragmentos amplilicados del locus HLA de 82 bp procedentes de los órganos internos coincidieron con los de otros tejidos del organismo. Los acusados tueron condenados por homicidio negligente, aunque absueltos de la acusación de manipular con el cuerpo. (Commonwealth ol Pennsylvania v Pestinikas, 1988)
Transferencias en mancha basadas en la PCR El protolipo de ejemplo de técnicas de detección de polimorfismos de secuencia es la transferencia en mancha. La transferencia en mancha consiste en una serie de sondas de ADN para detectar secuencias diana. Una sonda oligonucleotídica específica de secuencia (SSO), también denominada sonda oligonucleotidica específica de un alelo (ASO), es un fragmento de ADN monocatenario lo suficientemente grande como para conferir especificidad, aunque lo bastante corto para desestabilizarse por un solo nucleótido incompatible, uniendo asi únicamente la secuencia complementaria exacta. Las sondas SSO se emplean para detectar la presencia o ausencia de tipos alternativos de secuencias.
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clásico de tipado del grupo sanguíneo MN. GC es un polimorfismo de proteínas séricas en humanos que ha sido isotipado durante años por los laboratorios criminalísticos, empleando métodos de análisis de proteínas. Los otros tres sistemas no han sido utilizados con anterioridad en estudios de casos criminalísticos. Cada uno de los sistemas Polimarker delecta únicamente dos o tres aletas. Cuando el sistema Polimarker se combina con DQA1. el poder de discriminación se incrementa hasta uno entre dos mil. Las transferencias en mancha también se han utilizado en el análisis de las regiones hipervariables del ADN milocondrial.
Illinois contra Dotson La primera vez que un acusado usó la prueba de ADN fue a partir de la apelación de la condena de Gary Dotson por la violación de Cathleen Webb en Illinois. 1977. Dotson lúe condenado por las acusaciones de la señorita Webb y el testimonio de imposición legal en base al grupo sanguíneo ABO. por el que formaba parte del 10% de la población caucásica con el mismo tipo de semen que el encontrado en la ropa interior de la señorita Webb. Más tarde. Webb se relractó de su acusación contra Dobbson. Se descubrió entonces un error en el tipado del grupo ABO, revelando que, de hecho, el semen podía pertenecer al 66% de la población. No obstante, Dotson no fue indultado. El profesor Jeffreys no fue capaz de tipar la muesira de 10 años de antigüedad usando la huella genética de RFLP. Ed Blake, de la Foiensic Associates, empleando la prueba del sistema HLA DQ-r< mediante PCR, lúe capaz de establecer una exclusión creíble. Dotson lúe indultado en 1989 {Illinois v Dotson. 1989).
En los formatos tradicionales de transferencia en mancha, la muestra amplificada de ADN se fija a una membrana y se explora con una sonda ASO (cualquier sonda no fijada se lava); observándose un resultado positivo de la prueba por medio de la reacción colorimétrica producida por una enzima ligada a la sonda. Los equipos de reactivos comerciales utilizan una transferencia en mancha inversa, en la cual la sonda se fija a la membrana y posteriormente se añade la muestra amplifica de ADN. Los resultados, positivos o negativos, de la pre- AFLP y STR sencia de una determinada secuencia se determinan visualmente; por tanto, los El análisis de AFLP consiste en la separación electroforética por tamaño de patrones de manchas azules de la tira indican un genotipo especifico. fragmentos polimórfícos de ADN producidos por amplificación, en lugar de por escisión (análisis RFLP). El HLA DQA1 (anteriormente conocido como DQ-«) y el Amplitype Los locus de VNTR empleados en el análisis de AFLP son más pequeños PM+DQA1 (comúnmente conocido como el sistema Polimarker) son sistemas que los locus de RFLP: por tanto, los fragmentos diana amplificados son más comerciales de transferencia en mancha inversa empleados en criminología pequeños. En consecuencia, los AFLP requieren geles de poliacrilamida de (PE 6/osysfems). Los equipos de reactivos de la prueba han demostrado ser alta resolución, en vez de los geles de agarosa de baja resolución utilizados en potentes análisis, fáciles de realizar. No se necesita más equipo que un terlos análisis de RFLP. La poliacrilamida es lo bastante fuerte como para que mociclador. El analista puede realizar la prueba en menos de un día. El anápueda manipularse, al contrario que la agarosa. evitando asi la necesidad de lisis se realiza de modo satisfactorio a pesar de que la muestra esté degrala transferencia del ADN (transferencia Southern) a una membrana de nylon. dada, aunque los locus genéticos más grandes pueden no amplificarse cuanLa concentración de productos amplificados por PCR es tan superior al ADN do están presentes locus genéticos más pequeños. Estos sistemas de transpresente inícialmente que no es necesaria la hibridación del ADN diana ferencia en mancha se han introducido de modo generalizado en los tribunamediante una sonda marcada, pudiéndose teñir directamente el contenido total les, y han recibido la aceptación de los juzgados. de ADN con una tinción de plata u otra tinción no especifica. De modo alterEl HLA DQA1 es un sistema genético único. En la versión inicial, existían 21 nativo, se puede marcar el ADN durante el proceso de amplificación, añadiengenotipos posibles del sistema, procedentes del emparejamiento de seis aledo una marca fluorescente. La imagen de los geles resultantes puede proyectas: 1.1, 1.2,1.3, 2, 3 y 4: el poder de discriminación resultante sería de uno tarse automáticamente sobre un escáner de fluorescencia. Debido a la elimientre veinte. Posteriormente, el alelo 4 se fraccionó en tres aletas distintos (4.1, nación de la transferencia Southern y de la autorradiografia, el análisis de 4.2 y 4.3). dando lugar a un mayor poder de discriminación (Fig. 68-3). La lira AFLP se puede realizar en uno o dos días, en lugar de las semanas necesade transferencia en mancha Polimarker analiza cinco locus genéticos diferenrias para tas análisis de RFLP. tes: el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), la glucoforina A (GYPA), la cadena y de la hemoglobina (HBGG). D7S8 y el componente específico de grupo (GC) (Fig. 68-4). La glucoforina A es el sistema genético Figura 68-3. Tiras de sondas de ADN del sistema AmpliType HLA DQA1 que muestran los resultados obtenidos en un caso de asesinato. Las tiras de la parte superior a la parte inferior son: 1) muestra de referencia estándar de la víctima (4.1,4.2/4.3); 2) muestra de reterencia estándar del sospechoso #1 (1.1); 3) muestra de referencia estándar del sospechoso #2 (4.1,4.2/4.3); 4) prueba de gota de sangre recuperada del apartamento del sospechoso (4.1. 4.2/4.3); 5) prueba de una muestra de pelo recuperada del cuerpo de la victima (4.1. 4.1); 6) control #1 o muestra de control de calidad positivo (1.1,4.1): 7) ADN de control #2 o control negativo (sin ADN). El perfil de ADN generado a partir de la prueba de la gota de sangre (tira 4) recuperada del apartamento del sospechoso coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estándar de la victima (tira 1). No se puede excluir al sospechoso #2 (tira 3) como el donante de la muestra de pelo (tira 5) procedente del cuerpo de la victima. La víctima no puede ser excluida como donante de la prueba de la gota de sangre. Se puede excluir al sospechoso #1 (tira 2) como el donante de la prueba de la muestra de pelo y de la mancha de sangre.
Puesto que se pueden separar las repeticiones de cada individuo, es posible la determinación de aletas diferenciados. Los resultados de RFLP se
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Figura 68-4. Tiras de sondas de ADN del sistema AmphType PM que muestran los resultados en un caso de robo. Tanto el sospechoso #1 como el sospechoso #2 pueden ser excluidos como los donantes del material de la prueba. informan como determinados tamaños de banda con cierto grado de imprecisión; los resultados de AFLP se informan como alelos, determinados por el número de repeticiones. Lo ideal es que los alelos consten de secuencias repetidas con fidelidad, pero algunos alelos no concuerdan en la secuencia y otros presentan una repetición parcial. Los sistemas de PCR actuales alcanzan la suficiente resolución como para revelar diferencias ocasionales en la región de repetición, originando una ligera varíancia de longitudes o cambio de movilidad, también denominado microheterogeneidad de alelos microvariantes. Los primeros AFLP descritos incluían: D1S80. DI7S30 (también denominado D17S5), colágeno A (ColA) y APOB (un polimorfismo 3' de repetición de secuencia del locus de la apolipoproteína B). Estos AFLP iniciales consistían en secuencias de repetición mayores de 8 bp, conocidos como "minisatélites" o regiones de "repetición larga en tándem" (LTR). En la actualidad, el D1S80 es el sistema mejor desarrollado y está disponible comercialmente (Fig. 685). El locus D1S80 presenta un elemento de repetición de 16 bp y sus fragmentos amplificados varían entre 369 bp y más de 801 bp. Las regiones que presentan secuencias de repetición de 2 bp a 8 bp. se denominan "microsatélites" o regiones de "repetición corta en tándem" (STR)
(Butler, sitio web; Weedn, 1998c). Los fragmentos de STR son bastante más pequeños que los de LTR, con longitudes medias del orden de 200 bp. En el genoma humano, existen más de 30.000 locus distintos de STR conocidos. Se prefieren los fragmentos de STR más cortos a los AFLP iniciales de LTR. debido a su menor susceptibilidad a la degradación y a su amplificación preferente. La "marginación alélica" no se observa con las pequeñas STR. aunque se produce con los alelos de LTR más grandes. Sin embargo, las repeticiones de dinucleótido. bastante utilizadas en el mapeo genético, no se emplean en los laboratorios de medicina forense, debido a la producción de las denominadas "bandas shadow" y "bandas slutter". La mayoría de las STR utilizadas son repeticiones de tetranucleótido. Los Iragmentos más pequeños de STR son más apropiados para el análisis por instrumentos automáticos que los fragmentos de ADN más grandes de los sistemas de RFLP. El análisis automatizado de STR emplea ADN marcado con fluorescencia. Los fragmentos de ADN migran a un detector, donde cualquier producto de amplificación marcado se lee en tiempo real o se lee off-line en un escáner, tras completarse la electroforesis. El análisis es bastante rápido debido a la amplificación simultánea y al análisis multiplexde grupos de sistemas genéticos (Figs. 68-6 y 68-7).
Carril
1
2
3
4
5
6
7
s
>>
lo
41
Figura 68-5. Gel oe la PCR manual del sistema AFLP D1S80 que muestra los productos del locus D1S80 procedentes de numerosos individuos tipados mediante GeneAmp Deteclion System, seguidos por tinción con plata. La escala alélica del sistema AmpliFLP D1S80 comienza con el alelo 14 y contiene los alelos comprendidos entre el 16 y el 41. Los carriles 1. 4. 7 y 10 son la escala alélica del sistema AmpliFLP D1S80; el carril 2 es un control de tipo 16,31: el carril 3 présenla el tipo 24.37; el canil 5 presenta el tipo 18; el carril 6 presenta el tipo 28.31: el carril 8 presenta e¡ tipo 18,25 y el carril 9 presenta el tipo 17.28
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P R U E B A S F O R E N S E S D E I D E N T I D A D M E D I A N T E A N Á L I S I S D E I ADN
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Figura 68-6. Imagen de gel generada por ordenador de un análisis multiplex de STR automático a partir de numerosos individuos. Cada fragmento amplificado de átelos STR se ha marcado con un fluoróforo. Se han amplificado simultáneamente nueve sistemas de STR. Aquí se demuestra la gran variación existente entre los individuos.
Las STR fueron utilizadas en 1991 por el Armed Forces Institute oí Pathology para identificar a las víctimas de la Guerra del Golfo, pero sólo de modo reciente están disponibles comercialmente. Se venden como sistemas multiplex. en los cuales se analizan simultáneamente varios locus genéticos (es decir, STR). El poder de discriminación que se consigue, mediante la combinación de ocho o nueve sistemas, es similar al de los análisis de RFLP. Recientemente, el Federal Bureau oí Investigatlon (FBI) Technical Workmg Group on ADN Analysls Methods (TWGDAM). junto con el FBI's Combined ADN Index System (CODIS) Workmg Group (el grupo de usuarios que supervisa la red informática federal de base de datos del ADN). han publicado las paulas por las cuales se emplearán las STR específicas en los perfiles de ADN de los delincuentes condenados, para su inclusión en el CODIS. Se han seleccionado trece STR, con el objetivo de conseguir la potencia estadística necesaria para identificar a un individuo entre el gran número de perfiles de STR incluidos en la base de datos nacional. Cada STR de las que constituyen este grupo fue elegida de acuerdo con los resultados de un estudio exhaustivo de colaboración entre el FBI y el estado, quienes analizaron las STR disponibles en numerosos laboratorios bajo determinadas condiciones. Los 13 locus de STR se han convertido en el método estándar de análisis para el funcionamiento de la base de datos, así como para los estudios sistemáticos de casos de individuos. Actualmente, se dispone de equipos de reactivos comerciales que incluyen los 13 locus de STR (PE Blosystems Protiler/Coliler. Promega Power Plex I & //).
Marcadores de género y del cromosoma Y En la actualidad, la determinación de género se realiza mediante el sistema de la amelogenina. Se han reconocido otros marcadores de género, aunque no se utilizan de forma generalizada, La amelogenina es útil como determinante de género porque los alelos del cromosoma X y del cromosoma Y son de distinto tamaño, diferenciándose en los sistemas electroforéticos. Por tanto, dos bandas indican un hombre y una sola banda indica una mujer. La determinación de género supone una innovación frente al resto de marcadores de identidad habituales, ya que proporciona información biológica del fenotipo especifico del individuo de origen. La información sobre el género de la muestra de ADN puede ser esencial en la investigación de los posibles sospechosos. La determinación de género también es importante para clasificar las muestras como procedentes de la victima o del sospechoso. Los marcadores polimórficos del cromosoma Y se están empleando en Europa, y están investigándose en Estados Unidos, no para la determinación de género, sino porque parecen útiles en el tipado de los frotis vaginales, donde la fracción femenina contamina el ADN del esperma. También se pueden emplear para caracterizar el linaje paterno (del mismo modo que el ADN mitocondrial se utiliza para caracterizar el linaje materno). La descripción del linaje familiar de Thomas Jefferson se consiguió empleando marcadores del cromosoma Y (Foster. 1998).
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PATOLOGÍA MOLECULAR
Figura 68-7. Electroferograma de STR de un grupo multiplex de STR procedente de un solo individuo (el original es en color). Los electroferogramas consisten en una presentación cuantitativa de los datos, una alternativa a la imagen virtual del gel, como se muestra en la Figura 68-6. El eje horizontal se marca con unidades de tiempo arbitrarias y el eje vertical con unidades de fluorescencia arbitrarias. En este caso, se muestran nueve STR y el marcador de género amelogenina. Todos las STR muestran dos picos que indican alelos heterocigotos (cada alelo se représenla en un cuadrado junto al número de repeticiones): el marcador amelogenina representa un homocigoto X que indica una mujer. Las áreas sombreadas indican las regiones en las cuales puede encontrarse el rango de alelos para cada locus de STR. Los sistemas multiplex se construyen para ser distinguidos mediante rangos de tamaños no superpuestos y separación mediante colores (azul, verde y amarillo).
Secuenciación del ADN mitocondrial La secuenciación del ADN mitocondrial (ADNmt) es una tecnología accesoria reciente, que se aplica cuando existen cantidades muy pequeñas de muestra de ADN o cuando éste está muy degradado, sobre todo en pelo (que prácticamente no contiene ADN nuclear) y en restos muy reducidos (Butler. 1998a; Holland, 1999). El ADNmt también es útil cuando existen limitaciones de las muestras de referencia, ya que se puede utilizar un único familiar distante como referencia de la línea materna (el análisis del ADN nuclear requiere varios familiares cercanos). El ADNmt consta de una molécula circular de ADN de 16.569 bp de longitud. Sólo se tipan polimorfismos de la secuencia, puesto que no contiene regiones significativas de ADN repetitivo. La región del ADNmt que se analiza en la identificación humana es el "bucle de desplazamiento" ("displacement loop") {D-loop). también conocido como "región de control". Este locus abarca 1.100 bp y contiene dos regiones hipervariables. La secuenciación directa es el método más eficaz para tipar el ADNmt, aunque también se han empleado los sistemas de transferencia en mancha. Una sola célula contiene desde cientos a miles de copias de ADNmt, pero sólo una copia de ADN nuclear. Por tanto, cuando no puede uparse el ADN nuclear, en algunas ocasiones, puede tiparse el ADNmt. Las mitocondrias se heredan estrictamente de madre a hijo sin contribución paterna, a diferencia del ADN nuclear. Sólo existe una única secuencia de ADNmt en la célula ("homoplasmia"), mientras que el ADN nuclear se encuentra en pares de cromosomas. En consecuencia, no hay recombinación genética. Una secuencia exacta de ADNmt se puede localizar a través del linaje materno de una familia durante numerosas generaciones. Sin embargo, el poder de discriminación de la secuenciación del ADNmt está limitado, alrededor de uno entre cientos. Esta prueba es muy cara, y se realiza actualmente en muy pocos laboratorios.
Instrumentación Aunque la comunidad ha escogido un grupo de locus de STR para el análisis sistemático, las plataformas instrumentales en las que se realiza el análisis no se han decidido. Las pruebas de RFLP se realizaban como técnicas manuales muy laboriosas. La primera instrumentación automatizada utilizada por la comunidad forense fue el lector de imagen computarizado para la autorradiografía de RFLP. La tecnología basada en la PCR, junto a la separación de fragmentos, transferencia en mancha y secuenciación, son más fáciles de automatizar.
Inicialmente, los métodos de STR empleaban técnicas manuales de tinción con plata. En la actualidad, el análisis de STR se realiza mediante electroforesis capilar con detección fluorescente en tiempo real (p. ej., PE-Bio 310): en cambio, una pequeña parte de la comunidad realiza lectura del gel olf-ítne mediante un escáner (p. ej., Hitachi FMBio. Molecular Dynamics Fluorlmager. BioRad Multilmager). Para el funcionamiento de las grandes bases de datos se emplean instrumentos multicanal de detección en tiempo real (p. ej., PEBio 377 o 3700). Además de la determinación de los fragmentos, estos instrumentos también pueden utilizarse para la secuenciación del ADN (p. ej., análisis del ADNmt). Los análisis por espectrometría de masas por tiempo de vuelo producen resultados de una gran precisión y de modo más rápido (Butler, 1998b. 1999). Los sistemas basados en microchip han originado un gran entusiasmo. Algunos dispositivos de microchip permitirán el análisis del ADN de modo sistemático (p. ej., Nanogen. Cepheid). Las técnicas de Taqman y beacon molecular son métodos alternativos de biología molecular que se utilizan en las plataformas actuales. La automatización completa no se limita a las plataformas de análisis del ADN, Numerosos laboratorios emplean estaciones de trabajo robóticas con circuito web, que pueden extraer, preparar y amplificar el ADN diana. También han aumentando los sistemas de gestión de la información del laboratorio (LIMS).
DEGRADACIÓN DEL ADN Y DAÑO AMBIENTAL El ADN es una molécula resistente que puede tolerar un notable rango de temperaturas, pH, concentración salina y otros factores que destruyen los marcadores serológicos clásicos. La validación inicial de pruebas, realizada por los laboratorios de medicina forense, demostró que la mezcla de ADN con detergentes, aceites, gasolinas y otros adulterantes, no alteraba su tipado. No obstante, el ADN de la mayoría de muestras sufre una progresiva fragmentación aleatoria o "degradación", que transforma el ADN de alto peso molecular en ADN de bajo peso molecular (Kobilinsky, 1992). La fragmentación del ADN se debe fundamentalmente a la acción de enzimas autolíticas tras la muerte celular, pudiendo participar también las desoxirríbonucleasas bacterianas. Transcurridos unos días, prácticamente no se aisla ADN de alto peso molecular de los tejidos. El ADN de alto peso molecular procedente de materiales desecados o congelados puede conservarse durante años. Fragmentos residuales más pequeños de ADN pueden persistir a pesar de la degradación. El ADN mitocondrial suele conservarse cuando ya no se puede
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PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANÁLISIS DEL ADN
recuperar ADN nuclear, debido a su elevado número de copias (a menudo miles en cada célula). En consecuencia, el análisis de ADNmt se emplea en la identificación de restos de esqueletos antiguos. Se puede producir una degradación rápida o un daño en el ADN bajo determinadas circunstancias (Parsons, 1997). La hidrólisis química del ADN es muy lenta y normalmente no es significativa. Sin embargo, los iones metálicos pueden catalizar la hidrólisis oxidativa. La radiación ultravioleta origina dimerización de timidina. Se ha descrito la despurinación en el "ADN antiguo". A pesar de la fragmentación, la información de la secuencia aún está presente dentro de los fragmentos de ADN. La degradación afecta sobre todo a las pruebas basadas en la determinación de Iragmentos y a las pruebas que requieren secuencias grandes. Las pruebas tradicionales de RFLP requieren ADN de alto peso molecular no degradado, mientras que los análisis de PCR pueden realizarse en muestras degradadas: se puede obtener ADNmt a partir de restos de esqueletos en los que no puede recuperarse ADN nuclear.
RECOGIDA DE MUESTRAS La obtención apropiada de muestras es muy importante en la medicina legal. En la escena del crimen, se debe reconocer la prueba antes de recogerla adecuadamente. Esto se suele conseguir con la ayuda de sustancias químicas que hacen visibles las gotas de sangre. El patrón de salpicaduras de sangre se emplea para ayudar al investigador a interpretar y recoger de un modo inteligente las muestras procedentes de una plétora de gotas de sangre. La documentación adecuada de la custodia, el embalaje y el precintado son tan importantes como la recogida inicial. Los líquidos biológicos derramados en artículos que pueden recogerse (p. ej., sangre en un trozo de ropa) se deben obtener y empaquetar por separado. Cuando los líquidos biológicos están depositados sobre superficies u objetos que no pueden recogerse, el liquido se obtiene limpiándolos con torundas estériles humedecidas con agua destilada esténl, hasta que la mancha sea recogida en su totalidad. Se ha descrito una técnica para las marcas de mordiscos en el cuerpo (Sweet, 1997), que consiste en lavar con una torunda humedecida y a continuación utilizar una torunda seca. Se debe recoger una torunda de control a partir de zonas no manchadas adyacentes a la mancha de líquido. Las torundas de las manchas y las torundas de control se secan al aire y se empaquetan por separado. La sangre no coagulada procedente del organismo sigue siendo la muestra de elección para los laboratorios de ADN; también la sangre anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y citrato-fosfato-dextrosa (CPD). La sangre anticoagulada con hepanna no se recomienda para la prueba de ADN. Aunque los glóbulos rojos maduros no poseen ADN (ni nuclear ni mitocondrial). se obtiene bastante ADN de la circulación a partir de los leucocitos. A pesar de que el hemo inhibe la reacción de la PCR, la sangre es una buena luente de ADN para la prueba de PCR, ya que la actividad inhibitoria del hemo se diluye fácilmente. No obstante, en caso de una putrefacción significativa, se prefieren otras fuentes de ADN. Prácticamente cualquier tejido puede emplearse para el tipado de ADN. Algunos tejidos de los que podría pensarse que son mejores fuentes de ADN debido a su mayor densidad celular y. por tanto, mayor concentración de ADN, en la práctica son menos recomendables debido a su mayor velocidad de degradación posmortem (Kobilinsky, 1992). Entre los tejidos blandos, el ADN hepático se degrada rápidamente mediante enzimas autolíticas. mientras que el tejido cerebral constituye una buena fuente en periodos de tiempo intermedios posmortem. El hueso y los dientes son las fuentes más estables de tejido posmortem. Se obtiene ADN informativo a partir de restos de esqueletos con decenas de años. Generalmente, cuanto más tiempo transcurrido posmortem y mayor descomposición del cuerpo, la degradación del ADN procedente de los tejidos del cadáver es mayor. Hay que tener un especial cuidado para evitar la contaminación de la muestra por otras fuentes de ADN. Las muestras se deben recoger utilizando guantes e instrumentos estériles. Siempre que sea posible, se debe obtener una biopsia de tejido no expuesto mediante una incisión. Las muestras se mantendrán refrigeradas, preferiblemente congeladas (aunque las congelaciones y descongelaciones repetidas destruyen los fragmentos grandes de ADN). La desecación, incluso un sencillo secado al aire, puede ser un méto-
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do adecuado de almacenamiento de algunas muestras de ADN (p. ej., gotas de sangre y huesos). Los tejidos fijados con formalina no son apropiados, aunque pueden emplearse para el análisis de ADN por PCR. No debe desecharse ningún tejido ni liquido biológico sin un previo análisis de ADN.
EXTRACCIÓN DEL ADN El paso inicial y más crítico en cualquier prueba de ADN es la extracción de éste a partir de la sangre u otras fuentes biológicas. El ADN procedente de una muestra de sangre, un frotis vaginal u otra fuente histológica, debe aislarse de otros componentes celulares y contaminantes ambientales mediante una técnica de extracción. El método clasico y más usual es la extracción con cloroformofenol y la posterior precipitación con etanol. Es un método eficaz y fiable que ha resistido el paso del tiempo, aunque es engorroso. Un nuevo método más simple y rápido es el método "Chelex" (Walsh, 1991). La muestra se hierve para liberar su contenido celular y posteriormente se añade Chelex-100 que fija los iones metálicos, inactivando nucleasas y polimerasas. Se obtiene bastante ADN. aunque relativamente de escasa pureza; no obstante, es suficiente para la mayoría de pruebas basadas en la PCR. Está aumentando el uso de la extracción con columna en fase sólida (p. ej., las columnas Quiagen) como medio de purificación, sobre todo cuando se trabaja con grandes volúmenes de muestras. El ADN obtenido es mucho más puro que el separado con Chelex. sin embargo, es relativamente caro. Pueden ser eliminados contaminantes como los encontrados en cigarrillos y en ciertas pinturas. El empleo de partículas de silicona es otro excelente método de purificación del ADN cuando se precisa eliminar inhibidores. Numerosos laboratorios eliminan la fase de extracción mediante la realización de la PCR directamente a partir de un triturado del material manchado. Esta técnica es la más empleada en papeles de liltro con manchas conocidas de sangre, procedentes de muestras de bancos de datos de delincuentes. Los frotis vaginales representan una consideración especial de extracción El ADN masculino se separa del ADN femenino mediante un proceso de lisis diferencial (Crouse, 1993). La tracción femenina se obtiene fácilmente a partir de las células epiteliales, por un procedimiento de extracción estándar. La fracción masculina se obtiene mediante la rotura de los puentes de hidrógeno de la cápsula protectora del espermatozoide con una solución de ditiotreitol (DTT). Este sistema es eficaz en el análisis de RFLP. para el cual se desarrolló inicialmente; sin embargo, los sistemas más sensibles basados en la PCR presentan "contaminación" femenina en la fracción masculina.
NORMAS DE GARANTÍA DE LA CALIDAD Los laboratorios que realizan análisis forenses de ADN son conscientes de que las normas forenses son muy estrictas y cuentan con la posibilidad de exámenes judiciales exhaustivos de sus procedimientos y prácticas. Existe un acuerdo general sobre los procedimientos de laboratorio apropiados para los análisis forenses de ADN. La comunidad forense es pequeña y eslá bien comunicada: aunque los métodos de tipado de ADN no están estandarizados, los procedimientos son bastante uniformes. Cualquier variación significativa o aparición de un nuevo método requiere una validación. El FBI's TWGDAM. actualmente conocido como Scientitic Workmg Group on ADN Analysls Methods (SWGDAM). publicó las pautas iniciales de los procedimientos analíticos del ADN que se convirtieron de tacto en normas ( Technical Worklng Group. 1989,1995). Estas normas fueron modificadas por el FBI's DNA Advisory Board (DAB) y aceptadas por el FBI Director de conformidad con el DNA Idenlilicalion Acl. un componente del proyecto de ley Crime, aprobado en 1994 (Federal Bureau ol Investigalion. 1998). Estas normas suponen la pnmera regulación gubernamental en el campo de la criminalistica, aplicándose a los laboralonos criminalísticos que remiten los resultados del ADN al F8/'s National DNA Index System o que admiten ciertas cesiones federales. La American Society ol Crime Laboratory Directors (ASCLD) tiene un programa de acreditación de los laboratorios de criminalística. El American Board ol Criminalists (ABC) certifica a los criminalistas; además tiene una categoría especial para los analistas de ADN. Los analistas que trabajan en muestras de casos de individuos deben estar colegiados (o equi-
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S E C C I Ó N VII
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PATOLOGÍA MOLECULAR
valenle) en genética, bioquímica y biología molecular, y deben tener un año de experiencia en biología forense. Todas estas normas requieren pruebas de competencia, disponibles comercíalmente (es decir, Coltege of American Pathologisls. Cellmark Diagnoslies y Collaborative Tesling Services) dos veces al año para cada analista. Las comparaciones entre laboratorios han demostrado una gran precisión en las pruebas de RFLP realizadas por la comunidad forense de tipado del ADN. El estudio de competencia informa de las determinaciones medias del tamaño de los fragmentos de RFLP que difieren en unas pocas bases y el rango de resultados situado dentro del intervalo de confianza ± 2.5%, empleado en la mayoría de los laboratorios de criminalística (Mudd, 1994). La exactitud y la reproducibilidad de las diferentes pruebas basadas en la PCR también son bastante buenas.
DESAFÍOS LEGALES Nunca antes una prueba científica había supuesto un desafío legal tan grande y tan divulgado como la prueba de ADN. La prueba de ADN es tan potente que la defensa no ha tenido más remedio que acometer la prueba con gran vigor. El drama del tribunal se ha forjado en gran parte por las personalidades significativas implicadas. El furor público del debate legal ha conducido a percepciones erróneas por el público profano acerca de la controversia que rodea a la tecnología; aunque los casos legales son un mal camino para evaluar cualquier tecnología, los temas legales no son cuestiones científicas (Wooley, 1992). A pesar de los desafíos del tribunal (Roberts, 1991,1992), la comunidad forense ha acogido esta tecnología y la aceptación judicial es actualmente habitual (Office of Technology Assessment, 1990; National Research Council, 1992,1996: Attorney General Jane! Reno's National Commisston on the Future olADN Evidence, sitio web). El primer desafio significativo y satisfactorio para la prueba de ADN fue el caso de Nueva York contra Castro en 1989, basado en la percepción del juez de que el análisis se había realizado sin el rigor suficiente (People v Castro, 1989).
lidad de una coincidencia al azar. La discusión científica trata sobre lo grande que debe ser la estadística, a menudo sutilezas sobre diferencias de un par de órdenes de magnitud en estimaciones de 1 entre 10 billones; aunque, a menudo, los tribunales han percibido la discusión como una falta de consenso y han dictaminado la interpretación estadística como totalmente inadmisible. Actualmente, existe un acuerdo general entre los genetistas de población y los estadistas sobre la validez de la estadística, disminuyendo los desafíos de la defensa en este tema (Chakraborty, 1991; Lander, 1994). Una mezcla sustancial de datos de tipados del ADN, procedentes de poblaciones aisladas, demuestra que la variación entre los individuos es bastante mayor que la variación entre los grupos de población; en consecuencia, las frecuencias generadas a partir de grandes grupos raciales son estimaciones suficientes. El National Research Council (NRC) ha publicado dos informes sobre el análisis de ADN, dirigidos particularmente a temas estadísticos (National Research Council, 1992, 1996). El segundo informe del NRC indica pautas específicas sobre el método estadístico de tratamiento seguido en la actualidad por los laboratorios criminalísticos (Technical Working Group. 1990; Attorney General Janet Reno's National Commission on ADN Analysis Methods, sitio web). Hoy en día, la defensa raramente desafía la admisión de la prueba de ADN, aunque reta, en menor medida, el peso de la prueba. El empuje de la defensa se dirige a la garantía de calidad, a la tasa de errores y, en el caso de las pruebas de PCR. a temas de contaminación. Por otra parte, la recogida de pruebas y la manipulación son objeto de mayor impugnación que la prueba por sí misma. Por ejemplo, la fundación de la defensa de O. J. Simpson postuló que la prueba había sido colocada o manipulada. Por supuesto, se desafiará nuevamente a la tecnología, le mismo que se introducen nuevos métodos de tipado del ADN. Finalmente, hay que reconocer que la prueba de ADN es más eficaz que los relatos de testigos presenciales y las pruebas de confesión.
BASES DE DATOS DE ADN
Nueva York contra Castro
A lo largo de la historia, no se han podido investigar un gran número de casos, sobre todo de abusos sexuales, debido a la falta de sospechosos. Los El acusado José Castro y sus abogados defensores Neufeld y Scheck organizaron agresores sexuales son conocidos por presentar una alta tasa de reincidencia; el primer desafio con éxito a la admisión de la prueba de ADN. En 1987, el señor por ello, algunos estados empezaron a establecer bancos de datos de abusaCastro, un hombre hispano de 38 años de edad, fue acusado del apuñalamiento dores sexuales, que se utilizarán para comparar perfiles serológicos de conohasta la muerte de su vecina Vilma Ponce y de su hija de 2 años de edad. Una pequeña gota de sangre del reloj que levaba el señor Castro lúe analizada por la cidos agresores sexuales con pruebas de casos de abusos sexuales. Aunque Ufecodes Corporation, determinándose que no pertenecía a Castro, aunque si coinesto fue útil en numerosas ocasiones, la eficacia de los bancos de datos estacidía con la sangre de la víctima. La posibilidad de que otro hombre hispano escogiba obstaculizada por el bajo poder de discriminación de la prueba serológica do al azar tuviese el mismo perfil de ADN lúe de 1 entre 189 millones. El juez decla-del semen. Sin embargo, el análisis de ADN, debido a su mayor poder de disró ser admisible la prueba de que el ADN no coincidía con el de Castro, aunque la criminación, ha aumentado el poder investigador de tales bancos de datos al prueba de que éste coincidía con el ADN de Ponce no lúe admitida debido a fallos nivel de los archivos de huellas digitales. del laboratorio en el empleo de técnicas de análisis aceptables. No obstante, frente A partir de junio de 1998, todos los estados tienen la obligación de poseer a otra prueba, el señor Castro se declaró culpable de los asesinatos a finales de una base de datos de delincuentes condenados. La mayoría de bancos de 1989. Tras la conclusión del estudio y la declaración de culpabilidad, el juez Sheíndlm se inclinó sobre el asiento y preguntó al acusado si la sangre era de la vícdatos estatales obtienen y tipan muestras de ADN procedentes de delincuentima, a lo que él contestó que si, confirmando los resultados de la prueba de ADN tes sexuales condenados. También suelen incluirse los delincuentes violentos [People v Castro. 1989). condenados, sobre todo los autores de homicidios. La tendencia es ampliar el requerimiento de la obtención de muestras de ADN en los delitos. A menudo, los delincuentes violentos ya han sido condenados por delitos anteriores. La La tecnología forense del tipado de ADN ha experimentado progresos sigrecopilación no sólo sirve para capturar a grandes delincuentes, sino también nificativos y mejoras a partir de los procedimientos de garantía de calidad para intervenir antes de que se intensifique la conducta criminal del autor. (Mudd, 1994). Las autorradiografias de los casos iniciales, como las de Castro, no son representativas de las autorradiografias de calidad obtenidas posteriormente por la comunidad forense. Del mismo modo, los argumentos de la defensa han evolucionado con el tiempo. Inicialmente, la defensa desafiaba la validez de la tecnología en sí misma, aunque esto nunca ha sido un argumento válido. La estrategia de la defensa que mayor éxito reunía estaba en el reto de la interpretación estadística de una coincidencia de ADN. Aunque han planteado muchos condicionantes estadísticos, los argumentos actuales se han centrado en "la subestructura" y en el empleo de bases de datos adecuadas de frecuencias de población; ésta debería ser una base de datos caucásica, una base de datos italiana o una base de datos de Nueva York. Las diferencias en las frecuencias alélicas entre los subgrupos étnicos pueden subestimar la posibi-
Los bancos de datos facilitan la comparación de casos y sospechosos a través de organismos y limites jurisdiccionales, incluso sin pistas o sospechas. El FBI ha creado un sistema de soñware, el Combined ADN Index System (CODIS) y una red, conocida como National ADN Índex System (NDIS). que permite a las jurisdicciones comparar perfiles de ADN de casos de individuos sospechosos conocidos y de sospechosos desconocidos, con bases de datos de delincuentes condenados. El Reino Unido ha tomado medidas más drásticas para establecer una completa base de datos nacional de ADN de criminales. Las muestras se obtienen de un rango más amplio de categorías de delitos, a diferencia de la mayoría de programas estatales de Estados Unidos, que se centran en los abusos sexuales. Las muestras se recogen a partir de detenidos, mientras
C A P Í T U L O 68
•
PRUEBAS
F O R E N S E S DE I D E N T I D A D M E D I A N T E
que en Estados Unidos sólo se obtienen de condenados. Los británicos afirman que las posibilidades de encontrar al autor de un crimen, mediante una coincidencia de ADN, son de uno entre cada dos delitos (Weedn. 1998b).
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ANÁLISIS
DEL
ADN
1413
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Apéndices Soluciones fisiológicas, tampones, indicadores ácido-base, materiales de referencia estándar y tabla de conversión de temperaturas.
Pesos ideales, superficie corporal e Índice de masa corporal (IMC)
Cálculo aproximado del volumen sanguíneo total (VST)
Tabla periódica de los elementos
Unidades del Sistema Internacional (SI)
A P É N D I C E
Soluciones fisiológicas, tampones, indicadores ácido-base, materiales de referencia estándar y tabla de conversión de temperaturas
Como la concentración total de tampón/litro es de 0,1 M
SOLUCIONES FISIOLÓGICAS
[acetato] + [ácido acético] = 0,1 M Una solución fisiológica es aquella que contiene varias sales a una concentración aproximadamente equivalente a la de los líquidos corporales del hombre. La más sencilla es la solución salina fisiológica que tiene la misma presión osmótica que la sangre. También existen soluciones más complejas, como por ejemplo, las que mantienen a los tejidos en un estado de metabolismo activo durante periodos prolongados. La Tabla A1-1 proporciona las fórmulas de algunas soluciones isotónicas en relación a la sangre.
TAMPONES* Los tampones permiten controlar los cambios de pH. En general, los tampones están compuestos por un ácido débil y su sal o por una base débil y su sal. La ecuación de Henderson-Hasselbach
Sustituyendo el valor del acetato en la Ecuación 2; 1,38 [ácido acético] + [ácido acético] = 0,1M Por tanto, [ácido acético] = 0,042 M [ácido acético] = 2,52 g/l [acetato] ' = 0,058 M = 4,76 g/l Ejemplo 2. Si se mezclan 648 mi de ácido dietilbarbitúrico 0,025 M y 10 mi de dietilbarbiturato sódico 0,5 M y se diluyen hasta un litro, calcular el pH de la solución (pK del ácido dietilbarbitúrico = 7,98 y concentración molar = moles/litro). Existe la siguiente relación entre la molandad y el volumen de una solución: M1V1 = M2V2
pH = pK + log [sal]/[ácido]
(1)
es útil para calcular la relación entre el ácido (o base) y su sal correspondiente y es necesaria para obtener el pH deseado de un sistema tampón. Ejemplo 1. Si sabemos que el pH de un tampón acetato 0,1 M es de 4,9; calcular la concentración de ácido acético y acetato sódico del tampón (pK del ácido acético = 4,76). Sustituyendo los valores de pH y pK en la Ecuación 1:
(2)
(3)
donde M1 = molaridad de la solución inicial V1 = volumen de la solución inicial M2 = molaridad de la solución final V2 = volumen de la solución final Emplear la Ecuación 3 para calcular los cambios de concentración de la sal y el ácido después de diluir hasta un litro: [dietilbarbiturato sódico] = 0,025 x 0,648 = 0,0162 mol/l [ácido dietilbarbitúrico] = 0,5 x 0,01 = 0,005 mol/1
log [acetatojVfácido acético] = 4,9 - 4,76 = 0,14 |acetato]/[ácido acético] = 1,38 ¡acetato] = 1,38 [ácido acético]
Calcular el pH de la solución mediante la Ecuación 1: ' Para un análisis razonado, que incluye la preparación de soluciones lampón con una luerza iónica definida, consultar Bates RG: Determination ot pH-Theory and Practice, 2nd ed. New York. John Wiley and Sons, 1973.
Tabla A1 -1
Soluciones fisiológicas Salina
Cloruro 0,85 g sódico Cloruro calcico Cloruro potásico Bicarbonato sódico o-Glucosa Cloruro de magnesio Fosfato monosódico Agua destilada 100 mi
Solución de Locke
———— Solución de Ringer
Solución de Tyrode
0,9 g
0.7 g
0,8 g
0,024 g
0,0026 g
0,02 g
0,042 g
0,035 g
0,02 g
0,01-0,03
0,1 g
0,01-0,25 g
0,1 g 0,01 g 0,005 g
100 mi
100 mi
100 mi
pH =7,98-log (0,0162/0,005) = 7,98 - log 3.24 = 7,98 - 0,51 = 7,47 La máxima capacidad tampón se obtiene en el valor de pK del ácido o la base débiles. Por ejemplo, en el caso del ácido acético con un pH de 4,76, es necesaria una mayor cantidad de ácido para modificar el pH de un tampón acetato desde 4,76 hasta 4,66 que desde 4,2 hasta 4.1. La capacidad de tamponamiento eficaz abarca un rango de pH de, aproximadamente, una unidad a ambos lados del valor de pK del ácido o base débiles. En el caso del ácido acético, ésta se sitúa entre pH 3,8 y pH 5,8.
Tampones fosfato de Sorensen En general, estas soluciones tampón son útiles porque el rango de las mezclas varía entre pH 5 y 8. Pareparar soluciones 0,1 M de fosfato potásico monobásico (13,6 g/l) y fosfato sódico dibásico (14,2g/l). Mezclar ambas soluciones en las proporciones indicadas en la Tabla A1-2 para oblener el pH deseado del tampón.
1418
APÉNDICES
Tabla Al-2
Tabla de S o r e n s e n para la mezcla d e t a m p o n e s
Tabla A1-3 T a m p ó n tris (hidroxymetil) a m i n o m e t a n o
NA..HPO Solución (mi)
KHjPCJ, Solución (mi)
PH
0.25 0,5 1.0 2.0 3.0 4.0 5,0 6.0 7.0 8.0 9.0 9,5
9,75 9,5 90 8,0 7.0 6.0 5.0 4.0 30 2.0 1.0 0,5
5.288 5.589 5,906 6,239 6.468 6.643 6.813 6.979 7.168 7.381 7.731 8.043
;
—
mi 0,1 N HCI añadidos
pH resultante a23°C
pH resultante a 37 C
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 200 225 25.0 275 30.0 32 5 35.0 37.5 40.0 42.5 45,0
9,10 8,92 8,74 8.6? 8,50 8.40 8,32 8.23 8,14 8,05 7,96 7,87 7,77 7,66 7,54 7,36 7,20
8,95 8,78 8.60 8,48 8.37 8.27 8.18 8.10 8.00 7.90 7.82 7,73 7,63 7,52 7,40 7,22 7,05
Tabla A1 -4 Indicadores á c i d o - b a s e COLOR Indicador"'
Rango de pH
Azul de timol (A) Narania de melilo (B) Azul de bromolenol (A)' Verde de Bromocresol (A)' Rojo de metilo (A)' Púrpura de Bromocresol (A) Azul de Bromotimol (A) Rojo lenol (A)" Rojo neutro (B) Azul de Timol (A)' Fenolftaleina (A) Timolftaleina (A)
1
1
1
1.2-2.8 3.1-4,4 3.0-4.6 4,0-5.6 4.4-6.2 5.2-6.8 6.2-7.6 6.4-8.0 6.8-8.0 8.0-9.6 8.0-10.0 9.4-10,6
Cantidad de indicador por 10 mi 1-2 golas de solución acuosa al 0.1% 1 gota de solución acuosa al 0,1% 1 gota de solución acuosa al 0,1 % 1 gota de solución acuosa al 0.1 % 1 gota de solución acuosa al 0,1 % 1 gota de solución acuosa al 0,1 % 1 gola de solución acuosa al 0,1 % 1 gola de solución acuosa al 0,1% 1 gota de solución al 0.1% en alcohol al 70% 1-5 gotas de solución acuosa al 0,1% 1-5 gotas de solución al 0.1% en alcohol al 70% 1 gota de solución al 0.1% en alcohol al 90%
Ácido
Alcalino
Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Roio Amarillo Incolora Incolora
Amarillo Naranja Azul-violeta Azul Amarillo Violeta Azul Rojo Amarillo Azul Roja Azul
Las letras A o B que figuran a continuación del nombre del indicador significan que el indicador es un acido o una base respectivamente ' Para el rango ácido i Sal sódica Para ei rango alacaimo 1
/ Tabla A1-5 Ácidos - y álcalis d e u s o f r e c u e n t e ' Solución Concentración de HCL Concentración de H,SO Concentración de HNO, Concentración de ácido láctico Concentración de ácido acético glacial Concentración de NH,,OH ;
Peso molecular
Densidad especifica'
g/l'
Molaridad'
Normalidad'
Cantidad aproximada de mi para obtener 1.000 mi de una solución 1 N
36,46 98,08 63.02 90.08 60.08 35,05
1,19 1,84 1,42 1.21 1.06 0,90
440 1.730 990 1 030 1 060 250
12 18 16 11 17.5 15
12 3€ 16 11 17,5 15
83 28 64 87 57 67
" Disponible comercialmonte ' Las cifras pueden variar ligeramente dependiendo dol lote o labricante
Tampón de tris (hidroximetil) aminometano* El lampón de tris (hidroximetil) aminometano se utiliza en un rango de pH entre 7,0 y 9,0, pero su mejor capacidad tampón se sitúa entre 7,5 y 8,5. Es prácticamente ineficaz por debajo de pH 7,0 y por encima de pH 9,0. Una de las ventajas de este tampón es su excelente estabilidad. El
* Cuando se requieren tampones de molaridad superior, sustituir el HCI 0.1N por HCI 1N.
tampón puede prepararse pesando la cantidad apropiada de tris (hidroximetil) aminometano, disolviéndola en agua, y ajustando el pH hasta el valor deseado con HCI. Por ejemplo, si se quieren obtener 100 mi de tampón 0,05 M, se colocan 0,6057 g de tris (hidroximetil) aminometano en un Irasco volumétrico de 100 mi. Se disueleven en unos 50 mi de agua. Se añade el HCI 0,1N, tal y como se indica en la Tabla A1-3. y se enrasa hasla el volumen final con agua destilada. La tabla muestra los valores de pH obtenidos al mezclar 0.6057 g de tris (hidroximetil) aminometano disuelto en agua con las cantidades indicadas de HCL 0.1 N y diluido con agua hasta 100 mi de volumen final.
APÉNDICE 1
Tabla A 1 - 6 MRE 40h 83d 84k 136e 350a 723c 911b 912a 913 914a 915a 916a 917a 918a 919a 930e 931Í 934 937 955b
Tabla A1 -7
•
1419
SOLUCIONES FISIOLÓGICAS, TAMPONES, INDICADORES Á C I D O BASE,
Materiales de referencia estándar ( M R E ) p a r a d e t e r m i n a c i o n e s clínicas % de la fracción estoiquiométrica de pureza de masa
Tipo de MRE
Oxalato sódico Trióxido de arsénico Ftalalo polásico ácido Dicromato potásico Ácido benzoico Tris (hidroximetil) aminometano Colesterol Urea Ácido úrico Creatinina Carbonato calcico Bilirrubina D-Glucosa (dextrosa) Cloruro potásico Cloruro de sodio Filtros de vidrio, transmitancia Filtros líquidos, absorbencia Termómetros clínicos de laboratorio (0, 25. 30, 37) Hierro (metal) Plomo en sangre
Uso certificado Estándar reduclométrico Estándar reductométrico Estándar acidométrico Estándar de oxidación Estándar acidométrico Estándar acidimétrico Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Rango de longitud de onda (440-635 nm Rango de longitud de onda (302-678 nm Temperatura
99,972 99,9926 99,9911 99,984 99,9958 99,901 99.8 99,9 99.7 99,7 99.9
98,3 99.7 99,9817
99,89
99.90
Cantidad de unidad (iNg) 60 60 60 60 30 50 2,0 25 10 10 20 01 25 30 30 3 filtros Ampollas Uno de cada 50 Conjunto de 4 ampollas
C o n v e r s i ó n de t e m p e r a t u r a s
Centígrado 110° 100 95 90 85 80 75 70 65 60 !)h
50 Ah
44 43 42 41 40,5 40 39,5 39 38,5
Fahrenheit
Centígrado
Fahrenheit
230° 212 203 194 185 176 167 158 149 140 131 122 113 111.2 109.4 107,6 1058 104,9 104 103.1 102.2 101.3
38" 37,5 37 36,5 36 35,5 35 34 33 32 31 30 25 20 15 10 +5 0 -5 -10 -15 -20
100,4" 99.5 98,6 97.7 96,8 95,9 95 93,2 91,4 89,6 87,8 86 7
7
68 59 50 41 32 23 14 +5 -4
1°F = -17,2°C 1°C = 33,8°F Para convertir los grados Fahrenheil en centígrados, restar 32 y multiplicar por 0.555. Para convertir los grados centígrados en Fahrenheil. multiplicar por 1,8 y sumar 32
INDICADORES ÁCIDO-BASE* Un indicador ácido-base es un ácido débil o una base débil, que en estado no disociado presenta un color y composición diferentes a los de la forma ionizada. El cambio de color se produce en un rango estrecho de concentración de iones de hidrógeno. Este rango se denomina intervalo de cambio de color y se expresa en términos de pH (logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno). Gran número de sustancias presentan propiedades de indicador, sin embargo, son pocas las empleadas en la práctica para neutralizar reacciones y determinar el pH. La Tabla A1-4 muestra algunos indicado-
• Basado en Dean JA (ed): Handbook ol Chemistry, revised 13th ed. New York, McGraw-Hil, 1985.
res ácido-base de uso frecuente. En general, los ácidos débiles deben titularse en presencia de indicadores que cambian en soluciones levemente alcalinas. Las bases débiles deben titularse en presencia de indicadores que cambian en soluciones levemente acidas. La Tabla A1-5 incluye ciertos ácidos y álcalis de uso común. La disponibilidad de medidores de pH de precisión permite titular el pH deseado y puede remplazar el uso de indicadores en determinadas aplicaciones. Dean JA (ed): Handbook ot Chemistry, 13th ed. New York, McGraw-Hil, 1985. Fasman GD (ed): Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 3rd ed. Cleveland. CRC Press, 1976. Meinke WW: Standard Reference Materials for Clinical Measurements. Anal Chem 1971;43:28A. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals and Drugs. 12th ed. Whitehouse Station. NJ. Merck and Co., 1996.
Pesos ideales, superficie corporal e índice de masa corporal (IMC)
Tabla A2-1
C o m p a r a t i v a de las tablas de peso-estatura a partir d e datos actuariales: r e c o m e n d a c i o n e s de la c o m p a ñ í a d e seguros d e vida Metropolitan sin corregir por e d a d y r e c o m e n d a c i o n e s edad-específicas del centro de investigación gerontológica CENTRO DE INVESTIGACIÓN GERONTOLÓGICA" (RANGO DE PESO E D A D - E S P E C Í F I C O PARA HOMBRES Y MUJERES)
METROPOLITAN 1983 PESOS* 25-59 a ñ o s Mujeres
20-29 a ñ o s
30-39 a ñ o s
40-49 a ñ o s
147
45-59
150
38-50 39-52
42-54
46-61
43-56
152
47-62
41-54
48-64
Estatura (cm)
Hombres
50-59 a ñ o s
60-79 años
45-58
49-61
52-64
47-59
50-63
54-67
48-61
52-65
56-69
42-56
44-58 46-59
50-64
54-67
58-71
49-65 50-67
44-58 45-59
48-62 49-64
51-65 53-68
55-69 57-72
59-74 61-76
l!>!) 157
56-66 57-67
160
58-68
162
59-70 59-72
52-69
55-70
59-74
64-78
53-71
46-61 48-64
51-66
165
52-68
168
60-74
54-73
49-65
61-76 53-79
65-79 67-81
170
56-74
51-67
60-77
65-79
71-83
173
61-76 62-78
53-70 54-72
57-72 59-74
57-76
53-69
55-74
64-79
67-81
72-89
175
63-79
59-77
54-71
64-81
68-83
73-91
178
60-78
55-73
180
64-81 65-83
59-76 61-78
61-80
57-76
62-81
66-83 68-86
71-86 73-91
76-94 78-97
183
67-85
59-78
64-83
69-88
75-94
80-99
185 188
68-87
66-85
71-91
77-97
83-102
190
71-92
60-80 62-82 64-84 65-87
193
69-89
68-88
73-93
79-99
85-105
69-90
75-96
81-102
87-108
71-93
78-99
83-105
89-111
' Los valores de esta tabla se refieren a estaturas medidas sin calzado y pesos obtenidos sin ropa. La Compañía de Seguros de Vida Metropolitan (1983 Metropolian Height and Weight Tables. Stat Bull Meiropol Lile ins Co, 1983; 64 (|Jan-Jun]:2) presentó una tabla de estatura y peso tomados en sujetos desnudos (Tabla 4), as como una tabla de estatura y peso en sujetos veslidos (Tabla 1). Ettinger WH Jr. Halter JB (eds): Principles ol Geriatric Medicine and Geronde Andres R: Mortality and obesity: The rationale for age-specific height-weight tables. In Hazzard WR. Bierman EL, Blass JP. tology. 3rd ed New York, McGraw-Hil, 1994. p847. reproducción autorizada.
APÉNDICE 2
•
1421
PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E ÍNDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )
Tabla A2-2 Tabla de índice de masa corporal (IMC) Para utilizar esta tabla buscar la estatura apropiada en la columna de la izquierda y localizar en esa línea el peso. La cifra que figura en la parte superior de la columna correspondiente equivale al IMC para ese peso y estatura. Se ha redondeado el peso en kilogramos 19
IMC
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
61 63 65 67 69 72 74 76 78 81
63 65 67
65
07 69 70
69 72 74 77 79 80
73 76 79 82 84 87 93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127
76 79 8! 84 87 80 93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130
Peso corporal (kilogramos)
Estalura (cm)
IMC
45
47 49 50 52 54 55 57 58 60 62 64 65 67 69 71
-4 45 46 48 40 51 53 54 56 58 59 61 63 00 67 68 70 73 74
37
38
39
147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 180 183 185 188 190 193
41 43 44
36
-•-13
47 (9 50 52 54 55 57 59 61 63
„4 66 68 70 /1 74 76 78
48 19 51 53 54 56 58 60 62 64 65 68 69 71 73 75 78
80
50 52 54 55 57 59 0I 63 I ¡4 66 68 70 73 75 77 79 81 83
B2 40
52 I-i
56 58 59 61 64 00
07 69 72 73 76 78 80 83
54 56 58
00 00' 04 66 68 70 72 74 77 79 81
80
8¡,
8,7 89
86 88 01 93
4!
43
43
84
56 58 60 62 64 00 68 71 73 75 78 80
80 84 87 •0) 92 94
59 60 63 64 67 69 73 76 78
80
80
83 80
B6
88
00
72 74 77 79 81
0,7
69 72 74 79 82 84 87 89 92 95 98
y4 86 B9 92 94 97 too oo 103 102 106 105 109 108 112
77 79 80 84 87 90 92 95 98 101 103 107 109 112 115
93 95 98 101 104 107 110 113 116 119
72 74 76 79 82 84 87 90 93 96 98 101 104 107 110 113 116 120 123
41
87 'JO
80
07
90 00 95 98 100
91 93 96 99 102 104
44
45
46
47
48
49
0o
51
52
98 101 104 108 112 115 119 122 126 130 134 138 142 146 150 154 159 163 168
100 103 107 110 114 117 121 125 129 133 137
102 105 109 112 116 120 124 128 132 136 140 144 148 153 157 161 166 170 174
104 108 111 115 119 122 127 131 135 139 143 147 151 156 160 165 169 174 170
106 110 113 117 121 126 129 133 137 142 146 150 155 159 164 168 173 177 182
108 112 116 120 124 128 132 136 140 145 149 153 158 162 167 171 176 181 186
111 114 118 122 126 130 134 139 143 147 152 156 157 166 170 175 180 184 190
88;
Peso corporal (kilogramos)
Estatura (cm)
Fuente
147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 180 183 185 188 190 193
78 -I 83 Be 89 92 95 38 101 104 107 110 113 117 120 122 127 130 134
80 B3 86 88 92 04 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130 134 138
82 85 88 91 94 97 100 103 107 110 113 117 120 123 127 131 134 137 142
84 B8 90 93 97 100 103 106 109 113 116 119 123 127 130 134 137 141 145
B.7 30 93 96 99 102 105 109 112 116 119 122 126 130 133 137 141 145 149
http//www.nhlbi.nih.gov/guidelines/obesity/bmi_lbl htm
80 92 JO
98 102 105 108 112 115 118 122 126 129 133 137 140 145 148 15?
91 94 98 101 104 108 111 1 14 118 122 125 129 132 137 140 144 148 152 156
93 96 100 103 107 110 113 117 121 124 128 132 136 140 143 147 151 156 160
95 98 102 105 109 112 116 120 123 127 131 135 139 143 147 151 155 159 164
• 11
145 149 153 158 162 166 171
112 117 121 125 129 133 137 142 146 150 155 159 164 169 174 178 183 188 193
I 422
APÉNDICES
Figura A2-1. Nomograma para determinar la superficie corporal en niños y adultos. De Boothby WM. Sanditord RB: Boston Med Surg J 1921; 185:337, con permiso.
APÉNDICE 2
•
PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E ÍNDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )
Figura A2-2. Nomograma para determinar la superficie corporal en ninos. (De DuBois EF: Basal Metabolism in Health and Disease. Philadelphia. Lea & Febiger, 1936.)
1423
A P É N D I C E
3
Cálculo aproximado del volumen sanguíneo total (VST)
Para calcular el volumen sanguíneo total (VST) de un paciente, una de las aproximaciones habituales considera que a cada kilogramo de peso corporal le corresponden 70 mi de VST. Es útil en muchos pacientes, sin embargo, en otros, especialmente en niños y adultos con sobrepeso, la cifra obtenida mediante este cálculo proporciona una aproximación inexacta del VST real. Para estos pacientes existen métodos de estimación del VST más adecuados.
volumen sanguíneo más ajustada a cada individuo que la regla de 70 ml/ kg (Gilcher, 1996).
Varones ! Mujeres
Obeso
Delgado
Normal
Atlètico
60 55
65 60
70 65
75 70
NIÑOS
ADULTOS
El Espectro de COBE emplea la fórmula de Nadler y Alien para calcular el VST aproximado de los pacientes (COBE Spectra Apheresis System Operator's Manual, 1997). Esta fórmula utiliza la estatura, el peso y el sexo del paciente para calcular el VST. La fórmula específica es la siguiente: 3
Varones: VST(ml) = 604 + [367 x estatura (m)] + [32,2 x peso (kg)]
El cálculo de Nadler y Alien es particularmente inexacto en niños, y en especial en varones prepuberales, a los que se recomienda aplicar los valores del sexo femenino para mejorar la estimación (Kim. 2000). Pueden emplearse los siguientes valores de VST por kilogramo de peso corporal (Oski. 1993). Neonatos prematuros Neonatos a término Bebés y preescolares
89-105 тЬ'кд 82-86 ml/kg 73-82 ml/kg
3
Mujeres: VST(ml) = 183 + [356 x estatura (m)] + [33,1 x peso (kg)] EL VST también puede calcularse empleando el área de superficie corporal (Shoemaker, 1989): 2
Varones: VST = 2.740 ml/m
2
Mujeres: VST = 2.370 ml/m
Otra aproximación relativamente sencilla, que se muestra a continuación, emplea la denominada "regla del cinco" de Gilcher, y es una estimación de
COBE" Spectra'" Apheresis System Operator's Manual: Lakewood, CO, Gambro* BCT, 1997, p1. Shoemaker WC: Fluids and electrolytes in the acutely ill adult. In Shoemaker WC, Ayres S. Grenvik A, et al. (eds): Textbook of Critical Care, 2nd ed. Philadephia, WB Saunders Company, 1989, p 1130. Gilcher RO: Apheresis: Principles and practices. In Rossi EC, Simon TL, Moss GS, Gould SA (eds): Principles of Transfusion Medicine. 2nd ed. Baltimore, Wiliams & Wilkins, 1996, p 542. Kim HC: Therapeutic pediatric apheresis. J Clin Apheresis 2000; 15:129-157. Oski FA: The erythrocyte and its disorders. In Nathan DG, Oski FA (eds): Hematology ot Infancy and Childhood. 4th ed, Philadelphia, WB Saunders Company, 1993, p 28.
El nuevo lormato IUPAC numera los grupos del 1 al 18. También se mueslra el sistema numèrico IUPAC previamente empleado por el Chemical Abstract Service (CAS). Para los elemenios radiactivos no presentes en la naturaleza, se muestra enlre paréntesis el nùmero de masa del isotopo más es'able De Lide DR. Fredenkse HPR CRC Handbok ol Chemislry and Physics. 74ih ed 1993-1994. Boca Raion. FL. CRC Press. 1993. Leigh GJ (ed). Nomenclalure ol Inorganic Chemistry. Oxford. Blackwell Scientific Publications. 1990. Chemical and Engineering News. 1985,63:27.
A P É N D I C E
5
Unidades del Sistema Internacional (SI) • H. Peter Lehmann, Ph D. • John Bernard Henry, M.D. El SI consiste en siete unidades básicas de dimensión independientes que se enumeran en la Tabla A5-1, junto con los simbolos que corresponden a dichas unidades. La Tabla A5-2 muestra una serie de unidades derivadas del SI utilizadas en el laboratorio clínico. Hay dos tipos de unidades derivadas: las unidades coherentes, que derivan directamente de las unidades básicas sin emplear (actores de conversión, y las unidades incoherentes, generadas a partir de las unidades básicas y que contienen un factor numérico con el fin de obtener cifras más prácticas. La Tabla A5-3 muestra los prefijos que se refieren a las fracciones o múltiplos de las unidades SI básicas o derivadas. La descripción completa de las unidades SI y su aplicación en medicina se encuentra en la publicación de la Organización Mundial de la Salud The SI for the Health Proflessions (Worid Health Organization, 1977). Un compendio de cantidades y sus unidades SI recomendadas se describe en Tietz (1995). Para la conversión de las unidades SI recomendadas (Tablas A5-4 hasta A5-13). se aplicaron las siguientes normas: 1. Todos los intervalos de refencia se han convertido a unidades SI excepto en los casos en que las determinaciones no son cuantitativas. 2. Los nombres químicos no se han modificado; por ejemplo, se mantiene el término urea en lugar de carbamida. 3. Los factores son los publicados por el Consejo Métrico Nacional Americano (Lundberg, 1986; Young, 1987: Beeler, 1987), basado en los factores de la Comisión Métrica de Canadá (1981). 4. Los factores para la unidad básica se calculan para un volumen de 1 litro. 5. El orden de magnitud de los factores se calcula para que los valores de las unidades SI rindan cifras convenientes- por ejemplo, se emplean prefijos para valores superiores a 1.000 o inferiores a 0,001. 6. El valor de las unidades SI recomendadas es equivalente al valor que resulta de aplicar el factor a las unidades convencionales. 7. Para compuestos de masa molecular relativa no definida (por ejemplo, proteínas), los intervalos de referencia se convierten en cantidad de masa por litro. 8. Para mezclas de composición indeterminada (por ejemplo, los fosfolípidos), los intervalos de referencia se convierten en cantidad de masa por litro o se basan en un estándar determinado -por ejemplo, DHEA para 17-cetosteroides. 9. Las cantidades de naturaleza relativa, normalmente expresadas en porcentaje -p. ej., fracciones de isoenzimas de LD- se representan como fracciones. 10. Las unidades enzimáticas se reflejan como Unidades Internacionales por litro (U/litro). A pesar de que el katal es la unidad del SI que corresponde a la actividad catalítica (incluidos los enzimas), y se define como el número de moles de sustrato transformados por segundo en condiciones determinadas, sin embargo, su empleo es limitado. —
_.
_
Tabla A5-1 U n i d a d e s básicas d e l S I Cantidad Longitud Masa Tiempo Intensidad de corriente eléctrica Temperatura termodinámica Intensidad lumínica Cantidad de sustancia
Nombre
Símbolo
metro kilogramo segundo amperio kelvin candela mol
m kg s A K ed mol
Tabla A5-2 U n i d a d e s S I derivadas Cantidad Área Volumen
Nombre de la unidad metro cuadrado* metro cúbico' litro'
Concentración masa kilogramo/litro' suslancía mol/litro Molalidad mol/kilogramo Densidad kilogramo/litro Fracción de masa kilogramo/kilogramo Fracción molar mol/mol Concentración numérica número/litro Temperatura grado Celsio" Presión pascal' Frecuencia herzio" Aclaramiento litro/segundo Potencial eléctrico voltio" Energía julio" ' Unidad derivada coherente I Unidad derivada incoherente • Tanto ' L" como "I" son símbolos del litro. T
1
:
Símbolo de la unidad m-' m' L = dm ' :
J
kg/l mol/l kg/l kg/l kg/kg mol/mol L °C = ° K - 273.15 Pa = kg/ms Hz = 1 cycle/s Us V = kg m7s A J = kg m /s 1
¿
3
2
?
11. Se mantiene la escala de pH para medir la concentración de iones de hidrógeno. 12. Actualmente, se recomienda mantener la unidad de mm de Hg para referirse a la presión (P , P ). 13. Los porcentajes se expresan en el SI como fracciones, donde una fracción es una cantidad indefinida que viene dada por el número de partículas definidas que constituyen un componente específico dividido por el número total de partículas definidas del sistema. c02
02
Beeler MF: SI Units and the AJCP Am J Clin Pathol 1987; 87:140. Lundberg GD, Iverson C. Radulescu G: Now read this: The SI units are here. AJAMA 1986. 255:2329. The SI manual in health care. Ottawa, Sector 9.10 Health and Welfare. Metric Commission of Canada, 1981. Tietz NW (ed): Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia, WB Saunders Co., 1995. World Health Organization: The SI lor the Health Professions. Geneva. WHO, 1977. Young DS: Implementation of SI units for clinical laboratory data: Style speciications and conversion tables. Ann Intern Med 1987, 106:114, Tabla A5-3
Prefijos
Prefijo
Simbolo del prefijo
Factor
exa peta fera giga mega kilo heclo deca deci centi mili micro nano pico femto atto
E P T G M k h da d c m M n P f a
10'" 10 tO 10> iœ 10' 10' 10' 10 ' 10 10' 10° 10 10 IO' 15
14
(
;
?
9
, ?
5
tt>"
APÉNDICE 5
Tabla A5-4
•
U N I D A D E S DEL S I S T E M A I N T E R N A C I O N A L (SI)
1427
Parámetros químicos e n sangre total, suero y plasma I N T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TÍPICOS
COMPONENTE Ácido acatoacético cualitativa cuantitativa Acetona cualitativa cuantitativa Albúmina cualitativa
SISTEMA
— 97,95
Negativa 20-100 Mmol/I
Suero Suero
Negaliva 0.30-2 0 mg/dl
—
Negativa 20-340 pmol/l
Suero
3.2-4.5 g/dl (Iraccionamiento salmo) •: 3,2-5.6 g/dl (electroforesis) 3.8-5.0 g/dl (unión a colorante) Negativa, pero representada como mg/dl 0,2171
32-45 g/l 32-56 g/l 38-50 g/l Negativa, pero representada como mmol/l
3-8 Sibley-Lehninger U/dl a 37" C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadamente 4 veces los niveles del adulto 3.6-7.0 mg/dl 0.01-0.03 mg/dl 20-120 ng/dl (difusión) 40-80 ng/dl (método enzimatico) 12-48 pg/dl (método con resina) 16-120 unidades Somogy/dl 0-4 U/dl < 7 ng/dl 0.6-1.6 mg/dl 0.7-2.0 mg/dl Negativa
22-59 mU/l a 37° C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadamente 4 veces los niveles del adulto 2.6-5.0 mmol/l 0.8-2.3 umol/1 12-70 pmol/l 23-47 Mmol/l 7-28 Mmol/l 30-220 U/1 0-40 U/1 < 0,4 Mmol/l 34-91 Mmol/l 40-114 Mmol/l Negativa
Aldolasa
Suero adultos niños neonatos
Nitrógeno ct-amino ácido Acido S-aminolevulinico Amoniaco
Suero Suero Plasma
Amilasa Arginmsuccinico- liasa Arsénico Ácido ascòrbico (vitamina C)
Suero Suero Sangre total Plasma Sangre total Suero, plasma o sangre total Sangre total varón mujer Suero Plasma Suero Suero
Bases, exceso
Base total Bicarbonato Ácidos biliares Bilirrubina directa (conjugada) indirecta (no conjugada) total total en neonato Gases en sangre (véase Cap 9) PH Sangro total Pco
?
Po Bromuro Calcio ionizado ?
total Dióxido de carbono (contenido en CO,) Dióxido de carbono
Capacidad de combinación del CO. Presión parcial de CO.. (Peo,)
Ácido carbónico (CO ,H,)
Unidades del SI recomendadas'
Negativa 0.2-1,0 mg/dl
Suero y sangre total
Barbitúricos
Factor'
Suero Suero
Alcohol etílico
1
U n i d a d e s convencionales
Sangre total Sangre total Suero Suero Suero Sangre total (arterial) Plasma o suero (arterial) Sangre total (venosa) Plasma o suero (venosa) Plasma o suero (venosa) Sangre total (arterial) Sangre total (venosa) Sangre total (arterial) Sangre total (venosa)
172.95
7,4
07139 76.26 0.5872 1,85 10 0.05055 56 78 —
-3,3 a +1,2 mEq/l -2,4 a +2,3 mEq/l 145-160 mEq/l 21-28 mmol/l 0,3-3,0 mg/dl
1
< 0.3 mg/dl 0.1-1,0 mg/dl 0,1-1,2 mg/dl 1.0-12,0 mg/dl
17.10
< 5 Mmol/l 2-17Minol/l 2-21 Mmol/l 17-205 MOI/I
7,38-7,44 (arterial) 7.36-7,41 (venosa) 35-40 mm Hg (arterial) 40-45 mm Hg (venosa) 95-100 mm Hg (arterial) < 5 mg/dl
1
7,38-7.44 7.36-7,41 4.7-5,3 kPa 5.3-6.0 kPa 12.7-13,3 kPa < 0,63 mmol/l
4.0-4,8 mg/dl 2.0-2,4 mEq/l 30-58% del total 9,2-11,0 mg/dl 4,6-5,5 mEq/l 19-24 mmol/l
1 1 10
0,1333 0.1333 0,125 0,2500 0.5000 0,01 0,2500 0,5000 1
21-28 mmol/l 22-26 mmol/l
-3.3 a +1.2 mmol/l -2.4 a +2.3 mmol/l 145-160 mmol/l 21-28 mmol/l 3.0-30.0 mg/l
1.00-1.20 mmol/l 0.30-1.58 del total 2,30-2.74 mmol/l 19-24 mmol/l 21-28 mmol/l
!
24-30 mmol/l
22-26 mmol/l 24-30 mmol/l
24-30 mmol/l
1
24-30 mmol/l
35-40 mm Hg
0,1333
4.7-5,3 kPa
40-45 mm Hg 1.05-1,45 mmol/l 1.15-1,50 mmol/l
5.3-6.0 kPa 1
1.05-1.45 mmol/l 1.15-1.50 mmol/l La labia continua en la pagina siguiente
¡428 Tabla A5-4
APÉNDICES
P a r á m e t r o s q u í m i c o s en sangre total, s u e r o y p l a s m a (continuación) INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE
Carboxihemoglobina (monóxido de carbono hemoglobina)
SISTEMA Plasma (venoso) Sangre total suburbano no fumador fumador gran fumador Suero Suero Suero
Beta caroteno Ceruloplasmina Cloruro Colesterol total (véase Cap. 12)
Suero
esteres Colinesterasa (seudocolínesterasa)
Suero Eritrocitos Plasma
Citrato Cobre
Suero o plasma Suero, plasma varón mujer Plasma 8 A.M. - 10 A.M. 4 P.M. - 6 P.M. Suero o plasma varón mujer Suero varón mujer Suero o plasma Suero o plasma y orina varón mujer Suero Suero
Cortisol
Crea li na
Creatina quinasa (CK)
Creatmina (véase Cap. 10) Aclaramiento de creatinina (endógena) (véase Cap. 9) Crioglobulinas Electroforesis de proteínas albúmina alfa-1 alla-2 beta gamma
Suero albúmina alfa-1 alfa-2 beta gamma Grasas neutras (ver triglicéridos) Ácidos grasos total (libres y esterificados) libres (no esterificados) Ferritina
Fibrinógeno Fluoruro Folato
Suero Plasma Suero varón mujer Plasma Sangre total Suero Eritrocitos
Galactosa
Gammaglobulina Globulinas totales Glucosa, en ayunas
Sangre total adultos niños Suero Suero Suero o plasma Sangre total
Unidades c o n v e n c i o n a l e s
Factor"
Unidades del SI recomendadas*
1,02-1,38 mmol/l < 1,5% saturación de hemoglobina
1.02-1.38 mmol/l 0,01
Fracción de hemoglobina saturada
0,01863 10 1
0,015-0.050 0,050-0 090 0,7-3,7 timol/l 230-500 mg/l 95-103 mmol/l
150-250 mg/dl (varía con la dieta, el sexo y la edad) 65-75% del colesterol total 0,65-1.3 pH unidades 0.5-1.3 pH unidades 8-18 U/l a 37° C 1.7-3,0 mg/dl
0.02586
3.88-6,47 mmol/l
0,01 1
Fracción de colesterol total: 0.65-0,75 0,65-1,3 unidades' 0.5-1,3 unidades 8-18 U/l a 37" C 88-156 umol/l
70-140 u. g/dl 80-155 ug/dl
0,1574
11-22 Mmol/l 13-24 u.mol/1
5-23 ug/dl 3-13 (i g/dl
27,59
138-635 nmol/l 83-359 nmol/l
0,1-0,4 mg/dl 0,2-0,7 mg/dl
76,25
8-31 umol/l 15-53 Mmol/l
1
55-170 U/l a 37° C 30-135 U/l a 37° C 53-106 nmol/l 27-53 u.mol/1
107-139 ml/min 87-107 ml/min Negativa
0.01667
1,78-2.32 ml/s 1.45-1.78 ml/s Negativa
52-65% de la proteina total 2,5-5,0% de la proteína total 7,0-13.0% de la proteina total 8,0-14.0% de la proteina total 12.0-22,0% de la proteína total Concentración 3,2-5,6 g/dl 0.1-0,4 g/dl 0.4-1,2 g/dl 0,5-1,1 g/dl 0,5-1,6 g/dl
0,01 0,01 0,01 0,1 0,01
Fracción de proteínas totales: 0,52-0,65 0.025-0.05 0.07-0,13 0.08-0.14 0,12-0,22
10
32-56 ql 1-4 gl 4-12 gl 5-11 gl 5-16 gl
9-15 mmol/l 300-480 u£q/l
1 1
9-15 mmol/l 300-480 umol/l
15-200 ng/ml 12-150 ng/ml 200-400 mg/dl < 0,05 mg/dl
1 1 0,01 0,5263 2,266
15-200 MO/' 15-150 MQ/I 2,00-4.00 g/l < 0,027 mmol/l 11-57 nmol/l > 5 nmol/l 376-1.450 nmol/l > 317 nmol/l
l ,5-5.0% saturación 5,0-9.0% saturación 40-200 ug/dl 23-50 mg/dl 95-103 mEq/l
55-170 U/l a 37° C 30-135 U/l a 37" C 0,6-1,2 mg/dl (adulto) 0,3-0.6 mg/dl (niños < 2 años)
i 52,05
1 88,40
> 3,5 ng/ml (análisis isotópico) 166-640 ng/ml (bioensayo) > 140 ng/ml (análisis isotópico) Ninguna < 20 mg/dl 0,5-1,6 g/dl 2,3-3,5 g/dl 70-110 mg/dl 60-100 mg/dl
0,05551 10 10 0,05551
Ninguna < 1,11 mmol/l 5-16 g/l 23-35 g/l 3.9-6,1 mmol/l 3,3-5.6 mmol/l J
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Tabla A5-4
P a r á m e t r o s q u í m i c o s en sangre total, suero y plasma (continuación) I N T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TÍPICOS
COMPONENTE Tolerancia a la glucosa oral
intravenosa
Glucosa- 6-loslato deshidrogenasa (G6PD) •y-Glulamiltransferasa Gluiatión Hormona del crecimiento Guanasa Haptoglobina Hemoglobina
(i-hiúroxibutirico deshiclrogenasa 17- hidroxicosticosleroides
Inmunoglobulinas: IgG IgA
IgM IgM igD igE Insulina Tolerancia a la insulina (0.1 unidades/kg)
SISTEMA Suero o plasma en ayunas 30 min
20-50 mg/dl sobre nivel en ayunas
120 min
5-15 mg/dl sobro nivel en ayunas
180 min Suero o plasma en ayunas 5 min 60 min 120 min 180 min Eritrocitos Suero Sangre total Suero Suero Suero Suero o plasma cualitativo cuantitativo Sangre total varón mujer Suero
Plasma análisis isotópico bioensayo Suero en ayunas 30 min
Suero
Cuerpos cetónicos 17-Ketosteroids Ácido láctico (como lactato)
Suero Plasma Sangre total venosa arterial Suero
Factor*
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s
0,05551
3.9-6.1 mmol/l 1.7-3.3 mmol/l por encima de nivel en ayunas 1.1-2.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas 0.3-0.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas Nivel en ayunas o inferior
Igual o inferior al nivel en ayunas 70-110 mg/dl Máximo de 250 mg/dl Descenso signiticativo Inferior a 120 mg/dl Nivel en ayunas 250-500 unidades/10' células 1 200-2 000 mlU/ml de concentrado de eritrocitos 5-40 IU/I 24-37 mg/dl < 10 ng/ml < 3 nmol/ml/min 60-270 mg/dl
I 0,03254 1 1 0,01
Negativa 0.5-5.0 mg/dl
10
12.0-16,0 g/dl 13,5-18,0 g/dl 140-350 U/ml
Plasma varón 7-19 ug/dl mu|er 9-21 ug/dl tras 24 unidades USP de ACTH IM (tniramuscular) 35-55 ug/dl Suero 800-1,801 mg/dl 113-563 mg/dl 54-222 mg/dl 0,5-3,0 mg/dl 0,01-0.04 mg/dl
Isocitrico deshidrogenasa
Láclalo deshidrogenasa isoenzimas LD.(ánodo) LD, LD, LD, LD, (cátodo)
70-1l0mg/dl 30-60 mg/dl sobre nivel en ayunas
60 min
90 min Hierro lotal Suero Capacidad de fijación de hierro Suero Saturación de hierro Suero
Lactato deshidrogenasa (LD)
Unidades c o n v e n c i o n a l e s
1 1
10 1 25,59'
1
3.9-6.1 mmol/l Máximo de 13.9 mmol/l Descenso significativo Inlenor a 6.7 mmol/l Nivel en ayunas 250-500 punidades/célula 1 200-2 000 U/1 de concentrado de eritrocitos 5-40 U/1 a 37° C 0,78-1.20 mmol/l
<10|ig/l <3 U/l a 37° C 0.6-2.7 g/l Negativa 5-50 mg/1 120-160 g/l 135-180 g/l 140-350 kU/l 193-524 mmol/l 248-579 mmol/l 966-1.517 mmol/l
0,01 III
8,0-18.0 g/l 1,1-5.6 g/l 0,5-2,2 g/l 5.0-30.0 mg/l 0.1-0,4 mg/l
11-240 plU/ml 4-24 ulU/ml
7,175"
79-1722 pmol/l 29-172 pmol/l
Glucosa de 70-110 mg/dl Descenso hasta el 50% de los niveles en ayunas Nivel en ayunas 60-150 pg/dl 250-400 ug/dl 20-55%
0.05551 0.01
Glucosa de 3,9-6 1 mmol/l Descenso hasta 0.5 de los niveles en ayunas Nivel en ayunas 10.7-26.9 jimol/l 44,8-71,6 umol/l Fracción de la capacidad total de fijación de hierro; 0,20-0,55 0,83-4,18 U/l a 25° C
0.1791 0.1791 0,01
50-240 unidades/ml a 25" C (unidades Wolfson-Williams Ashman) Negativa 25-125 ug/dl
0,0166
5-20 mg/dl 3-7 mg/dl (lactato-»piruvato) 80-120 unidades a30°C (piruvato->lactato) 185-640 unidades a 30° C (lactato-»piruvato) 100-190 U/l a 37° C
0,1110
17-27% 27-37% 18-25% 3-8% 0-5%
0.01
—
34,67*
Negativa 866-4.334 nmol/l
0 48
0.6-2.2 mmol/l 0.3-0.8 mmol/l 38-62 U/1 a 30" C
048
90-310 U/l a 30° C
1
100-190 U/l a 37° C
Suero Fracción de LDH lotal 0.17-0,27 0 27-0,37 0 18-0.25 0 03-0.08 0.00-0.05 La labia continúa en la pagina siguiente
1430
APÉNDICES
Tabla A5-4
Parámetros químicos e n sangre total, suero y p l a s m a (continuación) INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE
SISTEMA
Unidades convencionales
Láclalo deshidrogenasa (termoeslable) Tolerancia a la lactosa
Suero
30-60% del total
Suero
Plomo Leucina-aminopeptidasa (LAP)
Sangre total Suero varón mujer Suero
Cambios en la glucosa sérica a los de la prueba de tolerancia a la glucosa < 50 ug/dl
Lipasa Lípidos totales colesterol (véase Cap. 12) triglicéridos (véase Cap. 12) fosfolípidos ácidos grasos (libres) Fósloro en (oslollpidos Litio intervalo terapéutico Hormona estimulante del tiroides de acción prolongada (LATS) Hormona luteinizante (LH)
Suero
Suero Suero
Suero varón mujer
80-200 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 75-185 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 0-1.5 U/ml (Cherry-Crandall) 14-280 mlU/ml 400-800 mg/dl 150-250 mg/dl 10-90 mg/dl 150-380 mg/dl 9,0-15,0 mmol/l 8,0-11,0 mg/dl Negativa 0,5-1,4 mEq/l Indetectable
Magrogiobulinas totales Magnesio
Suero Suero
Metahemoglobina
Sangre total
Mucoproteína Muraminidasa Mioglobina Nitrógeno no proteico (NPN)
Suero Suero Suero Suero o plasma Sangre total Suero Suero
6-30 mlU/ml Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopáusico < 30 mlU/ml Posmenopáusico > 35 mlU/ml 70-430 mg/dl 1,3-2,1 mEq/l 1,8-3,0 mg/dl < 0,24 g/dl < 1% de la hemoglobina lotal 800-200 mg/dl 4-13 mg/l < 90 ug/l 20-35 mg/dl 25-50 mg/dl 0-1.6 unidades a 37° C 8-20 mlU/ml a 37° C
Suero
5-Nucleotidasa Ornítina-carbamiltransterasa Osmolalidad Oxígeno (véase Cap 9) presión (PO ) ?
contenido saturación PH
Fenilalanina
Fosfatasa loslatasa acida toslatasa alcalina Fósloro en fostolipidos (véase lípidos totales) Fostolípidos (véase lípidos totales) Fósforo inorgánico
1
Factor*
Unidades del SI recomendadas
0.01
Fracción de LDH total: 0,30-0 60
0,04826
Cambios en la glucosa sérica similares a los de la prueóa de tolerancia a la glucosa < 2.41 umol/l
0,24 278 1 0,01 0,02586 0.01129" 0.01 1 0.3229
— I
:
6-30 IU/I Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopáusico < 30 IU/I Posmenopáusico > 35 IU/I 0,7-4,3 g/l 0,65-1,05 mmol/l 0,74-1,23 mmol/l < 2,4 g/l Fracción de hemoglobinal total <0,01 0,8-2,0 g/l 4-13 mg/l < 90 ug/l 14,3-25.0 mmol/l 17,8-35.7 mmol/l 0-1.6 unidades a 37" C 8-20 U/l a 37° C
280-295 mOsm/kg
l
280-295 mmol/kg
Sangre total (arterial) Sangre tolal (arterial) Sangre total (arterial) Sangre total (arterial) Sangre tolal (venosa) Suero o plasma (venoso) Suero adultos neonatos (a término)
95-100 mm Hg
0.1333
12.7-13.3 kPa
15-23% de volumen
0,01
Fracción del volumen: 0,15-0,23
< 3,0 mg/dl 1,2-3.5 mg/dl
60,54
< 182|imol/l 73-212 umol/l
Suero
0,13-0.63 U/la 37" C (p-nitrofenilfosfato) 20-130 IU/I a 37" C (p-nitrofenilfosfato en lampón AMP)
16,67
2,2-10,5 U/l a 37" C
l
20-130 U/l a 37" C
2,3-4,7 mg/dl 4,0-7,0 mg/dl
0.3229
0,74-1.52 mmol/l 1,29-2,26 mmol/l
Suero
Suero adultos niños
1
19.2-48,0 U/l 18.0-44,4 U/l 0-417 U/l 14-280 U/l 4,00-8,00 g/l 3.88-6,47 mmol/l 0,11-2.15 mmol/l 1.50-3,80 g/l 9.0-15,0 mmol/l 2.58-3.55 mmol/l Negativa 0.5-1.4 mmol/l Indetectable
0,01 0,5000 0,4114 10 0.01 0.01
0.7139
94-100% 7,38-7,44
Fracción saturada: 0,94-1.00 I
7.38-7,44
7,36-7.41
7.36-7,41
7,35-7,45
7,35-7,45
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Tabla A5-4
Parámetros químicos en sangre total, suero y plasma (continuación/ INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE
SISTEMA
Potasio Prolactina Proteínas (ver Cap 13) totales albúmina globulina Fraccionamiento de proteínas Protoporlirina Piruvato Saliciiatos intervalo terapéutico Sodio Sulfato inorgánico Sullohemoglobina Sulfamidas Testoslerona
Plasma Suero varón mujer Suero
Eritrocitos Sangre total Suero Plasma Suero Sangre total Suero o sangre total Suero o plasma varón mujer Suero Suero
Unidades convencionales
Factor"
3,8-5.0 mEq/l
1
3,8-5,0 mmol/l
1-25ng/ml 1-20 ng/ml
1
1-25 ug/l 1-20 ug/l
6.0-7.8 g/dl 3.2-4.5 g/dl 2.3-3.5 g/dl Véase electroforesis 15-50 mg/dl 0.3-0,9 mg/dl Negativa 15-30 mg/dl 136-142 mEq/l 0,2-1,3 mEq/l 0,9-6.0 en mg/dl as SO, Negativa Negativa
10
60-78 g/l 32-45 g/l 23-35 g/l Ver eleclroforesis 0.27-0.89 nmol/l 34-102umol/l Negativa 1.08-2,17 mmol/l 136-142 mmol/l 0.10-0,65 mmol/l 0.09-0.63 mmol/l a SO, Negativa Negativa
0.01777 113.6 — 0.07240 1 0.5 0.1042
300-1.200 ng/dl 30-95 ng/dl Negativa
—
Suero
5.5-12.5 ug/dl 0,9-2,3 ng/dl 25-38% relativo de captación
12,87 12,87 0,01
tiroxina fijadora de globulina (TBG) tirotropina Iriyodotironina (T,) Translerasas aspartato amino-transferasa (AST o SGOT) alanina amino-transferasa (ALT o SGPT) gamma glutámicotransferasa (GGT) Triglicóridos (véase Cap. 12) Troponina I
Suero
10-26 ug/dl
10
Nitrógeno uréico Aclaramiento de urea aclaramiento máximo aclaramiento estándar
Suero Suero y orma
Ácido úrico
Suero varón mujer Suero Suero ayuno de 3 horas o 6 horas después de 5000 unidades de vitamina A / kg en 24 horas
Tiocianato Pruebas de hormona tiroidea (véase Cap. 169 tiroxina total (T ) tiroxina libre (T, libre) captación de T por resina 4
3
Vitamina A Tolerancia a la vitamina A
Vitamina B,, Vitamina B,, no saturada capacidad de fijación Vitamina C Xilosa, absorción
Zinc
0.03467
0.5-5 ulU/ml Suero Suero
Suero Suero
Suero Suero Plasma Suero normal en malabsorción
Suero
Unidades del SI recomendadas'
10.4-41.6 nmol/l 1.0-3.3 mmol/l Negativa 71-161 nmol/l 12-30 pmol/l Fracción de captación relativa 0.25-0,38 100-260 ug/l 0.5-5 ulU/l 1.23-3 de nmol/l
80-200 mg/dl
0.0154
8-33 U/l a 37° C
1
4-36 U/l a 37" C
1
5-40 IU/I a 37° C 10-190 mg/dl < 2.0 mg/ml
1 0.01129'
8-23 mg/dl
0.357
64-99 ml/min 41-65 ml/min. o más del 75% del aclaramiento normal
0.01667
1.07-1.65 l/s 0.68-1,08 l/s o superior al 0,75 del aclaramiento normal
4,0-8,5 mg/dl 2,7-7,3 mg/dl
0,05948
0,24-0,51 mmol/l 0,16-0,43 mmol/l 0,52-2,09 umol/l
15-60 ug/dl
0.03491
15-60 ng/dl
0.03491
8-33 U/l a 37° C 4-36 U/l a 37° C 5-40 U/l a 37° C 0.11-2.15 mmol/l 0.06 ug/l 0.01 ug/l 2.9-8 2 mmol/l
0.52-2.09 nmol/l
200-600 ug/dl Valores en ayunas o ligeramente superiores 160-950 pg/ml 1.000-2.000 pg/ml
0.7378 0.7378
6,98-20.95 nmol/l Valores en ayunas o ligeramente superiores 118-701 pmol/l 738-1475 pmol/l
0.6-1.6 mg/dl
56.78
34-91 nmol/l
25-40 mg/dl entre 1 y 2 horas Máximo aproximadamente de 10 mg/dl Dosis: adultos 25 g de o-xilosa niños 0.5 g de o-xilosa/kg 50-150 tag/dl
0,06661
1.67-2.66 mmol/l entre 1 y 2 horas Máximo aproximadamente de 0.67 mmol/l
0,1530
7,7-23,0 nmol/l
" Fíiclor = tactor numérico (observar que no se presentan las unidades) Valor en unidades del SI = valor en unidades convencionales x tactor. Generalmente no determinado en sangre (las muestras de elección son la orina, el pelo o las uñas, en los casos agudos se analiza el contenido gástrico) Unidad basada en la concentración del ion de hidrógeno Como cortisol " Como DHEA "* Como trioleina • • Una (1) Unidad Internacional de insulina corresponde a 0.04167 mg del Cuarto Estándar Internacional (mezcla del 52% de insulina bovina y el 48% de insulina porcina) 1 1
1
1432
Tabla A5-5
APÉNDICES -
Orina INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE Ácido aceloacélico Acetona Addis, recuento de
Albúmina cualitativa cuantitativa Aldosterona Cuerpos alcaptónicos Nitrógeno u-aminoácido Ácido 6-aminolevuilnico
Nitrógeno amónico Amilasa Arsénico Ácido ascórbico Proteína de Bence-Jones Berilio Bilirrubina cualitativa Sangre oculta Borato Calcio cualitativo (Sulkowitch) cuantitativa
Catecolaminas
SISTEMA
Al azar Negativa Al azar Negativa recogida de 12 horas Leucocitos y células epiteliales 1.800.000/12 h RBC 500.0000/12 h Moldes hialinos: <5.000/12 h
—
Al azar 24 h 24 h Al azar 24 h Al azar adulto niños 24 h 24 h 2h 24 h Al azar 24 h Al azar 24 h Al azar Al azar 24 h Al azar 24 h dieta normal dieta baja en calcio dieta rica en calcio Al azar 24 h
epinelnna norepinefrina catecolaminas libres totales metanefrinas totales Cloruro 24 h Prueba de concentración Al azar - después de restricción de (Fishberg) líquidos gravedad especifica osmolalidad Cobro 24 h Coproporfinna Al azar adulto 24 h adulto niños 24 h Creatina varón mujer
Creatinina
24 h varón mujer
Cistina cualitativa Cistma y cisteina Deshidroepiandrosterona
Ácido díacético Epinelnna
Factor*
Unidades c o n v e n c i o n a l e s
Al azar 24 h 24 h varón mujer Al azar 24 h
Unidades del SI recomendadas'
i
Negativa Negativa 1,8 x 10« 12 h
l 1
0,5 x 10 12 h <5,0 x 10 12 h
Negativa 15-150 mg/d 2-26 ug/d Negativa 100-290 mg/d
— 0,001 2,774
Negativa 0,015-0,150 g/d 6-72 nmol/d Negativa 7,1-20,7 mmol/d
0,1-0.6 mg/dl <0,5 mg/dl 1,5-7,5 mg/d 20-70 mEq/d 500-1.200 mg/d 35-260 unidades Somogyi/hora <50 pg/i 1-7 mg/dl >50 mg/d Negativa <0,5 pg/d Negativa Negativa <2 mg/l
76,26
1 + turbidez
0,07139
7,626 1 0.07139 0.1850 0.01335 56,78 5,678
— 111,0
— — 16,44 •
1
3
8-46 pmol/l <38 pmol/l 11-57 u.mol/d 20-70 mmol/d 35.6-85.7 mmol/d 6,5-48.1 U/h <0,67 j-mol/l 57-397 u.mol/1 >284 pmol/d Negativa <5,55 nmol/d Negativa Negativa <32 pmol/l 1 + turbidez
100-240 mg/d < 150 mg/d 240-300 mg/d <14 pg/dl <100 ug/d (varia con el ejercicio físico) <10 ng/d <100 ng/d 4-126 pg/d 0,1-1,6 mg/d 140-250 mEq/d
0.02495
> 1.025 >850 mOsm/kg <50 pg/d
1 1
0,01574
> 1,025 >850 mmol/kg <0,8 pmol/d
3-20 pg/dl
15,27
46-305 nmol/d
50-160 pg/d <80 pg/d
1,527
76-244 nmol/d <122 nmol/d
<40 mg/d <100 mg/d Superior en niños y durante el embarazo
7,625
<305 pmol/d <763 pmol/d Superior en niños y durante el embarazo
20-26 mg/kg/d 1,0-2,0 g/d 14-22 mg/kg/d 0,8-1,8 g/d Negativa 10-100 mg/d
8,840 8,840 8.840 8 840
177-230 pmol/kg/d 8,8-17,7 mmol/d 124-195 pmol/kg/d 7,1-15,9 mmol/d Negativa 42-416 pmol/d
0,2-2.0 mg/d 0,2-1,8 mg/d Negativa <20 pg/d
3,467
59.11* 5,911* 5,458 5,911 5.911* 5,458* 1
4.161*
5,458
2,5-6,0 mmol/d <3,7 mmol/d 6,0-7,5 mmol/d <828 nmol/d <591 nmol/d <55 nmol/d <591 nmol/d 24-745 nmol/d 0.5-8,7 pmol/d 140-250 nmol/d
0,7-6.9 pmol/d 0.7-6.2 pmol/d Negativa <109 nmol/d La labia continúa en la página siguiente
APÉNDICE 5
•
UNIDADES
DEL
SISTEMA
INTERNACIONAL
DE
1433
(SI)
Tabla A5-5 Orina (continuación) INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS SISTEMA
COMPONENTE Eslrógenos lolales
h varón hembra ovulación máximo luteinico menstrual embarazo posmenopáusico 24 h. no embarazo mitad del ciclo —
estrona (E,) estradiol (E.,) estriol (E ) Grasa cualitativa FIGLU (Acido Nformiminogiutámico)
—
3
Fluoruro Hormona foliculoestimulante (FSH)
Fructosa Glucosa cualilativa cuantitativa sustancias reductoras del cobre glucosa en azucares totales Gonadotropinas pituitarias (FSH y LH) Etiocolanolona
11-
11-
11-
Factor*
Unidades del SI recomendadas*
24
Iraccionados
11-
Unidades convencionales
hidroxiandrosterona
hidroxietiocolanolona
cetoandrosterona
celoeliocolanolona
Lactosa Plomo Magnesio Melanina cualitaliva Mucina Muramidasa (lísozima) Mioglobina cualitativa cuantitativa Osmolalidad Pentosas pH Fenosullataleina (PSP)
Al azar 24 h
ug/d
ug/d Hasta 4 5 . 0 0 0 ug/dia Hasta 10 ug/dia
Negativo
3.468
— 5,740
7 - 9 3 nmol/d < 3 7 nmol/d 7 - 1 0 4 nmol/d Negativa < 7 , 2 umol/d 2 3 . 0 umol/8 h
h
U/l U/l
52,63
< 5 3 umol/d
1
4-25 4-30
IU/I IU/I
•
40-50
2 x basal
1
30-65
0,005551
2 x basal 0 , 1 7 - 0 . 3 6 mmol/d
—
Negativa
40-50
U/l mg/d
0.5-1.5
h varón mujer 24 h varón mujer 24 h varón mujer 24 h varón mujer 24 h varón mujer 24 h 24 h 24 h Al azar 24 h 24 h
3,468
3.671
mg/d
4-30
0.003468
3.699
2 - 2 5 iig/d < 1 0 ug/d 2 - 3 0 ug/d Negativo < 3 mg/d
4-25
nmol/d nmol/d 1 4 - 8 7 nmol/d Más de 1 5 6 nmol/d Más de 35 nmol/d 76-364
4-25
<1
1 7 - 6 2 nmol/d 97-347
22-80
Al azar 24 h
h
S
28-100
4 mg/8
24
3,468
ug/d
tras 15 g de L-histidina 24 h 24 h adulto prepuberal posmenopáusico mitad del ciclo 24 h
1
g/d
1
IU/I
0,5-1,5
g/d
Media de 2 5 0 mg/d Media de 1 3 0 mg/d 1 0 - 5 0 U/l
0,005551 1
Media de 2 5 0 mg/día Media de 0 . 7 2 mmol/día 1 0 - 5 0 lU/d
3.443
4,8-17,2
24
1.4-5,0
mg/d
0.8-4,0
mg/d
0.1-0,8
mg/d
<0,5
2,8-13,8 3.263
0,3-2,6
3.26
0,7-2,0
mg/d
0.2-0,6
mg/d
0.1-1,1
mg/d
0.2-1,0
mg/d
0,2-0,8
mg/d
0.2-1,0 0.2-0,8
mg/d mg/d
3.274
3.274 2.291 0,004826
100-150 1 3-36
Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mOsm/kg de agua 2 - 5 mg/kg/d
min 6 0 min 1 2 0 min Al azar
colorante excretado 9 - 1 7 % colorante excretado 3 - 1 0 % colorante excretado Negativa
4.6-8,0
20-50% 16-24%
0.5000
—
mg/d
mg/d
colorante excretado
nmol/d < 1,6 nmol/d
0,7-3,3 0,7-2,6
14-40
mg/d ug/d 6 . 0 - 8 , 5 mEq/d Negativa
umol/d nmol/d
nmol/d nmol/d
0,3-3,63
< 100
Al azar 24 h Al azar 24 h Al azar Orina recogida tras administración de 6 fng de PSP i.v. 1 5 min 30
Ácido fenilpirúvico. cualtitativo
5-18
nmol/d nmol/d
nmol/d nmol/d 4 1 - 1 1 7 nmol/d < 0 , 4 8 nmol/d 3 . 0 - 4 , 3 mmol/d Negativa 0,7-3,3 0,7-2,6
100-150
I
—
1.3-36
mg/d mg/d
1
Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mmol/kg 2 - 5 mg/kg/d
1
4,6-8.0
0.01
Fracción de colóranle excretado:
I 1
0.20-0.50 0.16-0.24 0.09-0.17 0.03-0,10
Negativa La tabla continua en la página siguiente
1434
APÉNDICES
Tabla A5-5 Orina (continuación) INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS SISTEMA
COMPONENTE
Unidades convencionales
1
Factor*
Unidades del SI recomendadas
Fósforo Porfobilinógeno cualitativo cuantitativo Potasio Pruebas de embarazo
Al azar
0,9-1,3 g/d
32,29
29-42 mmol/d
Al azar 24 h 24 h Muestra matutina concentrada
Negativa <1,0 mg/d 40-80 mEq/d Positiva en embarazo normal o en presencia de tumores productores de gonadotropina coriónica
—
Negativa <4,4 pmol/d 40-80 mmol/d Positiva en embarazo normal o en presencia de tumores productores de gonadotropina coriónica
Pregnanediol
24 h varón mujer pico
<1,5 mg/d 1 -8 mg/d 1 semana después de la ovulación
3.120
4,420 1 —
<4.7 pmol/d 3-25 pmol/d 1 semana después de la ovulación <156 pmol/d Negativa
3.120
Sustancias reductoras, total Sodio Sólidos, totales
embarazo niños 24 h varón mujer niños Al azar 24 h 24 h 24 h 24 h
Peso especifico
Al azar
Azúcares (excepto glucosa) Acidez titulable Nitrógeno ureico Ácido úrico Urobilinógeno
Al azar 24 h 24 h 24 h 2h 24 h
Uropepsina
Al azar 24 h
1,001-1,035 (rango) Negativo 20-50 mEq/d 6-17 g/d 250-750 mg/d 0,3-1,0 unidades Ehrlich 0,05-2,5 mg/d o 0,5-4,0 unidades Ehrlich/dia 15-45 unidades/hora (Anson) 1.500-5.000 unidades/día (Anson)
Al azar 24 h 24 h
Negativa 10-30 pg/d 1,5-7,5 mg/d
— 1,204 5,046
Negativo 12-36 nmol/d 7,6-37.9 umol/d
24 h 24 h
600-1.600 ml/d 0,15-1,2 mg/d
0.001 15,30
0,6-1,6 l/d 2,3-18,4 pmol/d
Pregnanetriol
Proteína, cualitativa
Uroporfirinas cualitativa cuantitativa Ácido vanilmandélico (VMA) Volumen, total Zinc
<50 mg/d Negativa 0,4-2,4 mg/d 0,5-2,0 mg/d Más de 1 mg/d Negativo 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 75-200 mEq/d 55-70 g/d Disminuye con la edad hasta 30 g/día 1,016-1,022 (ingesta líquida normal)
2,972
—
1 1 1 1 1
— 1 35 70 0,005948 1 1,693 1 7,37
1,2-7.1 nmol/d 1,5-5,9 nmol/d Más de 3 j-mol/d Negativa 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 75-200 mmol/d 55-70 g/d Disminuye con la edad hasta 30 g/dia Densidad relaliva (U 20° C/agua 20° C) 1,016-1,022 (ingesta liquida normal) 1,001-1,035 (rango) Negativo 20-50 mmol/d 214-607 mmol/d 1.5-4,5 mmol/d 0,3-1,0 U 0.1-4,2 pmol/d 0.5-4,0 U/d 111-332 U/h 11-37 kU/h
' Como norepinetrina " Como normetaneírina Basado en cistina * Basado en estriol :
f—~
Tabla A5-6
Líquido sinovial INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE Diferencia de glucosa entre la sangre y el liquido sinovial Recuento celular diferencial Coágulo de fibrina Coágulo de mucina Recuento de células nucleadas Viscosidad Volumen
Unidades convencionales
Factor
Unidades del SI recomendadas
<10 mg/dl
0,05551
<0,56 mmol/l
Granulocitos <25% de células nucleadas Ausente Abundante <200 células/ml Elevado <3.5 mi
0.01
Fracción del número de granulocitos: <0.25 de células nucleadas Ausente Abundante
10"
<200 x 10* células/litro Elevado <0,0035 1
0,001
APÉNDICE 5
Tabla A5-7
•
UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE (SI)
1435
Liquido seminal INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE Licuefacción Morfología espermálica
Motilidad espermálica PH Recuento espermático Volumen
Tabla A5-8
Unidades convencionales
Factor
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s A los 20 minutos
A los 20 minutos >70% de espermatozoides normales y maduros
>60% >7.0 (valor medio = 7,7) 60-150 x 10 /ml fc
1,5-5,0 mi
0,01 0,01 1 io 0.001 3
Fracción numérica : >70% de espermatozoides normales y maduros Fracción numérica: >0.60 >7,0 (valor medio = 7,7) 9
60-150 x 10 /l 0,0015-0.005 I
Líquido gástrico INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE
Unidades c o n v e n c i o n a l e s
Volumen residual en ayunas pH Secreción acida basal (BAO)' Secreción acida máxima (MAO) (tras estimulación con histamina) Relación BAO/MAO
200-100 mi <2,0 0-6 mEq/h 5-40 mEq/h <0,4
Factor 0.001 1 1 1 1
Unidades del SI recomendadas 0,02-0,101 <2,0 0-6 mmol/h 5-40 mmol/h <0,4
* Varia en lunción del sexo y la edad
Tabla A5-9
-
Hematología INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE Volumen de hematíes varón mujer Volumen plasmático varón mujer Pruebas de coagulación y hemostasis tiempo de hemorragia
Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) Antitrombina III inmunológica funcional Tiempo de lisis del coágulo (actor de euglobina sangre tolal Retracción del coágulo Factores de coagulación Factor XIII (prueba de rastreo) Fibrinógeno Productos de degradación de la fibrina (fibrinógeno) FDP sérico D-dímeros plasmáticos Plasminógeno inmunológica funcional Proteina C Proteina S (total) Tiempo de protrombina
Tiempo de trombina
Unidades convencionales
Factor
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s
20-36 ml/kg peso corporal 19-32 ml/kg peso corporal
0,001
0,020-0.036 l/kg peso corporal 0,019-0 032 l/kg peso corporal
25-43 ml/kg peso corporal 28-45 ml/kg peso corporal
0,001
0,025-0,043 l/kg peso corporal 0,028-0.045 l/kg peso corporal
20-30 mg/dl 80-120 U/dl
id 10
200-300 mg/l 800-1.200 U/l
1"M horas a 37° C Ninguno a las 24 horas y a 37° C Completo a las 4 horas y a 37° C 0.50-1.50 u/ml Coágulo insoluole en 5 mol/litro de urea a las 24 horas 200-400 mg/dl
1.000
500-1.500 U/l
0,01
2,0-4,0 g/l
<10 ug/ml <200 ng/ml
I I
<10 mg/l <200 ug/i
10-20 mg/dl 80-120 U/dl 0.7-1,4 u/ml 0.7-1,4 u/ml Depende del reactivo de tromboplastina empleado generalmente de 10 a 13 segundos Depende de la concentración del reactivo de trombina empleado, generalmente de 17 a 25 segundos
I!)
100-200 mg/l 800-1.200 U/l 700-1 400 U/l 700-1 400 U/l
Depende de la localización y orientación de la incisión y del instrumento empleado, generalmente de 2 a 8 minutos. Depende de los reactivos de activación y (osfolipidos empleados. generalmente de 25 a 35 segundos.
I0 10 10
La tabla continúa en la página siguiente
1436
Tabla A5-9
APÉNDICES
Hematología (continuación) INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS
COMPONENTE Faclor de von Willebrand mmunológica actividad del cofactor ristocelina Recuento sanguíneo completo (CBC) hematocrito varón mujer hemoglobina varón mu|er recuento de eritrocitos varón mujer recuento leucocitario Índices de eritrocitos volumen corpuscular medio (MCV) Hemoglobina corpuscular media (MCH) Concentración media de hemoglobina corpuscular (MCHC) Recuento diferencial de leucocitos (adulto) neutrófilos segmentados bandas eosinólilos basófilos linfocitos monocitos Hemoglobina A., Hemoglobina F Fragilidad osmótica
Recuento plaquetario Recuento de reticulocitos Velocidad de sedimentación (ESR) (Westergren) varones menores de 50 años varones de 50 a 85 años varones mayores de 85 a ñ o s mujeres menores de 50 anos mujeres de 50 a 85 años mujeres mayores de 85 a ñ o s Viscosidad índice de sedimentación Zeta
Unidades convencionales
Factor
Unidades del SI recomendadas
50-150 U/dl 50-150 U/dl
10 10
500-1 500 U/l 500-1.500 U/i
41.5-50.4% 35.9-44.6%
0.01
Fracción de volumen: 0.415-0.504 0.359-0.446
14.0-17.5 g/dl 12.3-15.3 g/dl
10
140-175 g/l 123-153 g/l
4.5-5.9 x 10"7pl 4.5-5.1 x 10"/|il 4.4-11,0 x 107pl
10* 10'
4.5-5,9 x 10'TI 4,1-5,1 x 10'7I 4.4-11.3 x 1071
80-96 |_m
1
80-96 fL
27.5-33.2 pg
1
27.5-33,2 pg
33.4-35.5%
0.01
Fracción de concentración: 0.334-0,355
:í
Porcentaje medio 56% 3% 2,7% 0.3% 34% 4%
Rango de recuentos absolutos 1800-700/ц! 0-700/pl 0-450/Ц1 0-200/Ц1 1000-4800/pl 0-800/pl 1.5-3,5% de hemoglobina total
<2% & cié LISIS % (p/v) NaCI Fresco 0,2 0.3 97-100 0.35 90-99 0.4 50-95 0.4b 5-45 0,5 0.6 0.55 — 0.6 — 0.65 0.7 — 0.75 150 000-450 000/pl 0.5-1.5% 25.000-75.000 células/|il
24 lìoras a 37° С 95-100 85-100 75-100 65-tOO 55-95 40-85 15-70 0-40 0-10 0-5 0
1010 10" 10r> 10' 0.01 0,01 % NaCI-171 % de Lísis-0,01
Fracción de Rango de media numérica recuento absoluto t,8-7.8 x 1071 0.56 0-0,70 x 1071 0,03 0-0.45 x 1071 0.027 0-0,20 x 1071 0,003 1.0-4.8 x 1071 0.34 0-0.80 x 1071 004 Fracción de masa: 0,015-0.035 de hemoglobina total Fracción de masa: <0.02 Fracción lisada
106 0,01 10
NaCI 24 horas mmol/l Fresco a 37" С 342 0,95-1,00 51.3 0.97-1,00 0,85-1.00 59 8 0.90-0,99 0,75-1.00 68 4 0,50-0,95 0,65-1.00 770 0.05-0,45 0,55-0,95 85.5 0-0,06 0,40-0,85 94 1 0 0,15-0,70 1026 0-0.04 111.2 0,010 1197 0-0,05 128 3 0 150-450 x ЮУ1 tracción numérica: 0.005-0.015 25-75 x 1071
1 0.01
14-1.8 veces la fracción del agua: 0.41-0.54
6
< 15 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <42 mm/h 1 4-1,8 veces la del agua 41-54%
Todos los porcenlaies se multiplican por 0.01 para obtener la tracción
APÉNDICE 5
Tabla A5-10
•
1437
UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE ( S I )
Líquido amniótico INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS Unidades convencionales
COMPONENTE Aspecto periodo temprano de gestación a término Albúmina periodo temprano de gestación a término Bilirrubina periodo temprano de gestación a término Cloruro periodo temprano de gestación a término Creatinma periodo temprano de gestación a término Estriol periodo temprano de gestación a término Lecitina / estingomielina temprano (inmaduro) a término (maduro) Osmolalidad periodo temprano de gestación a término Pco periodo temprano de gestación a término
Claro Claro o ligeramente opalescente
Factor
U n i d a d e s del SI r e c o m e n d a d a s
—
Claro
—
Claro o ligeramente opalescente
0.39 g/dl 0.19 g/dl
3,9 g/l 1,9 g/l
<0,075 mg/dl <0,025 mg/dl
17.10
<1.3 umol/l <0.41 iimol/l
Aproximadamente equivalente al cloruro sérico Generalmente 1-3 mEq/litro inferior al cloruro sérico
— 1
Generalemente 1-3 mEq/litro inferior al cloruro sérico
0.8-1,1 mg/dl 1.8-4,0 mg/dl (generalmente >2 mg/dl)
88,40
71-97 umol/l 159-354 umol/l (generalmente >177 umol/l)
<10ug/dl <60 ug/dl
3,468
<347 nmol/l >2 081 nmol/l
<1:l >2:1
I
Aproximadamente equivalente a la osmolalidad sérica 230-270 mOsm/kg
1
33-55 mm Hg 42-55 mm Hg (aumenta al llegar a término)
0.1333
4,4-7,3 kPa 5.6-7,3 kPa (aumenta al llegar a término)
7,12-7.38 6,91-7,43 (disminuye al llegar a término)
1
7.12-7,38
0.60 ± 0,24 g/dl 0.26 ±0,19 g/dl
I
60 ± 2.4 g/l 2.6 ± 1.9 g/l
1
7-10 mmol/l inferior al sodio sérico
<10% >50%
0,01
Fracción teñida: <0,1 >0.5
0 >20%
0,01
Fracción teñida: <0,0 >0,2
18,0 ± 5.9 mg/dl 30.3 ± 11,4 mg/dl
0,1665
3,00 ± 0,98 mmol/l 5,04 ± 1.90 mmol/l
3.72 ± 0,96 mg/dl 9.90 ± 2,23 mg/dl
59,48
221 ± 57 nmol/l 589 ± 133 umol/l
450-1 200 mi 500-1.400 mi (aumenta al llegar a término)
0.001
0,45-1,2 I 0.5-1.4 I (aumenta al llegar a término)
1
1
<1:1 >2:1 Aproximadamente equivalente a la osmolalidad sérica 230-270 mmol/kg
2
riUI
PH periodo lemprano de gestación a término Proleina total periodo temprano de gestación a término Sodio periodo lemprano de gestación a término
Tinción, citológica Rojo aceite 0 periodo temprano de gestación a término Sulfato azul Nilo periodo temprano de gestación a término Urea periodo lemprano de gestación a término Ácido úrico periodo temprano de gestación a término Volumen periodo temprano de gestación a término s
.
Aproximadamente equivalente al sodio sérico 7-10 mEq/litro inferior al sodio sérico (aumenta al llegar a término)
6,91-7,43
APÉNDICES
1438
Tabla A5-11 Liquido cefalorraquídeo INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS Factor
Unidades convencionales
COMPONENTE Albúmina Recuento celular Glucosa Lactato deshidrogenasa (LDH)
< 10-30 mg/dl <5 células/uI 40-80 mg/dl Aproximadamente el 10% del nivel en suero
10 10 005551 —
Proteínas Electrotoresis de proteínas prealbúmina albúmina alfa-1-globulina alfa-2-globulina beta glubulina gamma globulina Xantocromía
12-60 mg/dl
10
2-7% 56-76% 2-7% 4-12% 8-18% 3-12% Negativo
0,01
Unidades del SI recomendadas 100-300 mg/l
6
<50 x 10-71 2.8-4,4 mmol/l Fracción de la actividad: aproximadamente 0 1 del nivel en suero 120-600 mg/l
Fracción: 0,2-0.07 056-0,76 0,02-0,07 0.04-0,12 0 08-0.18 0,03-0,12 Negativo
Tabla A5-12 Miscelánea INTERVALOS DE REFERENCIA TÍPICOS COMPONENTE Bilis, cualitativa Cloruro Aclaramientos creatinina, endógena Diodrast inulina PAH Azul de Diagnex (análisis gástrico sin sonda) Grasa grasa total grasa neutra ácidos grasos libres ácidos grasos combinados/ conjugados Nitrógeno, total Sodio Tripsina, actividad
SISTEMA Heces al azar Sudor Suero y orina (pautados)
Orina
Heces. 24 h Sudor Hocos frescas, al azar
|:
V
Negativo en adultos Positivo en niños 4-60 mEq/l 115 ± 20 ml/mín 600-720 ml/min 100-150 ml/min 600-750 ml/min Ácido libre presente
Factor —
—
1 0.01667
—
Unidades del SI recomendadas Negalivo en adultos Positivo en niños 4-60 mmol/l 1,92 ± 0.33 ml/s 10.00-12.00 ml/s 1.67-2.50 ml/s 10.00-12.50 ml/s Ácido libre presente
Heces. 72 h
Captación de I " en el tiroides Urobilinógeno cualitativo cuantitativo
Unidades convencionales
Heces al azar Heces. 24 h
<5 g/24 h 10-25% de materia seca
1 0,01
1-5% de materia seca 5-13% de materia seca 5-15% de materia seca
0.01 0.01 0.01
10% de la ingesta
0.01
1-2 g/24 h 10-80 mEq/l Positivo (2+ a 4+)
71,39 1
7,5-25% en 6 horas
0.01
Fracción de la ingesta: 0,075-0,25 en 6 horas
Positivo 40-200 mg/24 h 80-280 unidades Ehrlich/24 h
—
Positivo 68-339 umol/d
1 693
<5 g/d Fracción de la masa: 0,1-0,25% de materia seca 0.01-0,05% de materia seca 0.05-0,13%de materia seca 0,05-0,15% de materia seca Fracción de masa: 0,1 de la ingesta 71-143 mmol/d 10-80 mmol/l Positivo (2+ a 4+)
Tabla A5-13 Selección de valores de referencia pediátricos S'-Fosfatasa àcida neonato 2-13 años S-Aldolasa neonato niño S-Foslatasa alcalina neonato niño S-a-fetoproteína neonato 2 semanas S-Amilasa neonato 1 año S-Aspartato aminolransterasa neonato 1-3 años S-Bilirrubina neonato
7,4-19,4 U/l 6,4-15,2 U/l
4 veces el valor del adulto 2 veces el valor del adulto 40-300 U/l 60-270 U/l
hasta 100 mg/l ¡ndetectable actividad amilasa escasa o nula valores del adulto 16-74 U/l 6,30 U/l
PRETÉRMINO 24 h 48 h
3-5 dias S-Calcio pretérmino. primera semana a término, última semana 1-2 años 2-16 años U -catecolaminas
17-30 nmol/l (10-60 mg/l) 103-137 umol/l (60-80 mg/l) 171-257 umol/l (100-150 mg/l) 1,50-2,50 mmol/l 1.75-3,00 mmol/l 2.50-3,00 mmol/l 2,25-2,87 mmol/l
A TÉRMINO 34-103 nmol/l (20-60 mg/l) 103-120 nmol/l (60-70 mg/l) 68-205 nmol/l (40-120 mg/l)
(60-100 mg/l) (70-120 mg/l) (100-120 mg/l) (90-115 mg/l)
:
NOREPINEFRINA 1 año
1-5 años 6-15 años > 1 5 años U-Cloruro (varia con la ingesta de cloruro) bebé niño S-Coleslerol sangre umbilical 1-2 años 2-16 años U-Cortisol (libre) 4 meses-10 años 11-20 años S-Creatina quinasa neonato 3 semanas-3 meses >1 año
30-90 nmol/d (5,4-15.9 ng/d) 50-180 nmol/d (8,1-30,8 ug/d) 110-420 nmol/d (19,0-71.1 ug/d) 200-510 nmol/d (34,4-87.0 ug/d)
1,7-8.5 mmol/d
17-34 mmol/d 1,2-2,5 mmol/l (460-980 mg/l) 1.8-4.9 mmol/l (700-1900 mg/l) 3.5-6.5 mmol/l (1.350-2 500 mg/l)
6-74 nmol (2-27 ug/d) 2-152 nmol/d (0,7-55 ug/d)
3 veces el valor del adulto 1,5 veces el valor del adulto valores del adulto
EPINEFRINA
1-23 nmol/d (0.1-4,3 ng/d) 4-50 nmol/d (0,8-9,1 ng/d) 7-339 nmol/d (1.3-10.5 ng/d)
19-72 nmol/d (3,5-13,2 ng/d)
S-Creatinina Valor de referencia superior hasta los 5 años hasta los 6 años hasta los 7 años hasta los 8 años hasta los 9 años hasta los 10 años > 10 años S-Estradiol 0-2 años 2-4 años 4-6 años 6-8 años 8-10 años 10-12 años 12-14 años 14-16 años 16-26 años Grasa fecal neonato pretérmino neonato a término 3 meses-1 año 1 año P-Áciúos grasos no esterificados neonato 4 meses-10 años S-Glucosa neonato pretérmino neonato a término bebé S-Y-glutamicotransferasa neonato prematuro neonato-3 semanas 3 semanas-3 meses 1-5 años 6-15 años 16 años-adulto S-Haptoglobina neonato 1 año y mayores de 1 año S-Inmunoglobulina IgG 0-5 semanas 6 meses 1 año 5 años 10 años
44 nmol/l (5.0 mg/l) 53 nmol/l (6.0 mg/l) 62 nmol/l (7,0 mg/l) 71 nmol/l (8,0 mg/l) 80 nmol/l (9,0 mg/l) 88 nmol/l (10.0 mg/l) 106 nmol/l (12,0 mg/l) 0-26 pmol/l (0.7-pg/ml) 0-26 pmol/l (0-7 pg/ml) 0-51 pmol/l (0-14 pg/ml) 0-37 pmol/l (0-10 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 26-385 pmol/l (7-105 pg/ml) 26-1.175 pmol/l (7-320 pg/ml)
hasta 0,40 excretado hasta 0,20 excretado hasta 0,15 excretado hasta 0,085 excretado 0-1,845 mmol/l 300-1.100 mmol/l 1,1-3.6 mmol/l (200-656 mg/l) 1,1-6,1 mmol/l (200-1.100 mg/l) 3.3-5.8 mmol/l (600-1.050 mg/l) 56-233 U/l 10-103 U/l 4-111 U/l 2-23 U/l 2-23 U/l 2-35 U/l
z o o m
cz
z O >
5 > z o
> o z >
haptoglobina detectable sólo en 0,1-0,2 de valores del adulto 7.500-15.000 mg/l 1.500-7000 mg/l 1.400-10.300 mg/l 3.700-15.000 mg/l 4.400-15.500 mg/l
í.a rab/a continúa en la página siguiente
¿fe es -o
Tabla A5-13
Selección de valores de referencia pediátricos* (continuación)
S-Inmunoglobuima 0-5 semanas 6 meses 1 año 5 años 10 años S-Inmunoglobulina 0-5 semanas 6 meses 1 año 5 años 10 años Aclaramiento de <1 mes 1-6 meses 6-12 meses >1 año U-17-Cetosteroides 0-3 dias 1-3 años 3-6 años 6-9 años 10-12 años
IgA
4 meses 1 año 2-16 años S-Potasio neonato pretérmino neonato a término 2 dias-2 semanas 2 semanas-3 meses 3 meses-1 año 1-16 años S-Testosterona
ninguno 200-1.300 mg/l 200-1.300 mg/l 300-2.000 mg/l 500-2.300 mg/l IgM <200 mg/l 300-600 mg/l 300-1.600 mg/l 200-2.200 mg/l 300-1.700 mg/l
EDAD
Inulina ?
29-88 ml/minutos por 1,73 m de superficie corporal 40-112 ml/minutos por 1,73 nV de superficie corporal 62-121 ml/minutos por 1,73 m' de superficie corporal 78-164 ml/minutos por 1,73 m de superficie corporal J
:
Adolescente S-Lactato deshidrogenasa 1-3 dias S-Fósforo (inorgánico)
0-0.2 u.mol/d (0-0.5 mg/d) <7,0 pmol/d (<2.0 mg/d) 2-10 pmol/d (0,5-3.0 mg/d) 3-14 prnol/d (0.8-4.0 mg/d) varón: 2-21 pmol/d (0,7-6,0 mg/d) mujer 2-17 pmol/d (0,7-5,0 mg/d) varón 10-52 nmol/d (3-15 mg/d) mujer: 10-42 pmol/d (3-12 mg/d) hasta 2 veces los valores del adulto PRETÉRMINO
neonato 6-10 días
1.81-2.58 mmol/l (56.0-80.0 mg/l) 1,97-3,78 mmol/l (61-117 mg/l)
A TÉRMINO
0-2 años 2-4 años 4-6 anos 6-8 años 8-10 años 10-12 años 12-14 años 14-16 años 16-18 años 18-20 años 20-25 años S- Tiroxina 1-3 dias 1 semana-1 mes 1-4 meses 4-12 meses 1 -6 años 6-10 años
1.61-2,52 mmol/l (50.0-78,0 mg/l) 1.58-2,87 mmol/l (49-89 mg/l)
* Inlormaciön basada en Melles S (ed): Pediatric Clinical Chemistry. Washington, DC. American Association lor Clinical Chemistry. 1977. ' S = suero; U = orina; P = plasma ' Como DHEA. v __
1,55-2,62 mmol/l (48-51 mg/l) 1.26-1.94 mmol/l (39-60 mg/l) 0.84-1.61 mmo/l (26-50 mg/l) 4,5-7,2 mmol/l 5,0-7.7 mmol/l 4,0-6.4 mmol/l 4,0-6.2 mmol/l 3,7-5.6 mmol/l 3.6-5,2 mmol/l VARÓN
0,14-1.28 mmol/l (0-0.4 ng/ml) 0,17-5.55 nmol/l (0-1.6 ng/ml) 0,28-1,39 nmol/l (0,1-0,4 ng/ml) 0.21-9.72 nmol/l (0.1-2,8 ng/ml) 0,31-1,74 nmol/l (0,1-0,5 ng/ml) 0.29-10,06 nmol/l (0.1-2.9 ng/ml) 0.17-26.37 nmol/l (0-7.6 ng/ml) 3.12-19.43 nmol/l (0.9-5.6 ng/ml) 9.02-25.33 nmol/l (2,6-7,3 ng/ml) 13.88-24,98 mol/I (4,0-7,2 ng/ml) 11.80-38,86 nmol/l (3.4-11,2 ng/ml) 142-296 nmol/l (11,0-23,0 pg/dl) 116-232 nmol/l (9.0-18.0 pg/dl) 97-212 nmol/l (7,5-16.5 pg/dl) 71-187 nmol/l (5,5-14.5 pg/dl) 71-174 nmol/l (5,5-13,5 pg/dl) 64-161 nmol/l (5,0-12,5 pg/dl)
MUJER
0.24-0,62 nmol/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.24-0,69 nmol/l (0,1-0 2 ng/ml) 0.35-0,69 nmol/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.52-1.04 nmol/l (0.1-0.3 ng/ml) 0,69-1.39 nmol/l (0.2-0.4 ng/ml) 0.69-1.74 nmol/l (0.2-0,5 ng/ml) 1,04-2.43 nmol/l (0.3-0,7 ng/ml) 1.21-3.30 nmol/l (0,3-1,0 ng/ml) 1.39-3.30 nmol/l (0,4-1,0 ng/ml) 1 39-3.30 nmol/l (0,4-1,0 ng/ml) 1.39-3,30 nmol/l (0,4-1.0 ng/ml)
