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1 INTRODUÇÃO O estudo da biologia molecular é hoje a principal fronteira com a evolução da Medicina. Diversas áreas estão atualmente tendo seus conceitos modificados a partir desta nova abordagem. Sendo o câncer uma doença resultante do acúmulo de mutações genéticas, adquiridas ou hereditárias, tem sido demonstrado que o comportamento biológico da neoplasia está relacionado à expressão gênico tumoral, sendo, portanto um tema de grande relevância na avaliação prognóstica desta doença. Também na área da infectologia, as ferramentas disponíveis através da biologia molecular têm auxiliado bastante no sentido de aumentar a acuidade diagnóstica, além de definir novas interrelações fisiopatológicas. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007). Desta forma, a pesquisa médica encontra-se no momento comprometida de forma intensa com a necessidade de estudar os aspectos da biologia molecular com o objetivo de permitir o desenvolvimento de estratégias de prevenção, diagnóstico precoce e tratamento de diversas doenças. Neste sentido, a repercussão dos trabalhos a serem desenvolvidos por este grupo de pesquisa refere-se a uma contribuição ao esforço atualmente realizado a nível mundial, permitindo a definição dos aspectos de biologia molecular dos observados em indivíduos em Joinville e região assim como sua comparação com outras regiões do Brasil e do mundo. (ANTONINI; MENEGHIN, 2004). A biologia molecular está diretamente relacionada à genética e à bioquímica e consiste no estudo dos genes que transmitem as informações de geração em geração. Estas moléculas são longos polímeros de ácido desoxirribonucléico, desoxirribonucléico, ou simplesmente DNA. Apenas quatro blocos químicos de construção, guanina (G), adenina (A), timina (T) e citosina (C), são colocados em uma ordem única de código para todos os genes em todos os organismos vivos. (ROBERTIS; et al , 2006). Os genes determinam os traços hereditários, como a cor do cabelo ou dos nossos olhos e até como ocorrem às reações químicas do nosso organismo. Eles fazem isso fornecendo instruções sobre como cada atividade em cada célula do nosso corpo deve ser realizada. (TORRES; AZEVEDO; FELIPE; ET AL, 2003). Muitas doenças são causadas por mutações ou alterações na seqüência do DNA de um gene (doenças monogênicas) ou de vários (doenças poligênicas). Quando a
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informação é codificada por uma alteração genética, a proteína resultante pode não funcionar corretamente ou pode não ter sido formada. Em ambos os casos, as células que contêm alterações genéticas
podem
não funcionar conforme esperado.
Diagnóstico pré-natal e pré-implantacional, predisposição genética ao câncer, investigação de doenças neurológicas, diagnóstico ou estagiamento de doenças e pesquisa de agentes patogênicos são algumas das muitas aplicabilidades da técnica de biologia molecular. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007). O objetivo desse trabalho é realizar uma breve revisão bibliográfica sobre a técnica PCR, Captura Híbrida, Tecnica de Hibridação e tenologia do DNA recombinante destacando os seus fundamentos e aplicação a sua utilização ao descobrimento de diversas doenças.
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2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Reação da polimerase em cadeia (PCR)
PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase (figura 1). A reação de PCR se baseia no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de
DNA de fita simples)
utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. (BOLLELA; SATO; FONSECA 1999).
FIGURA 1: Técnica de PCR Disponível em: INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO, 2005.
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A replicação da molécula de DNA em grande escala e, de todas as técnicas moleculares, PCR é considerada a mais desenvolvida. Diferentemente dos métodos imunológicos, nos quais se identifica a doença por meio dos anticorpos dirigidos aos microrganismos, os métodos moleculares evidenciam a molécula do DNA na amostra do paciente. Em muitos casos, porém, a detecção da molécula de DNA do microrganismo na amostra clínica não indica, necessariamente, a confirmação da enfermidade (TORRES; AZEVEDO; FELIPE; et al , 2003). A reação em cadeia pela polimerase (PCR) é rápida e eficaz, dependendo apenas de métodos de extração do material genético e para a retirada de substâncias que possam interferir na técnica. (BOLLELA; SATO; FONSECA 1999).
2.1.1 Procedimento A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da polimerase e iniciou de um novo ciclo. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, ET AL, 2003). Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que ocorra a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio). A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio. Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de
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aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. (SOUZA, 2003). Posteriomente aquece-se o tubo a 94ºC para ocorrer a desnaturação, ou seja, separar a dupla fita do DNA, a seguir cada fita do DNA que foi separado serve como molde para a síntese de novas cadeias complementares Para que isso aconteça, resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. (ASSIS; LOPES; CARDOSO, et al , 2007). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada novamente a 72 °C dentro do tubo para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla. em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial. ( BOLLELA; SATO; FONSECA, 1999). O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado. (SOUZA, 2003).
2.1.2 Eletroforese em gel
Consiste em uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Essa técnica foi descoberta e empregada pela primeira vez em 1937 por Arne Tisélius um bioquímico russo. O efeito eletroforético tem como base a teoria de Debye-Hückel-Onsager, onde esta teoria de dissociação eletrolítica aceita o fato de as partículas carregadas moverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada uma diferença de potencial em uma solução contendo eletrólitos. (SOUZA, 2003). A electroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho em Biologia Molecular. Em geral, DNA, RNA e proteínas podem ser separados segundo o seu tamanho numa matriz usando um campo eléctrico aplicado. Na electroforese em gel de agarose, o DNA ou o RNA é separado fazendo a amostra migrar através de um gel de
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agarose. As proteínas são normalmente separadas segundo o seu tamanho usando electroforese em gel de acrilamida; também podem ser separadas segundo a sua carga eléctrica usando focagem isoeléctrica, separa moléculas com base em seu tamanho e carga elétrica. Existem vários tipos de eletroforese; mas para separar as moléculas de DNA é utilizada a eletroforese em gel. Essa técnica é empregada para determinar o número, tamanho ou isolar os fragmentos de DNA. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, et al , 2003).
O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb. Alternativamente para a resolução de fragmentos superiores a 1 kb pode-se utilizar a agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting) que é um tipo de agarose derivada de síntese orgânica. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, et al , 2003). Já o gel de agarose é feito apenas através da mistura de um tampão e agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis. Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do gel. (DIAS, FONSECA JUNIOR, RODRIGUES, et al , 2012) A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha e formado por resíduos de D e L galactose unidos por ligações glicosídicas α (1→3) e β(1→4), é
um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. Por isso, para se preparar um gel de agarose procede-se de modo similar a preparação de uma gelatina. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, et al , 2003). Dissolve-se uma quantidade em gramas do pó de agarose, ajustando-se a concentração apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra, em um dado volume de tampão de eltroforese. Os dois tipos de tampão mais utilizados são TAE (Tris-acetato-EDTA) e TBE (Tris-borato-EDTA). Aquece-se a mistura em forno microondas ou utilizando um bico de bunsen, até que a solução fique homogênea e transparente. Aguarda-se a diminuição da temperatura até aproximadamente 50ºC e verte-se em uma forma (um tipo de molde específico para o preparo do gel). (SOUZA, 2003).
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Sobre a solução ainda morna coloca-se um pente (uma tira de teflon denteada que ficará a 1 mm acima do fundo da forma) que servirá como molde para produzir diversas cavidades (poços) no gel. Essas minúsculas cavidades não chegam a atravessar o gel e servirão como reservatórios onde as amostras de DNA serão aplicadas. Ao esfriar e polimerizar, a agarose fica com o aspecto turvo e com resistência diretamente proporcional à concentração de agarose utilizada. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, et al , 2003). A seguir, a forma contendo o gel é colocada no interior da cuba de eletroforese horizontal (Figura 1). Na cuba o gel encontra-se entre fios de platina que atuam como cátodo e ânodo provocando a passagem de corrente elétrica gerada por uma fonte de eletricidade. Adiciona-se o mesmo tampão usado para fundir a agarose em quantidade suficiente para que o gel fique totalmente imerso tomando-se o cuidado para que o nível de tampão fique pelo menos 1 mm acima do gel. A seguir retira-se cuidadosamente o pente. (SANTOS; et al , 2011).
FIGURA 2: Representação esquemática dos equipamentos necessários para a realização da eletroforese em sistema horizontal. Fonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php Antes da aplicação, as amostras de DNA deverão ser misturadas a um tampão de amostra. O tampão de amostra contém corantes e reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Estes últimos asseguram que a amostra de DNA entre no poço pela força da gravidade. Já os corantes, azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento
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da corrida, já que apresentam velocidade conhecida durante a migração na matriz em direção ao pólo positivo. (SOUZA, 2003). Estes corantes podem ser adicionados simultaneamente no tampão de amostra, ou utilizados individualmente, dependendo da disponibilidade e objetivo do experimento. Mais rapidamente, como o Amarelo G, que acompanha para permitir uma estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA de uma dada amostra é necessário aplicar em um dos poços o marcador de massa molecular (ladder). Ele permite inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada. (DIAS, FONSECA JUNIOR, RODRIGUES, et al , 2012) Após a aplicação das amostras, encaixa-se a tampa da cuba contendo os cabos que permitirão a conexão entre a cuba e a fonte de corrente contínua. Os grupos de moléculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do poço e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Após a visualização os resultados geralmente são fotodocumentados. (SOUZA, 2003). No caso de géis corados com brometo de etídio, as fotos devem ser adquiridas sob luz ultravioleta. Para tal, utiliza-se filme Polaroid (branco e preto) ou um software capaz de transformar em imagem a intensidade relativa de fluorescência emitida pelas bandas de DNA captadas por uma câmera fotográfica digital. (MARANHÃO; AZEVEDO; BRÍGIDO, et al , 2003). Em alguns laboratórios, a fim de minimizar os potenciais efeitos danosos da luz ultravioleta, o gel corado com brometo de etídio é colocado dentro de uma câmara e a luz U.V só é ligada com a câmara fechada. Uma câmera acoplada registra a foto do gel. (SOUZA, 2003). Uma das análises que pode ser feita por eletroforese em gel de agarose é o diagnóstico da mutação que deu origem à Anemia Falciforme. Esta mutação pontual no gene da globina beta da hemoglobina. (SANTOS; et al , 2011).
2.1.3 Nested-PCR Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final, para aumentar sensibilidade e eficiência da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1 a reação (round) e outro interno ao produto do
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1a reação. A 1 a reação necessita de um maior tempo de extensão por causa do maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1a reação, que servirá como molde na mistura (mix) da 1 a reação. O produto da 1a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto da 2a reação gerado em grande quantidade, por isso pode ser visualizado na corrida
eletroforética
ou
utilizado
para sequenciamento.
(FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1995).
2.1.4 RAPD( Random Amplified Polymorphic DNA) Baseia-se na amplificação randômica do DNA, ou seja ao acaso, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, utilizando iniciadores pequenos de seqüências arbitrárias, que detectam polimorfismos, mesmo na ausência de informações da seqüência específica de nucleotídeos do DNA alvo. (WELSH; MCCLELAND, 1990). Os marcadores de RAPD são extremamente apropriados para realização de mapas genéticos, diferenciação de espécies animais e vegetais e para impressões de DNA, com especial utilidade, tipagem do genoma de microrganismo, possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clinicas e nos estudos de genética de populações. (WILLIAMS; KUBELIK; LIVAK; et al , 1990)
2.1.5 Real time PCR (PCR em tempo real) PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA representando um grande avanço nos métodos moleculares de auxilio diagnostico, porém a detecção do resultado é realizada dos ciclos através de marcadores, e reaalizar a quantificação dos ácidos nucléicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Threshold (CT ). (WELSH; MCCLELAND, 1990).
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Esse tipo de PCR requer utilização de instrumentação que contém um termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e na coleção da emissão e um computador com um software para aquisição de dados e análise final da reação, A aplicação em diagnósticos, como a detecção de patógenos, ou doenças, tornase interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e rapidez do resultado, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na análise da PCR. (MAMONI; BLOTTA,2005).
2.2 Captura Híbrida Conceitua-se como uma técnica de diagnóstico da presença do HPV através da utilização do DNA. Para realizá-la, o médico deve obter material de colo ou vagina, no caso da mulher, ou da uretra, no caso do homem, as infecções ocorrem em áreas como vulva, vagina, colo uterino, região perianal e entre outras, Ambos devem ser obtidos previamente no laboratório que irá realizar o exame. (RODRIGUES; DALPICOLLI, 2009). O diagnóstico molecular da infecção pelo HPV é importante para a triagem do vírus e baseia-se, principalmente, em métodos como: captura híbrida (CH), southern blot , hibridização in situ, hibridização em fase sólida ( microarrays)
e reação em cadeia
da polimerase (PCR). Entre eles, a captura híbrida é o método molecular mais utilizado em nosso meio para a detecção de HPV. Esta técnica baseia-se na hibridização de DNA, fazendo uso de sondas específicas contra os tipos de HPV considerados de alto risco.(TULIO; PEREIRA; NEVES, ET AL, 2007). O teste molecular de captura híbrida para HPV é capaz de detectar o DNA de 18 tipos virais que mais comumente infectam o trato anogenital (masculino e feminino), O exame é considerado como simples e não causa dor ao paciente, segue o mesmo padrão de outros exames ginecológicos. (RODRIGUES; DALPICOLLI, 2009). De acordo com o especialista, a eficácia deste método consiste em detectar o vírus antes mesmo dele significar a infecção propriamente dita, diferenciando a captura híbrida em relação aos outros exames. “O papanicolau irá diagnosticar a infecção por HPV somente quando a célula manifestar alterações, já na colposcopia é preciso haver a
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infecção pelo vírus para que ele seja identificado, ou seja, o material para análise, colhido nestes exames, precisa estar “doente” e apresentar -se alterado”, explica Nicolau.(TULIO; PEREIRA; NEVES, ET AL, 2007).
2.3 Técnica de Hibridação A hibridação in situ por fluorescência (FISH) foi descrita em 1988 por Pinkel como adaptação do método radioativo existente, tornando-o mais simples, rápido e sensível. Fundamentalmente assenta no mesmo princípio, ou seja, na hibridação de um fragmento de DNA marcado com um fluorócromo, à sua sequência complementar presente no DNA do tecido alvo. A visualização deste sinal é feita por microscopia de fluorescência. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003). Os passos básicos incluem o tratamento do tecido alvo, removendo restos celulares e permeabilizando a amostra de forma a permitir a penetração da sonda, por exemplo, no núcleo da célula. Tanto a sonda como o DNA alvo são desnaturados através de incubação a temperatura elevada em presença de formamida (agente desnaturante). A sonda encontra-se em excesso, de forma a favorecer a cinética de ligação ao DNA alvo. A hibridação é conseguida pela incubação a 37ºC, e seguem-se diversas lavagens para retirar a sonda em excesso, bem como a sonda que tenha hibridado de forma inespecífica em zonas não complementares. Nestas lavagens joga-se a estabilidade dos híbridos formados face a diferentes condições de estringência (concentração salina) e temperatura. (ROBERTIS; et al , 2006). A detecção do sinal é conseguida pela excitação do fluorócromo associado à sonda com luz ultravioleta e visualização da preparação no microscópio de fluorescência. Entre os fluorocromos mais utilizados encontra-se o 5-tiocianato de fluoresceína (FITC), verde, ou a rodamina (TRITC) e o Texas Red, vermelho, enquanto que o fundo azul é obtido pela pintura cromossômica com diaminofenilindolo (DAPI). (TORRES; AZEVEDO; FELIPE; ET AL, 2003).
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FIGURA 3: Esquema ilustrativo do processo de hibridação in situ por fluorescência. Fonte: BOTARI et al. (2006)
2.4 Tecnologia do DNA recombinante A Tecnologia do DNA recombinante, e conceituado como um conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Essa técnica pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da sequencia de um gene e consequentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003). uma proteína recombinante é uma proteína que é derivada de DNA recombinante. A técnica do DNA recombinante foi proposta por Peter Lobban, um estudante de graduação, com a. Dale Kaiser no departamento de Bioquímica da Universidade de Stanford. A técnica, em seguida, foi realizada por Lobban e Kaiser; Jackson, Symons e Berg; e Stanley Norman Cohen, Chang, Herbert Boyer e Helling, em 1972 – 1974. (ROBERTIS; et al , 2006). Como consequência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação
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de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. (ROBERTIS; et al , 2006). Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003).
2.4.1 Aplicações Práticas em Geral Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente. Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína. (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL, 2007).
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FIGURA 4: Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.
Fonte: Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular Approach. 3d ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA, p.110. A figura acima demostra uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. (CARNEIRO; JUQUEIRA, 2003). Um plasmídeo é uma pequena molécula circular que contém uma origem de replicação (ori), gene que confere resistência a um antibiótico (no exemplo ampicilina, Amp) e sítio(s) de restrição (no exemplo, sítio de restrição para a EcoRI), o qual pode ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido é ligado ao vector e os plasmídeos recombinantes são transformados em bactérias, tais como a E. coli. As bactérias são plaqueadas em meios contendo o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência, como forma de seleccionar as bactérias resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se então colónias de bactérias com o plasmídeo recombinante. (CANDEIAS, 1991). Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente, antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente
as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta
finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico). (GOEDDEL, 1979). O desenvolvimento desta nova tecnologia só foi possível pela descoberta, das enzimas ou endonucleases de restrição. Este tipo de enzima atua como uma espécie de "tesoura biológica" que, após reconhecer determinada seqüência nucleotídica, faz corte bifilamentar na ligação açúcar-fosfato da molécula de DNA, produzindo fragmentos. Elas são produzidas naturalmente por bactérias como forma de defesa contra infecção viral, onde clivam em diversos fragmentos o material genético dos vírus, impedindo sua
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reprodução na célula bacteriana. Portanto, a bactéria protege seu próprio DNA dessa degradação, modificando sua sequencia de reconhecimento. (CANDEIAS, 1991). São em grande número os objetivos práticos da pesquisa biológica, desde a satisfação da curiosidade humana sobre a natureza da vida, até ao controle e eliminação de doenças humanas, de outros animais e de plantas, enfim, a melhoria da qualidade de vida. Com as diversas técnicas de DNAr vai-se tornando mais rápido e eficiente o atendimento àqueles objetivos. Mesmo desconhecendo, ainda, os limites das possibilidades da aplicação prática da engenharia genética, não resta dúvida de que passamos a dispor de tecnologia altamente promissora para a solução de problemas de natureza variada. (GOEDDEL, 1979).
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3 CONCLUSÃO
As técnicas de biologia molecular possibilitam a identificação da expressão de genes e/ou proteínas. Cada uma das técnicas de biologia molecular citadas anteriormente, utilizadas isoladamente ou em associação, fornece uma série de resultados relevantes para a compreensão de varias patologias. De posse dessas informações acerca de quanto mais cedo uma doença for detectada, maior será a probabilidade de instituir o tratamento adequado. alguns casos, um diagnóstico tardio pode tornar completamente irreversível o curso da doença.
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